Evaluación preliminar para aislamiento e identificación bioquímica

de Streptomyces sp., a partir de un nicho ecológico del Campus

Belmonte de la Universidad Libre, Seccional Pereira

Duque Juan Esteban *López Rodolfo **

*Estudiante de microbiología. Universidad Libre **Docente investigador. Universidad Libre. Grupo de investigación MICROBIOTEC. Semillero de investigación de microorganismos eficientes del suelo SIMICRES.

Resumen: Streptomyces sp. se considera de gran importancia en el campo de la

descomposición de residuos vegetales, por su capacidad para degradar celulosa.

El objetivo del presente trabajo de investigación consistió en evaluar las

posibilidades de aislar y caracterizar bioquímicamente la actinobacteria del género

Streptomyces, de muestras de suelo provenientes de un nicho ecológico del

campus Belmonte de la Universidad Libre Seccional Pereira, con el propósito de

obtener y purificar cultivos con fines de su aplicación en biocompostaje. Las

muestras de suelo se llevaron a laboratorio en bolsas ziploc®; seguidamente se

homogenizaron las muestras de manera manual, para posteriormente realizar las

diluciones propuestas; luego se realizaron siembras de las tres últimas diluciones

en medio de cultivo Agar avena, que permanecieron en condiciones de

temperatura ambiente; de los resultados se escogieron las colonias de morfología

semejante al género Streptomyces; a los 14 días de cultivo se procedió al repique

en medios Ashby, YGM y Murashige & Skoog (con pH ajustados a 7.0) para

conocer su productividad y sus características macroscópicas. El medio de cultivo

Ashby obtuvo los mejores aislamientos y la menor incidencia de contaminación a

diferencia de los otros. Posteriormente se procedió a la caracterización

microscópica, utilizando el Manual de Bergey; seguidamente se realizaron las

pruebas bioquímicas recomendadas para el género Streptomyces.

Palabras Clave: Actinobacterias, Streptomyces, suelo, medios de cultivo.

Abstract: Streptomyces sp. is considered of great importance in the field of the

decomposition of vegetable residues, for his aptitude to degrade cellulose. The aim

of the present work of investigation consisted of evaluating the possibilities of

isolating and characterizing biochemically the actinobacteria of the kind

Streptomyces, of samples of soil from an ecological niche of the campus Belmonte

of the University Free Sectional Pereira, with the intention of obtaining and

purifying cultures with ends of his application in biocompost. The samples of soil

removed to laboratory in bags ziploc®; immediately afterwards there were

homogenized the samples of a manual way, later to realize the proposed dilutions;

then there were realized sowings of the last three dilutions in the middle of culture

Agar oats, which they remained in conditions of temperature set; between the

results there were chosen the colonies of morphology similar to the kind

Streptomyces; to 14 days of culture one proceeded to the chime in means Ashby,

YGM and Murashige and Skoog (with pH fitted to 7.0) to know his productivity and

his macrocospic characteristics. Culture Ashby obtained the best isolations and the

minor incident of pollution unlike others. Later one proceeded to the microscopic

characterization, using Bergey's Manual; immediately afterwards there were

realized the biochemical tests recommended for the kind Streptomyces.

Keywords: Actinobacteria, Streptomyces, soil, culture media.

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Generalidades

El bienestar y la prosperidad del hombre dependen en gran medida de su dominio

sobre las poblaciones microbianas. Se ha visto que el crecimiento óptimo de los

microorganismos depende de varios factores corno son: pH, temperatura,

nutrientes, agua, entre otras (Muñoz, 2015).

La ecología microbiana se enfoca al estudio de la diversidad y funcionalidad de las

comunidades microbianas en los ambientes naturales y ambientes creados por el

hombre. Desde hace algunos años se propone que la mayoría de especies

microbianas no crece en el laboratorio, por lo que los estudios sobre la

biodiversidad y biogeografía de los microorganismos de distintos ambientes

ofrecen gran potencial para el campo investigativo e industrial (Medina, H &

Evangelista, 2011).

El suelo constituye el ambiente que alberga la mayoría de tipos representativos de

seres microscópicos y a una gran cantidad de microecosistemas en los cuales,

muchos de estos seres interactúan entre sí (Tresierra, Bendayán, & García, 1994).

Una de estas interacciones resulta ser la degradación de estructuras complejas a

simples para la mayor asimilación de nutrientes cuya mayor importancia resalta en

la producción de enzimas celulíticas.

La descomposición aeróbica ha sido usada para tratar residuos sólidos;

recientemente, el compostaje ha empezado a ser muy común para la degradación

de biocomponentes con microorganismos, pues los materiales obtenidos del

resultado del compostaje, redundan en la calidad de la estructura del suelo (Wei et

al., 2016).

Los carbohidratos en compostaje no solo incluyen sacáridos solubles sino que

también celulosa insoluble, siendo difícil de degradar para muchos de los

microorganismos. Además, los cambios en el ambiente del compostaje no son

conducentes con la calidad de la degradación de celulosa (Zhao et al., 2016).

1.2 Actinobacterias

Las actinobacterias son un grupo importante de bacterias saprófitas y de

crecimiento filamentoso, capaces de producir una amplia variedad de enzimas

extracelulares (León et al., 2011) y metabolitos secundarios de interés comercial e

industrial. Se ha evaluado que producen compuestos de uso biotecnológico como

antibióticos y enzimas industriales, entre otros (Bérdy, 2005).

Las actinobacterias son microorganismos atractivos por producir enzimas

hidroliticas de lignocelulosa (Taha et al., 2016). Las actinobacterias pueden formar

esporas en condiciones de altas temperaturas, además de resistir duros

ambientes, por lo que la inoculación de actinobacterias puede ser excelente

herramienta para aplicarse en bioprocesos, donde la celulosa se convierte en

productos complejos a simples, sin requerir la adición de enzimas (Zhao et al.,

2016) (Olson, McBride, Joe Shaw, & Lynd, 2012). Grupo en el cual hace parte

Streptomyces sp. (Zhao et al., 2016).

Además, las actinobacterias no solo son importantes en la degradación de

material vegetal, sino que hacen parte de un grupo de bacterias capaces de fijar

nitrógeno; el nitrógeno como factor limitante más importante en el desarrollo de las

plantas, después del agua, es primordial en la formación de estructuras

moleculares como ácidos nucléicos, aminoazúcares y aminoácidos, entre otros

(Olivares, 2008). Dentro de la gran variedad de microorganismos que han sido

descritos como Fijadores Biológicos de Nitrógeno (FBN) forman grupo importante

las bacterias del tipo Actinomicetos, que además desempeñan un papel

importante en la producción de metabolitos secundarios y la degradación de

material orgánico (Salazar & Ordoñez, 2013) .

1.3 Género Streptomyces

Representantes de Streptomyces son gram positivas, aerobias estrictas y catalasa

positivas; que no se colorean con la técnica de Ziehl-Neelsen ni de Kinyoun

(decoloración por ácido sulfúrico al 2%); capaces de producir filamentos (o

micelios) largos (de 0.5 a 1.0 µm de diámetro y una longitud indefinida), muy

ramificados y que no se fragmentan; presentan filamentos aéreos que pueden ser

rudimentarios y pueden estar adornados por espirales, enroscamientos o

ramificaciones múltiples, con producción de esporas (conidias), con frecuencia en

cadenas, que pueden ser rectas o flexuosas, enruladas o espiraladas. La

superficie de la espora puede ser lisa, rugosa o espinosa, formando pigmentos

asociados con las esporas (azules, verdes, grises, rojos, violetas, blandos o

amarrillos). Suelos con condiciones alcalinas y neutras son las más favorables

para el desarrollo de Streptomyces que suelos ácidos (Singleton, 2003).

Streptomycetes son habitantes naturales del suelo, responsables del geosmin que

emite la fragancia terrosa después de las lluvias; contienen una amplia variedad

de metabolitos secundarios que poseen antibacterianos, antifúngicos y antivirales,

entre otros y son importantes en la mineralización en los procesos del suelo,

además de descomponedores de restos vegetales (Sheetal & Modi, 2012).

Streptomyces sp. es un género que agrupa más de 500 especies de bacterias

gram positivas y filamentosas; hacen parte del Phylum Actinobacteria, Orden

Streptomycetales. Streptomyces es un género ubicuo en hábitats del suelo y

sedimentos acuáticos (Gontang et al., 2007).

En condiciones ambientales, los componentes bioactivos son cruciales en la vida

de Streptomyces en el suelo, y asociaciones asimbioticas donde se cree que los

antibióticos son armas antagonistas o como moléculas de señalización que

proporcionan una ventaja en la competitividad por nutrientes. Streptomyces es un

grupo saprofito habitante del suelo, con un rol crucial en el ciclado de nutrientes

(Kennedy, 1999); pero también se han encontrado endófitos, patógenos y como

simbiontes beneficiosos con una amplia variedad en organismos superiores,

incluyendo insectos y plantas (Loria et al., 2007) (Kaltenpoth et al., 2009) (Khan et

al., 2010) (Hulcr et al., 2011).

Además, Streptomyces es reconocido por tener un control en la salud del suelo, frente a diversos patógenos, especialmente cuando es inoculado como un microorganismo nativo (Kinkel, Schlatter, Bakker, & Arenz, 2012).

Actinomicetos viven extensivamente en ambientes ricos en lignocelulosa como el

suelo, compostaje, y otros. En una mezcla de poblaciones microbianas del

compostaje, los actinomicetos son importantes porque son capaces de producir

lacasa y descomponer la lignina, especialmente por altas temperaturas (Lu et al.,

2013).

En trabajos realizados con compostaje de residuos orgánicos, se realizó el

aislamiento de diferentes morfotipos microbianos, para evaluar su actividad

enzimática en medios sólidos con xilano y celulosa. Seleccionaron los mejores

microorganismos para cada actividad, encontrando 5 microorganismos con

potencial para degradar celulosa, de los cuales el actinomiceto Streptomyces sp.

demostró su capacidad para degradar celulosa (Cruz C., Castellanos S., &

Argüello A., 2011).

Jiménez (2012) reporta aceleración de las fases del proceso de compostaje de

residuos vegetales, cuando las pilas se inocularon con los microorganismos

Aspergillus Niger (Hongo) y/o Streptomyces (Actinomycetos), al disminuir el

tiempo de compostaje en 30 días, en comparación con las pilas que no fueron

inoculadas.

En el trabajo realizado por Salazar y Ordoñez (2013), para aislar e identificar

actinomicetos fijadores de nitrógeno, reportan que la caracterización microscópica

de la cepa JBUTP_GEA_G_A014, no indicó un rasgo particular que permitiera la

clasificación dentro de un grupo específico, recomendando las caracterizaciones

macroscópicas y bioquímicas para su identificación.

Además, para la confirmación del género, efectuaron pruebas para características

bioquímicas, según el medio de cultivo selectivo como fijadoras de nitrógeno

(medio Ashby); los resultados obtenidos fueron comparados (grado de similitud)

con referencias reportadas para géneros de Actinomicetos en el Manual de Bergey

(Salazar y Ordóñez, 2013).

1.4 Medios de cultivo

El medio avena agar es muy usado a nivel general para el aislamiento de los

hongos induciendo esporulación ya sea para el aislamiento, donde en algunos de

ellos se pueden cambiar algunas de sus características para favorecer o generar

las condiciones óptimas para el desarrollo del microorganismo en estudio ya sea

modificando el pH o agregando antibióticos (Curvelo & Rojas, 2010).

El medio Ashby es un agar especial por estar libre de nitrógeno, lo que facilita la

identificación de cepas potenciales en la fijación de nitrógeno. Los

microorganismos que crecen en este medio reemplazan la metabolización del

nitrógeno por el nitrógeno atmosférico que se encierra en el microambiente de la

caja de Petri (Salazar & Ordoñez, 2013).

El medio YGM contiene el extracto de levadura y la glucosa que influyen en el

crecimiento de actinobacterias (Glazebrook, Doull, Stuttard, & Vining, 1990)

(Shima, Hesketh, Okamoto, Kawamoto, & Ochi, 1996). Aunque se han utilizado

diferentes fuentes de carbono para el crecimiento de S. kanamycetus, se

encuentra que la glucosa (dextrosa) es la fuente de carbono más adecuada para

la producción de un antibiótico de S. kanamyceticus (Roodney et al., 2005). El

medio GYM streptomyces o ISP que a diferencia del anterior se utiliza extracto de

malta y carbonato de calcio (CaCO3) como fuente de cationes esenciales para el

crecimiento de Streptomyces (Song, Lee, Kang, Baek, & Suh, 2004)(Schumann &

Maier, 2014)(Montero-Calasanz et al., 2013).

En una gran mayoría de trabajos de investigación que se realizan en la

micropropagación vegetal, el medio basal MS es el medio de cultivo más utilizado,

propuesto por (Murashige & Skoog, 1962), para aplicarse en las técnicas de

cultivo de tejidos vegetales; medio en el cual se reporta con frecuencia la aparición

de microorganismos, especialmente bacterias (López, 2009); (Ramírez, Castaño,

& López, 2009)

2. OBJETIVO

Teniendo en cuenta la importancia ambiental de los actinomicetos en el desarrollo

de los suelos, y sabedores del posible potencial natural de sus representantes que

pueden estar presentes en el campus Belmonte de la Universidad Libre Seccional

Pereira, se propuso como objetivo del presente trabajo de investigación la

evaluación preliminar para aislar e identificar bioquímicamente actinobacterias del

genero Streptomyces sp., presentes en un nicho ecológico del campus Belmonte,

con propósitos para aplicarse en procesos de biocompostaje.

3. MATERIALES Y MÉTODOS

Protocolo de aislamiento y cuantificación de Streptomyces sp., a partir de

muestras de suelo de la Universidad Libre Seccional Pereira.

3.1Toma de la muestra de los suelos.

Se tomaron las muestras a partir del suelo rizosférico de uno de los (4) nichos

ecológicos presentes en la Universidad Libre los cuales son: Humedal, Bosque

intervenido, Matorral, guadual. (Ver Figura 1). El tipo de nicho ecológico escogido

fue el bosque intervenido.

Figura 1. Tipos de ecosistemas presentes en la Universidad Libre Seccional

Belmonte (Fuente: Autores).

Se analizó un nicho ecológico (Ver Figura 2), basados en la metodología

propuesta por Korayem et al. (2015) para el aislamiento de Streptomyces sp. en

suelos áridos, así como la metodología propuesta por Salazar & Ordoñez (2013)

para el aislamiento de actinomicetos en diferentes ecosistemas. El sitio de

recolección de la muestra de suelo se indica con su posicionamiento geográfico,

haciendo uso de un equipo GPS que denota: 4°48’19.72”N 75°45’34.91” O

Elevación 1246 m. Dicho suelo indicó al tacto una textura franco limosa, propia de

un suelo de la Unidad Montenegro, presente en la región del Eje Cafetero.

.

Figura 2. Mapa del muestreo geográfico de la Universidad Libre seccional

Belmonte (Fuente: Google Earth).

En el nicho ecológico se tomaron 3 muestras con la utilización de una pala

previamente lavada, en una capa de suelo no superior a los 20 cm de profundidad

en un hoyo en forma de V (Salazar & Ordoñez, 2013). Cada muestra de suelo se

rotuló como lo señala la NTC 3656 que incluye fecha, hora, nombre de la persona

que realiza el muestreo, profundidad, tipo de análisis, mapa o esquema de la zona

muestreada.

Para optimizar y homogenizar las muestras se adoptó la metodología enunciada

en el Manual de Laboratorio de Análisis Químico de Suelos y foliares de la UTP

(Salazar & Ordoñez, 2013).

Rojo: Bosque intervenido

Las muestras fueron recolectadas en bolsas con cierre hermético (Ziploc®); del

sitio de muestra, las muestras se transportaron en nevera portátil hasta al

laboratorio de Biología, donde se llevó el análisis.

El trabajo se realizó en el laboratorio de Biología de la Universidad Libre Seccional

Pereira. El cuarteo de las muestras de suelo se realizó sobre superficies

asépticas; retirando raíces, piedras y otros residuos sólidos (Ver figura 3). Paso

seguido, se formó un montón simétrico el cual se dividió en cuatro partes iguales,

dos de las cuales se desechan y las dos restantes se mezclaron nuevamente

hasta homogeneidad (Ver Figura 4). Estos pasos se vuelven a repetir hasta lograr

una cantidad de muestra aceptable aproximada de 100 g (NTC 3656) (Ver Figura

5).

Figura 3. Preparación de las muestras de 100 g.

Figura 4. Mezcla manual y cuarteo de las muestras.

Luego las contramuestras fueron refrigeradas a 4°C durante 2 semanas, luego

fueron descartadas por no requerirse.

3.2 Aislamiento de Streptomyces sp.

Para efectuar el aislamiento de especies de Streptomyces, se tomaron 10 g de la

muestra; luego se suspendieron en 90 ml de agua estéril, y se realizaron

diluciones por duplicado desde 10-1 hasta 10-7 en solución peptona (Oliveira, Silva,

& Sand, 2010).

Para la suspensión de las diluciones, se empleó el medio Agar-Avena, propuesto

por Curvelo y Rojas (2010).

Tabla 1. Componentes de avena agar

Componentes g/L

Agar-Agar 15

Avena 30

Para su preparación, se debe hervir la avena durante 1 hora en un litro de agua;

se procede a colar y se agrega el agar, después se completa el litro de agua y se

lleva a condiciones de autoclave a 121°C y 15 lbs de presión, por 20 min y servir

(Curvelo & Rojas, 2010).

Posteriormente, 0,1 ml de cada suspensión (las tres últimas diluciones) son

esparcidos en superficie en el agar (Agar Avena) por triplicado. Finalmente, se

incubaron a temperatura ambiente (30 ± 3° C), durante 14 días. En los días 7 y 14

de la incubación se revisaron las poblaciones microbianas presentes de cada

suspensión (Salazar & Ordoñez, 2013).

Para el cultivo de las suspensiones se empleó el medio Ashby, propuesto por

(Salazar & Ordoñez, 2013).

Componentes y preparación:

Tabla 2. Componentes del medio Ashby

Componentes g/L

Sacarosa 20

CaCl2 0.2

KH2PO4 1

MgSO4 0.2

FeSO4 0.005

NaCl 0.2

Agar-Agar 15

Se agregan los componentes al agua destilada. Seguido se calienta hasta

ebullición 5 min y se lleva a condiciones de autoclave (15lb y 121°C), por 20 min.

Por último se sirven en cajas de petri estériles.

También se empleó el agar YGM, propuesto por (Glazebrook et al., 1990) (Shima

et al., 1996).

Componentes y preparación:

Tabla 3. Componentes del medio YGM

Componentes g/L

Glucosa 4.0

Extracto de levadura 4.0

Agar 15

Agua destilada 1000

Seguido se calienta hasta ebullición 5 min y se lleva a condiciones de autoclave

(15lb y 121°C), por 20 min. Por último se sirven en cajas de petri estériles.

Se probó suplementando el medio YGM con extracto de malta y carbonato de

calcio al medio, según (Song et al., 2004)

Tabla 4. Componentes del GYM Streptomyces

Componentes g/L

Glucosa 4.0

Extracto de levadura 4.0

CaCO3 2.0

Extracto de malta 10.0

Agar 15

Agua destilada 1000

Seguido se ajustó el pH a 7.0 antes de agregar el agar. Después se llevó a

condiciones de autoclave (15lb y 121°C), por 20 min.

El último medio de cultivo probado fue el medio basal MS (Murashige y Skoog),

compuesto por las siguientes sustancias, según Tabla 4:

Tabla 5. Composición del medio basal MS

NUTRIENTE MS mg/L 1. NH4NO3 1650.0

2. KNO3 1900.0

3. MgSO4 x 7 H2O 370.0

4. KH2PO4 170.0

5. CaCl2 x 2 H2O 440.0

6. Na2EDTA x 2 H2O 37.4

7. FeSO4 x 7 H2O 27.8

8. H3BO3 6.2

9. MnSO4 x 4 H2O 22.3

10. ZnSO4 x 7 H2O 8.6

11. KI 0.83

12. Na2MoO4 x 2 H2O 0.25

13. CuSO4 x 5 H2O 0.025

14. CoCl2 x 6 H2O 0.025

Luego de mezcladas las sales, se lleva la solución a condiciones de autoclave (15

psi y 121 °C), por 20 minutos.

3.3 Caracterización macroscópica

Cuando el tiempo de incubación ha terminado se recopilan las características a un

nivel macroscópico crecidas en el agar (Agar Ashby, Agar YGM y Murashige &

Skoog) considerando: textura, color, forma, superficie y borde. Los aspectos a

valorarse son: colonias rugosas, cerosas, polvorosas bordes irregulares, colores

blanco, gris y café claro, posibilidad de colonias con anillos segmentados.

3.4 Caracterización microscópica

Se efectúa una primera clasificación de las colonias crecidas Agar (Agar Ashby,

Agar YGM y Murashige & Skoog) usando la tinción de Gram, descartando colonias

que macroscópicamente pueden ser similares a los Actinomicetos pero

microscópicamente presenten morfologías diferentes. Los actinomicetos son

bacterias Gram grampositivas, filamentosas y parcialmente ácido resistentes

(Negrón, Serrano, & Panizo, 2013) (Boone, Castenholz, & Garrity, 2001).

3.5 Caracterización bioquímica

Las pruebas bioquímicas se emplean para identificar de forma clara y precisa, la

presencia o ausencia de una enzima, de un grupo de enzimas, o de una vía

metabólica completa en uno o más microorganismos (Bojalil, Trujillo, & Cerbon,

1959).

A partir de las características bioquímicas que se evidencian con la aplicación de

estas pruebas, se logra la identificación en género o especie de microorganismos

mediante comparación de similitudes con características bioquímicas que han sido

reportadas (Krieg & Padgett, 2011)

3.5.1 Prueba de la Catalasa

Se utiliza para comprobar la presencia de la enzima catalasa que se encuentra en

la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias que contienen citocromo. Para

ello se deposita una gota de Peróxido de Hidrógeno al 30% sobre un portaobjetos

y haciendo uso de un asa de argolla se deposita sobre el reactivo la masa

bacteriana. El resultado será positivo si se observa la producción de pequeñas

burbujas como resultado de la degradación de peróxido de hidrógeno en agua y

oxígeno gaseoso (Bailón, Cruz, & Sandoval, 2003). El resultado para

Streptomyces sp. es positivo (Arias, Sánchez, & Hardisson, 1978).

3.5.2 Prueba de la Oxidasa

Al ser la mayoría de los actinomicetos aerobios estrictos, la prueba de la Oxidasa

permite poner de manifiesto el sistema citocromoxidasa, que se encuentra en

organismos de este tipo. Para ello se usó el método directo en donde se adiciona

una gota del reactivo de Kovacs sobre las colonias en el medio. El resultado es

positivo si se produce una reacción de color violeta a los pocos segundos (Bailón

et al., 2003). El resultado para Streptomyces sp es negativo (Hernández & Loaiza

Cano, 2014)(Salazar & Ordoñez, 2013).

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Toma de muestras

A partir de las muestras se realizó el procedimiento de cuarteo para su posterior

análisis (Ver Figura 5).

Figura 5. Representación de cuarteo de la muestra

4.2 Aislamiento de Streptomyces sp.

Posteriormente de una de las partes resultantes del cuarteo se procedió a efectuar

las diluciones (Ver Figura 6).

Figura 6. Preparación de las diluciones desde 10-1 hasta 10-7

Para el aislamiento de Streptomyces sp se utilizó el medio de cultivo Agar avena,

en el cual se realizó las diluciones de 10 -7. En la última dilución que fue 10-7, se

encontró una supuesta colonia del grupo actinobacteria y supuesto Streptomyces

sp (Ver figura 7).

Figura 7. Dilución 10-7 en el agar avena. Presencia de hongos y bacterias

filamentosos.

En el medio Agar avena se notó que crecen Actinobacterias y también una gran

diversidad de microorganismos tanto hongos como bacterias. Al ser un medio

enriquecido, y especial para microorganismos del suelo (Curvelo & Rojas, 2010).

Al agar avena también se le puede agregar sustancias antimicrobianas o

antifúngicas dependiendo de qué tipo microorganismo.

A partir de la colonia se realizaron repiques en los medios a probar (Agar Ashby,

Agar YGM y Murashige & Skoog). En el medio Ashby, las colonias aparecieron

entre los 5 a 7 días de incubación (Ver Figura 8).

Figura 8. Resultado del repique en medio Ashby.

En el agar YGM, las colonias aparecieron de 4 a 7 días de incubación (Ver Figura

9)

.

Figura 9. Resultado del repique en Agar YGM

En el agar suplementado (GYM streptomyces médium) las colonias aparecieron

de 5 a 8 dias (Ver Figura 10).

Figura 10. Resultado del repique en el agar GYM Streptomyces

En medio basal MS, las colonias empezaron a aparecer de 4 a 7 días de

incubación (Ver Figura 11).

Figura 11. Resultado del repique en medio basal MS

En el medio Asbhy, el aislamiento es más factible quizás por la escasez de

nutrientes, lo que impide que otro tipo de bacterias proliferen.

Se evidencio que el medio de cultivo Ashby usado tuvo buena productividad al

aislar una colonia con características de Streptomyces sp el mayor problema fue la

incidencia de contaminación por hongos (Ver Figura 12).

Figura 12. Evidencia de los repiques contaminados en el medio Asbhy.

Para el agar YGM, la incidencia de contaminación fue tanto de hongos y bacterias,

puede estar relacionado con el alto contenido de nutrientes (Glazebrook et al.,

1990) (Ver Figura 9). En la Figura 10 se nota que hubo poca contaminación.

Para el medio basal MS, la incidencia de contaminación fue especialmente de

hongos, aunque el aislamiento no fue tan productivo (Ver Figura 13).

Figura 13. Evidencia de los repiques contaminados en el medio MS

4.3 Caracterización macroscópica

Del previo aislamiento de la actinobacteria Streptomyces sp. se escogieron las

colonias morfológicas más parecidas a la literatura.

En el caso del agar Asbhy se obtuvo colonias rugosas y polvorosas con bordes

irregulares asimismo un color café grisáceo (Ver figura 12). Estas colonias son

parecidas a las colonias registradas por (Salazar & Ordoñez, 2013).

Figura 13. Evidencia macroscópica en el medio Ashby. Primera y segunda foto a

la izquierda; colonias obtenidas del repique, tercera foto a la derecha; evidencia

fotográfica por (Salazar & Ordoñez, 2013).

En el Agar YGM podemos notar que las colonias bacterianas fueron colonias

cerosas y polvorosas con bordes irregulares y un color blanquecino, estas colonias

pueden ser comparadas con el registro fotográfico del aislamiento, debido que

algunos ingredientes utilizados en el YGM, concuerdan con los ingredientes del

medio usado por (Sheetal & Modi, 2012).

Figura 14. Comparación macroscópica de colonias Streptomyces sp. Primera foto

a la izquierda; colonias obtenidas del repique, la segunda foto del centro; colonias

obtenidas del GYM Streptomyces la tercera foto a la derecha y la cuarta foto;

evidencia fotográfica por (Sheetal & Modi, 2012).

En el medio basal MS, se obtuvo colonias polvorosas y bordes irregulares con un

punto negro en el centro el resto es de color blanquecino.

Figura 15. Evidencia macroscópica de colonias en el medio basal MS

4.4 Caracterización microscópica

Para la tinción de Gram se escogió una de las colonias aisladas en el agar Ashby,

debido a que el aislamiento fue más productivo.

Se hicieron las respectivas pruebas, sin embargo los resultados no concuerdan

con los conceptos expuestos en el literatura (Sheetal & Modi, 2012)(Boone et al.,

2001)(Hernández & Loaiza Cano, 2014).

Streptomyces sp, es un estreptococo Gram positivo (Atta, 2015) (Röttig et al.,

2016). En esta prueba no se pudo evidenciar, semejante a lo reportado por

Salazar y Ordóñez (2013).

Figura 16. Comparación fotográfica de los resultados microscópicos. La primera

foto a la izquierda; tinción de Gram de colonias aisladas (100x), la foto del centro

es una foto de referencia de Streptomyces (Salazar & Ordoñez, 2013) y la tercera

foto a la derecha es la morfología descrita por (Boone et al., 2001).

Caso también registrado en una de las cepas reportados por (Salazar & Ordoñez,

2013) en donde la caracterización microscópica no permitió clasificarla.

4.5 Caracterización bioquímica

4.5.1 Prueba de la Catalasa

Para las pruebas bioquímicas, en la prueba de la catalasa resulto positivo (Ver

Tabla 5).

Tabla 6. Comparación de las pruebas bioquímica catalasa.

Colonia aislada Positivo (Salazar & Ordoñez, 2013)

Negativo(Salazar & Ordoñez, 2013)

Prueba catalasa

La prueba para Streptomyces sp, es positiva (Hernández & Loaiza Cano, 2014)

(Arias et al., 1978) (Varela & Grotiuz, n.d.).

4.5.2 Prueba de la Oxidasa

En el caso de la prueba oxidasa, el resultado fue negativo concordando con la

literatura pero la prueba puede estar determinada con la viabilidad metabólica de

las colonias aisladas (Lara Mantilla et al., 2008) (Varela & Grotiuz, n.d.) .

Tabla 7. Comparación de la prueba oxidasa

Colonia aislada Positivo (Salazar & Ordoñez, 2013)

Negativo (Salazar & Ordoñez, 2013)

Prueba oxidasa

5. CONCLUSIONES

En el suelo del nicho ecológico evaluado, se pudo tener la evidencia de la

presencia de Actinomicetos, dentro de los cuales se pudieron aislar colonias con

características morfológicas del género Streptomyces sp.

Cuando las siembras seleccionadas no se someten a repiques frecuentes en el

tiempo, tienden a perder su capacidad de crecimiento en las siembras nuevas,

además de no presentar actividad metabólica.

6. RECOMENDACIONES

Realizar nuevos análisis a partir del mismo nicho ecológico y mejorar las pruebas

bioquímicas que permitan identificar el género Streptomyces, para ser evaluado en

diferentes medios de cultivo, incluido el medio líquido, además de evaluar su

tiempo de viabilidad y actividad metabólica.

Se recomienda la utilización del medio Nitrato-Agar, debido a que por el contenido

de sus sales, se beneficia el crecimiento de actinomicetos, según lo reportan

Korayem y colaboradores (2015).

7. BIBLIOGRAFÍA

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