Evaluación preclínica de la Curcumina para el tratamiento ...
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1 Evaluación preclínica de la Curcumina para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas no transmisibles
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Evaluación preclínica de la Curcumina
para el tratamiento de enfermedades
inflamatorias crónicas no transmisibles
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Evaluación preclínica de la Curcumina para el tratamiento de enfermedades
inflamatorias crónicas no transmisibles
Jorge Humberto Tabares Guevara
Trabajo de Investigación presentado como requisito para optar al título de
Doctor en Ciencias Básicas Biomédicas, énfasis Inmunología
Director
José Robinson Ramírez Pineda, MSc, PhD.
Codirector
Juan Carlos Hernández, Sci.Doc.
Comité tutorial
Paula Andrea Correa Vanegas, MSc, PhD, Universidad de Antioquia, Medellín
Carlos Julio Montoya Guarín, MD, PhD, Universidad de Antioquia, Medellín
Universidad de Antioquia
Corporación Académica Ciencias Básicas Biomédicas
Medellín
2020
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Tabla de contenido
1. Presentación 7
2. Introducción general 8
3. Capítulo I: La Curcumina a bajas dosis promueve células reguladoras y ateroprotección en ratones dislipidémicos 24
4. Capítulo II: Explorando los efectos de la Curcumina a bajas dosis en enfermedad autoinmune y su mecanismo antiinflamatorio 83
5. Conclusión general 117
6. Perspectivas 120
7. Anexo 1. Otros desarrollos del proceso 122
8. Agradecimientos 137
9. Referencias 139
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Abreviaturas
ACV: accidente cerebrovascular Acs: anticuerpos AINES: antiinflamatorios no esteroideos ALT: alanino aminotransferasa ApoB100: apolipoproteína B100 ApoE: apolipoproteína E AST: aspartato aminotransferasa BHE: barrera hematoencefálica Breg: linfocito B regulador BSA: albúmina de suero bovino, del inglés bovine serum albumin CCR-: receptor de quimioquinas C-C, del inglés C-C chemokine receptor CD: del inglés cluster of differentiation (ej. CD40) cDC: células dendríticas clásicas o convencionales CFA: adyuvante de Freund completo, del inglés Complete Freund’s Adjuvant
CPA: células presentadoras de antígeno, del inglés antigen presenting cells ConA: concanavalina A COX 2: ciclooxigenasa 2. CT: colesterol total DC: células dendríticas, del inglés dendritic cells DEXA: dexametasona DMSO: dimetilsulfóxido DNA: ácido desoxirribonucleico ELISA: del inglés enzyme-linked immunosorbent assay EAE: encefalomielitis experimental autoinmune
EMRR: esclerosis múltiple recurrente-remitente
EMPP: esclerosis múltiple progresiva primaria
EMPS: esclerosis múltiple progresiva secundaria
EMRP: esclerosis múltiple recurrente progresiva
ECV: enfermedades cardiovasculares Flt3: del inglés FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3) receptor Foxp3: del inglés forkhead box P3 FRAP: del inglés Ferric Reducing Antioxidant Power Assay. G-CSF: del inglés granulocyte colony-stimulating factor GM-CSF: del inglés granulocyte-macrophage colony-stimulating factor HDL: lipoproteína de alta densidad H&E: hematoxilina/Eosina HFD: dieta proaterogénica, del inglés high fat diet HRP: del inglés horseradish peroxidase ICAM-1: del inglés intercellular adhesion molecule-1 Ig: inmunoglobulina (ej. IgM) IkK: I kappa B quinasa K ICOS: del inglés inducible co-stimulator IHQ: inmunohistoquímica
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IL-: interleuquina (ej. IL-10)
IFN-: interferón- (ej. IFN) i.v: intravenoso i.p: intraperitoneal LDL: lipoproteínas de baja densidad, del inglés low density lipoprotein LFA-1: antígeno funcional leucocitario-1 LXR: del inglés Liver X receptor-α MBP: proteína básica de la mielina
MCP-1: proteína quimioatrayente de monocitos-1 M-CSF: factor estimulante de monocito/macrófago MDA: malondialdehído MDA-LDL: LDL modificada por Malondialdehído MHC: complejo mayor de histocompatibilidad MOG: glicoproteína de la mielina del oligodendrocito MS: del inglés multiple sclerosis
Mo-DC: células dendríticas derivadas de monocitos mRNA: mensajero ácido ribonucleico (del inglés messenger ribonucleic acid) NFκB: del inglés nuclear factor kappa B NL: nódulo linfático NLp: nódulos linfáticos poplíteos NLpb: nódulos linfáticos para bronquiales NLsl: nódulos linfáticos sacrolumbares
NLR: del inglés NOD-like receptors NLRP3: del inglés NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3 NO: óxido nítrico NOD: del inglés nucleotide-binding oligomerization domain NTCD: del inglés Non transmissible chronic diseases OMS: organización mundial de la salud OR: oil Red O OVA: ovoalbúmina ox-LDL: lipoproteínas de baja densidad oxidada PAMP: patrón molecular asociado a patógenos, del inglés pathogen-associated molecular patterns PBS: buffer fosfato salino PCR: reacción en cadena de la polimerasa pDC: células dendríticas plasmacitoides PD-1: del inglés programmed cell death protein-1 PHA: fitohematoglutinina PI3K: del inglés phosphoinositide 3-kinase PLP: del inglés proteolipid protein)
PMA: phorbol 12-myristate 13-acetate
PPAR: del inglés peroxisome proliferator-activated receptor-γ PRR: receptores de reconocimiento de patrones PTX: toxina pertussis rLDL: receptor de lipoproteínas de baja densidad RT-PCR: reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa
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ROS: del inglés reactive oxygen species SBF: suero bovino fetal s.c.: subcutáneo SNC: sistema nervioso central
SPF: condiciones libres de patógenos específicos para murinos, del inglés specific pathogen free SR: receptores scavenger, del inglés scavenger receptor STAT5: del inglés signal transducer and activator of transcription 5 TBS: tris fosfato salino TCR: receptor de las células T, del inglés T cell receptor Tg: triglicéridos TGF-β: factor de crecimiento transformante β, del inglés transforming growth factor β Th-: células T colaboradoras, del inglés T helper (ej. Th1) TIM: del inglés T cell immunoglobulin mucin receptor 1 TLR: receptores tipo Toll, del inglés Toll-like receptor TNF: factor de necrosis tumoral, del inglés tumor necrosis factor TolDC: células dendríticas tolerogénicas Tr1: linfocitos T reguladores tipo 1 Treg: linfocitos T reguladores
V-CAM: molécula de adhesión celular vascular
vLDL: lipoproteínas de muy baja densidad WT: del inglés wild type
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1. Presentación
En el desarrollo de esta tesis se presentan los resultados del estudio sobre el
efecto inmunomodulador de la Curcumina en dos modelos murinos de
enfermedades inflamatorias crónicas no transmisibles.
En el Capítulo 1 se presentan los resultados del estudio acerca del efecto
ateroprotector de la Curcumina en un modelo murino de ratones dislipidémicos.
Este efecto ateroprotector se asoció con cambios inmunológicos, en vez de
efectos hipolipemiantes o antioxidantes. Se encontró que el tratamiento induce
un aumento en la producción de IL-10 en diferentes subpoblaciones de células
del sistema inmune y un aumento en la frecuencia de linfocitos Treg.
En el Capítulo 2, se presentan los resultados de los estudios en un modelo
murino de encefalitis experimental autoinmune (EAE), el cual es usado como
modelo de la esclerosis múltiple humana. En este caso, se encontró que el
tratamiento subcutáneo con la Curcumina podía tener efectos neuroprotectores,
a través de su acción antiinflamatoria. Asimismo, se demostró la importancia del
papel que media la IL-10 como mecanismo inmunomodulador de la Curcumina
bajo el esquema de tratamiento propuesto.
Finalmente se presentan las conclusiones generales y con base en los
resultados obtenidos, más lo reportado previamente en la literatura, se proponen
un modelo de acción de la Curcumina para las patologías experimentales
estudiadas, y su relación con la respuesta antiinflamatoria.
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2. Introducción general
Las enfermedades crónicas no trasmisibles (NTCD, Non Transmissible Chronic
Diseases), se definen como procesos de evolución prolongada, de etiología
múltiple y con un desarrollo poco predecible, que rara vez alcanzan una cura
completa, lo cual genera una gran carga tanto en la calidad de vida del paciente,
como en la salud pública (1). De estas, cuatro categorías son las principales
responsables de la morbilidad y la mortalidad por NTCD: i) enfermedades
cardiovasculares (ECV), ii) cáncer, iii) enfermedades respiratorias crónicas, y iv)
diabetes. Además, estas patologías comparten factores de riesgo comunes
como la hipertensión, la hiperglicemia, la hipercolesterolemia y la obesidad, que
a su vez se derivan de regímenes alimentarios no saludables, sedentarismo,
consumo de tabaco y exceso de alcohol (2).
Si bien las NTCD pueden prevenirse o controlarse, en gran parte con
intervenciones que abordan los factores de riesgo comunes mediante una
detección y un tratamiento temprano, esta batalla se sigue perdiendo, ya que en
los últimos años las NTCD han logrado alcanzar proporciones pandémicas.
Estas enfermedades amenazan el desarrollo tanto económico como social,
además de la vida y la salud de millones de personas. La Organización Mundial
de la Salud (OMS) señaló que para el año 2016, de los 57 millones de muertes
ocurridas, las NTCD fueron responsables de 41 millones, lo que representa el
71% de las muertes globales. Entre las principales NTCD se incluyen
enfermedades cardiovasculares (17,9 millones de muertes, 44% de todas las
muertes por NTCD); cáncer (9 millones de muertes); enfermedades respiratorias
crónicas (3,8 millones de muertes); y diabetes (1,6 millones de muertes). Cerca
del 75% de las muertes prematuras de adultos (las cuales ocurren en personas
de 30 a 69 años) fueron causadas por NTCD, lo que demuestra que éstas no
son únicamente un problema de las poblaciones mayores (>60 años) (2). Las
NTCD son un problema global de salud pública que afecta la mayoría de
naciones, pero principalmente aquellas poblaciones en situación de
vulnerabilidad socioeconómica y son actualmente la causa principal de morbi-
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mortalidad de nuestro país (2,3). La carga mundial de enfermedades no
transmisibles y la amenaza que suponen constituye un importante problema de
salud pública que desmejora el desarrollo social y económico en todo el mundo.
Para evitar las crecientes desigualdades entre diferentes países y poblaciones
se necesitan medidas urgentes a nivel mundial, que mitiguen esta amenaza.
Con respecto a las ECV, la mortalidad se explica en gran parte por la ruptura o
la oclusión de los vasos arteriales que irrigan el cerebro o el corazón, llevan al
infarto de los tejidos comprometidos y a otros daños severos de estos órganos.
El tratamiento de las ECV se basa principalmente en la revascularización de
vasos ocluidos a través de medios invasivos (como cateterismos o stent) y el uso
de antiagregantes, anticoagulantes y antihipertensivos. Asimismo, se han
implementado medidas preventivas que tratan de retardar la aparición de
eventos cerebrovasculares, específicamente reduciendo los factores de riesgo
comunes tales como la hipertensión arterial, el tabaquismo, el sedentarismo y la
hiperglucemia, junto con la administración de medicamentos hipolipemiantes.
Aunque estas medidas han logrado impactar la mortalidad por ECV en los países
en vía de desarrollo, la salud pública y la economía en estos sigue siendo
afectada por estas enfermedades, dado su alto costo en tratamientos médicos y
pérdida de productividad. A pesar de los constantes esfuerzos e inversiones en
la búsqueda de nuevos fármacos contra las ECV, los intentos siguen siendo
relativamente fallidos, ya que si bien estos logran impactar algunos factores de
riesgo como la hipercolesterolemia o la hipertensión, no tienen efectos sobre el
componente inmunológico que precede la aparición de algunas ECV. Por lo
tanto, se hace evidente la necesidad de profundizar nuestros conocimientos
sobre los mecanismos patogénicos de estas enfermedades, con el fin de
desarrollar medidas preventivas y terapéuticas que logren mitigar sus efectos.
De esta manera, la búsqueda de nuevas moléculas con propiedades
inmunomoduladoras que logren modificar los eventos inflamatorios ocurridos
durante las ECV, podrían llevar a la implementación de nuevas terapias (4,5).
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El fenómeno central durante la patogénesis de las ECV es un proceso crónico
conocido como la aterosclerosis, en el que se observa una perturbación de la
pared vascular de las arterias coronarias, carótidas, aortas y arterias periféricas
(6). La aterosclerosis es de origen multifactorial, desencadenada por
interacciones complejas entre factores genéticos, biológicos y ambientales. El
proceso aterosclerótico se inicia con un daño del endotelio vascular, el cual
desempeña un papel esencial en la fisiología arterial, pues controla el tono
vascular normal, la coagulación, el estado quiescente de las células musculares
lisas y la adhesión de los leucocitos. El endotelio normal exhibe una baja
permeabilidad a lipoproteinas, mantiene una superficie antiadherente para
leucocitos y posee mecanismos de control para mantener una superficie
anticoagulante (6). Pero una vez el endotelio es activado y se hace disfuncional,
se produce la expresión de moléculas de adhesión, procoagulantes y citoquinas
proinflamatorias (7). En este estado disfuncional, el endotelio presenta un
aumento en su permeabilidad a las lipoproteínas de baja densidad (LDL) hacia
la íntima, donde son retenidas (7). Estas LDL son acumuladas y más
susceptibles a sufrir modificaciones oxidativas causadas por ataques
enzimáticos mediados por mieloperoxidasas, lipoxigenasas o por especies
reactivas de oxígeno (ROS), convirtiéndose en LDL oxidadas (ox-LDL). Estas ox-
LDL han sido identificadas como un antígeno dominante durante la patogénesis
de la aterosclerosis; sin embargo, la β2 glicoproteína I (β2-GPI) y las proteínas
de choque térmico (heat shock protein, HSP) también han sido implicadas en
este proceso (8,9). Paralelamente, las ox-LDL activan al endotelio, lo que
conlleva a la expresión de moléculas de adhesión que llevan principalmente a
que los monocitos y linfocitos T circulantes atraviesen el endotelio por diapédesis
a través de las uniones interendoteliales y colonicen así el espacio subendotelial
(6). En este sitio, y mediante la acción de diversas citoquinas como, por ejemplo,
el factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF) y la IL-
3, los monocitos son diferenciados a macrófagos, los cuales regulan
positivamente la expresión de receptores de la inmunidad innata (como los
receptores tipo Toll, TLR, y receptores scavenger, SR). De esta manera, los
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macrófagos endocitan las moléculas ox-LDL que conlleva a su activación,
produciendo radicales de oxígeno y nitrógeno, proteasas y citoquinas
proinflamatorias. Todo esto activa otras células presentes en la placa
ateromatosa y promueve la infiltración de más monocitos, linfocitos T y de LDL
desde la circulación. Finalmente, se genera un cúmulo de ox-LDL intracelular, la
cual es internalizada a través de SR (principalmente CD36) por el macrófago, lo
que conlleva a que se transforme en una célula espumosa (7).
Se ha evidenciado que los macrófagos activados con ox-LDL y las células
espumosas poseen propiedades proaterogénicas, debido a la expresión
aumentada de receptores scavenger CD36 y la producción de ROS, que
promueven la aparición de nuevas ox-LDL, activando consecuentemente otros
monocitos/macrófagos y promoviendo la formación de nuevas células
espumosas (10). La acumulación de células espumosas, linfocitos T
principalmente productores de IFNγ (Th1), células de músculo liso y material
lipídico en la íntima, origina la formación de una estría grasa, evento temprano
en la aterogénesis. El reclutamiento de células inflamatorias resulta en la
liberación local de mediadores proinflamatorios, como citoquinas y enzimas
proteolíticas, que promueven el incremento del flujo de lipoproteínas, estrés
oxidativo y formación de nuevas células espumosas (6). Este círculo vicioso de
inflamación, muerte celular y oxidación de LDL, finalmente resulta en un
engrosamiento progresivo de la estría grasa, lo que conlleva a la formación de la
placa aterosclerótica, que obstruye la luz arterial. Además, se pueden generar
desprendimientos de material lipídico y de trombos que provocan taponamientos,
lo que conlleva a isquemia en las regiones afectadas (6). Si bien el proceso
aterosclerótico es localizado, la respuesta inflamatoria descrita lleva a
consecuencias sistémicas. Estas evidencias sustentan de manera convincente
el papel patogénico del sistema inmune, principalmente de los macrófagos y los
linfocitos Th1, en el desarrollo y progresión de la aterosclerosis.
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La presencia de linfocitos T en el ateroma, los cuales reconocen antígenos
derivados de la ox-LDL, fue la primera pista que demostró la presencia de una
respuesta inmune localizada contra ox-LDL (11,12). Los linfocitos T CD4+ juegan
un papel crucial en el desarrollo de la aterosclerosis, ya que su eliminación en
los modelos murinos de aterosclerosis conduce a la reducción de las lesiones
aórticas (13). Los linfocitos T CD4+ no son una población homogénea, ya que
consiste principalmente de diferentes subpoblaciones como linfocitos de tipo
Th1, Th2, Th17 y linfocitos T reguladores (Treg) que ejercen diferentes
funciones. La población predominante de linfocitos T CD4+ en el ateroma, es la
de los linfocitos de tipo Th1, los cuales tienen propiedades proaterogénicas,
principalmente atribuida a la secreción de IFN que lleva a la posterior infiltración
de monocitos, activación de macrófagos, formación de células espumosas y a la
ruptura de la placa, debido a la disminución en la síntesis de colágeno (14). Por
su parte, el papel de la respuesta de linfocitos Th17 aún sigue siendo debatible,
a pesar de su detección tanto en lesiones humanas como murinas, ya que ha
sido implicada en la estabilización de la placa aterosclerótica debido a que
promueve la inducción de fibrosis (9) o reducción del ateroma (15), mientras que
su papel proaterogénico ha sido atribuido al hecho de que tanto el IFN como la
IL-17 son expresados por linfocitos T CD4+ infiltrantes de vasos ateroescleróticos
coronarios (16).
Aunque los linfocitos B son poco frecuentes en el ateroma, la evidencia sugiere
que también contribuyen en la patogénesis de la aterosclerosis. Los linfocitos B
se dividen tradicionalmente en subpoblaciones B1 y B2; los linfocitos B1 son
considerados como la fuente principal de anticuerpos naturales anti-IgM,
incluidos los autoanticuerpos IgM anti-ox-LDL ateroprotectores. Mientras, los
linfocitos B2 se encuentran implicados en la producción de anticuerpos de alta
afinidad IgG, y son vistos principalmente como células aterogénicas, ya sea a
través de la inducción de anticuerpos IgG o la producción de citoquinas
proinflamatorias como TNF (8). Por otro lado, los linfocitos Treg ejercen un
papel ateroprotector debido a los efectos estabilizadores de la placa
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ateromatosa, mediados por el factor de crecimiento transformante β (TGF-β) o
la producción de IL-10 (17). Además, el impacto ateroprotector de los linfocitos
Treg ha sido demostrado experimentalmente en ratones ateroscleróticos, donde
se ha usado su eliminación (aumento del ateroma) o transferencia adoptiva de
esta población celular (efectos ateroprotectivos) (17). Por lo tanto, tratamientos
inmunomoduladores que medien un aumento en la función o expansión de estas
células, parecen ser una estrategia promisoria para el tratamiento de la ECV
(18,19).
En los últimos años, se ha evidenciado tanto en humanos como en ratones, la
presencia dentro de la placa aterosclerótica de células dendríticas (DC), que
ejercen funciones proaterogénicas o antiaterogénicas durante el progreso de
esta patología (20,21). Las DC tienen la capacidad de internalizar la ox-LDL y
adoptar un tipo de apariencia de células espumosas in vivo, y de esta manera es
probable que ellas participen en respuestas inflamatorias en las lesiones
ateromatosas (22). Las DC pueden migrar desde la pared vascular hacia el tejido
linfático o interactuar con linfocitos T de la adventicia. También puede ser
considerado que los antígenos circulantes pueden ser tomados directamente por
las DC en el bazo o nódulos linfáticos, y que estas células en esos sitios
contribuyan a la activación de los linfocitos T (21). Se ha propuesto que las DC
que están presentes en las lesiones ateroscleróticas logran capturar antígenos
para luego procesarlos y ser presentados en el complejo mayor de
histocompatibilidad clase I (MHC I) o clase II (MHC II). Tras su maduración, las
DC migran al nódulo linfático drenante para presentar el antígeno a los linfocitos
T naive (21). Se han identificado en modelos murinos de aterosclerosis distintas
subpoblaciones de DC en la aorta: las células dendríticas diferenciadas de
monocitos (Mo-DC), las células dendríticas convencionales o clásicas (cDC) (23)
y las células dendríticas plasmacitoides (pDC) (21). Se demostró que las Mo-DC
expresan altos niveles del receptor de quimioquinas CX3CR1 y que ratones
dislipidémicos deficientes en este receptor, presentan lesiones ateroscleróticas
atenuadas (24). Por su parte, las cDC (MHC II+ CD11c+ CD103+) promueven la
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respuesta de linfocitos Treg (23). El papel de las pDC en aterosclerosis ha sido
contradictorios, por ejemplo, la eliminación de pDC agrava la lesión en el seno
aórtico y en la arteria carótida en ratones deficientes en el receptor de LDL (rLDL-
/-), lo que es atribuido a la pérdida de la indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) que
normalmente restringe la proliferación de los linfocitos T (25). Por el contrario, en
dos estudios independientes la eliminación de las pDC disminuye el ateroma en
el seno aórtico de ratones deficientes en apolipoproteína E (ApoE-/-) (26,27). El
entendimiento de la contribución funcional de las subclases de DC en la
aterosclerosis permite orientar nuevos enfoques terapéuticos, ya que esta
población de células puede llevar a un aumento de la aterosclerosis o una
respuesta ateroprotectiva mediada por linfocitos Treg, lo cual puede ser de
potencial interés para estrategias terapéuticas traslacionales al ámbito clínico.
El descubrimiento del papel inmunogénico y tolerogénico de las DC ha abierto
una posibilidad de intervención inmunológica para una variedad de
enfermedades. La proliferación y supervivencia de los linfocitos Treg depende
fundamentalmente de la continua interacción con DC, presumiblemente por la
presentación antigénica en un contexto tolerogénico. La ausencia de vías
inhibitorias, como PD-1 (programmed cell death protein-1) o ICOS (inducible co-
stimulator), reduce la actividad de los linfocitos Treg y lleva a un incremento en
las lesiones ateroscleróticas en ratones rLDL-/- (28,29). Por otro lado, moléculas
antiinflamatorias como TGF-β o IL-10, han sido evaluadas para la prevención y
terapia en enfermedades autoinmunes, gracias a las propiedades tolerogénicas
mediadas por las DC (30). En el contexto de aterosclerosis, estas estrategias
han sido probadas en modelos murinos, donde se ha demostrado que al tratar
DC con IL-10 y un ateroantígeno (apoB100 humana) y luego ser administradas
a ratones rLDL-/- y transgénicos para ApoB100 humana (ratones huB100tg x
rLDL-/-), se induce tolerancia de linfocitos T a ApoB100, con una disminución en
las respuestas específicas Th1 y Th2, y una reducción significativa de la placa
aterosclerótica (31). Por otro lado, la transferencia adoptiva de cuerpos
apoptóticos de DC pulsadas con ox-LDL en ratones rLDL-/-, demostró la
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capacidad de modular la aterosclerosis induciendo tolerancia, y evidenciando un
mayor número de DC esplénicas tolerogénicas CD103+, con un aumento
concomitante de linfocitos Treg (32). Esta evidencia reciente de que la
ateroesclerosis es promovida por la alteración del equilibrio entre la actividad
supresora de los linfocitos Treg y la activación de la inmunidad efectora Th1, ha
dado lugar a nuevas oportunidades para inducir la expansión o función de los
linfocitos Treg y así estimular la inmunidad ateroprotectora al inducir tolerancia
inmunológica.
Se han utilizado DC diferenciadas a partir de médula ósea y estas han sido
utilizadas para la generación de TolDC in vitro, y protocolos de inmunoterapias
en modelos animales de aterosclerosis (32,33). Sin embargo, existe el riesgo de
activación espontánea durante el cultivo o luego de su transferencia adoptiva in
vivo, lo que ha llevado a la búsqueda de agentes que logren mantener estable
su fenotipo inmaduro (34–37). El mecanismo asociado al potencial
inmunoregulador de las TolDC, es su capacidad para inducir linfocitos Treg. De
manera interesante, se ha demostrado que estos linfocitos Treg, ejercen una
retroalimentación negativa sobre las TolDC, que lleva a la inhibición de
coestimuladores y a la inducción de factores inhibidores en los linfocitos T (38).
De esta manera, las TolDC y los linfocitos Treg parecen retroalimentarse para
potenciar y mantener sus funciones tolerogénicas en el tiempo. Todos estos
hallazgos, junto con las evidencias que demuestran que las TolDC juegan un
papel importante en la diferenciación, expansión y activación de los linfocitos
Treg, propone a estas células como estrategia promisoria inmunorreguladora
contra las NTCD, entre estas las ECV, generando linfocitos Treg específicos de
ateroantígenos.
Por otro lado, similar a lo ocurrido durante la patogénesis de la aterosclerosis, la
esclerosis múltiple (multiple esclerosis, MS) es un tipo de NTCD, en la cual el
sistema inmune parece tener gran relevancia. La MS es una enfermedad
inflamatoria crónica que conlleva a un daño de la vaina de la mielina que cubre
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a los axones, y al daño a las neuronas en el SNC, debido a la pérdidad de la
selectividad que se da en la barrera hematoencefálica (BHE), que permite el
ingreso de células del sistema inmune que generan dichas afectaciones (39). La
BHE es una pequeña capa de células endoteliales especializadas, que separa el
SNC del sistema circulatorio, y que actúan como un sistema protector que
garantiza la función cerebral, ya que evita que moléculas dañinas ingresen al
SNC (40). Bajo circunstancias normales, el SNC es considerado un sitio de
vigilancia inmune altamente regulado y activo (41). Sin embargo, durante la MS,
los linfocitos de la periferia pueden cruzar la BHE y migrar hacia el SNC. Es así
como la interrupción de la integridad de la BHE es un requisito previo para el
desarrollo de la MS, y esto se produce en respuesta al estrés oxidativo,
citoquinas, factores de crecimiento o factores ambientales que pueden afectar la
estabilidad de la BHE, ya que pueden modificar las uniones célula-célula,
además de permitir la adhesión y migración transendotelial de diversos
leucocitos (42).
La respuesta inflamatoria ocurrida en la MS, se han reproducido modelos
animales experimentales que han logrado contribuir al conocimiento de esta
enfermedad; el más aceptado y usado es el modelo de EAE (experimental
autoimmune encephalomyelitis) que reproduce las características patogénicas
de la MS humana. Uno de los modelos más usados para EAE es el inducido en
la cepa de ratones C57BL/6, a los cuales se les administra un péptido derivado
de MOG (mielyn oligodendrocyte glycoprotein) en conjunto con el adyuvante
completo de Freund (CFA), y posteriormente la toxina pertussis (PTX), para
generar la ruptura de la BHE (43). Esta combinación induce una respuesta
autoinmune contra MOG, que a través de la inflamación inducida por linfocitos
autorreactivos Th1/Th17, y junto a la producción de autoanticuerpos
opsonizantes de la mielina, median la activación del complemento y/o la
citotoxicidad mediada por macrófagos. Además, se da la producción de
citoquinas proinflamatorias (IFN, IL-17, TNF), que en conjunto generan daño
a la mielina y la pérdida axonal (43,44). Las DC contribuyen en la patogénesis
de la MS, a través de la presentación antigénica de diferentes péptidos derivados
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de proteínas del SNC, como lo son la MBP (mielyn basic protein), PLP
(proteolipid protein,) y MOG (44). Al inicio de la MS, las DC proporcionan señales
para la polarización de los linfocitos T autorreactivos; una vez que los linfocitos
cruzan la BHE e ingresan al SNC, las DC residentes proporcionan nuevamente
señales estimulantes para promover la diferenciación de los linfocitos Th1/Th17
durante la progresión de MS (39).
También existe evidencia de la participación de los linfocitos B en la patogénesis
de la MS (45). Estos linfocitos tienen la capacidad de presentar autoantígenos a
los linfocitos T CD4+ y promover respuestas, tanto Th1 como Th17, a través de
sus marcadores de superficie (46). Ciertos linfocitos B se convierten en células
plasmáticas que secretan anticuerpos específicos de la mielina y pueden
conducir a un deterioro funcional y a la evolución de la MS, mediante activación
del complemento o citotoxicidad mediada por macrófagos (47).
La polarización de los linfocitos T CD4+ naive en linfocitos T patogénicos, es un
proceso importante en el desarrollo de la MS. Diferentes estudios en humanos y
modelos animales han demostrado que los linfocitos Th17 cumplen un papel
patogénico en la MS y EAE (48,49). Los linfocitos Th17 secretan varios tipos de
citoquinas proinflamatorias, como IL-17, IL-21, IL-22, IL-23 y TNF, que
promueven respuestas inflamatorias. Además, la IL-17 es capaz de inducir la
secreción de IL-1β, IL-6 y óxido nítrico, y mediar la disfunción de las células
endoteliales de la BHE durante la MS (50,51). Igualmente, se han observado
linfocitos Th1 patogénicos en lesiones del SNC en la MS y EAE. La transferencia
adoptiva de linfocitos Th1 específicos de la mielina en ratones, induce EAE grave
y alta producción de IFN, que ha sido también detectado en altos niveles en el
líquido cefalorraquídeo de pacientes con MS (52).
Al igual que lo ocurrido durante la aterosclerosis, las Treg mantienen el estado
de tolerancia inmune durante la MS. La transferencia adoptiva de linfocitos Treg
reduce la severidad de EAE y que su eliminación la aumenta (53,54). En ese
contexto, se ha propuesto que los posibles mecanismos de iniciación y
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perpetuación de la enfermedad podrían deberse a la propagación de linfocitos
Th1/Th17, debido al reconocimiento de epítopes propios y la activación de
células espectadoras. Dado esto, parece que también una estrategia terapéutica
alternativa en la MS podría ser restaurar la auto-tolerancia hacia los
autoantígenos mediante enfoques de inmunización tolerogénica (55)(56).
Gracias al reconocimiento del papel de la respuesta inflamatoria en el desarrollo
de las NTCD, y del sistema inmune como blanco terapéutico, se han
incrementado el uso de nuevas formas de intervención de éstas y de otras
condiciones crónicas asociadas, como la diabetes tipo 2 o algunas
enfermedades autoinmunes, a través de la inmunomodulación (57). Un sistema
inmunitario saludable defiende al cuerpo contra enfermedades e infecciones,
pero su desregulación o mala función, puede desencadenar patologías
asociadas al daño de células y tejidos sanos. Estos ataques pueden afectar
cualquier parte del cuerpo, debilitando la función corporal e incluso poniendo en
peligro la vida. El panorama general que emerge, tanto de estudios preclínicos
como clínicos, es que las terapias biológicas (anticuerpos monoclonales, mAb)
que bloquean los mediadores proinflamatorios, incluyendo las citoquinas, son
costosas para los sistemas de salud, dificultando su implementación rutinaria en
el tratamiento de NTCD. Adicionalmente, una complicación frecuente del uso de
estas terapias biológicas (al igual que de otras terapias inmunosupresoras), es
el riesgo de infección y la aparición de tumores, como consecuencia de una baja
especificidad del tratamiento (58–60). En los últimos años, se han realizado
aproximaciones terapéuticas que involucran la transferencia adoptiva de células
inmunes como las TolDC y los linfocitos Treg, y aunque han demostrado ser
efectivas, los requerimientos técnicos y la logística para su ejecución son
complicadas, costosas y difíciles de aplicar en el ámbito clínico (61). Debido a
esto, es necesario idear nuevas estrategias que contemplen las
vías/dosis/esquemas de administración y formas de liberación de
inmunomoduladores que, además de ser efectivas, sean seguras, costo-
efectivos y fáciles de implementar en la práctica clínica (62).
19
Una amplia variedad de medicamentos inmunosupresores han sido utilizados
para tratar diversos tipos de patologías inflamatorias, como las alergias y las
enfermedades autoinmunes (63). Aunque éstos han logrado ser efectivos, sólo
confieren efectos temporales, ya que no logran modificar permanentemente la
respuesta inmune hacia los antígenos patogénicos y, por lo tanto, no alcanza a
ser un tratamiento que lleve a curación. En el año 2008, Kang y colaboradores
reportaron la utilización de inmunosupresores como adyuvantes para
"tolerización inmunogénica". En este, caso la dexametasona (DEX) se administró
junto con un inmunógeno peptídico de la proteína ovoalbúmina (OVA), en un
modelo murino de hipersensibilidad retardada, se demostró que la DEX induce
una respuesta tolerogénica a la inmunización activa y que esta se asocia
directamente con la expansión de linfocitos Treg específicos de OVA in vivo, lo
cual disminuye la hipersensibilidad a OVA (64).
Las investigaciones recientes en el Grupo Inmunomodulación (GIM) de la
Universidad de Antioquia, sugieren que una de las estrategias más promisoria
de inmunoterapia para las NTCD consiste en inducir de manera activa una
respuesta inmune tolerogénica antígeno específica. En este sentido, desde hace
varios años el GIM viene trabajando en esa dirección, explorando compuestos
de origen natural o sintético que funcionen como adyuvantes tolerogénicos,
dados los efectos que pudieran tener éstos sobre la respuesta inmune y sus
capacidades para inducir, TolDC y/o linfocitos Treg. La hipótesis de trabajo se
ha centrado en que la inyección subcutánea, repetitiva y a bajas dosis de
formulaciones que contengan adyuvantes tolerogénicos, provocaría el
condicionamiento de las DC hacia un estado tolerogénico (TolDC) (62). Esto
favorece un ambiente regulador a través de la producción de citoquinas como la
IL-10, lo que, en consecuencia, llevaría a la expansión/función de linfocitos Treg.
Estos linfocitos Treg eventualmente migrarán a los tejidos y a los nódulos
linfáticos, para ejercer un efecto supresor sobre células que promueven la
respuesta de linfocitos T patogénicos. Adicionalmente, las bajas dosis usadas,
la vía de administración subcutánea y la corta vida media de los adyuvantes
tolerogénicos, tendría en consecuencia muy baja o nula exposición sistémica,
20
asegurando la ausencia de efectos secundarios tóxicos; además, esto se
convierte en una estrategia experimental simple, segura y de bajo costo de
inducción de linfocitos Treg (62).
De esta manera, el propósito fue evaluar el potencial de adyuvante tolerogénico
de la Curcumina, un compuesto de origen natural cuya seguridad y uso ha sido
establecido. La Curcumina (1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadien-
3,5-dione), es el principal polifenol hidrofóbico extraído del rizoma de la planta
Cúrcuma longa, y ha sido históricamente consumida por los humanos. Es una
molécula que exhibe distintas actividades biológicas, que incluyen propiedades
antiinflamatorias, antioxidantes, inducción de apoptosis, potente actividad
antiviral, antibacterial, antiproliferativa, hipoglucemiante e hipocolesterolémica
(65). Asimismo, existe evidencia de los efectos de la Curcumina en una variedad
de condiciones patológicas como el cáncer, inflamación, obesidad y enfermedad
cardiovascular (66–71). Como otros polifenoles dietarios, la Curcumina tiene
poca biodisponibilidad sistémica, característica farmacocinética que ha sido
determinada a través de varias especies animales, y es el resultado de una pobre
absorción y ávida conjugación metabólica y reducción (72). A pesar de que la
Curcumina es poco disponible seguido a su administración oral, existen reportes
en animales que demuestran que puede ejercer en altas dosis actividad biológica
en sitios distantes al de absorción, tales como pecho, próstata, pulmón y,
especialmente, en el hígado (73–76). Es por esto que diversas presentaciones
de la Curcumina han sido formuladas con el fin de incrementar su
biodisponibilidad/biodistribución y vida media, teniendo como fin incrementar sus
efectos sistémicos (77). La seguridad farmacológica y eficacia de la Curcumina
la convierten en un compuesto potencial para el tratamiento y prevención de una
amplia variedad de enfermedades humanas; sin embargo, esta no ha sido
todavía aprobada como un agente terapéutico.
En el caso de algunas ECV (hipertensión, isquemia cerebral o infarto agudo de
miocardio), cuya causa subyacente es la aterosclerosis, la Curcumina ha
demostrado ejercer efectos benéficos sobre algunos de los componentes
21
modificables o susceptibles de modulación que hacen parte del proceso
aterosclerótico, como la hipercolesterolemia. Se ha reportado que la Curcumina
disminuye los niveles hepáticos de colesterol y modifica los niveles plasmáticos
de lipoproteínas o aumenta el transporte reverso de colesterol; gracias a esto se
ha logrado demostrar su papel protector contra la hipercolesterolemia en
animales que reciben dietas proaterogénicas y suplementados con dosis altas
de Curcumina (78–80). En ese contexto, los efectos hipolipemiantes han sido
encontrados en humanos con síndrome metabólico que han sido tratados con
Curcumina (81). Adicionalmente, ensayos in vitro e in vivo han demostrado que
la Curcumina actúa como un agente inhibidor de la oxidación y la peroxidación
lipídica de la LDL (82,83). Así mismo, se ha observado su capacidad para inhibir
la agregación plaquetaria, la cual pudiese estar relacionada con la inhibición del
tromboxano (promotor de la agregación) y un incremento en la actividad de la
prostaciclina (inhibidor de la agregación) (84).
Mientras que los efectos de la Curcumina sobre el metabolismo de lípidos o la
agregación plaquetaria han sido ampliamente estudiados, los mecanismos
ateroprotectores mediados por ésta, a través de la modulación del sistema
inmune, aún no han sido totalmente elucidados. La proteína C reactiva (PCR) ha
sido identificada como un importante factor de riesgo predisponente a las ECV;
su mecanismo patogénico en aterosclerosis sugiere que media la activación del
sistema del complemento (vía clásica) y la formación de células espumosas, lo
que desencadena una cascada de eventos que incluye la activación y
degranulación de neutrófilos, y disfunción endotelial. Se ha observado en
ensayos clínicos que el consumo de curcuminoides (entre ellos Curcumina) lleva
a una reducción significativa de los niveles circulantes de PCR (85),
demostrando su capacidad antiinflamatoria. Además, la Curcumina puede
regular negativamente la expresión de varias citoquinas, incluyendo IL-1β, IL-2,
IL-12, IL-6, IL-8, TNF y quimioquinas, a través de la inhibición de NFκB (86,87).
22
La evidencia sugiere que la Curcumina es un agente modulador del crecimiento
y respuesta de distintas células del sistema inmune. Por ejemplo, en linfocitos T
derivados de bazo humano, se encontró que la Curcumina inhibe su proliferación
frente a estímulos policlonales (como Concanavalina A, fitohemaglutinina y
Phorbol 12-myristate 13-acetate), lo cual se acompañaba de una disminución de
IL-2; esto además, se correlacionó con la supresión en la activación del NFκB
(88). También, se ha observado que inhibe la activación del inflamasoma NLRP3
en macrófagos (89), lo que es de gran importancia dado su papel crucial en el
desarrollo y progresión de la aterosclerosis (90). En este contexto, recientemente
se observó que el tratamiento con Curcumina en ratones dislipidémicos
disminuye el tamaño del ateroma a través de la regulación de TLR4, lo que
conlleva a una disminución en la producción de IL-1β, la cual depende de la
activación del inflamasoma NLRP3 (91). Por otra parte, la modulación del NFκB
lleva al bloqueo de la maduración de las DC, induciendo un fenotipo de TolDC,
que subsecuentemente promueve linfocitos Treg Foxp3+ funcionales, tanto in
vitro como in vivo (87). Gracias al descubrimiento del papel que juega la
inflamación durante el desarrollo del proceso aterogénico, y a que en paralelo
existe una red conformada por linfocitos Treg, mediadores solubles como la IL-
10 y el TGFβ, y receptores inhibitorios que en conjunto pueden modular la
inflamación, se espera que tratamientos que fortalezcan esta red den lugar a
nuevas estrategias de tratamiento.
El diseño e implementación de estrategias inmunoprofilácticas e
inmunoterapéuticas que involucren el uso in vivo de agentes capaces de generar
TolDC e inducir la expansión y activación de linfocitos Treg, como la Curcumina,
es una idea atractiva con un gran potencial para atenuar la progresión de la
aterosclerosis o la MS. A pesar de esto, los mecanismos ateroprotectivos o
neuroprotectores mediados por la Curcumina a través de la modulación del
sistema inmune, aún no son totalmente elucidados. La Curcumina tiene varios
aspectos importantes para el posible desarrollo de una terapia tolerogénica: su
adquisición, purificación y caracterización son de bajo costo; posee propiedades
23
fluorescentes, pudiéndose desarrollar métodos analíticos específicos y sensibles
usando equipos simples como un espectrofluorometro, lo que hace posible su
cuantificación y la evaluación de su biodisponibilidad/distribución; y, finalmente,
existe suficiente literatura científica sobre su uso y seguridad, inclusive
administrada a altas dosis. Adicionalmente, ha sido demostrado de manera
persistente que tiene efectos antiinflamatorios in vivo (66). Estas características
podrían facilitar una transición hacia el escenario clínico y por lo tanto pudiera
ser una terapia útil para su uso en algunas patologías humanas de origen
inflamatorio.
Es así como, usando dos modelos murinos de ratones, los cuales asemejan las
características clínicas y fisiopatológicas de la aterosclerosis y la esclerosis
múltiple (dos NTCD) que afectan a los humanos, y las cuales tienen como
componente principal un autoantígeno que inicia la respuesta inflamatoria que
induce el desarrollo de la enfermedad, en este trabajo pretendimos evaluar si la
administración subcutánea a bajas dosis de Curcumina induce
atero/neuroprotección, que pudiese estar asociada con cambios
inmunoreguladores (red tolerogénica), más que cambios metabólicos, sin ser
necesaria la circulación sistémica de la Curcumina a altas concentraciones. Así
mismo, determinamos si este perfil tolerogénico es mediado a través de la
producción de IL-10, lo que en consecuencia llevaría a la expansión/función de
los linfocitos Treg.
24
3. Capítulo I: La Curcumina a bajas dosis promueve células
reguladoras y ateroprotección en ratones dislipidémicos
Resumen
Introducción: La aterosclerosis es la primera causa de morbimortalidad en el
mundo. Debido a su complejidad, es de vital importancia entender el origen de
las lesiones cardiovasculares, con el fin de comprender los mecanismos
patogénicos y desarrollar tratamientos efectivos. Esta enfermedad comienza por
un daño en el endotelio vascular, permitiendo la acumulación de lipoproteínas de
baja densidad (LDL) en la íntima arterial, donde sufren modificaciones oxidativas,
generando LDL oxidadas (ox-LDL). El reconocimiento específico de antígenos
derivados de ox-LDL por células del sistema inmune genera inflamación crónica
persistente, mediada principalmente por linfocitos Th1 en el ateroma. Esta
respuesta efectora puede ser controlada por medio de la respuesta inmune
reguladora y atenuar su progresión; este efecto puede ser potenciado por la
Curcumina, que ha demostrado que puede inhibir la maduración de células
dendríticas y promover la expansión de linfocitos T reguladores in vivo. La
importancia del sistema inmune en la génesis y progresión del ateroma ha
impulsado la investigación de alternativas inmunoterapéuticas que modulen la
respuesta inflamatoria durante la aterosclerosis, a través de la inducción de
células con perfil regulador.
Objetivo: Determinar el efecto in vivo de la administración subcutánea de la
Curcumina en un modelo murino de aterosclerosis y su contribución en la
modulación de la respuesta inflamatoria.
Metodología: Ratones ApoE-/- (dislipidémicos que desarrollan lesiones
ateroscleróticas), fueron tratados los días 0, 4 y 7 con Curcumina (10 μg en 50
µL de PBS + 2% DMSO) en la almohadilla plantar; este esquema fue repetido
ocho veces con intervalos de una semana. A partir del día 21 de iniciado el
tratamiento, se alimentaron con dieta proaterogénica por 14 semanas. Se
evaluaron parámetros clínicos de toxicidad, perfil lipídico en suero, actividad
antioxidante, el tamaño de la placa aterosclerótica y el infiltrado inflamatorio en
25
el seno aórtico, y por citometría de flujo se evaluó la presencia de células con
perfil regulador o inflamatorio en el bazo.
Resultados: En los ratones tratados con Curcumina, no se evidenciaron efectos
hipolipemiantes o antioxidante, que pudieran mediar ateroprotección. Pero sí se
evidenció una reducción significativa del tamaño de las placas ateroscleróticas y
del infiltrado de monocitos/macrófagos y linfocitos T, y un aumento de células
Foxp3+ en el seno aórtico. Conjuntamente, se encontró un incremento
significativo en la frecuencia de CPA productoras de IL-10 y linfocitos
CD4+Foxp3+, acompañado de una disminución de linfocitos productores de IFN
y TNF.
Conclusión: Estos resultados sugieren que la Curcumina modula la población de
células con características reguladoras durante el proceso aterogénico,
favoreciendo una disminución en la respuesta inflamatoria mediada por linfocitos
T reguladores, lo que conlleva a un retraso en el proceso proaterogénico.
Palabras clave: aterosclerosis, lipoproteína de baja densidad oxidada (ox-LDL),
Curcumina, linfocitos T reguladores, alternativas inmunoterapéuticas.
26
Abstract
Introduction: Atherosclerosis is the first cause of morbidity and mortality in the
world. Due to its complexity, it is vitally important to know the origin of
cardiovascular lesions, to understand the pathogenic mechanisms and develop
effective treatments. This disease begins with damage to the vascular
endothelium, allowing the accumulation of low-density lipoproteins (LDL) in the
arterial intima, where they undergo oxidative modifications, generating oxidized
LDL (ox-LDL). The specific recognition of ox-LDL-derived antigens by cells of the
immune system generates persistent chronic inflammation, mainly mediated by
Th1 lymphocytes in the atheroma. This effector response can be controlled by
the regulatory immune response and attenuate its progression. This effect can
be enhanced by Curcumin, since it has been shown that it can inhibit the
maturation of dendritic cells and promote the expansion of regulatory T
lymphocytes in vivo. The importance of the immune system in the genesis and
progression of atheroma has prompted the investigation of immunotherapeutic
alternatives that modulate the inflammatory response during atherosclerosis,
through the induction of cells with regulatory profile.
Aim: To determine the in vivo effect of subcutaneous administration of Curcumin
on a murine model of atherosclerosis and its contribution in modulating the
inflammatory response.
Methodology: ApoE-/- mice (dyslipidemic and developing atherosclerotic lesions),
were treated on days 0, 4, and 7 with Curcumin (10 µg in 50 µL of PBS + 2 %
DMSO) in the footpad; This scheme was repeated eight times with one-week
intervals. From day 21 of starting treatment, they were fed a pro-atherogenic diet
for 14 weeks. Clinical parameters of toxicity, serum lipid profile, antioxidant
activity, the size of the atherosclerotic plaque and the inflammatory infiltrate in the
aortic sinus were evaluated, and the presence of cells with a regulatory or
inflammatory profile in the spleen was evaluated by flow cytometry.
Results: In the mice treated with Curcumin, there were no lipid-lowering or
antioxidant effects that could mediate atheroprotection. However, there was a
27
significant reduction in the size of the atherosclerotic plaques and the infiltration
of monocytes/macrophages and T lymphocytes, and an increase in Foxp3+ cells
in the aortic sinus. Together, a significant increase in the frequency of IL-10-
producing APCs and CD4+ Foxp3+ lymphocytes was found, accompanied by a
decrease in IFN and TNF-producing lymphocytes.
Conclusion: These results suggest that Curcumin modulates the population of
cells with regulatory characteristics during the atherogenic process, favoring a
decrease in the inflammatory response mediated by T regulatory lymphocytes,
which leads to a delay in the proatherogenic process.
Keywords: atherosclerosis, oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL), Curcumin,
regulatory T cells, immunotherapeutic alternatives.
28
Objetivos
Objetivo General
Determinar el efecto in vivo de la administración subcutánea de la Curcumina
sobre células tolerogénicas en un modelo murino de aterosclerosis y su
contribución en la modulación de la respuesta inflamatoria.
Objetivos específicos ● Evaluar el efecto antiaterogénico de la Curcumina en ratones deficientes
en Apolipoproteína E.
● Determinar el efecto de la Curcumina in vivo sobre células con fenotipo
inflamatorio, y su potencial para inducir células con fenotipo antiinflamatorio.
● Evaluar si el tratamiento con la Curcumina induce apoptosis en células de
órganos linfoides secundarios.
29
Materiales y métodos
Animales, dieta y reactivos
Se utilizaron ratones C57BL/6 deficientes en apolipoproteína E (ApoE-/-),
provenientes de un núcleo fundador adquiridos en Jackson Laboratories (USA),
los cuales fueron mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos
para murinos (specific pathogen free, SPF) en el bioterio de la Sede de
Investigación Universitaria (SIU) de la Universidad de Antioquia, mediante un
estricto programa de cruces endogámicos a partir de las colonias fundadoras.
Los ratones ApoE-/- exhiben lesiones alrededor del área del arco aórtico y la
arteria abdominal. La generación rápida de estas lesiones requiere del suministro
de una dieta rica en grasa, que lleva a un aumento de los niveles plasmáticos de
colesterol debido a un severo defecto en el aclaramiento de lipoproteínas por el
hígado (92). Esta cepa de ratones ha estado sujeta a controles microbiológicos
anuales para garantizar la ausencia de patógenos específicos de murinos. Todos
los procedimientos descritos en el presente trabajo fueron aprobados por el
comité institucional para el uso y cuidado de los animales de experimentación
(CICUAL) de la Universidad de Antioquia.
Los ratones ApoE-/- carecen de un gen involucrado en el metabolismo de lípidos,
cuya deficiencia genera hipercolesterolemia. Estos animales han permitido el
estudio de hiperlipidemias y el proceso aterosclerótico (93–95). Los ratones
ApoE-/- fueron alimentados con dieta estándar durante las primeras 2 rondas de
tratamiento con la Curcumina (10μg en phosphate buffered saline, PBS, Gibco,
Life Technologies, USA) o el vehículo (PBS + dimetilsulfóxido, DMSO, Sigma-
Aldrich, USA) y posteriormente con dieta proaterogénica (42% de grasa y 1,5%
de colesterol, referenciada como HFD (high fat diet; Harlan Teklad, USA), de
acuerdo con el modelo experimental de aterosclerosis adaptado a las
condiciones instauradas en el Grupo Inmunomodulación de la Universidad de
Antioquia (96). La Curcumina (≥90 %) fue adquirida en Cayman Chemical (Ítem
No. 81025; MI, USA). Previo a su uso, se prepararon soluciones stock de 20
30
mg/mL en DMSO y se almacenaron a -20°C, a partir de estas se prepararon las
soluciones inyectables en PBS libre de endotoxina para el esquema de
tratamiento.
Evaluación in vivo del efecto ateroprotector de la Curcumina
Con el fin de evaluar si la inyección subcutánea a bajas dosis de la Curcumina,
tiene un efecto ateroprotector y modulador de la respuesta inmune, se usó un
modelo murino de aterosclerosis. Basados en la literatura y en los resultados
obtenidos en nuestro Grupo (96,97), los ratones ApoE-/- desarrollan
espontáneamente lesiones ateroscleróticas similares a las humanas en
diferentes secciones del aparato circulatorio arterial, que crecen hasta formar
lesiones estables cuyo desarrollo y progresión pueden acelerarse como
consecuencia del uso de HFD, en comparación con una dieta estándar (98).
Basados en el protocolo publicado por Kang y colaboradores (64) y resultados
previamente obtenidos en el Grupo (62), los ratones ApoE-/- machos de 8-10
semanas fueron tratados con vehículo o la Curcumina en la almohadilla plantar.
Estos fueron administrados los días 0, 4 y 7 (esquema que representa una ronda
de tratamiento). Este esquema se repitió 8 veces con intervalos de una semana.
Durante las primeras 2 rondas de tratamiento (hasta el día 21) los animales
fueron alimentados con una dieta estándar para roedores, y a partir del día 21
los ratones fueron alimentados con HFD, hasta finalizar el tratamiento (figura 1A).
Los animales fueron vigilados diariamente para determinar cambios en la
postura, hidratación, comportamiento y apariencia física. Adicionalmente, se
llevó a cabo un registro semanal de peso y estado general de salud.
Sacrificio de animales y obtención de muestras
Una semana después del cese del tratamiento, se realizó la eutanasia de los
animales mediante una dosis letal de ketamina y xilacina (100 mg/kg y 10 mg/kg,
respectivamente) por inyección intraperitoneal y se obtuvieron diferentes
muestras biológicas para los distintos análisis (figura 1B). De cada animal se
obtuvo en condiciones asépticas: sangre por punción cardiaca, corazón, cayado
31
aórtico-aorta abdominal, nódulos linfáticos poplíteos y bazo. Para mantener en
condiciones óptimas órganos como el bazo y los nódulos linfáticos, fueron
transportados en un baño de hielo hasta su procesamiento. Las células
provenientes de nódulo linfático poplíteo (NLp) y de bazo se obtuvieron aplicando
los protocolos publicados en eBioscience Best Protocol, con algunas
modificaciones acorde a las condiciones de nuestro laboratorio (99). Para
obtener suspensiones celulares de NLp, se realizó disrupción mecánica de los
tejidos entre dos membranas de poliéster con un poro de 74 µm (Spectra Mesh®
Woven Filters, USA) en una caja de Petri estéril (BD Falcon, USA) conteniendo
2 mL del medio RPMI 1640-GlutaMAX™ (Gibco, Life Technologies, USA).La
suspensión obtenida se lavó durante 10 minutos a 500 x g x 4°C. Finalmente las
células se resuspendieron en 1 mL del medio RPMI 1640-GlutaMAX™
suplementado con 10% de suero bovino fetal (fetal bovine serum, FBS, Gibco,
Life Technologies, USA), 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina
(Gibco, Life Technologies, USA).
La suspensión celular se mantuvo en frio mientras se realizó el recuento
mediante citometría de flujo usando el kit de viabilidad celular con perlas de BD
Biosciences (349480, USA). Por su parte, las células del bazo se obtuvieron a
través de perfusión del órgano, inyectándolo repetidamente con 3 mL de PBS
con el fin de promover la salida de los esplenocitos y el resto de las células fueron
obtenidas por disrupción mecánica del tejido (descrita anteriormente). Esta
suspensión se lavó una vez durante 10 minutos a 500 x g x 4°C y el botón
obtenido se resuspendió en 0,5 mL de buffer de lisis de glóbulos rojos
(eBioscience, USA) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Pasado el tiempo
de lisis, las células se lavaron en las condiciones ya descritas con 5 mL de PBS
centrifugando 5 min a 500 x g x4°C, el botón obtenido se resuspendió en 2 mL
de medio RPMI 1640-GlutaMAX™ suplementado, y finalmente se realizó el
conteo de las células de la misma manera que se evaluó en el NLp.
32
El corazón se perfundió con 2 mL de cloruro de sodio 0,9% (CORPAUL,
Colombia) directamente en el ventrículo izquierdo y posteriormente con 1 mL de
heparina sódica 20 UI/mL (Gland Pharma, India); así mismo se realizó la
microdisección del cayado aórtico abdominal, retirando todo el tejido graso de
sus alrededores. Cada corazón fue removido del cayado aórtico-aorta-abdominal
mediante un corte en la aorta ascendente cerca de 1 mm después de que ésta
emerge del corazón. Posteriormente, se fijó con paraformaldehído al 4% (JT
Baker, USA) durante 48 horas a 4ºC, sumergido en una solución de sacarosa al
30% (Sigma-Aldrich, USA) durante 24 horas a 4ºC y finalmente en la resina de
congelación Shandon Cryomatrix (Thermo Scientific, USA) a -20°C hasta su
procesamiento. Las muestras de sangre total de los ratones fueron centrifugadas
durante 15 minutos a 4000 x rpm y los sueros obtenidos fueron almacenados a
-80°C hasta el momento de su análisis.
Procesamiento de muestras para la cuantificación del tamaño de la placa ateromatosa y el infiltrado inflamatorio en el seno aórtico
Las muestras de corazón fueron procesadas en criostato (CM-1850, Leica
Microsystems, Germany), obteniendo criosecciones seriadas de 6 μm de
espesor desde el inicio del seno aórtico hasta el inicio del arco ascendente y
posteriormente dispuestos en placas electrocargadas Superfrost Plus (Thermo
Scientific, USA). Para determinar el área de la placa aterosclerótica o la
deposición lipídica, los cortes histológicos fueron teñidos con
Hematoxilina/Eosina (Thermo Scientific, USA) o con Oil Red (Sigma-Aldrich,
USA), respectivamente. Adicionalmente, se destinaron cortes de seno aórtico en
placas para inmunofluorescencia, los cuales fueron fijados en acetona a 4ºC
durante 5 min y almacenadas a -20ºC hasta efectuar las diferentes
inmunotinciones. En estas se evaluó el infiltrado inflamatorio mediante la
detección de marcadores de macrófagos (CD68), linfocitos T (CD3) y células
reguladoras (Foxp3). Para las inmunotinciones, se siguieron y adaptaron los
protocolos publicados por R&D Systems (100).
33
En general, después de rehidratar las criosecciones con PBS, se llevó a cabo la
recuperación de los antígenos cubriendo las criosecciones con la solución
UniTrieve (Innovex Bioscienses NB325, USA) a 65°C en baño maría durante 30
min. Los tejidos fueron lavados 3 veces con agua, realizando recambio de agua
después de cada lavado. Luego los cortes se enjuagaron con PBS y se rodearon
con una barrera hidrofóbica utilizando el marcador Dako Pen (Dako, Dinamarca).
Para reducir las interacciones hidrófobas no específicas entre los anticuerpos
primarios y el tejido, estos fueron cubiertos con una solución de bloqueo
comercial Background Buster (Innovex Bioscienses, NB306-50, USA) y buffer de
bloqueo compuesto de 1% de albúmina de suero bovino (bovine serum albumin,
BSA, Sigma-Aldrich, USA) y 0,3% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, USA). Los
tejidos fueron incubados en oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente en
cámara húmeda. Posteriormente se incubaron con los anticuerpos primarios
anti-CD68 (FA-11, Bio-Rad Laboratories Inc. Hercules, USA) para macrófagos
en una dilución 1:100 en buffer diluente (TBS + BSA 0,3% + Triton X-100 0,3%),
anti-CD3 (KT3, Bio-Rad Laboratories Inc. Hercules, USA) para linfocitos T en una
dilución 1:50 en buffer de bloqueo (TBS + BSA 1% + Triton X-100 0,3%) y anti-
Foxp3 para células reguladoras (FJK-16S, eBioscience, USA) en una dilución
1:100 en buffer de bloqueo, en todos los casos los anticuerpos fueron incubados
durante toda la noche a 4°C en cámara húmeda. Como control negativo se
utilizaron placas a las cuales se les adicionó el buffer de bloqueo sin el anticuerpo
primario. Luego, las criosecciones se lavaron de 3 a 4 veces (5 min cada uno)
con buffer de lavado (TBS + Tween® 20, 0,05%) y se incubaron a temperatura
ambiente con el anticuerpo secundario de cabra anti-rata conjugado con Alexa
594 (Thermo Fisher Scientific Inc., USA). Posteriormente se realizaron de 3 a 4
lavados con buffer de bloqueo a temperatura ambiente y finalmente se añadió al
cubreobjetos medio de montaje VECTASHIELD (Vector Laboratories, H-1200,
USA), el cual contiene DAPI para el marcaje de núcleos celulares.
La cuantificación del área del ateroma por H&E o la deposición lipídica con OR,
se realizó mediante la medición del área de la lesión aterosclerótica o el área
34
positiva en rojo en µm2, respectivamente. La evaluación del infiltrado inflamatorio
de macrófagos y de linfocitos T se realizó mediante la sumatoria del área positiva
en rojo. Estos análisis se realizaron a partir de microfotografías tomadas a una
magnificación de 10x usando la cámara digital (Nikon DS-Fi1, Japón) adaptada
a un microscopio de fluorescencia Zeiss Axio Scope.A1 (Carl Zeiss, Germany).
Para el análisis de Foxp3, se tomaron fotografías en una magnificación de 20x
de las tres válvulas aórticas en cada corte del seno aórtico y se contaron el
número de células positivas para este marcador. Las imágenes fueron
analizadas usando los software Image J o NIS ELEMENTS (Nikon, Japón)
(101,102).
Caracterización de esplenocitos con fenotipo regulador por citometría de flujo
El procedimiento que será descrito a continuación aplica para todas las
citometrías realizadas en este estudio, excepto el paso de incubación con
estímulos que es necesario para la visualización de IL-10, pero no de Foxp3. Los
bazos de cada animal fueron procesados individualmente. 1x106 células fueron
estimuladas con Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 5 ng/ml; Sigma-Aldrich,
USA, P8139) ionomicina (500 ng/mL; Sigma-Aldrich, USA, I0634) y monensina
(2µM; eBioscience, USA) en tubos de 12x75mm (BD Falcon, USA) durante 4-5
horas en 1mL de medio completo (RPMI 1640-GlutaMAX™) libre de endotoxina
suplementado con 10% de FBS y 100 U/mL de penicilina/100 µg/mL de
estreptomicina). Luego las suspensiones celulares tanto para la tinción de IL-10
como para Foxp3 fueron lavadas dos veces con PBS e incubadas con 0,5 µg de
Fc BlockTM (BD Biosciences, USA) y 0,05 µg del colorante amino-reactivo
LIVE/DEAD® (Fixable Aqua and Green Dead Cell Stain Kit, Invitrogen, USA)
durante 15 min a 4°C. Posteriormente se lavaron una vez con PBS y se
resuspendieron en solución de bloqueo durante 10 minutos. Finalmente se
efectuó la tinción de superficie adicionando los anticuerpos a las concentraciones
óptimas previamente tituladas.
35
Para la tinción intracelular de IL-10 las células se fijaron con formaldehído al 4%
en PBS durante 20 minutos a 4°C. Luego se permeabilizaron con una solución
de PBS que contenía saponina al 0,1% (Sigma-Aldrich, USA), SBF al 10%, BSA
al 0,1%, 1 mM de CaCl2, 1mM MgSO4 y 40 mM de HEPES (Sigma-Aldrich, USA),
antes de adicionar el anticuerpo anti-IL-10. En el caso de la tinción intracelular
para Foxp3, se utilizaron las soluciones de fijación y permeabilización
comerciales (BD Biosciences) para la tinción con su anticuerpo Foxp3. Las
tinciones inmunofluorescentes se efectuaron siguiendo y adaptando a las
condiciones del laboratorio los protocolos sugeridos por los proveedores
(eBioscience Best Protocols® y BD Biosciences) (99).
Durante las tinciones inmunofluorescentes desarrolladas en este trabajo se
usaron los siguientes anticuerpos provenientes de BD Biosciences (USA): anti-
CD11c-PE-Cy7 (HL3), anti-CD8a-APC (53-6.7), anti-CD4-APC y PE (RM4-5),
anti-MHC II PE y FITC (AF6-120.1), anti-CD19 APC (1D3), anti-IL-10 APC y PE
(JES5-16E3) anti-IFN PE (XMG1.2), anti-TNF PE-Cy7 (MP6-XT22) y anti-
Foxp3 PE (MF23); y eBioscience (San Diego, CA, USA): anti-GITR-PE-Cyanine
7 (DTLA-1,) y anti-PD.1-APC-eFluor 780 (J43). Posteriormente, las muestras
fueron adquiridas en el citómetro BD LSR Fortessa™ o Accuri™ C6 Plus
localizado en la Unidad de Citometría de la Sede de Investigación Universitaria
(SIU) y el Grupo Inmunomodulación (respectivamente), ambos pertenecientes a
la Universidad de Antioquia. Para las tinciones que incluían el marcador CD4, se
adquirieron entre 30,000–50,000 eventos dentro de la región de las células CD4+.
Para las demás tinciones, se adquirieron 300,000–500,000 eventos dentro de la
región de las células vivas. Los datos colectados se analizaron en el software
FACSDiva 8.0.1 (BD Biosciences).
Se usaron controles de fluorescencia menos uno (Fluorescence minus one,
FMO) durante la jerarquización de las regiones con el fin de distinguir las
poblaciones positivas de las negativas. Para el caso de la tinción con IFN, TNF
e IL-10, este límite de fluorescencia se determinó además usando un control de
36
células sin estímulo pero coloreadas. Durante la estandarización de las tinciones,
se crearon las matrices de compensación usando como controles suspensiones
celulares de bazo y nódulo linfático teñidas con un solo fluorocromo. Los valores
de compensación se obtuvieron alineando las medianas de las poblaciones en
cada canal independiente. La compensación se verificó en cada experimento con
los controles de FMO. Durante los análisis, los datos se visualizaron usando la
escala biexponencial (lógica) y los diagramas de contornos de probabilidad al
5% (103). Así mismo, para normalizar sobre el número total de células, como
una aproximación a los valores absolutos para cada población celular analizada,
el cociente entre el número de eventos positivos para cada población analizada
y el número de eventos dentro de la población de células vivas, se multiplicó por
el recuento celular obtenido por ratón para los órganos evaluados. Los datos
fueron analizados con el software FlowJoTm Software Version 10.6.2.
Evaluación de la producción de citoquinas
Las suspensiones celulares de bazo fueron procesadas individualmente y
resuspendidas a una densidad de 1,5x106 células/mL para luego ser cultivadas
a 37oC en atmósfera húmeda con 5% CO2, en presencia de diferentes
concentraciones de Con A (0,1; 0,3 o 1 µg/mL) durante 72 horas. Luego se
determinó la producción de IFN en los sobrenadantes de cultivos, usando un
estuche comercial de ELISA (Mouse ELISA Kit II OptEIA, BD Biosciences, USA),
siguiendo las recomendaciones del fabricante. La absorbancia fue medida en un
lector de ELISA (Bio-Rad iMark, USA) a una longitud de onda de 450 nm con
corrección a 570 nm. La concentración de la citoquina en las muestras problema
se determinó por medio de la interpolación con curva estándar. El nivel de
detección mínimo para esta citoquina fue 31,25 pg/mL y máximo 1000 pg/mL,
finalmente se usó el programa Prisma Graphpad Prism Versión 6 para el análisis
estadístico.
37
Cuantificación de IgM e IgG totales y específicos contra la ox-LDL
Los niveles de inmunoglobulinas tipo IgM y IgG totales en suero fueron
cuantificados por ELISA, usando Ready-Set-Go Kits (eBioscience), siguiendo las
instrucciones del fabricante y la absorbancia fue medida en un lector de ELISA
(Bio-Rad iMark, USA) a una longitud de onda de 450 nm. Los niveles de
inmunoglobulinas tipo IgM, IgG, IgG1, IgG2c específicas de la ox-LDL fueron
medidos en el suero de los ratones a través de un ensayo de ELISA in house.
Brevemente, se sensibilizaron platos de 96 pozos (Costar, USA) con 50 µL de
ox-LDL (10 µg/mL) en PBS pH 7,4, durante toda la noche a 4ºC. Posteriormente
fueron lavados 5 veces con una solución tampón (TBS pH 8,0) y bloqueados 2
horas con BSA 1% a temperatura ambiente. Los platos se lavaron con TBS y
fueron incubados por 24 horas con 100 µL de la muestra de suero diluida 1:100,
1:1000 y 1:10000 en PBS-SBF 10%. Luego se lavó 5 veces con TBS y fueron
adicionados anticuerpos biotinilados anti-IgM o anti-IgG a una dilución de 1:8000,
anti-IgG1 o anti-IgG2c a una dilución 1:500, durante 2 horas a 37ºC; luego los
platos fueron lavados y se incubó con el conjugado Avidina/HRP (eBioscience,
USA) a una dilución 1:250 durante 30 minutos. Pasado este tiempo los platos
fueron lavados 7 veces con TBS y se añadieron 100µL del sustrato
tetrametilbenzidina (BD, Biosciences, USA) durante 30 minutos, adicionándose
después 50 µL de una solución de H2SO4 2N para detener la reacción. La
absorbancia fue medida en un lector de ELISA (Bio-Rad iMark, USA) a una
longitud de onda de 405 nm. Los resultados se graficaron como concentración
en pg/mL (para el caso de las totales) o en la densidad óptica dependiente de la
dilución en el caso de las inmunoglobulinas específicas de ox-LDL.
Cuantificación de malondialdehído (MDA)
Los valores de MDA plasmáticos y provenientes de macerados de órganos
(hígado y riñón) fueron evaluados utilizando una curva de calibración de 0,15 μM
a 10μM de 1,1,3,3-Tetraethoxypropane como estándar. Los datos fueron
expresados en μM de MDA por gr de proteína. La cuantificación de las proteínas
38
se realizó mediante el método del ácido bicinconínico (BCA), el cual genera una
reacción colorimétrica detectable a 562 nm, la absorbancia fue medida en un
lector de ELISA (Bio-Rad iMark, USA).
Evaluación de la capacidad antioxidante
La capacidad de las muestras para reducir el complejo férrico-2,4,6-tripiridil-s-
triazina (TPTZ-FE) fue cuantificada acorde al método FRAP (Ferric Reducing
Antioxidant Power Assay) (104). La solución de trabajo para FRAP contiene
tampón acetato 300 mM (pH 3,6), TPTZ 40 mM y 20 mM FeCl3·6H2O en agua
en una razón 10:1:1. Las muestras fueron obtenidas a partir del macerado del
tejido individual en 1 mL de PBS y filtradas en membrana de 0,5 µm. Las
muestras y la solución de trabajo fueron mezcladas a una razón de 1:25 por 10
min a 37ºC en oscuridad. La absorbancia fue leída a 593 nm usando un
espectrofotómetro (UV/Vis PowerWave TM XS2) y esta fue interpolada en una
curva de calibración con TROLOX (31,25–1000 µM). Los resultados son
expresados en equivalentes µmol de Trolox por gramo de muestra (µmol TE/g).
Evaluación de marcadores bioquímicos en suero
A partir de las muestras de suero de cada ratón se determinó la concentración
de colesterol total (CT), colesterol LDL (low density lipoprotein), colesterol HDL
(High density lipoprotein), triglicéridos, aspartato aminotransferasa (AST),
alanino aminotransferasa (ALT), creatinina y amilasas en ayunas mediante el
método de química húmeda siguiendo las indicaciones del fabricante
(BioSystems, España) y analizados en espectrofotómetro BioSystems BTS 350
(BioSystems, España).
Determinación de mRNA de genes inflamatorios asociados con inflamación o regulación inmune
Para determinar la expresión transcripcional de genes asociados con perfil de
respuesta inmune inflamatoria, como IFN, TNF, MCP-1 y IL-1β, y genes
asociados con regulación inmune como Foxp3, IL-10 y TGF-β, se realizó la
39
extracción del RNA total de las arterias abdominales o nódulos linfáticos
parabronquiales (NLpb), empleando el estuche comercial RNeasy mini kit
(Qiagen, Hilden, Germany), siguiendo las recomendaciones del fabricante. La
concentración y pureza del RNA obtenido fue determinado como la razón de la
absorbancia 260/280 nm en un espectrofotómetro (NanoDrop-1000; Thermo
Scientific, Wilmington, USA) y valores entre 1,8 y 2 fueron aceptados como
óptimos para la realización de la reacción en cadena de la polimerasa
(polymerase chain reaction, PCR) en tiempo real. El RNA obtenido fue tratado
con DNAsa (DNase I, RNase-free, Qiagen, Hilden, Germany), siguiendo las
instrucciones del fabricante, para garantizar la eliminación de cualquier
contaminación con restos de DNA genómico. Posteriormente, se realizó la
síntesis del DNA copia (DNAc), a partir de una concentración estándar de
aproximadamente 200 ng de RNA y utilizando cebadores aleatorios
(RevertaidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit; Fermentas, Glen Burnie,
MD, USA). El DNAc fue almacenado a -20°C hasta la amplificación de los genes.
El DNAc fue diluido 1:4 para la cuantificación de la expresión génica por PCR en
tiempo real, utilizando el kit TaqMan® Gene Expression Master Mix (Applied
Biosystems, Germany) en un volumen final de reacción de 10 µL. Para el caso
de IL-1β se realizó la cuantificación de la expresión génica por PCR en tiempo
real, utilizando el kit Maxima SYBR Green qPCR master mix (Thermo Fisher
Scientific USA) y cebadores específicos para este gen (IL-1βF 5´-
CAGCTTTCGACAGTGAGGAGA-3 y IL-1βR 5´-TTGTCGAGATGCTGCTGTGA-
3, COLOMBIA), en un volumen final de reacción de 10 µL. La reacción fue
realizada en el termociclador Light Cycler® 96, Real-Time PCR Detection
System (Roche, Germany). La determinación de la especificidad de los
cebadores se realizó mediante una curva melting. La cuantificación relativa se
expresó utilizando el método de ΔCt utilizando la fórmula: (1,8)–ΔCt, donde 1,8 es
la eficiencia media de la PCR, y ΔCt es la diferencia entre el ciclo de detección
(Ct) promedio de dos réplicas de la muestra y del gen constitutivo de la
Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (105). Los resultados se
40
expresaron como unidades relativas de cada gen, respecto a la expresión del
gen constitutivo.
Evaluación de muerte celular
Para la evaluación de muerte celular se utilizó el Kit de Anexina V (AnnV) (BD
Biosciences, USA) para citometría de flujo. Células de bazo y NLp de ratones
ApoE-/- tratados o no con la Curcumina fueron procesadas siguiendo las
instrucciones del fabricante. Las células fueron clasificadas por citometría de flujo
como: Células vivas (AnnV-IP-), células en apoptosis temprana (AnnV+IP-),
células en apoptosis tardía (AnnV+IP+) y células necróticas (AnnV-IP+) (Figura
suplementaria 1). El NLp drenante a la pata izquierda de los ratones no tenía
tratamiento con la Curcumina 3 semanas antes de su recolección, mientras que
el NLp de la pata derecha recibió tratamiento cerca de una semana antes del
análisis de las muestras.
Determinación de la Curcumina
Dado que la Curcumina exhibe una fuerte fluorescencia en solventes orgánicos
(106), utilizamos esta propiedad para realizar su cuantificación en las
almohadillas plantares y suero de ratones C57BL/6 WT. Se realizó la extracción
mediante homogenización de los tejidos en 200 µL de etanol absoluto, el
homogenizado obtenido fue centrifugado a 18,000 rpm 5 min. El sobrenadante
fue recolectado y filtrado (0,22 µm), este procedimiento fue repetido 3 veces.
Posteriormente se realizó la evaporación del solvente de extracción a 55°C.
Luego de su evaporación el residuo concentrado en el tubo fue reconstituido con
100 µL de etanol grado HPLC y posteriormente se realizó su cuantificación en
un lector de microplatos multi modo Biotek SynergyTM HT (BioTek® Instruments,
Inc., USA) a 485 nm de excitación, emisión a 528 nm con una ganancia de 70.
La cantidad de Curcumina fue obtenida usando una curva de calibración (0,1 µg
– 10 µg), elaborada bajo las mismas condiciones descritas anteriormente y con
la misma Curcumina con la cual los animales fueron tratados. Muestras de
ratones tratados con el vehículo fueron usadas como blanco.
41
Análisis estadístico
Para el análisis de los datos obtenidos se aplicó el test paramétrico t student o
no paramétrico U Mann–Whitney después de verificar el supuesto de normalidad
de los datos mediante la prueba Shapiro Wilk. La elaboración de las gráficas y
los cálculos estadísticos se realizaron en el programa GraphPad Prism Version
8. En todos los casos se consideró significativo un valor p<0,05.
42
Resultados
La administración a bajas dosis de Curcumina no induce toxicidad clínica o bioquímica
Con el propósito de conocer si la inyección subcutánea repetitiva de la
Curcumina es tóxica in vivo, ratones ApoE-/- fueron tratados bajo el esquema
descrito en la figura 1. Se evaluaron algunos parámetros clínicos, entre estos la
apariencia física, la postura, la hidratación y el comportamiento durante todo el
tratamiento. Ninguno de los animales presentó cambios en estos parámetros,
(datos no mostrados). Así mismo, los animales fueron pesados semanalmente
para detectar una posible pérdida de peso debida al tratamiento. Como se
observa en la figura 2A, los animales tratados con Curcumina muestran un
incremento progresivo semanal en la ganancia de peso de la misma manera que
el grupo vehículo, sin diferencias estadísticamente significativas. Por otra parte,
cuando se realizó la eutanasia y toma de muestras, se registraron los pesos de
diferentes órganos: bazo, hígado y riñón (figura 2B, C y D, respectivamente),
demostrando que el tratamiento con Curcumina no induce cambios significativos
en el peso de estos órganos.
Así mismo, se evaluó el conteo y la viabilidad celular en el bazo, el cual fue
utilizado para la realización de la evaluación fenotípica por citometría de flujo de
diferentes poblaciones celulares. No se observaron cambios en el número total
de células (figura 2E), número total de células vivas (figura 2F) o en el porcentaje
de células vivas (figura 2G). Adicionalmente, para establecer si la Curcumina
produjo daño a nivel hepático, renal o pancreático, se cuantificaron los niveles
séricos de los marcadores bioquímicos ALT (figura 2H), AST (figura 2I),
creatinina (figura 2J) y amilasa (figura 2K). Los resultados no evidencian
incremento asociado al tratamiento y que los niveles de estos marcadores
bioquímicos se encuentran entre los valores referencia establecidos previamente
en nuestro laboratorio en cepas wild type (WT) (107). Lo anterior indica que el
43
tratamiento no induce efectos tóxicos significativos a nivel esplénico, hepático,
renal o pancreático.
La Curcumina a bajas dosis retarda el desarrollo de la aterosclerosis en ratones ApoE-/-
Con el propósito de conocer si la inyección subcutánea repetitiva de la
Curcumina promueve ateroprotección in vivo, ratones ApoE-/- fueron tratados
bajo el esquema descrito en la figura 1A. Al finalizar los experimentos,
criosecciones seriadas del seno aórtico fueron tomadas para evaluar por
histopatología el tamaño del ateroma. Como se observa en las figuras 3A, 3B y
3C, los ratones tratados con Curcumina en tres experimentos independientes
presentaron una reducción estadísticamente significativa en el tamaño de la
placa aterosclerótica; en la figura 3D se muestran imágenes representativas de
cortes del seno aórtico coloreados con hematoxilina-eosina. Sumado a esto, el
depósito lipídico en la placa ateromatosa disminuyó con el tratamiento (Figura
suplementaria 2), aunque este hallazgo no fue estadísticamente significativo.
La Curcumina tiene efecto ateroprotector in vivo, en ausencia de cambios en el perfil lipídico.
Se determinó si, bajo el esquema de tratamiento utilizado la Curcumina
promueve cambios en el perfil lipídico de los animales tratados. Se observó que
la administración de este tratamiento no cambia los niveles plasmáticos de
Colesterol total (CT) (figura 4A), lipoproteínas de baja densidad (c-LDL) (figura
4B), lipoproteínas de alta densidad (c-HDL) (figura 4C) o triglicéridos (figura 4D).
Por lo tanto, nuestro tratamiento no tiene efecto hipolipidémico que contribuya
con la reducción de la placa aterosclerótica.
El efecto ateroprotector de la Curcumina in vivo no se explica por sus efectos antioxidantes
Se determinó si bajo nuestro esquema de tratamiento, los efectos
ateroprotectores de la Curcumina se debieron a su capacidad antioxidante. Para
44
este fin, la capacidad antioxidante en diferentes tejidos (suero, hígado y riñón)
fue determinada empleando el método de FRAP. Como se observa en las figuras
5A-5C, en los animales tratados con Curcumina no se evidenció un aumento
significativo de la capacidad antioxidante con respecto a los animales tratados
con el vehículo. Así mismo, cuando se cuantificaron los niveles de
malondialdehído (MDA), un subproducto de la peroxidación lipídica de la LDL o
de la acción de los radicales libres sobre los ácidos grasos poliinsaturados de la
membrana celular, no se observó una disminución significativa en este marcador
en las diferentes muestras evaluadas (figuras 5D-5F). Estos resultados
demuestran que la concentración de la Curcumina administrada a los animales
no logra tener un efecto antioxidante.
La administración de Curcumina no altera los niveles plasmáticos de IgM e IgG totales, o específicos del ateroantígeno ox-LDL
Se evaluó en el suero de los ratones dislipidémicos, el efecto de la Curcumina
sobre los niveles de anticuerpos totales y específicos para la ox-LDL. Los niveles
de IgM (figura 6A) e IgG (figura 6B) totales tuvieron niveles similares en ambos
grupos. Por su parte, los anticuerpos específicos para la ox-LDL (figuras 6C y
6D), no presentaron cambios en IgM o ni IgG anti-oxLDL. Finalmente, no se
evidenciaron cambios significativos en los niveles de IgG1 e IgG2c anti-oxLDL
(figuras 6E y 6F) en comparación con el grupo control.
El tratamiento con Curcumina disminuye la respuesta inflamatoria en
el seno aórtico
Se analizó el infiltrado de macrófagos (CD68+) y de linfocitos T (CD3+) por
inmunofluorescencia. Los resultados indican que el grupo de ratones tratados
con la Curcumina exhibió respecto al vehículo, una reducción promedio de 41%
en el infiltrado macrófagos y de 34,5% de linfocitos T (figuras 7A y 7B). Además,
una reducción promedio de 42,8% en el core necrótico de la placa aterosclerótica
45
(figura 7C), mostrando que el tratamiento con la Curcumina tuvo efectos
antiinflamatorios a nivel de la placa aterosclerótica.
El tratamiento con Curcumina disminuye la respuesta inflamatoria sistémica
Se analizaron las poblaciones de linfocitos T productoras de IFN y TNFα (Th1)
en el bazo por citometría de flujo y la producción de IFN en esplenocitos
estimulados con ConA por ELISA. El esquema utilizado para el análisis de las
poblaciones celulares CD4+ IFN+ TNF+ y CD8+ IFN+ se muestra en las figuras
suplementarias 3 y 4, respectivamente. La frecuencia de linfocitos de linfocitos T
CD4+ IFN+ y CD4+ TNF+ esplénicos de los ratones tratados con la Curcumina
mostró una reducción significativa para ambas poblaciones celulares (figuras 8A
y 8B). Adicionalmente, se observó una reducción de la frecuencia de los linfocitos
T CD8+ IFN+ (figura 8C). La respuesta de los linfocitos a un estímulo policlonal
inespecífico fue también analizada, empleando ConA a diferentes
concentraciones (0,1, 0,3 y 1 µg/ml a 72h). En el estímulo con 1 µg/ml de ConA
se observó una disminución significativa en la producción de IFN en los
esplenocitos de ratones tratados con la Curcumina (figura 8D), siguiendo el
mismo patrón de los análisis por citometría de flujo de los linfocitos T. Cuando
se evaluó los niveles de mRNA de IFN, TNF, MCP-1, IL-1β, TGFβ, IL-10 y
Foxp3, en la aorta abdominal por RT-PCR, no se evidenció cambio significativo
en los niveles de expresión del mRNA de los genes evaluados (figura
suplementaria 5A y 5B); sin embargo, se observa una tendencia a la reducción
del mRNA para IL-1β. En el caso del mRNA para Foxp3, IL-4 y IL-10 en el NLpb
(siendo este es las cercano al cayado aórtico), solo se observó una tendencia
hacia el aumento en el mRNA para IL-10 (figura suplementaria 5C).
46
El tratamiento con Curcumina incrementa células inmunes reguladoras
Se evaluó si el tratamiento con Curcumina induce linfocitos T con un fenotipo
regulador (linfocitos CD4+ Foxp3+, figura suplementaria 6); se evidenció un
aumento significativo en el porcentaje de linfocitos CD4+ Foxp3+, tanto en el bazo
como en el NLp (figuras 9A y 9B). Cuando se evaluó en el seno aórtico por
inmunofluorescencia la presencia de células Foxp3+, encontramos un aumento
significativo en los animales que recibieron el tratamiento (figuras 9C y 9D),
indicando que éste incrementa la población de linfocitos T CD4+Foxp3+, tanto a
nivel sistémico, como en la placa aterosclerótica. Por otro lado, al evaluar la
expresión de los receptores inhibitorios GITR y PD-1 en linfocitos T CD4+Foxp3+
de bazo (figura 9E y 9F) o NLp (figura 9G y 9H), encontramos un aumento
significativo en la frecuencia de linfocitos T CD4+Foxp3+ provenientes de NLp
que expresan el receptor inhibitorio PD-1. Estos resultados en conjunto muestran
que la presencia de los Treg podría contribuir al control de la inflamación y al
retraso en la progresión de las placas ateroscleróticas en los ratones ApoE-/-.
Nos interesamos en conocer si la administración de Curcumina podría modular
la producción de IL-10 en CPA totales (MHC II+), células dendríticas (MHC IIHi
CD11c+, figura suplementaria 7) y linfocitos B (CD19+, figura suplementaria 8)
derivados de bazo. Aunque no se observaron diferencias en el porcentaje de
células MHC II+ IL-10+ (figura 10A), es evidente la frecuencia elevada de células
dendríticas productoras de IL-10 en ratones tratados con la Curcumina en
comparación con el vehículo (figura 10B).
Adicionalmente se determinó si el tratamiento con la Curcumina, induciría la
expresión de esta citoquina en células CD19+, dado el efecto ateroprotector
evidenciado en este tratamiento. Observamos que existe un aumento en el
porcentaje de linfocitos B productores de IL-10 (figura 10C) en los esplenocitos
totales. Se evaluó, además si el efecto ateroprotector de la Curcumina también
podría estar relacionado con la inducción de linfocitos T CD4+IL-10+ (figura
47
suplementaria 9). Como se observa en la figura 10D, el porcentaje de células
productoras de IL-10 frente a la población parental CD4+, fue significativamente
mayor en el grupo de ratones tratados con la Curcumina en comparación con el
vehículo. En conclusión, la expresión de IL-10 en DC, linfocitos B y linfocitos T,
esta incrementada luego del tratamiento con la Curcumina, lo cual contribuiría a
un estado antiinflamatorio que retrasa la progresión de la aterosclerosis en los
ratones ApoE-/-.
La exposición a bajas dosis de Curcumina induce apoptosis local y regional pero no sistémica
Se evaluó la apoptosis en órganos linfoides secundarios (NLp drenante al sitio
de inyección de la Curcumina y en el bazo), mediante la tinción con Anexina V y
ioduro de propidio (figura suplementaria 1). Cuando evaluamos la muerte celular
en NLp de los animales tratados con la Curcumina, encontramos un aumento
significativo de células Anexina V+ en comparación con animales control,
indicando que el tratamiento induce apoptosis en los NLp drenantes al sitio de la
inyección (figura 11A y 11B). Además, este efecto es sostenido en el tiempo, ya
que el tratamiento con la Curcumina fue aplicado en la almohadilla plantar
derecha una semana y en la izquierda tres semanas antes de la eutanasia de los
animales. Lo que indicaría que la Curcumina probablemente podría haberse
acumulado e inducir apoptosis durante el transcurso del tratamiento. Sin
embargo, no se encontró un aumento de la muerte celular en el bazo (figura
11C).
La administración de la Curcumina bajo el esquema y dosis utilizado
aumenta su disponibilidad en el tejido inyectado
Quisimos determinar si la dosis de la Curcumina (10 µg) utilizada en nuestro
trabajo, lograba aumentar su distribución en el tejido inyectado o su vida media
en suero. Para ello realizamos un experimento en el cual, luego de la inyección
de la Curcumina en la almohadilla plantar en ratones C57BL/6, evaluamos su
48
retención en la almohadilla plantar drenante al sitio de inyección en diferentes
tiempos, con una inyección o una ronda de tratamiento (3 inyecciones) con la
Curcumina. Como se observa en la figura 12A, se encontró la presencia de la
Curcumina en la almohadilla plantar inyectada hasta 72 horas post inyección
tanto con una dosis única, como con una ronda de tratamiento. Cuando se evaluó
la concentración en suero de la Curcumina en diferentes tiempos (15 min, 24, 48
y 72 h), pudimos observar concentraciones cuantificables de esta luego de 15
min post inyección y nuevamente hasta 72 h post inyección, reduciéndose sus
niveles a medida que transcurre el tiempo de inyección (figura 12B).
49
Discusión
Este capítulo presenta evidencia experimental que soporta que la inyección
subcutánea y a bajas dosis de la Curcumina, es un tratamiento promisorio para
evitar la progresión de las lesiones ateroscleróticas en ratones ApoE-/-, asociado
a la inducción de linfocitos Treg y CPA productoras de IL-10. Desde hace varios
años se ha demostrado el papel ateroprotector que desempeñan los linfocitos
Treg en la aterogénesis (108), y cómo terapias que aumenten su actividad logran
atenuarla (109). Además, los avances en el entendimiento de los mecanismos
supresores de los linfocitos Treg, permiten sugerir que estos linfocitos son un
blanco importante para el desarrollo de terapias farmacológicas que permitan
incrementar su frecuencia o potenciar su función (110). De esta forma, se puede
modular la respuesta inmune durante procesos inflamatorios, como ocurre en la
aterosclerosis. La Curcumina puede llevar a la expansión de linfocitos Treg tanto
in vivo como in vitro, debido a un bloqueo en la maduración de las DC, ya que
disminuye la expresión de moléculas implicadas en la presentación antigénica
(MHC II, CD80/86, CD40) e induce la producción de IL 10 en esta población,
generando un fenotipo de TolDC, que contrarresta los procesos inflamatorios
(87,111). Además, una de las ventajas que tiene la Curcumina es su seguridad
y bajo costo (112), sugiriendo su potencial para el tratamiento de enfermedades
inflamatorias crónicas.
Investigaciones previas muestran que la Curcumina induce su acción
ateroprotectora a través de su acción hipolipemiante o antioxidante (80,82). Un
estudio demostró que la administración oral diaria de 20 mg/kg en ratones ApoE-
/- redujo la respuesta inflamatoria y los niveles séricos de colesterol total y
triglicéridos, además se observó un aumento en genes asociados con el
transporte reverso de colesterol como el ABCA-1 y ABCG1 (ATP-binding
cassette transporter A1 and G1) que median el eflujo de colesterol intracelular a
través de la HDL (la cual también se aumentó debido al tratamiento) (80), y
asimismo, la curcumina también reduce la peroxidación de la LDL (82). Sin
50
embargo, en nuestro estudio los efectos ateroprotectores de la Curcumina a la
dosis usada no inducen efectos hipolipemiantes o antioxidantes.
Estudios previos han revelado que la administración de LDL en su forma nativa
o con modificaciones oxidativas (LDL/ox-LDL, MDA-LDL), e inclusive péptidos
de la ApoB100, ligados al uso conjunto de adyuvantes clásicos como el Alum
(aluminium hydroxide) o CFA (Complete Freund adyuvant), disminuyen la
inflamación y el desarrollo de ateromas en modelos animales de aterosclerosis
(113–116). Estos estudios han permitido elucidar el papel que juegan los
anticuerpos contra las diferentes formas de la LDL en ateroprotección. Una de
las poblaciones celulares importantes que hacen parte del infiltrado en la placa
aterosclerótica en humanos y modelos animales de aterosclerosis son los
linfocitos B (117). Su papel en aterosclerosis radica en parte a la producción de
anticuerpos específicos contra la ox-LDL. Se ha observado que la esplenectomía
en ratones ApoE-/- hipercolesterolémicos aumenta la formación de placas
ateroscleróticas y que este efecto es revertido con la transferencia adoptiva de
linfocitos B (118,119). Pero cuando se realiza la transferencia adoptiva de
linfocitos B2 a ratones ApoE-/- esplenectomizados, esto agravó la aterosclerosis
(120). Por otra parte, al realizar la transferencia de linfocitos B1 (subclase de
linfocitos B) a ratones ApoE-/- esplenectomizados se atenúa el desarrollo de
aterosclerosis, ya que se disminuyen los centros necróticos, el contenido de
células apoptóticas y se aumentan los niveles plasmáticos de IgM específica
contra la ox-LDL (121).
El rol de las IgG en la enfermedad ha sido controversial, ya que se ha encontrado
que en humanos existe una correlación entre sus niveles y el desarrollo de ECV
(122), mientras la inmunización pasiva en ratones con esta inmunoglobulina
favorece la regresión de la placa aterosclerótica (123). La explicación a esto
puede depender del tipo de respuestas inmune a las que está suscrita la
secreción de anticuerpos. Por ejemplo, la subclase IgG1 responde a una
respuesta Th2 en tanto que la IgG2 a un perfil Th1 (115). En el contexto del
51
desarrollo de la aterosclerosis, se ha observado que el perfil Th1 y Th2
contribuyen en el proceso proaterogénico, si bien el tipo de respuesta Th2 se ha
correlacionado más con ateroprotección (124), está en estados crónicos de la
enfermedad puede empeorar su desarrollo (125). De esta manera, diferentes
poblaciones de linfocitos B pueden tener papeles contrarios en el proceso
aterogénico (126). Los datos publicados sugieren que la Curcumina aumenta la
respuesta humoral (127). Un estudio realizado en ratas, determinó que luego de
5 semanas de exposición dietaría a la Curcumina a 40 mg/kg, los niveles de IgG
aumentaron significativamente, pero cuando se usan concentraciones inferiores
a 20 mg/kg de Curcumina no se evidencian cambios en los niveles de IgG. Sin
embargo, cuando evaluamos la producción de anticuerpos (IgM, IgG, y las
subclases IgG1 e IgG2c), no encontramos cambios relevantes asociados al
tratamiento. Por el contrario, sólo encontramos una pequeña reducción de anti-
IgG-ox-LDL y una tendencia a la reducción de IgG2c, esto puede deberse a que
existió una reducción de la respuesta de tipo Th1 (figura 8), la cual se ha visto
asociada con la producción de esta subclase de anticuerpos (115).
Dado que los macrófagos juegan un papel central durante todas las etapas de
desarrollo de la placa aterosclerótica, como células proinflamatorias y
prooxidantes, la homeostasis del colesterol en el macrófago es relevante, ya que
su desbalance dará lugar a la acumulación excesiva de colesterol y su
transformación en célula espumosa. Esta acumulación de colesterol es mediada
por la internalización de las formas oxidadas de la LDL a través del receptor
CD36 (128). Por otra parte, se ha demostrado que citoquinas y ROS (factores
proaterogénicos) son secretados por los macrófagos presentes en la placa
aterosclerótica. El reconocimiento de la ox-LDL por los macrófagos, induce la
producción de citoquinas proinflamatorias y ROS, este último, implicado en
apoptosis, necrosis y eferocitosis defectuosa en los macrófagos, como se
observa en lesiones ateroscleróticas avanzadas y vulnerables (129). Nuestros
resultados revelan que el contenido de macrófagos y el core necrótico en la placa
aterosclerótica se encuentran reducidos de manera significativa en los animales
52
tratados con la Curcumina (figura 7A y 7C), esto concuerda con reportes previos
en los cuales la Curcumina regula negativamente la expresión de CD36,
citoquinas proinflamatorias y moléculas de adhesión, atenuando la aterosclerosis
en ratones (80,130). Estos efectos impactan el infiltrado de leucocitos hacia la
placa aterosclerótica, ya que afecta la expresión de genes que participan en la
adhesión y migración transendotelial de células desde la circulación (131). Sin
embargo, estos estudios se basaron en concentraciones altas de Curcumina y
administradas generalmente de manera diaria, lo cual pudiera aumentar su
concentración sanguínea, y así tener un efecto predominante sobre el endotelio
vascular.
Por otra parte, es claro el papel de la respuesta inmune adaptativa en el proceso
aterogénico, el cual se encuentra mediado por una respuesta de tipo Th1, con
altos niveles de IFN (132). Diferentes estudios funcionales han demostrado el
papel crucial de esta citoquina durante el proceso de aterogénesis; por ejemplo
en ratones ApoE-/- deficientes en IFN, se ha observado una disminución en el
desarrollo de la lesión, mientras que el IFN recombinante empeora la
enfermedad (133,134). En ese sentido, la disminución de LT CD3+ en los ratones
ApoE-/- tratados con la Curcumina en el seno aórtico, confirma el efecto
inmunológico provocado por este tratamiento, el cual, también se vio evidenciado
en la reducción de la frecuencia de los linfocitos T circulantes productores de
IFN y/o TNF (Figuras 7 y 8). Así mismo, se observó una disminución en la
producción de IFN por esplenocitos de los animales tratados con la Curcumina,
y estimulados ex vivo (figura 8D). De esta manera la reducción en la respuesta
proinflamatoria tipo Th1 podría romper el ciclo de oxidación e inflamación que
conduce a la acumulación de células espumosas y el infiltrado de linfocitos T en
las placas ateroscleróticas.
El efecto antiaterogénico de la Curcumina en diferentes modelos animales puede
ser mediado por mecanismos que incluyen la inhibición de vías de señalización
y los efectos hipolipemiantes e antioxidantes (79,80,130,131,135–141). En este
53
trabajo nos centramos en determinar si el efecto ateroprotector de la Curcumina
se asocia con la inducción de poblaciones celulares con potencial
inmunoregulador, como los linfocitos Treg (Foxp3+). Se ha observado que los
linfocitos Treg protegen contra la aterosclerosis, a través de sus mecanismos de
supresión (142). Como se observa en la figura 9, cuando se evaluó la frecuencia
de linfocitos T CD4+Foxp3+ en suspensiones celulares de bazo y NLp (sitio
drenante a la inyección de Curcumina), encontramos un aumento significativo de
esta población. Esto es de vital importancia dado que un estudio prospectivo
reveló que bajos niveles basales de linfocitos CD4+Foxp3+ se asocian con un
riesgo incrementado de desarrollar síndrome coronario agudo 11 a 14 años
después (143). Así mismo la eliminación de linfocitos Treg en ratones, lleva a un
incremento de la aterosclerosis (144).
Por otro lado, cuando evaluamos por inmunofluorescencia la presencia de
células Foxp3+ en el seno aórtico, encontramos un aumento significativo del
número de células positivas para este marcador, dejando en evidencia no solo
que el tratamiento aumenta a nivel sistémico la presencia de células Foxp3+, sino
también en el sitio de inflamación local, pudiendo de esta manera tener efectos
antiinflamatorios en el ateroma, y evitando su progresión. Estos resultados están
acorde a los reportados previamente, donde el tratamiento en ratones ApoE-/-
con G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor) fue ateroprotectivo, y se
asoció con un aumento en la frecuencia de linfocitos Treg tanto en el bazo como
en los nódulos linfáticos (145). Sin embargo, en dicho experimento se utilizó una
proteína recombinante, cuyo uso puede tener efectos secundarios y su
transferencia a la práctica clínica para el uso en aterosclerosis requiere de
ensayos clínicos en humanos, necesarios para demostrar su factibilidad y
seguridad (145), contrario a lo que podría ocurrir con la Curcumina, cuya
seguridad es elevada.
Entre los mecanismos usados por las DC para inducir tolerancia se encuentran
la inducción de deleción clonal, la anergia clonal, la desviación inmune
54
(polarización de los perfiles de los linfocitos Th) y la inducción o expansión de
linfocitos Treg (146). El concepto de adyuvantes tolerogénicos, donde
compuestos inmunosupresores inducen tolerancia cuando se coadministran con
péptidos inmunogénicos, proporcionó una nueva estrategia de tratamiento para
enfermedades autoinmunes. Además, este tratamiento es capaz de inducir la
expansión de linfocitos Treg antígeno-específicos, capaces de persistir por un
largo periodo y proliferar después de la re-estimulación antigénica (64). La
Curcumina ha sido utilizada para la inducción de TolDC in vivo (111) y aunque
en el presente trabajo no se administró en conjunto con un antígeno relevante a
la respuesta aterogénica (por ejemplo, ox-LDL o péptidos de la apoB100), no
podemos descartar su papel como adyuvante tolerogénico, ya que se ha
determinado que cuando los ratones ApoE-/- son alimentados con dieta estándar
(no HFD), estos alcanzan a tener concentraciones circulantes de ox-LDL (147).
Por lo cual especulamos que las DC pueden captar la Curcumina y el
ateroantígeno (sin necesidad de coinyectarlo), generando CPA tolerogénicas y
así inducir linfocitos Treg que medien una supresión específica de la respuesta
T efectora presente en el ateroma. Cuando discriminamos las CPA por la
expresión de MHC II+ y la producción de IL-10+, no se evidenció cambios
significativos en esta población. Sin embargo, como se observa en la figura 10B,
al analizar las DC (MHC IIHi CD11c+) pudimos observar que en esta población
existió un aumento en la producción de esta citoquina, por lo que sugiere que el
tratamiento, lleva a la inducción de TolDC.
Por otro lado, no se evaluó el estado de maduración/activación de las DC, en
base a la expresión de moléculas como CD40, CD80, CD86 y CD83 (148,149).
Sin embargo, se ha observado que la producción de IL-10 inhibe la producción
de IL-12 y modula la expresión de moléculas coestimuladoras en DC, lo cual se
correlaciona con su capacidad para inhibir alorespuestas (148). En nuestros
experimentos evidenciamos que el tratamiento con la Curcumina moduló la
respuesta inflamatoria en el seno aórtico, el bazo y los NLp de los ratones
tratados, en comparación con el vehículo, pudiendo ser un efecto mediado a
55
través de TolDC productoras de IL-10. Es necesario evaluar si efectivamente
bajo nuestras condiciones experimentales a bajas concentraciones de
Curcumina, las DC presentan baja expresión de moléculas coestimuladoras y si
efectivamente carecen de la expresión de IL-12, como se ha demostrado in vitro
(150,151). En conclusión, dado que el tratamiento es un inductor de TolDC por
excelencia, se esperaría que estas células condujeran a la generación de las
demás poblaciones reguladoras.
Estudios recientes indican que además de la inducción de linfocitos Treg, las
TolDC pueden promover la generación de linfocitos Breg esplénicos con un
fenotipo CD19Hi FcIIbHi, las cuales pueden inhibir la respuesta de linfocitos T vía
IL-10 y CD40L-CD40 (152). Aunque los linfocitos B productores de IL-10 pueden
encontrarse en proporciones variables en subpoblaciones de linfocitos B (de
transición-2, de la zona marginal y B-1a), es difícil definirlos con base en
marcadores de superficie particulares (153,154). Por este motivo, la población
Breg en el presente estudio fue definida por su capacidad de producir la IL-10 en
las células CD19+. La reducción del tamaño de la placa ateromatosa en los
ratones dislipidémicos podría asociarse a una respuesta reguladora mediada
también por esta población.
Varios subconjuntos de linfocitos B parecen ser capaces de secretar IL-10,
incluidos los linfocitos B reguladores especializados (155). Se encontró una
disminución de los linfocitos B1a y Breg (ambos subconjuntos son grandes
productores de IL-10) y en la producción local de IL-10 en la aorta de ratones
ApoE-/- deficientes en L-selectina (Sell-/-), y en comparación a ratones ApoE-/-
hubo un aumento significativo de la aterosclerosis, aunque ambos tuvieron
números de linfocitos Treg similares (156). Otro estudio evaluó la transferencia
de linfocitos B a partir de ganglios linfáticos de ratones ateroscleróticos, en los
cuales la expresión de IL-10 aumenta, esto evita la formación de neoíntima en
un modelo de lesión vascular en la carótida de ratones; este efecto protector se
pierde con el bloqueo de IL-10 o la transferencia de linfocitos B deficientes en IL-
56
10 (157). Por lo tanto, los linfocitos Breg aumentados con nuestro tratamiento
podrían de hecho tener un potencial protector importante en la aterosclerosis.
Con base en el papel que podrían jugar los linfocitos Breg en la inducción de
linfocitos Tr1, quisimos identificar si el tratamiento con la Curcumina aumenta o
no esta población celular. Los ratones tratados con Curcumina presentaron un
incremento en el porcentaje de linfocitos T CD4+ productores de IL-10 en el bazo,
de esta forma el efecto del tratamiento sobre el tamaño de la placa ateromatosa
podría asociarse además a una respuesta reguladora mediada también por
linfocitos Tr1. El tratamiento con la Curcumina, estaría generando también
linfocitos T CD4+ productores de IL-10, que a su vez apoyarían la inducción de
TolDC vía IL-10. De esta forma, la IL-10 inducida por el tratamiento estaría
generando una red inmunoreguladora que proporciona protección contra la
aterosclerosis vía TolDC/Breg/Tr1 y linfocitos Treg.
Uno de los efectos de la Curcumina es la inducción de apoptosis en células
tumorales (158,159), lo cual se evidencia por la pérdida del potencial de
membrana mitocondrial, la liberación de citocromo C y la activación de caspasas
efectoras (160). Estudios que han inyectado por vía intraperitoneal DC
apoptóticas cargadas con ox-LDL o miméticos de células apoptóticas como
terapia para la aterosclerosis, han demostrado la inducción de TolDC y el
incremento de linfocitos B1a productores de anticuerpos IgM, lo que reduce las
placas ateroscleróticas (32,161). Por lo anterior, se evaluó si el tratamiento con
la Curcumina induce muerte celular en los nódulos linfáticos poplíteos, los cuales
son drenantes al sitio de inyección, usando ioduro de propidio y Annexina V.
Encontramos que la Curcumina aumenta la apoptosis, incluso cuando las
mediciones fueron realizadas una (NLp izquierdo) o tres (NLp derecho) semanas
después de la última inyección del tratamiento. Dado el bajo número de células
obtenidas para la medición de la apoptosis, en nuestro estudio no identificamos
que poblaciones celulares fueron blanco de tal efecto; esto a futuro sería
importante realizarlo ya que pueden existir poblaciones celulares más sensibles
57
a la Curcumina en el NLp. Esta inducción de apoptosis pudiera tener efectos
benéficos, ya que el proceso por el cual se da la remoción de las células
apoptóticas (CA) por fagocitos (entre los que estarían las CPA) es crucial para
mantener tolerancia a lo propio en ausencia de inflamación. Este proceso es
denominado eferocitosis y ha demostrado restaurar la tolerancia periférica,
pérdida en procesos autoinmunes como en diabetes tipo 1 experimental (162).
Bajo condiciones fisiológicas, las señales derivadas de células apoptóticas evitan
la maduración de las DC resultando en inducción de tolerancia. Por el contrario,
la necrosis secundaria derivada de la no remoción de las células apoptóticas
tiene como resultado inflamación y maduración de las DC contribuyendo a
inflamación crónica y enfermedad autoinmune (163,164).
Por su parte, en respuesta a la ingestión de células apoptóticas, los macrófagos
restringen la producción de citoquinas proinflamatorias y mejoran la producción
de moléculas que amortiguan la inflamación y median resolución y reparación
(165). Por ejemplo, la unión de la fosfatidil serina (FS) del CA al receptor de
eferocitosis TIM-1 (T cell immunoglobulin mucin receptor 1) de los linfocitos T
suprime la producción de TNF, IL-6 y CCL5 al bloquear la activación de NFκB,
mientras que la unión al receptor de eferocitosis estabilina 2 estimula la
producción de TGFβ. La detección de la FS de CA por moléculas intermediarias
a las proteínas tirosina quinasas MERTK (MER proto-oncogene tyrosine kinase)
y AXL puede suprimir las vías de señalización proinflamatorias mediadas por
TLR y receptores de IFN tipo 1. Los esteroles derivados de la degradación de las
células apoptóticas por el fagolisosoma en macrófagos activa receptores de
esteroles nucleares, como PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor-γ)
y el LXR-α (Liver X receptor-α), estimulando la producción de citoquinas
antiinflamatorias (IL-10 y TGFβ) e inducen la diferenciación de linfocitos Treg.
Así mismo estos receptores se unen a receptores co-represores nucleares, que
previenen la remoción de secuencias promotoras de genes que codifican para
citoquinas proinflamatorias como TNF y IL-1β, suprimiendo su producción (164).
En las placas ateroscleróticas avanzadas, la eferocitosis se encuentra
58
defectuosa e impulsa la progresión de la enfermedad, aunque los linfocitos Treg
mejora este proceso (166). En este sentido, la reducción del core necrótico en la
placa aterosclerótica y el aumento de células Foxp3+ observados en nuestros
experimentos, sugieren que el proceso de eferocitosis podría estar aumentado.
Sin embargo, estudios adicionales son requeridos para validar esta hipótesis.
El aumento de la apoptosis en el NLp puede estar relacionada con la vía de
administración usada, ya que este efecto no se evidenció en los esplenocitos, y
especulamos que se indujo por la una acumulación de la Curcumina en la
almohadilla plantar. Observamos diferencias en los tipos de muerte inducida
entre los NLp, este efecto puede deberse al hecho de que el NLp derecho es el
drenante a la última ronda de inyección. Si bien la necrosis esta aumentada en
este nódulo, esto puede deberse a un efecto secundario debido al tiempo de
toma de muestra y el análisis de citometría, donde las células al ser aisladas se
encuentran en un estado apoptótico temprano-tardío (como se observa en la
figura 11C), y al no ser removidas por fagocitos, durante el tiempo de la tinción,
ellas finalmente pueden pasar a un estado de necrosis, lo cual pudiera ser la
razón del efecto observado. Las razones para una biodisponibilidad reducida de
cualquier agente dentro del cuerpo son la mala absorción, alta tasa de
metabolismo, inactividad de productos metabólicos y/o eliminación rápida del
cuerpo. Los estudios realizados hasta la fecha han sugerido una fuerte actividad
intrínseca y, por lo tanto, eficacia de la Curcumina como agente terapéutico para
diversas dolencias. Sin embargo, los estudios relacionados con la absorción,
distribución, metabolismo y excreción de Curcumina han revelado una absorción
deficiente y un metabolismo rápido de esta que reduce severamente su
biodisponibilidad. En nuestro estudio encontramos que la concentración de
Curcumina en el suero de los ratones inyectados con una vez o tres veces (1
ronda de tratamiento) alcanzó concentraciones máximas de aproximadamente
de 200 ng/mL 24 horas después de la última inyección y que sus niveles
disminuyeron luego de 48h.
59
Al investigar las propiedades farmacocinéticas de la Curcumina por vía oral o
intraperitoneal en ratones, se ha encontrado que con 1 g/kg oral, aparecen
niveles plasmáticos de 0,13 μg/mL luego de 15 min, mientras que el nivel
plasmático máximo de 0,22 μg/mL fue observado a 1 h, y luego de 6 h disminuyó
por debajo del límite de detección. Al administrar 0,1 g/kg intraperitoneal se
encontró un punto máximo de 2,25 μg/mL luego de 15 min y esto disminuyó
rápidamente en 1h (167). La ingesta oral de 2 g/kg en ratas, mostró una
concentración sérica máxima de 1,35 μg/mL en 50 min, mientras que en
humanos la misma dosis resultó extremadamente baja (Niveles séricos de 0,006
±0,005 μg/mL a 1 h) (168). Estos estudios sugieren el papel que juega la vía de
administración en los niveles alcanzables de la Curcumina en suero, e indican a
su vez que la cantidad en animales y en humanos, no son directamente
comparables a pesar de administrar las mismas dosis. Los estudios de
farmacocinética desarrollados a la fecha, sugieren que la principal razón de la
baja biodisponibilidad de la Curcumina son la baja absorción, solubilidad,
biodisponibilidad, penetración y estabilidad y, adicionalmente, el rápido
metabolismo y aclaramiento (169), lo cual limita su potencial uso terapéutico. En
este sentido, se han ideado diversas nanoformulaciones de Curcumina para
superar los problemas farmacológicos que restringen su uso práctico.
Diversos modelos animales soportan que el uso de nanopartículas poliméricas
(170), sólidas lipídicas (171), nanoemulsiones (172), hialurosomas (173) y
nanofibras (174) potencian la actividad antiinflamatoria de la Curcumina gracias
a su mayor biodisponibilidad y biodistribución. Sin embargo, hasta donde
conocemos no se han realizado trabajos para estudiar los beneficios de
formulaciones nano o microestructuradas de Curcumina en modelos de
aterosclerosis in vivo y solo dos estudios las han abordado in vitro con la
intención de dirigirlas a los efectos proaterogénicos de los macrófagos y las
células espumosas presentes en la pared vascular (175,176). Estudios en los
que se usaron versiones micro/nanoestructuradas de Curcumina administradas
por diferentes vías (oral o intravenoso), permitieron confirmar su potencial para
60
tratar varias enfermedades inflamatorias crónicas como la hepatoesteatosis,
artritis, o colitis, vía inducción de TolDC y linfocitos Treg productores de IL-10
(177–179). Sin embargo, no existen estudios como el nuestro, en el cual se utilizó
una vía de administración subcutánea, que logró demostrar la presencia de la
Curcumina por más de 48h en el sitio de inyección, con efectos ateroprotectores
mediados a través de una red inmunomoduladora que involucra diferentes tipos
celulares productores de IL-10.
En el presente estudio pudo observarse una inhibición de la respuesta efectora
mediada por la inducción de células con fenotipo regulador, en especial linfocitos
Treg y CPA productoras de IL-10. Esto asociado a la inducción de diferentes
tipos celulares con fenotipo regulador, apoyan el papel de la Curcumina como
inmunomodulador del proceso aterogénico en ausencia de efectos
hipocolesterolemiantes o tóxicos. De acuerdo con este estudio, la reducción de
las lesiones ateroscleróticas fue consecuencia de la supresión de la respuesta
inflamatoria en la placa, y esta fue probablemente mediada por una red de
células tolerogénicas entre estas CD4+Foxp3+ y TolDC/Breg. De igual forma la
Curcumina podría difundir hasta los órganos linfoides para generar TolDC en los
órganos drenantes a través de un aumento en la eferocitosis, ya que se ha
encontrado que la Curcumina puede aumentar la capacidad endocítica de las
DC (151).
Los ateroantígenos circulantes en los ratones dislipidémicos podrían estar
mediando la inducción de linfocitos reguladores antígeno-específicos. Sin
embargo, esto estaría por confirmarse, ya que nuestro estudio no abordó
experimentalmente esta pregunta. Los hallazgos presentados en este estudio
conforman un cuerpo de evidencia que implica la inducción de una red
inmunoreguladora que media protección contra la aterosclerosis en los ratones
dislipidémicos. Así, el tratamiento con Curcumina podría ser una estrategia con
potencial inmunopreventivo no sólo en la aterosclerosis, sino también en otras
enfermedades crónicas inflamatorias no transmisibles.
61
Conclusiones
• El tratamiento subcutáneo con la Curcumina reduce la progresión del
tamaño de la lesión aterosclerótica y el core necrótico, además existe una
reducción del infiltrado inflamatorio de monocitos/macrófagos y linfocitos T en el
seno aórtico de ratones ApoE-/-, en ausencia de efectos hipolipemiantes,
antioxidantes o tóxicos.
• Curcumina aumenta la migración de células Foxp3+ hacia el seno aórtico,
y aumenta la frecuencia de células con fenotipo regulador: DC productoras de
IL-10 y linfocitos Treg en el bazo y nódulos linfáticos poplíteos.
• Los esplenocitos de animales tratados con Curcumina producen menos
IFN en respuesta a un estímulo policlonal.
• En la almohadilla plantar de los animales tratados con la Curcumina se
genera un efecto acumulativo, que pudiera estar relacionado con una liberación
sostenida de la molécula permitiendo una mayor disponibilidad para ser
captadas por células inmunes, y así promover inmunotolerancia en el escenario
inflamatorio de la aterosclerosis.
62
Figuras Figura 1. Diseño experimental: modelo murino experimental de aterosclerosis (dislipidemia y desarrollo de placas ateroscleróticas en el sistema circulatorio arterial). (A) Ratones machos ApoE-/- de 8 a 10 semanas de edad fueron tratados con Curcumina 10𝛍g o vehículo (PBS + DMSO 1%) en la almohadilla plantar tres veces o dosis (D1, D2 y D3), que corresponden a una ronda de tratamiento. Este esquema fue repetido durante 8 rondas con intervalos de descanso de una semana. Luego de la segunda ronda de tratamiento los ratones (semana 4) fueron alimentados con dieta proaterogénica (HFD) por 12 semanas, pasado este tiempo se realizó la eutanasia de los animales y se obtuvieron diferentes muestras biológicas para su posterior análisis de histopatología, fenotipificación celular, bioquímica sanguínea y producción de anticuerpos (B).
63
Ganancia de peso corporal
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 160
5
10
15
20
Semanas de tratamiento
(g
r)
Curcumina
Vehículo
InicioHFD
Vehículo Curcumina 0
5×107
1×108
1.5×108
2×108
2.5×108
# T
ota
l d
e c
élu
las/B
azo
Vehículo Curcumina 0
5×107
1×108
1.5×108
2×108
# T
ota
l d
e c
élu
las
viv
as/B
azo
Vehículo Curcumina 65
70
75
80
85
90
Nara
nja
de T
iazo
l +
IP
- (%
)
Bazo
Vehículo Curcumina 0
100
200
300
400
mg
Hígado
Vehículo Curcumina 0
1
2
3
4
5
gr
Riñón
Vehículo Curcumina 350
400
450
500
mg
Vehículo Curcumina 0
2
4
6
Cre
ati
nin
a (m
g/d
L)
Vehículo Curcumina 0
500
1000
1500
2000
Am
ilasas (U
/L)
A
E
B C D
H J KI
Vehículo Curcumina 0
50
100
150
200
AL
T (
U/L
)
Vehículo Curcumina 0
100
200
300
400
500
AS
T (
U/L
)
GF
Figura 2. La administración de Curcumina a bajas dosis no provoca toxicidad clínica o bioquímica a nivel local o sistémico. En el modelo murino establecido, se evaluaron parámetros clínicos y bioquímicos de toxicidad. (A) Registro semanal de la
ganancia de peso de los animales durante el tratamiento, representado como 𝜟(g) que
corresponde a la ganancia de peso semanal, durante el periodo experimental. Peso del bazo (B), hígado (C) y riñón (D) al finalizar el experimento. Determinación del número total (E), número de células vivas (F) y porcentaje de células vivas (G) en bazo. La tinción para la viabilidad celular incluye naranja de tiazol e IP. Niveles de alanino aminotransferasa (ALT) (H), aspartato aminotransferasa (AST) (I), creatinina (J) y amilasas (K) en sangre total de los ratones tratados. Cada punto representa un animal. Los datos fueron analizados usando la prueba t student, previa verificación de normalidad de los datos y son presentados como la media±SEM. Los datos son representativos de uno de tres experimentos independientes.
64
Ta
mañ
o d
e la
pla
ca
(
m2)
0
2×105
4×105
6×105
8×105
****
Ta
mañ
o d
e la
pla
ca
(
m2)
0
2×105
4×105
6×105
8×105
*
Vehículo Curcumina 0
1×105
2×105
3×105
4×105
Ta
mañ
o d
e la
pla
ca
(
m2)
*
A
B
C
D
250 m 250 m
Vehículo Curcumina
Figura 3. La Curcumina a bajas dosis retarda el desarrollo de las placas ateroscleróticas en ratones ApoE-/-. En el modelo murino establecido se evaluó el tamaño de las placas ateroscleróticas en seno aórtico. Imágenes representativas de criosecciones en el seno aórtico coloreadas con H&E (A). Se presenta la cuantificación del tamaño del ateroma de criosecciones en el seno aórtico coloreadas con H&E de tres experimentos independientes (B-D). El tamaño de las lesiones ateroscleróticas fue calculado con el programa NIS ELEMENTS. En las gráficas cada punto representa el área promedio de 7-9 criosecciones por animal. Los resultados fueron analizados usando la prueba t student previa verificación de normalidad de los datos. * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,0001. Los datos son presentados como la media±SEM.
65
A B
Vehículo Curcumina 0
500
1000
1500C
ole
ste
rol (m
gd
L)
Vehículo Curcumina 0
100
200
300
400
500
c-H
DL
(m
gd
L)
Vehículo Curcumina 0
200
400
600
800
1000
c-L
DL
(m
gd
L)
Vehículo Curcumina 0
50
100
150
200
Tri
glicéri
do
s (
mg
dL
)
C D
Figura 4. El tratamiento con la Curcumina no evidencia efectos hipolipemiantes. Los niveles de colesterol total (A), colesterol LDL (c-LDL) (B), colesterol HDL (c-HDL) (C) y triglicéridos (D) fueron cuantificados en el suero a partir de sangre total de los ratones tratados con Curcumina o vehículo. Los resultados fueron analizados usando una prueba t student previa verificación de normalidad de los datos. Cada punto representa un animal. Los datos son presentados como la media±SEM.
66
FRAP suero
Vehículo Curcumina 0
5
10
15
20
m
ol E
T/ m
g p
rote
ína
FRAP hígado
Vehículo Curcumina 0
20
40
60
80
100
m
ol E
T/ m
g p
rote
ína
FRAP riñón
Vehículo Curcumina 0
10
20
30
40
m
ol E
T/ m
g p
rote
ína
MDA en suero
Vehículo Curcumina 0.00
0.02
0.04
0.06
MD
A (
nm
ol/ m
g p
rote
in) MDA en hígado
Vehículo Curcumina 0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25M
DA
(n
mo
l/ m
g p
rote
in) MDA en riñón
Vehículo Curcumina 0.0
0.5
1.0
1.5
MD
A (
nm
ol/ m
g p
rote
in)
A
D
CB
E F
Figura 5. El efecto ateroprotector in vivo de la Curcumina no se asocia con sus efectos sistémicos antioxidantes. Se tomaron muestras de suero a partir de sangre total o macerado de órganos (hígado y riñón) de los animales tratados con Curcumina (o vehículo). Se realizó la evaluación de la capacidad antioxidante mediante el método FRAP (poder antioxidante de reducción férrica) en (A) suero, (B) hígado y (C) riñón. Cuantificación de la concentración de subproductos de la peroxidación lipídica MDA en (D) suero, (E) hígado y (F) riñón. Los resultados fueron analizados con la prueba t student, previa verificación de normalidad de los datos. Cada punto representa un animal. Los datos son presentados como la media±SEM.
67
IgM total
IgM
(g
/ml)
Vehículo Curcumina 0
400
800
1200
IgM anti-oxLDL
Ab
so
rban
cia
(405 n
m)
1/10
0
1/10
00
1/10
000
1/10
0000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
IgG total
IgG
(g
/ml)
Vehículo Curcumina 0
400
800
1200
IgG1 anti-oxLDL
Ab
so
rban
cia
(405 n
m)
1/10
0
1/10
00
1/10
000
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
IgG2c anti-oxLDL
Ab
so
rban
cia
(405 n
m)
1/10
0
1/10
00
1/10
000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
IgG anti-oxLDL
Ab
so
rban
cia
(405 n
m)
1/10
0
1/10
00
1/10
000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
A
C D E F
B
Figura 6. El tratamiento con la Curcumina no altera los niveles de IgM e IgG totales o de anticuerpos IgM, IgG, IgG1 e IgG2c específicos de ox-LDL. En suero de ratones machos ApoE-/- tratados con vehículo (negro) o Curcumina (azul) se cuantificaron IgM e IgG totales (A-B) y específicos de ox-LDL (C-D) y subclases anti-IgG1ox-LDL (E) e anti-IgG2c ox-LDL (F), por ELISA. Los resultados fueron analizados usando t student, previa verificación de normalidad de los datos. Los datos son presentados como la media±SEM. * p<0,05.
68
CD68+
Vehículo Curcumina 0
5×106
1×107
1.5×107
2×107
r
ojo
/1x
10
5
m2 **
CD3+
Vehículo Curcumina 0
5×106
1×107
1.5×107
r
ojo
/1x
10
5
m2
*
Vehículo Curcumina A
B
C
250 µm 250 µm
250 µm250 µm
Tamaño del centro necrótico
Vehículo Curcumina 0
1×105
2×105
3×105
4×105
m
2
**
Vehículo Curcumina
Figura 7. La Curcumina induce una menor respuesta inflamatoria en la placa aterosclerótica. En ratones machos ApoE-/- tratados con Curcumina (o vehículo) se evaluó el infiltrado inflamatorio en seno aórtico. Imágenes representativas de inmunofluorescencia de criosecciones (izquierda) de CD68 (A) y CD3 (B) y la cuantificación del área positiva para cada marcador (derecha). Imágenes representativas (izquierda) y cuantificación (derecha) del tamaño del centro necrótico (flecha) en el seno aórtico coloreadas con H&E (C). Cada punto corresponde al área promedio positiva de 7-9 criosecciones por animal. Los resultados fueron analizados usando la prueba t student, previa verificación de normalidad de los datos. Los datos son presentados como media±SEM. * p<0,05; ** p<0,01.
69
A
C D
CD
4+ IF
N+
(%
)
Vehículo Curcumina 0
10
20
30
40 *
CD
4+ T
NF
+(%
)
Vehículo Curcumina 0
10
20
30 *C
D8
+ IF
N+
(%)
Vehículo Curcumina 0
20
40
60 *
SE
0,1
g/mL C
onA
0,3
g/mL C
onA
1 g/m
L ConA
0
200
400
600
800
IFN
(p
g/m
L) Vehículo
Curcumina
*
B
Figura 8. La Curcumina disminuye la frecuencia de linfocitos T proinflamatorios y
la producción de IFN en esplenocitos de ratones ApoE-/-. Suspensiones celulares
de bazo fueron obtenidas de ratones machos ApoE-/- tratados con Curcumina (o vehículo) para la evaluación de la producción de citoquinas proinflamatorias, así: CD4+
IFN+ (A), CD4+ TNF+ (B) y CD8+IFN+ (C). Adicionalmente, 1x106/mL esplenocitos
fueron estimulados con diferentes concentraciones de Con A (0,1, 0,3 y 1 µg/mL) por 72
horas, y el IFN fue cuantificado por ELISA en los sobrenadantes de cultivo (D). Los
resultados fueron analizados usando una prueba t student o U Mann Whitney, previa verificación de normalidad de los datos. Cada punto representa un animal. Los datos son presentados como media±SEM o mediana±IQR y son representativos de 2 experimentos independientes. * p<0,05.
70
A NLp
Vehículo Curcumina 0
10
20
30
CD
4+
Fo
xp
3+
(%
)
**Bazo
CD
4+
Fo
xp
3+
(%
)
Vehículo Curcumina 0
10
20
30 *
B
D
Seno aórtico
Vehículo Curcumina 0
5
10
15
# C
élu
las F
oxp
3+
en
sen
o a
órt
ico
*
Vehículo CurcuminaControl (-)
C
Bazo
Vehículo Curcumina 0
10
20
30
CD
4+
Fo
xp
3+
GIT
R+
(%
) Bazo
Vehículo Curcumina 0
2
4
6
CD
4+
Fo
xp
3+
PD
-1+
(%
)
NLp
Vehículo Curcumina 0
10
20
30
CD
4+
Fo
xp
3+
GIT
R+
(%
) NLp
Vehículo Curcumina 0
2
4
6
8
10
CD
4+
Fo
xp
3+
PD
-1+
(%
)
*
E F
HG
Figura 9. La Curcumina aumenta la frecuencia de linfocitos CD4+ Foxp3+. La frecuencia de la población CD4+Foxp3+ fue evaluada en bazo (A) o nódulo linfático poplíteo (NLp) (B), de ratones machos ApoE-/- tratados con Curcumina (o vehículo). Cada punto representa un animal. Cuantificación del número de células Foxp3+ en el seno aórtico por inmunofluorescencia (C-D), las flechas indican las células positivas para el marcador Foxp3. (E) Frecuencia de la población CD4+Foxp3+GITR+ y CD4+Foxp3+PD-1+ (F) evaluada en bazo o nódulo linfático poplíteo (NLp) (G-H). Cada punto corresponde al número de células promedio positivas por ratón de 3-6 criosecciones. Los resultados fueron analizados usando una prueba t student o U Mann Whitney, previa verificación de normalidad. Los datos son presentados como la media±SEM o mediana±IQR y son representativos de 2 experimentos independientes. * p<0,05; *** p<0,0001.
71
MH
C-I
I+IL
-10
+ (%
)
Vehículo Curcumina 0
2
4
6
8
MH
C-I
IHiC
D11c
+IL
-10+ (
%)
Vehículo Curcumina 0
1
2
3
4 **
CD
19
+IL
-10
+(%
)
Vehículo Curcumina 0
2
4
6 ***
CPA DC
Linfocitos T
A B
DLinfocitos BC
CD
4+IL
-10
+(%
)
Vehículo Curcumina 0
5
10
15 *
Figura 10. La Curcumina aumenta la frecuencia de células dendríticas, linfocitos B y linfocitos T productores de IL-10 en esplenocitos totales. Se evaluó por citometría de flujo la expresión de IL-10 en las cuatro poblaciones celulares: CPA (MHC-II+) (A), DC (MHC-IIHiCD11c+) (B), linfocitos B (CD19+) (C) y linfocitos T (CD4+) (D). Los datos son presentados como la media±SEM o mediana±IQR y fueron analizados usando la prueba t student o U Mann Whitney, previa verificación de normalidad de los datos, para establecer la significancia estadística de las diferencias entre los grupos. * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,0001. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes.
72
60
70
80
90
100
An
nV
-IP
- (%
)Vivas
****
0
10
20
30
40
An
nV
+IP
- (%
)
Apoptóticas tempranas
*
0
5
10
15
20
25
An
nV
+IP
+ (
%)
Apoptóticas tardias
*
0
5
10
15
20
IP+
An
nV
-
Necróticas
****
50
60
70
80
90
100
An
nV
-IP
- (%
)
***
0
10
20
30
40A
nn
V+
IP-
(%)
***
0
5
10
15
20
25
An
nV
+IP
+ (
%)
0
5
10
15
20
IP+
An
nV
-
NLpDerecho
NLpIzquierdo
Bazo
Vehículo Curcumina
70
80
90
100
An
nV
-IP
- (%
)
Vehículo Curcumina 0
10
20
30
40
An
nV
+IP
- (%
)
Vehículo Curcumina 0
5
10
15
20
25
An
nV
+IP
+ (
%)
Vehículo Curcumina 0
5
10
15
20
IP+
An
nV
-
A B C D
Figura 11. La Curcumina induce apoptosis regional pero no sistémica en ratones ApoE-/-. Células del nódulo linfático poplíteo (NLp) o esplenocitos de ratones machos ApoE-/- tratados con Curcumina (o vehículo) fueron teñidas con Anexina V y ioduro de propidio para la evaluación de la muerte celular. Porcentajes de células vivas (A), células en apoptosis temprana (B), células en apoptosis tardía (C) y células necróticas (D) en NLp derecho, NLp izquierdo y esplenocitos totales. Los datos son presentados como la media±SEM o mediana±IQR y fueron analizados usando la prueba t student o U Mann Whitney, previa verificación de normalidad de los datos, para establecer la significancia estadística de las diferencias entre los grupos. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes. * p<0,05; ** p<0,005; *** p<0,0005. **** p<0,0001. Células Ann-IP- (vivas), Ann+IP- (apoptosis temprana) Ann+IP+ (apoptosis tardía) IP+Ann- (necróticas).
73
Figura 12. Biodistribución de la Curcumina bajo el esquema y vía de administración utilizados. (A) Cuantificación de la Curcumina de muestras de macerado de la almohadilla plantar o suero de ratones machos C57BL/9 tratados con Curcumina a diferentes tiempos post inyección. (B) Biodisponibilidad (en suero) de la Curcumina luego de una inyección o ronda de tratamiento. Los datos se presentan como media±SEM con un n=3 por cada grupo.
74
Muerte celular
iod
uro
d
e p
rop
idio
Annexin VFSC FSC-A
SS
C
FS
C-H
Figuras suplementarias Figura suplementaria 1. Estrategia de análisis para definir el estado de muerte celular en NLp. Células vivas: Anexina V- ioduro de propidio- (Ann-IP-). Células en apoptosis temprana: Anexina V+ ioduro de propidio- (Ann+IP-). Células en apoptosis tardía: Anexina V+ ioduro de propidio+ (Ann+IP+). Células necróticas: Ioduro de propidio+ Anexina V- (IP+Ann-).
75
Vehículo Curcumina 3×105
4×105
5×105
6×105
Áre
a p
osit
iva
Oil R
ed
(
m2)
A B
Vehículo Curcumina
Figura suplementaria 2. Evaluación de la deposición lipídica en el seno aórtico. (A) Imágenes representativas de criosecciones de seno aórtico coloreadas con Oil Red y (B) cuantificación del área positiva en rojo para la coloración. Los datos son presentados como la media±SEM y son representativos de 2 experimentos independientes.
76
Figura suplementaria 3. Estrategia de análisis para la población celular CD4+ IFN+
TNF+. Las regiones fueron seleccionadas a partir de los controles de células sin estímulo (SE) y fluorescencia menos uno (FMO).
77
Figura suplementaria 4. Estrategia de análisis para la población celular CD8+ IFN+.
Las regiones fueron seleccionadas a partir de los controles de células sin estímulo (SE) y fluorescencia menos uno (FMO).
78
mRNA TGF- Aorta
Exp
resió
n r
ela
tiva
(mR
NA
TG
F
)
Vehículo Curcumina 0
500
1000
1500
mRNA IL-10 Aorta
Exp
resió
n r
ela
tiva
(m
RN
A IL
-10)
Vehiculo Curcumin 0
50
100
150
mRNA Foxp3 Aorta
Exp
resió
n r
ela
tiva
(mR
NA
Fo
xp
3)
Vehículo Curcumina 0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
mRNA IFN Aorta
Exp
resió
n r
ela
tiva
(mR
NA
IF
N)
Vehículo Curcumina 0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
mRNA TNF Aorta
Exp
resió
n r
ela
tiva
(m
RN
A T
NF
)
Vehículo Curcumina 0
5
10
15
20
mRNA MCP-1 Aorta
Exp
resió
n r
ela
tiva
(mR
NA
MC
P-1
)
Vehículo Curcumina 0
100
200
300
400
500
mRNA IL-1 Aorta
Exp
resió
n r
ela
tiva
(mR
NA
IL-1
)
Vehiculo Curcumina 1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
1×108
A
B
mRNA Foxp3 NLpb
Exp
resió
n r
ela
tiva
(mR
NA
Fo
xp
3)
Vehiculo Curcumina 0
200
400
600
mRNA IL-4 NLpb
Exp
resió
n r
ela
tiva
(m
RN
A IL
-4)
Vehiculo Curcumina 0
20
40
60
mRNA IL-10 NLpb
Exp
resió
n r
ela
tiva
(mR
NA
IL
-10)
Vehiculo Curcumina 0
100
200
300
400
C
Figura suplementaria 5. La Curcumina no altera la cantidad de mRNA de marcadores inflamatorios o antiinflamatorios. En muestras de aorta abdominal (A-B) y nódulos linfáticos parabronquiales (NLpb) (C) de ratones machos ApoE-/- tratados
con Curcumina (o vehículo) se cuantificaron los niveles de mRNA de IFN, TNF, MCP-
1, IL-1β, TGFβ, IL-10 y Foxp3. Cada punto representa un animal. Los resultados fueron analizados usando una prueba t student, previa verificación de normalidad de los datos. Los datos son presentados como la media±SEM.
79
Figura suplementaria 6. Estrategia de análisis para la población celular CD4+ Foxp3+. Las regiones fueron seleccionadas a partir del control de fluorescencia menos uno (FMO).
80
Figura suplementaria 7. Estrategia de análisis para la población celular MHC IIHI CD11c+ IL-10+. Las regiones fueron seleccionadas a partir de los controles de células sin estímulo (SE).
81
Figura suplementaria 8. Estrategia de análisis para la población celular CD19+IL-10+. Las regiones fueron seleccionadas a partir de los controles de células sin estímulo (SE) y fluorescencia menos uno (FMO).
82
Figura suplementaria 9. Estrategia de análisis para la población celular CD4+ IL-10+. Las regiones fueron seleccionadas a partir de los controles de células sin estímulo (SE) y fluorescencia menos uno (FMO).
83
4. Capítulo II: Explorando los efectos de la Curcumina a bajas
dosis en enfermedad autoinmune y su mecanismo
antiinflamatorio
Resumen
Introducción: La esclerosis múltiple (multiple sclerosis, MS) es una enfermedad
inflamatoria desmielinizante del sistema nervioso central (SNC), y la mayoría de
pacientes desarrollan parálisis clínica. Aunque la etiología de la MS es
desconocida, es vista como una enfermedad autoinmune, la cual resulta de la
activación de linfocitos T autorreactivos a la mielina del oligodendrocito del SNC.
El modelo murino experimental usado para la reproducción de la MS es conocido
como encefalitis experimental autoinmune (EAE), en el cual se inmunizan
animales con antígenos neuronales tales como la glicoproteína de la mielina del
oligodendrocito (MOG) que inducen las características clínicas y patológicas
similares a las ocurridas durante la MS, y puede ser usado para estudiar el
mecanismo y eficacia de potenciales agentes terapéuticos. La patogenia de
MS/EAE es un proceso complejo que involucra la activación de macrófagos y
microglía, la diferenciación de linfocitos Th1/Th17 específicos de antígenos
neuronales y la secreción de citoquinas inflamatorias en el SNC. El
descubrimiento de una red conformada por TolDC, linfocitos Treg, y en especial
de mediadores como la IL-10, los cuales pueden ser inducidos por la Curcumina,
que podría inhibir el desarrollo de la inflamación ocurrida durante EAE, sugiere
nuevas estrategias inmunopreventivas o inmunoterapéuticas para
enfermedades crónicas no transmisibles.
Objetivo: Evaluar los mecanismos inmunológicos de la neuroprotección, luego
de la administración subcutánea repetitiva a bajas dosis de la Curcumina en un
modelo murino de EAE.
Metodología: Se administró la Curcumina subcutáneamente día de por medio en
ratones C57BL/6 antes de la inducción de EAE, y hasta finalizar el experimento.
El efecto neuroprotector fue evaluado con un score clínico de parálisis y
evaluación histológica de cordón lumbar. Adicionalmente, se evaluaron
84
citoquinas (IFN, IL-17-A, TNF e IL-10) en esplenocitos en respuesta al
antígeno MOG (ex vivo). Por RT- PCR se determinó la expresión de genes
relacionados con la respuesta pro/antiinflamatoria en cordón lumbar, y se
cuantificaron los niveles de IgG1 e IgG2c específicos de MOG en el suero de los
animales. Finalmente se evaluó el efecto neuroprotector de la Curcumina en
ratones deficientes en IL-10 inducidos a desarrollar EAE bajo el mismo esquema
de tratamiento.
Resultados: Se encontró que el tratamiento con la Curcumina disminuye las
manifestaciones clínicas, la desmielinización, el infiltrado inflamatorio, la
expresión génica de IFN, IL-17, y los niveles séricos de IgG1/IgG2-anti-MOG.
Asimismo, se observó una reducción en la producción ex vivo de IL-17-A y TNF,
y un aumento en la producción de IL-10. Finalmente se encontró una pérdida del
efecto neuroprotector mediado por el tratamiento con la Curcumina en los
ratones IL-10-/-.
Conclusión: El tratamiento subcutáneo y a bajas dosis con la Curcumina tiene
efecto neuroprotector, evidenciado por la disminución de la parálisis: dicho efecto
parece estar mediado por la IL-10, que juega un papel crucial en el efecto
antiinflamatorio promovido por la Curcumina.
Palabras clave: esclerosis múltiple, encefalomielitis experimental autoinmune,
IL-10
85
Abstract
Introduction: Multiple sclerosis (multiple sclerosis, MS) is a demyelinating
inflammatory disease of the central nervous system (CNS), and most patients
develop clinical paralysis. Although the etiology of MS is unknown, it is seen as
an autoimmune disease, which results from the activation of autoreactive T
lymphocytes to myelin from the CNS oligodendrocyte. The experimental murine
model used for the reproduction of MS is known as experimental autoimmune
encephalitis (EAE), in which animals are immunized with neuronal antigens such
as oligodendrocyte myelin glycoprotein (MOG). This model induces similar
clinical and pathological characteristics to those that occurred during MS and can
be used to study the mechanism and efficacy of potential therapeutic agents.
MS/EAE pathogenesis is a complex process involving macrophage and
microglial activation, differentiation of neural antigen-specific Th1/Th17
lymphocytes, and secretion of inflammatory cytokines in the CNS. The discovery
of a network of TolDC, Treg lymphocytes, and mediators such as IL-10, which
can be induced by Curcumin, which could inhibit the development of inflammation
that occurred during EAE, suggests new immunoprotective or immunotherapeutic
strategies for chronic non-communicable diseases.
Aim: To evaluate the immunological mechanisms of neuroprotection, after
repetitive subcutaneous administration at low doses of Curcumin in a murine
model of EAE.
Methodology: Curcumin was administered subcutaneously every other day in
C57BL/6 mice before EAE induction and until the end of the experiment. The
neuroprotective effect was evaluated with a clinical score of paralysis and
histological evaluation of the lumbar cord. Additionally, cytokines (IFN, IL-17-A,
TNF, and IL-10) were evaluated in splenocytes in response to the MOG antigen
(ex vivo). The expression of genes related to the pro/anti-inflammatory response
in the lumbar cord was determined by RT-PCR, and the levels of MOG-specific
IgG1 and IgG2c in the serum of the animals were quantified. Finally, the
86
neuroprotective effect of Curcumin was evaluated in IL-10 deficient mice induced
to develop EAE under the same treatment scheme.
Results: Curcumin treatment was found to decrease clinical manifestations,
demyelination, inflammatory infiltrate, gene expression of IFN, IL-17, and serum
IgG1/IgG2-anti-MOG levels. Also, a reduction in ex vivo production of IL-17-A
and TNF was observed, and an increase in IL-10 production. Finally, a loss of
neuroprotective effect mediated by treatment with Curcumin was found in IL-10-/-
mice.
Conclusion: Subcutaneous low-dose treatment with Curcumin has a
neuroprotective effect, evidenced by the decrease in paralysis, this effect seems
to be mediated by IL-10, which plays a crucial role in the anti-inflammatory effect
promoted by Curcumin.
Keywords: multiple sclerosis, experimental autoimmune encephalomyelitis, IL-
10.
87
Introducción La MS es un trastorno autoinmune y neurodegenerativo, con inflamación crónica,
desmielinización, pérdida axonal y neuronal en el sistema nervioso central
(SNC). Existen aproximadamente 2,5 millones de personas alrededor del mundo
que padecen de esta enfermedad, con mayor incidencia en mujeres que en
hombres (43,180). La MS se divide en cuatro categorías según la aparición y
duración de las manifestaciones clínicas: MS recurrente-remitente, MS
progresiva primaria, MS progresiva secundaria y MS recurrente-progresiva
(181). Las lesiones de pacientes con MS se caracterizan por áreas multifocales
de destrucción de la vaina de la mielina, muerte de oligodendrocitos, daño axonal
y neuronal. La desmielinización del SNC genera una serie de síntomas clínicos,
como parestesia, ataxia, deterioro cognitivo, pérdida de visión y movilidad (182).
La mayor parte de los pacientes que sufren de MS son adultos jóvenes,
conllevando a enormes cargas físicas, psicosociales y económicas a sus
familias.
Aunque se han producido nuevas terapias para el tratamiento de la MS, la tasa
de discapacidad y mortalidad temprana sigue siendo preocupante. Actualmente,
no existe una cura definitiva para la MS y el tratamiento se ha basado
principalmente en agentes inmunomoduladores que reducen la aparición de la
sintomatología clínica y la progresión; sin embargo, muchos de estos son de alto
costo y tienen diversos efectos secundarios (183). Entre las terapias
inmunomoduladoras se incluye el IFNβ, que inhibe la diferenciación de linfocitos
T, entre estos los linfocitos Th17, los cuales desempeñan un papel crítico en el
desarrollo de la respuesta autoinmune, e inhibe la expresión de varias citoquinas
involucradas en el proceso de inflamación, como IL-1β e IL-23. La supresión de
la diferenciación de células Th17 por IFNβ podría ser el mecanismo más
importante de supresión selectiva en la MS (184). A pesar de esto, la patogénesis
de la MS y las estrategias terapéuticas para su tratamiento aún merecen estudio
a profundidad.
88
La MS ha sido estudiada en el modelo murino de EAE, que comparte
características clínicas y patológicas con la enfermedad humana. La EAE puede
inducirse en animales mediante inmunización con MOG u otro antígeno de la
mielina, junto con la PTX la cual permite la permeabilización de la BHE; y está
mediada por linfocitos T específicos de la mielina que migran al SNC y atacan
las neuronas (185). Este modelo ha sido útil para estudiar los procesos
inflamatorios durante el curso de la enfermedad y para el desarrollo de
potenciales terapias contra la MS (186). Mediante técnicas de coloración
histológicas como la H&E y Luxol fast blue, se observa, en cortes de cordón
lumbar o cerebro, el infiltrado inflamatorio o el daño de la mielina ocasionado por
la respuesta inmune. De esta manera, el modelo provee la oportunidad de
estudio de la fisiopatología de la MS, teniendo la ventaja del corto tiempo
requerido para las evaluaciones (4 semanas). En resumen, el uso de este
modelo permite la evaluación de tratamientos preventivos o terapéuticos para la
MS, siendo también un modelo autoinmune, como lo ocurrido en el modelo de
aterosclerosis.
Se ha demostrado que la Curcumina en altas dosis por vía oral o intraperitoneal,
puede tener efectos neuroprotectores en el modelo de EAE. Estos efectos se
deben en parte a que la Curcumina evita la apoptosis del oligodendrocito, la
producción de citoquinas como el IFN e IL-17 en linfocitos CD4+ y otras
citoquinas proinflamatorias. Además, aumenta los niveles de expresión de los
genes de la IL-10 y Foxp3 en muestras de cerebro o cordón lumbar, logrando de
esta manera reducir la severidad de EAE (187–191). Dado los resultados
expuestos en el capítulo anterior, en el cual se indujo una red tolerogénica que
media ateroprotección (IL-10/TolDC/Treg/Breg), utilizamos el modelo de EAE
como herramienta experimental para evaluar si este esquema de tratamiento
podría ser efectivo en otro modelo inflamatorio de enfermedad, y además, siendo
este un modelo murino más corto que el de aterosclerosis, determinar si el
mecanismo principal que conlleva a los efectos antiinflamatorios mediados por
la Curcumina se deben a la producción de IL-10.
89
Objetivos
Objetivo general
Evaluar los mecanismos inmunológicos de la neuroprotección, luego de la
administración subcutánea repetitiva a bajas dosis de la Curcumina en un
modelo murino de EAE.
Objetivos específicos
● Evaluar el efecto neuroprotector de la Curcumina en un modelo murino de
encefalomielitis experimental autoinmune.
● Determinar el efecto de la Curcumina sobre la producción de citoquinas pro-
antiinflamatorias en esplenocitos reestimulados ex vivo con MOG.
● Determinar los niveles de mRNA en el cordón lumbar de genes implicados
en la respuesta inflamatoria, luego del tratamiento con la Curcumina.
● Evaluar el papel de la IL-10 como neuroprotector luego de la administración
de la Curcumina en ratones deficientes en IL-10 inducidos a desarrollar EAE.
90
Materiales y métodos
Animales, dieta y reactivos Se utilizaron ratones hembra C57BL/6 de 7-12 semanas de edad (wild type, WT),
provenientes del bioterio SPF de la Sede de Investigación Universitaria (SIU) de
la Universidad de Antioquia. Para los experimentos de la evaluación del papel
neuroprotector de la IL-10, se usaron hembras C57BL/6 deficientes en IL-10 (IL-
10-/-) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA). Los animales fueron
mantenidos en condiciones SPF en la Facultad de Ciencias Biológicas, Pontificia
Universidad Católica de Chile (PUC). Todos los procedimientos descritos en este
capítulo fueron aprobados por el Comité de Ética para la experimentación con
animales de la UdeA y de la PUC. Los animales fueron alimentados con dieta
estándar para roedores autoclavable (Lab Diet, USA).
Estandarización del modelo murino de esclerosis múltiple
Se evaluaron diferentes condiciones experimentales para la inducción de EAE,
para definir cuál de ellas presentaba menos variabilidad en la sintomatología
clínica. Para ello, grupos (n=6) de ratones C57BL/6 hembras de 7-12 semanas
de edad, fueron inmunizadas con diferentes concentraciones de la combinación
del péptido de MOG (secuencia 35-55, Syd labs, USA) y CFA 10 mg/mL, (Sigma-
Aldrich Merck, USA). Dos y 48 horas después de la sensibilización, los animales
fueron inyectados por vía intraperitoneal (i.p.) con la toxina pertussis (PTX,
Sigma-Aldrich Merck, USA) a las concentraciones indicadas en la Tabla 1. Como
control negativo, se utilizaron ratones con el mismo esquema, en ausencia de
MOG. En los ratones C57BL/6 IL-10 se generó un modelo leve, dado que la
deficiencia en IL-10 aumenta la severidad de la enfermedad (192). Sin embargo,
el comportamiento del puntaje clínico de parálisis es similar al modelo EAE grave
en los animales WT.
91
Tabla 1. Condiciones experimentales para la estandarización del modelo
EAE
Los animales fueron vigilados diariamente para determinar cambios en la
postura, hidratación, comportamiento y apariencia física, llevándose a cabo un
registro diario del peso y estado general de salud. Adicionalmente, se realizó un
puntaje clínico diario para evaluar la severidad de la enfermedad previamente
reportado (193), el cual tuvo en cuenta los siguientes ítems: 0= No parálisis, 0.5=
Parálisis parcial de la cola, 1= Cola totalmente paralizada, 2= Parálisis parcial en
las extremidades traseras, 2.5= Una extremidad trasera paralizada 3= Parálisis
completa en las extremidades traseras, 3.5= Parálisis completa en las
extremidades traseras y debilidad en las extremidades delanteras 4= Parálisis
completa en las extremidades traseras y delanteras, 5=Moribundo.
Evaluación in vivo del efecto neuroprotector de la Curcumina
El modelo grave de EAE evidenció una menor variabilidad en la presentación
clínica de la enfermedad, y fue elegido para evaluar el efecto neuroprotector de
la Curcumina. Para ello, grupos de ratones C57BL/6 hembras de 7-10 semanas
de edad fueron inmunizadas en el lomo con la combinación del péptido MOG y
CFA. Dos horas y 48 horas después de la sensibilización, los animales fueron
inyectados por vía i.p. con PTX. Los animales fueron tratados con vehículo (PBS
+ DMSO 1%) o Curcumina (10 µg/50 µL en PBS) en ambas almohadillas
plantares, siete días antes de la sensibilización. Este régimen de administración
fue dado día de por medio durante todo el desarrollo del experimento (Figura 1).
Tipo de EAE Péptido MOG35-55 CFA Toxina pertussis
Control (-) - 1000 µg/ratón 300 ng/ratón
Leve (IL-10-/-) 100 µg/ratón 500 µg/ratón 250 ng/ratón
Moderado 50 µg/ratón 1000 µg/ratón 300 ng/ratón
Intermedio 100 µg/ratón 500 µg/ratón 200 ng/ratón
Grave 50 µg/ratón 1000 µg/ratón 400 ng/ratón
92
Los animales fueron vigilados diariamente desde el inicio del tratamiento con la
Curcumina para determinar cambios físicos y el score clínico, como se describió
en el capítulo anterior. La eutanasia de los animales se realizó en el día 22
(n=12/grupo) y día 28 (n=7/grupo) post sensibilización, en dos experimentos
independientes.
Evaluación del papel neuroprotector de la Curcumina en ratones
deficientes en IL-10
Grupos de ratones C57BL/6 hembras de 7-10 semanas de edad, deficientes en
IL-10 (n=10/grupo) fueron inmunizados en el lomo con la combinación del
péptido MOG y CFA. Dos horas y 48 horas después de la sensibilización, los
animales fueron inyectados por vía i.p. con 250 ng de PTX. Los animales fueron
tratados con vehículo o Curcumina en almohadilla plantar, siete días antes de la
sensibilización. Este régimen de administración fue dado día de por medio
durante todo el desarrollo del experimento hasta el día 22. Los animales fueron
vigilados diariamente para determinar cambios físicos y el score clínico igual a
como se describió con anterioridad.
Eutanasia de animales y obtención de muestras
Una vez finalizado el experimento se realizó la eutanasia de los animales con
una dosis letal de ketamina y xilacina (100 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente)
por inyección i.p. De cada animal se obtuvo en condiciones asépticas: sangre
por punción cardiaca, muestras de cordón lumbar para histopatología
preservado en PFA al 4% tamponado y para RNA preservadas en RNA later
(Qiagen, Hilden, Germany). A partir del bazo se obtuvieron suspensiones
celulares como se describió en el capítulo anterior. Las muestras de sangre total
de los ratones fueron centrifugadas durante 15-20 minutos a 4000 rpm y los
sueros obtenidos fueron almacenados a -80°C hasta el momento de su análisis.
93
Evaluación de la respuesta antígeno-específica en esplenocitos
totales
Las suspensiones celulares de bazo provenientes de los ratones WT, fueron
resuspendidas a una densidad de 2 x 106 células/mL y cultivadas a 37o C en
atmósfera húmeda con CO2 al 5% durante 48 o 72 horas en presencia de
Concanavalina A (ConA 5 µg/mL), el péptido MOG 20 µg/mL, o un péptido no
relacionado usado como control (Leishmania panamensis 20 µg/mL). Usando
estuches comerciales de ELISA, se determinaron los niveles de IFN, TNF
(Mouse ELISA Kit II OptEIA, BD Biosciences, USA), IL-17-A e IL-10 (R&D
systems, USA) en los sobrenadantes de cultivos, siguiendo las recomendaciones
del fabricante. La absorbancia fue medida en un lector de ELISA (Bio-Rad iMark,
USA) a una longitud de onda de 450 nm con corrección a 570 nm.
Determinación de anticuerpos IgG1 e IgG2c específicos contra MOG
Los niveles de inmunoglobulinas tipo IgG1 e IgG2c específicas de MOG en el
suero de los ratones WT fueron medidos a través de un ensayo de ELISA in
house. Se sensibilizaron platos de 96 pozos (Costar, USA) con 50 µL de MOG
(10 µg/mL) en PBS pH 7,4, durante toda la noche a 4ºC; luego, fueron lavados
con TBS pH 8,0 y bloqueados 2 horas con BSA 1%. Posteriormente, se lavó con
TBS y fueron incubados por 24 horas con 100 µL de la muestra de suero diluida
1:100 en PBS-SBF 10%. Luego, se lavó con TBS y fueron adicionados
anticuerpos biotinilados anti-IgG1 o anti-IgG2c (BD, Biosciences, USA) a una
dilución 1:500, durante 2 horas a 37ºC. Posteriormente los platos fueron lavados
y se incubó con el conjugado Avidina/HRP (eBioscience, USA) por 30 minutos.
Pasado este tiempo, los platos fueron lavados y se añadió el sustrato
tetrametilbenzidina (BD, Biosciences, USA) durante 30 minutos, y pasado este
tiempo fueron adicionados 50 µL de una solución de H2SO4 2N para detener la
reacción. La absorbancia fue medida en un lector de ELISA (Bio-Rad iMark,
USA) a una longitud de onda de 405 nm.
94
Cuantificación de mRNA de genes asociados con inflamación y
regulación inmune
Para determinar la expresión transcripcional de genes asociados con el perfil de
la respuesta inmune inflamatoria como IL-17, IFN, TNF e IL-1β, o genes
asociados con regulación inmune como IL-10, Foxp3, TGF-β e CTLA-4, en
cordón lumbar, se siguió el protocolo descrito en el capítulo anterior.
Análisis histopatológico del cordón lumbar
El tejido de cordón lumbar aislado de la médula espinal de los animales fue fijado
en PFA al 4% tamponado, incluidos en parafina y posteriormente procesados
con micrótomo para obtener cortes de 4 µm. Después de colorear las placas con
hematoxilina-eosina y Luxol fast blue (Sigma-aldrich, USA), los cortes fueron
visualizados microscópicamente para determinar el infiltrado inflamatorio y la
desmielinización. Para el infiltrado inflamatorio se utilizó la siguiente escala de
observación: 0= No células inflamatorias, 1= Pocas células inflamatorias
dispersas, 2= Moderados focos de células inflamatorias, y 3= Extensos focos de
células inflamatorias. Para la evaluación de la desmielinización se utilizó la
siguiente escala de observación: 0= No desmielinización, 1= Pocos focos de
desmielinización, 2= Moderadas áreas de desmielinización, y 3= Extensas y
confluentes áreas de desmielinización, esta escala fue modificada basada en
publicaciones anteriores (194). El análisis fue realizado en ciego y en un
promedio de 5 cortes por animal.
Por otro lado, evaluamos la integridad de la BHE, mediante la retención del Azul
de Evans (Sigma-Aldrich, USA) en cerebro y medula ósea. Para ello, los
animales fueron perfundidos por vía intracardiaca con 20 mL de una solución al
4% de azul de Evans diluida en PBS. Posterior a esto, se realizó la disección de
las muestras de cerebro y cordón lumbar. Para la recuperación del colorante, las
muestras fueron homogeneizadas en 3 mL de acetona y centrifugadas a 14000
rpm. Luego, se tomaron 2 mL del sobrenadante y se procedió a la evaporación
95
del solvente a 55ºC. Las muestras fueron resuspendidas en un volumen de 500
µL de etanol y fueron leídas a una longitud de onda de 620 nm (195). Se utilizó
como blanco etanol y además la muestra de un cerebro de un ratón naive, al cual
se le realizó el mismo procedimiento de perfusión intracardiaca del colorante y la
recuperación anteriormente descrita.
Análisis estadístico En los ensayos de neuroprotección se aplicó el test paramétrico t student o no
paramétrico U Mann-Whitney después de verificar el supuesto de normalidad de
los datos mediante la prueba Shapiro Wilk. Los análisis estadísticos se realizaron
en el programa GraphPad Prism Version 8. En todos los casos se consideró:
p<0,05 significativo *; p<0,01 muy significativo **; y p<0,001 altamente
significativo ***.
96
Resultados
Estandarización del modelo EAE en ratones hembra C57BL/6 WT Se estandarizó el modelo EAE en nuestro laboratorio, evaluando diferentes
condiciones experimentales con combinaciones de péptido-MOG/CFA/PTX
(Tabla 1). El modelo que presentó mejores resultados en cuanto a la pérdida de
peso y puntaje clínico de parálisis fue el Grave (figura suplementaria 1). Con este
modelo de EAE grave se evaluó el efecto neuroprotector de la administración de
la Curcumina a bajas dosis.
La administración a bajas dosis de la Curcumina retrasa o desaparece
la sintomatología de EAE
Para conocer si la inyección subcutánea repetitiva de la Curcumina generaba
neuroprotección in vivo, ratones hembra C57BL/6 inducidas a desarrollar EAE
fueron tratadas bajo el esquema descrito en la figura 1A. Los animales fueron
observados diariamente en búsqueda de cambios en la apariencia física, la
postura, la hidratación y el comportamiento como indicativos de posibles efectos
tóxicos derivados del tratamiento o la inducción de EAE. Como se observa en la
figura 2A, los animales que recibieron Curcumina muestran un incremento
progresivo en la ganancia de peso, mejor que el grupo del vehículo. Cuando se
aplicó el puntaje clínico en los animales, observamos que en los animales
tratados con Curcumina presentaban un retraso o no aparición de la
sintomatología clínica (figura 2B). Asimismo, el porcentaje de animales sanos fue
superior en el tratamiento con Curcumina (figura 2C). Resultados similares
fueron observados a los 28 días (figura 3). Estos resultados indican que el
tratamiento con la Curcumina a bajas dosis retrasa o desaparece la
sintomatología clínica de EAE.
97
La administración de Curcumina disminuye el infiltrado inflamatorio y
la desmielinización en el sistema nervioso central
Se analizó el infiltrado celular en el cordón lumbar y la desmielinización
neuronal. El grupo de ratones tratado con Curcumina exhibió respecto al
vehículo, una reducción significativa de los puntajes inflamatorio (figura 4A día
22 y figura 5A día 28) y de desmielinización (figura 4B día 22 y figura 5B día 28).
Cuando se determinó la expresión del mRNA de genes inflamatorios y
antiinflamatorios en el cordón lumbar a través de RT-PCR, se evidenció una
disminución significativa en los niveles de expresión del mRNA de IL-17 e IFN y
una tendencia al aumento de IL-10 (no significativa) en los ratones tratados con
Curcumina, comparados con el vehículo (figura 6A y 6B). Estos eventos podrían
influir en la disminución del infiltrado inflamatorio y la desmielinización del cordón
lumbar.
La Curcumina disminuye la producción de IL-17-A y TNF, y aumenta
la producción de IL-10 en esplenocitos estimulados con MOG
Se analizó la respuesta de los linfocitos al estímulo específico con el péptido
MOG, se observó una disminución significativa en la producción ex vivo de
TNF, así como un aumento significativo en IL-10, cuando fueron evaluadas a
las 72h en los esplenocitos de los animales tratados con la Curcumina por 22
días, como se observa en la figura 7. Para el caso de la IL-17-A se observó un
fenómeno particular: si bien en las células que fueron estimuladas con MOG no
se observan diferencias entre el tratamiento con Curcumina y el vehículo, las
células de los animales que recibieron el vehículo presentaron un aumento
significativo en la producción de esta citoquina en comparación a las células de
los animales tratados con la Curcumina, tanto en condiciones basales (sin
estímulo), como estimuladas con el péptido control (Lpan). Además, la
evaluación de las citoquinas ex vivo en el experimento de 28 días, evidenció
disminución de la IL-17-A en esplenocitos estimulados con MOG o ConA (Figura
7), en las células obtenidas de los ratones tratados con Curcumina.
98
Evaluación de los niveles plasmáticos de anticuerpos de IgG1 e IgG2c
específicos del neuroantígeno MOG
Se cuantificó en el suero de los ratones los niveles de anticuerpos específicos
para MOG, de las subclases IgG1 e IgG2c. Como puede observarse en la figura
8, los niveles de IgG1 e IgG2c específicos para MOG, en el día 22 no varían con
el tratamiento, aunque para el día 28 se observa una tendencia a estar
disminuidos ambos isotipos.
La IL10 es indispensable para el efecto neuroprotector de la
Curcumina
Para determinar el papel neuroprotector que juega la IL-10 durante el tratamiento
con la Curcumina, se realizó el mismo esquema de tratamiento utilizado en los
experimentos anteriores, pero esta vez utilizando un modelo de EAE leve en
ratones deficientes en IL-10. Como se observa en la figura 9, en ambos grupos
experimentales se observó pérdida de peso y la aparición de los síntomas
clínicos de la enfermedad y el porcentaje de animales enfermos fue similar.
Asimismo, al evaluar el infiltrado inflamatorio por histopatología mediante la
tinción de H&E en el cordón lumbar, encontramos que el tratamiento con
Curcumina no tuvo efecto antiinflamatorio en el SNC (figura 9D). Estos
resultados indican que la presencia de la IL-10 es importante para mediar el
efecto neuroprotector de la Curcumina en el modelo de EAE.
99
Discusión Los avances alcanzados en el entendimiento de cómo la Curcumina llevo a
ateroprotección, nos llevaron a plantear si el papel de la IL-10 es fundamental en
el mecanismo de acción para inducir la red inmunoreguladora observada. Para
esto requeríamos usar un modelo murino de enfermedad, en el cual el sistema
inmune jugará un papel fundamental como en aterosclerosis, y más corto en el
tiempo de desarrollo. Para ello, se estandarizó bajo las condiciones de nuestro
laboratorio, el modelo murino de encefalitis experimental autoinmune (EAE), el
modelo experimental más comúnmente usado de enfermedad desmielinizante
humana, la MS. Este modelo es desarrollado en la cepa de ratones C57BL/6, y
gracias a la colaboración experimental que recibimos del Instituto Milenio de
Inmunología e Inmunoterapia en Santiago de Chile, tuvimos la oportunidad de
realizar experimentos en ratones deficientes en IL-10 (mismo fondo genético de
los ratones C57BL/6 usados en nuestro laboratorio). Estos animales fueron
usados como herramienta para demostrar el papel de la IL-10 en
neuroprotección, bajo las condiciones experimentales de tratamiento con la
Curcumina.
La EAE es una condición compleja en la cual la interacción entre una variedad
de mecanismos inmunopatológicos y neuropatológicos lleva a una aproximación
de las principales características patológicas de MS: inflamación,
desmielinización y pérdida axonal. Los mecanismos inmunoreguladores y de
remielinización también se producen en EAE, por lo tanto, también pueden servir
como modelo para estos procesos. Además, tiene una ventaja en comparación
al modelo de aterosclerosis, ya que permite observar los efectos del tratamiento
en los animales vivos, mientras que en el modelo de aterosclerosis depende de
análisis post mortem. Además, la EAE tiene una neurofarmacología compleja, y
una variedad de los medicamentos que se usan actualmente en la MS se han
desarrollado, probado y validado con estudios preclínicos en este modelo, siendo
una herramienta de farmacología traslacional (196).
100
Luego de estandarizar y adaptar el modelo de EAE a las condiciones de nuestro
laboratorio y en vista de que el modelo grave presenta menos variabilidad y mejor
sintomatología clínica, decidimos adaptar nuestro esquema de administración de
la Curcumina a bajas dosis del modelo de aterosclerosis al de EAE grave. Los
experimentos se realizaron en dos etapas, una temprana que fue 22 días post
inmunización, y una tardía de 28 días. Los resultados muestran que los animales
tratados tienen menos manifestaciones clínicas (figuras 2 y 3), siguiendo los
protocolos previamente reportados (194,197). Estos resultados concuerdan con
estudios previos donde se evaluó la Curcumina en su forma natural o
nanoformulación; sin embargo, estos tratamientos fueron administrados en
diferentes esquemas y por medio de diferentes vías (oral o intraperitoneal)
(150,188–191), en dosis que superan más de 10 veces la suministrada en
nuestro estudio.
Al realizar la evaluación histopatológica del cordón lumbar encontramos que en
los animales tratados con la Curcumina, se redujeron el infiltrado inflamatorio y
la desmielinización. La disminución de la parálisis clínica en los modelos de EAE
mediada por Curcumina, ha sido asociada en parte por su capacidad de disminuir
la inflamación y la desmielinización en el SNC, debido a una disminución en la
producción de IL-12 por macrófagos y microglia (150). Por otro lado, en nuestro
estudio observamos que la neuroprotección se dio en ausencia de un efecto de
la Curcumina sobre la ruptura de la BHE (figura suplementaria 2) (195). Esto nos
sugiere que a pesar de haber iniciado el tratamiento de los animales antes de la
inducción de EAE, la Curcumina no evitó la ruptura de la BHE, lo cual evitaría el
ingreso de las células del sistema inmune hacia el SNC y sus posteriores
consecuencias, sugiriendo que el tratamiento nuevamente tiene efectos
inmunomoduladores antiinflamatorios. Algunos estudios en otros modelos de
enfermedades inflamatorias como aterosclerosis, Alzheimer y artritis han
mostrado que el bloqueo de la inflamación mediado por la Curcumina se debe
en parte a que evita la activación de los macrófagos y linfocitos e inhibe la
producción de citoquinas proinflamatorias y de quimioquinas (79,198,199).
101
La patogénesis de EAE/MS es un complejo proceso de activación de células
inmunes y producción de citoquinas inflamatorias. IL-17 y IFN son dos
mediadores críticos durante el desarrollo de EAE y MS (188). Por otra parte,
citoquinas como IL-10 y el TGFβ contraregulan la respuesta inflamatoria (200).
Para determinar si la Curcumina redujo la respuesta inflamatoria a nivel del SNC,
examinamos la expresión en el cordón lumbar de los animales tratados hasta el
día 22 de diferentes genes, entre los que se encontraban: IL-17, IFN, TNF e
IL-1β. En este estudio encontramos una reducción significativa tanto en el
puntaje clínico como en la inflamación y la desmielinización del SNC, que se
relaciona con una inhibición en la expresión de IL-17 e IFN a nivel del SNC. La
reducción en la respuesta Th1/Th17 observada en el órgano blanco puede ser
debida a una represión transcripcional de IFN/IL-17 o una disminución del
infiltrado de linfocitos T dentro del SNC. Esto concuerda con estudios previos,
donde la reducción de la respuesta de tipo Th1/Th17 limita la inducción de EAE
por el tratamiento con la Curcumina (188). Al determinar si la Curcumina inhibe
la respuesta de citoquinas proinflamatorias Ag-específica ex vivo a MOG por
parte de linfocitos T en esplenocitos totales, observamos que el tratamiento in
vivo con la Curcumina disminuyó la secreción de citoquinas proinflamatorias (IL-
17-A y TNF) frente al antígeno neuronal, principalmente en el día 28 post
inmunización, lo cual concuerda con reportes previos (188).
Cuando se evaluó la respuesta antiinflamatoria a nivel del SNC, examinamos la
transcripción a nivel del cordón lumbar de los genes Foxp3, IL-10, TGFβ y CTLA-
4 de los animales, y observamos un aumento que no alcanza a ser significativo
en la expresión de IL-10. Sin embargo, la Curcumina indujo la producción de IL-
10 en respuesta Ag-específica a MOG por parte de linfocitos T en los
esplenocitos totales, solo en el día 22 post inmunización, pero creemos que el
efecto observado puede deberse a que la medición a 48 h fue un tiempo corto
para su cuantificación, lo cual concuerda con reportes previos, en el cual en este
tiempo de cuantificación se observaron bajos niveles de IL-10 (188). Esta
102
citoquina es crítica para la inmunoregulación de EAE, ya que se ha observado
que ratones IL-10-/- son más susceptibles y desarrollan un EAE más severo que
los ratones WT (201). Además, las células provenientes de ratones IL-10-/- tienen
una proliferación Ag-específica más fuerte y producen una mayor cantidad de
citoquinas proinflamatorias (IFN y TNF) cuando se estimulan con
neuroantígeno (201). Especulamos entonces que, bajo las condiciones
evaluadas, el tratamiento con la Curcumina regula la respuesta de tipo Th17
mediante un aumento en la producción de IL-10.
Aunque en este trabajo no se evaluó si la Curcumina eleva la expresión de
PPAR en el SNC y órganos linfoides, sería de gran interés determinar su papel
como neuroprotector, ya que en EAE y otros modelos inflamatorios ha sido
sugerido que la Curcumina funciona como un agonista de PPAR logrando inhibir
la inflamación (188,202). Ya que se ha evidenciado la presencia de elementos
de respuesta de PPAR en el promotor del gen de IL-10, y que se ha descrito
que agonistas de PPAR median la producción de IL-10 en células dendríticas y
linfocitos T CD4+ (203), el eje PPAR/IL-10 podría tener un papel crítico en el
regulación de la respuesta Th17 observada en nuestros experimentos.
Los linfocitos B tienen un papel esencial en la patogénesis de la MS, ellos regulan
la respuesta autoinmune y participan en el desarrollo de las lesiones en el SNC
(204). Datos de estudios en animales y humanos han enfatizado la importancia
de los linfocitos B en la patología de la MS, por ejemplo, poblaciones de linfocitos
B se detectan dentro de las lesiones de pacientes con MS al inicio de los
síntomas clínicos (205–207). La síntesis persistente de Ig (oligoclonales)
detectadas en el líquido cefalorraquídeo (LCR) en más del 95% de los pacientes
es una de las características de la MS y, además se ha demostrado que estas Ig
son producidas localmente por los linfocitos B del LCR en la MS (208). Estas Ig
son principalmente IgG, pero IgM también se encuentra en cerca del 40% de los
pacientes con MS. Las IgG e IgM se han asociado con un mayor riesgo de
conversión de síndrome de desmielinización clínicamente aislado a pacientes
103
con MS clínicamente definidos (209,210). La evidencia más convincente del
papel de los linfocitos B en la patología de la MS, proviene de los resultados
clínicos donde las terapias selectivas contra los linfocitos B son altamente
beneficiosas (211–213). Por lo anteriormente expuesto, y dado que la producción
de anticuerpos juega un papel importante en MS, se evaluó los niveles
plasmáticos de IgG1 y IgG2c anti-MOG. Al observar los resultados encontramos
que hubo una reducción (aunque no significativa) de los niveles de ambos
isotipos en los animales tratados con Curcumina en el día 28 post inmunización;
esto puede también estar demostrando una contracción de la respuesta
adaptativa. A pesar de que esta reducción no fue significativa, este resultado es
de gran importancia dado que se ha demostrado que la inyección de anticuerpos
monoclonales específicos de MOG en ratas Lewis acelera la patología clínica y
la desmielinización del SNC (214) y, además los anticuerpos humanos contra
MOG pueden causar desmielinización dependiente de complemento (215). Sería
interesante en trabajos posteriores determinar si parte del papel neuroprotector
de la Curcumina es a través de los linfocitos B.
La IL-10 fue descrita por primera vez como un factor producido por los linfocitos
Th2, que inhibe la producción de citoquinas por linfocitos Th1 (216). Se ha
demostrado que IL-10 inhibe la producción de una amplia gama de citoquinas en
linfocitos T, al afectar la presentación de antígenos y la coestimulación mediada
por CPA (217). La IL-10 también juega un papel importante en la regulación de
la lesión autoinmune en EAE, que se demuestra por el aumento de la
susceptibilidad de los ratones IL-10-/- (201). Por el contrario, ratones que sobre
expresan IL-10 son altamente resistentes a la inducción de EAE (218). Como en
el capítulo anterior observamos una red inmunoreguladora de células
productoras de IL-10, quisimos probar si existía una asociación causal entre la
producción de la IL-10 y la neuroprotección mediada por la Curcumina. Para ello,
ratones C57BL/6 deficientes en IL-10 fueron tratados con la Curcumina e
inducidos a desarrollar EAE, pero bajo condiciones de inmunización leve, dado
su deficiencia y susceptibilidad a la enfermedad. El resultado demuestra que el
104
efecto neuroprotector de la Curcumina es ausente en los ratones IL-10-/-, por lo
tanto, este mecanismo está mediando la neuroprotección, y especulamos que
este mismo mecanismo juega un papel crucial en la ateroprotección inducida por
la Curcumina. Por lo tanto, la red tolerogénica de TolDC/Treg/Breg inducida por
el tratamiento con la Curcumina es dependiente de la producción de IL-10.
105
Conclusiones ● El tratamiento profiláctico con la Curcumina a bajas dosis disminuye la
aparición de la sintomatología clínica de parálisis en los animales inducidos a
desarrollar EAE.
● El tratamiento disminuye el infiltrado inflamatorio y la desmielinización en el
cordón lumbar.
● El tratamiento disminuye la producción de citoquinas proinflamatorias IL-
17-A y TNF, y aumenta la IL-10 en el sobrenadante de esplenocitos
reestimulados con MOG.
● El efecto neuroprotector de la Curcumina es dependiente de la producción
de IL-10.
106
Figuras Figura 1. Evaluación del efecto neuroprotector de la Curcumina en el modelo murino grave de EAE. (A) Ratones hembras C57BL/6 de 7 a 10 semanas de edad fueron tratadas con Curcumina (o vehículo) en la almohadilla plantar día de por medio 7 días antes de la inmunización con CFA/MOG, 2 y 48 h después recibieron una inyección intraperitoneal de toxina pertussis (PTX) y se realizó el monitoreo a partir de la inmunización del puntaje clínico de EAE en los animales durante 22 o 28 días. (B) En el día 22 y 28 post inmunización se realizó la eutanasia y toma de muestras de los animales para análisis histopatológico, expresión génica, reestimulación ex vivo y ELISA de anticuerpos MOG-específicos.
107
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
-5-4-3-2-1012345
p
es
o (
gr)
VehículoCurcumina
** * ** ** *
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
0
1
2
3
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( S
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)
**
** ****** *** *** *** ***
***
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
0
20
40
60
80
100
Dia post inmunización
An
imale
s s
an
os
(%
)
A
B
C
Figura 2. La administración de Curcumina tiene efecto neuroprotector 22 días post inmunización. Ratones hembras C57BL/6 fueron tratadas con Curcumina (o vehículo) e inducidas a desarrollar EAE. (A) Registro diario de la ganancia de peso. (B) Evaluación diaria del puntaje clínico. (C) Porcentaje de animales sanos. Los gráficos muestran la media ±SEM. Los resultados fueron analizados con la prueba t student, previa verificación de normalidad de los datos. * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,0001.
108
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
-5-4-3-2-1012345
Vehículo
Curcumina
pe
so
(g
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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
0
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( S
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******************
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
0
20
40
60
80
100
Dia post inmunización
An
imale
s s
an
os (
%)
A
B
C
Figura 3. La administración de Curcumina a bajas s.c. tiene efecto neuroprotector 28 días post inmunización. Ratones hembras C57BL/6 fueron tratadas con Curcumina (o vehículo) e inducidas a desarrollar EAE. (A) Registro diario de la ganancia de peso. (B) Evaluación diaria del puntaje clínico. (C) Porcentaje de animales sanos. Los gráficos muestran la media ±SEM. Los resultados fueron analizados usando la prueba t student o U Mann Whitney, previa verificación de normalidad de los datos. * p<0,05; ** p<0,01.
109
0
1
2
3
4
Sco
re in
flam
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rio
*
Vehículo Curcumina0
1
2
3
4
Sco
re d
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ialin
izació
n *
Vehículo Curcumina
A
C D
B Figura 4. Evaluación del infiltrado inflamatorio y la desmielinización en el cordón lumbar 22 días post inmunización. Ratones hembras C57BL/6 fueron tratadas con Curcumina (o vehículo) e inducidas a desarrollar EAE. (A) Imágenes representativas del cordón lumbar coloreadas con Hematoxilina-Eosina y score inflamatorio (B). Imágenes representativas del cordón lumbar coloreadas con Luxol fast blue (C) y score de desmielinización (D). En los gráficos cada punto representa un animal y son expresados como la mediana±IQR. Los resultados fueron analizados usando una prueba U Mann Whitney, previa verificación de normalidad de los datos. * p<0,05.
110
0
1
2
3
4
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flam
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***
Vehículo Curcumina0
1
2
3
4
sco
re d
esm
ialin
izació
n ***
Vehículo Curcumina
A
C
B
D
Figura 5. Evaluación del infiltrado inflamatorio y la desmielinización en el cordón lumbar 28 días post inmunización. Ratones hembras C57BL/6 fueron tratados con Curcumina (o vehículo) e inducidos a desarrollar EAE. (A) Imágenes representativas del cordón lumbar coloreadas con H&E y score inflamatorio (B). Imágenes representativas del cordón lumbar coloreadas con Luxol fast blue (C) y score de desmielinización (D). En los gráficos cada punto representa un animal y son expresados como la mediana±IQR o media ±SEM. Los resultados fueron analizados usando una prueba U Mann Whitney o t student, previa verificación de normalidad de los datos. *** p<0,0001.
111
0
100
200
300
400
UR
T IL
-17
/HP
RT
(x
10
5)
IL-17
*
Vehiculo Curcumina 0
200
400
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UR
T IL
-10
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T I
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x1
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*
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500000
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TNF
UR
T T
NF
/H
PR
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x1
05)
Vehiculo Curcumina 0
50000
100000
150000
200000
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x1
05)
0
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T IL
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10
5)
Vehiculo Curcumina 0
2000
4000
6000
8000
CTLA4
UR
T C
TL
A4/H
PR
T (
x10
5)
Genes inflamatorios y antiinflamatorios
A
B
Figura 6. Evaluación de la expresión de genes inflamatorios y antiinflamatorios en cordón lumbar. Ratones hembras C57BL/6 fueron tratadas con Curcumina (o vehículo) e inducidas a desarrollar EAE durante 22 días. Se tomaron muestras de cordón lumbar para la cuantificación de los niveles de expresión de mRNA de genes inflamatorios IL-
17, IFN, TNF y IL-1β (A) y antiinflamatorios IL-10, Foxp3, TGFβ y CTLA-4 (B). Cada
punto representa un animal. Los resultados fueron analizados usando una prueba t student, previa verificación de normalidad de los datos. Los datos son presentados como la media±SEM. * p<0,05.
112
IL-17-A
0
500
1000
1500
IL-1
7-A
(p
g/m
L)
*
*
IFN
0
500
1000
1500
2000
2500
30006000
7000
IFN
(
gm
L)
TNF
0
100
200
300
400
TN
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pg
/mL
)
***
IL-10
0
50
100
150
200
250
IL-1
0 (
pg
/mL
)
*
VehículoCurcumina
NE ConA MOG L(pan)0
500
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1500
IL-1
7-A
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g/m
L) *
*
NE ConA MOG L(pan)0
500
1000
1500
2000
2500
IFN
(
gm
L)
NE ConA MOG L(pan)0
50
100
150
IL-1
0 (
pg
/mL
)
Dia 22
Dia 28
NE ConA MOG L(pan)0
100
200
300
400
TN
F
(p
g/m
L)
A
B
Figura 7. Evaluación de la respuesta antígeno-específica en esplenocitos. 2 x 106/mL esplenocitos de animales tratados con Curcumina (o vehículo) fueron tratadas con ConA (5 µg/ml), MOG (20 µg/ml), Lpan (20 µg/ml) o solo medio (no estimuladas (NE)). (A) Evaluación de la producción de citoquinas ex vivo, tras 72 horas de cultivo de esplenocitos (22 días post inmunización). (B) Evaluación de la producción de citoquinas ex vivo, tras 48 horas de cultivo de esplenocitos (28 días post inmunización). Los datos son presentados como la media±SEM o mediana±IQR. Los resultados fueron analizados usando una prueba t student o U Mann Whitney, previa verificación de normalidad de los datos. * p<0,05; *** p<0,0001.
113
Naive Vehículo Curcumina 0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Ab
s a
655n
m
IgG1 anti-MOG
IgG1 anti-MOG
Vehículo Curcumina 0.0
0.5
1.0
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2.0
Ab
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655n
m
Naive Vehículo Curcumina 0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Ab
s a
655n
m
IgG2c anti-MOG
IgG2c anti-MOG
Vehículo Curcumina 0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Ab
s a
655n
m
Dia 28
Dia 22
A
B
Figura 8. Cuantificación de anticuerpos anti-MOG en animales tratados con la Curcumina. En muestras de suero de los ratones hembras tratados con el esquema descrito, se cuantificaron los niveles de anticuerpos IgG1 e IgG2c anti-MOG, el día 22 (A) y 28 (B). Cada punto representa un animal. Los resultados fueron analizados usando una prueba t student, previa verificación de normalidad de los datos. Los datos son presentados como la media±SEM de la absorbancia a 405 nm.
114
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
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Dia post inmunización
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B
C
D
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Figura 9. Evaluación del efecto neuroprotector de la Curcumina en ratones IL-10-/-
Ratones IL-10-/- hembras C57BL/6 de 7 a 10 semanas de edad, fueron tratadas con Curcumina (o vehículo) en la almohadilla plantar día de por medio 7 días antes de la inmunización con CFA/MOG. (A) Registro de la ganancia de peso. (B) Evaluación del puntaje clínico. (C) Porcentaje de animales sanos. (D) Score inflamatorio de cordón lumbar. Los gráficos son presentados como la media ±SEM.
115
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38
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4
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Intermedio
Grave
Control (-)
Moderado
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gr)
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1
2
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4
Día post inmunización
Pu
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( S
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)
A
B
Figuras suplementarias Figura suplementaria 1. Estandarización del modelo murino de encefalomielitis experimental autoinmune (EAE). Ratones hembras C57BL/6 de 7 a 12 semanas de edad fueron inmunizadas con la combinación de diferentes concentraciones de CFA y MOG, 2 y 48 h después recibieron una inyección intraperitoneal de toxina pertussis (PTX) y se realizó el monitoreo durante 38 días. (A) Registro diario de la ganancia de peso. (B) Evaluación diaria del puntaje clínico. Los gráficos son presentados como la media ±SEM.
116
Cerebro
Blanco Vehículo Curcumina0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Ab
so
rba
ncia
( 6
10
nm
)
Vehículo
Curcumina
Blanco
Cordón lumbar
Vehículo Curcumina0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Ab
so
rba
ncia
( 6
10
nm
)
A
B
Figura suplementaria 2. Evaluación de la ruptura de la barrera hematoencefálica mediante la tinción de azul de Evans. Ratones hembras C57BL/6 de 7 a 10 semanas de edad tratadas con Curcumina (o vehículo) e inmunizadas con CFA/MOG. En el día 22 post inmunización se tomaron muestras de cerebro (A) y cordón lumbar (B) y se evaluó la presencia de Azul de Evans a 610 nm. Los gráficos son presentados como la media ±SEM.
117
5. Conclusión general
Los resultados de este trabajo sugieren que el tratamiento con la Curcumina de
forma subcutánea presenta efectos moduladores de la respuesta inmune
durante el desarrollo de dos NTCD cuya patogénesis de desarrollo implica la
respuesta inflamatoria. La relación que existe entre el desbalance inmune y el
establecimiento de la respuesta inflamatoria es un evento clave en el desarrollo
de ambas patologías, convirtiéndose en un blanco terapéutico de intervención
oportuna, disminuyendo así la sintomatología clínica desfavorable.
Las bajas dosis usadas de la Curcumina y el esquema de administración
subcutáneo utilizado, permitieron no solo una no exposición sistémica de la
molécula, sino demostrar de una forma segura que se pueden obtener efectos
sobre células inmunes con funciones reguladoras, las cuales logran impactar el
desarrollo in vivo de la aterosclerosis y la EAE. Esta alternativa de intervención
permite pensar en un sistema de liberación compatible para su uso en pruebas
clínicas en humanos, ya que puede ser fácilmente preparada y de bajo costo, así
mismo abre una ventana de intervención en otras patologías de origen
inflamatorio donde la activación de linfocitos Treg ha demostrado tener un efecto
terapéutico.
Los resultados del presente estudio son esperanzadores para el ámbito clínico,
ya que el tratamiento con la Curcumina no solo redujo los parámetros
inflamatorios en la patogénesis de la aterosclerosis, sino que además permitió
ver la mejoría clínica de los animales inducidos a desarrollar EAE, sugiriendo
que este tipo de terapias no solo pudieran ser usadas como tratamientos
inmunoprofilácticos sino como inmunoterapéuticos, es decir cuando ya se ha
establecido la sintomatología clínica. Sin embargo, es necesario profundizar en
este escenario, ya que en nuestro trabajo experimental en los ratones ApoE-/- no
evaluamos el potencial terapéutico del tratamiento en placas establecidas, que
pudieran indicar un posible efecto de regresión de la placa, el cual tendría un alto
valor dado que la aterosclerosis humana es una enfermedad inflamatoria crónica
118
silenciosa; si esto resulta ser cierto, sería de gran valor para el futuro traslacional
de esta terapia.
En resumen, durante la patogénesis de la aterosclerosis en ratones ApoE-/-, la
ox-LDL activa las DC las cuales llevan a la diferenciación de linfocitos Th que
promueven el desarrollo de la placa aterosclerótica. Sin embargo, cuando estos
son tratados con la Curcumina en la almohadilla plantar, se genera una
acumulación de la misma, la cual puede ser captada por DC residentes de la
piel, y estas podrían migrar a órganos linfoides secundarios (Nódulo linfático),
donde además existen señales antiinflamatorias mediadas por la eferocitosis;
así, estás DC adquieren características tolerogénicas (producción de IL-10) que
llevan a la diferenciación de linfocitos Treg y Breg, que interfieren con la
progresión de la placa aterosclerótica.
Un contexto similar ocurre durante la inducción de EAE, donde el papel
desencadenante de la enfermedad está principalmente mediado por linfocitos
Th17 y Th1 específicos de MOG. Igualmente, el tratamiento con la Curcumina
en ratones WT logra un aumento de la respuesta inmune reguladora, que se ve
evidenciando por un menor grado de inflamación y daño a nivel de SNC. Sin
embargo, cuando este tratamiento es aplicado en los ratones IL-10-/-, vemos que
no se da un aumento en la respuesta inmune reguladora, teniendo como
resultado la presentación clínica de la enfermedad y por ende daños a nivel del
SNC, demostrando que el mecanismo protector es mediado, al menos en gran
parte, a través de la producción de IL-10.
119
Figura modelo Figura Modelo. Efectos inmunoreguladores de la Curcumina en el modelo murino de aterosclerosis y EAE. (A) En los ratones ApoE-/- las DC captan el ateroantígeno ox-LDL y activan la respuesta inmune Th1 y Th2, generando una respuesta aberrante por estas células y el aumento del ateroma. Sin embargo, el tratamiento con la Curcumina aumenta la frecuencia de TolDC, linfocitos Treg y Breg (aumentando la producción de IL-10 en estos) lo cual en conjunto suprime la respuesta inmune Th1 y Th2, llevando a una reducción en el tamaño del ateroma. (B) En los ratones WT inducidos a desarrollar EAE, las DC captan el antígeno MOG y activan linfocitos Th17 y Th1, que favorecen el daño al SNC. En este caso el tratamiento con la Curcumina, aumenta la frecuencia de TolDC, Treg y Breg los cuales bloquean la respuesta inmune Th17 y Th1, llevando a una reducción del infiltrado y la desmielinización en el SNC, evitando su daño. Este efecto protector es dependiente de la IL-10, ya que en los ratones IL-10-
-/- se genera daño del SNC y la sintomatología clínica, incluso en presencia del tratamiento con la Curcumina.
120
6. Perspectivas
A partir de los estudios y discusiones presentados, las perspectivas se orientan
en varias direcciones:
● En primer plano, estarían los trabajos encaminados a establecer la
funcionalidad del tratamiento terapéutico con la Curcumina en ambos modelos
de enfermedad, y determinar el efecto sobre placas establecidas, para observar
si este puede retardar la progresión o mediar la regresión de la placa; y por otra
parte, en el modelo de EAE determinar si el iniciar el tratamiento varios días
después de la inducción del modelo también retardaría la sintomatología clínica
de la enfermedad. Esto permitiría saber que el tratamiento no solo tiene
propiedades preventivas sino además curativas. Si bien hemos realizado un
experimento preliminar del tratamiento terapéutico de la Curcumina en ratones
inducidos a desarrollar EAE (información complementaria 2), es necesario
profundizar en este aspecto para determinar si los mecanismos protectores del
tratamiento terapéutico son similares a los operados durante el tratamiento
profiláctico.
● Otro punto a evaluar es el efecto in vivo del tratamiento con la Curcumina
sobre marcadores adicionales del estado de maduración/activación de las TolDC
(CD80, CD83, CD86), que son de vital importancia durante la sinapsis
inmunológica.
● Es necesario explorar si los mecanismos de supresión de los linfocitos Treg
aumentan por el tratamiento con la Curcumina, incluyendo la expresión de otros
receptores como CD25, CTLA-4, LAG3, y otros mecanismos de supresión como
la citólisis mediada por granzima B.
● Sería interesante conocer la especificidad de los linfocitos Treg hacia los
antígenos que median estas dos enfermedades. Esto sería de gran importancia
para realizar estudios donde se coadministre Curcumina+antígeno y determinar
sus efectos protectores en los modelos de enfermedad estudiados, evaluando si
el tratamiento media la expansión de linfocitos Treg antígeno-específicos con
efectos antiinflamatorios.
121
● Es necesario determinar si la ruta de administración subcutánea del
tratamiento con la Curcumina evaluada en este trabajo hace la diferencia, ya que
comúnmente es usada por vía oral o intraperitoneal en la mayoría de los modelos
experimentales usados.
● Finalmente, en una última fase se encontrarían los estudios relativos a la
mejora de las propiedades fisicoquímicas de la formulación de Curcumina, para
que esta sea segura para realizar los estudios traslacionales para el uso de la
Curcumina como tratamiento preventivo o terapéutico contra la aterosclerosis y
la esclerosis múltiple en humanos u otras enfermedades de origen inflamatorio
crónico.
122
7. Anexo 1. Otros desarrollos del proceso
Publicaciones ● Tabares-Guevara, JH. Villa-Pulgarin, JA, Hernandez, JC. Aterosclerosis:
inmunopatogénesis y estrategias de inmunoterapia. Manuscrito en preparación.
● Duarte L, Altamirano-Lagos M, Tabares-Guevara J, Opazo M, Diaz M,
Navarrete R, Catalina Muza, Vallejos O, Riedel C, Susan Bueno, Alexis Kalergis
Gonzalez P. Asymptomatic herpes simplex virus type 1 infection causes an
earlier onset and more severe experimental autoimmune encephalomyelitis.
Manuscrito en revisión en Brain Behavior and Immunity 2020.
● Ospina-Quintero, L. Jaramillo, JC. Tabares-Guevara, JH. Ramirez-Pineda,
JR J. Reformulating small molecules for cardiovascular disease immune
intervention: low-dose combined Vitamin D/Dexamethasone promotes IL-10
production and atheroprotection in dyslipidemic mice. Frontiers in immunology
2020; 11:743.
● Gutierrez G, Giraldo-Davila D, Combariza MY, Holzgrabe U, Tabares
Guevara JH, Ramirez-Pineda JR, Acin S, Munoz DL, Montoya G, Balcazar N.
Serjanic Acid Improves Immunometabolic Markers in a Diet-Induced Obesity
Mouse Model. Molecules 2020;25.
● Caro-Gomez E, Sierra JA, Escobar JS, Alvarez-Quintero R, Naranjo M,
Medina S, Velasquez-Mejia EP, Tabares-Guevara JH, Jaramillo JC, Leon-Varela
YM, Munoz-Durango K, Ramirez-Pineda JR. Green Coffee Extract Improves
Cardiometabolic Parameters and Modulates Gut Microbiota in High-Fat-Diet-Fed
ApoE(-/-) Mice. Nutrients 2019;11.
● Tabares-Guevara JH, Lara-Guzman OJ, Londono-Londono JA, Sierra JA,
Leon-Varela YM, Alvarez-Quintero RM, Osorio EJ, Ramirez-Pineda JR. Natural
Biflavonoids Modulate Macrophage-Oxidized LDL Interaction In Vitro and
Promote Atheroprotection In Vivo. Frontiers in immunology 2017;8:923.
123
● Rincon-Arevalo H, Villa-Pulgarin J, Tabares-Guevara J, Rojas M, Vasquez
G, Ramirez-Pineda JR, Castano D, Yassin LM. Interleukin-10 production and T
cell-suppressive capacity in B cell subsets from atherosclerotic ApoE-/- mice.
Immunologic research 2017; 65:995-1008.
● Blanquiceth Y, Rodriguez-Perea AL, Tabares Guevara JH, Correa LA,
Sanchez MD, Ramirez-Pineda JR, Velilla PA. Increase of Frequency and
Modulation of Phenotype of Regulatory T Cells by Atorvastatin Is Associated with
Decreased Lung Inflammatory Cell Infiltration in a Murine Model of Acute Allergic
Asthma. Frontiers in immunology 2016; 7:620.
Ponencias en eventos científicos:
● VII Seminario Ciencias Básicas Biomédicas “La administración subcutánea
a bajas dosis de Curcumina reduce la progresión de la aterosclerosis en ratones
dislipidémicos.” Modalidad oral.
● VIII Seminario en Ciencias Básicas Biomédicas, 2016: “La Curcumina a
bajas dosis promueve células reguladoras y ateroprotección en ratones
dislipidémicos.” Modalidad Poster.
● Congreso Inmunocolombia; 11° Congress of the latin american association
of immunology- ALAI 10. Colombian congress of allergy asthma and immunology
ACAI, 2015. “Naturally-ocurring biflavonoids modulate macrophage response in
vitro and are atheroprotective in vivo”. Modalidad Poster.
124
INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA 1: EVALUACIÓN DEL EFECTO
NEUROPROTECTOR DE LA CURCUMINA EN RATONES IL-10gfp VertX
INDUCIDOS A DESARROLLAR EAE
El desarrollo de las manifestaciones clínicas en el modelo de EAE está ligado a
la respuesta inflamatoria. Como resultado de la inflamación en el sistema
nervioso central, se generan daños en el oligodendrocito y la desmielinización
de la mielina que conlleva a las manifestaciones clínicas de la enfermedad. Por
lo anterior y basados en los resultados presentados en el Capítulo II, evaluamos
el papel de la Curcumina en un modelo de ratones Vert-X (IL-10/GFP) inducidos
a desarrollar EAE.
Al igual que en los ratones WT (Capítulo II), el tratamiento con la Curcumina evita
la pérdida de peso, retrasa la aparición de la sintomatología clínica de EAE y
aumenta el porcentaje de animales sanos (Figura complementaria 1) en los
ratones Vert-X (IL-10/GFP).
Además, se evaluó el infiltrado inflamatorio en muestras de bazo, cerebro,
cordón lumbar, sangre y nódulos linfáticos sacrolumbares. Para el caso de
cerebro y cordón lumbar, se utilizó para la homogeneización del tejido
colagenasa IV. Mediante citometría de flujo se caracterizaron células mieloides
y linfoides usando los siguientes paneles de tinción: Panel mieloide: anti-Ly6C-
PE (clone AL-21), anti-MHC-II-BV605 (clone M5/114.15.2), anti-Ly6G-
PerCPCy5.5 (clone 1A8), anti-CD103-BV421 (clone M290), anti-CD64-AF647
(clone X54-5/7.1), anti-CD11b-APCCy7 (clone M1/70), anti-CD11c-PECy7 (clone
HL3), anti-CD45-BV786 (clone 30-F11), Singlec-F PECF594 (clone E50-2440)
Panel linfoide: anti-CD45-BV786 (clone 30-F11), anti-CD3-PerCPCy5.5 (clone
H57-597), anti-CD4-BUV496 (clone GK1.5), anti-CD8-APCCy7 (clone 53-6.7),
anti-CD19-PECy7 (clone 1D3) (todos los anticuerpos fueron de BD Biosciences).
Los datos fueron adquiridos en el citómetro LSR Fortessa X-20 (BD Biosciences)
y analizados en el software Flow Jo V7.0.
125
El análisis por citometría de flujo evidencia que el tratamiento con la Curcumina
lleva una disminución de diferentes poblaciones celulares, incluyendo linfocitos
T y B. Esta observación se da principalmente en NLsl y SNC (cerebro y cordón
lumbar). Como se observa en la figura complementaria 2A existe una reducción
significativa de leucocitos (CD45+) en el NLsl, así como de las subpoblaciones
de linfocitos T (CD4+, CD8+) y B (CD19+); esto fue observado en los días 7, 14 y
28 post inducción de EAE. En el caso del cerebro (figura complementaria 2B)
este efecto fue observado solo al día 28; además, se observó un leve aumento
de DC en el día 14. Al realizar la evaluación del infiltrado leucocitario en el cordón
lumbar (Figura complementaria 2C), encontramos una reducción significativa de
los leucocitos (CD45+) y de células CD3+, CD4+, CD8+ y CD19+, tanto en el día
7 como en el día 14 post inducción de EAE. En el bazo (figura complementaria
2D) se observó una modulación de las poblaciones de PNN, CD3+, CD4+ y CD8+
solo en el día 7, mientras que no se observaron cambios significativos en la
sangre (figura complementaria 2E). Estos resultados sugieren que el tratamiento
con la Curcumina reduce la inflamación en los NLsl y el SNC, lo que conlleva a
un retraso o no aparición de la sintomatología clínica. Estos animales fueron
utilizados con el fin de evaluar la expresión de IL-10 por diferentes poblaciones
celulares del sistema inmune; en la Tabla 1 complementaria se encuentra un
resumen de los hallazgos preliminares obtenidos, los cuales sugieren la
presencia de diferentes subpoblaciones celulares produciendo IL-10, en los
animales tratados con la Curcumina. Sin embargo, es necesario corroborar los
resultados obtenidos.
126
Tabla complementaria 1. Evaluación de la expresión de IL-10 en ratones IL-10gfp
VertX luego del tratamiento con Curcumina y la inducción de EAE.
El tratamiento con Curcumina aumenta ( ), disminuye ( ) o es similar (=) en la
expresión de IL-10 en la población celular indicada. ND= No determinado.
Población Órgano
Dia 7 Dia 14 Dia 28
Cerebro Médula NLsl Bazo Sangre Cerebro Médula NLsl Bazo Sangre Cerebro Médula NLsl Bazo Sangre
DC IL-10+ = = ND = ND =
ND = = ND
ND
CD4 IL-10+ = =
= = =
= ND
=
=
CD8 IL-10+ = =
= = =
= ND = =
= =
CD19 IL-10+ = =
= = =
= ND = =
=
127
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
-1
0
1
2
3
p
es
o (
gr)
Dia 7 Dia 14 Dia 28
Vehículo D7
Curcumina D7
Vehículo D14
Curcumina D 14
Vehículo D28
Curcumina D28
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
0
1
2
3
Pu
nta
je c
lin
ico
(
SE
M)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
0
20
40
60
80
100
Día post inmunización
An
imale
s s
an
os
(%
)
A
B
C
Figura complementaria 1. Evaluación del efecto neuroprotector de la Curcumina en ratones C57BL/6 Vert-X (IL-10/GFP). Ratones hembras C57BL/6 Vert-X de 7 a 10 semanas de edad fueron tratadas con Curcumina (o vehículo) en la almohadilla plantar y luego inducidos a desarrollar EAE, se realizaron eutanasias los días 7, 14 y 28 post inmunización. (A) Registro diario de la ganancia de peso. (B) Evaluación diaria del puntaje clínico. (C) Porcentaje de animales sanos. Los gráficos muestran la media±SEM.
128
129
Figura complementaria 2. Evaluación del infiltrado inflamatorio en ratones C57BL/6 Vert-X (IL-10/GFP) inducidos a desarrollar EAE tratados o no con Curcumina. El día de la eutanasia se analizó por citometría de flujo el infiltrado mieloide o linfoide en el bazo (A), cerebro (B), cordón lumbar (C), nódulos linfáticos sacro lumbar (NLsl) (D) y sangre (E) de ratones que fueron tratados con Vehículo o Curcumina en la almohadilla plantar (eutanasia 7, 14 y 28 días post inmunización). Los datos fueron analizados usando una prueba t student previa verificación de normalidad y son presentados como la media±SEM. * p<0.05; ** p<0.01.
130
INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA 2: EVALUACIÓN DEL EFECTO
TERAPÉUTICO NEUROPROTECTOR DE LA CURCUMINA EN RATONES
INDUCIDOS A DESARROLLAR EAE
En el capítulo II, evaluamos el efecto profiláctico de la administración s.c. de la
Curcumina, y encontramos que este tiene efectos neuroprotectores, ya que
disminuye la respuesta inflamatoria y la desmielinización del SNC. Por lo
anterior, se evaluó el potencial de la Curcumina como tratamiento terapéutico de
la EAE, es decir en ratones que ya habían sido inducidos a desarrollar EAE, a
diferencia de nuestro esquema anterior, en el cual iniciamos el tratamiento 7 días
antes de la inmunización para desarrollar EAE.
Para esto, se tomaron ratones hembra C57BL/6 WT de 7-10 semanas de edad
y se indujeron a desarrollar EAE. Siete días después de haber sido inmunizadas,
se inició el tratamiento día de por medio con Curcumina hasta finalizar el
experimento (día 22). Durante este tiempo se evaluó el peso y el score clínico de
parálisis.
En este caso, se evidenció que la Curcumina evita la pérdida de peso y retrasa
la aparición de la sintomatología clínica de EAE y aumenta el porcentaje de
animales sanos (Figura complementaria 3). Esta reducción puede deberse a una
reducción de la inflamación en el SNC, como lo observado en los experimentos
desarrollados en el capítulo II de esta tesis, y por ende tener un retraso en la
aparición de la sintomatología clínica de la enfermedad. Es necesario profundizar
acerca de los mecanismos que median neuroprotección bajo este esquema de
tratamiento, para entender si son los mismos encontrados con el tratamiento
profiláctico, ya que al ser un esquema de tratamiento diferente y más corto podría
estar potenciando mecanismos de regulación diferentes a los evaluados en esta
tesis. Este resultado es de gran valor, ya que nos brinda un primer acercamiento
de esta terapia en una patología inmune cuyo inicio y desenlace es bien
conocido, brinda nuevas oportunidades para su tratamiento.
131
p
es
o (
gr)
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
-1
1
3
Curcumina
Vehículo
Pu
nta
je c
lin
ico
(
SE
M)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
0
1
2
3
Dia post inmunización
An
imale
s s
an
os (
%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 220
20
40
60
80
100
* ** ** ** **** *
*
* *** ****** ****** ***
*** *** *** ***
A
B
C
Figura complementaria 3. Evaluación del efecto terapéutico de la Curcumina en ratones C57BL/6 inducidos a desarrollar EAE. Ratones hembras C57BL/6 de 7 a 10 semanas de edad fueron inducidas a desarrollar EAE, 7 días después de la inmunización fueron tratadas con Curcumina (o vehículo) en la almohadilla plantar día de por medio hasta el día 21, (A) Registro diario de la ganancia de peso. (B) Evaluación diaria del puntaje clínico. (C) Porcentaje de animales sanos. Los gráficos muestran la media±SEM. * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,0001.
132
INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA 3: EVALUACIÓN DEL EFECTO
TERAPÉUTICO DE LA CURCUMINA EN RATONES LÚPICOS.
Con los antecedentes de los efectos atero/neuroprotectores derivados de los
efectos antiinflamatorios del tratamiento subcutáneo con la Curcumina,
evaluamos en otro modelo murino de autoinmunidad sus posibles efectos
antiinflamatorios. El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad
autoinmune cuya manifestación principal es la glomerulonefritis mediada por
complejos inmunes, y los ratones MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/MpJ), presentan una
mutación en el gen Fas el cual está involucrado en la apoptosis celular, y genera
la proliferación de linfocitos autorreactivos1. Estos animales son considerados un
modelo de la enfermedad lúpica ocurrida en el humano, con linfadenopatías
asociadas a la proliferación aberrante de linfocitos T, esplenomegalia, e
hipergammaglobulinemia con anticuerpos anti-ADN que se depositan en
diversos órganos. El daño está asociado al depósito de complejos inmunes,
activación del sistema del complemento y el infiltrado inflamatorio en el órgano
afectado. Los tratamientos actuales para las enfermedades autoinmunes
sistémicas mejoran parcialmente la salud de los pacientes con baja eficacia
farmacológica e inmunosupresión sistémica. Basados en esto, durante la
pasantía se evaluó el potencial de la Curcumina sobre la sintomatología clínica
de LES en ratones MRL/MpJ.
Brevemente, se usaron ratones machos MRL/MpJ-Fas /J de 8 semanas de edad
(momento en cual inicia la sintomatología clínica), que fueron tratados con 10 µg
de Curcumina (o vehículo) s.c. en ambas almohadillas plantares tres veces por
semana durante 4 semanas. El día de la inyección se registró el puntaje clínico
basado en una escala previamente publicada (Tabla complementaria 2)2, el peso
y la proteinuria (con tirillas colorimétricas para uroanálisis, CentriVet sticks,
1 Keil A, Hall SR, Körner M, Herrmann M, Schmid RA, Frese S. Suppression of lupus nephritis and skin lesions
in MRL/lpr mice by administration of the topoisomerase I inhibitor irinotecan. Arthritis Res Ther. 2016 Oct 22;18(1):243. doi: 10.1186/s13075-016-1144-5. PMID: 27770825; PMCID: PMC5075215. 2 Funes SC, Ríos M, Gómez-Santander F, et al. Tolerogenic dendritic cell transfer ameliorates systemic lupus erythematosus in mice. Immunology. 2019;158(4):322-339. doi:10.1111/imm.13119.
133
ACON laboratories Inc., USA). Mediante el puntaje clínico se evaluó si el animal
presentaba alteraciones físicas (mucosas opacas, pelaje hirsuto) o conductuales
(ausencia de acicalamiento, aislamiento social, ausencia de interacción con su
enriquecimiento ambiental, desánimo o con problemas para su desplazamiento).
Si el animal presentaba un puntaje total de 14 o más en los parámetros
evaluados, este debería de ser sometido a eutanasia inmediatamente.
Encontramos que el tratamiento subcutáneo con la Curcumina estabiliza la
ganancia de peso de los animales (que aumenta con la inflamación generalizada)
y mejora significativamente la aparición de la sintomatología clínica de LES entre
los días 22 y 26, sin cambios aparentes en la proteinuria (Figura complementaria
4).
Logramos observar que el tratamiento con la Curcumina puede reducir la
severidad de la sintomatología clínica de LES; sin embargo, es necesario realizar
experimentos complementarios en este modelo para determinar si el mecanismo
que puede estar reduciendo la aparición de la sintomatología clínica en estos
animales es mediado también a través de una red inmunoreguladora. De esta
manera especulamos que el tratamiento subcutáneo con la Curcumina pudiera
ser evaluado en patologías de origen autoinmune.
Tabla complementaria 2. Parámetros evaluados en el puntaje clínico para el
modelo murino de lupus (Instituto Milenio Inmunología e Inmunoterapia,
laboratorio de inmunología molecular).
VARIABLES EVALUADAS
OBSERVACIONES PUNTUACIÓN PERIODISIDAD
CONDUCTA
a)
Interacción y Movilidad
Normal: Atento al medio, interactúa con sus pares, se acicala Pequeños cambios: reduce el
0
1
134
acicalamiento y el desplazamiento. Desplazamiento dificultoso, con pasos cortos, con actividad reducida; retraído al fondo de la jaula Animal inmóvil, postrado con posición cifótica.
2
3
3 veces por semana
ASPECTO
b) Piel
Piel normal, sin soluciones de continuidad Piel con 1 o dos lesiones pequeñas (< a 0,5 cm2) Piel con mayor a 2 lesiones pequeñas (< a 0,5 cm2) Piel con lesiones entre > 0,5 cm2, < 1,0 cm2
Piel con lesiones grandes (> 1,0 cm2)
0
1
2
3
4
3 veces por semana
c) Pelaje
Pelaje lustroso y
continuo.
Pelaje hirsuto
0
1
3 veces por semana
d) Alopecia Sin alopecia
Alopecia menor a 0,5 cm2
Alopecia entre 0,5 cm2 y 1,0 cm2
Alopecia mayor a 1,0
cm2
0
1
2
3
3 veces por
semana
135
PARÁMETROS FISIOLÓGICOS
e) Proteinuria
Tiras de
reactivad para uroanálisis
Nada
15 mg/dL
30 mg/dL
100 mg/dL
300 mg/dL
≥ 2000 mg/dL
0
1
2
3
4
5
3 veces por semana
f) Peso
Corporal
Normal (no hay pérdida de peso corporal) Pérdida de peso inferior al 10%, Pérdida de peso entre 10-20%. Posible disminución en la ingesta de alimento Pérdida de peso superior al 20%. * El animal no consume agua ni alimento
0
1
2
3
3 veces por semana
136
Perd
ida d
e p
eso
(%
)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
100
110
120
130
Vehículo
Curcumina
Pu
nta
je c
lín
ico
(m
ed
ian
a
IQ
R)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
0
2
4
6
* ** **
Día
Pro
tein
uri
a (
mg
/mL
)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
0
20
40
60
80
100
A
B
C
.
Figura complementaria 4. Evaluación del efecto terapéutico de la Curcumina en ratones lúpicos. Ratones machos MRL/MpJ de 8 semanas de edad fueron tratadas con Curcumina (o vehículo) en ambas almohadillas plantares tres veces por semana. (A) Registro diario de la ganancia de peso. (B) Los datos son presentados como la media±SEM o mediana±IQR y fueron analizados usando la prueba t student o U Mann Whitney, previa verificación de normalidad de los datos, para establecer la significancia estadística de las diferencias entre los grupos.
137
8. Agradecimientos
Minciencias por el apoyo económico, mediante la beca 617-2014.
Al Grupo de Inmunomodulación y a su director, por recibirme en su laboratorio y
permitirme realizar este proyecto de investigación.
A los miembros de mi comité tutorial la Dra. Paula Andrea Correa Vanegas y el
Dr. Carlos Julio Montoya por sus aportes durante todo el desarrollo del trabajo,
los cuales ayudaron a consolidar los resultados, y en especial al Dr. Juan Carlos
Hernández, por ser el codirector de este trabajo para realizar la entrega final del
manuscrito y sustentación, por ser un ejemplo del quehacer científico, por
enseñarme a través de su experiencia que esto no es una profesión sino un estilo
de vida. Por recibirme bajo su responsabilidad y en su laboratorio, y permitirme
colaborar en sus proyectos de investigación.
A la Corporación Académica Ciencias Básicas Biomédicas por la formación
brindada a todos sus estudiantes y el apoyo para resolver nuestras dificultades,
en especial a la Dr Eliana Restrepo por su asesoría durante el proceso final.
A los integrantes del GIM y a los que pasaron: Diana María, Julio, Naty, Christian,
EriKa, María, Natalia M, Lara, Lina, Alex, Jelver, Julián, Carmencita, Kathy,
Neifer, Camilo, Leidy Laura, Morales, Claudia, por el apoyo constante.
A los integrantes del Grupo de Inmunología Molecular del Dr Alexis Kalergis,
donde realice mi pasantía internacional: Maria Jose, Camila, Mariana, Tomas,
Jorge, Karen, Nicolas, Orlando, Magda, Trinidad, Lorena, Ayleen, en especial a
Angello y Luisa por su colaboración y discusión durante el desarrollo de los
experimentos.
138
Principalmente a mi familia y desde el fondo de mi corazón quiero expresarles
todo mi amor, por mi formación como persona y que gracias a sus incalculables
esfuerzos he podido alcanzar los objetivos propuestos en mi vida.
A mi hermano Tavo que esté en la gloria, que lo llevo en mi corazón y pienso en
él todos los días de mi vida, que su empuje y tenacidad fueron mi ejemplo para
nunca rendirme.
A mi padre Gustavo Tabares por ser un ejemplo durante toda mi vida, a mi madre
Gilma por sus incalculables oraciones y ayuda.
A mi hermana Diana por su apoyo, por ser una mujer determinada y ejemplo de
honestidad, entrega y responsabilidad.
A mis amigos Janny, Juank, Harold, Deyvin, Victor, Jairo, Chava, Miguel, Mario,
Billy, por brindarme su compañía y ánimo sarcástico en todos los momentos
difíciles.
Y a todas las personas que de una u otra manera han hecho parte de mi formación como profesional, pero sobre todo como persona.
139
9. Referencias
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