EVALUACIÓN EN 3 MICROAMBIENTES DIFERENTES DE LA ...
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1 EVALUACIÓN EN 3 MICROAMBIENTES DIFERENTES DE LA TERMORRESISTENCIA DE UNA CEPA DE Salmonella spp AISLADA DE COMPOST GERMAN ANDRES BAUTISTA BALLEN TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar el título de Microbiólogo Industrial PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTA D.C Febrero de 2009
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EVALUACIÓN EN 3 MICROAMBIENTES DIFERENTES DE LA
TERMORRESISTENCIA DE UNA CEPA DE Salmonella spp AISLADA DE
COMPOST
GERMAN ANDRES BAUTISTA BALLEN
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar el título de
Microbiólogo Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTA D.C
Febrero de 2009
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Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de
buscar la verdad y la justicia”.
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EVALUACIÓN EN 3 MICROAMBIENTES DIFERENTES DE LA
TERMORRESISTENCIA DE UNA CEPA DE Salmonella spp AISLADA DE
COMPOST
GERMÁN ANDRÉS BAUTISTA BALLEN
APROBADO
Dra. Ana Karina Carrascal M.Sc Dra. Maria Mercedes Martínez M.Sc Director Asesor Dra. Ivonne Gutiérrez Rojas M.Sc Dra. Adriana Matíz Villamil M.Sc Jurado Jurado
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EVALUACIÓN EN 3 MICROAMBIENTES DIFERENTES DE LA
TERMORRESISTENCIA DE UNA CEPA DE Salmonella spp AISLADA DE
COMPOST
GERMÁN ANDRÉS BAUTISTA BALLEN
APROBADO
Dra. Ingrid Schuler PhD. Dra. Janeth Arias Palacios M.Sc – M.Ed Decana Académica Directora de Carrera
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A mis padres y hermanos, el motor de mi vida. A quien A mis padres y hermanos, el motor de mi vida. A quien A mis padres y hermanos, el motor de mi vida. A quien A mis padres y hermanos, el motor de mi vida. A quien
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sus cuidados durante todo este tiempo. sus cuidados durante todo este tiempo. sus cuidados durante todo este tiempo. sus cuidados durante todo este tiempo.
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Agradecimientos
A la Dra. Ana Karina Carrascal, Directora del Laboratorio de Microbiología
de Alimentos, por depositar infinita confianza en mí y brindarme todas las
herramientas necesarias para el desarrollo de este proyecto y el
crecimiento personal.
A la Dra. Maria Mercedes Martínez, Directora del Laboratorio de
Microbiología Ambiental y de Suelos, por ofrecerme sus conocimientos y
apoyo a nivel profesional.
A Sonia por sus consejos y colaboración en la realización de este trabajo.
A las personas que hacen parte del Laboratorio de Microbiología
Ambiental y de Suelos, por su invaluable contribución.
A Nata por su compañía y apoyo en todo momento.
A la Pontificia Universidad Javeriana y al Proyecto FIUC por la financiación
de este proyecto.
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TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN 10 INTRODUCCIÓN 11 1. MARCO TEÓRICO 13 1.1 ABONOS ORGÁNICOS 13 1.1.1 Compost 13 1.2 Microorganismos patógenos en los bioinsumos 15 1.3 Salmonella spp. 18 1.3.1 Características bioquímicas 19 1.3.2 Serotipificación 19 1.3.3 Efecto de la temperatura 20 1.4 Brotes de Salmonella spp. asociados al consumo de alimentos 21
2. JUSTIFICACION 24 3. OBJETIVOS 25 3.1 Objetivo general 25 3.2. Objetivos específicos 25 4. METODOLOGÍA 26 4.1 Microorganismos de estudio 26 4.1.1 Banco de cepas primario 26 4.1.2 Caracterización de la cepa 27 4.2 Curvas de crecimiento 27 4.3 Microcosmos 28 4.3.1 Preparación de los inóculos 28 4.3.2 Montaje del microcosmos 29 4.3.3 Análisis y seguimiento del microcosmos 29 4.4 Curvas de muerte térmica 30 4.4.1 Preparación del inóculo 30 4.4.2 Montaje curvas de muerte térmica 31 4.4.2.1 Curvas muerte térmica en caldo compost 3 2 4.4.3 Valor D 32 5. RESULTADOS 34 5.1 Microorganismos de estudio 34
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5.1.1 Aislamiento de la cepa 34 5.1.2 Caracterización de la cepa 34 5.2 Banco de cepas primario 36 5.3 Elaboración de curvas de crecimiento 36 5.4 Microcosmos 37 5.5 Curvas de muerte térmica 37 5.5.1 Valor D 42 6. DISCUSION DE RESULTADOS 44 6.1 Microorganismos de estudio 44 6.2 Elaboración de curvas de crecimiento 44 6.3 Microcosmos 45 6.4 Curvas de muerte térmica 47 6.4.1 Curva de muerte térmica en caldo BHI a pH 5.5 51 6.4.2 Curvas de muerte térmica en caldo compost 52 6.5 Valor D 53 7. CONCLUSIONES 55 8. RECOMENDACIONES 56 9. REFERENCIAS 57 10. ANEXOS 70 ANEXO 1. Preparación del caldo compost 70
ANEXO 2. Resultados Número Más Probable de Salmonella spp. 71
según el Método de la EPA Nº 1682/2006
ANEXO 3. Recuentos curvas de muerte térmica 75
ANEXO 4. Recuentos y absorbancias de las curvas de crecimiento 79
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ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Temperatura necesaria para la eliminación de algunos 17
patógenos en compost.
Tabla 2. Composición de los tratamientos para el microcosmos 29
Tabla 3. Resultados de la identificación bioquímica, serológica y 34
microscópica de la cepa aislada.
Tabla 4. Caracterización de la cepa mediante Kit de bioquímicas 35
Tabla 5. Caracterización serológica de la cepa 36
Tabla 6. Valor D para cada tratamiento con Salmonella spp. 43
Tabla 7. Valor D para S. enteritidis 43
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Distribución estimada anual de los costos (dólares) 22
de Salmonelosis en EEUU.
Figura 2. Montaje del inóculo para curvas de crecimiento 28
Figura 3. Montaje final del microcosmos 30
Figura 4. 4a. Montaje curvas de muerte térmica 31
4b. Control de Tº mediante termocupla
Figura 5. Cepa aislada de Salmonella spp 35
Figura 6. Bioquímicas Salmonella spp 35
Figura 7. Curva de crecimiento por absorbancia Salmonella spp. 38
y S. enteritidis
Figura 8. Curva de crecimiento por recuento en placa de 39
Salmonella spp. y S. enteritidis
Figura 9. Comportamiento de Salmonella spp respecto al pH en 39
el microcosmos
Figura 10. Microcosmos control 40
Figura 11. Curvas muerte térmica a 50, 60 y 70ºC en caldo BHI a pH 7,0 40
Figura 12. Curva muerte térmica a 80ºC en caldo BHI a diferente pH 41
Figura 13. Curva de muerte térmica a 80ºC en caldo compost 41
Figura 14. Curva muerte térmica S. enteritidis a 70ºC en caldo BHI (pH 7.0) 42
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RESUMEN
El uso de bioinsumos agrícolas en la última década ha generado brotes por el
consumo de alimentos contaminados con patógenos, de ahí la importancia de
evaluar la termorresistencia de patógenos. El objetivo de este trabajo fue determinar
la temperatura óptima de muerte para una cepa de Salmonella spp aislada de pilas
de compost empleando microambientes diferentes a escala de laboratorio. Para ello
se recreó un microambiente a base de compost inoculado artificialmente con 10 y
100 células/g de Salmonella spp previamente aislada de residuos domiciliarios y
llevado a incubación durante nueve semanas a 70ºC, semanalmente se evaluó el
pH y la presencia de Salmonella spp mediante el método EPA 1682/2006, hasta la
tercera semana se tuvo la presencia del patógeno, concordando con la disminución
del pH. Por otro lado, se realizaron curvas de muerte térmica para éste
microorganismo en diferentes medios: caldo BHI (pH 7.0) a temperatura de 50, 60,
70 y 80ºC; caldo BHI (pH 5.5) a 80ºC; caldo compost filtrado y sin filtrar a 80ºC.
Igualmente se llevó a cabo un ensayo control en caldo BHI (pH 7.0) con S.
enteritidis a 70ºC. En cada ensayo se halló el valor DL y DT (Lineal – Tails “colas”)
debido a la injuria bacteriana sufrida por la cepa, determinándose un valor DL de
40.2 min en caldo BHI a pH 7.0; de 17.7 min en caldo BHI a pH 5.5 y de 31.8 min en
caldo compost filtrado, sugiriendo una posible sensibilidad de la cepa a los ácidos
inorgánicos y la necesidad de sustratos de fácil degradación para recuperarse de la
injuria bacteriana. Los datos obtenidos demuestran que es necesario llegar a
temperaturas altas para garantizar la calidad del compost.
Palabras clave: compost, injuria bacteriana, Salmonella spp., termorresistencia, y
valor D.
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INTRODUCCION
El compostaje es uno de los procesos más utilizados hoy en día a nivel
agroindustrial para el manejo de residuos sólidos. Sin embargo, son varias las
materias biodegradables sometidas a este tratamiento y dependiendo de su
procedencia, pueden determinar el tipo y la cantidad de microorganismos que se
desarrollen durante el proceso.
Al emplear materias como estiércol de animales se está agregando una carga
microbiana elevada de patógenos proveniente del tracto intestinal de estos, así
mismo sucede al emplear lodos residuales y desechos domésticos. La gran mayoría
de los microorganismos presentes en estas materias son catalogados como
patógenos y muchos de ellos sobreviven al tratamiento térmico que se da durante el
proceso de compostaje, encontrándose al final de este un elevado número de
microorganismos viables de alto riesgo para la salud y causantes de brotes de difícil
control.
El abono orgánico producto del compostaje es generalmente empleado en
agricultura en el cultivo de hortalizas para consumo humano, significando un riesgo
debido a la contaminación cruzada que se presenta del suelo a la planta y sobretodo
en plantas que se desarrollan a nivel de suelo y que presentan pliegues en su
estructura, generando así un medio que alberga gran cantidad de patógenos.
Por tal razón, es de imperiosa necesidad identificar estos microorganismos
patógenos y establecer metodologías tendientes a disminuir o eliminar la totalidad
de esta población microbiana presente al final del proceso de compostaje, siendo el
tratamiento térmico uno de los más antiguos, sencillos y eficaces para la
disminución o eliminación de la carga microbiana patógena presente en este
material.
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Del mismo modo la identificación de un microorganismo con características
especiales de adaptación en ambientes hostiles concede importancia al estudio de
los métodos empleados para contrarrestar la inclemencia del medio en donde se
desarrolla y la posibilidad de exhibir estas cualidades en otros ambientes, bajo otras
circunstancias o incluso representarlas a nivel de laboratorio.
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1. MARCO TEORICO
1.1 Abonos orgánicos Un abono orgánico se define como un recurso o producto biológico, que al ser
aplicado al suelo activa principalmente los procesos microbiales, fomentando
simultáneamente su estructura, aireación y capacidad de retención de humedad y
aportando pequeñas cantidades de nutrientes. Incluye subproductos animales,
estiércoles, residuos vegetales y lombricompuestos (ICA, 1995).
Los procesos para la obtención de productos orgánicos se basan en la degradación
de la materia orgánica, los cuales la transforman en una mezcla homogénea de gran
valor agronómico. Su calidad depende de la estabilización de los residuos orgánicos
utilizados para su elaboración, mediante procesos como el compostaje, la
lombricultura o camas de secado (Zaleski et al., 2005).
1.1.1 Compost Este proceso consiste en la descomposición de la materia orgánica en un ambiente
controlado mediante la acción de microorganismos, los cuales sintetizan enzimas,
vitaminas, hormonas, antibióticos y otros compuestos que repercuten
favorablemente en el equilibrio biótico del suelo y en el desarrollo vegetal (Augusti,
1995).
El éxito que ha tenido el proceso de compostaje radica principalmente en combinar
los conocimientos científicos con los tradicionales, donde la gran cantidad de
materiales de desecho y residuos orgánicos que se producen en la naturaleza son
aprovechados (Alfaro et al., 2001).
El proceso de compostaje depende de factores tanto físicos como químicos y
biológicos, dentro de los cuales se encuentran la humedad y el oxígeno cuyos
niveles deben estar también controlados para reducir el potencial en la producción
de olores. La temperatura es un parámetro clave en el proceso debido a que si se
alcanzan los niveles necesarios es posible la destrucción de la mayoría de los
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patógenos. Del mismo modo el tamaño de las partículas a compostar, el diseño de
la pila y el tamaño de ésta afectan la velocidad de aireación, y la tendencia del
compost a retener o desperdiciar el calor que es generado (Chen et al., 2000).
El compostaje hecho a partir de residuos animales y desechos orgánicos
biodegradables puede ser usado, dependiendo de su grado de madurez y calidad,
en procesos agrícolas como la horticultura o para la rehabilitación de minas y
suelos. Dentro de las materias primas utilizadas para compostaje se encuentran
residuos de jardinería, lodos industriales, desechos sólidos municipales y de
ganadería entre otros (Déportes et al., 1995). El compost no es un producto
peligroso, sin embargo puede contener un número elevado de contaminantes que
ponen en riesgo la salud pública y el medioambiente (Gong, 2007).
Al emplear desechos animales como el estiércol en pilas de compost, varias clases
de bacterias patógenas como coliformes y Salmonella pueden existir y perdurar en
esta materia (Déportes et al., 1995). En estiércol de vaca, lodos residuales y
residuos de comida el número de coliformes presentes es de 105 -109 UFC/g (Pera
et al., 1991). Estos valores pueden ser críticos si se tiene en cuenta que los cultivos
orgánicos, en su mayoría hortalizas, son tratados con material de compost o abonos
orgánicos a base de estiércol animal. Aunque se considera que la mayoría de
microorganismos patógenos mueren por el calor generado durante la fermentación
de la pila, muchos de ellos se han encontrado al final del proceso de compostaje.
Esto se debe a que las temperaturas al interior y exterior de la pila de compost no
son uniformes, siendo la temperatura externa más baja que la interna. Mientras que
en el interior en fase termófila la temperatura oscila los 65-75 ºC en el exterior
puede continuar en 30-40 ºC. De esta forma es posible que microorganismos
patógenos logren sobrevivir durante el proceso del compostaje (Gong, 2007).
Uno de los factores más relevantes en el proceso de compostaje es la temperatura,
la cual influye en la proliferación y sobrevivencia de las bacterias y hongos, que son
fundamentales en la descomposición de la materia orgánica y en la eliminación de
microorganismos patógenos. Esta descomposición inicial es realizada por
microorganismos mesófilos, cuya temperatura óptima es de 15 a 45ºC, y conlleva al
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aumento de la temperatura hasta los 40ºC, lo que provoca que los microorganismos
termófilos sean más competentes y se incremente la temperatura hasta los 70ºC
(Pinto, 2001).
Las elevadas temperaturas alcanzadas en la fase termofílica del proceso de
compostaje representan un factor fundamental a la hora de producir abonos
orgánicos libres de patógenos, debido a que los microorganismos patógenos son
eliminados cuando la pila de compost ha sido correctamente construida y se ha
logrado llegar una temperatura por encima de los 60ºC (LeaMaster et al., 1998).
Por otra parte, aunque la mayoría de patógenos son destruidos rápidamente cuando
la pila de compost alcanza una temperatura uniforme de 55ºC, unos pocos logran
sobrevivir y se hace necesario lograr temperaturas superiores a los 67ºC para
garantizar la ausencia de quistes de protozoos, huevos de helmintos, cepas de
Clostridium perfringens y C. botulinum (Jones & Martin, 2003). Además, se ha
reportado la capacidad de ciertas cepas de Salmonella spp. para crecer y
desarrollarse a temperaturas cercanas a los 68ºC (Droffner y Brinton, 1995).
1.2 Microorganismos patógenos en los bioinsumos Un gran número de virus patógenos, bacterias, protozoos y parásitos se encuentran
en los materiales de desecho destinados al proceso de compostaje. Son varios los
microorganismos presentes en estos materiales que son un riesgo de infección tanto
para humanos como para animales (Jones y Martin, 2003). Este tipo de
contaminación ha llamado la atención de las entidades reguladoras de la calidad
debido a la creciente popularidad de los métodos de agricultura orgánica y a la
elevada demanda de bioabonos frente a los fertilizantes químicos. El uso agrícola o
doméstico de este compost puede incrementar el riesgo de transmisión de
enfermedades por contacto de humanos o animales con el material del compost o
por contaminación de los cultivos de alimentos (Jones y Martin, 2003; Strauch y
Ballarini, 1994).
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Los desperdicios animales en forma de estiércol son unos de los más aplicados en
la agricultura debido a que es un método económico y ambientalmente sostenible
para el tratamiento del suelo, ya que posee un valor benéfico como fertilizante
fuente de nitrógeno, fosfato y potasio que puede ayudar a mantener la calidad del
suelo. Sin embargo, el estiércol animal frecuentemente contiene microorganismos
patógenos que ingresan en la cadena alimentaria. Por tal motivo, es indispensable
controlar el nivel de patógenos con el fin de evitar la contaminación del suelo,
aguas, cosechas, animales y el hombre (Islam et al., 2004).
Existe un gran número de bacterias capaces de desarrollarse en los materiales
usados para el compostaje y más aún capaces de sobrevivir todo el proceso y
hallarse al final de este. Bacterias como Salmonella, Campylobacter, Escherichia
coli, Listeria, Pasteurella, Staphylococcus aureus, Leptospira, Serpulina
hyodysenteriae, Mycobacterium bovis, Mycobacterium paratuberculosis, Clostridium
prefringens, Clostridium tetani entre otros (Jones y Martin, 2003). La gran mayoría
de estos microorganismos no sobreviven el proceso de compostaje, sin embargo
algunos como Listeria, Mycobacterium y los esporoformadores pueden ser más
resistentes y encontrarse al final del proceso (tabla 1). No obstante, el número
encontrado de estos microorganismos al final del compostaje no representa riesgo
alguno (Jones, 1982; Pell, 1997; Jones y Martin, 2003). Según Jones y Martin
(2003) la mayoría de patógenos son eficientemente removidos durante el proceso
de compostaje siempre y cuando la temperatura alcance los 55 °C y se mantenga
durante 3 días como mínimo.
Sin embargo, son bastantes los casos reportados de brotes asociados con bacterias
por el consumo de frutas, verduras y hortalizas provenientes de lugares en donde se
fertiliza la tierra con estiércol y con desechos de plantas de tratamiento. Este es uno
de los factores que contribuye a las infecciones humanas de tipo entérico, pues los
abonos orgánicos de baja calidad, usados en cultivos de vegetales frescos de
consumo directo especialmente en lechugas y zanahorias, son a base de estiércol
animal (Pell, 1997).
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Tabla 1. Temperatura necesaria para la eliminación de algunos patógenos en
compost (Arnedo et al., 2002).
Organismo Temperatura y tiempo de exposición
Salmonella spp. Se destruye al exponerse 1 hora a 55ºC o
15-20 min a 60ºC.
Escherichia coli Muere al exponerse durante 1 hora a 55ºC o
de 15-20 min a 60ºC
Brucella abortus Se elimina con exposiciones a 62-63ºC
durante 3 min y 1 hora a 55ºC
Mycobacterium tuberculosis Muere a los 66ºC dentro de 15 min o
después de calentamiento momentáneo a
67ºC
Huevos de Ascaris lumbricoides Mueren en menos de 1 hora a temperaturas
superiores a 55ºC
Los desechos animales aplicados en los abonos orgánicos contribuyen con un
aporte significativo de nutrientes esenciales como nitrógeno, fosfato y potasio,
además de incluir microorganismos que ayudan a la estabilización y mantenimiento
de los bioabonos. Si los bioabonos no son sometidos a procesos eficientes de
compostaje, pueden llegar a convertirse en un vehículo transmisor de
microorganismos patógenos que puede incurrir en brotes de carácter entérico
(Chang & Fang, 2007).
Acorde con Islam et al., (2004), la contaminación de hortalizas frescas con
Escherichia coli O157H:7. y Salmonella spp. ocurre más fácilmente en granjas
donde se manejan aguas para riego y abonos contaminados. Además,
microorganismos como Escherichia coli O157H:7, Salmonella typhimurium y L.
monocytogenes, se pueden encontrar en una amplia variedad de carnes crudas, así
como en vegetales frescos de consumo directo como la lechuga y el brócoli.
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Ahora bien, los humanos pueden entrar en contacto con los patógenos presentes en
los bioinsumos ya sea por contacto directo o indirecto con agua o comida
previamente contaminada. El contacto directo se puede dar mediante manipulación
del material orgánico, por caminar sobre el área donde se aplica, por manipular el
suelo donde se aplica o por inhalación de los microorganismos presentes en el aire.
El contacto indirecto se puede dar por el consumo de las cosechas contaminadas,
por ingestión de agua contaminada, por contacto con el bioinsumo o con patógenos
transportados por vectores como roedores, insectos e incluso mascotas (Gutiérrez &
Martínez 1999).
1.3 Salmonella spp. El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Estos
microorganismos se hallan distribuidos ampliamente en la naturaleza que abarcan
un amplio rango de huéspedes que van desde animales (reptiles, aves, insectos)
hasta humanos, y en los cuales produce un amplio espectro de enfermedades
(Parra et al, 2002).
Se caracteriza por ser un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo, móvil no
formador de esporas y con flagelo perítrico. Los desinfectantes comunes como
clorados, iodados y fenoles son eficaces frente a Salmonella spp (Mejía, 2003). Al
ser un Gram negativo se caracteriza por tener la típica pared celular estratiforme
rica en lípidos. La capa externa contiene lipopolisacárido (LPS) responsable de la
mayoría de las propiedades tóxicas y biológicas de este microorganismos. Unido al
lipopolisacárido se encuentran las complejas cadenas de oligosacáridos que
determinan especificidad antigénica en las cepas. El peptidoglucano forma una capa
definida en la pared celular entre el lipopolisacárido y la membrana citoplasmática.
Salmonella spp posee además un 10% de lipoproteínas encargadas de la
asociación LPS – peptidoglucano (Hirsh, 1999).
El rango de temperatura para el crecimiento de Salmonella esta entre 5.5 y 45 °C y
la máxima temperatura en la cual puede desarrollarse, así como empezar a morir,
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depende de la cepa de Salmonella presente y la fase de crecimiento en la que se
encuentre, la composición del medio y otros factores como los microorganismos
presentes (Doyle y Mazzotta, 2000).
El género de Salmonella mas conocido y estudiado es sin duda alguna Salmonella
typhi, causante de la fiebre tifoidea, pero en los últimos años han adquirido gran
notoriedad otros géneros como Salmonella dublin, Salmonella enteritidis y
Salmonella spp por ser patógenos causantes de brotes y muertes en humanos (Pell,
1997).
1.3.1 Características bioquímicas
Las características bioquímicas más relevantes y claves en el proceso de
identificación de Salmonella spp son: catalasa (positivo) y oxidasa (negativo), la
fermentación de la glucosa y otros carbohidratos, con la producción de gas, la
producción de ácido sulfhídrico, la lisina-descarboxilasa, la capacidad de
crecimiento en agar citrato de Simmons, la no producción de indol, la incapacidad
de hidrólisis de la urea, la resistencia al verde malaquita, tetrationato, desoxicolato y
selenito (ICMSF, 1996).
1.3.2 Serotipificación
La identificación serológica, se basa en la detección de antígenos específicos de
esta bacteria, como el antígeno somático “O”, flagelar “H” y el de virulencia Vi. El
antígeno somático “O” es un complejo termoestable de lipopolisacárido que se
encuentra en todos los microorganismos Gram negativos y está localizado en su
memebrana externa. La cadena de polisacáridos de este antígeno es un polímero
de unidades repetidas de oligosacáridos, de 3 a 5 azúcares, lineales o ramificados.
La naturaleza de los grupos terminales y el orden en que se encuentran las
unidades repetidas de la cadena determina la especificidad antigénica somática de
cada bacteria. Estos antígenos son resistentes a los ácidos diluidos y a los
alcoholes (Caffer et al., 2001).
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La definición del serotipo se realiza mediante la descripción de sus antígenos de
pared y flagelares. Esta se basa en la mezcla del organismo, que hace el papel de
antígeno, con el suero inmune (anticuerpo). Si el suero posee aglutininas frente al
antígeno, se presenta una aglutinación (Schneider, 2001).
1.3.3 Efectos de la temperatura
La resistencia térmica de Salmonella ha sido ampliamente estudiada sobre diversos
sustratos y ambientes, tanto a nivel ambiental como de alimentos, a fin de
establecer la temperatura necesaria para la destrucción de éste patógeno. A nivel
medioambiental se ha buscado mejorar la forma de erradicar éste microorganismo
de los productos agrícolas debido al impacto que causa en los ya mencionados
cultivos, aguas de riego y humanos.
El control de la temperatura durante los diversos procesos agrícolas, como la
elaboración de bioabonos, ha resultado ser una metodología eficiente para el control
de patógenos, sin embargo, se ha sugerido la combinación de diversos factores
como el contenido de humedad, la concentración de amonio y la presencia de otros
microorganismos, como complemento eficaz para el tratamiento térmico, así como
lo describe Knoll (1961) en algunos experimentos, donde varias cepas de
Salmonella spp. fueron sometidas a diferentes temperaturas de compostaje,
encontrando que al exponer por 14 días a temperatura de 55 – 60ºC, el producto
final era negativo para Salmonella spp.
Sin embargo, Droffner & Brinton (1995) reportaron la sobrevivencia de Salmonella
spp. y Escherichia coli en compost industrial durante 59 días a 60ºC, al igual que
Gibbs et al., (1998), quienes encontraron Salmonella spp. en muestras de compost
luego de realizar el proceso de compostaje alcanzando temperaturas de 53ºC,
demostrando la resistencia de ésta cepa al tratamiento térmico en bioinsumos y su
persistencia en toda la línea de producción agrícola.
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Por otra parte, Salmonella spp. no se caracteriza por ser una bacteria que presente
elevada termorresistencia en comparación con otras cepas como S. senftenberg o
S. typhimurium (Doyle & Mazzotta, 2000). No obstante, estudios de resistencia
térmica bacteriana en alimentos y medios de cultivo han demostrado que
Salmonella spp. es capaz de generar factores de termorresistencia como proteínas
de membrana alternas que le confieren una mayor protección al calor (Humpheson
et al., 1998).
1.4 Brotes de Salmonella spp. asociados al consumo de alimentos
Las bacterias del género Salmonella continúan siendo un problema mayor en lo que
a salud pública respecta y al riesgo que representa en la industria alimentaria,
debido a que son una de las bacterias más importantes que pueden provocar
enfermedades en el hombre por ingestión de alimentos contaminados. Ha sido
aislada de una amplia variedad de alimentos y de materias primas para la
fabricación de estos. Varios procesos térmicos aplicados en la industria durante la
fabricación de alimentos suelen ser efectivos para la destrucción de este
microorganismo, sin embargo, el tratamiento con calor ha dejado de ser altamente
efectivo y debe combinarse con otro factor como lo es la variación en los valores de
pH (Leguérinel et al., 2007). Esta resistencia a los tratamientos térmicos resulta en
gran medida de cambios en la formulación o características del alimento en el que
se encuentre y alteraciones en los sólidos totales, acidez y actividad del agua (aw)
(Doyle y Mazzotta, 2000).
Los casos de brotes por Salmonella en frutas y vegetales crudos, se deben
probablemente a la contaminación del alimento en el campo, por el uso de abonos
orgánicos o durante la etapa de riego. La temperatura juega un papel fundamental
en le desarrollo de este patógeno y en su virulencia. La temperatura incorrecta en el
almacenamiento de los alimentos, así como las condiciones favorables para el
crecimiento en la superficie de frutas y verduras, han sido probablemente los
factores que han contribuido con el desarrollo de brotes de salmonelosis (Harris et
al., 2003).
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Los brotes producidos por Salmonella spp. anualmente reportan en países
industrializados y en vías de desarrollo una gran cantidad de pérdidas no solo de
vidas sino también a nivel monetario, sólo en EEUU y Canadá las pérdidas
ascienden a $3.4 billones de dólares (Figura 1).
Figura 1. Distribución estimada anual de los costos (dólares) de Salmonelosis en EEUU. Fuente: USDA, 2007 <en línea>
Son varios los brotes de salmonelosis reportados en una amplia variedad de
alimentos como tomates crudos (Hedberg et al., 1999; Klerks, 2007; Zhuang et al.,
1995), lechuga, melones, espinaca y varias clases de ensaladas preparadas con
estos alimentos (Sivapalasingam et al., 2004), así como también en tejidos internos
de frutas como melón y sandía (Golden et al., 1993). Esto se debe principalmente a
que recientemente se ha incrementado la demanda de alimentos orgánicos así
como de frutas y vegetales frescos, permitiendo la expansión de este mercado y la
oferta de grandes cantidades de alimentos crudos (Francis et al., 1999;
Sivapalasingam et al., 2004; Thunber et al., 2002).
Según Pell (1997), Salmonella spp ha sido en un 45% el microorganismo
responsable de enfermedades y brotes asociados al consumo de alimentos como
23
huevos, pescados, ensaladas y chocolates en donde el agente causante ha sido
identificado. El costo a nivel económico de la salmonelosis ha sido estimado en un
valor cercano al billón de dólares por año, debido al tratamiento de la sintomatología
caracterizada por nausea, calambres, diarrea, y en cerca del 2% de los casos se
presenta artritis (Pell, 1997).
Parra y colaboradores (2002) reportan que a nivel mundial Salmonella spp es un
microorganismo asociado con frecuencia a las enfermedades diarreicas, las cuales
continúan siendo una de las causas más importantes de morbilidad y mortalidad
sobre todo en lactantes, niños y ancianos, además de que las infecciones agudas
del tracto gastrointestinal están consideradas como una de las enfermedades más
frecuentes en Colombia.
24
2. JUSTIFICACIÓN Las implicaciones a nivel de salud pública y medio ambiente que conlleva el
entregar un bioinsumo contaminado con algún patógeno, en este caso el compost,
para su uso en procesos agrícolas es enorme si se tiene en cuenta que se emplea
para la fabricación de productos mínimamente procesados, cuya demanda se ha
incrementado en la última década (Francis et al., 1999). Además, no solo los
cultivos se ven perjudicados por la presencia de algún patógeno contaminante,
también las aguas de riego se ven afectados debido a que los microorganismos se
movilizan a través de ésta hacia otros cultivos y abastecimientos de agua (potable o
de riego) aledaños al cultivo.
De esta forma, la importancia de realizar un estudio acerca de la temperatura óptima
para eliminar un patógeno como Salmonella spp, radica en que se podrán aplicar
estos avances en la mejora de los procesos de compostaje, hallando los valores
térmicos necesarios para la destrucción de patógenos resistentes a las
temperaturas máximas alcanzadas normalmente durante este proceso.
Al determinar la temperatura en la que se destruye la mayoría de la población
bacteriana de las cepas de Salmonella spp presentes en el compost, se pueden
plantear nuevas metodologías tendientes a optimizar la temperatura alcanzada
durante cada una de las fases del compostaje, especialmente la termófila, en donde
la mayoría de patógenos suelen ser eliminados, permitiendo de esta manera la
obtención de un compost limpio libre de contaminantes y apto para el uso en
diferentes áreas sin representar ningún riesgo para la salud pública o el medio
ambiente.
Asimismo, la identificación de una cepa de Salmonella spp resistente a un elevado y
prolongado tratamiento térmico creará nuevas perspectivas en cuanto a la
incidencia de esta bacteria en alimentos de consumo humano y sobretodo hacia los
nuevos mecanismos de adaptación y resistencia adquiridos por los microorganismos
en ambientes hostiles.
25
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general:
- Determinar la temperatura óptima de muerte para una cepa de Salmonella
spp aislada de pilas de compost empleando microambientes diferentes a
escala de laboratorio.
3.2 Objetivos específicos:
- Realizar el aislamiento y caracterización de una cepa de Salmonella spp
proveniente de residuos orgánicos domiciliarios.
- Establecer el comportamiento de la cepa en un microcosmos creado a base
de material de compostaje bajo condiciones de temperatura y pH
controlados.
- Evaluar en 2 medios de cultivo a escala de laboratorio el efecto de diferentes
temperaturas sobre la cepa y la influencia del medio en la transmisión de
calor y la resistencia que este le confiera al microorganismo.
- Identificar la temperatura y el tiempo necesario para una reducción del 90%
de la población microbiana (determinación de valor D) mediante la
realización de curvas de muerte térmica.
26
4. METODOLOGIA
Los ensayos llevados a cabo en este estudio se realizaron en los laboratorios de
Microbiología de Alimentos y Microbiología Ambiental, Departamento de
Microbiología, Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana.
4.1 Microorganismos de estudio
Para el presente estudio se realizó el aislamiento de la cepa de Salmonella spp a
partir de muestras de compost, elaborado a partir de residuos domésticos,
provenientes de una empresa ubicada en el Llano.
Para el aislamiento se empleó la Técnica de Número Mas Probable (NMP) para
Salmonella spp en Bioinsumos y Abonos Orgánicos, según el método de la EPA Nº
1682 (2006).
La cepa empleada como control en las curvas de crecimiento y de muerte térmica
fue S. enteritidis (CMDM PUJ 247) suministrada por el cepario de la Pontificia
Universidad Javeriana.
4.1.1 Banco de cepas primario
Para la conservación de las cepas se siguió la metodología descrita por Poutou et
al., (1994), usando inóculos en caldo BHI con glicerol al 30% p/v y almacenados
a -70ºC.
Las pruebas de viabilidad se realizaron semanalmente, llevando el vial a evaluar en
diluciones seriadas (base 10) desde 10-1 hasta 10-9. Las diluciones 10-6 y 10-7 se
sembraron en profundidad (1 ml) empleando agar BHI y se llevaron a incubación por
24h a 37ºC, para así realizar conteo de las unidades formadoras de colonia (Meza
et al., 2002). La pureza se confirmó con aislamientos de las colonias en agar XLD y
coloraciones de Gram, verificando en cada uno las características metabólicas y
morfológicas respectivamente.
27
4.1.2 Caracterización de la cepa
Para la caracterización de la cepa se realizaron las pruebas bioquímicas API 20E y
BBL Crystal E/NF. La metodología llevada a cabo fue la descrita en el inserto de
cada Kit bioquímico.
Igualmente la cepa fue llevada al Laboratorio de Microbiología de la Facultad de
Veterinaria de la Universidad Nacional de Colombia para un análisis mediante
antisueros específicos para el microorganismo.
4.2 Curvas de crecimiento
Para la realización de las curvas de crecimiento se tuvo en cuenta la metodología
empleada por Díaz-Borrego et al., (2005) con algunas modificaciones en base a la
metodología propuesta por Pedroza et al., (2007) para las curvas de crecimiento
bacteriano.
El preinoculo consistió en un erlenmeyer de 50 ml con 27 ml de caldo BHI
adicionada con una suspensión del microorganismo igual al patrón 0.5 de
McFarland. Previamente se preparó mediante la emulsión de una colonia de
Salmonella spp crecida en agar XLD (24h – 37ºC) en un tubo Khan con 3 ml de
caldo BHI estéril. El preinoculo se llevó a incubación durante 12h a 37ºC bajo
agitación continua (130 rpm).
Para la preparación del inóculo, se agregó el preinoculo en un erlenmeyer de 500 ml
con 270 ml de caldo BHI estéril y se llevó a incubar a 37ºC y 130 rpm (figura 2). El
cultivo se monitoreó inicialmente cada 15 minutos durante las dos primeras horas
empleando la técnica de espectrofotometría a una DO de 540 nm. Luego se
realizaron mediciones cada dos horas hasta determinar el inicio de la fase
estacionaria para cada una de las cepas (estudio y control).
28
Figura 2. Montaje del inóculo para curvas de crecimiento
El recuento en placa se realizó cada dos horas, haciendo diluciones seriadas (base
10) del inóculo en agua peptonada 0.1% p/v estéril y sembrando en profundidad
(1ml) en agar BHI para ser llevadas a incubar a 37ºC durante 18h.
4.3 Microcosmos
El montaje del microcosmos se basó en la metodología llevada a cabo por Natvig et
al., (2002); y por Lemunier et al., (2005), con algunas modificaciones en cuanto a la
preparación y distribución de los inóculos y en la temperatura de incubación del
microambiente, debido al objetivo de la investigación.
4.3.1 Preparación de los inóculos
Un tubo Khan con 2.5 ml de caldo BHI estéril se ajustó al tubo 0.5 de McFarland a
partir de la emulsión de una colonia de Salmonella spp crecida en agar XLD (24h –
37ºC), para posteriormente ser adicionado a un erlenmeyer de 50 ml con 22.5 ml de
caldo BHI estéril y ser llevado a incubación (16h - 37ºC - 120 rpm). Pasado este
tiempo se midió la absorbancia del inóculo y las UFC/ml en placas de agar BHI para
establecer la concentración inicial.
29
A partir del inóculo se realizaron diluciones sucesivas en frascos Schott de 500 ml
con 225 ml de agua peptonada 0.1% p/v estéril hasta obtener concentraciones de
100 y 10 células/ml. Cada dilución fue agregada a una muestra de compost y
homogenizada manualmente. A la muestra de compost control se le adicionó agua
peptonada 0.1% p/v estéril para mantener las condiciones de humedad similares.
4.3.2 Montaje del microcosmos
Se emplearon envases de vidrio de 750 cm3 y cada uno fue adicionado con 150 g de
la muestra de compost (tabla 2). Este compost tenía la misma procedencia del cual
se aisló la cepa inicialmente, y se encontraba en fase mesofílica (1 semana). Cada
envase se selló con un tapón de caucho, se rotuló adecuadamente y se llevo a
incubar a 70ºC (figura 3). Previamente se tomaron muestras de cada tratamiento
correspondientes al tiempo cero (inicio del estudio) para el análisis de pH y
Salmonella spp.
Tabla 2. Composición de los tratamientos para el microcosmos
Tratamiento Muestra de compost (g) Inóculo
1 150 100 células/g
2 150 10 células/g
Control 150 Agua peptonada estéril 0.1%
4.3.3 Análisis y seguimiento del microcosmos
Se retiraron semanalmente 3 envases de cada tratamiento para realizar el
seguimiento al comportamiento de Salmonella spp y niveles de pH en cada
microambiente.
Para el seguimiento del microorganismo se empleó la Técnica de Número Mas
Probable (NMP) para Salmonella spp en Bioinsumos y Abonos Orgánicos, según el
método de la EPA Nº 1682 (2006).
30
El pH del compost fue medido semanalmente a los envases retirados para el
análisis de Salmonella spp. Éste se midió diluyendo una muestra de compost en
agua destilada relación 1:5 (Lemunier et al., 2005).
Figura 3. Montaje final del microcosmos
4.4 Curvas de muerte térmica
4.4.1 Preparación del inóculo
El preinoculo se preparó adicionando un tubo Khan con 2 ml de caldo BHI, ajustado
al patrón 0.5 de McFarland mediante la emulsión de una colonia de Salmonella spp,
en un erlenmeyer de 50 ml con 18 ml de caldo BHI estéril y llevado a incubar por
12h a 37ºC bajo agitación (130 rpm).
Para preparar el inóculo, un erlenmeyer de 500 ml con 180 ml de caldo BHI estéril
fue adicionado con el cultivo de 12h y llevado a incubación durante 10h a 37ºC y
130 rpm, tiempo durante el cual la cepa ha alcanzado ya la fase estacionaria y por
ende mayor termorresistencia (Pagan et al., 1997; Fang et al., 1996; Foster &
Spector, 1995). Para la cepa control se realizó la misma metodología bajo las
mismas condiciones, con la única diferencia que el tiempo de incubación del inóculo
31
fue de 12 horas, tiempo necesario para que la cepa de S. enteritidis alcanzara la
fase estacionaria.
4.4.2 Montaje curvas de muerte térmica
A partir del inóculo se tomaron 0.5 ml y se realizaron diluciones seriadas (base 10)
en agua peptonada 0.1% p/v estéril hasta 10-8, sembrando por triplicado en
profundidad las ultimas tres diluciones (10-6, 10-7, 10-8) en agar BHI a fin de conocer
la concentración inicial en UFC/ml antes de iniciar el tratamiento térmico (Meza et
al., 2002). Así mismo, se realizó coloración de Gram para asegurar la pureza del
inóculo.
Se tomaron 10 ml del cultivo y se adicionaron a un tubo de ensayo tapa rosca de
vidrio (16 x 150 mm) estéril. Este se llevó a un baño serológico ajustado
previamente a la temperatura establecida para cada ensayo (50, 60, 70 y 80ºC)
(Taylor-Robinson et al., 2003).
La temperatura al interior del inóculo se mantuvo monitoreada mediante la ubicación
de una termocupla dentro del tubo de ensayo control (10 ml de caldo BHI estéril)
(figura 4).
Figura 4. 4a. Montaje curvas de muerte térmica 4b. Control de Tº mediante
termocupla
4a 4b
32
Las curvas a temperatura de 50, 60 y 70ºC se llevaron a cabo durante 120 minutos,
mientras la curva a 80ºC se realizó durante 240 minutos.
En intervalos de tiempo de 15 minutos cronometrados, se retiró el tubo de ensayo y
se realizaron diluciones seriadas (base 10) en agua peptonada 0.1% p/v estéril. La
cantidad de diluciones se manejo acorde con la temperatura y el tiempo de
exposición al calor del inóculo, siendo menor el número de diluciones a medida que
transcurría el tratamiento térmico. Las últimas tres diluciones de cada muestreo se
sembraron por triplicado en profundidad empleando agar BHI, y posteriormente
incubadas a 37ºC durante 24h para determinar el número de sobrevivientes o
células viables (Henry et al., 1969).
Para la curva de muerte térmica en caldo BHI a pH 5.5 se empleo ácido
clorhídrico 0.5 M adicionado al inóculo antes de ser transferido al tubo de ensayo. El
ajuste se realizó con papel indicador de pH (Blackburn et al., 1997).
4.4.2.1 Curva muerte térmica en caldo compost
La curva de muerte térmica fue llevada a cabo en caldo compost (Galindo &
Londoño, 2005), suplementado con peptona de caseína al 2.5% (p/v), pH 7.0
(Anexo 1).
Se preparó una variación del caldo compost no filtrado, a fin de evaluar la incidencia
de los sólidos en la termorresistencia del microorganismo. De tal forma que se
realizaron dos curvas de muerte térmica a 80ºC x 120 minutos, una en caldo
compost filtrado y otra en caldo sin filtrar. Tanto el preinoculo como el inóculo se
desarrollaron en este medio. La metodología para el tratamiento térmico y la
recuperación de células viables fue la misma que se empleó para el caldo BHI.
4.4.3 Valor D
Para hallar el valor D a partir de las curvas de muerte térmica, se aplicó el modelo
propuesto por Stumbo (1973) representado en la siguiente fórmula matemática:
33
Donde:
Dt es el valor D para determinada temperatura t
X es el tiempo del tratamiento térmico en minutos
No es el número de células al inicio del tratamiento
Nf es el número de células supervivientes después del tratamiento
Se halló un valor D lineal y un valor D Tail (con colas) para las gráficas que no
presentaron comportamiento lineal. Este valor se calculó teniendo en cuenta los
shoulders (hombros), mientras que en el valor D lineal solo se tuvieron en cuenta los
datos que presentaron comportamiento lineal decreciente (Humpheson et al., 1998).
ln
XDt
No
Nf
=
34
5. RESULTADOS
5.1 Microorganismos de estudio
5.1.1 Aislamiento de la cepa
Para el aislamiento y purificación de la cepa se empleó la metodología descrita en el
Método EPA Nº 1682 / 2006 a partir de una muestra de compost tomada al finalizar
el proceso proveniente de una empresa procesadora de residuos domésticos
ubicada en el Llano. Los resultados obtenidos durante el desarrollo del método
resultan ser los esperados para un microorganismo del género Salmonella (tabla 3).
Tabla 3. Resultados de la identificación bioquímica, serológica y microscópica de la
cepa aislada.
Medio Resultado
MSRV Colonia blanquecina con halo grande de movilidad
XLD Colonias transparentes con centros negros. Fig 5a.
HECKTOEN Colonias verde-azules con centro negro. Fig. 5b.
SULFITO BISMUTO Colonias de color verde metálico con centro negro y
halo de precipitación. Fig. 5c.
TSI Reacción ALK/AC con producción de H2S. Fig 6c
LIA Reacción ALK/ALK con producción de H2S. Fig 6b
UREA Negativo, sin cambio de color del medio. Fig. 6a
COLORACIÓN DE GRAM Bacilos Gram negativos
5.1.2 Caracterización de la cepa
Los resultados de las pruebas bioquímicas API 20E y BBL Crystal E/NF se muestran
en la tabla 4. En ambos casos el microorganismo fue identificado como Salmonella
spp.
35
Figura 5. Cepa aislada de Salmonella spp: a. XLD b. Hecktoen c. Sulfito Bismuto
Figura 6. Bioquímicas Salmonella spp. a. Urea b. LIA c. TSI
Tabla 4. Caracterización de la cepa mediante Kit de bioquímicas
Prueba Microorganismo % ID T
Salmonella spp. 99,9 0,97
API 20E
Salmonella
choleraesuis ssp
arizonae
0,1 0,25
BBL Crystal E/NF Salmonella species 73,97 0,96
5a 5b 5c
6a 6b 6c
36
Los resultados del análisis mediante antisueros realizado en la Facultad de
Veterinaria de la Universidad Nacional de Colombia se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Caracterización serológica de la cepa
Análisis Resultado
ANTISUERO POLIVALENTE “O” Positivo, aglutinación
ANTISUERO GRUPO “B” Negativo, no aglutinó
ANTISUERO GRUPO “D” Negativo, no aglutinó
5.2 Banco de cepas primario
El banco para el microorganismo de estudio se realizó con una concentración de 33
x 108 UFC/ml en caldo BHI con glicerol al 30%. La estabilidad de la cepa se evaluó
en tres ocasiones en las cuales se confirmó la pureza y la estabilidad de la cepa.
Además en los recuentos realizados durante los 6 meses del estudio la población se
mantuvo constante en 108 UFC/ml, encontrándose al final una concentración de 2 x
108 UFC/ml.
A partir de este banco se realizaron los aislamientos necesarios para el montaje de
cada curva de muerte térmica.
5.3 Elaboración de curvas de crecimiento
En la figura 7 se muestran los resultados de la curva de crecimiento por
absorbancia, donde se pueden observar las diferentes etapas de crecimiento de los
microorganismos, evidenciándose que entre la hora 8 y 10 se logra tener la fase
estacionaria para la cepa en estudio y la cepa control respectivamente.
Con relación a la figura 8 que muestra los recuentos en UFC/ml, los resultados son
similares, solamente se observa un cambio en la hora 8 representado en el aumento
de la población, cambio que no se presenta en la gráfica de absorbancia (figura 7).
37
5.4 Microcosmos En la figura 9 se presentan los resultados de los recuentos en NMP/4g de
Salmonella spp. y el comportamiento del pH en el microcosmos durante las nueve
semanas de estudio. Igualmente en la figura 10 se muestra el control del
microcosmos con sus valores de NMP/4g y pH.
En la primera semana de estudio se presenta un descenso del 88.1% y 94.1% de la
población inicial en los tratamientos de 10 y 100 células/g respectivamente. Esta
disminución se presenta simultáneamente con una ligera caída de 0.2 en el nivel de
pH.
Si se observa detalladamente en la segunda semana la población de ambos
tratamientos se incrementa al igual que el valor de pH. Ambos tratamientos
alcanzan poblaciones similares entre 6.5 y 6.7 NMP/4g, mientras el nivel de pH
aumenta de 6.4 a 6.7.
A partir de la tercera semana tanto la población de ambos tratamientos como el nivel
de pH descienden, siendo el recuento de Salmonella spp NMP/4g <0.006473
mientras el pH alcanza paulatinamente un mínimo de 4.5, presentándose una
correlación entre la caída del pH y la disminución de la población inicial del
microorganismo.
5.5 Curvas de Muerte térmica
En la figura 11 se muestran las curvas de muerte térmica realizadas a Salmonella
spp a temperatura de 50, 60 y 70ºC en caldo BHI a pH de 7.0.
Ninguno de estos tratamientos térmicos logró la destrucción total del
microorganismo durante el tiempo establecido para cada uno (2 horas), sin embargo
se observa variación en el comportamiento de la cepa dependiendo de la
temperatura. A temperatura de 50ºC se redujo la población inicial en un 36.8% y
gráficamente se presenta de manera linear decreciente.
38
Por otra parte, a temperatura de 60ºC la población inicial se vio disminuida en un
53.2% y a 70ºC en un 62%. No obstante gráficamente las curvas a 60 y 70ºC no
presentan una conducta linear decreciente, por el contrario exhiben un
comportamiento irregular conocido como shoulders (hombros) (Asselt & Zwietering,
2006).
Figura 7. Curva de crecimiento por absorbancia Salmonella spp. y S. enteritidis
De igual forma sucede con las curvas de muerte térmica realizadas a temperatura
de 80ºC (figura 12), en donde no se presenta una tendencia lineal decreciente en la
inactivación de la cepa, pero con la variante que el tiempo de exposición al calor se
duplicó (240 minutos) para lograr la inactivación total de la cepa, siendo esta a los
180 minutos de tratamiento a pH 7.0 y de 105 minutos a pH 5.5.
En la figura 14 se muestra la curva de muerte térmica de referencia (S. enteritidis),
en donde la cepa se mantuvo constante durante 90 min en una concentración de
104 UFC/ml, para luego de 135 min de tratamiento alcanzar la muerte de todas las
células.
Tiempo (min)
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Abs
orba
ncia
540
nm
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Salmonella spp.S. enteritidis
39
Figura 8. Curva de crecimiento por recuento en placa de Salmonella spp. y S.
enteritidis
Figura 9. Comportamiento de Salmonella spp respecto al pH en el microcosmos
Tiempo (m in)
0 200 400 600 800 1000
Log 10
UF
C/m
l
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
9,5
Salmonella spp.S. enteritidis
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo (semanas)
NM
P/4
g
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
pH
100 Células/g10 Células/gpH
40
Figura 10. Microcosmos control
Figura 11. Curvas muerte térmica a 50, 60 y 70ºC en caldo BHI a pH 7,0
Tiempo (min)
0 20 40 60 80 100 120 140
Log 10
UF
C/m
l
2
3
4
5
6
7
8
9
10
50ºC60ºC70ºC
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo (semanas)
NM
P/4
g
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
pH
NMP/4g
pH
41
Figura 12. Curva muerte térmica a 80ºC en caldo BHI a diferente pH
Figura 13. Curva de muerte térmica a 80ºC en caldo compost
Tiempo (min)
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Log 10
UF
C/m
l
0
2
4
6
8
10
pH 5,5pH 7,0
Tiempo (min)
0 20 40 60 80 100 120 140
Log 10
UF
C/m
l
0
2
4
6
8
10
Sin FiltrarFiltrado
42
Figura 14. Curva muerte térmica S. enteritidis a 70ºC en caldo BHI (pH 7.0)
En caldo compost la destrucción de la totalidad de los microorganismos requirió de
una menor cantidad de tiempo a temperatura de 80ºC respecto al caldo BHI (pH 7.0
y 5.5), siendo esta de tan solo 75 minutos en caldo compost sin filtrar y de 120
minutos en caldo filtrado (figura 13).
5.5.1 Valor D
En la tabla 6 se presenta el valor D para cada una de las temperaturas y cada uno
de los medios empleados, con un valor D lineal y un valor D Tail (con colas) en
donde se tienen en cuenta los valores que no presentaron tendencia lineal
decreciente. En el caso de la curva de muerte térmica en caldo BHI a 50ºC no aplica
un valor D Tail debido a que el comportamiento de la gráfica fue lineal decreciente
durante todo el tratamiento.
Tiempo (min)
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Log 1
0 U
FC
/ml
0
2
4
6
8
10
43
En la tabla 7 se presenta el valor D correspondiente a la cepa de S. enteritidis con la
cual se comparó la cepa de estudio, y como era de esperarse los valores son
inferiores indicando una menor termorresistencia de la cepa.
Tabla 6. Valor D para cada tratamiento con Salmonella spp.
Medio de cultivo Temperatura (ºC) Valor D lineal (m in) Valor D Tail (min)
50 35.7 NA*
60 80.7 24.6
70 73.6 20.9
Caldo BHI pH 7,0
80 40.2 20.2
Caldo BHI pH 5,5 80 17.7 13.1
Caldo compost sin
filtrar
24.5 8.1
Caldo compost filtrado
80
31.8 14.52
* No Aplica
Tabla 7. Valor D para S. enteritidis
Medio de cultivo Temperatura (ºC) Valor D lineal (m in) Valor D Tail (min)
Caldo BHI pH 7,0 70 10.8 16.9
44
6. DISCUSION DE RESULTADOS
6.1 Microorganismos de estudio
El banco para el microorganismo de estudio (Salmonella spp.) se realizó con una
concentración inicial de 33 x 108 UFC/ml, manteniéndose constante durante todo el
estudio ya que hasta el sexto mes no se disminuyó la unidad logarítmica,
manteniéndose en 108. Para esta clase de microorganismos, se reporta un elevado
porcentaje de supervivencia en distintos medios de conservación, debido a la
presencia de factores de virulencia que le permiten soportar temperaturas bajas y
ambientes adversos (Meza et al., 2002). Además durante el estudio la cepa no
presentó modificaciones a nivel metabólico y tampoco se registró contaminación de
otros microorganismos.
6.2 Elaboración de curvas de crecimiento
La cepa control (S. enteritidis) presentó valores de absorbancia y recuento en placa
(figura 7 y 8) mucho mayores comparados con la cepa de estudio (Salmonella spp).
Esto puede adjudicarse posiblemente al origen “salvaje” de la cepa en estudio ya
que en este tipo de microorganismos, adaptados a los ambientes adversos, el
metabolismo es más rápido logrando degradar sustratos en un menor tiempo y
culminando su ciclo de vida en un período de tiempo mas corto, y ello se evidencia
al iniciar la fase estacionaria 2 horas antes que la cepa control, fase en la cual los
microorganismos son más resistentes al estrés en comparación con la fase de
logarítmica (Taylor-Robinson et al., 2003; O’Bryan et al., 2006). Este factor es
importante ya que en el medio ambiente estos microorganismos son competidores
eficientes frente a hongos y actinos que están presentes en el suelo, lo que le
permite aumentar la población y de esta manera poder diseminarse dentro del
suelo.
Los datos de la fase estacionaria difieren con los obtenidos por Juneja & Marks
(2006), quienes requirieron para Salmonella spp, bajo las mismas condiciones
45
(caldo BHI sin suplementos), un período de tiempo de 18 horas para iniciar la fase
estacionaria, comparadas con las 8 horas requeridas en este estudio. Esto se debe
posiblemente a la elaboración del inóculo previo a la curva de crecimiento, ya que
mediante esta metodología se logra un proceso previo de adaptación por parte de la
cepa, propiciando de esta forma curvas de crecimiento en menor tiempo (Walker et
al., 1990; Gay et al., 1996).
6.3 Microcosmos
La resistencia de Salmonella spp a diferentes tratamientos térmicos ha sido
evaluada principalmente en alimentos como huevos (Garibaldi et al., 1969), leche
líquida (Dega et al., 1972), leche en polvo (Read et al., 1968) carne de pollo
(O´Bryan et al., 2006) y harina de maíz (VanCauwenberge et al., 1981). Sin
embargo son pocos los estudios que reportan la termorresistencia de Salmonella
spp en microambientes a base de compost y en caldo compost, a pesar de ser éste
un insumo agrícola que en los últimos años ha adquirido una elevada importancia en
los procesos agroindustriales (Tchobanoglous, 1994). Es posible que la falta de
datos referenciados esté relacionado con el hecho de que sólo en años recientes se
han presentado brotes de Salmonella asociado al consumo de vegetales donde las
fuentes de contaminación han sido el agua y los abonos (Solomon et al., 2002;
Natvig et al., 2002; Warriner et al., 2003).
Al someter las muestras de compost a temperatura de 70ºC durante 9 semanas
continuas, se impide el desarrollo normal de éste y por ende el comportamiento no
será el típico esperado. Las 3 fases que dividen el proceso, mesófila, termófila y de
maduración (Sansford & MacLeod, 1998), no se llevaron a cabo debido al ambiente
extremo al cual fueron sometidas, razón por la cual variables dependientes como el
pH se vieron afectadas, presentando también un comportamiento anormal durante
el estudio.
Durante la fase mesófila (2 a 5 días dependiendo de la materia prima) se presentan
normalmente valores ácidos de pH (5,5 – 6,5) debido a la producción de ácidos
46
orgánicos por parte de los microorganismos fermentadores facultativos (Droffner &
Brinton, 1995). Durante la primer semana de estudio, el microcosmos exhibió el
mismo comportamiento descrito anteriormente presentando una leve disminución en
el pH acompañado de la reducción en la población de Salmonella spp (figura 9).
Ésta disminución en el crecimiento puede deberse a que el pH óptimo para
Salmonella spp oscila entre 5.5 y 7.4, siendo los valores más cercanos al neutro los
más favorables para su desarrollo (Weissinger et al., 2000), resultando un pH de 6.0
a temperatura de 70ºC sumamente hostil para su supervivencia ya que se dificulta la
síntesis de enzimas extracelulares encargadas de degradar el material orgánico
obstaculizándose de esta forma la toma de nutrientes por parte del microorganismo
(Tiquia et al., 1998).
Por otro lado, en la primera semana de tratamiento disminuyó la población inicial del
tratamiento 1 hasta 5 NMP/4g; y el tratamiento 2 hasta 2.13 NMP/4g, pero en la
segunda semana el incremento del pH estuvo acompañado de un alza poblacional
que alcanzó los mismos valores en ambos tratamientos, 6.7 y 6.58 NMP/4g,
sugiriendo que en ambos tratamientos, independientemente de la concentración
inicial de Salmonella spp, el medio posiblemente le proporciona al microorganismo
las condiciones necesarias para recuperarse de la injuria sufrida a causa de la
temperatura a la que fue sometida. Estas condiciones hacen referencia al sustrato
disponible y a la protección al calor suministrada por las partículas de gran tamaño
presentes en el compost (Galindo & Londoño, 2005), ya que como se demostró en
estudios llevados a cabo por Natvig et al., (2002) y Franz et al., (2005) un tamaño de
partícula mediano en suelos favorece la retención de agua y disminuye la tensión de
oxígeno, incrementando las posibilidades de colonización de los microorganismos,
garantizando la sobrevivencia de éstos en el suelo.
A partir de la tercera semana la concentración de Salmonella spp en ambos
tratamientos fué <0.006473 NMP /4g, lo cual sugiere que la cepa al ser sometida a
esta temperatura durante un largo período de tiempo inicia su etapa de muerte,
debido a que es una temperatura que está en el límite de supervivencia de la
bacteria y si la exposición al calor es constante a través del tiempo se alcanza un
punto en donde la degradación de proteínas membranales y partículas intracelulares
47
es inevitable e irreparable (Doyle & Mazzotta, 2000), es allí donde se llega a la
destrucción total del microorganismo.
Teniendo en cuenta lo anterior, si bien después de la segunda semana no se
encontró crecimiento de Salmonella spp en el microcosmos, es posible que en
compost con poblaciones mayores de éste microorganismo, el tiempo de
supervivencia pueda ser mayor, además es importante señalar que a temperatura
de 70ºC durante 9 semanas seguidas se puede ver inhibido el crecimiento de
actinomycetes, hongos y bacterias esporoformadoras, quienes son los
microorganismos encargados de descomponer proteínas, degradar ácidos
orgánicos y transformar el nitrógeno en amoníaco, para de esta forma alcalinizar el
pH del compost (Sundberg et al., 2004). Esto podría ser la causa del pH ácido del
medio durante todo el tratamiento y uno de los principales factores que limitó el
desarrollo de Salmonella spp.
6.4 Curvas de muerte térmica
Las curvas de muerte térmica realizadas tanto en caldo BHI (pH 5.5 y 7.0) como en
caldo compost, no muestran una tendencia linear decreciente, por el contrario
exhiben un comportamiento particular conocido como shoulders (hombros) o
comportamiento bifásico, el cual puede deberse a varias razones como la
heterogeneidad dentro de la población o la adaptación al calor durante el
tratamiento térmico (Stringer et al., 2000).
Teniendo en cuenta los controles llevados a cabo en el desarrollo del estudio, la
adaptación al calor de la cepa de Salmonella spp durante la elaboración de las
curvas es probablemente la causa por la cual no se presenta un comportamiento
linear decreciente. La adaptación al calor por parte de la cepa en estudio puede
relacionarse con la síntesis de proteínas de choque térmico y/o el desarrollo de
injuria bacteriana (Asselt & Zwietering, 2006).
Las curvas de muerte térmica realizadas en caldo BHI (pH 7.0) a temperatura de 60,
70 y 80°C muestran una reducción que oscila entre 4 y 6 unidades logarítmicas de
48
la población inicial de Salmonella spp. durante los primeros 15 a 30 minutos de
tratamiento, tiempo después del cual se presenta un leve incremento en la población
microbiana que se mantiene estable durante cerca de 30 minutos antes de
presentar una disminución linear en la población (figura 11 y 12).
Éste fenómeno se atribuye principalmente a la injuria bacteriana, consistente en
daños subletales a nivel de rRNA que cambia la fisiología de la célula bacteriana
causando pérdida de la integridad de la membrana celular y por consiguiente el
desperdicio de una gran variedad de constituyentes intracelulares. Este daño puede
ser causado por radiaciones, deshidratación, congelación o temperaturas cercanas
al punto de ebullición (Ray, 1993).
A nivel molecular la injuria bacteriana consiste en fenómenos a nivel intracelular: la
inducción de la síntesis de proteínas de choque térmico y la degradación de material
ribosomal. La inducción de la síntesis de las proteínas de choque térmico (HSP)
puede presentarse antes o durante la aplicación de calor y conlleva a un incremento
significativo en la resistencia a la temperatura y a otros factores adversos (Lindquist
& Craig, 1988).
Adicionalmente, se sugiere que los sobrevivientes iniciales durante un tratamiento
térmico pueden con el tiempo ganar protección adicional a partir del material celular
proveniente de la muerte de otras células al comienzo de este tratamiento
(Humpheson et al., 1998), siendo éste uno de los posibles factores de la
termorresistencia de la cepa si se tiene en cuenta que las curvas de muerte térmica
se iniciaron con recuentos de 108 UFC/ml y 10 ml de suspensión inicial, una
cantidad elevada comparada con estudios recientes en donde se emplean
cantidades de 0.1 a 1 ml (Brackett et al., 2001; Bacon et al., 2003; Leguérinel et al.,
2007).
Otro posible factor asociado a la termorresistencia es la producción de componentes
extracelulares a nivel de membrana celular, debido a que es allí en donde se ve
afectada la permeabilidad y por ende la pérdida de material citoplasmático. En
Salmonella spp., S. enteritidis y S. typhimurium se han encontrado, luego de la
49
aplicación de un tratamiento térmico, la expresión de 7 proteínas con pesos
moleculares de 14, 16, 21, 23, 60, 75 y 89 KDa, relacionando su producción con el
incremento de la resistencia al calor por parte de estos microorganismos (Xavier &
Ingham, 1997). Si bien no se ha comprobado que se trata de proteínas que
confieran única y exclusivamente termorresistencia, si se ha reportado su papel en
la modificación de la pared celular a nivel de conformación para disminuir la
permeabilidad y por ende limitar la pérdida de material intracelular (Xavier & Ingham,
1997; Humpheson et al., 1998). Por consiguiente, es posible que durante el
tratamiento térmico ocurra la producción de proteínas de choque térmico (HSP) en
una pequeña cantidad de células y conlleve a la aparición de colas (tails) en las
curvas de microorganismos recuperados.
De igual forma, se ha encontrado que S. typhimurium requiere de la síntesis de
proteínas durante la recuperación después de un tratamiento térmico para sintetizar
la subunidad de RNA 17S y proteínas alternas como lo son las de choque térmico
(HSP), las cuales le permiten resistir durante mas tiempo el calor y recuperarse en
mayor cantidad en un medio de cultivo luego de sufrir injuria (Witter, 1981).
La injuria bacteriana también viene acompañada de la degradación completa de la
partícula ribosomal 30S y una ligera alteración de la partícula 50S. Estas dos
partículas conforman el ribosoma el cual es responsable de la síntesis de proteínas
en la célula. Durante un procedimiento de choque térmico a microorganismos como
Staphylococcus aureus y Salmonella typhimurium se encontró que el RNA 23S,
asociado con la partícula ribosomal 50S, permanecía intacto mientras el 16S,
asociado con la partícula ribosomal 30S, era degradado por completo (Witter, 1981).
La concentración inicial de microorganismos con la cual se realizaron las curvas de
muerte térmica puede ser fundamental en el comportamiento exhibido por la cepa,
debido a que un elevado número de células/ml facilita la interacción célula-célula en
el cultivo y la formación de conglomerados que resisten mejor las condiciones
térmicas extremas (Taylor-Robinson et al., 2003). De igual forma, una elevada
concentración de microorganismos (mayor a 108 UFC/ml) en el medio de prueba
tiene un efecto de protección en la destrucción térmica, debido probablemente al
50
resultado de una rápida disminución en el oxígeno disuelto (causado por la
respiración de las células) que reduce el daño oxidativo al microorganismo (Doyle &
Mazzotta, 2000).
Otro factor importante a tener en cuenta es el medio en el cual se lleva a cabo el
ensayo. Si se observan detenidamente los resultados se notará la elevada
termorresistencia que presenta Salmonella spp en caldo BHI a pH 7,0 en
comparación con el caldo compost (figura 9). Esto puede deberse a que los medios
con algún tipo de azúcar (el caldo BHI contiene D (+) glucosa 2g/l) como sacarosa,
fructosa o glucosa (Goepfert et al., 1970), tienden a disminuir el aW y deshidratar
parcialmente las células, incrementando de esta forma su resistencia al calor (Corry,
1974; Baird-Parker et al., 1970). En igual sentido, se ha reportado que el calor
favorece la interacción de componentes de bajo peso molecular y cationes
divalentes presentes en el medio de calentamiento, con componentes de la
superficie celular, resultando en la estabilización de la membrana externa y el
subsiguiente incremento en la tolerancia al calor por parte de las células (Sergelidis
& Abrahim, 2009).
De la misma forma, sustancias como la trimetilglicina (betaína) y la carnitina (4-
trimetilamino-3-hidroxibutirato) presentes en el caldo BHI, han sido reportadas como
sustancias termoprotectoras debido a que estabilizan la membrana celular luego de
un proceso térmico, e incluso por estimular la síntesis de proteínas de choque
térmico (HSP) (Ryser & Marth, 1999; Schultzen et al., 2007). La base molecular de
la acción de la betaína y la carnitina radica en que son sustancias clasificadas como
osmoprotectoras, y su actividad se fundamenta en el hecho de que pueden
acumularse al interior de la célula en concentraciones elevadas sin afectar las
funciones citoplasmáticas, restaurando de esta forma la turgencia y aumentando la
osmolaridad externa (Angelidis & Smith, 2003). La betaína y la carnitina son
constituyentes del caldo BHI (Lynne, 2004), medio de cultivo empleado en este
estudio para las curvas de crecimiento y de muerte térmica, por consiguiente, su uso
al parecer favoreció la termorresistencia de la cepa estudiada.
51
Igualmente, el medio de recuperación juega un papel fundamental ya que las células
injuriadas pueden repararse y crecer en un medio nutritivo pero son incapaces de
desarrollarse en un medio selectivo debido al incremento en la sensibilidad hacia
ciertos reactivos químicos empleados para aumentar la selectividad en los medios
de cultivo (Ray, 1993). Boziaris et al., (1998) reportan que las células de Salmonella
spp y S. typhimurium injuriadas mediante calor se tornan sensibles al desoxicolato,
agente selectivo empleado en el medio xilosa - lisina - desoxicolato (XLD). Las
células injuriadas pierden su resistencia normal y se vuelven sensibles a muchos
agentes químicos, además de perder compuestos celulares de bajo peso molecular
hacia el medio. De esta forma se sugiere que la mayoría de estudios deben emplear
medios nutritivos sin agentes selectivos para la recuperación de células injuriadas
por tratamientos térmicos (Stephens et al., 1997; Boziaris et al., 1998).
6.4.1 Curva de muerte térmica en caldo BHI a pH 5.5
Por otra parte, el pH juega un papel fundamental como complemento para el calor
en el desarrollo de las curvas de muerte térmica, viéndose disminuido drásticamente
el tiempo requerido para la inactivación de Salmonella spp a temperatura de 80ºC
en caldo BHI ajustado a pH de 5.5 (figura 12), siendo en este estudio reducido a la
mitad comparado con el caldo BHI a pH de 7.0.
Couvert et al., (1999) sugieren que una disminución en el pH del medio de
calentamiento y/o del medio de cultivo para la recuperación reduce la resistencia
bacteriana al calor. Igualmente Leguérinel et al., (2007) han demostrado que un
tratamiento térmico para S. typhimurium a pH de 5 reduce el tiempo de
calentamiento en una proporción de 3.5 veces, o con el mismo tiempo de
calentamiento, puede reducir la temperatura en 2.25ºC con la misma eficiencia letal.
Esto se debe a que el pH ácido del medio altera el orden de los componentes de la
membrana celular haciéndola más permeable y por ende más sensible a factores
externos (Leguérinel et al., 2007). Del mismo modo, las alteraciones
conformacionales de proteínas y lipopolisacáridos (LPS) de la membrana externa
durante un tratamiento térmico provocan un cambio en la estructura de la membrana
externa y en su permeabilidad (Boziaris et al., 1998). Por ende, el calor
52
suministrado al microorganismo afecta de manera más directa el material
intracelular denaturando e impidiendo la síntesis de nuevas proteínas.
Sin embargo, Doyle y Mazzotta (2000) reportan un incremento en la
termorresistencia de S. enteritidis al disminuir el pH del medio con ácido láctico y
ácido cítrico, pero no al emplear ácido clorhídrico o acético pues se reduce el tiempo
de exposición al calor necesario para la destrucción de la cepa, lo que demuestra
que en este tipo de ensayos la termorresistencia esta asociada al tipo de ácido
utilizado. De este modo, los ácidos inorgánicos al parecer disminuyen la
termorresistencia de los microorganismos ya que penetran con mayor facilidad la
pared celular alterando su conformación (Humphrey et al., 1995; Kinner & Moats,
1981).
6.4.2 Curvas de muerte térmica en caldo compost
Para esta parte se trabajó con caldo compost filtrado y sin filtrar a temperatura de
80ºC debido a que previamente se había logrado la inactivación total de la cepa a
esta temperatura en caldo BHI.
Contrario a los esperado, el caldo compost filtrado presentó mejores condiciones
para la supervivencia de Salmonella spp puesto que se logró recuperar la cepa
hasta los 105 minutos de tratamiento, en contraste con los 60 minutos obtenidos en
el caldo sin filtrar (figura 13). Al no filtrar el caldo compost se pueden hallar
partículas suspendidas de gran tamaño las cuales se esperaría le brindaran
protección a la cepa durante el tratamiento térmico, pero contrario a esto, resulto ser
un medio que no favorece el desarrollo de la termorresistencia de la cepa,
posiblemente por la dificultad de la cepa para degradar las partículas de gran
tamaño en busca de nutrientes, debido a que este microorganismo no presenta una
maquinaria enzimática capaz de degradar sustratos complejos (Bertoldi et al., 2000).
Igualmente el gran tamaño de las partículas podría llegar a representar un
impedimento en la migración de la célula por el medio de cultivo en busca del
sustrato mas simple para degradar, la peptona de caseína, puesto que para
53
desarrollar factores de termorresistencia como la síntesis de proteínas de choque
térmico (HSP) o el reensamble de las partículas ribosomales la célula necesita de
sustratos asimilables (Humpheson et al., 1998), por consiguiente, las partículas
suspendidas en el caldo compost sin filtrar podrían obstaculizar el acceso del
microorganismo a los nutrientes de fácil metabolismo.
Caso contrario se presume podría suceder en el caldo compost filtrado, en donde el
microorganismo puede llegar a entrar en contacto directo con la peptona de caseína
y de esta forma incrementar la resistencia al calor.
Al comparar los resultados obtenidos en el caldo compost (filtrado – sin filtrar) con el
caldo BHI (pH 7.0) se observa una gran diferencia, pues la cepa en estudio resistió
75 minutos más el tratamiento térmico a 80ºC en el caldo BHI respecto al caldo
compost filtrado, y 120 minutos comparado con el caldo sin filtrar.
Por su parte, el caldo compost podría llegar a limitar el crecimiento y desarrollo
normal de la cepa, debido a que se han reportado la presencia de sustancias
antibacterianas, producidas por actinomycetes y hongos, y de compuestos tóxicos
naturales formados durante el compostaje (Eklind et al., 2004). Igualmente, se han
hallado en muestras de compost sustancias fitotóxicas tales como taninos y
polifenoles, clasificadas como inhibidores aleloquímicos, que muchas veces pueden
actuar como atrayentes, estimulantes, toxinas, repelentes o inhibidores de
crecimiento (Fan & Lou, 2004). De la misma forma, restos de enzimas bacterianas y
ácidos húmicos encontrados en compost presentan cierto tipo de actividad
antimicrobiana (Loffredo et al., 2007; Casulli & Sanesi, 2007), lo cual puede interferir
de manera directa en la baja termorresistencia exhibida por Salmonella spp en el
caldo compost, puesto que las células injuriadas en un tratamiento térmico son más
sensibles ante cualquier sustancia antibacteriana (Ray, 1993).
6.5 Valor D
En la tabla 6 se presentan los valores DL (Lineal) y DT (Tails “colas”) para cada uno
de los tratamientos realizados en este estudio. Como se puede observar el valor DL
54
corresponde al comportamiento de la cepa una vez ha sufrido la injuria, mientras
que en el valor DT se tienen en cuenta todos los valores obtenidos durante el
tratamiento térmico, es decir, antes, durante y después de sufrir injuria. Es por esto
que el valor DT es menor en todos los tratamientos realizados a Salmonella spp,
excluyendo el ensayo a 50ºC en donde el comportamiento de los datos fue lineal
decreciente y no presentó shoulders o tails (hombros o colas).
Las curvas de muerte térmica en este estudio presentaron un comportamiento
bifásico caracterizado por shoulders u hombros al inicio y por una disminución lineal
en la población al final del tratamiento. La presencia de shoulders (hombros) en un
tratamiento térmico indica en la mayoría de los casos que la cepa sufre de injuria
bacteriana (Humpheson et al., 1998; Stringer et al., 2000; Asselt & Zwietering,
2006), pudiendo ser este el caso de la cepa en estudio. En la segunda fase la
población microbiana disminuye de forma progresiva hasta el final del tratamiento,
siendo esta última fase en la cual se reporta el aumento en la termorresistencia de
las cepas mediante la sobre-expresión de proteínas, la reparación a nivel de rRNA o
la adaptación al medio de calentamiento (Witter, 1981; Lindquist & Craig, 1988;
Xavier & Ingham, 1997; Sergelidis & Abrahim, 2009). El valor DT corresponde a los
datos obtenidos en ambas fases de las curvas de muerte térmica, mientras el valor
DL concierne únicamente al comportamiento de las células en la segunda fase,
siendo éste último valor superior en todos los tratamientos llevados a cabo con
Salmonella spp (Tabla 6). Al ser mayor éste valor se presume que la cepa genera
mayor termorresistencia luego de sufrir injuria bacteriana, indicando a su vez que la
cepa podría emplear algunos de los mecanismos descritos anteriormente para
protegerse del calor.
Caso contrario sucede con la cepa de Salmonella enteritidis, empleada como punto
de referencia para los ensayos, en donde el valor DL es menor que el DT (Tabla 7).
Esto puede deberse a que el comportamiento de la cepa fue diferente al exhibido
por el microorganismo de estudio. S. enteritidis no presentó comportamiento bifásico
ni recuperación durante el tratamiento térmico, lo cual podría suponer que no sufrió
de injuria bacteriana, y por ende, no desarrolló mecanismos de termorresistencia,
aunque se ha reportado en S. enteritidis la sobre-expresión de 2 proteínas de pesos
55
moleculares de 75 y 60 kDa luego de un tratamiento térmico, sugiriendo que se trate
posiblemente de proteínas de choque térmico (Xavier & Ingham, 1997). Sin
embargo, en este estudio no se podría sugerir que la cepa de referencia haya
sufrido de injuria, y por ende, hubiese exhibido algún mecanismo de
termorresistencia más allá del que le confieren sus proteínas regulares de
membrana y los componentes del medio.
De lo anteriormente dicho, se puede resaltar la forma como los microorganismos
patógenos para la salud pública presentes en el medio ambiente han desarrollado
mecanismos de protección que contrarrestan las metodologías empleadas por el
hombre para su destrucción. De esta manera, sobresale la necesidad de realizar
controles adecuados a los productos agrícolas, y principalmente, del buen manejo
que debe hacerse de la temperatura en el proceso de compostaje si se desean
producir bioinsumos confiables de excelente calidad.
56
7. CONCLUSIONES
• La cepa aislada de compost se logró caracterizar como Salmonella spp.
• Se determinó tanto la temperatura como el tiempo necesarios para la muerte
de Salmonella spp. en un microambiente a base de material para
compostaje, siendo éste de 3 semanas a 70ºC, identificando además la
correlación existente entre la disminución del pH y la subsiguiente ausencia
del microorganismo.
• El medio BHI ajustado a pH 7.0 le confiere mayor termorresistencia al
microorganismo en comparación con el caldo compost (pH 7.0) y con el
caldo BHI ajustado a pH de 5.5, permitiendo determinar la sensibilidad de la
cepa a pH’s ácidos incluso en medios nutritivos.
• Fue posible establecer el valor DL y DT (Lineal – Tails “colas”) para cada uno
de los tratamientos a causa de la injuria bacteriana sufrida por la cepa,
siendo el valor DT el que presenta una disminución del 90% de la población
inicial en un menor tiempo de tratamiento.
57
8. RECOMENDACIONES
• Se hace necesario cuantificar en el microcosmos otros microorganismos
presentes como coliformes y Escherichia coli ya que estos influyen en el
comportamiento de Salmonella spp. y dificultan su adecuada recuperación.
• Realizar las curvas de muerte térmica en intervalos de tiempo más cortos a
fin de establecer con más exactitud el momento en el que se presenta la
injuria bacteriana, además de poder calcular valores D más precisos.
• Se recomienda el seguimiento de Salmonella en un compost en condiciones
reales inoculado artificialmente donde se puedan medir otras variables.
58
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10. ANEXOS
ANEXO 1. Preparación del caldo compost
Composición Cantidad (g/L)
Compost 30
Peptona de caseína 25
Preparación:
1. Adicionar 30g de compost tamizado en 1L de agua destilada. Llevar a
calentar hasta disolver totalmente.
2. Autoclavar a 15Lb de presión durante 15 minutos.
3. Licuar hasta lograr homogeneidad
4. Pasar por un colador para retener partículas de gran tamaño.
5. Adicionar peptona de caseína al 2.5%
6. Autoclavar a 15Lb de presión durante 15 minutos.
Observaciones:
• Para la preparación del caldo compost sin filtrar se omitió el paso 4, los
demás se realizaron tal y como esta descrito.
72
ANEXO 2. Resultados Número Más Probable de Salmonella spp. según el Método de la
EPA Nº 1682/2006
1. Fase de enriquecimiento
Concentración Muestra 10ml TSB 3x 5ml TSB 3x 10ml TSB 1x
M1 5 4 4 M2 5 5 4
S1-10A 3 0 0 S1-10B 2 0 0 S1-10C 1 1 0
S1-100A 0 5 0 S1-100B 0 5 5 S1-100C 5 0 0 S2-10A 3 0 0 S2-10B 5 0 0 S2-10C 5 0 0
S2-100A 4 0 0 S2-100B 2 4 0 S2-100C 5 0 0
S3 0 0 0 S4 0 0 0 S5 0 0 0 S6 0 0 0
S7 0 0 0 S8 0 0 0 S9 0 0 0
M1: Muestra de compost inoculada con 10 M.O
M2: Muestra de compost inoculada con 100 M.O
S1: Número de la semana en la cual se realiza el muestreo
10-100: Número de células/g inoculados a la muestra (Salmonella spp.)
A,B,C: Número de replicas
2. Comportamiento de pH en microcosmos estudio y control
Semana Estudio Control 0 6.6 6.6 1 6.4 6.3 2 6.7 6.7 3 6.1 6.1 4 5.9 5.9 5 5.2 5.2 6 4.9 4.8 7 4.7 4.7
8 4.5 4.6 9 4.6 4.6
73
3. Porcentaje de peso seco
Muestra Peso húmedo (g) % Peso Seco Promedio % Peso Seco
M1 15.0 77.5 77.5
M2 15.0 76.2 76.2
S1-10A 15.0 34.4
S1-10B 15.0 33.0
S1-10C 15.0 37.1
34.88
S1-100A 15.2 34.3
S1-100B 15.0 34
S1-100C 15.3 37.9
35.41
S2-10A 15.0 28.2
S2-10B 15.0 33
S2-10C 15.2 23.1
28.14
S2-100A 15.0 30.5
S2-100B 15.0 31.3
S2-100C 15.0 27.3
29.73
S3-10A 15.1 24.2
S3-10B 15.0 21.4
S3-10C 15.0 25.6
23.78
S3-100A 15.2 38.1
S3-100B 15.1 32.4
S3-100C 15.0 36.6
35.75
S4-10A 15.2 40.8
S4-10B 15.0 44
S4-10C 15.0 39.3
41.38
S4-100A 15.0 36
S4-100B 15.0 34
S4-100C 15.1 31.8
34
S5-10A 15.0 43.3
S5-10B 15.0 38.6
S5-10C 15.2 40.1
40.70
S5-100A 15.1 45.1
S5-100B 15.1 47.7
S5-100C 15.0 42.6
45.15
S6-10A 15.0 30.3
S6-10B 15.0 34.6
S6-10C 15.3 38.5
34.50
S6-100A 15.0 31.2
S6-100B 15.0 28
S6-100C 15.0 32.6
30.64
S7-10A 15.0 52.5
S7-10B 15.0 48.2
S7-10C 15.0 44.5
48.4
S7-100A 15.0 48.4
S7-100B 15.0 55.3
S7-100C 15.0 45.6
49.76
S8-10A 15.0 56.3
S8-10B 15.0 60.2
S8-10C 15.0 52.5
56.33
S8-100A 15.0 46.4
S8-100B 15.0 55.3
S8-100C 15.0 59.6
53.76
S9-10A 15.0 62.5
S9-10B 15.0 64.6
S9-10C 15.0 53.7
60.26
S9-100A 15.0 68.4
S9-100B 15.0 58.1
S9-100C 15.0 51.6
59.36
74
4. Resultado NMP/4g
Muestra NMP/4g M1 17.93 M2 84.46
S1-10 A 2.96 S1-10 B 1.88 S1-10 C 1.55 S1-100 A 4.6 S1-100 B 4.6 S1-100 C 5.79 S2-10 A 3.61 S2-10 B 6.65 S2-10 C 9.48 S2-100 A 4.99 S2-100 B 6.98 S2-100 C 8.035
S3-10 A.B.C 1.08 S3-100 A.B.C 0.72 S4-10 A.B.C 0.62 S4-100 A.B.C 0.76
S5-10 A.B.C 0.64 S5-100 A.B.C 0.57 S6-10 A.B.C 0.84 S6-100 A.B.C 0.62 S7-10 A.B.C 0.53 S7-100 A.B.C 0.52 S8-10 A.B.C 0.46 S8-100 A.B.C 0.48 S9-10 A.B.C 0.43 S9-100 A.B.C 0.44
M1: Muestra de compost inoculada con 10 M.O
M2: Muestra de compost inoculada con 100 M.O
S1: Número de la semana en la cual se realiza el muestreo
10-100: Número de células/g inoculados a la muestra (Salmonella spp.)
A,B,C: Número de replicas
75
5. Fase de enriquecimiento del control
Concentración Muestra 10ml TSB 3x 5ml TSB 3x 10ml TSB 1x
C0 5 4 2 C1 0 0 0 C2 0 0 0 C3 0 0 0 C4 0 0 0 C5 0 0 0
C6 0 0 0 C7 0 0 0 C8 0 0 0 C9 0 0 0
6. Porcentaje de peso seco control
Muestra Peso húmedo (g) % Peso Seco C0 15.0 80.0
C1 15.0 41.33 C2 15.1 34.50 C3 15.0 25.80 C4 15.0 45.95 C5 15.2 49.80 C6 15.0 40.55 C7 15.1 48.65 C8 15.0 55.70 C9 15.0 58.95
7. Resultado NMP/4g Control
Muestra NMP/4g C0 11.6 C1 0.63 C2 0.75 C3 1.0 C4 0.56
C5 0.52 C6 0.64 C7 0.53 C8 0.46 C9 0.44
76
ANEXO 3. RECUENTOS CURVAS DE MUERTE TÉRMICA
1. Salmonella spp. 50ºC en caldo BHI
2. Salmonella spp. 60ºC en caldo BHI
Curva Muerte Térmica Salmonella spp 60ºC
Tiempo (min) R1 (Antilog UFC/ml) R2 (Antilog UFC/ml) R3 (Antilog UFC/ml) X SD Error
0 9,36 9,46 9,43 9,42 0,051 0,03
15 5,1 5 4,9 5 0,1 0,06
30 4,5 4,3 4,25 4,35 0,13 0,075
45 5,36 5,11 5,2 5,22 0,13 0,075
60 5,11 5,11 5,2 5,14 0,052 0,03
75 5,04 5,1 5,1 5,08 0,035 0,02
90 5,04 5 5 5,01 0,023 0,013
105 4,9 4,84 5 4,91 0,081 0,05
120 4,47 4,47 4,3 4,41 0,1 0,06
Curva Muerte Térmica Salmonella spp 50ºC
Tiempo (min) R1 (Antilog UFC/ml) R2 (Antilog UFC/ml) R3 (Antilog UFC/ml) X SD Error
0 9,11 9,1 9,4 9,2 0,17 0,1
15 8,3 8,3 8,3 8,3 0 0
30 8 7,93 7,97 7,96 0,035 0,02
45 7,11 7,1 7,14 7,11 0,021 0,012
60 6,84 7 6,95 6,93 0,082 0,05
75 6,54 6,71 6,6 6,61 0,086 0,05
90 6,41 6,3 6 6,23 0,21 0,12
105 6,04 6,11 6,11 6,08 0,04 0,023
120 5,75 5,86 5,82 5,81 0,055 0,032
77
3. Salmonella spp. 70ºC en caldo BHI
Curva Muerte Térmica Salmonella spp 70ºC
Tiempo (min) R1 (Antilog UFC/ml) R2 (Antilog UFC/ml) R3 (Antilog UFC/ml) X SD Error
0 9,23 9,28 9,2 9,24 0,04 0,023
15 4,25 4,18 4,23 4,22 0,036 0,021
30 5,78 4,6 4,78 5,05 0,63 0,36
45 4,6 4,47 4,6 4,56 0,075 0,043
60 3 3,3 3,3 3,2 0,17 0,1
75 3,43 3,64 3,5 3,52 0,11 0,063
90 3,52 3,77 3,72 3,67 0,13 0,075
105 4,04 3,97 3,96 3,99 0,043 0,025
120 3,54 3,47 3,53 3,51 0,04 0,023
4. Salmonella spp. 80ºC en caldo BHI
Curva Muerte Térmica Salmonella spp 80ºC
Tiempo (min) R1 (Antilog UFC/ml) R2 (Antilog UFC/ml) R3 (Antilog UFC/ml) X SD Error
0 9,18 9,25 9,18 9,2 0,04 0,023
15 2,6 2,47 2,3 2,46 0,15 0,086
30 4,75 4,34 4,1 4,4 0,33 0,19
45 4,18 4,11 4,04 4,11 0,07 0,04
60 3,9 3,6 3,78 3,76 0,15 0,086
75 3,34 3,11 3,1 3,18 0,13 0,075
90 3,17 3 2,9 3,02 0,14 0,081
105 2,47 2,7 2,6 2,59 0,12 0,07
120 2,3 2,3 2,3 2,3 0 0
135 2,47 2,6 2,47 2,51 0,075 0,043
150 2 2 2,3 2,1 0,17 0,1
165 1,7 1 1,3 1,33 0,35 0,2
180 0 0 0 0 0 0
78
5. Salmonella spp. 80ºC en caldo BHI a pH 5.5
Curva Muerte Térmica Salmonella spp 80ºC pH 5.5
Tiempo (min) R1 (Antilog UFC/ml) R2 (Antilog UFC/ml) R3 (Antilog UFC/ml) X SD Error
0 9,14 9,17 9,04 9,12 0,068 0,04
15 2,47 2,6 2,3 2,46 0,15 0,086
30 2,9 2,95 2,84 2,90 0,055 0,032
45 3,14 2,95 2,78 2,96 0,18 0,1
60 4,04 3,99 3,94 3,99 0,05 0,03
75 3,04 3,1 3,1 3,08 0,034 0,02
90 2,47 2,3 2,3 2,36 0,098 0,056
105 0 0 0 0 0 0
6. Salmonella spp. 80ºC en caldo compost filtrado
Curva Muerte Térmica 80°C Caldo Compost Filtrado
Tiempo (min) R1 (Antilog UFC/ml) R2 (Antilog UFC/ml) R3 (Antilog UFC/ml) X SD Error
0 9,34 9,17 9,23 9,25 0,086 0,05
15 5,55 5,5 5,6 5,55 0,05 0,03
30 3,17 3,23 3,14 3,18 0,046 0,026
45 1,8 1,84 1,95 1,86 0,08 0,046
60 3,43 3,41 3,36 3,40 0,036 0,021
75 2,3 2,47 2,3 2,30 0 0
90 2,3 2,3 2,3 2,30 0 0
105 2 2 1,95 1,98 0,03 0,017
120 0 0 0 0 0 0
79
7. Salmonella spp. 80ºC en caldo compost sin filtrar
Curva Muerte Térmica 80°C Caldo Compost Sin filtrar
Tiempo (min) R1 (Antilog UFC/ml) R2 (Antilog UFC/ml) R3 (Antilog UFC/ml) X SD Error
0 9,23 9,25 9,2 9,22 0,025 0,014
15 2,6 2,7 2,7 2,66 0,06 0,035
30 1,3 1,48 1,3 1,36 0,1 0,06
45 2,95 2,95 3,04 2,98 0,052 0,03
60 1,8 1,95 1,84 2,86 0,08 0,046
75 0 0 0 0 0 0
8. Salmonella enteritidis 70ºC en caldo BHI
Curva Muerte Térmica S. enteritidis 70ºC
Tiempo (min) R1 (Antilog UFC/ml) R2 (Antilog UFC/ml) R3 (Antilog UFC/ml) X SD Error
0 9,3 9,25 9,2 9,25 0,05 0,017
15 4,6 4,3 4,3 4,4 0,17 0,057
30 4,47 4,3 4,3 4,35 0,098 0,033
45 4,6 4,3 4,3 4,4 0,17 0,057
60 4,78 4,6 4,3 4,56 0,24 0,08
75 4,9 4,95 4,9 4,91 0,028 0,01
90 4,84 5,04 4,95 4,94 0,1 0,033
105 3,04 3,28 3,1 3,14 0,12 0,04
120 2,36 2,1 2,2 2,22 0,13 0,043
135 1 1 1 1 0 0
80
ANEXO 4. RECUENTOS Y ABSORBANCIAS DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO
1. Recuentos curva crecimiento Salmonella enteritidis
Curva Crecimiento Salmonella enteritidis
Tiempo (min) R1 (Antilog UFC/ml) R2 (Antilog UFC/ml) R3 (Antilog UFC/ml) X SD Error
0 7,98 8 7,98 7,99 0,012 0,007
120 8,3 8,25 8,3 8,28 0,029 0,016
240 9,08 9,1 9 9,06 0,053 0,03
360 9,23 9,18 9,11 9,17 0,06 0,033
480 9,23 9,18 9,23 9,21 0,03 0,017
600 9,25 9,18 9,23 9,22 0,036 0,02
720 9,25 9,2 9,25 9,23 0,03 0,017
840 8,97 8,99 8,97 8,98 0,011 0,006
2. Recuentos curva de crecimiento Salmonella spp.
Curva Crecimiento Salmonella spp
Tiempo (min) R1 (Antilog UFC/ml) R2 (Antilog UFC/ml) R3 (Antilog UFC/ml) X SD Error
0 6,93 6,97 6,91 6,94 0,03 0,017
120 7,53 7,54 7,62 7,56 0,05 0,028
240 8,04 7,96 7,98 7,99 0,042 0,024
360 8,52 8,11 8,6 8,41 0,26 0,15
480 9 9,1 9,11 9,07 0,061 0,035
600 8,34 8,6 8,65 8,53 0,16 0,092
720 8,28 8,5 8,67 8,48 0,2 0,11
840 8,25 8,46 8,6 8,44 0,18 0,1
81
3. Absorbancia curva de 4. Absorbancia curva de crecimiento S. enteritidis crecimiento Salmonella spp.
Tiempo (min) Abs 540nm
0 0,213
15 0,273
30 0,434
45 0,692
60 0,939
75 1,046
90 1,194
105 1,304
120 1,428
240 1,656
360 1,838
480 1,984
600 1,952
720 1,926
840 1,92
900 1,916
Tiempo (min)
Abs (540 nm)
0 0,24
15 0,264
30 0,324
45 0,44
60 0,492
75 0,612
90 0,7
105 0,808
120 0,924
240 1,926
360 2,112
480 2,31
600 2,358
660 2,382
720 2,364
780 2,352
