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EVALUACIÓN DEL YM976 COMO ALTERNATIVO A LAS HORMONAS GONADOTRÓPICAS

EN LA MADURACIÓN IN VITRO DE OOCITOS BOVINOS Y SU COMPETENCIA PARA EL

DESARROLLO EMBRIONARIO.

Diego Fernando Carrillo González

Universidad Nacional de Colombia

Sede Medellín

Facultad De Ciencias

2011

1

EVALUACIÓN DEL YM976 COMO ALTERNATIVO A LAS HORMONAS GONADOTRÓPICAS

EN LA MADURACIÓN IN VITRO DE OOCITOS BOVINOS Y SU COMPETENCIA PARA EL

DESARROLLO EMBRIONARIO.

Diego Fernando Carrillo González

Tesis de grado presentada para optar al título de

Magíster en Ciencias - Biotecnología

Director

Neil Vásquez Araque Biol., MSc., (c)Dr.

Línea de investigación en Biotecnología Animal

Producción in vitro de embriones

Grupo de Investigación Biotecnología Animal

Universidad Nacional de Colombia

Sede Medellín

Facultad De Ciencias

2011

2

AGRADECIMIENTOS

A mi familia, en especial a mis padres Beatriz González y Héctor Carrillo quienes con su

colaboración y apoyo incondicional, permitieron el poder desarrollar todas las actividades

propuestas para este estudio.

A mi profesor Neil Vásquez por su colaboración como asesor, tutor y amigo, al contribuir

en mi proceso de formación académica y en la ejecución del presente trabajo.

A la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín y al grupo de Biotecnología Animal

por proporcionarme la infraestructura necesaria para la realización de este trabajo.

A mis compañeros de trabajo en laboratorio y amigos por todo el apoyo incondicional

recibido durante este proceso de formación, especialmente a Yasser Lénis Sanín, Ana

María Mesa y Juan Camilo Zuluaga, quienes en cada uno de los logros alcanzados, siempre

han estado presentes.

A la Central Ganadera de Medellín y especialmente al Dr. Francisco Valencia, por su

colaboración en el aporte del material biológico.

3

RESUMEN

El AMPc juega un papel importante en la maduración del oocito. Los inhibidores

fosfodiesterasa tipo 4 como el YM976 inducen un aumento en la concentración

intracelular de AMPc, que conduce a la activación de la maduración del oocito. Objetivo.

Evaluar el efecto del YM976 sobre la maduración in vitro de oocitos y su competencia para

el desarrollo embrionario.

Materiales y Métodos. Los Complejos Cúmulo-Oocito se obtuvieron por aspiración

folicular y madurados in vitro por 24h en medio TCM-199 suplementado con el inhibidor

YM976 (1nM, 10nM, 100nM y 1000nM) o gonadotropinas (LH y FSH). La expansión se

evaluó bajo los criterios de Calder y col., 2003 y la metafase II por tinción con Hoechst.

Posteriormente fueron fertilizados y cultivados en medio KSOM Evolve por 7 días, bajo

condiciones de 5% CO2, 38,5°C y 95% de humedad. Resultados. Los resultados muestran

un mayor porcentaje de expansión grado 3 (p<0,05) con gonadotropinas (81%) que con

YM976 1nM y 10nM (24,83% y 23,21%). El porcentaje de metafase II no presento

diferencias entre gonadotropinas (79,62%) y YM976 10nM (88,33%), pero fueron mayores

(p <0.05) que YM976 1nM (60,39%). Sin embargo, no hubo diferencia entre

gonadotropinas, YM976 1nM y 10nM en la tasa de clivage (72,74%, 73,55% y 62,73%) y de

blastocistos (21,03%, 26,18% y 22,96%). Conclusiones. El inihibidor de PDE4 YM976

disminuye la expansión de las células del cúmulo, pero los oocitos madurados con YM976

1nm y 10nM tienen una competencia para el desarrollo embrionario similar a los oocitos

madurados con gonadotropinas.

Palabras clave: Clivaje, embriones, expansión, fosfodiesterasas tipo 4, maduración in vitro,

oocito.

4

ABSTRACT

The cAMP plays an important role on the oocyte maturation. The Phosphodiesterase type

4 inhibitors such as YM976 induce an increase in the intracellular concentration of cAMP

which leads to the activation of the oocyte maturation. Objective. To evaluate the effect

of the YM976 on oocytes in vitro maturation and its embryonic developmental

competence. Materials and Methods. The cumulus-oocyte complexes were obtained by

follicular aspiration and matured in vitro for 24 h in medium TCM-199 supplemented with

YM976 inhibitor (1nM, 10nM, 100nM and 1000nM) or gonadotropins (LH and FSH). The

expansion was evaluated by the criteria of Calder et al., 2003 and metaphase II by staining

with Hoechst. They were then fertilized and cultured in KSOM Evolve media for seven days

under 5% CO2, 38.5°C and 95% humidity conditions. Results. The results showed a higher

expansion grade 3 percentage (p <0.05) with gonadotropins (81%) than Ym976 1nM and

10nm (24.83% and 23.21%). The metaphase II percentage did not differ between

gonadotropins (79,62%) and YM976 10nM (88,33%), but they were higher (p <0.05) than

YM976 1nM (60,39%). However, there was no difference between gonadotropins, YM976

1nM and 10nM in cleavage rate (72,74%, 73,55% and 62,73%) and blastocysts rate

(21,03%, 26,18% and 22,96%). Conclusions. YM976 PDE4 Inihibidor decreases in the

expansion of cumulus cells, but oocytes matured with YM976 1nM and 10nM have

embryonic developmental competence similar to oocytes matured with gonadotropins.

Keywords: Cleavage, embryos, expansion, in vitro maturation, oocyte, phosphodiesterase

type 4.

5

CONTENIDO

AGRADECIMIENTOS 2

RESUMEN 3

INDICE DE TABLAS 8

LISTA DE FIGURAS 11

1. INTRODUCCION 12

2. MARCO TEÓRICO 14

2.1 Maduración del oocito 14

2.2 Maduración Citoplasmática 14

2.3 Maduración nuclear del oocito 15

2.3.1 Regulación y modulación de la maduración in vitro del oocito 16

2.3.2 Regulación del AMPc 16

2.4 Inhibidores de Fosfodiesterasas del AMPc 17

3 OBJETIVOS 20

3.1 Objetivo general 20

3.2 Objetivos específicos 20

4 METODOLOGÍA 21

4.1 Localización 21

4.2 Procesamiento del material de estudio 21

4.2.1 Aspiración y Maduración in vitro 21

6

4.2.2 Grupos Experimentales 22

4.2.3 Evaluación del efecto del inhibidor de PDE tipo 4, YM976, sobre el

grado de mucificación del Complejo Cúmulo Oocito y el

porcentaje de maduración nuclear de oocitos bovinos in vitro

23

4.2.4 Fertilización y desarrollo in vitro 23

4.2.5 Evaluación del porcentaje de clivaje obtenido de oocitos

madurados in vitro en presencia de gonadotropinas ó en

presencia del inhibidor de PDE tipo 4 YM976

24

4.3 Análisis Estadístico 25

5 RESULTADOS 27

5.1 Objetivo específico número uno: Determinación del grado de

expansión de las células del cúmulo en presencia del inhibidor de

PDE4 YM976

27

5.2 Objetivo específico número uno: Determinación del porcentaje de

maduración nuclear in vitro de oocitos bovinos

32

5.3 Objetivo específico número dos: Determinación del porcentaje de

embriones bovinos producidos in vitro en etapa de clivaje, a partir

de oocitos madurados con gonadotropinas o diferentes

concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976

34


embriones bovinos de cuatro o más células, producidos in vitro, a

partir de oocitos madurados con gonadotropinas o diferentes


36


embriones bovinos producidos in vitro, en etapa de blastocisto, a

7

partir de oocitos madurados con gonadotropinas o diferentes


38

6 DISCUSIÓN 43

7 CONCLUSIONES 47

BIBLIOGRAFÍA 49

8

INDICE DE TABLAS

Tabla 1 Grupos Experimentales de estudio para los inhibidores de

fosfodiesterasa y controles

23

Tabla 2 Análisis descriptivo de la expansión grado 3 de las células

del cúmulo en oocitos bovinos madurados in vitro con un

p<0,05

27

Tabla 3 Comparación de medias mediante el test de Tukey para

pruebas con N desigual para la expansión grado 3 de las

células del cúmulo en oocitos bovinos madurados in vitro

con un p<0,05

28



p<0,05

29




con un p<0,05.

29



p<0,05

31

Tabla 7 Comparación entre medias mediante el test de Tukey para



9

con un p<0,05 31

Tabla 8 Análisis descriptivo de la continuación de la Metafase II de

oocitos madurados in vitro.

33


pruebas con N desigual para la Metafase de oocitos bovinos

madurados in vitro con un p<0,05

33

Tabla 10 Análisis Descriptivo para las diferentes concentraciones del

inhibidor de PDE4 YM976 y gonadotropinas el clivaje de

oocitos madurados y fertilizados in vitro con un p<0,05.

35

Tabla 11 Comparación de medias mediante el test de Duncan para las

diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976 y

gonadotropinas, en el clivaje de oocitos bovinos madurados

y fertilizados in vitro; con un p<0,05

35

Tabla 12 Análisis descriptivo para las diferentes concentraciones del

inhibidor de PDE4 YM976 y gonadotropinas de embriones

en estado de cuatro o más células, producidos in vitro a

partir del total de oocitos madurados y fertilizados in vitro

37

Tabla 13 Comparación de medias mediante el test de Duncan para las

diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976 y

gonadotropinas, en embriones de cuatro o más células; con

un p<0,05

37


inhibidor de PDE4 YM976 y gonadotropinas de blastocistos

producidos in vitro a partir del total de oocitos madurados y

fertilizados in vitro

39

10

Tabla 15 Comparación de medias utilizando el test de Duncan para

las diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976

y gonadotropinas, en tasa de blastocistos a partir de oocitos

bovinos madurados y fertilizados in vitro; con un p<0,05

39


inhibidor de PDE4 YM976 y gonadotropinas de blastocistos

producidos in vitro a partir de oocitos clivados in vitro con

un p<0,05

41

Tabla 17 Comparación de medias utilizando el test de Duncan para

las diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976

y gonadotropinas, en tasa de blastocistos a partir de oocitos

bovinos clivados in vitro; con un p <0,05

41

11

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Expansión grado 3 de las células del cúmulo de oocitos

bovinos a las 24 horas

28


bovinos a las 24 horas de maduración in vitro

30


bovinos a las 24 horas de maduración in vitro

32

Figura 4 Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la maduración

nuclear in vitro de oocitos bovinos a las 24 horas de cultivo

34

Figura 5 Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la tasa de clivaje

de oocitos bovinos fertilizados a las 24 horas de maduración

in vitro

36

Figura 6 Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la tasa de

embriones en estado de 4 o más células a las 72 hpi

38


embriones a partir de oocitos bovinos fertilizados a las 24

horas de maduración in vitro

40


embriones a partir de oocitos bovinos clivados in vitro

42

12

INTRODUCCIÓN

El inventario ganadero en nuestro país has sido similar a través de los últimos años con un

valor aproximado de 23.500.000 de cabezas de ganado, del cual se producen para el

consumo en promedio 4.054.485 cabezas (fedegan 2008). Algunas tecnologías

reproductivas tales como la superovulación y la transferencia de embriones han sido

usadas como herramientas en la búsqueda de mejorar estas tazas de producción. Es en

esta misma búsqueda donde aparecen en nuestro país nuevas herramientas tales como la

producción de embriones in vitro (PIVE) la cual ha tomado mucho auge por su aplicación

en programas de mejoramiento genético y porque los costos de producción son más bajos

en comparación a otros procesos.

Adicionalmente, esta biotecnología ha permitido la investigación básica en los

mecanismos de la maduración de oocitos, fertilización y desarrollo embrionario,

generando grandes aportes sobre las condiciones de cultivo y factores hacia la búsqueda

de una eficiente producción de embriones in vitro de buena calidad. Las técnicas de

producción in vitro de embriones (PIVE) son atractivas debido a las posibilidades de

disminuir los costos de producción de embriones para la transferencia, el diagnóstico

molecular preimplantatorio, la clonación de células somáticas o de embriones y para la

producción de bovinos transgénicas.

La obtención de un embrión de buena calidad depende en gran parte de la competencia

del oocito para reanudar la meiosis y la capacidad para el desarrollo después de la

fertilización. Esta competencia la adquiere el oocito durante su crecimiento en la dinámica

13

folicular, sin embargo, en los procesos de maduración in vitro, el oocito es aspirado de un

folículo que no ha alcanzado su máximo tamaño para ovular y es cultivado por 24 horas en

presencia de las gonadotropinas FSH y LH, sin embargo la eficiencia y calidad de los

embriones producidos bajo estas condiciones es baja (Rizos et. al. 2002).

Lo anterior ha conducido a la búsqueda de modificaciones en los protocolos de

producción in vitro de embriones, siendo una alternativa el uso de inhibidores de las

enzimas fosfodiesterasa del AMPc (Thomas et al., 2004). Resultados previos obtenidos en

nuestro grupo, demostraron que el Rolipram, (un inhibidor de fosfodiesterasas tipo 4

PDE4), puede reemplazar la acción de las hormonas gonadotrópicas FSH y LH durante el

proceso de maduración in vitro de oocitos bovinos (López et al., 2008). Sin embargo la

especificidad de este inhibidor (Rolipram) por las fosfodiesterasas es del orden

micromolar e inhibe otras fosfodiesterasas en otros tejidos, presentando efecto

colaterales. De esta manera se ha desarrollado modificaciones desarrollando nuevas

generaciones de inhibidores con constantes de inhibición mucho más bajas (Huang et al.,

2001), que podrían generar una maduración de oocitos igual o mejor al obtenido con las

gonadotropinas y una óptima competencia para el desarrollo de embriones bovinos

producidos in vitro.

14

1. MARCO TEÓRICO.

La habilidad de un oocito para generar un individuo no es un proceso simple, por lo tanto,

el hecho que se realicen los primeros eventos no garantiza los eventos subsecuentes. Se

ha demostrado que estos eventos están asociados con el proceso de maduración del

oocito, durante la cual el oocito adquiere diferentes competencias o habilidades, que se

pueden describir en cinco niveles, cada uno dependiente del anterior: la habilidad del

oocito para continuar la meiosis, para clivar después de la fertilización, el desarrollo hasta

la etapa de blastocisto, la habilidad de implantarse y generar una gestación, y por último

generar un individuo a término. (Sirard et al., 2006)

1.1. Maduración del oocito.

En el ovario, el oocito se encuentra en un bloqueo meiótico (profase I, etapa de vesícula

germinal-GV) por muchos meses o años hasta que son ovulados o degenerados. La

maduración del oocito es iniciada durante el crecimiento folicular y es completada por el

pico preovulatorio de LH el cual induce la ovulación. Esta maduración del oocito involucra

cambios a nivel citoplásmico y nuclear, que capacitan al oocito para los posteriores

eventos como la fertilización y el desarrollo embrionario (Mayes, 2002).

1.2. Maduración Citoplasmática

La maduración citoplasmática involucra transformaciones que preparan al oocito para la

fertilización y el desarrollo embrionario preimplantatorio (Eppig, 1996; Sirard et al., 1989),

y comprende los cambios ultraestructurales que ocurren en el oocito durante el

15

crecimiento folicular desde el estadio de vesícula germinal hasta metafase II (Ducibella et

al., 1994; Duranthon y Renard, 2001; Hyttel et al., 1986a; Hyttel et al., 1986b; Shamsuddin

et al., 1993). Estos cambios ultraestructurales incluyen la migración de la vesícula germinal

cerca de la zona pelúcida, la síntesis y acumulación de los diferentes tipos de RNA,

ribosomas y polipéptidos (Whitaker, 1996), la localización de las mitocondrias en la

periferia del oocito, el aumento en el número de vesículas en el aparato de golgi y en los

niveles de glutation, la translocación de los gránulos corticales desde el centro del oocito

hacia la periferia y su posterior unión a la membrana plasmática (Fair et al, 1997).

1.3. Maduración nuclear del oocito

Durante el crecimiento folicular el oocito adquiere la competencia meiótica, la cual se

refiere a la capacidad del oocito para completar el ciclo meiótico o maduración nuclear.

Ésta es adquirida progresivamente durante el crecimiento folicular y está estrechamente

relacionada con el tamaño del oocito y éste a su vez con el tamaño del folículo (2 a 3 mm)

(Fair et al., 1997; Fair et al, 2001). El oocito se encuentra detenido en profase de la meiosis

I, desde la vida embrionaria hasta que se da el pico preovulatorio de LH; en respuesta a

éste, la meiosis continúa hasta metafase II, estadío en el que ocurre el segundo freno

meiótico. Como consecuencia el folículo expulsa un oocito completamente maduro

(ovulación) y apto para ser fecundado (Tsafriri y Channing, 1975; Whitaker, 1996). Este

proceso de continuación de la meiosis involucra la desintegración de la envoltura nuclear

(GVBD, Germinal Vesicle Break Down), la condensación de cromosomas, la formación del

huso en metafase I, la separación de cromosomas homólogos con expulsión del primer

cuerpo polar y el freno en metafase II (Kubelka, et al., 1988; Salomone et al, 2001). El

oocito de bovino requiere un periodo de 24 horas para completar únicamente la

maduración nuclear in vitro (Sirard, 1989; Sirard et al., 1989).

16

2.3.1 Regulación y modulación de la maduración in vitro del oocito

En los procesos de maduración in vitro (MIV), los complejos cúmulo oocito (CCO)

aspirados de folículos con un diámetro entre 3 y 8 mm (Thomas et al., 2002), completan

su maduración en 24 horas, mediante el uso de gonadotropinas, reflejada en la expansión

o mucificación del cúmulo, la continuación de la meiosis y la expulsión del primer cuerpo

polar (Wassarman y Albertini, 1994; Eckert y Niemann, 1995).

Las gonadotropinas FSH y LH se unen a receptores en las células de la granulosa del CCO,

la vía de señalización es la mediada por proteína G, la cual a su vez activa la adenilato

ciclasa, enzima que induce la producción de 3´, 5´- adenosín monofosfato cíclico (AMPc) a

partir del adenosín trifosfato (ATP). Los altos niveles de AMPc en las células de la

granulosa inducen la mucificación caracterizada por el desacoplamiento de las uniones

gap (Calder et al., 2003) y la secreción de ácido hialurónico (Salustri et al., 1992; Fulop et

al., 1997), disminuyendo los niveles de AMPc intraoocitario, el cual es el principal factor

involucrado en el freno meiótico, permitiendo la continuación de la meiosis y por tanto la

maduración nuclear (Tsafriri et al, 1996). Esta acción inhibitoria de la meiosis es mediada

por la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA), la cual inactiva por fosforilación a la

proteína fosfatasa cdc25, responsable de la activación del factor promotor de la

maduración (MFP), que induce la continuación de la meiosis (Jones, 2004; Josefsberg y

Dekel, 2002)

2.3.2 Regulación del AMPc

Durante la continuación de la meiosis estimulada por el pico preovulatorio de FSH y LH,

los niveles de AMPc intraoocitario descienden debido a la disminución de la expresión de

conexinas formadoras de las uniones gap (Calder et al., 2003) y por la hidrólisis del AMPc a

su forma inactiva 5´-AMP (Conti et al., 2002), reacción catalizada por fosfodiesterasas

(PDE). En los mamíferos, estas enzimas son codificadas por al menos 15 genes, agrupados

en 12 familias funcional y estructuralmente relacionadas (Spaulding, 1993; Muller et al.,

17

1996; Conti, 2000). Cada familia de enzimas es bloqueada por inhibidores específicos

(Soderling y Beavo, 2000; Tsafriri et al., 1996) y no específicos (Wagner et al., 1996;

Jackson et al., 1997; Nichols, 2000). La expresión de estas enzimas es específica de tejido

en la unidad folicular, el oocito bovino expresa la PDE tipo 3, mientras que en las células

de la granulosa se expresa la PDE tipo 4 (Tsafriri et al, 1996), sin embargo aún no se

conoce cuales genes (PDE3 A-B; PDE4 A-B-C-D) se expresan o qué variantes generadas por

splicing alternativo de PDEs se presentan en la unidad folicular bovina.

2.4 Inhibidores de Fosfodiesterasas del AMPc

Las fosfodiesterasas (PDE) son las enzimas responsables de la hidrólisis del AMPc, y el

aumento de éste, puede lograrse por la inhibición específica de estas enzimas. La alta

heterogeneidad en las familias de PDE y su distribución específica de tejido, hace de estas

enzimas puntos estratégicos para el diseño de medicamentos y su evaluación en

diferentes áreas de investigación. (Piaz y Giovannoni, 2000).

En el área de la reproducción, se han evaluado diversos tipos de inhibidores de

fosfodiesterasas específicos e inespecíficos. Entre los inhibidores inespecíficos están la

teofilina (inhibidor reversible) con un 41% de oocitos madurados in vitro (datos no

publicados del laboratorio de Biotecnología Animal de la Universidad Nacional de

Colombia-Sede Medellín) y 41% para el IBMX (inhibidor irreversible) (Sirard y First, 1988),

estos porcentajes de maduración son bajos comparados con los obtenidos con

gonadotropinas (Thomas et al., 2002). Los inhibidores específicos de PDE tipo 3 (localizada

en el oocito), como la Cilostamida y la Milrinona tienen un efecto bloqueador reversible

de la maduración del oocito de mamíferos, sin afectar la viabilidad del oocito, ni el

proceso ovulatorio (Jensen et al., 2002; Mayes y Sirard 2002). Mientras que los inhibidores

de PDE tipo 4, como el Rolipram (ciclopentiloxi-metoxifenil-pirrolidona), es un compuesto

con una actividad biológica variada, destacándose por sus efectos antiinflamatorio,

18

inmunosupresor, antidepresivo, antiparkinsoniano y neuroprotector (Demnitz et al.,

1998). Además se ha encontrado que disminuye la producción del factor de necrosis

tumoral (TNF); aumenta la producción de interleuquina 10 (IL-10) (Soares et al., 2003) y

promueve la regeneración de axones neuronales (Nikulina et al., 2004). Sin embargo, el

Rolipram presenta efectos adversos como náuseas y vómito (Lugnier, 2006).

En estudios realizados por nuestro grupo, se demostró que la maduración del oocito

inducida por gonadotropinas puede ser igualada aumentando los niveles de AMPc en las

células de la granulosa, utilizando como único estímulo Rolipram, confirmando la

compartimentalización de fosfodiesterasas (Tsafriri et al, 1996) y de AMPc en la unidad

folicular (Conti et al., 2002; Mayes y Sirard, 2002). Además se encontró que la maduración

de los oocitos en presencia de inhibidores de PDE4 produce oocitos competentes para los

procesos de fertilización y clivaje, sin embargo se debe buscar inhibidores que no generen

estos efectos colaterales y evaluar su eficiencia en la maduración in vitro de oocitos, para

su implementación en protocolos de producción de embriones. Las herramientas

computacionales y bioquímicas han generado recientes investigaciones que permiten

comprender las interacciones moleculares entre las enzimas PDE4 y sus inhibidores, la

expresión y función específica de las isoenzimas de PDE4, ha permitido el diseño de una

nueva generación de moléculas inhibidoras de PDE4 más específicas, tales como el

YM976, entre otros, con un gran potencial terapéutico en la clínica, disminuyendo o en

algunos casos anulando sus efectos colaterales observados con otros inhibidores

(Rolipram) (Huang et al., 2001).

Debido a su alta especificidad es un medicamento candidato para evaluar en los

protocolos de producción in vitro de embriones, sin embargo no se han realizado estudios

sobre maduración in vitro de oocitos de bovino, utilizándolo como único estímulo, en

19

ausencia de gonadotropinas, y la posterior producción de embriones in vitro, conociendo

que la constante de inhibición es mucho menor que la del Rolipram (Huang et. al 2001).

Medicamento IC50

PDE 4 B PDE 4 D

Ym976 2,2nM

Rolipram 570nM 1,1µM

Tomado de Huang et. al 2001

20

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo general

Evaluar el efecto del inhibidor de PDE4, YM976 sobre la maduración in vitro de oocitos

bovinos y la capacidad para formar embriones después de la fertilización.

3.2 Objetivos específicos

Evaluar el efecto del inhibidor de PDE tipo 4, YM976, sobre el grado de mucificación del

Complejo Cúmulo Oocito y el porcentaje de maduración nuclear de oocitos bovinos in

vitro.

Comparar el porcentaje de clivaje y de desarrollo embrionario obtenido de oocitos

madurados in vitro en presencia de gonadotropinas con el obtenido en presencia del

inhibidor de PDE tipo 4 YM976

21

4 METODOLOGÍA

4.1 Localización

El trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología Animal de la Universidad

Nacional de Colombia sede Medellín, ubicado en la Calle 59A No. 63-020, Bloque 19A -

113, a 1538 metros sobre el nivel del mar, con una precipitación promedio de 1571 mm

de agua y una temperatura promedio de 24° Centígrados.

4.2 Procesamiento del material de estudio

Los ovarios de bovino fueron obtenidos de hembras en ciclo reproductivo sacrificadas en

la Central Ganadera de Medellín. Los ovarios disectados a partir del tracto reproductivos

de las hembras poseían en al menos uno de ellos, una unidad de cuerpo lúteo; una vez

retirados del tracto, fueron depositados en solución tampón de fosfato salino (PBS) estéril

a 37°C para luego ser transportados (30 minutos aproximadamente) hacia el Laboratorio

de Biotecnología Animal de la Universidad Nacional Sede Medellín para su

procesamiento.

4.2.1 Aspiración y Maduración in vitro:

En el laboratorio, bajo condiciones asépticas fueron lavados los ovarios tres veces con PBS

a 37ºC para retirar material contaminante, sangre y detritus tisular. Luego con aguja

N°18 en jeringa de 5 mL, se procedió a la aspiración de los folículos con un diámetro de 3

a 8mm y el líquido fue recolectado en tubos cónicos de 15 mL a 37ºC. Una vez se

terminó este proceso, se descartó el sobrenadante y, el precipitado se resuspendió en

22

5mL de medio TCM-199 HEPES modificado con sales de Earle (Sigma M2520)

suplementado con 0,275 mg/mL de ácido pirúvico (Sigma P2506), 0,029 mg/mL de

glutamina (Sigma G9003), 100 UI/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina, 0.25

mm. Bajo visión con estereomicroscopio Nikon SMZ-645 se seleccionaron los Complejos

Cúmulo Oocito (CCO) de buena calidad, los cuales poseen varias capas compactas de

células de la granulosa. Los CCO seleccionados son lavados tres veces en medio TCM 199

y en grupos de diez CCO cultivados a 38.5°C en gotas de 50L de medio de maduración

suplementado con 10% de suero fetal bovino SFB (Sigma N4887), rhLH 5 µg/ml (Luveris,

Estradiol (Sigma E2758), 5% de suero fetal bovino, penicilina, estreptomicina, anfotericina

B (Sigma A5955). Las gotas fueron cubiertas con aceite mineral (Sigma M8410), en plato

de cultivo de 4 pozos. Las condiciones de cultivo fueron de 38.5°C, 5% de CO2 y 90% de

humedad relativa.

4.2.2. Grupos Experimentales

En este proceso se evaluaron diferentes concentraciones de medicamento YM976, desde

1nM, 10nM, 100nM y 1000nM, adicionados como suplemento en el medio base de

maduración y comparados con medios suplementados con gonadotropinas, también se

hizo una gota control, la cual no recibió algún estímulo en el medio base de maduración.

23

Tabla 1. Grupos Experimentales de estudio para los inhibidores de fosfodiesterasa tipo

4 y controles:

4.2.3 Evaluación del efecto del inhibidor de PDE tipo 4, YM976, sobre el grado de

mucificación del Complejo Cúmulo Oocito y el porcentaje de maduración nuclear de

oocitos bovinos in vitro.

Pasadas 24 horas de maduración in vitro, se realizó una evaluación de la expansión del

complejo cúmulo-oocito, basándose en los criterios de Calder et al.2003, (Grado 1, poco o

nada de expansión, Grado 2, expansión moderada de las capas externas del cúmulo,

Grado 3, expansión de todas las capas), mediante el uso del esteremicroscopio.

Posteriormente, los oocitos fueron desnudados y teñidos con DAPI y con el uso de un

microscopio de fluorescencia se evaluó la expulsión del primer cuerpo polar en cada uno

de ellos, en los diferentes tratamientos, para determinar el porcentaje de maduración.

4.2.4 Fertilización y desarrollo in vitro

Cumplidas las 24 horas de maduración in vitro con los diferentes estímulos

(gonadotropinas y las concentraciones del inhibidor YM976 1nM, 10nM, 100nM y

1000nM), los oocitos fueron lavados en medio de fertilización y transferidos a gotas de

24

50µl de medio de fertilización. Se utilizó semen proveniente del mismo ejemplar (Prosefo

Arafat 14190) de la planta de procesamiento San Pablo de la Universidad Nacional,

descongelado a 37°C por 1 minuto, y luego se seleccionaron los espermatozoides viables

y móviles mediante gradiente de swim up durante 45 minutos, se utilizó una

concentración final de 2 X 106/mL de espermatozoides y fueron incubados durante 18-20

horas. Las condiciones de fertilización fueron de 38.5°C, 5% de CO2 y 90% de humedad

relativa. Al finalizar el tiempo de fertilización, los presuntos cigotos fueron transferidos a

medio de cultivo KSOM Evolve por 72 horas.

4.2.5 Evaluación del porcentaje de clivaje y de desarrollo embrionario obtenido de

oocitos madurados in vitro en presencia de gonadotropinas ó en presencia del inhibidor

de PDE tipo 4 YM976.

Pasadas 72 horas por inseminación, se evaluaron los diferentes estadios de desarrollo

mediante la visualización con un microscopio invertido de contraste de fase y se

determinó el porcentaje de clivaje y de cigotos de cuatro o más células.

En el día siete de desarrollo se determinaron los porcentajes de embriones en estado de

blastocisto, mediante la visualización con un microscopio invertido de contraste de fase.

Para comprobar la presencia de embriones de cuatro o más células o de blastocistos, se

realizó tinción nuclear con Hoechst 33342, de la siguiente manera: Se retiraron los

embriones del medio de cultivo y se les realizaron dos lavados en gotas de 100 µl de PBS

que contenía 1 mg/ml polivinylpirrolidona (PVP). Los embriones fueron fijados en gotas de

100 µl de solución de paraformaldehido [4%(w/v) in PBS, pH 7.4] por 1 h a temperatura

ambiente, luego fueron lavados tres veces en gotas de 100 µl de PBS/PVP pasándolos gota

a gota. Los embriones se transfirieron a gotas de 50 µl de solución de trabajo tiñendo por

10 minutos. Posteriormente fueron lavados dos veces en gotas de PBS-PVP pasándolos

gota a gota. En un portaobjetos limpio se colocó una gota de solución a 1:10 poly-L-lysine

(Sigma P8920) por 2 minutos donde se transfirieron los embriones dejándolos allí durante

25

15 minutos a temperatura ambiente. Se añadió el mínimo volumen posible (2-16 Pl) de

solución descolorante (ProLong Antifade Kit; (Molecular Probes P-7481) sobre el área en la

que los embriones fueron fijados. Luego se colocó el cubreobjetos y se llevaron al

microscopio para observar la fluorescencia con filtro UV. Allí se observaron los núcleos de

las células de color azul.

4.3 Análisis estadístico

Se realizó un modelo de bloques incompletos al azar, donde se tomaron los diferentes

niveles de inhibidor YM976, el tratamiento con gonadotropinas y el control negativo. Se

realizaron mínimo 10 repeticiones donde cada una de las gotas de cultivo se tomó como

una repetición.

Para determinar el efecto del inhibidor de PDE tipo 4, YM976, sobre el grado de

mucificación del Complejo Cúmulo Oocito se halló el porcentaje de expansión en cada

una de las gotas de cada grupo de estudio, clasificando a los oocitos en las diferentes

categorías de expansión. Los datos fueron sometidos a un análisis de varianza (p<0,05)

donde se tomó cada uno de los grados de expansión como variable de respuesta y se

compararon todos los tratamientos de forma independiente en cada una de estas

variables (1, 10, 100, 1000nm, gonadotropinas y sin hormonas). Luego se realizó una

comparación de medias mediante el test de Tukey para pruebas con N desigual para cada

uno de los grados de expansión de las células del cúmulo en oocitos bovinos madurados

in vitro siendo significativo entre tratamientos si p<0,05.

Como parámetro indicativo de maduración nuclear in vitro se determinó el porcentaje de

expulsión del primer cuerpo polar en oocitos bovinos, este porcentaje se determinó en

cada una de las gotas de cada uno de los niveles de los grupos de estudio. Los datos

fueron sometidos a un análisis de varianza (p<0,05) donde el efecto variable fue la

26

expulsión del primer cuerpo polar en cualquiera de los bloques de tratamiento 1, 10, 100,

1000nM del inhibidor de PDE4 YM976, gonadotropinas y sin hormonas. Posteriormente

se procedió a hacer una comparación entre medias con el Test de Tukey para N desigual

para determinar se existía una diferencia significativa (p<0,05) entre los tratamientos.

Los porcentajes de clivaje fueron determinados a las 72 horas pos inseminación (hpi); la

variable dependiente fue el número de clivajes a partir del total de oocitos bovinos

fertilizados, previamente madurados in vitro en presencia de los tratamientos con el

inhibidor de PDE4 YM976 1, 10, 100, 1000nM y gonadotropinas. Posteriormente se

determinó del porcentaje de embriones bovinos de cuatro o más células, producidos in

vitro, a partir de oocitos madurados con gonadotropinas o diferentes concentraciones del

inhibidor de PDE4 YM976, a las 72 hpi, mediante el conteo de las blastómeras de cada uno

de ellos, sobre el total de los oocitos inseminados.

En la búsqueda de encontrar una mejor concentración del inhibidor de PDE4 YM976 que

permita la producción in vitro de embriones bovinos, se determinó del porcentaje de

embriones, en etapa de blastocisto, a partir de oocitos madurados con gonadotropinas o

diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976.

Para establecer la competencia de los embriones clivados para alcanzar la etapa de

blastocisto, se determinó el porcentaje de blastocistos a partir de embriones clivados.

Todos los datos fueron sometidos a un análisis de varianza (p<0,05) para evaluar los

efectos entre tratamientos. En esta parte del proceso, se buscó una diferencia mínima que

reflejara significancia, por lo que se realizó una comparación de medias mediante el test

de Duncan para las diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976 y

gonadotropinas

27

5 RESULTADOS

5.1 Objetivo específico número uno: Determinación del grado de expansión de las

células del cúmulo en presencia del inhibidor de PDE4 YM976.

Se encontró que el 81,12% de los oocitos madurados in vitro con gonadotropinas

presentan el mayor grado de expansión (grado 3), siendo mayor, estadísticamente

significativo (p<0,05) entre los grupos madurados con el inhibidor de PDE4 YM976 1nM

(24,83%), 10nM (23,21%), 100nM (20,41%) y 1000nM (12,42%) al igual que con el

tratamiento sin gonadotropinas (13,36%). No se presentó diferencia con respecto a la

expansión grado 3 entre los diferentes grupo madurados con el inhibidor de PDE4 (ver

tabla 3)

Tabla 2: Análisis descriptivo de la expansión grado 3 de las células del cúmulo en oocitos

bovinos madurados in vitro con un p<0,05.

Tratamientos Medias N Desviación Estándar

GON 81,125 11 15,069

1nM 24,832 9 25,188

10nM 23,219 5 24,537

100nM 20,419 7 15,785

1000nM 12,427 8 14,909

SH 13,364 11 14,614

28

Tabla 3: Comparación de medias mediante el test de Tukey para pruebas con N desigual

para la expansión grado 3 de las células del cúmulo en oocitos bovinos madurados in vitro

con un p<0,05.

Tratamiento GON 1nM 10nM 100nM 1000nM SH

µ=81,125 µ=24,832 µ=23,219 µ=20,420 µ=12,428 µ=13,365

GON 0,000143 0,000251 0,000144 0,000143 0,000143

1nM 0,000143 0,999993 0,997482 0,749217 0,764247

10nM 0,000251 0,999993 0,999886 0,934881 0,955104

100nM 0,000144 0,997482 0,999886 0,962238 0,977965

1000nM 0,000143 0,749217 0,934881 0,962238 0,999998

SH 0,000143 0,764247 0,955104 0,977965 0,999998

Figura 1. Expansión grado 3 de las células del cúmulo de oocitos bovinos a las 24 horas de

maduración in vitro.

29

Con respecto al grado 2 de expansión el menor porcentaje se observó en el grupo de

gonadotropinas (17,22%), sin embargo, no se encontró diferencia significativa (p>0,05)

con los demás grupos evaluados, 1nM (32,16%), 10nM (23,96%), 100nM (46,68%),

1000nM (37,41%) y sin gonadotropinas (23,28%) (ver tabla 5).




Gonadotropinas 17,221 11 16,113

1 32,164 9 31,379

10 23,967 5 23,709

100 46,684 7 16,169

1000 37,413 8 21,852

Sin Hormonas 23,184 11 25,433


para la expansión grado 2 de las células del cúmulo en oocitos bovinos madurados in vitro

con un p<0,05.

Tratamiento GON 1nM 10nM 100nM 1000nM SH

µ=17,222 µ=32,165 µ=23,968 µ=46,684 µ=37,413 µ=23,184

Gonadotropinas 0,744524 0,997267 0,184667 0,510552 0,990254

1nM 0,744524 0,993151 0,846898 0,997467 0,961733

10nM 0,997267 0,993151 0,633410 0,939733 1,000000

100nM 0,184667 0,846898 0,633410 0,974407 0,415757

1000nM 0,510552 0,997467 0,939733 0,974407 0,820106

Sin Hormonas 0,990254 0,961733 1,000000 0,415757 0,820106

30



En el grado 1 de expansión, el menor porcentaje se observó en el grupo de oocitos

madurados en presencia de gonadotropinas (1,65%), presentando diferencia

estadísticamente significativa (p<0,05) con los grupos de 1nM (43%), 1000nM (50,19%) y

sin gonadotropinas (63,45%), pero no con los grupos 10nM (52,81%) y 100nM (32,90%)

(p>0,05) (Ver tabla 7).

31



Tratamiento Medias N Desviación Estándar

Gonadotropinas 1,652 11 5,482

1nM 43,002 9 34,548

10nM 52,812 5 44,775

100nM 32,895 7 19,712

1000nM 50,159 8 26,825

Sin Hormonas 63,450 11 36,035

Tabla 7: Comparación entre medias mediante el test de Tukey para pruebas con N

desigual para la expansión grado 1 de las células del cúmulo en oocitos bovinos

madurados in vitro con un p<0,05.

TRATAMIENTO GON 1nM 10nM 100nM 1000nM SH

µ=1,6529 µ =43,003 µ =52,813 µ =32,896 µ =50,159 µ =63,451

GON 0,046117 0,080359 0,355449 0,020405 0,000272

1Nm 0,046117 0,994598 0,986532 0,996311 0,673306

10nM 0,080359 0,994598 0,886587 0,999991 0,992101

100nM 0,355449 0,986532 0,886587 0,875489 0,380070

1000nM 0,020405 0,996311 0,999991 0,875489 0,941430

SH 0,000272 0,673306 0,992101 0,380070 0,941430

32



5.2 Objetivo específico número uno: Determinación del porcentaje de maduración

nuclear in vitro de oocitos bovinos

Al comparar los porcentajes de metafase II de oocitos bovinos madurados in vitro bajo

diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976,con el obtenido en presencia de

gonadotropinas, se encontró el mayor porcentaje en la concentración 10nM del inhibidor

de PDE4 (88,33%), sin presentar diferencia estadísticamente significativa (p>0,05)con el

grupo madurado en gonadotropinas (79,62%) (ver tabla 8).Sin embargo al compararlas

con las demás concentraciones del inhibidor, 1nM (60,39%), 100nM (61,78%) y 1000nM

(45,05%), y el con el grupo madurado sin gonadotropinas (55,87%), se encontró una

diferencia significativa con cada uno de estos grupos (p<0,05)(ver tabla 9)

33

Los porcentajes de metafase II en los grupos de 1nM (60,39%) y 100nM (61,78%), no

presentaron diferencia significativa (p>0,05), sin embargo cuando se comparan con el

grupo de 1000nM (45,05%) se observa diferencia significativa (p<0,05), pero ninguno de

estos tres grupos presenta diferencia con el grupo madurado sin gonadotropinas (55,87%)

(p>0,05).

Tabla 8: Análisis descriptivo de la continuación de la Metafase II de oocitos madurados in

vitro.

Tratamientos Medias Desviación Estándar Valid N

Sin Hormonas 55,871 7,507 11

Gonadotropinas 79,204 4,321 12

1 nM 60,391 9,220 9

10 nM 84,027 13,199 6

100 nM 61,785 6,219 7

1000 nM 45,059 5,956 8


para la Metafase de oocitos bovinos madurados in vitro con un p<0,05.

TTO SH GON 1 10 100 1000

µ=55,87196 µ=79,20496 µ=60,39087 µ=84,02778 µ=61,78572 µ=45,05952

Sin Hmns 0,00014561 0,81404454 0,00014615 0,70694554 0,07493347

Gon 0,00014561 0,00020146 0,88606292 0,00156939 0,00014561

1 nM 0,81404454 0,00020146 0,00017983 0,99942952 0,00324595

10 nM 0,00014615 0,88606292 0,00017983 0,00025201 0,00014561

100 nM 0,70694554 0,00156939 0,99942952 0,00025201 0,00256288

1000 nM 0,07493347 0,00014561 0,00324595 0,00014561 0,00256288

34

Figura 4: Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la maduración nuclear in vitro de

oocitos bovinos a las 24 horas de cultivo.

5.3 Objetivo específico número dos: Determinación del porcentaje de embriones

bovinos producidos in vitro en etapa de clivaje, a partir de oocitos madurados con

gonadotropinas o diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976.

Los porcentajes de clivaje fueron determinados a las 72 horas pos inseminación (hpi)

contando el número de embriones con dos o más células, sobre el total de oocitos

inseminados. Al comparar este porcentaje entre los grupos no se encontró diferencia

significativa (p>0,05) (ver tabla 11).

35

Tabla 10. Análisis Descriptivo para las diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4

YM976 y gonadotropinas el clivaje de oocitos madurados y fertilizados in vitro con un

p<0,05.


1nM 73,55 5 22,150

10nM 62,73 6 2,715

100nM 69 3 9

1000nM 50,33 4 9,920

GON 72,74 5 19,890

.

Tabla 11. Comparación de medias mediante el test de Duncan para las diferentes

concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976 y gonadotropinas, en el clivaje de oocitos

bovinos madurados y fertilizados in vitro; con un p<0,05.

1nM 10nM 100Nm 1000nM GON

µ= 73,550 µ= 62,733 µ= 69,000 µ= 50,325 µ= 72,740

1nM 0,34167849 0,67755352 0,05270545 0,93743216

10nM 0,34167849 0,54522471 0,23784083 0,36399258

100nM 0,67755352 0,54522471 0,09770477 0,71720554

1000nM 0,05270545 0,23784083 0,09770477 0,05622295

GON 0,93743216 0,36399258 0,71720554 0,05622295

36

Figura 5. Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la tasa de clivaje de oocitos bovinos

fertilizados a las 24 horas de maduración in vitro.


bovinos de cuatro o más células, producidos in vitro, a partir de oocitos madurados con

gonadotropinas o diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976

Al comparar el porcentaje entre los grupos de gonadotropinas (44,77%) y del inhibidor

1nM (42,35%), 10nM (40%) y 100nM (43,6%), no se encontró diferencia significativa

(p>0,05), sin embargo el grupo 1000nM (15,76%) mostró el porcentaje más bajo

significativamente (p<0,05) con respecto a los demás tratamientos (ver tabla 13).

37

Tabla 12. Análisis descriptivo para las diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4

YM976 y gonadotropinas de embriones en estado de cuatro o más células, producidos in

vitro a partir del total de oocitos madurados y fertilizados in vitro.


GON 44,77 7 23,84

1nM 42,35 6 22,96

10nM 40,05 8 10,16

100nM 43,60 5 9,73

1000nM 15,77 5 2,03

Tabla 13. Comparación de medias mediante el test de Duncan para las diferentes

concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976 y gonadotropinas, en embriones de cuatro

o más células; con un p<0,05.

TTO GON 1nM 10nM 100nM 1000nM

µ= 44,771 µ= 42,350 µ= 40,051 µ= 43,600 µ= 15,768

GON 0,814567 0,658648 0,903845 0,010313

1nM 0,814567 0,812611 0,897432 0,013446

10nM 0,658648 0,812611 0,730974 0,017880

100nM 0,903845 0,897432 0,730974 0,011924

1000nM 0,010313 0,013446 0,017880 0,011924

38

Figura 6. Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la tasa de embriones en estado de

cuatro o más células a las 72 hpi.


bovinos producidos in vitro, en etapa de blastocisto, a partir de oocitos madurados con

gonadotropinas o diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976.

Los mayores porcentajes de embriones en etapa de blastocisto, a partir de oocitos

inseminados, fueron obtenidos en los grupos madurados con el inhibidor de PDE4 YM976

en las concentraciones 1nM (26,18%) y 10nM (22,96%) los cuales no presentaron

diferencia estadísticamente significativa (p>0,05) al compararlos con el grupo madurado

39

con gonadotropinas (21,03%), pero siendo mayor que los porcentajes encontrados con los

grupos de 100nM (10,50%) y 1000nM (10,76%) (ver tabla 15).

Tabla 14. Análisis descriptivo para las diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4

YM976 y gonadotropinas de blastocistos producidos in vitro a partir del total de oocitos

madurados y fertilizados in vitro.


1nM 26,19 6 13,31

10nM 22,9 6 4,41

100nM 10,5 3 0,5

1000nM 10,7 4 1,42

GON 21,0 7 2,7

Tabla 15. Comparación de medias utilizando el test de Duncan para las diferentes

concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976 y gonadotropinas, en tasa de blastocistos a

partir de oocitos bovinos madurados y fertilizados in vitro; con un p<0,05.

TTO 1nM 10nM 100nM 1000nM GON

µ= 26,185 µ= 22,963 µ= 10,500 µ= 10,765 µ= 21,035

1nM 0,488472 0,004765 0,004717 0,298868

10nM 0,488472 0,019192 0,018514 0,677403

100nM 0,004765 0,019192 0,954376 0,039221

1000nM 0,004717 0,018514 0,954376 0,035507

GON 0,298868 0,677403 0,039221 0,035507

40

Figura 7. Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la tasa de embriones a partir de

oocitos bovinos fertilizados a las 24 horas de maduración in vitro.

El porcentaje más alto de producción de embriones se encontró en los grupos madurados

in vitro con YM976 1nM (43,67%) y 10nM (37,72%), que no presentan diferencia

significativa (p>0,05) con el grupo de gonadotropinas (43,51%). A su vez, 100nM y

1000nM presentaron los menores porcentajes (15,35% y 20%, respectivamente)

estadísticamente significativos (p<0,05) al compararlos con los grupos de 1nM, 10nM y

gonadotropinas (ver tabla17).

41

Tabla 16.Análisis descriptivo para las diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4

YM976 y gonadotropinas de blastocistos producidos in vitro a partir de oocitos clivados in

vitro con un p<0,05.


1nM 43,7 6 19,8

10nM 37,7 8 3,4

100nM 15,3 3 1,3

1000nM 20 3 1

GON 43,5 5 15,33

Tabla 17. Comparación de medias utilizando el test de Duncan para las diferentes

concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976 y gonadotropinas, en la tasa de blastocistos

a partir de oocitos bovinos clivados in vitro; con un p <0,05.

1nM 10nM 100nM 1000nM GON

µ=43,678 µ =37,722 µ =15,300 µ =20,000 µ =43,510

1nM 0,506624 0,005185 0,015269 0,984142

10nM 0,506624 0,01787 0,04562 0,494225

100nM 0,005185 0,01787 0,578014 0,004728

1000nM 0,015269 0,045620 0,578014 0,013534

GON 0,984142 0,494225 0,004728 0,013534

42

Figura 8. Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la tasa de embriones a partir de

oocitos bovinos clivados in vitro.

43

6 DISCUSIÓN

La adquisición de la competencia para el desarrollo, dependen de la íntima relación del

oocito con las células somáticas (de la granulosa), cuya función principal es la de nutrir al

oocito hasta etapas finales de su desarrollo. Sin embargo, en la última década se han

desarrollado nuevos conceptos en la biología reproductiva, dentro de ellos, el rol que

juega el oocito en la regulación de las células de la granulosa, así como también la

expansión del cúmulo en la maduración y la adquisición de la competencia del oocito para

su posterior desarrollo (Glichrist y Thompson 2007). Sin embargo en la PIVE los oocitos

son aspirados del folículo interrumpiendo la maduración que ha estado adquiriendo

durante la dinámica folicular, para ser sometidos a una maduración forzosa en presencia

de gonadotropinas por 24h., las cuales se unen a receptores específicos de las células del

cúmulo, generando la expansión y maduración nuclear hasta metafase II en el oocito,

procesos que son mediados principalmente por la vía del AMPc.

El AMPc como segundo mensajero ha sido implicado en la regulación de la maduración de

oocitos en mamíferos. Cuando los niveles de AMPc dentro del oocito descienden, se

induce la continuación de la meiosis, caracterizada inicialmente por el rompimiento de la

vesícula germinal (germinal vesicle breakdown GVBD); finalizando con la expulsión del

primer cuerpo polar (Tsafiri et al. 1996). Los niveles de AMPc son regulados por las

enzimas fosfodiesterasas (PDE) que hidrolizan el AMPc en AMP, con una expresión

especifica de compartimiento en la unidad folicular, en donde la PDE 3 se expresa en el

oocito y la PDE4 en las células del cúmulo (Tsafiri et al. 1996).

Al modular concentraciones de AMPc en las células del cúmulo utilizando inhibidores

específicos de PDE4 se logra obtener a las 24h de cultivo, un porcentaje de maduración

44

nuclear similar a la encontrada con gonadotropinas. Sin embargo la expansión en

presencia del inhibidor de PDE4 Rolipram presenta una cinética diferente debido al

mantenimiento de las uniones gap entre el oocito y las células del cúmulo por más tiempo

(Glichrist y Thompson 2007). Esta respuesta también se observó en este trabajo al utilizar

el inhibidor YM976 en todas las concentraciones evaluadas, donde fue menor la expansión

de oocitos grado 3 comparado con los madurados en presencia de gonadotropinas (ver

figura 1). Esta prolongación de las uniones gap durante las maduración in vitro en

presencia de inhibidores de PDE4 podría permitir el paso de metabolitos, iones,

nucleótidos y aminoácidos, que mejoran la maduración citoplásmica del oocito,

aproximándose a una sincronización entre la maduración citoplásmica y nuclear (Glichrist

y Thompson 2007).

Sin embargo con las concentraciones de 100nM y 1000nM, a pesar de prolongarse la

presencia de uniones gap, se observó una disminución en los porcentajes de maduración

nuclear del oocito (ver figura 4), característica necesaria para la fertilización y posterior

desarrollo embrionario. Posiblemente debido a que estas concentraciones de YM976

pueden tener efecto inhibitorio sobre la PDE tipo 3 localizada en el oocito, lo que evitaría

la disminución de concentraciones de AMPc y la continuación de la meiosis de manera

eficiente (López et al. 2008).

Otros compuestos como el Ro 20-1724 (Bilodeau 2003), el Roflumilast (Huang et al. 2001)

y el Rolipram (Tsafiri et al. 1996), han mostrado resultados similares en la expansión del

oocito y la continuación de meiosis, utilizando diferentes concentraciones de acuerdo a la

especificidad y la constante de inhibición de cada uno de éstos.

El porcentaje de clivaje a partir de oocitos madurados en presencia de gonadotropinas fue

del 72,74%, el cual no difiere de los porcentajes obtenidos con el inhibidor YM976 en

todos los grupos, con un rango entre 50 - 73,55% (ver figura 5); porcentajes similares son

reportados por Sagirkaya et al. 2006 (76,15%) y Alm et al. 2004 (67,4%). Estos resultados

45

sugieren que el porcentaje de clivaje no es un buen criterio para evaluar la competencia

del oocito, debido a que se presentaron diferencias en el porcentaje de maduración

nuclear que no se correlacionan con estos porcentajes.

Se evaluó el porcentaje de embriones en estado de cuatro o más células a las 72 hpi,

donde se encontraron porcentajes entre el 15 y 44% (ver figura 6) para los diferentes

grupos. Los grupos encontrados con gonadotropinas (44,8%) y el inhibidor de PDE4

YM976 a concentraciones de 1nM (42,35%), 10nM (40%) y 100nM (43,6%), son similares a

los reportados por Holm et al. 1998 (48%), Sirisathien et al. 2003 (39%) y Duque et al.

2003 (43% y 58% usando 5% de SFB y sustitutos sintéticos de suero respectivamente). Sin

embargo estos resultados son menores a los reportados por Senatore et al. 2010 (73%

usando técnicas de OPU (Ovum Pick Up)). El porcentaje obtenido con el inhibidor de PDE4

YM976 a una concentración de 1000nM (15,76%) fue el más bajo, sugiriendo que esta

concentración tiene un efecto deletéreo durante la maduración de oocito reflejándose en

el clivaje de cuatro o más células.

Con respecto al desarrollo embrionario (etapa de blastocisto), los porcentajes mayores

fueron obtenidos en los grupos 1nM (26,18%) y 10nM (22,96%)del inhibidor, similares al

grupo de gonadotropinas (21,03%), (ver figura 7) acorde a estos resultados, autores como:

Bettegowda et al. 2007 encontraron porcentajes de embriones alrededor del 23,5%,

Sirisathien et al 2003, con un 23% utilizando factor de crecimiento epidérmico, Sagirkaya

et al 2007 con un 26% al suplementar el medio con 10% de suero fetal bovino (SFB). Sin

embargo el porcentaje de blastocistos obtenido con el inhibidor de PDE4 YM976 a una

concentración de 100nM (10,5%) fue el más bajo en este estudio, a pesar de que el

porcentaje en la maduración nuclear y de clivaje fueron similares a la obtenida con la

concentración de 1nM, sugiriendo que los efectos del inhibidor sobre la maduración del

oocito, deben ser complementada con otras evaluaciones como es la competencia de este

oocito para el desarrollo embrionario. Por último el porcentaje de blastocistos obtenido

46

con 1000nM fue del 10,76%, mostrando que esta concentración es deletérea no solo en la

formación de blastocistos, sino también en los procesos de maduración nuclear (45,05%),

clivaje (50,32%) y embriones de cuatro o más células (15,77%).

Con base en estos resultados se sugiere evaluar un rango en el cual se evalúen las

concentraciones 1nM y 10nM, para determinar la concentración óptima del inhibidor para

la producción in vitro de embriones bovinos; adicionalmente, la evaluación de

citotoxicidad, de estas concentraciones planteadas, y la necesidad de estudiar otros

parámetros de evaluación de calidad del oocito y del embrión, tales como la

determinación de la celularidad embrionaria, expresión génica (Sagirkaya et al. 2007),

niveles de glutatión (Wang et al. 2007) y actividad enzimática en el oocito (Alm et al.,

2005), bajo estos protocolos de producción in vitro embriones bovinos.

47

7 CONCLUSIONES

Se concluye que las concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976 1 y 10 nM durante la

maduración in vitro del oocito disminuye la expansión de las células de la granulosa,

posiblemente facilitando el paso de metabolitos, iones, nucleótidos y aminoácidos que

mejoran la competencia del oocito para el desarrollo embrionario.

Los oocitos madurados en presencia del inhibidor de PDE4 YM976 a las concentraciones

1nM y 10nM como único estímulo, presentan una maduración nuclear y competencia

para el desarrollo embrionario, similar a los oocitos madurados con gonadotropinas.

Las concentraciones de inhibidor de PDE4 YM976 1nM y 10nM, bajo las condiciones

experimentales usadas en este estudio, pueden ser aplicadas en procesos de maduración

in vitro de oocitos bovinos, mientras que las concentraciones de 100nM y 1000nM

presentan efectos deletéreos sobre la producción in vitro de embriones bovinos.

48

BIBLIOGRAFÍA

Alm H, Torner H, Lohrke B, Viergutz T, Ghoneim IM, Kanitz W. Bovine blastocyst

development rate in vitro is influenced by selection of oocytes by brillant cresyl blue

staining before IVM as indicator for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity. En:

Therio. Vol: 63 (2005); p. 2194-2205.

Atienza JM, Susanto D, Huang C, McCarty AS, Colicelli J. Identification of inhibitor

specificity determinants in a mammalian phosphodiesterase. En: J Biol Chem. Vol. 274, no

8 (1999); p.4839-47.

Bettegowda A, Yao J, Sen A, Li Q, Lee K, Kobayashi Y, Patel O, Coussens P, Ireland J and

Smith G. JY-1, an oocyte-specific gene, regulates granulosa cell function and early

embryonic development in cattle. En: Proc Natl Acad Sci. Vol 104, N° 45 (2007); p. 17602-

17607.

Bilodeau S. Effects of phosphodiesterase inhibitors on spontaneous nuclear

maturation and cAMP concentrations in bovine oocytes. En: Therio. Vol 60 (2003) p. 1679-

1690

Calder MD, Caveney AN, Smith LC and Watson AJ. Responsiveness of bovine cumulus-

oocyte-complexes (COC) to porcine and recombinant human FSH, and the effect of COC

quality on gonadotropin receptor and Cx43 marker gene mRNAs during maturation in

vitro. En: Reprod Biol Endocrinol. Vol. 1(2003); p. 14.

Conti M, Phosphodiesterases and cyclic nucleotide signaling in endocrine cells. En:

Mol Endocrinol. Vol. 14, no. 9 (2000); p. 1317-1327.

49

Conti M, Andersen CB, Richard F, Mehats C, Chun SY, Horner K, Jin C and Tsafriri A.

Role of cyclic nucleotide signaling in oocyte maturation. En: Mol and Cell Endocrinol. Vol.

187: (2002); p. 153-159

Demnitz J, LaVecchia L, Bacher E, Keller T, Müller T, Schürch F, Weber H and Pombo-

Villar E. Enantiodivergent synthesis of (R)- and (S)-Rolipram. En: Mol, Vol. 3 (1998); p.107-

119

Ducibella T, Duffy P and Buetow J. Quantification and localization of cortical granules

during oogenesis in the mouse. En: Biol Reprod. Vol. 50: (1994); p. 467-73.

Duque P, Gómez E, Díaz E, Facal N, Hidalgo C, Diez C. Use of two replacements of

serum during bovine embryo culture in vitro. En: Therio. Vol 59 (2003); p. 889-899.

Dym O, Xenarios I, Ke H, Colicelli. Molecular docking of competitive

phosphodiesterase inhibitors. En: J Mol Pharmacol. Vol. 61, no 1. (2002):; p. 20-25.

Eckert J and Niemann H. In vitro maturation, fertilization and culture to blastocysts of

bovine oocyte in protein-free media. En: Therio. Vol. 43 (1995); p.1221-1225.

Eppig JJ. Coordination of nuclear and cytoplasmic oocyte maturation in eutherian

mammals. En: Reprod Fertil Dev. Vol. 8, no.4 (1996); p. 485-489.

Fair T, Hulshof SCJ, Hyttel P, Greve T and Boland M. Oocyte ultraestructure in bovine

primordial to early tertiary follicles. En: Anat Embryol. Vol. 195 (1997); p. 327-336.

Fair T, Lonergan L and Boland M. The acquisition of developmental competence in

bovine oocytes. En: Animal Science and Production, faculty of agriculture research report.

(2001); p. 30-32.

Fulop C, Salustri A and Hascall VC. Coding sequence of a hyaluronan synthase

homologue expressed during expansion of the mouse cumulus-oocyte complex. En: Arch

Biochem Biophys. Vol. 337 (1997); p. 261-266.

50

Gilchrist R., Thompson J. Oocyte maturation: Emerging concepts and technologies to

improve developmental potential in vitro. En: Therio. Vol 67 (2007); p. 6-15.

Holm P, Shukri NN, Vajta G, Booth P, Bendixen C and Callesen H. Developmental

Kinetics of the first cell cycles of bovine in vitro produced embryos in relation to their in

vitro viability and sex. En: Therio. Vol 50 (1998); p. 1285-1299.

Huang Z, DucharmeY, Macdonald D and Robichaud A. The next generation of PDE4

inhibitors. En: Curr Opin Chem Biol. Vol. 5 (2001); p. 432-438

Hyttel P, Callesen H and Greve T. Ultrastructural features of preovulatory oocyte

maturation in superovulated cattle. En: J Reprod Fertil. Vol. 76 (1986a); p. 645-56.

Hyttel P, Xu KP, Smith S and Greve T. Ultrastructure of in-vitro oocyte maturation in

cattle. En: J Reprod Fertil. Vol. 78 (1986b); p. 615-25.

Jackson EK, Mi ZC, Carcillo JA, Gillespie DG and Dubey RK. Phosphodiesterases in the

rat renal vasculature. En: Journal of Cardiov Pharmacol. Vol. 6 (1997); p. 798-801.

Jensen JT, Schwinof KM, Zelinski-Wooten MB, Conti M, De Paolo LV and Stouffer RL.

Phosphodiesterase 3 inhibitors selectively block the spontaneous resumption of meiosis

by macaque oocytes in vitro. En: Hum Reprod. Vol. 17, no 8 (2002); p. 2079-2080.

Jin SL, Swinnen JV, Conti M. Characterization of the structure of a low Km, rolipram-

sensitive cAMP phosphodiesterase. Mapping of the catalytic domain. En: J Biol Chem. Vol.

267, no 26 (15 Sept 1992); p.18929-18939.

Jones KT. Turning it on and off: M-phase promoting factor during meiotic maturation

and fertilization. En: Mol Hum Reprod 2004; 10(1):1-5.

Josefsberg LB and Dekel N. Translational and post-translational modifications in

meiosis of the mammalian oocyte. En: Mol Cell Endocr. Vol. 187 (2002); p. 161-171.

51

López YS, Mejía AM, Escobar EE, Agudelo B, Vásquez NA y Echavarría H. Efecto del

inhibidor de fosfodiesterasa tipo 4-Rolipram, sobre la maduración in vitro de oocitos

bovinos. En: Rev Colomb Cienc Pecu. Vol. 21 (2008); p. 59-65

Kubelka M, Motlik J, Fulka JJ, Prochazka R, Rimkevikova Z and Fulka J. Time sequence

of germinal vesicle breakdown in pig oocytes after cycloheximide and p-

aminobenzamidine block. En: Gam. Res. Vol. 19 (1988); p. 423-431.

Lugnier C. Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) superfamily: A new target for

the development of specific therapeutic agents. En: Pharm Ther. Vol. 109 (2006); p. 366-

398.

Mayes M. The meiotic arrest of bovine oocytes. Du grade de Philosophiae Doctor

(Ph.D.), Université Laval - Québec, Canadá (2002). 171 p.

Mayes MA and Sirard MA. Effect of type 3 and type 4 phosphodiesterase inhibitors on

the maintenance of bovine oocytes in meiotic arrest. En: Biol Reprod. Vol. 66 (2002);

p.180-184.

Muller T, Engels P and Fozard Jr. Subtypes of the type 4 cAMP phosphodiesterases:

structure, regulation and selective inhibition. En: Tips. Vol. 17 (1996); p. 294-298.

Nichols WK. Respiratory drugs. En: Gennaro A (Ed). Remington: The Science and

Practice of Pharmacy. 20th Edition. Philadelphia: Philadelphia College of Pharmacy and

Science. (2000.); p. 1297-1313.

Nikulina E, Tidwell J, Dai H, Bregman B, and Filbin M. The phosphodiesterase inhibitor

rolipram delivered after a spinal cord lesion promotes axonal regeneration and functional

recovery. En: Proc Natl Acad Sci. Vol. 101, no. 23 (2004); p. 8786-8790.

Olson SE and Seidel GE Jr. Culture of in vitro-produced bovine embryos with vitamin E

improves development in vitro and after transfer to recipients. En: Biol Reprod. Vol. 62

(2000); p. 248-252.

52

Piaz VD and Giovannoni MP. Phosphodiesterase 4 inhibitors, structurally unrelated to

Rolipram, as promising agents for treatment of asthma and other pathologies. En: Eur J

Med Chem. Vol. 35, no.5 (2000); p. 463-480.

Pillai R, Kytle K, Reyes A, Colicelli J. Use of a yeast expression system for the isolation

and analysis of drug-resistant mutants of a mammalian phosphodiesterase. En: Proc Natl

Acad Sci U S A. Vol. 90, no. 24 (1993); p. 11970-11974.

Rizos D, Ward F, Duffy P, Boland MP, Lonergan P. Consequences of bovine oocyte

maturation, fertilization or early embryo development in vitro versus in vivo: implications

for blastocyst yield and blastocyst quality. En: Mol Reprod Dev. Vol 61 (2002); p. 234-248.

Sagirkaya H, Misirlioglu M, Kaya A, First N, Parrish J, Memili E, Developmental

potential of bovine oocytes cultured in different maturation and culture conditions. En:

Anim Reprod Sci. Vol 101 (2007); p. 225-240.

Sali& T.L. Blundell. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints.

En: J. Mol. Biol. Vol. 234 (1993); p. 779-815.

Salomone DF, Damiani P, Fissore RA, Robl JM and Duby RT. Biochemical and

developmental evidence that ooplasmic maturation of prepubertal bovine oocytes is

compromised. En: Biol Reprod. Vol 64 (2001) ;1761?1768.

Salustri A, Yanagishita M, Underhill CB, Laurent TC and Hascalll VC. Localization and

synthesis of hyaluronic acid in the cumulus cells and mural granulosa cells of the

preovulatory follicle. En: Dev Biol. Vol. 15, no,1 (1992); p. 541- 551.

Senatore EM, Xu J, Suarez MV, Gong G, Lin T, Bella A, Moreno JF, Mannino ME, Tian X,

Presicce GA, Wu S, Du F. Improved in vitro development of OPU-derived bovine (Bos

Taurus) embryos by group culture with agarose-embedded helper embryos. En: Therio.

Vol 74 (2010); p. 1643-1651.

53

Shamsuddin M, Larsson B and Rodriguez-Martinez H. Maturation-related changes in

bovine oocytes under different culture conditions. En: Anim Reprod Sci. Vol. 31 (1993); p.

49-60.

Shimada M, Kheir M and Terada T. Posphatidylinositol 3-kinase in cumulus cells is

responsible for meiotic progession from MI to MII stage in porcine follicular oocytes. En: J

Mamm. Ova Res. Vol. 15, 68 - 76, 1998.

Sirard MA. Temporary inhibition of in vitro meiotic resumption by adenylatecyclase

stimulation in immature bovine oocytes. En: Therio. Vol. 31 (1989); p. 257.

Sirard MA and First NL. In vitro inhibition of oocyte nuclear maturation in the bovine.

En: Biol Reprod. Vol. 39 (1988); p. 229-234.

Sirard MA, Florman HM, Leibfried-Rutledge ML, Barnes FL, Sims ML and First NL.

Timing of nuclear progression and protein synthesis necessary for meiotic maturation of

bovine oocytes. En: Biol Reprod. Vol. 40 (1989); p. 1257-1263.

Sirard MA, Richard F, Blondin P and Robert C. Contribution of the oocyte to embryo

quality. En: Therio. Vol. 65 (2006); p. 126-136.

Sirisathien S, Hernandez H, Brackett B. Influences of epidermal growth factor and

insulin-like growth factor-I on bovine blastocyst development in vitro En: Anim Reprod Sci.

Vol 77 (2003); p. 21-32.

Soares A C, Souza D G, Pinho V, Vieira A T, Barsante M, Nicoli J R and Teixeira M.

Impaired host defense to Klebsiella pneumoniae infection in mice treated with the PDE4

inhibitor rolipram. En: British J Pharm. Vol. 140 (2003); p.855-862.

Soderling SH and Beavo JA. Regulation of cAMP and cGMP signaling: new

phosphodiesterases and new functions. En: Curr. Opin. Cell Biol. Vol. 12 (2000); p.174-179.

Spaulding SW. The way in which hormones change cyclic adenosine 3´,5´-

monophosphate-dependent protein kinase subunits, and how such changes affect cell

behavior. En: Endocr Rev. Vol. 14 (1993); p. 632-650.

54

Thomas RE, Armstrong DT and Gilchrist RB. Differential effects of specific

phosphodiesterase isoenzyme inhibitors on bovine oocyte meiotic maturation. En: Dev

Biol. Vol. 244 (2002); p. 215-225.

Thomas RE, Armstrong DT, Gilchrist RB. Bovine cumulus cell-oocyte gap junctional

communication during in vitro maturation in response to manipulation of cell-specific

cyclic adenosine 3,5-monophosophate levels. En: Biol Reprod. Vol. 70 (2004); p. 548-556.

Thomas RE, Armstrong DT, Thompson JG, Gilchrist RB. Effect of specific

phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on

meiotic and developmental capacity. En Biol Reprod. Vol 71 (2004); p. 1142–1149.

Tsafriri A and Channing CP. Influence of follicular maturation and culture conditions

on the meiosis of pig oocytes in vitro. En: J Reprod Fertil. Vol. 43 (1975); p. 149-52.

Tsafriri A, Chun SY, Zhang R, Hsueh AJ and Conti M. Oocyte maturation involves

compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ

cell: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. En: Dev Biol. Vol. 178 (1996); p.

392-402.

Wagner U, Bredenbroke D, Fehman HC, Schwarz F, Schudt C and Vonwichert P. Effects

of selective and nonselective phosphodiesterase inhibitors on tracheal mucus secretion in

the rat. En: Eur J Pharmacol. Vol. 298 (1996); p. 265-270.

Wang Z, Yu S, Xu Z. Improvement in bovine embryo production in vitro by treatment

with green tea polyphenols during in vitro maturation of oocytes. En: Anim Reprod Sci. Vol

100 (2007); p. 22-31.

Wassarman PM and Albertini DF. The mammalian ovum. En: Knobill E and Neill JD

(Eds.). The Physiology of Reproduction, Vol. I. Second edition. New York: Raven-Press

(1994). p. 79-122.

Whitaker M. Control of meiotic arrest. En: Rev Reprod. Vol. 1 (1996); p.127-135.

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