EVALUACION DE LA DIVERSIDAD GENETICA DE GRANADILLA final
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EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE MATERIALES CULTIVADOS DE GRANADILLA (Passiflora ligularis) PROCEDENTE DEL EJE CAFETERO MEDIANTE EL USO DE MARCADORES MOLECULARES GINA PAOLA SOLANO FLOREZ TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al título de Bióloga PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGIA Bogotá, D. C. 2007
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EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE MATERIALES
CULTIVADOS DE GRANADILLA (Passiflora ligularis) PROCEDENTE DEL EJE
CAFETERO MEDIANTE EL USO DE MARCADORES MOLECULARES
GINA PAOLA SOLANO FLOREZ
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
Bióloga
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGIA
Bogotá, D. C. 2007
NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE MATERIALES
CULTIVADOS DE GRANADILLA (Passiflora ligularis) PROCEDENTE DEL EJE
CAFETERO MEDIANTE EL USO DE MARCADORES MOLECULARES
GINA PAOLA SOLANO FLOREZ
APROBADO
________________________ Maria del Pilar Márquez M.Sc
Directora
________________________ ________________________ Ingrid Schuler Ph.D José Salvador Montaña M.Sc Jurado Jurado
EVALUACIÒN PRELIMINAR DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE MATERIALES
CULTIVADOS DE GRANADILLA (Passiflora ligularis) PROCEDENTE DEL EJE
CAFETERO MEDIANTE EL USO DE MARCADORES MOLECULARES
GINA PAOLA SOLANO FLOREZ
APROBADO
________________________ ______________________ Angela Umaña Muñoz, M.Phil Andrea Patricia Forero Decana Académica Directora de Carrera
Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias
A Dios y a mis padres por su ejemplo de lucha, por sus sabios consejos; agradezco
su compresión, su dulzura y dedicación
A mi hermana por que ha contribuido con mi formación a lo largo de mi vida y mi
carrera.
A mi familia y Cesar por el cariño y apoyo durante todo este tiempo, a todos gracias
por que hoy alcanzo una meta más en mi vida
vi
Agradecimientos Durante este proceso de preparación como profesional y crecimiento personal han
sido muchas las personas que de una u otra forma han colaborado y enriquecido mi
vida tanto profesional como personal.
A Maria del Pilar Márquez por su colaboración y constante asesoría por su
confianza, enseñanzas y amistad
A la Dra. Ingrid Schuler por brindarme la oportunidad, por la confianza depositada y
por posibilitar tantas oportunidades
A Andrea Forero por introducirme en el mundo de la biotecnología, por sus consejos
y sugerencias constructivas
A William Escobar y Nixon Pérez por su colaboración en el trabajo en campo
Al Centro de investigaciones y Estudios en Diversidad y Recursos Genéticos
CIEBREG
A Colciencias
A mis compañeros de laboratorio Diego Mejía, Paula Aguilar; a mi Amiga Ángela
García, a ellos por el apoyo moral y compañía en este tiempo, por enseñarme que la
paciencia es la mejor compañía y consejera en este trabajo
Finalmente, agradezco a todas aquellas personas de la Unidad de Biotecnología
Vegetal que colaboraron siempre que fue necesario para que este proyecto saliera
adelante; al igual que a todos mis compañeros de carrera.
vii
TABLA DE CONTENIDOS
RESUMEN _________________________________________________________ 1 1. INTRODUCCION __________________________________________________ 2 2. MARCO TEORICO_________________________________________________ 4
2.1. Clasificación botánica ..................................................................................... 4
2.2 Taxonomía Y Botánica ..................................................................................... 4 2.2.1 Descripción botánica de Passiflora ligularis, Juss ..................................... 5
2.3 Origen y distribución ........................................................................................ 6
2.4 Importancia Económica ................................................................................... 6
2.5 Condiciones De Cultivo y Propagación ........................................................ 9 2.5.1 Clima ............................................................................................................ 9 2.5.2 Suelos .......................................................................................................... 9 2.5.3 Biología reproductiva y Propagación ........................................................... 9 2.5.5 Usos y Propiedades ................................................................................... 11
2.6 Problemas Agronómicos y de Cultivo ......................................................... 12 2.6.1 Plagas y Enfermedades ............................................................................. 12
2.7 Marcadores genéticos .................................................................................... 14 2.7.1 Marcadores Moleculares ........................................................................... 14 2.7.2 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) .......................................... 17
2.8 RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) ................................. 19 2.8.1. Ventajas del Método ................................................................................. 19
2.9 Marcadores AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) .............. 20 2.9.1. Ventajas del Método ................................................................................. 21
2.10. Extracción de DNA ....................................................................................... 22
2.11. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ............................................................................. 23 2.11.1 Coeficientes de Asociación ..................................................................... 24
2.12. ESTADO DEL ARTE DEL GENERO PASSIFLORA ................................... 26
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN ___________________ 30 3.1 Problema y justificación ................................................................................ 30
5. OBJETIVOS _____________________________________________________ 32 5.1 Objetivo General ............................................................................................. 32
5.2 Objetivos Específicos .................................................................................... 32
6. MATERIALES Y METODOS ________________________________________ 32 6.2 Material utilizado ............................................................................................. 34
6.3 Fase de Laboratorio ....................................................................................... 34 6.3.1 Estandarización del protocolo de extracción de DNA .............................. 34
viii
6.3.2 Diseño experimental ................................................................................ 35
6.4 Cuantificación de DNA ................................................................................... 35
6.5 RAPD (DNA polimórfico amplificado al azar) .............................................. 36
6.6 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ................................... 38
6.7 Análisis de datos ............................................................................................ 41 6.7.1 Extracción de DNA ..................................................................................... 41 6.7.2 Análisis RAPD y AFLP ............................................................................... 42
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ______________________________________ 42 7.1 Estandarización del protocolo de extracción de DNA ............................... 42
7. 2. Análisis RAPD (Polimorfismo de DNA amplificado al azar) .................... 49
7.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ................................... 54
8. CONCLUSIONES ________________________________________________ 57 9. RECOMENDACIONES ____________________________________________ 58 10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS _________________________________ 59 11. ANEXOS ______________________________________________________ 69
ix
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Composición nutricional de la granadilla (Passiflora ligularis)__________11
Tabla 2. Plagas que afectan el cultivo de granadilla (Passiflora ligularis)________13
Tabla 3.Enfermedades principales que afectan el cultivo de ganadilla (Passiflora
ligularis___________________________________________________________14
Tabla 4.Factores, niveles y tratamientos evaluados para la extracción de DNA de
(Passiflora ligularis)_________________________________________________34
Tabla 5. Concentraciones de MgCl2 y DNA evaluadas______________________35
Tabla 6. Perfiles de amplificación de DNA para RAPD______________________35
Tabla 7.”Primers” Operon utilizados para el análisis de Passiflora ligularis mediante
RAPD.____________________________________________________________36 Tabla 8. Combinaciones de “Primers” EcoRI x MseI para el análisis de Pasiflora
ligularis mediante AFLP. _____________________________________________39
Tabla 9. Incidencias de los distintos factores (método y tipo de tejido) y sus
interacciones en la calidad y Cantidad de DNA extraído según el modelo
factorial___________________________________________________________43
Tabla 10. Condiciones de PCR para RAPD_______________________________51 Tabla 11. Ciclos de temperatura del termociclador_________________________51
Tabla 12. Porcentaje de polimorfismos y bandas en el ensayo de AFLP________54
x
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Comportamiento de la producción de granadilla (Passiflora ligularis) en Colombia desde 1992 hasta 2003. ............................................................................... 7 Figura 2. Representación de las posibles combinaciones de las OTU. ................... 24 Figura 3. Diagrama deSíntesis de la metodología .................................................... 33 Figura 4. Evaluación de la calidad de DNA extraído con tejido seco (A) y tejido conservado e frio (B), con los diferentes protocolos .................................................. 43 Figura 5. Evaluación de la calidad de DNA extraído con tejido conservado en frio mediante el protocolo 3 (Mc Couch I et al 1988) de los 90 individuos colectados. ... 45 Figura 6. Dendrograma usando el algoritmo UPGMA, basado en el índice de similitud de Dice. Muestra las similitudes entre las procedencias evaluadas de Passiflora ligularis mediante marcadores molecualres RAPD………………………..53 Figura 7. Gel de acrilamida al 6% donde se observa la amplificación por medio de marcadores AFLP, combinaciones E- TA x M- CTT (90.63%), E-TT x M- CAA (61.54%), E- AT x M- CTT (90.82%). ......................................................................... 55 Figura 8. Dendrograma usando el algorismo UPGMA, basado en el indice de similitud de Dice. Muestra las similitudes entre las procedencias evaluadas de Passiflora ligularis mediante maracadores moleculares AFLP……………………….
xi
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Procedencia del material vegetal de Passiflora ligularis analizado mediante RAPD _______________________________________________ 70 Anexo 2. Protocolos evaluados para la extracción de DNA total de tejido foliar de Passiflora ligularis ______________________________________________ 75 Anexo 3. Protocolo de extracción de DNA. MC Couch, S.R, G. Kochert, Z.H. Yu,ZY. Wing, G.S. Khush, W.R Coffman y S.D.Tanksley. 1988. Molecular mapping of rice chomosome. Theor Appl.Genet 76: 815-829 (Modificado) __________________ 77 Anexo 4. Cuantificación de calidad y cantidad de DNA muestras Quindío, Risaralda y Tolima, protocolo de Mc Cauch modificado tejido fresco _________________ 79 Anexo 5. Cuantificación de calidad y cantidad de DNA tejido fresco __________ 81 Anexo A. Cuantificación de calidad de DNA (260/208 OD) Muestras Quindío, Risaralda tejido fresco ___________________________________________ 81 Anexo B. Cuantificación de cantidad de DNA (µg/ml) Muestras Quindío y Risaralda tejido fresco ___________________________________________________ 81 Anexo 6. Cuantificación de calidad y cantidad de DNA tejido seco ___________ 82 Anexo A. Cuantificación de calidad de DNA (260/208 OD) Muestras Quindío, Risaralda tejido seco ____________________________________________ 82 Anexo B. Cuantificación de Cantidad de DNA (µg/ml) Tejido seco ___________ 82 Anexo 7.Resultados para la prueba de medias de Duncan ________________ 83 Anexo 8. Productos de amplificación marcador RAPD ____________________ 87 Anexo 9. Productos de Pre amplificación marcadores AFLP ________________ 89 Anexo 10. Formato libreta de campo ________________________________ 90 Anexo 11. Protocolo de tinción con nitrato de plata ______________________ 91
RESUMEN
La granadilla (Passiflora ligularis) es una especie neotropical perteneciente a la
familia Passifloraceae, con gran valor comercial por sus frutos comestibles.
Colombia es uno de los mayores productores de esta fruta a escala mundial gracias
a las campañas de consumo de productos exóticos que vienen realizando los países
productores de la fruta en todo el mundo.
Una primera etapa para desarrollar programas de fomento, requiere del
conocimiento de la diversidad genética de la especie en las zonas donde se
concentra su producción. Las técnicas de biología molecular y en particular el uso
de marcadores moleculares permiten conocer, caracterizar y estimar la diversidad
genética y las relaciones entre grupos de interés.
En este estudio se evaluaron individuos de Passiflora ligularis procedentes del eje
cafetero, para estimar la diversidad genética con marcadores RAPD y AFLP, como
un primer acercamiento al análisis de diversidad genética dentro de la especie. El
protocolo de extracción de DNA de Mc Couch modificado (1988) permitió obtener
DNA de calidad y cantidad óptima para la amplificación con marcadores
moleculares.
Se obtuvo un protocolo óptimo de amplificación para los marcadores RAPD,
evidenciándose un bajo polimorfismo en la población evaluada con 11 “primers”, lo
cual se refleja en índices de similitud altos. De la misma forma para los marcadores
AFLP se establecieron las combinaciones de “Primers” que evidencian el mayor
polimorfismo.
Se sugiere que los AFLP pueden generar mayor información en el análisis de
diversidad, debido a que presenta el mayor grado de polimorfismo, siendo las
combinaciones E- AT x M-CTT, E- TA x M- CTT, E- TG x M- CTG las más
informativas con un total de 231 bandas polimórficas.
2
1. INTRODUCCION El conocimiento de la distribución de la variabilidad genética es de suma importancia
para el desarrollo de estrategias de conservación efectivas. La variabilidad puede
ser muy diferente entre especies y entre poblaciones de una misma especie y esta
variabilidad puede ser de gran interés para programas de selección y mejoramiento
de especies con valor comercial y ambiental.
La granadilla (Passiflora ligularis) es una especie neotropical perteneciente a la
familia Passifloraceae, con gran valor comercial por sus frutos comestibles.
Colombia se caracteriza por ser uno de los mayores productores de esta fruta a
escala mundial, junto con Venezuela, Sudáfrica y Australia. La granadilla ha ganado
importancia en el comercio internacional gracias a las campañas de consumo de
productos exóticos que vienen realizando los países productores de la fruta a escala
mundial.
La granadilla presenta un mercado interno activo, siendo los departamentos de
Huila, Risaralda, Valle del cauca, Cundinamarca y Tolima los principales
productores. La fruta además se exporta a diferentes países con beneficios
arancelarios que la ponen en una situación ventajosa frente a otros productos. Sin
embargo hasta el momento no existen investigaciones que permitan el desarrollo de
un paquete tecnológico para el fomento del cultivo.
Una primera etapa para desarrollar programas de fomento, requiere del
conocimiento de la diversidad genética de la especie en las zonas donde se
concentra su producción. Las técnicas de biología molecular y en particular el uso
de marcadores moleculares permiten conocer, caracterizar y estimar la diversidad
genética y las relaciones entre grupos de interés. La primera fase de este proceso
requiere ajustar los protocolos de extracción de DNA y amplificación para RAPD y
AFLP, para la especie en estudio.
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Dentro de estos marcadores moleculares encontramos los RAPD (Random
Amplification of Polymorphic DNA), desarrollados por Williams et al. (1990); los
cuales están basados en la amplificación de DNA geonómico mediante la utilización
de “primers” de secuencia nucleotídica corta (10 nucleótidos) al azar; donde los
productos de amplificación son separados en geles de agarosa.
Por otra parte los marcadores moleculares AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism), es un método altamente sensible para detectar polimorfismos de
DNA (Vos et al., 1995), que combina una digestión enzimática con endonucleasas,
con una amplificación posterior por PCR. El análisis de AFLP permite obtener
marcadores dominantes, no específicos para un locus, se caracteriza por presentar
una alta resolución y sensibilidad al mostrar los polimorfismos y no requieren
información previa del genoma en estudio.
Estas son dos de las herramientas más utilizadas y sugeridas para los estudios de
variación genética. Igualmente han sido aplicadas en estudios de genotipificación,
diferenciación poblacional y diversidad genética en una gran variedad de
organismos, al igual que para realizar selección asistida por marcadores.
Con este trabajo se pretende caracterizar molecularmente el material de granadilla
cultivado en una de las zonas de mayor producción en Colombia como lo es el Eje
Cafetero, como un primer paso para el futuro desarrollo de programas de fomento
para esta especie.
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2. MARCO TEORICO
2.1. Clasificación botánica
Reino: Vegetal
División: Angiospermas
Clase: Dicotyledoneas
Subclase: Archiclamydeeae
Orden: Violales
Suborden: Flacourtineae
Familia: Passifloraceae
Género: Passiflora
Especie: Passiflora ligularis
Nombre común: Granadilla dulce
Sinónimos (Romero 1991): Passiflora ligularis Juss. Var. germiniflora DC
Passiflora loweri Heer
Passiflora serratispula DC
Passiflora tiliaefolia
2.2 Taxonomía Y Botánica
La granadilla, Passiflora ligularis, Juss. Ann Mus. Hist. Nat. 6: 113.1805, pertenece a
la familia de las Passifloraceae. El nombre de la familia y del género principal,
Passiflora, tiene su origen en “flor de la pasión”, refiriéndose a la pasión de
Jesucristo (Escobar 1988).
Dentro de la familia de las Passifloraceae se encuentran plantas comunes como:
granadillas, curubas, badeas, pasifloras, pasionarias, parchas, parchitas, tumbo,
curubo, curubito, maracuyá, taxo, etc. Estas se encuentran, desde el nivel del mar
hasta los subpáramos. Presentan dos tipos de crecimiento vegetal como lo son las
lianas o enredaderas herbáceas con zarcillos axilares, y los árboles (Escobar 1988).
5
Las hojas de esta familia se caracterizan por ser alternas, pecioladas con estipulas,
con nectarios extra florales (ausentes en algunas especies de pasiflora). Con
pedúnculos axilares, tres brácteas grandes involucradas o pequeñas y esparcidas
sobre el pedúnculo. Presenta flores hermafroditas; con cuatro o cinco sépalos,
cuatro o cinco pétalos, aunque en algunas especies de Passiflora se encuentran
ausentes. Tiene opérculo membranoso; cinco estambres unidos por los filamentos,
formando un androginóforo, en otras ocasiones son ocho libres, con ovario supero,
sub-sesil con tres o cuatro placentas parietales. El fruto se caracteriza por tener
semillas que presentan testa lisa o reticulada, con arilo (Escobar 1988).
2.2.1 Descripción botánica de Passiflora ligularis, Juss
La granadilla se caracteriza por ser una planta con raíces fasciculadas, con tallo
herbáceo, cilíndrico, voluble, típico de una enredadera glabra, con zarcillos axilares
simples. Presenta hojas de color verde claro, acorazonadas con margen liso, simple
y alterno con nervaduras pronunciadas por el envés que miden aproximadamente 8
a 14 cm de largo, el pecíolo tiene tres pares de glándulas finas y alargadas.
Las flores miden de 6 a 8 cm de diámetro, los sépalos y pétalos son de color
blancuzco o amarillento y la corola por su parte presenta bandas alternadas
moradas y blancas (Escobar 1988). Los estambres están sostenidos por su base;
las anteras se unen hacia la mitad del filamento. Lo cual facilita la labor de los
polinizadores.
Su fruto tiene forma redonda ovalada y su sabor se describe como dulce y agridulce.
Dentro de su cáscara dura, lisa y cerácea, encerrada en un saco membranoso,
donde se encuentra una pulpa gelatinosa compuesta de alrededor de 250 pequeñas
semillas comestibles, de color café oscuro o negro (Escobar 1988).
El fruto esta sostenido con dos brácteas que miden de 6 a 12 cm de largo, la
cáscara es semidura, encerrada y delgada, de color amarillo o naranja,
generalmente presenta un pecíolo largo. El pericarpio está formado de varias capas
de células, que le da la solidez al fruto. Por su parte el mesocarpo es de color
6
blanco, con una textura esponjosa y seca, mide alrededor de 3 mm de grosor
(Escobar 1988).
En el interior de la fruta se encuentran tres placentas longitudinales almacenando
las semillas que están rodeadas de una membrana fina de color blanco
(parénquima), las semillas son planas, elípticas, de color negro, estas junto con el
arilo tienen cerca del 76% de los carbohidratos (Escobar 1988, Trujillo 1983).
2.3 Origen y distribución
La granadilla (Passiflora ligularis) es originaria de Sudamérica, esta planta crece
entre los 2000 y 3000msnm, se cultiva desde el norte de Argentina hasta México.
Colombia es uno de los países con mayor producción a nivel mundial
(aproximadamente 20.504 Tn/año), al igual que Venezuela, Sudáfrica y Australia
(CAQ 1992; Escobar 1988; Espinal et al. 2005).
Los principales cultivos en Colombia se encuentran en los departamentos de
Antioquia, Boyacá, Caldas, Chocó, Cundinamarca, Huila, Santander, Tolima, Valle
del Cauca, Quindío y Risaralda.
2.4 Importancia Económica
Las especies del género Passiflora constituyen una riqueza muy valiosa, tanto a
nivel económico, como de recursos genéticos. Su flor ha despertado gran interés en
la industria de plantas ornamentales en Europa. Algunas pasifloras tienen
propiedades sedativas, antiespasmódicas y antibacteriales (Perry et al 1991). En
América Latina, centro de diversidad y origen de las Passifloras, es el fruto, el que
tiene mayor importancia a nivel de la agroindustria.
Dentro de esta gran variedad genética, inter e intraespecífica las que producen
frutos comestibles son las que se convierten en un recurso importante para nuestro
país y por la tanto es vital su conservación. Colombia es el país que mayor número
de especies de pasifloras posee en el mundo, esto se debe a la gran diversidad de
hábitat y climas, de igual manera su evolución está influenciada por la presencia de
7
las tres cordilleras, debido a que éstas forman una gran cantidad de sitios aislados
por su posición y ubicación geográfica (Escobar 1988).
La granadilla es una fruta de gran importancia para los países andinos, en especial
para Colombia y Ecuador, ya que se ha convertido en la fruta tropical exótica con
mayor participación y crecimiento durante los últimos cinco años, dentro del renglón
de las exportaciones. En Colombia los cultivos comerciales de estas frutas son
relativamente nuevos, pero a pesar de la excelente aceptación del mercado ante
estos frutales, no se cuenta con una oferta tecnológica que permita satisfacer toda
la demanda que está exigiendo el mercado (Espinal et al 2005).
Según datos del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR), en Colombia,
del área sembrada destinada a los frutales de exportación, la granadilla participó
aproximadamente con el 4.7% en el 2003, presentando en el período 1992-2003 un
crecimiento de 3.9% promedio anual. En 1992 se cultivaron 1.069 ha. y en 1998 se
llegó a las 1.545 ha cultivadas., pero en 1999 el área dedicada a este cultivo cayó
vertiginosamente hasta alcanzar 914 ha cultivadas, aunque a partir de ahí se inicia
una gran recuperación del cultivo alcanzando en el 2003 una superficie de
producción de 1.821 ha (Figura 1) (Espinal et al 2005).
Comportamiento de la producción de granadilla en Colombia (Tn/Año)
Figura 1. Comportamiento de la producción de granadilla (Passiflora ligularis) en Colombia
desde 1992 hasta 2003.
Ton
Año
8
La dinámica de la producción ha superado el crecimiento en área, lo que indica
ganancias en productividad dado que el crecimiento promedio en el período 1992-
2003 fue de 5,0%, alcanzando en este último año una producción de 20.504 ton.
Los rendimientos han experimentado un crecimiento de 1.1% promedio anual,
manteniéndose alrededor de 11 y 12 ton/ha (I Censo nacional de frutas
agroindustriales y promisorias 2004, Espinal et al 2005).
Según información suministrada por el MADR, la mayor producción de granadilla en
el año 2003 se presentó en los departamentos del Valle del cauca (45%), Huila
(20%), Risaralda (12%), Caldas (7%), Cundinamarca (4%) y Tolima (4%) (I Censo
nacional de frutas agroindustriales y promisorias 2004, Espinal et al 2005).
Risaralda es actualmente el tercer productor nacional, y se destaca por el gran auge
que ha adquirido el cultivo en la zona, pasando de 53 hectáreas cultivadas en 1992
a 208 hectáreas en el 2003, lo que significó pasar de producir 579 toneladas a
2.457, con un crecimiento 1992-2003 promedio anual de 12.8% con relación a la
superficie de cultivo y de 12.5% en la producción (Espinal et al 2005).
La expansión en el cultivo parece estar más relacionada con incrementos en área
que por mejoras productivas, pues los rendimientos, aunque se mantienen sobre el
promedio nacional muestran una tasa de crecimiento negativa de -0.2% (Espinal et
al 2005).
El departamento de Quindío, que participó en el 2003 con tan solo el 3% de la
producción nacional, muestra la mayor dinámica de crecimiento del cultivo en todo
el país durante el período 1992-2003, aunque con un volumen de producción muy
por debajo del logrado por el departamento de Valle, con un crecimiento del 27%
promedio anual en área y producción. Los rendimientos en este departamento han
estado cercanos al promedio nacional llegando a 11.1 ton./ha. en el 2003 (Espinal et
al. 2005).
9
2.5 Condiciones de Cultivo y Propagación
2.5.1 Clima
La temperatura óptima para el cultivo de granadilla, con un buen desarrollo
fisiológico y productivo, se encuentra entre los 13 y 19 °C. A temperaturas mayores
o menores a las señaladas, el desarrollo se ve afectados sustancialmente (CIA
1992).
Los niveles de precipitación para el buen desarrollo van de los 600 a 1.000 mm
anuales, por lo que en áreas con precipitaciones pluviales inferiores se cultiva con
riego adicional. Los mejores rendimientos se obtienen en altitudes entre los 1.800 y
2.700 m.s.n.m, pero existen plantas en estado silvestre o cultivadas fuera de este
rango; sin embargo a altitudes superiores a los 2.500 m.s.n.m existe el peligro de las
heladas, que ocasiona la quema de las hojas y tallos inhibiendo de esta manera la
producción de frutos (CIA 1992). La especie prospera bien con una humedad
relativa de 75% (Benalcázar et al. 2001).
2.5.2 Suelos
Dentro de las características edáficas para el cultivo de granadilla se encuentran el
buen drenaje de los suelos y la buena disponibilidad de humedad. Los suelos deben
presentar una textura entre franca: franco arenoso o los franco arcillo-arenoso. Con
cantidades superiores al 3% de materia orgánica, con el fin de mantener la
humedad, temperatura y mejorar las características estructurales al igual que las
químicas. El pH del suelo debe ser ligeramente ácido por lo que se encuentra entre
6.0 a 6.5 (CIA 1992, Benalcázar et al. 2001).
2.5.3 Biología reproductiva y Propagación
Passiflora ligularis es una planta diploide (2n = 18) (Snow et al 1993) que posee dos
juegos de cromosomas y se reproduce por polinización cruzada, en donde los
gametos de diferentes plantas se unen para formar el cigoto.
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Debido a la forma de reproducción se presenta un constante intercambio genético
en cada generación aumentando de esta manera la variabilidad genética con un alto
grado de heterocigosis (Chaves 1993)
La propagación de la granadilla se puede realizar sexualmente y asexualmente. La
propagación por semilla se inicia con la selección y extracción del fruto, por lo que
debe ser extraído de plantas sanas de alta productibilidad, que presenten frutos
maduros, enteros, sanos y con un peso individual de 100 gramos o más.
El proceso se inicia con el corte del fruto por la mitad, luego se evacua su contenido
en un recipiente con agua donde se mantiene por un periodo de 48 horas. Después
de este tiempo la semilla es tamizada hasta que el arilo sea totalmente desprendido.
Luego, se deja secar a la sombra durante 24 horas y pasado este tiempo se
procede a sembrar la semilla en tierra con una mezcla de materia orgánica para
luego ser trasplantada. En promedio la semilla germina entre 15 o 20 días después
de la siembra (Benalcázar et al. 2001).
El segundo método de propagación se realiza por injertos. Este tipo de propagación
generalmente se utiliza para superar problemas de enfermedades causadas por
hongos presentes en el suelo. Así como por estacas, la cual dura dos meses antes
de ser trasplantada a la tierra (Benalcázar et al. 2001).
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2.5.4. Composición nutricional del fruto
La granadilla es rica en fósforo y vitamina C, es una fruta con un alto contenido en
calorías (Tabla 1) y presenta propiedades diuréticas y digestivas (Nagy 1980).
Tabla 1. Composición nutricional de la grandilla (Passiflora ligularis)
Componentes
Contenido de 100 g de parte comestible
Valores diarios recomendados (basado
en una dieta de 2000 calorías)
Agua 86 % Proteínas 1.1 %
Carbohidratos 11.6 % 300 g Cenizas 0.9 %
Grasa total 0.1 % 66 g Calorías 46
Fibra 0.3 g 25 g Ácido ascórbico 20 mg 60 mg
Calcio 7 mg 162 mg Fósforo 30 mg 125 mg Hierro 0.8 mg 18 mg
Niacina 2.0 mg 20 mg Riboflavina 0.1 mg 1.7 mg
Tomado de Nagy 1980
2.5.5 Usos y Propiedades El principal uso es consumo en fresco (no procesada), el refresco y helados de
pulpa de granadilla son otra forma de consumo. También se prepara jalea y
mermelada, opciones agro industriales que permiten emplear las frutas sanas, con
características de apariencia externa no recomendada para el mercado de consumo
en fresco (Cerdas et al 2003).
La raíz de la planta tiene propiedades narcóticas y es considerada como emética;
Con la cocción de flores, hojas y/o raíces se obtiene una bebida tranquilizante y
relajante para dormir. Los frutos son considerados de los más agradables en la flora
americana, son refrescantes, laxantes y diuréticas, muy útil para el control de
cálculos y malestares del sistema urinario e intestinal, al igual que depura la sangre
12
(Cerdas et al 2003, Trujillo 1983). La infusión de las hojas de la planta se utiliza para
controlar la fiebre tifoidea (Nagy 1980).
La pasiflorita es un alcaloide muy usado como sedativo, el cual actúa en el sistema
nervioso. Por otra parte el jugo fresco de las hojas preparado con agua azucarada
es una bebida eficaz para tratar las fiebres biliosas (Trujillo 1983).
2.6 Problemas Agronómicos y de Cultivo
2.6.1 Plagas y Enfermedades
La granadilla es susceptible al ataque de plagas, dentro de las que sobresalen las
larvas masticadoras, que atacan las hojas de la granadilla y producen la defoliación
llegando a producir la muerte de la planta en algunas ocasiones (Benalcázar et al.
2001).
El factor más limitante del cultivo de la granadilla en Colombia lo constituyen las
enfermedades, dentro de las que se destacan principalmente la roña o antracnosis
producido por Glomerella cingulata, la secadera producida por Nectria
haematococca y más recientemente el virus de la hoja morada o mancha anular del
fruto atribuida a una cepa del virus del mosaico de la soya (Tamayo 2000).
La secadera es causada por el hongo Nectria haematococca, el cual es un habitante
natural del suelo, por lo que su control se realiza aplicando químicos al suelo donde
se va a sembrar. Este hongo ataca la granadilla por las heridas naturales que
presentan las raíces, sin embargo cuando estas heridas son causadas por el
trasplante, el efecto es más severo y rápido. De igual manera, el ataque de insectos
deja expuestas las superficies para el ataque del patógeno, favoreciendo de esta
forma la presencia de secadera en las ramas (Tamayo 2004).
13
El efecto que causa Nectria haematococca es la pudrición del cuello de la planta,
especialmente en condiciones de alta humedad al igual que puede invadir
sistemáticamente la planta a través de la raíces provocando síntomas de flacidez y
marchitez en los diferentes estados de desarrollo de la planta (Tamayo y Becerra
2004).
Por otra parte el cultivo se ve afectado por el hongo Oidium que está en el follaje
más joven de la planta, y se presenta cuando existen cambios bruscos de
temperatura y humedad en el ambiente (Benalcázar et al. 2001).
La maduración temprana de las flores y frutos y por ende su pudrición se da a causa
de Botrytis eata; este hongo se presenta principalmente en las flores y frutos en
desarrollo debido a la alta humedad por encajamiento o densidad de las ramas
(Benalcázar et al. 2001).
En los cuadros 2 y 3 se muestra un resumen de las enfermedades y plagas que
atacan al cultivo con su respectivo tratamiento biológico Tabla 2. Plagas que afectan el cultivo de granadilla (Passiflora ligularis)
Nombre común Nombre científico Tratamiento Dosis Gusano de los
brotes
Dionne juna Bacillus thuringiensis Polibia sp.
30 g / ha 50 individuos al
inicio de la infestación
Gusano del follaje
Dionne glycera Bacillus Thuringiensis
300 g / ha
Acaro rojo
Tetranychus urticae Acrinatrin Phytoseiulus
persimilis Feltiella sp.
1 lt / ha 100 individuos m2
50 individuos por m2 al
inicio de la infección Tomado de Benalcázar et al. 2001.
14
Tabla 3. Principales enfermedades que afectan el cultivo de granadilla (Passiflora ligularis) Nombre común
Nombre
científico Tratamiento Dosis
Antracnosis
Colletotrichum Gloeosporioides
Bacillus sp. Pseudomonas sp.
106 UFC / ml 107 UFC / ml
Pudrición de flores.
Botrytis cinerea Bacillus subtilis. Trichoderma koningii T. longibranchiatum
107 UFC / ml 106 - 108 UFC / ml 106 – 107 UFC / ml
Pudrición de las raíces
Fusarium oxysporum
Trichoderma hamatum. T. viride
107 UFC / ml 106 UFC / ml
Pudrición negra de la Raíz.
Pythium sp. Trichoderma Lignorum
105 UFC / ml
Pudrición limitada de la raíz.
Rhizoctonia solani
Streptomyces Griseoviridis
107 UFC / ml
Tomado de Benalcázar et al. 2001
2.7 Marcadores genéticos
En la actualidad se conocen tres tipos de marcadores; los marcadores morfológicos,
los bioquímicos, también conocidos como enzimáticos, y por último los marcadores
moleculares.
Los marcadores morfológicos son por lo general, características observables o
medibles, que resultan de la expresión de un número de genes y son dependientes
de la interacción con el medio ambiente, lo cual al momento de un análisis hace
difícil la interpretación de los datos, por lo que la probabilidad de encontrar
asociaciones con características agronómicas es baja (Rocha 2003).
2.7.1 Marcadores Moleculares
Los marcadores moleculares son definidos como secuencias de DNA, las cuales en
los últimos años se han convertido en una herramienta útil para la detección de la
diversidad genética, con su consecuente aplicación en programas de selección
genética de plantas asistida por marcadores. Los polimorfismos (variantes) a nivel
de DNA pueden ser detectados mediante técnicas moleculares (Rocha 2003).
15
Rocha (2003) plantea que estos fragmentos de DNA pueden ser físicamente
localizados dentro del genoma de un organismo. En ocasiones estos fragmentos
pueden encontrarse cerca de un gen que codifica una característica de interés,
aunque también pueden estar en una región no codificante. Una de las
características fundamentales de estos marcadores es que son específicos para
cada individuo, especie o grupos sistemáticos mayores. Dentro de las ventajas que
ofrecen estos marcadores es que no se ven afectados por el medio ambiente lo cual
los convierte en una herramienta útil para el análisis tanto de poblaciones como de
individuos (Karp et al. 1997).
Los marcadores morfológicos por su parte son todos aquellos atributos de las
plantas o características observables y cuantificables, resultantes de la expresión
de un número determinado de genes, los cuales pueden ser altamente heredables y
permiten la discriminación rápida de fenotipos (Demey et al. 2003).
Comparados con los marcadores moleculares, los marcadores morfológicos
presentan algunas desventajas, entre las que encontramos la dependencia directa
de la interacción con el medio ambiente para la expresión de los caracteres, lo cual
al momento de un análisis hace difícil la interpretación de los datos, por lo que la
probabilidad de encontrar asociaciones con las características agronómicas es baja
(Kurt et al. 2005, Rocha 2003).
Por otra parte los datos arrojados por estos marcadores son cuantitativos y
cualitativos limitando de esta manera la cantidad de caracteres evaluados en
comparación con las que se puede llegara a evaluar con los marcadores
moleculares (Kurt et al. 2005, Rocha 2003).
16
Aunque la descripción morfológica de los órganos vegetativos, reproductivos y
rasgos agronómicos han sido útiles para la caracterización y evaluación de los
recursos genéticos, estas descripciones se ven limitadas por la dependencia del tipo
de heredabilidad del carácter, ya que se puede presentar que una característica se
herede a través de poligenes, dominancia parcial o completa; Otra limitante dentro
de estos es el tiempo requerido para la evaluación completa de los mismos (Demey
et al. 2003).
Los marcadores bioquímicos, por su parte, son fundamentalmente isoenzimas las
cuales son generalmente utilizadas en estudios de identificación de genotipos y
estudios de genética de poblaciones. A pesar de que son marcadores
codominantes, es decir que diferencian entre homocigotos y heterocigotos en
organismos diploides, y que ésta es un técnica de bajo costo; la principal limitante
es el bajo número de enzimas disponibles para cada organismo, igualmente se ven
afectados por el ambiente, por lo que son unos marcadores inestables (Kurt et al.
2005, Rocha 2003).
Dentro de las ventajas de los marcadores moleculares encontramos la estabilidad,
permitiendo que sean detectados en todos los tejidos, independiente de la etapa de
desarrollo de la planta y carecen de efectos pleitrópicos y epistáticos, ya que no se
ven afectados por el medio ambiente (Stuber et al. 1999, Caetano-Anolles &
Trigiano 1997).
Actualmente los marcadores moleculares se emplean, para hacer más eficiente la
selección de plantas y de variedades que son utilizadas en programas de
mejoramiento genético (metodología que se conoce como selección asistida por
marcadores). Este tipo de selección hace posible la predicción de los genotipos a
obtener en un determinado cruce, con base en la información de los parentales
empleados. De igual forma los marcadores pueden ser utilizados para identificar
plantas individuales que contienen características de interés particular (Rocha
2003).
17
En la actualidad los estudios de mejoramiento genético y propagación masiva,
exigen el conocimiento de las variedades y los genotipos promisorios para que sean
utilizados con el fin de obtener cultivares de alta calidad. Varios marcadores
moleculares permiten establecer las diferencias existentes entre los individuos
comparando su DNA, entre los que se destacan los RFLP, RAPD, SSR, AFLP entre
otros, los cuales abren las posibilidades de generar huellas genómicas
(fingerprintings), de las especies de interés, útiles para la identificación genética de
individuos dentro de la misma especie (Bustamante et al. 2001, Dahlberg et al.
2002, Karp et al. 1997, Thompson et al. 1998).
Adicionalmente el grado de polimorfismo obtenido con los diferentes marcadores
moleculares es mayor comparado con los marcadores morfológicos y bioquímicos
La elección de un marcador molecular depende del objetivo que se busca, de la
estructura de la población, de la diversidad genómica de la especie que se va
analizar, de la disponibilidad del sistema y del tiempo requerido para el análisis.
Debido a que cada uno de los marcadores presenta ventajas y desventajas antes de
escoger algún sistema, es vital evaluar el potencial de utilidad que puede tener en
una población, especie o género, de igual forma se debe evaluar la eficiencia de la
técnica en la detección de polimorfismos (Staub et al. 1997).
2.7.2 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
La técnica PCR fue desarrollad por Kary B. Mullis en 1984, ésta permite obtener
millones de copias (in vitro) de un fragmento de DNA, el cual sirve como molde,
mediante la acción de la enzima taq polimerasa. Esta enzima aislada de Thermus
aqualticus, es una proteína termoestable, la cual polimeriza los nucleótidos de
manera fiel, permitiendo la formación de nuevas moléculas de DNA (Rocha 2003).
La amplificación del DNA mediante PCR, simplifica los procesos de clonaje, análisis
y modificación de ácidos nucleicos y se caracteriza por ser una técnica sencilla,
sensible y rápida. La cantidad de DNA requerido para la reacción es mínima. De
18
igual manera no se requiere previo conocimiento del material genético (Kurt et al.
2005). La mezcla de “primers”, DNA, dNTPs y taq es sometida a cambios de
temperatura que permiten separa las cadenas de DNA que tienen la secuencia de
interés, permitir que los “primers” encuentren la secuencia complementaria y la
cadena sea elongada, la repetición de estos ciclos permite la multiplicación
exponencial de la secuencia de interés (Erlich et al. 1992)
Componentes del método
La amplificación específica de las regiones de DNA se realiza mediante tres pasos
fundamentales que son: la desnaturalización de DNA, el anillamiento o hibridación
de “primers” específicos y por último, la elongación de la cadena
Desnaturalización del DNA: temperaturas elevadas (94°C) permiten que el DNA de
doble cadena se separe, quedando de esta manera DNA de cadena sencilla, el cual
es utilizado por la enzima taq polimerasa como molde para la síntesis de una nueva
cadena complementaria. Cuando se presenta una denaturación incompleta se da el
realineamiento de las cadenas lo cual se ve reflejado en la disminución del producto;
cuando este ciclo es muy prolongado la enzima pierde actividad (Erlich et al. 1992,
Kurt et al. 2005).
Anillamiento: en este paso la temperatura disminuye (50- 65°C) para permitir el
apareamiento de los “primers” con las cadenas sencillas de DNA. Los “primers” son
cadenas de DNA, generalmente complementarias al extremo del fragmento que se
quiere amplificar. Si la temperatura es muy alta el anillamiento no sucede, pero
cuando es muy baja se presenta anillamientos inespecíficos. Generalmente esta
temperatura depende de la composición de las bases, longitud y concentración de
los “primers” (Kurt et al. 2005).
Elongación de la cadena: teniendo el DNA de cadena sencilla y el “primer” como
cebador, la taq polimerasa empieza el proceso de elongación o copia, añadiendo
deoxinucleótidos en el extremo 3´ al “primer”, esta etapa se da a 72°C para evitar el
anillamiento inespecífico de los “primers” (Erlich et al 1992, Kurt et al. 2005).
19
2.8 RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) La técnica de RAPD, desarrollada paralelamente por Welsh y Mc Clelland (1990) y
Williams et al. (1990) tiene como base la reacción en cadena de la polimerasa o
PCR (Polymerase Chain Reaction). Esta técnica involucra la utilización de “primers”
arbitrarios cortos (10 nucleótidos), que amplifican segmentos aleatorios dentro del
genoma generando de tres a diez puntos de información por cada muestra
analizada (Williams 1990). Los productos de esta amplificación son separados en
geles de agarosa al 1.5%, teñidos con bromuro de etidio y son visualizados bajo
rayos ultravioleta (Tingey et al. 1992).
Este se caracteriza por ser un marcador dominante, por lo que los polimorfismos
que se observan son el resultado de inserciones, deleciones o cambio de un solo
nucleótido en la cadena molde que alteran la secuencia en uno o los dos puntos de
homólogia con el “primer”, y se hacen visibles por la presencia o ausencia de una
banda. Como resultado se obtienen patrones electroforéticos con bandas de
diferentes tamaños correspondientes a múltiples locus, que forman una huella
genética (Tingey et al. 1992)
Esta técnica es útil para detectar polimorfismos para el mapeo genético, estudios
filogenéticos, y estudios de genética de poblaciones; al igual que para determinar el
nivel de distribución genética entre y dentro de las poblaciones (Anand 1998).
2.8.1. Ventajas del Método
Los marcadores RAPD se caracterizan por no requerir información previa de la
secuencia de DNA para el diseño de “primers” específicos, por lo que se utilizan
“primers” universales. Es un proceso rápido, sencillo, automatizable, para el cual se
requiere poca cantidad de DNA.
Sin embargo esta técnica se puede ver afectada por diferentes factores como la
concentración del “primer”, la temperatura de anillamiento del “primer” y la baja
calidad de DNA (Caetano-Anolles & Trigiano 1997, De Vicente et al. 2003).
20
2.9 Marcadores AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
La técnica del polimorfismo en la longitud del fragmento amplificado (AFLP) hace
uso de la huella genómica del DNA. Esta huella es usada para visualizar los
polimorfismos del DNA entre las diferentes muestras que se analizan. De igual
manera estos pueden ser usados para evaluar la relación existente entre estas
muestras. Por otra parte se utilizan como fuente de marcadores moleculares para
generar mapas de ligamento (Mueller et al. 1999).
La técnica de AFLP, se basa en la detección de fragmentos de restricción por
amplificación de PCR (Segura 2002; Vos et al. 1995). Los AFLP son una
herramienta útil para determinar la identidad de una muestra específica de DNA,
para asegurar la relación entre muestras o para identificar marcadores moleculares
asociados a rasgos fenotípicos y/o loci genéticos (Invitrogen 2003)
Los marcadores AFLP se caracterizan por combinar dos técnicas, una de ellas los
RAPD, basados en la amplificación de fragmentos de DNA, utilizando “primers”
arbitrarios y los RFLP basados en la hibridación con sondas específicas, y el corte
o digestión con enzimas de restricción. Por esta razón los AFLP presentan varias
ventajas, entre las que se encuentran, el no requerir información previa de la
secuencia a analizar y la sensibilidad que permite la detección de fragmentos de
baja abundancia (Echenique et al. 2004).
Se plantea que esta técnica se divide en cuatro pasos fundamentales: digestión,
Ligación, Pre-amplificación y amplificación, estos dos últimos son tomados como
una solo por muchos autores.
Digestión: Se lleva a cabo por medio de dos enzimas específicas de restricción,
una de ellas es de corte raro y la otra de corte frecuente (Vos et al. 1995, Blears et
al. 1998). La utilización de dos enzimas de restricción es justificada por Vos et al
(1995), debido a que los fragmentos que generan estas enzimas, están en un rango
de tamaño ideal, tanto para ser amplificados como para ser separados en el gel de
acrilamida.
21
Ligación: Los fragmentos generados en la digestión, son ligados, mediante una
ligasa, a adaptadores específicos para cada enzima de restricción con el fin de
generar secuencias conocidas para la amplificación.
Generalmente estos adaptadores son “primers” de doble cadena, complementarios
a la secuencia de corte de las enzimas; estos están diseñados de tal manera que la
ligación de un fragmento a un adaptador no reconstituye los sitios de restricción
(Blears et al. 1998).
La secuencias terminales en cada fragmento adaptado están conformadas por la
secuencia del adaptador y el remanente de la secuencia del sitio de restricción, las
cuales sirven para la unión de los “primers” (Blears et al. 1998, Muller et al. 1999).
Pre amplificación (PRC + 1): Se realiza una primera PCR (preselectiva), usando
cebadores oligonucleótidos complementarios al adaptador y a los sitios de
restricción, más un nucleótido selectivo (Blears et al. 1998)
Amplificación selectiva: Los productos de la amplificación preselectiva se someten
a otra PCR, y nuevamente se selecciona un subconjunto de fragmentos.
Generalmente, en la segunda amplificación selectiva se agregan dos nucleótidos
más a los “primers”
2.9.1. Ventajas del Método
La cantidad de DNA requerida es poca, debido a que combina la generación de
fragmentos por medio de enzimas de restricción y la amplificación con PCR.
El número de polimorfismos por reacción es mayor que el obtenido con RFLP,
puesto que genera un mayor número de bandas. Por otra parte no es necesario
conocer las secuencias del genoma de la especie estudiada. (Vos et al. 1995,
Blears et al. 1998, Muller et al. 1999).
22
De igual manera Vos et al (1995) plantea que la preamplificación seguida de una
amplificación disminuye el ruido de fondo en la lectura, puesto que se eliminan
bandas que son producto de errores en el apareamiento de los “primers”, lo cual
sucede cuando se hace una amplificación, al igual se reduce el número de
fragmentos amplificados, por esto es altamente reproducible.
Durante el aislamiento y purificación de DNA genómico de plantas pueden surgir
una serie de problemas que disminuyen la calidad y cantidad del DNA y pueden
afectar las reacciones enzimáticas lo cual influye en la calidad de los productos
amplificados por PCR (Weising et al. 2005)
Debido a que la composición bioquímica de tejidos y especies vegetales varia
considerablemente es difícil contar con un único protocolo de extracción que pueda
servir para todas las especies de plantas especies cercanamente relacionadas
puede requerir diferentes procedimientos de extracción de DNA. (Weising et al.
2005)
2.10. Extracción de DNA a partir de tejido vegetal
Generalmente el trabajo en biología molecular requiere en principio del aislamiento
del ácidos nucleicos (DNA, RNA) y es necesario que estos sean de alta calidad y
cantidad. El aislamiento de DNA genómico es esencial para muchas de las
aplicaciones en técnicas de biología molecular, incluidas la digestión con enzimas
de restricción, análisis de southernblot, construcción de librerías genómicas,
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), entre otras (Michiels et al. 2003). Es
por esto que se han planteado diferentes protocolos para su aislamiento.
Cada una de estas metodologías de extracción presenta una lisis celular, donde un
detergente (SDS, CTAB) se encarga de solubilizar proteínas, tejidos y membranas
al igual que solubiliza polisacáridos (Michiels et al. 2003).
Sin embargo después de este proceso, en el DNA extraído se encuentra un alto
contenido de metabolitos secundarios como fenoles y polisacáridos que pueden
23
afectar la reacción de PCR, inhibiendo la acción de de la polimerasa (Rogers et al.
1995). Es por esto que dentro de los protocolos de extracción se encuentra la
utilización de sales, que precipitan los polisacáridos; de igual manera se hace uso
de solventes orgánicos como el fenol cloroformo y cloroformo isoamílico para
eliminar compuestos fenólicos, con el fin de obtener un DNA de alta calidad que
pueda ser amplificado (Roger 1996, Vroh et al. 1996).
La pureza del DNA extraído puede ser evaluada mediante espectrofotometría, la
cual mide la relación de la absorbancia A260/A280, si está entre 1.7 – 2.0 el DNA es
de alta pureza y no está acompañado de otras moléculas contaminantes; una
relación mayor a 2.0 indica que en la muestra se encuentra RNA; y si la relación es
menor de 1,7 existe la posibilidad de encontrarse en la muestra proteínas u otros
contaminantes como fenoles, compuestos orgánicos entre otros (Brown, 2000;
Davis et al. 1994 ).
2.11. ANÁLISIS ESTADÍSTICO APLICADO A LOS ESTUDIOS DE DIVERSIDAD
Dependiendo el problema que se desea resolver y el tipo de información molecular
recolectada, se pueden escoger las herramientas interpretativas que más se
ajusten.
Generalmente en los estudios de diversidad genética, se trabajan con variables
cualitativas de tipo binario. En este caso la variable maneja dos estados, presencia
(1) y ausencia (0)
Distancia y similitud genética
La distancia genética entre dos secuencias, individuos o taxa, es definida como un
estimativo cuantitativo de la divergencia genética que puede existir entre estos.
Inverso a esto se habla de similitud genética. De esta manera cuando la distancia
genética es baja la similitud genética es alta (Page 1998).
24
2.11.1 Coeficientes de Asociación
Estos coeficientes permiten medir las coincidencias y diferencias en los estados de
caracteres entre dos características o OTU “operacional Taxonomic Unit”. Para la
aplicación de estos índices se requieren datos doble estado (Crisci et al. 1983)
Al comparar dos OTU, A y B, para un carácter doble estado (presencia- ausencia),
se presentan cuatro posibilidades:
1. Ambas OTU Presenten el carácter comparado (a)
2. Ambas OTU tenga ausente el carácter comparado (d)
3. La primera OTU tenga el carácter presente y la segunda lo tenga ausente (b)
4. La primera lo tenga ausente y la segunda lo tenga presente (c)
Al pasar cada una de estas posibilidades a una matriz de dos por dos se obtiene la
siguiente representación (Figura 2).
Figura 2. Representación de las posibles combinaciones de las OTU. Tomado de IPGRI y Cornell University, 2004
25
Dentro de los múltiples coeficientes de asociación existentes los que se muestran a
continuación son los más utilizados en estudios de diversidad genética con
marcadores moleculares.
2.11.1.1 Coeficiente de asociación de Jaccard (CAJ)
Solamente cuenta las bandas presentes para cualquiera de los individuos (‘i’ o ‘j’).
Las ausencias dobles se consideran como datos ausentes, esto como elemento a
favor de la similitud. Si se presentan falsos positivos o falsos negativos, la
estimación del índice tiende a ser sesgada (Crisci et al. 1983).
Puede aplicarse con datos de marcadores codominantes. Los valores de la similitud
que se obtienen a partir de la aplicación de este coeficiente varia entre 0 (mínima
similitud) y 1 (máxima similitud) (Crisci et al. 1983)
CAJ = a
———— a + b+c
2.11.1.2 Coeficiente de Dice (SD)
En este coeficiente se le da mayor peso a las coincidencias, es decir a los
caracteres que están presentes en las dos OTU. Considera que la ausencia tiene
menor importancia biológica y, de esta manera, este coeficiente tiene un significado
completo en función de la similitud del DNA. Los valores varían entre 0 y 1, lo cual
equivale a los valores de mínima y máxima similitud, respectivamente (Crisci et al.
1983. I PGRI y Cornell University, 2004).
SD = 2 a ———— 2 a + b+ c
26
UPGMA (unweighted pair – group method using arithmetic averages)
Este es un análisis de agrupamiento computacional, comúnmente empleado, el cual
analiza grupos cercanos, teniendo en cuenta el valor de similitud genética. Las
figuras obtenidas mediante este método consisten en un algoritmo que se utiliza
para establecer las relaciones genético poblacionales, agrupando las poblaciones
de acuerdo a las bandas en cada una de las especies. Donde aquellas que
comparten más bandas son las más cercanas y forman un grupo (Crisci et al. 1983).
2.12. ESTADO DEL ARTE DEL GENERO PASSIFLORA
En Colombia y a nivel internacional son varias las instituciones que se han
interesado en realizar estudios en las diferentes especies del género Passiflora,
debido a la importancia económica y farmacológica que representan.
En la Unidad de Biotecnología Vegetal de la Pontificia Universidad Javeriana, se
destacan en el campo de cultivo In Vitro el trabajo realizado por Becerra (2003)
donde se evaluó el efecto del origen del material vegetal y la edad sobre la
capacidad morfogenética, de dos especies de Passifora (P. edulis y P. mollissima)
cultivados In Vitro, para lo cual se utilizó medio Murashige & Skoog suplementado
con reguladores de crecimiento. Se observó un mayor número de brotes por disco
foliar para P. edulis de plantas de 1 y 2 meses de edad del material cultivado en
invernadero, mientras que para P. mollissima el mayor número de brotes se
presentó con las plantas de invernadero que estaban entre los 2 y 3 meses de edad.
Por lo que se concluye que para cada una de las especies el material que mejor
respuesta morfogenética tiene es el cultivado en invernadero (Becerra 2003)
Ovalle (1995) evaluó la organogénesis In Vitro de Passiflora mollissima y Passiflora
ligularis a partir de discos foliares; en este trabajo se establecieron las condiciones
de cultivo para lograr la regeneración de brotes para P. mollissima y la regeneración
de callos de P. ligularis a partir de discos foliares, en diferentes medios. Malaver
(2000) evaluó algunos factores en el cultivo de anteras de Passiflora edulis.
27
García (1993) realizó una comparación de material parental y micropropagado de
maracuyá (P. edulis), mediante electroforegramas de proteínas totales y esterasa.
Según los resultados se planteó que las esterasas son indicadores indirectos de
estabilidad genética más eficiente que las proteínas
De igual manera se han desarrollado trabajos en transformación genética en el
género Passiflora con P. mollissima a partir de discos foliares infectados con
Agrobacterium tumefaciens (Leal 2002). Forero (1999) evaluó las condiciones para
la transformación genética de la curuba de castilla usando Agrobacterium
tumefaciens; de igual manera se destacan los trabajos realizados por Hodson &
Góngora 1999 y Cancino 2000, 1994.
A nivel molecular Rodríguez (2001), empleó fragmentos de restricción para evaluar
los marcadores moleculares como herramienta en estudios de taxonomía y filogenia
en Passiflora, donde se evaluaron las relaciones existentes entre 12 especies de
Passiflora a partir de los patrones generados por la combinación de sondas
provenientes de distintos genomas y cuatro enzimas. Al realizar el análisis las
especies trabajadas se agrupan en cuatro subgéneros: Passiflora, Tacsonia,
Decaloba y Dysosmia, lo cual coincide con la taxonomía tradicional; de igual manera
se encontró que la mayor diversidad se encuentra en el subgénero Passiflora.
Por otra parte Varón (2000) desarrolló el estudio de detección de polimorfismo en
regiones amplificadas de cpDNA, mtDNA y rDNA de Passiflora utilizando enzimas
de restricción con 11 especies del género; encontrando bandas polimórficas en los
tres genomas, siendo las regiones de DNA de cloroplasto las que ofrecen un mayor
porcentaje de polimorfismo, al contrario de las regiones de DNA mitocondriales que
son las menos polimórficas. Al realizar el análisis de agrupamiento; con el genoma
de cloroplastos evidenció mejor las relaciones taxonómicas en el género Passiflora
(Varón 2000).
Vargas (2000) estudió las relaciones filogenéticas de especies del genero Passiflora
haciendo énfasis en el subgénero Tacsonia a partir de RFLP, utilizando dos
genomas (cpDNA y mtDNA). De acuerdo con los resultados el árbol resultante de
28
RFLP cpDNA fue el más concordante de acuerdo con estudios realizados
anteriormente con base en caracteres morfológicos.
Otros trabajos moleculares que se destacan son los realizados por el programa
nacional de recursos genéticos de CORPOICA (Fajardo et al. 1998; Sánchez et al.
1999). En 1998 Fajardo et al desarrollaron el análisis de variación genética del
género Passiflora L. utilizando marcadores RADP, donde se evaluaron catorce (14)
especies con 50 “primers” aleatorios, dando como resultado 626 bandas
polimórficas; al realizar el análisis se observó que P. ligularis y P. adenopoda
muestran una amplia variación intraespecifica, contrario a lo que se observa con P.
edulis y P. maliformis (Fajardo et al. 1998).
A nivel filogenético se han realizado estudios en el género Passiflora (Muschner et
al. 2003), donde se analizaron 61 especies del género Passiflora, que generalmente
se encuentran clasificadas en 11 subgéneros. Este estudio se realizó usando dos
segmentos de DNA no codificantes (ITS and the plastid trnL-trnF), se utilizaron
estas secuencias debido a su alta tasa de sustitución de nucleótidos (Muschner et
al. 2003).
Crochemore et al (2003) evaluaron la diversidad genética en Passion fruit
(Passiflora spp.) mediante marcadores moleculares RAPD. Para lo cual utilizo 11
especies de este género; se encontró que utilizando solo cinco “primers” se
producían 136 bandas polimórficas; permitiendo de esta manera evidenciar un alto
nivel de disimilaridad entre la especies evaluadas dando como resultado tres
grandes agrupaciones. Teniendo como base estos mismos marcadores De
Andrade et al (2002) evaluaron la variación genética existente entre las especies de
Passiflora. Haciendo uso de 21 “primers”, que generaron 270 productos diferentes
de amplificación; se obtuvo como resultado que la similaridad entre las especies de
Passiflora es del 17,3%, mientras que el valor de similaridad entre P. edulis Sims y
P.endulis Sims f. flavicarpia fue de 34.35%.
29
Segura et al (2002) realizaron el estudio de diversidad del genero Passiflora en el
sub genero Tacsonia utilizando AFLP, haciendo uso de dos combinaciones de
primers que generaron de 34 a 80 fragmentos por genotipo para un total de 260
fragmentos, las bandas observadas contribuyeron a revelar el polimorfismo global
dentro del género evidenciándose de esta manera la gran diversidad existente en
este. El mayor grado de polimorfismo fue observado en P. mixta de donde el 100%
de las bandas son polimórficas seguida de la cultivariedad P. tripartita var.
Mollissima con 84 %.
En el estudio realizado por Sanchez et al (1999), se obtuvo como resultado un alto
nivel de polimorfismo intraespecífico en P. ligularis, P. maliformis y P. edulis dando
bases para el mejoramiento genético de estas especies. Por otra parte el
subgénero Tacsonia, presenta rangos de similaridad más estrechos, insinuando un
importante flujo de genes por hibridizaciones interespecíficas, con importantes
implicaciones para la taxonomía actual.
30
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
3.1 Problema y justificación La granadilla, Passiflora ligularis es una fruta originaria de América Tropical que se
cultiva desde el norte de Argentina hasta México, en zonas cuya temperatura varía
entre los 14°C y 22°C. Esta fruta presenta características importantes que la hacen
llamativa para el consumo y su comercio, tales como el alto contenido de calorías, y
alto contenido de calcio, fósforo y vitamina C. La principal forma de consumo de
estos frutos es en fresco, puesto que su procesamiento es difícil por la fragilidad de
sus semillas, que no son fáciles de retirar del arilo o pulpa. La granadilla en el
comercio internacional ha ganado importancia gracias a las campañas de consumo
de productos exóticos que vienen realizando los países productores de la fruta a
escala mundial, entre los que se encuentran Colombia, Ecuador y Venezuela (CCI
2003).
Tradicionalmente, los principales departamentos productores de granadilla en
Colombia han sido Valle del Cauca y Antioquia, que en 1998 produjeron
aproximadamente el 88% del total de la producción colombiana. Sin embargo, para
1999 esta participación se redujo a 68%, por la disminución del área sembrada en
Antioquia, donde el cultivo prácticamente desapareció, al pasar de 757 ha en 1998 a
30 ha en 1999 (MADR 2004).
Actualmente la producción de granadilla en Colombia se concentra en los
departamentos de Huila, Risaralda, Valle del Cauca, Cundinamarca, Tolima y
Boyacá (MADR 2006), siendo Huila el que tiene la proporción más alta de
producción (44%), seguido de los departamentos de Risaralda (16%) y Valle del
Cauca (14%). En el departamento de Antioquia la producción se ha reducido a un
0.8% (MADR 2006).
31
La granadilla además de presentar un mercado interno activo, se exporta a
diferentes países, con beneficios arancelarios que la ponen en una situación
ventajosa frente a otros productos. A pesar de las ventajas socio-económicas del
cultivo, como la generación de empleos y la alta tasa de retorno, hasta el momento
no existen investigaciones que permitan el desarrollo de un paquete tecnológico
para el fomento de esta especie.
La reducción del área sembrada en granadilla por localidad, la pérdida de diversidad
del cultivo por problemas fitosanitarios y la consecuente disminución de la
producción para competir en el mercado nacional e internacional, exige una serie
de investigaciones dentro de las cuales se debe identificar el nivel de diversidad
genética de la granadilla en las zonas donde se concentra su producción.
Las técnicas de biología molecular y en particular el uso de marcadores
moleculares, han permitido conocer y caracterizar el contenido genético de los
organismos, así como estimar la diversidad y las relaciones entre los grupos de
interés (Phillips-Mora 1995). Uno de los usos más generalizados de los marcadores
moleculares en los programas de mejoramiento genético es la identificación y la
selección de individuos (O´Malley et al. 1996), esto hace la selección más confiable
y precisa.
Para llevar a cabo la caracterización molecular de cualquier especie se requiere de
la estandarización de protocolos de extracción DNA y amplificación como un paso
esencial para el análisis posterior de las muestras. Este trabajo tiene como finalidad
estandarizar estos protocolos para la caracterizaron molecular de los materiales
cultivados de granadilla provenientes del eje cafetero Colombiano.
32
4. PREGUNTA DE INVESTIGACION ¿Existe diferencia en la diversidad genética de materiales cultivados de Passiflora
ligularis provenientes del eje cafetero Colombiano?
4.1 HIPÓTESIS No hay una diferencia genética entre los materiales cultivados de Passiflora ligularis
provenientes del eje cafetero Colombiano
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo General
Caracterizar molecularmente los materiales cultivados de Passiflora ligularis
provenientes del eje cafetero Colombiano
5.2 Objetivos Específicos
Definir un protocolo de extracción de DNA, para evaluación con marcadores
moleculares, de granadilla (Passiflora ligularis) provenientes del eje cafetero
Definir las mejores condiciones para la amplificación de DNA de materiales
cultivados de Passiflora ligularis con marcadores moleculares RAPD y AFLP
6. MATERIALES Y METODOS
Este trabajo es la etapa preliminar del estudio sobre diversidad genética de
granadilla (Passiflora ligularis), que hace parte del proyecto “Valoración de Bienes y
Servicios Ambientales de la Biodiversidad para el Desarrollo Sostenible de Paisajes
Rurales Colombianos, Complejo Eco regional Andes del Norte (CEAN)” desarrollado
en el laboratorio de biología molecular de la Unidad de Biotecnología Vegetal de la
Pontificia Universidad Javeriana, el cual tiene como fin establecer los protocolos
para extracción de DNA y amplificación mediante marcadores moleculares RADP y
AFLP. Este estudio fue desarrollado en cuatro etapas que se muestran en la (figura
3).
33
M E T O D O L O G I A
FASE DE CAMPO
FASE DE LABORATORIO
Selección De
Fincas Muestreadas
Definición Protocolo de Extracción de DNA
Marcadores RAPD
Marcadores AFLP
Selección De Individuos
Del
lapo
rta
Del
lapo
rta I
Mc
Cou
ch I
Mc
Cou
ch
D
ella
porta
II
Doy
le &
Doy
le
Digestión
PCR con Diferentes “Primers”
Toma y Conservación De La Muestra
Evaluación de la Calidad y Cantidad de DNA en Gel de Agarosa al 0.8%
Ligación
Preamplificación
Recolección De Datos
Geográficos y observaciones
Fenotípicas del material
Cuantificación de DNA por
espectrofotometría
Amplificación
Selectiva
Evaluación de Amplificación
en Gel de Agarosa al
1.5%
Comprobación
de Amplificación
en Gel de Acrilamida al
6% Figura 3. Diagrama de Síntesis de la metodología
34
6.1 Fase de Campo
La fase de campo se llevó a cabo en los departamentos de Quindío, Risaralda,
Caldas y Tolima, en donde se seleccionaron 3 individuos de Passiflora ligularis por
finca, para un total de 90 individuos, pertenecientes a 29 predios. En cada una de
las fincas se tomaron los datos de la ubicación (anexo 1) y las observaciones
pertinentes según el formato de campo (anexo 10).
6.2 Material utilizado
En cada uno de los predios se colectaron hojas jóvenes y sanas de cada uno de los
individuos seleccionados, de las cuales unas muestras fueron almacenadas en
bolsas sellables con sílica gel y conservadas a temperatura ambiente (tejido seco),
para evitar la oxidación del material y garantizar una buena calidad de DNA. Otra
parte de las muestras fue almacenada en bolsas sellables con sílica gel y
conservadas en frio (tejido conservado en frio). El material colectado fue trasladado
al laboratorio y almacenado a -70º hasta su procesamiento. El tejido foliar
conservado en frio y el tejido seco fue macerado con nitrógeno liquido y almacenado
hasta su utilización
6.3 Fase de Laboratorio
6.3.1 Estandarización del protocolo de extracción de DNA
Para la extracción de DNA a partir de tejido seco se probaron seis protocolos
reportados en la literatura para el género Passiflora con los cuales se obtuvieron
buenos resultados (anexo 2)
1. Dellaporta (1983)
2. Doyle & Doyle (1987)
3. Mc Couch et al. Modificado I (1988)
4. Mc Couch et al. (1988)
5. Dellaporta modificado I (Gonzales et al. 1995)
6. Dellaporta modificado II.
35
6.3.2 Diseño experimental
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos con el tejido seco, para la extracción
de DNA a partir de tejido conservado en frio se probaron los protocolos 2 (Doyle &
Doyle 1987) y 3. (Mc Couch et al. Modificado I 1988).
El ensayo de extracción de DNA se realizó bajo la estructura de un diseño
experimental completamente al azar con arreglo factorial de 2 x 2. La variable
dependiente o de respuesta para el análisis de los datos se definió como la cantidad
y calidad de DNA.
Los factores evaluados fueron el método de extracción de DNA y el tipo de tejido. El
factor método se codificó como (A) y sus dos niveles, protocolos de Doyle & Doyle y
Mc Couch se codificaron como 1 y 2 respectivamente. El factor tipo de tejido se
codificó como (B) y sus dos niveles, conservado en frio y seco, se codificaron con 1
y 2, respectivamente (Tabla 4).
Tabla 4 .Factores, niveles y tratamientos evaluados para la extracción de DNA de Passiflora ligularis
Factor del diseño Niveles del factor Código TratamientosMétodo de extracción (A) Doyle & Doyle (1) A1 A1B1
Mc Couch (2) A2 A1B2 Tipo de tejido (B) Conservado en frio (1) B1 A2B1
Seco (2) B2 A2B2
6.4 Cuantificación de DNA
El DNA extraído en cada uno de los protocolos se corrió en un gel de agarosa al
0.8% teñido con bromuro de etidió (BEt 0.5 µg/ml). Estos geles fueron visualizados
en un transiluminador UV y documentados en el DocXR System de Biorad®.
El DNA se cuantificó usando el espectrofotómetro Beckman Du® 530, a través del
cual además se obtuvo una estimación de la pureza de DNA a través de la relación
de la densidad óptica de absorbancia A260/A280 nm.
36
6.5 RAPD (DNA polimórfico amplificado al azar)
Para el análisis por medio de marcadores moleculares RAPD se realizó una prueba
de amplificación preliminar con los tres individuos recolectados por finca y una
cuarta muestra que es la combinación del DNA de todos los individuos (pool); al
realizar la evaluación de la amplificación, en el pool se obtuvo el promedio de las
bandas de todos los individuos, lo cual nos indica que no se está perdiendo
información. Por lo que se decidió trabajar con el pool de cada una de la fincas.
Para cada uno de los predios evaluados se preparó una muestra mixta (pool)
combinando 2µl (aproximadamente 0.10 ng) de cada una de las extracciones de
DNA de los individuos del predio. De esta manera se obtuvieron 29 procedencias
para el análisis genético. Para establecer las condiciones óptimas de amplificación
se trabajó con 4 de estas procedencias (1.Salento – Quindío; 2.Calarcá – Quindío;
3. Génova – Quindío; 4. Santa Rosa – Risaralda).
Se establecieron las condiciones para la amplificación del DNA (PCR), teniendo en
cuenta las concentraciones de cloruro magnesio (MgCl2) y DNA reportadas
anteriormente para el género Passiflora (Tabla 5).Para la definición de las
condiciones de amplificación se realizaron tres repeticiones con cada una de las
variables. Tabla 5. Concentraciones de MgCl2 y DNA evaluadas
Concentración
MgCl2
2.25mM 2,5mM 2.75mM
Concentración de
DNA
20ng/µl 25 ng/µl 30ng/µl
Adicionalmente se probaron tres perfiles de amplificación, con el fin de ajustar las
condiciones de anillamiento (Tabla 6)
37
Tabla 6. Perfiles de amplificación de DNA Ciclos Perfil 1 Perfil 2 Perfil 3
Pre denaturación 94° C x 5 min 94° C x 5 min 94° C x 5 min
Denaturación 94° C x 1 min 94° C x 30 seg 94° C x 30 seg
Anillamiento 36° C x 1min 42° C x 30 seg 40° C x 30 seg
Extensión 72° C x 1,5 min 72° C x 1min 72° C x 1min
Paso 2-4 40 ciclos 45 ciclos 34 ciclos
Extensión final 72° C x 5min 72° C x 5 min 72° C x 5 min
Terminación 10°C 10°C 4° C
Teniendo establecidas las condiciones de amplificación fueron evaluados 33
“primers” de Operon® (compuestos cada uno por 10 bases nucleotídicas al azar)
(Tabla 7), previamente reportados en la literatura para estudios de diversidad
genética en el género Passiflora, como los que presentan mayor grado de
polimorfismo. Los productos amplificados fueron visualizados en geles de agarosa al
1.5%, teñidos con bromuro de etidio; visualizados en un transiluminador de luz UV y
documentados en el DocXR System de Biorad® (Anexo 8).
Tabla 7. “Primers” Opreron utilizados para el análisis de Passiflora ligularis mediante RAPD
Descripción Secuencia
OPA 1 5´-CAGGCCCTTC-3´
OPA 3 5´-AGTCAGCCAC-3´
OPA 10 5´-GTGATCGCAG-3´
OPA 13 5´-CAGCACCCAC-3´
OPA 19 5´-CAAACGTCGG-3´
OPB 8 5´-GTCCACACGG-3´
OPB 5 5´-TGCGCCCTTC-3´
OPB 6 5´-TGCTCTGCCC-3´
OPB 12 5´-CCTTGACGCA-3´
OPB 4 5´-GGACTGGAGT-3´
OPB 11 5´-GTAGACCCGT-3´
OPB 18 5´-CCACAGCAGT-3´
38
OPB 20 5´-GGACCCTTAC-3´
OPB 14 5´-TCCGCTCTGG-3´
OPAB 11 5´-GTGCGCAATG-3´
OPAB 5 5´- CCCGAAGCGA-3´
OPAC 4 5´-ACGGGACCTG-3´
OPAC 7 5´-GTGGCCGATG-3´
OPAC 10 5´-AGCAGCGAGG-3´
OPAD 14 5´-GAACGAGGGT-3´
OPAD 10 5´-AAGAGGCCAG-3´
OPAD 4 5´-GTAGGCCTCA-3´
OPAN 8 5´-AAGGCTGCTG-3´
OPAN 5 5´-GGGTGCAGTT-3´
OPAN 17 5´-TCAGCACGG-3´
OPAH 5 5´-TTGCAGGCAG-3´
OPAH 10 5´-GGGATGACCA-3´
OPAM 13 5´-CACGGCACAA-3´
OPAM 10 5´-CAGACCGACC-3´
OPAA 6 5´-GTGGGTGCCA-3´
OPAG 8 5´-AAGAGCCCTC-3´
OPAM 4 5´-GAGGGACCTC-3´
6.6 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
El nivel de polimorfismo del DNA fue también analizado mediante AFLP, para lo cual
se utilizo el “kit” AFLP Analysis system, de Invitrogen®, siguiendo las
recomendaciones del fabricante, evaluando cuatro individuos (1 y 2. Calarcá –
Quindío; 3 y 4. Cajamarca – Tolima) Este proceso constó de cuatro pasos
fundamentales:
39
Digestión del DNA Antes de iniciar la digestión todos los DNA se llevaron a una concentración de
100ng/ml. Se utilizaron dos enzimas de restricción suministradas en el “kit”, MseI de
corte frecuente que reconoce cuatro pares de bases en el sitio de corte y otra de
corte raro, EcoRI, que reconoce seis pares de bases en el sitio de corte. Para esta
reacción se utilizó buffer 5X a una concentración final de 1X, 1µl de las enzimas
EcoRI/MseI y agua hasta un volumen final de 12,5µl por cada muestra. A esto se le
adicionó DNA a una concentración final de 40ng /µl.
Esta mezcla se incubó a 37ºC durante dos horas, luego se inactivó por 15 minutos a
70ºC. Las muestras fueron colocadas en hielo hasta alcanzar 4ºC.
Ligación del DNA
En este paso se unieron los adaptadores específicos a los sitios cohesivos que se
obtuvieron de la digestión con enzimas, con el fin de generar secuencias conocidas
para la amplificación. La mezcla de ligación contenía 12µ de la solución de
adaptadores más 0,5 µl de la enzima T4 ligasa, para un volumen total de 12,5 µl por
reacción. Esta se le agrego a la reacción anterior y luego fue incubada por dos
horas a 20ºC. De la mezcla de la digestión-ligación se realizó una dilución 1:5 en
TE.
Preamplificación (PCR +1) Para la amplificación se utilizaron “primers” con secuencias complementarias a cada
uno de los “primers” más una base adicional en el extremo 3’. Aquí solo se
amplificaron los fragmentos en los cuales el nucleótido que flanquea el sitio de
restricción es complementario al nucleótido seleccionado.
La mezcla utilizada para esta reacción contenía DNA a una concentración final de
50ng/µl, 20 µl de pre-amp primer mix, PCR buffer AFLP 1X de concentración final y
taq polimerasa a 0.04 U/µl en un volumen final de 25µl
40
Con esta mezcla se realizó la PCR, en un termociclador MJ research PTC 100,
utilizando el siguiente perfil de amplificación: 94ºC por 30 segundos, 56ºC por 60
segundos y 72ºC por 60 segundos, por 20 ciclos.
Luego de esto se verificó la amplificación corriendo 10µl del amplificado en un gel de
agarosa al 1% (anexo 9), después se realizaron diluciones 1:50 con TE, las cuales
se utilizaron en la amplificación selectiva.
Amplificación selectiva (PCR+2 /+3)
Para esta amplificación se utilizaron “primers” que poseen la misma secuencia de
los “primers” de preamplificación más dos bases de selección en los extremos 3’.
Para este paso se requirió preparar dos mezclas, la primera contenía “primer”
EcoRI a una concentración final de 0.278 ng/µl, “primer” MseI 1,50ng/µl de
concentración final y agua para un volumen final de 5µl por reacción. La segunda
reacción contenía buffer 10X PCR a una concentración final de 1X, taq polimerasa
0.02 U/µl y agua para un volumen final de 10 µl. Luego para cada reacción se
mezclaron 5µl de la mezcla 1, 10µl de la mezcla 2 y 5µl de la dilución de la PCR +1.
La amplificación de DNA se realizó en un termociclador MJ research PTC 100, con
el siguiente perfil de amplificación: un ciclo inicial de 30 segundos a 94ºC, 30
segundos a 65º C y 60 segundos a 72ºC. Posteriormente se repitieron 25 ciclos,
reduciendo la temperatura de anillamiento en 0.7ºC en cada ciclo por 12 ciclos. Los
productos de amplificación se almacenaron a – 20°C hasta realizar la electroforesis.
Las combinaciones de “primers” utilizadas para las amplificaciones se muestran en
el Tabla 8.
41
Tabla 8. Combinaciones de “primers” Eco RI x Mse I para el análisis de Passiflora ligularis
mediante AFLP.
EcoRI MseI Eco-AG Mse-CAA Eco-AT Mse-CTT Eco-TA Mse-CTT Eco-TC Mse-CAA Eco-AA Mse-CTA Eco-AA Mse-CAG Eco- TT Mse-CAA Eco-AC Mse-CTA Eco-AC Mse-CAG Eco-TG Mse-CTG
La visualización de los fragmentos amplificados se realizó en geles de poliacrilamida
al 6%, los cuales fueron corridos en la cámara de electroforesis vertical Sequi-Gen
GT Sequencing Cell de BioRad®, a 110W durante dos horas y media a una
temperatura de 50ºC. Los geles fueron teñidos siguiendo el protocolo de tinción con
nitrato de plata (anexo 12).
6.7 Análisis de datos
6.7.1 Extracción de DNA
En el análisis estadístico se evaluó cada uno de los factores (método de
extracción (A) y tipo de tejido (B) con el fin de definir la influencia tuvieron en
la calidad y cantidad de DNA extraído.
El modelo corresponde a la siguiente fórmula:
Yijk = μ + A + B + AB + ε
Donde Yijk es la variable de respuesta, μ es el efecto medio general, A es el efecto
del factor i, B es el efecto del factor ij, AB es la interacción del efecto del facto A con
el factor B y ε es el error experimental
42
La información fue procesada con el Programa Statistical Analysis System (SAS),
utilizando el procedimiento de modelos lineales (GLM). Para el análisis estadístico
se realizaron análisis de varianzas y comparación de medias utilizando la prueba de
intervalos múltiples de Duncan
6.7.2 Análisis RAPD y AFLP El análisis de los datos obtenidos de las amplificaciones mediante los marcadores
RAPD y AFLP se realizó mediante el establecimiento de una matriz binaria, donde la
presencia de bandas fue 1 y la ausencia 0, posteriormente estos datos fueron
analizados mediante la utilización del programa estadístico NTSys versión 2.0. con
el cual construyó una matriz de similitud utilizando el coeficiente o índice de Dice.
Una vez obtenida la matriz de similitud, los materiales de granadilla fueron
agrupados en “clusters” a través de un dendrograma, usando el algoritmo de
agrupamiento UPGMA (unweigthed pair group method), lo cual permitió visualizar
en dos dimensiones las similitudes o diferencias entre los materiales evaluados.
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1 Estandarización del protocolo de extracción de DNA
En general para los estudios de diversidad genética en plantas, utilizando
herramientas biotecnológicas como los marcadores moleculares, se hace necesario
el uso de métodos precisos y eficientes de extracción de DNA; los cuales dependen
directamente de la especie a trabajar, por tal motivo en este trabajo se evaluaron
diferentes protocolos de extracción de DNA, teniendo en cuenta dos tipos de tejido
seco y tejido conservado en frio.
El material colectado (tejido seco y tejido conservado en frio) fue macerado con
nitrógeno líquido lo cual permite que el DNA obtenido sea de alto peso molecular;
permitiendo la separación de células unidas mediante pectina, al igual que permite
el rompimiento de las paredes celulares por daño mecánico y la lisis de los
protoplastos (Boiteux et al. 1999).
43
Empleando el material vegetal seco se evaluó la eficiencia de extracción de algunos
protocolos de extracción de DNA sugeridos en la literatura. La mayor cantidad de
DNA se obtuvo con el protocolo de Mc Couch (3) con una concentración promedio
de DNA 778.97 µg/ml seguido por el protocolo de Doyle & Doyle (2) con una
concentración promedio de 660.16 µg/ml. El protocolo 6 presentó las
concentraciones más bajas de DNA 83.74 µg/ml (anexo 6. B)
Con respecto a la pureza del DNA, los valores más altos se lograron mediante los
protocolos de Doyle & Doyle (2) y Mc Couch I (3) con valores de A260/A280 = 1.34 y
A260/A280 = 1,41 respectivamente; el valor más bajo A260/A280 = 1.18 se obtuvo con el
protocolo 1 (anexo 6.A), resultado que confirma lo observado en el gel de agarosa
(figura 4) donde se vio un alto nivel de degradación en estas muestras.
Figura 4. Evaluación de la calidad de DNA extraído con tejido seco (A), (individuos 1- 5) y tejido
conservado en frio (B), (individuos 1-8), con los diferentes protocolos de extracción de DNA.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos con el tejido seco, se seleccionaron los
protocolos de Doyle & Doyle (2) y Mc Couch (3) para ser evaluados en el tejido
conservado en frio. Los resultados obtenidos indican que con el protocolo de Mc
EXTRACCION DE DNA CON TEJIDO CONSERVADO EN FRIO (B)
EXTRACION DE DNA CON TEJIDO SECO (A)
Doyle & Doyle (2) Mc Couch (3)
Doyle & Doyle (2) Dellaporta II (6) MC Couch (3) Dellaporta (1) Dellaporta I (5) Mc Couch (4)
44
Couch (3) se obtiene un DNA de mayor grado de pureza (radio A260/A280 =1.81) que
con el protocolo de Doyle &Doyle (2) (radio A260/A280 =1.79) (anexo 5.A). Sin
embargo, según la prueba de de comparación de medias de Duncan (anexo 7), no
existen diferencias significativas entre los dos métodos (p<0,38) (Tabla 9); mientras
que si existen diferencias significativas con respecto al tipo de tejido utilizado
(p<0,0001) (Tabla 9). Estos resultados sugieren que para la extracción eficiente de
DNA de Passiflora. ligularis puede ser utilizado tejido conservado en frio con
cualquiera de los dos métodos.
Teniendo en cuenta la interacción entre el método de extracción y el tipo de tejido, la
prueba de comparación de medias de Duncan (anexo 7) sugiere que no existen
diferencias significativas (p<0,56) (Tabla9).
La cantidad de DNA obtenida con los protocolos de Doyle & Doyle (2) y Mc Couch
(3) fue de 820,4 ug/ml y 1543,3 ug/ml respectivamente (anexo 5.B). La prueba de
comparación de medias de Duncan indica que no hay diferencias significativas entre
los métodos de extracción empleados (p<0,056) (Tabla9) y la interacción entre el
método y el tejido (p<0,165) (Tabla 9), mientras que si existen diferencias
significativas con respecto al tipo de tejido utilizado (p<0,036) (Tabla9). Nuevamente
los resultados sugieren que para una extracción eficiente de DNA de Passiflora
ligularis debe ser utilizado tejido conservado en frio con cualquiera de los dos
métodos.
Tabla 9. Incidencia de los distintos factores (método y tipo de tejido) y sus interacciones en la pureza y cantidad de DNA extraído según el modelo factorial.
Variables de Respuesta Componentes de varianza (%)
Fuente de Variación Pureza Cantidad Método 1.07 36.76
Tejido 98.46** 44.30*
Método * Tejido 0.47 18.94 *P< 0.05 **P<0.01
45
Aunque las diferencias entre los dos métodos no fueron significativas, se eligió el
protocolo Mc Couch I 1988 (3) para realizar la extracción de DNA de todos los
individuos colectados.
Los resultados de concentración de DNA y pureza obtenidos mediante el protocolo
de Mc Couch I 1988 (3) en los 90 individuos se muestran en el anexo 4 y la figura 5.
Figura 5. Evaluación de la calidad de DNA extraído con tejido conservado en frio mediante
el protocolo de Mc Couch I et al 1988 (3) de los 90 individuos colectados.
La degradación observada en algunas de las muestras puede atribuirse a la acción
rápida de nucleasas, liberadas al iniciarse el proceso natural de degradación de los
tejidos (figura 5), este efecto se evidencia en el tejido seco donde se presenta una
mayor degradación con respecto al tejido conservado en frio (figura 4) (Hills et al.
1990).
46
Hills et al. (1990) plantean que la ventaja de un protocolo de extracción de DNA con
respecto a otros está directamente relacionada con el método de preservación del
material inicial (fresco, seco o congelado), siendo ésta la que mayor incidencia tiene
a la hora de obtener una DNA de alta calidad y pureza. De manera similar el estado
sanitario, fisiológico y químico de las muestras, inciden en la calidad y pureza del
DNA, lo cual se evidencia en este trabajo y concuerda con el estudio desarrollado
por Michiels (2003) donde establece que la calidad del DNA extraído está
directamente relacionada con la edad y las condiciones de crecimiento del material
vegetal utilizado.
Adicionalmente Rodríguez (2001) indica que el utilizar cantidades pequeñas de
material para la extracción (miniprep), como se hizo en este trabajo, ayuda a
disminuir la acción de nucleasas y otros procesos degenerativos en la muestra, lo
cual se evidencia en el aumento de la calidad del DNA aislado.
El desarrollo de métodos moleculares ha llevado a la necesidad de crear
metodologías de extracción de DNA más simples y eficientes. Sin embargo
variantes en la eficiencia de la lisis, el rendimiento y la pureza de DNA pueden
afectar los resultados de otras técnicas moleculares como la PCR. Las diferencias
básicas entre las metodologías aplicadas en este estudio radican en el número de
pasos empleados en el proceso de extracción y la composición del buffer de lisis; el
cual generalmente está compuesto de un agente estabilizador del pH, una sal para
precipitar las proteínas del DNA, un detergente para solubilizar las membranas e
inactivar algunas enzimas y un inhibidor de DNAsas (Bered 1998).
Las dos metodologías de extracción de DNA evaluadas se diferencian
principalmente en el buffer de extracción utilizado para la lisis, así como en los
reactivos utilizados para la precipitación de proteínas y sustancias utilizadas para la
remoción de contaminantes.
La presencia de EDTA en el buffer de extracción es de vital importancia, debido a
que es un agente quelante de iones metálicos de Ca++ y Mg++, que rompe la tensión
superficial de los lípidos de todos los sistemas internos de la membranas,
47
contribuyendo a la lisis celular, es por esto que se convierte en uno de los
compuestos fundamentales de todos los buffer de extracción (Gonzáles 1995).
En el protocolo de Mc Couch I 1988 (3) se utiliza como detergente el SDS el cual
solubiliza proteínas y componentes de tejidos de membrana, mientras que con el
protocolo de Doyle & Doyle 1990 (2) se utiliza CTAB que es un detergente catiónico,
que permite la solubilización de compuestos de tipo polisacárido. Se encontró que le
protocolo de Mc Couch I 1988 (3) fue más eficiente en los procesos de lisis, si se
tiene en cuenta que las Passifloras tienen un alto contenido de proteínas (Duke
1989).
En la purificación del DNA extraído se debe tener en cuenta que este se encuentra
ionizado. Los grupos fosfato de carga negativa se encuentran distribuidos a lo largo
de la cadena DNA y al agregar una sal como el acetato de Potasio, se forma una sal
sódica de DNA la cual tiene la capacidad de aumentar el poder iónico de la solución
facilitando la precipitación alcohólica de DNA por medio del isopropanol (Gonzalez
et al. 1995).
En el protocolo de Mc Couch (3) se realizaron dos lavados, uno de ellos con Acetato
de potasio y el otro con u buffer de lavado que contenía acetato de sodio e
isopropanol, lo que representa una ventaja frente al método de Doyle & Doyle 1990
(2) donde se realiza un solo lavado. Teniendo en cuenta que la especie trabajada
presenta altos niveles de contaminantes (Duke 1989), el método de Mc Couch (3)
es más eficiente, lo cual se ve claramente reflejado en la pureza obtenida.
De igual manera el tiempo y los pasos empleados en la purificación de DNA pueden
estar relacionados con la cantidad y la calidad del DNA obtenida al finalizar el
proceso de extracción. Boiteux (1999) evidencio una pérdida significativa de DNA
con protocolos que superaban las 2 horas; sin embargo lo que se observó en este
trabajo es que en el protocolo de Doyle & Doyle 1990 (2), en el cual se emplean 3
horas 40min, se ve una disminución en la cantidad de DNA obtenido. Contario a lo
que sucede con el protocolo de Mc Couch I 1988 (3) donde se emplearon 5 horas
en el proceso, teniendo en este una cantidad y calidad del DNA mayor.
48
Fraga et al (2004) proponen que al disminuir los pasos empleados en el proceso de
extracción y el tiempo de cada uno, disminuye las posibles contaminaciones y
perdida de DNA accidentales; con lo cual se obtendría mayor concentración y
rendimiento del mismo.
Teniendo en cuenta lo anterior se plantea que los protocolos demasiado
simplificados, dan como resultado un DNA parcialmente degradado o con
contaminantes, que a pesar de posibilitar la amplificación por PCR, compromete la
reproducibilidad de los resultados, generando de esta manera, falsos positivos
(Romano 1998, Fraga et al. 2004).
Uno de los mayores problemas que se encuentran al momento de aislar DNA son
los compuestos fenólicos y los metabolitos secundarios que presentan la especies
vegetales, puesto que estos degradan el DNA, al igual que inhiben la acción de la
taq polimerasa, la cual es fundamental en los procesos que involucran PCR
(Molinari 2001).
Se sabe que las especies de Passifloras poseen niveles variados de metabolitos
secundarios, entre los que se encuentran alcaloides, esteroides, flavonoides,
glicosideos, cianogénicos, gomas, taninos, resinas y algunos ácidos (Duke 1989).
Para la remoción de estos metabolitos secundarios y la eliminación de lípidos se
requiere de métodos orgánicos, en el caso del protocolo de Mc Couch I 1988 (3) se
adicionó un lavado con cloroformo, el cual remueve los residuos fenólicos presentes
en la muestra y disuelve componentes orgánicos como clorofila e hidrofenoles. Por
su naturaleza apolar captura lípidos y evita la precipitación de proteínas
hidrofóbicas denaturadas (Chaves et al. 1995).
Cabe mencionar que la degradación que se presentó en algunas muestras se debe
en principio, a que el tejido vegetal es expuesto a un daño mecánico que hace que
se produzcan fenoles durante la lisis como respuesta al estrés, lo cual afecta
considerablemente la calidad del DNA. Cuando el tejido se oxida se forman
49
quinonas, las cuales inhiben la acción de algunas enzimas, por esto se recomienda
la utilización de algunos antioxidantes como PVP, bisulfito de sodio o β-
mercaptoetanol, en el protocolo de extracción (Kim et al. 1997).
Por último para el aislamiento de DNA genómico además del método empleado, es
importante realizar una adecuada selección del material vegetal. Esto incluye,
colectar material joven pero completamente desarrollado y en buen estado
fitosanitario (Dellaporta 1983).
7. 2. Análisis RAPD (Polimorfismo de DNA amplificado al azar)
Para el marcador molecular RADP no existe un protocolo generalizado que sea
óptimo para todas las condiciones de la PCR; de esta manera se hace necesario
evaluar estas para cada especie a trabajar. Según Mc Pherson et al (1995), algunas
de las recomendaciones a la hora de establecer las condiciones adecuadas para la
PCR son:
Calidad del DNA: esta debe ser evaluada con el fin de obtener una buena
amplificación del mismo. La amplificación con muestras muy diluidas de DNA
generan un exceso de reactivos con respecto a la disponibilidad del DNA a
amplificar, lo cual hace menos probable la colisión entre el “primer” y su sitio de
especificidad y muy poca o nula amplificación (en estos casos se recomienda
adicionar primero los “primers” y luego de pasado un ciclo adicionar los reactivos
faltantes, ayudando a la unión adecuada del primer con el DNA) (Mc Pherson et al.
1995, Varon 2000). Según los resultados de amplificación obtenidos se determinó
que la concentración óptima de DNA es de 30ng por reacción, para obtener una
buena amplificación.
Concentración de cloruro de magnesio: al variar la concentración final se evidenció
que a una concentración final de 2.25mM de MgCl2 no se presentó amplificación,
mientras que con una concentración final de 2.5mM se obtuvieron amplificaciones;
sin embargo las bandas obtenidas con esta concentración no fueron bien definidas y
50
nítidas. Por tal motivo se decidió aumentar la concentración final a 2.75mM, con la
cual se obtuvieron buenos resultados, pues se consiguió una amplificación y una
intensidad de bandas optima para el análisis.
Mc Pherson et al (1995) plantean que la concentración de cloruro de magnesio
(MgCl2) es fundamental para determinar la intensidad de las bandas amplificadas.
En general un incremento en la concentración de este, aumenta el producto de PCR
pero disminuye la especificidad y fidelidad de los productos amplificados; a bajas
concentraciones puede inhibirse la acción de la Taq polimerasa y no producirse
amplificación.
Otra posible explicación a la falta de amplificación de algunos “primers” en donde se
evidencia la ausencia de bandas, es que no exista complementariedad entre las
bases nucleotídicas del “primer” y las bases del DNA molde de la especie vegetal
evaluada (Williams et al. 1990, De Vienne 2003).
Otra de las condiciones que se deben tener en cuenta en la amplificación por medio
de RAPD es la temperatura de anillamiento, debido a que es fundamental para la
hibridación específica de los “primers”; generalmente variando la temperatura de
anillamiento se obtienen diferentes grados de especificidad y eficiencia del proceso
de amplificación. Se ha establecido que la temperatura de anillamiento depende
directamente del tamaño de los “primers” y de su contenido de G-C. Se ha
establecido que para los “primers” de RAPD pueden oscilar entre 36° y 44°C
(Weising et al. 2005, Davis et al. 1994, Mc Pherson et al. 1995). Teniendo en cuenta
los resultados obtenidos con cada una de los perfiles de amplificación ensayados en
este trabajo se estableció que la temperatura óptima de anillamiento es de 40°C.
Las condiciones utilizadas para el análisis de las muestras de Passiflora ligularis
mediante marcadores moleculares RAPD se muestran en el Tabla 10, para una
reacción de 25 µl volumen final; el perfil de amplificación establecido se muestra en
el Tabla 11.
51
Tabla 10. Condiciones de PCR para RAPD Reactivo Concentración
Stock Concentración
Final
Buffer 10 X 1 X
MgCl2 50 mM 2.75 mM
dNTPs 10 mM 0.25 mM
Taq polimerasa 5 u/µl 1 u
Primer 25 µM 7 µM
DNA 5 ng/µl 30 ng/µl
H2O
Tabla 11. Ciclos de Temperatura del Termociclador
Ciclos Temperaturas y Tiempos
Pre denaturación 94° C x 5 min
Denaturación 94° C x 30 seg
Anillamiento 40° C x 30 seg
Extensión 72° C x 1min
Paso 2-4 34 veces
Extensión final 72° C x 5 min
Terminación 4° C
Los 33 “primers” probados inicialmente todos amplificaron, sin embargo de estos se
seleccionaron 11, los cuales presentaron el mayor número de bandas amplificadas.
Los “primers” seleccionados fueron OPB 11, OPB 20, OPAM 4, OPAN 8, OPAA 6,
OPG 8, OPAM 10, OPAN 5, OPAN 17, OPB 18, OPAB 5 (anexo 8). En los que se
obtuvieron un total de 66 bandas, de las cuales 24 fueron polimórficas.
El dendrograma obtenido a partir de los marcadores RAPD (Figura 6) reveló una
baja variabilidad entre las cuatro procedencias de Passiflora ligularis evaluadas,
evidenciándose índices de similitud altos entre la poblaciones; de esta manera se
observa una agrupación entre las procedencias 2 (Quindío, Calarcá) y 3 (Quindío,
Génova) con un porcentaje de similitud del 96%, seguido por la procedencia 1
(Quindío, Salento) con un porcentaje de 89%, siendo la procedencia 4 (Risaralda,
Santa rosa), la que presenta un índice de similitud más bajo 0.84.
52
Por otra parte las agrupaciones obtenidas presentan concordancia con la ubicación
geográfica de las poblaciones evaluadas; sin embargo cabe anotar que los índices
de similitud preliminares obtenidos sugieren que a pesar de la distancia geográfica
entre las poblaciones, la variabilidad intraespecífica de los materiales cultivados se
ha visto disminuida con el tiempo, comparado con los resultados obtenidos por
Fajardo (1998), donde se evidenció una alta variabilidad intraespecífica en
Passiflora ligularis, a pesar de que todas las accesiones evaluadas provenían de la
región donde se concentraban la mayor área de producción (Urrao, Antioquia).
Una posible explicación a la pérdida de pool genético dentro de la especie a través
del tiempo, puede ser el comportamiento errante del cultivo, debido a las
enfermedades que lo atacan, entre las que se encuentran la secadera; de igual
manera, los estándares de calidad exigidos para la exportación de la fruta ha llevado
a concentrar la siembra con individuos más homogéneos, perdiendo de esta manera
la variabilidad entre las poblaciones.
Otro factor que puede estar influenciando el nivel de variabilidad en la región es el
constante intercambio de semillas entre los cultivadores, según los datos
suministrados por los cultivadores, las semillas de las procedencias 2 y 3 son
originarias de Génova (Quindío), esta sería una de las razones por las cuales estas
dos procedencias presentan una alta similitud. Mientras que las semillas de la
procedencia 1 y 4 provienen de Santuario (Risaralda) y Urrao, (Antioquia)
respectivamente.
53
Figura 6. Dendrograma usando el algoritmo UPGMA, basado en el índice de similitud de Dice. Muestra las similitudes entre las procedencias evaluadas de Passiflora ligularis mediante marcadores moleculares RAPD. 1 Salento (Quindío), 2 Calarcá (Quindío), 3 Génova (Quindío), 4. Santa Rosa (Risaralda).
54
7.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Se evaluaron diez combinaciones diferentes de “primers”, donde las combinaciones
más informativas fueron E- AT x M-CTT, E- TA x M- CTT, E- TG x M CTG, por
presentar el mayor porcentaje de polimorfismo y mayor número de bandas
amplificadas, como se muestra en el Tabla12. Tabla 12. Porcentaje de polimorfismos y bandas detectadas en el ensayo de AFLP Combinación Número total
de bandas Bandas
monomórficasBandas
Polimórficas Porcentaje de polimorfismo
%
E-AG x M-CAA 10 7 3 30
E-TC x M-CAA 9 6 3 33.33
E-TT x M- CAA 13 5 8 61.54
E-AT x M-CTT 98 9 89 90.82
E-TA x M-CTT 64 6 58 90.63
E-TG x M-CTG 86 4 86 95.35
E-AA x M-CTA 8 6 2 25
E-AC x M-CTA 5 4 1 20
E-AA x M-CAG 12 5 7 58.33
E-AC x M-CAG 7 4 3 42.85
Las combinaciones de “Primers” más polimórficas fueron (E- AT x M-CTT), (E- TA x
M- CTT), (E- TG x M CTG) que generaron en total 231 bandas polimórficas (Tabla10
y figura 7).
55
Figura 7. Gel de acrilamida al 6% donde se observa la amplificación por medio de
marcadores AFLP, combinaciones E- TA x M- CTT (90.63%), E-TT x M- CAA (61.54%), E-
AT x M- CTT (90.82%).
La obtención de bandas polimórficas mediante el uso de marcadores moleculares
AFLP en Passiflora ligularis permite confirmar la aplicabilidad de esta herramienta
molecular en el estudio de diversidad genética de los materiales cultivados de
granadilla del eje cafetero. Según Engelborghs et al. (1998), los microsatélites, y los
AFLP pueden ser los marcadores más adecuados para el análisis de diversidad
genética, debido al alto poder de detección de polimorfismos de estos marcadores.
Lo cual se corrobora al observar el porcentaje promedio de polimorfismo obtenido
mediante los AFLP que es del 92.27%.
Con el dendrograma obtenido mediante marcadores moleculares AFLP (Figura 8) se
obtienen índices de similitud bajos dando como resultado la agrupación entre la
procedencia 2 Calarcá (Quindío) y 3 Cajamarca (Tolima) con un índice de similitud
de 0.63, seguido de la procedencia 1 Calarcá (Quindío) con un índice de similitud de
56
0.48, siendo la población 4 Cajamarca (Tolima) la que presenta el índice de similitud
más bajo entre las cuatro procedencia evaluadas (0.43).
Figura 8. Dendrograma usando el algoritmo UPGMA, basado en el índice de similitud de
Dice. Muestra la similitud entre las procedencias evaluadas de Passiflora ligularis mediante
marcadores moleculares AFLP. 1. Calarcá (Quindío), 2. Calarcá (Quindío), 3. Cajamarca
(Tolima), 4. Cajamarca (Tolima).
Aunque los resultados obtenidos mediante los marcadores RAPD y AFLP no son
comparables entre sí, debido a que fueron construidos con individuos diferentes,
con los AFLP se evidencia mayor número de bandas polimórficas, lo cual sugiere
que estos, pueden ser más informativos para la evaluación de la diversidad genética
de material cultivado de P. ligularis en el eje cafetero Colombiano.
57
8. CONCLUSIONES Los resultados de este estudio sugieren que de los seis protocolos evaluados para
la extracción de DNA, el uso del protocolo de extracción de DNA de Mc Couch
modificado I (1988) (protocolo 3) a partir de tejido colectado, empacado en sílica gel
y conservado en frio, constituye un método rápido con el cual se obtiene un DNA
genómico de Pasiflora ligularis de buena calidad y pureza, como se observó en gel
de agarosa y por espectrofotometría, para el análisis mediante herramientas
moleculares basadas en PCR.
Con los resultados obtenidos por medio de los marcadores moleculares RAPD,
utilizando 12 individuos de cuatro procedencias, se observó que existe un bajo
polimorfismo en el material cultivado de Passiflora ligularis.
Se sugiere que para la evaluación de la diversidad genética de Passiflora ligularis,
los marcadores AFLP pueden ser más informativos, debido a que con tres
combinaciones de “primers” se obtienen 231 bandas polimórficas.
Las tres combinaciones de “primers” candidatas para el análisis mediante AFLP son:
E- AT x M-CTT E- TA x M- CTT, E- TG x M CTG.
58
9. RECOMENDACIONES
Para la extracción de DNA se recomienda trabajar con material foliar joven, totalmente
desarrollado y que se encuentre en las mejores condiciones fitosanitarias.
Complementar la investigación evaluando material vegetal procedente de Tolima, Huila y
Cundinamarca, regiones de mayor producción de granadilla en Colombia, haciendo uso
de los marcadores moleculares AFLP.
Realizar el análisis de AFLP con material vegetal que provenga de poblaciones naturales
y otras zonas productoras del país.
Comparar los resultados que se obtengan del análisis de diversidad, con los datos
morfológicos recolectados, que se obtuvieron en el presente estudio pero que no se
incluyeron en el presente documento.
59
10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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69
11. ANEXOS
70
Anexo 1. Procedencia del material vegetal de Passiflora ligularis analizado mediante RAPD Numero Departamento Municipio Vereda Predio Altura Coordenadas
Muestra N Wo
1 Quindío Pijao La palmera Casa de lata 2170
2 Quindío Pijao La palmera Casa de lata 2170
3 Quindío Pijao La palmera Casa de lata 2170
4 Quindío Pijao Carniceros La mirandita 1884
5 Quindío Pijao Carniceros La mirandita 1884
6 Quindío Pijao Carniceros La mirandita 1884
7 Quindío Salento Canaan La Linda 1926 4º 37`00`` 75º35`54,2``
8 Quindío Salento Canaan La Linda 1927 4º 37`00`` 75º35`54,2``
9 Quindío Salento Canaan La Linda 1928 4º 37`00`` 75º35`54,2``
10 Quindío Salento Canaan El Topacio 1837 4º36`38,3`` 75º35`45,7``
11 Quindío Salento Canaan El Topacio 1837 4º36`38,3`` 75º35`45,7``
12 Quindío Salento Canaan El Topacio 1837 4º36`38,3`` 75º35`45,7``
13 Quindío Salento Canaan El Topacio 1837 4º36`38,3`` 75º35`45,7``
14 Quindío Salento Palestina El Recreo 1771 4º37`38,4`` 75º35`47,5``
15 Quindío Salento Palestina El Recreo 1771 4º37`38,4`` 75º35`47,5``
16 Quindío Salento Palestina El Recreo 1771 4º37`38,4`` 75º35`47,5``
17 Quindío Salento Palestina Buenos Aires 1699 4º37`24,4`` 75º36`14``
18 Quindío Salento Palestina Buenos Aires 1699 4º37`24,4`` 75º36`14``
19 Quindío Salento Llano Grande La aguadita 1792 4º 37`13`` 75º 37`3,2``
71
Numero Departamento Municipio Vereda Predio Altura Coordenadas
20 Quindío Salento Llano Grande La aguadita 1792 4º 37`13`` 75º 37`3,2``
21 Quindío Salento Llano Grande La aguadita 1792 4º 37`13`` 75º 37`3,2``
22 Quindío Calarca La paloma La fortuna 1988 4º27`19,2`` 75º38`54,2``
23 Quindío Calarca La paloma La fortuna 1988 4º27`19,2`` 75º38`54,2``
24 Quindío Calarca La paloma La fortuna 1988 4º27`19,2`` 75º38`54,2``
25 Quindío Calarca La paloma Lomitas 1911 4º 7`34,2`` 75º38`56,8``
26 Quindío Calarca La paloma Lomitas 1911 4º 7`34,2`` 75º38`56,8``
27 Quindío Calarca La paloma Lomitas 1911 4º 7`34,2`` 75º38`56,8``
28 Quindío Calarca La paloma Lomitas 1911 4º 7`34,2`` 75º38`56,8``
29 Quindío Calarca La paloma El jardín 1824 4º27`42,0`` 75º38`49,2``
30 Quindío Calarca La paloma El jardín 1824 4º27`42,0`` 75º38`49,2``
31 Quindío Calarca La paloma El jardín 1824 4º27`42,0`` 75º38`49,2``
32 Quindío Génova San Juan Alto La Primavera 1878 4º9`16,3`` 75º48`22,6``
33 Quindío Génova San Juan Alto La Primavera 1878 4º9`16,3`` 75º48`22,6``
34 Quindío Génova San Juan Alto La Primavera 1878 4º9`16,3`` 75º48`22,6``
35 Quindío Génova San Juan Alto El Pino 2039 4º9`20,7`` 75º 48`8,5``
36 Quindío Génova San Juan Alto El Pino 2039 4º9`20,7`` 75º 48`8,5``
37 Quindío Génova San Juan Alto El Pino 2039 4º9`20,7`` 75º 48`8,5``
38 Quindío Génova San Juan Alto La Ilusión 2011 4º9`6,7`` 75º48`14,2``
39 Quindío Génova San Juan Alto La Ilusiòn 2011 4º9`6,7`` 75º48`14,2``
40 Caldas Anserma La Esmeralda La Shakira 1827 5º12`51,9`` 75º45`46,11``
72
Numero Departamento Municipio Vereda Predio Altura Coordenadas
41 Caldas Anserma La Esmeralda La Shakira 1827 5º12`51,9`` 75º45`46,11``
42 Caldas Anserma La Esmeralda La Shakira 1827 5º12`51,9`` 75º 5`46,11``
43 Caldas Anserma La Esmeralda Los naranjos 1797 5º13`0,3`` 75º45`13,1``
44 Caldas Anserma La Esmeralda Los naranjos 1797 5º13`0,3`` 75º45`13,1``
45 Caldas Anserma La Esmeralda Los naranjos 1797 5º13`0,3`` 75º45`13,1``
46 Caldas Anserma Nubia Alta Bella Vista 1867 5º13`16,5`` 75º44`57,5``
47 Caldas Anserma Nubia Alta Bella Vista 1867 5º13`16,5`` 75º44`57,5``
48 Caldas Anserma Nubia Alta Bella Vista 1867 5º13`16,5`` 75º44`57,5``
49 Caldas Anserma Palo Blanco La blanquita 1917 5º14`36,0 75º45`0,33``
50 Caldas Anserma Palo Blanco La blanquita 1917 5º14`36,0 75º45`0,33``
51 Caldas Anserma Palo Blanco La blanquita 1917 5º14`36,0 75º45`0,33``
52 Risaralda Santuario Alta Esmeralda Las Cruces 1953 5º6`6,5`` 75º59`20``
53 Risaralda Santuario Alta Esmeralda Las Cruces 1953 5º6`6,5`` 75º59`20``
54 Risaralda Santuario Alta Esmeralda Las Cruces 1953 5º6`6,5`` 75º59`20``
55 Risaralda Santuario Los Planes La jirona 2057 5º6`28,4`` 75º59`44,8``
56 Risaralda Santuario Los Planes La jirona 2057 5º6`28,4`` 75º59`44,8``
57 Risaralda Santuario Los Planes La jirona 2057 5º6`28,4`` 75º59`44,8``
58 Risaralda Santuario Los Planes Desconocido 2153 5º7`11,2`` 76º0`5,7``
59 Risaralda Santuario Los Planes Desconocido 2153 5º7`11,2`` 76º0`5,7``
60 Risaralda Santuario Los Planes Desconocido 2153 5º7`11,2`` 76º0`5,7``
61 Risaralda Santuario Los Planes Desconocido 2153 5º7`11,2`` 76º0`5,7``
73
Numero Departamento Municipio Vereda Predio Altura Coordenadas
62 Risaralda Apia La Campana Alta Desconocido 2210 5º8`20,8`` 75º59`30,9``
63 Risaralda Apia La Campana Alta Desconocido 2210 5º8`20,8`` 75º59`30,9``
64 Risaralda Apia La Campana Alta Desconocido 2210 5º8`20,8`` 75º59`30,9``
65 Risaralda Apia La Campana Alta Desconocido 2210 5º8`20,8`` 75º59`30,9``
66 Risaralda Apia Alta Campana El campamento 2171 5º8`11,9`` 75º59`25,7``
67 Risaralda Apia Alta Campana El campamento 2171 5º8`11,9`` 75º59`25,7``
68 Risaralda Apia Alta Campana El campamento 2171 5º8`11,9`` 75º59`25,7``
69 Risaralda Apia San Luis La Angelita 2200 5º7`44,6`` 75º59`24,4``
70 Risaralda Apia San Luis La Angelita 2200 5º7`44,6`` 75º59`24,4``
71 Risaralda Apia San Luis La Angelita 2200 5º7`44,6`` 75º59`24,4``
72 Risaralda Santa Rosa El Chuso El Arrayan 2028 4º53`12,2`` 75º40`32,9``
73 Risaralda Santa Rosa El Chuso El Arrayan 2028 4º53`12,2`` 75º40`32,9``
74 Risaralda Santa Rosa El Chuso El Arrayan 2028 4º53`12,2`` 75º40`32,9``
75 Risaralda Santa Rosa El Chuso El Arrayan 2028 4º53`12,2`` 75º40`32,9``
76 Risaralda Santa Rosa El Chuso Las Plamas 2125 4º53`13,6`` 75º39`47,7``
77 Risaralda Santa Rosa El Chuso Las Plamas 2125 4º53`13,6`` 75º39`47,7``
78 Risaralda Santa Rosa El Chuso Las Plamas 2125 4º53`13,6`` 75º39`47,7``
79 Risaralda Santa Rosa Los Alpes Las Plamas
80 Risaralda Santa Rosa Los Alpes Las Plamas
81 Risaralda Santa Rosa Los Alpes Las Plamas
82 Tolima Cajamarca La pepita
74
Numero Departamento Municipio Vereda Predio Altura Coordenadas
83 Tolima Cajamarca La pepita
84 Tolima Cajamarca La pepita
85 Tolima Cajamarca Leona del cajón Plan de los Trujillo
86 Tolima Cajamarca Leona del cajón Plan de los Trujillo
87 Tolima Cajamarca Leona del cajón Plan de los Trujillo
88 Tolima Cajamarca La palmita
89 Tolima Cajamarca La palmita
90 Tolima Cajamarca La palmita
75
Anexo 2. Protocolos evaluados para la extracción de DNA total de tejido foliar de Passiflora ligularis ETAPAS Dellaporta II Mc Couch Doyle & Doyle Mc Couch (I) Dellaporta Dellaporta I
Lisis Tris-HCl 100mM Tris-HCl 100mM Tris-HCl 100mM Tris-HCl 100mM Tris-HCl 100mM Tris- HCl pH:8.0
150mM Buffer de extracción EDTA 50mM EDTA 50mM EDTA 20mM EDTA 50mM EDTA 50mM EDTA 15mM NaCl 500mM NaCl 500mM NaCl 1.4M NaCl 500mM NaCl 500mM NaCl 1M SDS 20% SDS 1.25% CTAB 2% SDS 1.25% SDS 20% CTAB 1.5% PVP 1% (40.000
Mr) Bisulfito de sodio 0.38%
PVP 1% (40.000 Mr)
Bisulfito de sodio 0.38%
PVP 1% (40.000 Mr) PVP 1%
β- Mercaptoetanol 2 %
Β- mercaptoetanol 2 %
β-mercaptoetanol 2 %
β-Mercaptoetanol 1.2%
INCUBACIÓN
Baño caliente y Vortex
65°C por 15´ en agua
65°C por 30´en agua
65°C por 30´en agua
65°C por 45´en agua
65°C por 15´ 65°C por 30´ en agua
PRECIPITACION Acetato de
potasio 5M Acetato de potasio 5M
Acetato de potasio 5M
Acetato de potasio 5M
Acetato de potasio 5M
DE PROTEINAS pH 5.5 pH 5.5 pH 5.5 pH 5.5
REMOCIÓN DE CONTAMINANTES
Cloroformo Fenol:cloroformo: isoamilico 25:24:1
INCUBACIÓN en hielo y agitación
20 ´30 30
Precipitación de
DNA Isopropanol e incubación a –
80°C por 1 h ó -20 por 2h o toda
la noche
Isopropanol e incubación a – 80°C por 1 h ó -20 por 2h o toda la noche
Incubación a – 80°C por 1 h ó -20 por 2h o toda la noche con isopropanol
Sobrenadante se mezcla 1:10 con acetato de sodio 3 M pH 5.2 y vol. Igual al del isopropanol
Adicional 700µl de isopropanol . incubar a -80°C por 1h ó a -20°C por 2h
Añadir 1:10 de volumen de acetato de sodio 3M pH 5.2 y 6:20 de isopropsnol . incubar a -20°C por 1h o toda la noche.
76
Lavado del DNA Al pellet se
agrega buffer T50E10 y se incuba a65°C X15´.Agregar isopropanol. Incubar a -80°CX1h ó -20°C X 2h o todo la noche. Remover el isopropanol , dejar secar a T° ambiente
Al pellet se agrega buffer T50E10 y acetato de sodio 3M e isopropanol. Incubar a -80°CX1h ó -20°C X 2h o todo la noche. Centrifugar y lavar con etanol al 70%, centrifugar, secar a T° ambiente
El pellet se lava con 70% y acetato de amonio 10mM. Incubar a -80°C X 1h ó -20°C X 2 o toda la noche, Centrifugar y secar a T° ambiente
El pellet se lava con etanol al 70%. Centrifugar y secar a T° ambiente
Al pellet se agrega buffer T50E10 y se incuba a65°C X15´.Agregar isopropanol. Incubar a -80°CX1h ó -20°C X 2h o todo la noche. Remover el isopropanol , dejar secar a T° ambiente
Lavar e l pellet con 1ml de etanol al 70% a-20°C
RESUSPENCION
FINAL Resuspender en T50E10 RNAsa Incubar a 37°C por 15´
Resuspender en T50E10 con RNAsa. Incubar a 37°C por 15´
Resuspender en TE con RNAsa.
Resuspender en TE con RNAsa. Incubar a 37°C por 30´
Resuspender en TE con RNAsa. Incubar a 37°C por 30
Resuspender en TE pH 8.0 con RNAsa. Incubar a 37°C por 30´
77
Anexo 3. Protocolo de extracción de DNA. MC Couch, S.R, G. Kochert, Z.H. Yu,ZY. Wing, G.S. Khush, W.R Coffman y S.D.Tanksley. 1988. Molecular mapping of rice chomosome.
Theor Appl.Genet 76: 815-829 (Modificado)
1. A 300mg tejido macerado con nitrógeno liquido, agregar 700µl de buffer de
extracción previamente calentado a 65ºC.
2. Incubar la mezcla a 65ºC durante 30 minutos agitando los tubos por inversión
suavemente cada cinco minutos.
3. Adicionar 500µl de de Acetato de Potasio 5M y se mezcla por inversión. Incubar en
baño de hielo durante 30 minutos con agitación
4. Centrifugar a 14 000 rpm durante 10 minutos
5. Rescatar el sobrenadante
6. Adicionar 500µl de cloroformo, mezclar por inversión por cinco minutos
7. Centrifugar a 14 000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente
8. Rescatar el sobrenadante sin tocar el cloroformo
9. Añadir 500µl de isopropanol a -20ºC , mezclar e incubar a -70ºC por una hora.
10. Centrifugar a 14 000 rpm por 10 minutos a 4ºC
11. Resupender el precipitado en 900µl de buffer TE
12. Centrifugar a 300 rpm durante 10 minutos a 4ºC
13. El sobrenadante se transfiere a un tubo nuevo, y se adiciona 75µl de acetato de
sodio 3M ph 5.2 y 500µl de isopropanol frió, mezclar e incubar a -70ºC por 30 minutos
14. Centrifugar a 14 000 rpm por 10 min a 4ºC, descartar el sobrenadante
15. Lavar el precipitado de DNA con 800µl de etanol al 70% frio
16. Centrifugar a 12 000 rpm por 5 min a 4ºC
17. Secar el precipitado a temperatura ambiente con el tubo en posición invertida.
18. Resuspender el DNA en 100µl de TE, agregar 1µl de RNAsa a 10mg/ml e incubar
a 37ºC por 30 minutos.
19. Al DNA resuspendido, agregar 1 volumen de cloroformo, mezclar por inversión
durante 5 minutos.
20. Centrifugar a 14 000 rpm durante 190 min.
21. Recuperar el sobrenadante en un tubo nuevo. Agregar 2.5 volúmenes de etanol
absoluto y 1:10 de acetato de amonio. Incubar por 2 horas a -20°C.
22. Centrifugar a 14 000 rpm durante 10 min; eliminar el sobrenadante y secar las
gotas poniendo el tubo invertido.
78
23. Lavar el pellet con etanol al 70%
24. Finalmente centrifugar a 12 000 rpm por 5 min, eliminar el sobrenadante; dejar
secar el pellet en posición invertida por 1 hora
Resuspender el pellet en 100µl de TE, agregar 2 l de RNAsa, incubar por 30 min a
37°C.
Buffer de extracción Tris-HCl 100mM, EDTA 50mM NaCl 500mM SDS 1.25% Bisulfito de sodio 0.38% Β- mercaptoetanol 1.5%
79
Anexo 4. Pureza y cantidad de DNA muestras Quindío, Risaralda y Tolima, protocolo de Mc Couch I tejido conservador en frio
Predio Muestras 260nm 280nm 260/280 Concentraciòn de ADN µg/ml Casa de lata 1 0,345 0,188 1,83 1709,5 Casa de lata 2 0,7 0,391 1,79 3494,5 Casa de lata 3 0,498 0,278 1,79 2494,5 La mirandita 4 0,254 0,138 1,84 1261,4 La mirandita 5 0,338 0,196 1,73 1681,4 La mirandita 6 0,236 0,13 1,82 1187,1
La Linda 7 0,209 0,121 1,73 1038,1 La Linda 8 0,117 0,067 1,75 585,93 La Linda 9 0,3 0,152 1,98 1489,4
El Topacio 10 0,312 0,174 1,79 1571,3 El Topacio 11 0,174 0,097 1,79 886,42 El Topacio 12 0,35 0,206 1,7 586,92 El Topacio 13 0,114 0,059 1,93 549,43 El Recreo 14 0,144 0,079 1,82 719,7 El Recreo 15 0,109 0,054 2 555,38 El Recreo 16 0,917 0,505 1,82 4830
Buenos Aires 17 0,359 0,191 1,88 1796 Buenos Aires 18 0,371 0,201 1,85 1857,8 La aguadita 19 0,116 0,068 1,71 712,56 La aguadita 20 0,208 0,11 1,89 1041,4 La aguadita 21 0,403 0,228 1,77 2011,9 La fortuna 22 0,082 0,041 1,99 412,41 La fortuna 23 0,337 0,186 1,81 1686,5 La fortuna 24 0,271 0,153 1,77 1348,7 Lomitas 25 0,228 0,127 1,8 1149,4 Lomitas 26 0,349 0,199 1,75 1737,8 Lomitas 27 0,801 0,443 1,81 4021,8 Lomitas 28 0,61 0,336 1,82 3052 El jardín 29 0,174 0,098 1,78 888,64 El jardín 30 0,482 0,264 1,83 2422,9 El jardín 31 0,113 0,059 1,92 548,37
La Primavera 32 0,495 0,276 1,79 2474,7 La Primavera 33 0,444 0,253 1,75 2208 La Primavera 34 0,407 0,241 1,69 2057,1
El Pino 35 0,493 0,285 1,73 2452,9 El Pino 36 0,727 0,428 1,7 3636,1 El Pino 37 0,327 0,183 1,79 3309,2
La Ilusión 38 0,433 0,235 1,84 2772,8 La Ilusiòn 39 0,157 0,087 1,8 762,58 La Shakira 40 0,283 0,157 1,8 2644,5 La Shakira 41 0,367 0,201 1,83 1854,8 La Shakira 42 0,172 0,101 1,7 860,49
Los naranjos 43 0,28 0,164 1,71 1416,9 Los naranjos 44 0,108 0,054 2 548,22
80
Los naranjos 45 0,489 0,285 1,72 2447,5 Bella Vista 46 0,382 0,216 1,77 1901Bella Vista 47 0,525 0,298 1,76 2629,6Bella Vista 48 0,2266 0,159 1,67 1325,4
La blanquita 49 0,405 0,23 1,76 2029,9 La blanquita 50 0,585 0,341 1,72 2934,6 La blanquita 51 0,402 0,239 1,68 2006,4 Las Cruces 52 0,189 0,11 1,72 948,85Las Cruces 53 0,318 0,187 1,7 1596,4Las Cruces 54 0,238 0,14 1,7 1173,7
La jirona 55 0,137 0,08 1,71 681,64 La jirona 56 0,326 0,192 1,7 1635,3 La jirona 57 0,279 0,163 1,71 1403,4
Desconocido 58 0,14 0,082 1,7 705Desconocido 59 0,986 0,05 1,7 428,92Desconocido 60 0,231 0,117 1,97 1168,3 Desconocido 61 0,261 0,14 1,86 1312,9 Desconocido 62 0,374 0,184 2 1865,3 Desconocido 63 0,312 0,159 1,96 1570,8 Desconocido 64 0,237 0,118 2 11190,8Desconocido 65 0,33 0,165 2 1649,3
El campamento 66 0,51 0,282 1,8 2564,2 El campamento 67 0,223 0,119 1,86 1118,5 El campamento 68 0,275 0,156 1,76 1376,4
La Angelita 69 0,925 0,516 1,79 4638,8 La Angelita 70 0,654 0,3 1,8 3266,5La Angelita 71 0,527 0,284 1,86 2647,9El Arrayan 72 0,676 0,373 1,81 3383,6 El Arrayan 73 0,41 0,238 1,72 2051,7 El Arrayan 74 0,484 0,274 1,77 2417,5 El Arrayan 75 0,593 0,324 1,,83 2963,5 Las Plamas 76 0,377 0,189 1,99 1883,7Las Plamas 77 0,452 0,222 2 2260,8Las Plamas 78 0,298 0,149 2 1491,8 Las Plamas 79 0,238 0,119 2 1192,1 Las Plamas 80 0,193 0,099 1,96 967,45 Las Plamas 81 0,411 0,235 1,75 2053,4 La pepita 82 0,362 0,204 1,77 1808,1La pepita 83 0,156 0,092 1,69 779,23La pepita 84 0,465 0,273 1,7 2332
Plan de los Trujillo 85 0,337 0,192 1,75 1684,3 Plan de los Trujillo 86 0,369 0,217 1,7 1846,9 Plan de los Trujillo 87 0,341 0,186 1,83 1715,5
La palmita 88 0,461 0,254 1,81 2309,1La palmita 89 0,325 0,179 1,82 1634,2La palmita 90 0,33 0,185 1,78 1647,2
81
Anexo 5. Pureza y cantidad de DNA tejido conservado en frio
Anexo A. Pureza de DNA (260/208 OD) Muestras Quindío, Risaralda tejido conservado en fresco
Muestras MC Couch I (3) Doyle & Doyle (2) 1 1,54 1,70 2 1,67 1,91 3 1,75 1,79 4 1,86 1,78 6 1,72 1,80 7 1,90 1,95 9 1,90 1,75 12 2,04 1,67 14 1,84 1,78 16 1,88 1,82
1,81 1,79
Anexo B. Cantidad de DNA (µg/ml) Muestras Quindío y Risaralda tejido conservado en frio
Muestras MC Couch (3) Doyle & Doyle (2)
1 1113,6 678,34
2 1235,2 639,13
3 1195,4 2653,98
4 2516,4 797,97
6 2348,4 532,71
7 1318,1 709,89
9 754,64 433,44
12 943,08 949,14
14 1080,2 224,46
16 2928,1 585,25
1543,312 820,431
82
Anexo 6. Pureza y cantidad de DNA tejido seco
Anexo A. Pureza de DNA (260/208 OD) Muestras Quindío, Risaralda tejido seco
Anexo B. Cuantificación de Cantidad de DNA (µg/ml) Tejido seco
Muestras Mc
Couch Doyle &
Doyle Dellaporta
modificado II Dellaporta
modificado I Mc
Couch I Dellaporta
1 82,986 793,4 89,45 189.46 451,54 115,89
2 37,952 437,9 5,609 148,02 2638,5 271,85
3 44,919 209,46 70.89 390.87 1029,5 118.9
4 69,365 1135,7 34.67 135.78 260,79 564,3
6 61,475 445,46 118,98 136,89 321,56 256,7
7 70,366 344,48 198.76 90,367 1068,8 134,9
9 103,83 1607,7 345.89 85,226 674,53 389.98
12 524,22 176,5 105.15 1885,7 319,89 267,12
14 0,457 1345 165,13 309,71 456,7 344,22
16 159,33 106 39,56 241,36 567,89 413,41
115,49 660,16 83,7458 413,90 778,97 296,049
Muestras Mc
Couch Doyle & Doyle (2)
Dellaporta modificado II
Dellaporta modificado I
Mc Couch I
(3) Dellaporta
1 1,36 1,18 1,02 1,67 1,34 1,78
2 1,21 1,17 1,47 0,92 1,43 1,14
3 0,92 1,51 1,13 1,98 1,63 0,67
4 1,23 1,09 1,56 1,45 1,46 1,42
6 1,43 1,24 1,23 0,84 1,46 0,98
7 1,38 1,31 1,45 0,95 1,34 1,67
9 1,79 1,45 1,16 1,43 1,33 0,64
12 0,91 1,19 1,37 0,45 1,34 1,45
14 1,33 1,34 1,67 1,15 1,61 0,64
16 1,42 1,89 1,08 1,08 1,16 1,46
1,30 1,34 1,31 1,19 1,41 1,18
83
Anexo 7.Resultados para la prueba de medias de Duncan
The SAS System
The GLM Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
METODO 2 DOYLE Mc COUCH
TEJIDO 2 CONSERVADO EN FRIO SECO
Number of observations 40
The SAS System
The GLM Procedure Dependent Variable: CALIDAD Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 1.85810490 0.61936830 24.22 <.0001 Error 36 0.92055820 0.02557106 Corrected Total 39 2.77866310 R-Square Coeff Var Root MSE PUREZA Mean 0.668705 10.07209 0.159910 1.587650 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F METODO 1 0.02007040 0.02007040 0.78 0.3815 TEJIDO 1 1.82927290 1.82927290 71.54 <.0001 METODO*TEJIDO 1 0.00876160 0.00876160 0.34 0.5620 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F METODO 1 0.02007040 0.02007040 0.78 0.3815 TEJIDO 1 1.82927290 1.82927290 71.54 <.0001 METODO*TEJIDO 1 0.00876160 0.00876160 0.34 0.5620
84
The SAS System
The GLM Procedure Dependent Variable: CANTIDAD Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 4820636.78 1606878.93 3.54 0.0242 Error 36 16357764.22 454382.34 Corrected Total 39 21178401.00 R-Square Coeff Var Root MSE CANTIDAD Mean 0.227620 70.90207 674.0789 950.7183 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F METODO 1 1771109.349 1771109.349 3.90 0.0561 TEJIDO 1 2137272.999 2137272.999 4.70 0.0368 METODO*TEJIDO 1 912254.433 912254.433 2.01 0.1651 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F METODO 1 1771109.349 1771109.349 3.90 0.0561 TEJIDO 1 2137272.999 2137272.999 4.70 0.0368 METODO*TEJIDO 1 912254.433 912254.433 2.01 0.1651
85
The SAS System
The GLM Procedure
Duncan's Multiple Range Test for PUREZA NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 36 Error Mean Square 0.025571 Number of Means 2 Critical Range .1026 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N METODO A 1.61005 20 Mc COUCH A A 1.56525 20 DOYLE
The SAS System
The GLM Procedure
Duncan's Multiple Range Test for CANTIDAD NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 36 Error Mean Square 454382.3 Number of Means 2 Critical Range 432.3 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N METODO A 1161.1 20 MCCAUCH A A 740.3 20 DOYLE The SAS System
86
The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for PUREZA
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 36 Error Mean Square 0.025571 Number of Means 2 Critical Range .1026 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N TEJIDO A 1.80150 20 CONSERVADO EN FRIO B 1.37380 20 SECO
The SAS System
The GLM Procedure
Duncan's Multiple Range Test for CANTIDAD
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 36 Error Mean Square 454382.3 Number of Means 2 Critical Range 432.3 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N TEJIDO A 1181.9 20 CONSERVADO EN FRIO B 719.6 20 SECO
The SAS System
The GLM Procedure Level of Level of -----------CALIDAD----------- -----------CANTIDAD---------- METODO TEJIDO N Mean Std Dev Mean Std Dev DOYLE CONSERVADO EN FRIO 10 1.79390000 0.08614516 820.43100 673.901460 DOYLE SECO 10 1.33660000 0.23409362 660.16000 532.293707 MCCAUCH CONSERVADO EN FRIO 10 1.80910000 0.14273242 1543.31200 757.247065 MCCAUCH SECO 10 1.41100000 0.14032423 778.97000 711.776981
87
Anexo 8. Productos de amplificación marcador RAPD
Productos de amplificación “primers” OPAN 8, OPB 20, OPPG 8 OPAB 5, OPAM 10.
88
Productos de amplificación “primers” OPB 11, OPB 18, OPAH 18, OPAB 20, OPB
14
Productos de amplificación “primers” OPAD1, OPAD14, OPAN17, OPAN5, OPAM4,
OPAM13
89
Anexo 9. Productos de Pre amplificación marcadores AFLP
90
Anexo 10. Formato libreta de campo Número de Colección:
Nombre científico: Nombre del colector:
Fecha de colección: Localización: País: Departamento: Ciudad/Pueblo: Vereda: Finca: Altitud: Longitud/Latitud: Detalles de la muestra: tipo de tejido: Cantidad: Método de preservación: Estado fitosanitario de la planta: (nemátodos, Fusarium, virus) Observaciones:
Número de Colección:
Nombre científico: Nombre del colector:
Fecha de colección: Localización: País: Departamento: Ciudad/Pueblo: Vereda: Finca: Altitud: Longitud/Latitud: Detalles de la muestra: tipo de tejido: Cantidad: Método de preservación: Estado fitosanitario de la planta: nemátodos, Fusarium, virus Observaciones:
91
Anexo 11. Protocolo de tinción con nitrato de plata
1. Después de finalizada la electroforesis el vidrio con el gel adherido se coloca
hacia arriba en una cubeta con solución fijadora durante 20 minutos
2. Lavar con agua desionizada durante tres minutos (dos veces) con agitación
constante.
3. Después de los lavados el gel se introduce en la solución de tinción por 30
minutos en total oscuridad (tapando la bandeja)
4. El exceso de plata se retira lavando el gel con agua destilada por diez
segundos(este paso es crítico para obtener un revelado optimo)
5. Luego el gel se coloca en una solución fría de revelado durante cinco
minutos aproximadamente o hasta que se visualicen las bandas
6. Visualizadas las bandas, la reacción de revelado se detiene mediante la
inmersión del gel en la solución de parada durante cinco minutos
7. Por último, se enjuaga el gel por cuatro minutos en agua desionizada
8. Se coloca el gel en un soporte para dejar secar toda la noche
9. Posteriormente podrá ser fotografiado, analizado en scanner e igualmente se
leen los polimorfismos en un transiluminador de luz blanca
