EVALUACIÓN DEL EFECTO DE FUENTES DE CARBONO Y DE …
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EVALUACIÓN DEL EFECTO DE FUENTES DE CARBONO Y DE NITRÓGENO SOBRE LA CONIDIOGÉNESIS DE Penicillium sp. HC1 EN MEDIO SÓLIDO Y LÍQUIDO GERALDINE TIBASOSA RODRIGUEZ TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al título de Microbióloga Industrial PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL Bogotá D.C. Junio 2014
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EVALUACIÓN DEL EFECTO DE FUENTES DE CARBONO Y DE NITRÓGENO SOBRE
LA CONIDIOGÉNESIS DE Penicillium sp. HC1 EN MEDIO SÓLIDO Y LÍQUIDO
GERALDINE TIBASOSA RODRIGUEZ
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
Microbióloga Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Bogotá D.C.
Junio 2014
EVALUACIÓN DEL EFECTO DE FUENTES DE CARBONO Y DE NITRÓGENO SOBRE
LA CONIDIOGÉNESIS DE Penicillium sp. HC1 EN MEDIO SÓLIDO Y LÍQUIDO
GERALDINE TIBASOSA RODRIGUEZ
APROBADO
_________________________________________ _______________________________________
CONCEPCION PUERTA B. JANETH ARIAS P.
Bacteriologa., PhD Bacteriologa, M.Sc - M.Ed
Decana académica Directora de carrera
EVALUACIÓN DEL EFECTO DE FUENTES DE CARBONO Y DE NITRÓGENO SOBRE
LA CONIDIOGÉNESIS DE Penicillium sp. HC1 EN MEDIO SÓLIDO Y LÍQUIDO
GERALDINE TIBASOSA RODRIGUEZ
APROBADO
_______________________________________ ___________________________________________
IVONNE GUTIERREZ ROJAS MARIA XIMENA RODRIGUEZ
Bacterióloga, MSc., PhDc Microbiologa, PhD
Directora Jurado
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la
moral cristiana y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”
Artículo 23 de la Resolución No. 13 de julio de 1946
“Ninguna disciplina resulta agradable a la hora de recibirla,
al contrario es dolorosa, pero después, produce la apacible
cosecha de una vida recta para los que han sido entrenados por ella”
Hebreos 12:11 NTV
AGRADECIMIENTOS
Le doy gracias a Dios por ser mi guía, compañía y fortaleza, por darme la oportunidad
de aprender cada día y conocer cosas nuevas.
A la doctora Ivonne Gutiérrez por brindarme su confianza, conocimiento y apoyo en
este camino.
A la Ingeniera Nubia Moreno y al Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional
de Colombia por abrirme sus puertas y darme la oportunidad de estar en este grupo
de investigación.
A mi mamá, mi razón de vivir, por ser mi fuerza y aliento diario, por darme el mejor
ejemplo de valentía y ganas de salir adelante. A mi tía María Victoria por su apoyo
incondicional y sus bellas palabras y a mi Abuelito Manuel que se que desde el cielo
me manda todo su apoyo y amor.
Al grupo de Fermentaciones: Alejandra Escobar, Diana Vergara, Carlos Carranza,
Alejandra Cruz, Diana Vinchira, Jeimy Macias, Luis Carlos Gutiérrez, Vannesa Florez,
por darme el mejor ambiente de trabajo y por enseñarme muchas cosas nuevas.
A mis amigas del alma Angélica Ramírez y Laura Vargas, por brindarme sus consejos,
su apoyo y su amistad.
RESUMEN
El desarrollo de bioinoculantes que usan microorganismos fúngicos como principio
activo han sido evaluados en la actualidad como alternativas en el manejo de los
residuos de pos-cosecha en cultivos como el arroz. Esta propuesta busca aumentar la
disponibilidad de nutrientes en el suelo, generar bajos costos en el manejo de estos
residuos y evitar la producción de gases nocivos para el medio ambiente, ocasionada
por los tratamientos convencionales que se le dan a este tipo de residuos. El hongo
Penicillium sp. HC1, fue seleccionado como un microorganismo potencial para el
desarrollo de un bioinoculante, dada su capacidad de secretar enzimas celuloliticas en
concentraciones significativamente altas. Teniendo en cuenta que se espera manejar
conidios de este hongo como propagulos en el insumo, es necesario evaluar el efecto
de diferentes fuentes de carbono y de nitrógeno sobre el proceso de conidiogenesis en
este microorganismo, como fase inicial del proceso de formulación del producto. Por
ello en la presente investigación, se determinó el efecto de estas variables sobre la
producción y la calidad de los conidios de Penicillium sp. HC1 en medio sólido y
líquido, evaluando cinco fuentes de carbono (glucosa, sacarosa, almidón de yuca,
salvado de trigo y harina de arroz) y cuatro de nitrógeno (triptosa, extracto de
levadura, fosfato de amonio y nitrato de potasio) manteniendo una relación 10:1 C:N.
Como variables de respuesta en medio solido se realizó recuento de conidios en
cámara de Neubauer (conidios/mm2), crecimiento radial (mm), velocidad de
crecimiento (mm/día) y morfología. En medio líquido se evaluó recuento de conidios
en cámara de Neubauer (conidios/ml), biomasa por peso seco (g/L) y morfología. En
cuanto a los recuentos en medio sólido todos los medios mostraron recuentos entre
104 y 105 conidios/mm2, sobresaliendo el salvado de trigo, la sacarosa y el almidón de
yuca con efectos positivos, en cuanto a crecimiento radial la glucosa junto con fuentes
orgánicas de nitrógeno fueron más altas significativamente. En medio líquido las
fuentes simples de carbono (glucosa y sacarosa) mostraron efectos negativos frente a
producción de conidios, mientras que combinaciones como salvado de trigo-triptosa,
harina de arroz-fosfato de amonio mostraron recuentos más altos. Finalmente para
evaluar el efecto de las fuentes de carbono y de nitrógeno sobre la calidad de los
conidios se realizaron pruebas de germinación frente a temperatura (45° y 50°C),
mostrando la mayoría una estabilidad hasta los 45°C mientras que en 50°C resistieron
solo conidios correspondientes a los medios almidón-triptosa y almidón-extracto de
levadura, en medio sólido.
INTRODUCCION
En Colombia el cultivo de arroz ocupa el tercer lugar de importancia agrícola después
del café y el maíz, representando en el año 2010 el 13% del área cosechada con
490.000 hectáreas (Fedearroz, 2005). Debido a esto según la FAO (Food and
Agriculture Organization) anualmente se producen cerca de 600 millones de toneladas
de tamo de arroz en el mundo, un residuo pos-cosecha que frecuentemente es
incinerado al aire libre in-situ generando polución, sobrecalentamiento global,
degradación del suelo y contaminación del agua (Guzmán et al, 2013). Actualmente
una mínima parte es aprovechada incorporándola al suelo como abono orgánico,
como forraje para animales e incluso es utilizado como fuente de fibras y celulosa para
la producción de pulpa y papel, y como materia prima para la producción de paneles
de tableros de densidad media (Medium Density Fiberboard (MDF)) (Kadam et al,
2000). Estos residuos orgánicos pueden ser una valiosa y económica opción como
fuente de nutrientes para el suelo, en la actualidad se buscan diferentes mecanismos
químicos, físicos y biológicos que sirvan como alternativas innovadoras para
contrarrestar el mal uso de este desecho. El tamo de arroz es una fuente importante
de variadas fuentes de carbono como la celulosa, la lignina y la hemicelulosa, sin
embargo los procesos químicos y físicos utilizados para su aprovechamiento no son de
gran interés por el costo y arduo trabajo que demandan estos procesos realizados
para obtener sustratos más simples en forma inorgánica como producto de su
degradación.
Actualmente el uso de bioinoculantes cobra importancia debido a la necesidad de
reducir el uso de fertilizantes químicos y de cumplir con la normatividad que prohíbe
la quema física de estos residuos pos-cosecha además de no afectar negativamente el
rendimiento del cultivo vegetal, al contrario conservando la fertilidad y proveyendo
de nutrientes al suelo (Rodríguez et al, 2008). El principio activo de un bioinculante
son los microorganismos estos cuentan con mecanismos que facilitan el crecimiento
vegetal y aumentan o mantienen su rendimiento, es una moderna alternativa para el
agricultor de baja, mediana y alta capacidad productiva.
Penicillium sp. HC1 fue seleccionado como un microorganismo potencial para la
degradación del tamo de arroz, gracias a los sistemas enzimáticos con que cuenta
puede llegar a degradarlo y generar productos inorgánicos solubles, siendo
aprovechados por la planta en el suelo y generando mayor productividad para el
cultivo. Sus propagulos, los conidios, serán los encargados de iniciar el proceso de
degradación, estos son formas reproductivas del hongo que fisiológicamente sirven
como una alternativa de dispersión cuando en el punto de crecimiento se agotan los
nutrientes. Teniendo en cuenta que los conidios actuarán principalmente como
propagulos en el insumo, es necesario evaluar el efecto de diferentes fuentes de
carbono y de nitrógeno sobre el proceso de conidiogenesis, ya que el medio de cultivo
en que crezca el hongo es el soporte primordial y fundamental para su desarrollo, así
como para la formación de sus estructuras vegetativas y reproductivas. Diversos
autores han estudiado el proceso de conidiogénesis y su comportamiento frente a
diferentes medios sólidos y sumergidos y han encontrado ciertas combinaciones que
pueden favorecer y desfavorecer este proceso.
Por ello en la presente investigación, se determinó el efecto de estas variables sobre
la producción y la calidad de los conidios de Penicillium sp. HC1 en medio sólido y
líquido, evaluando diferentes fuentes de carbono y de nitrógeno.
2. JUSTIFICACIÓN Y
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Crear conciencia del adecuado uso de los recursos naturales en la humanidad es un
compromiso realmente grande y difícil de lograr, la lucha contra el cambio climático y
la preservación del medio ambiente es hoy en día una de las batallas más importantes
por la cual luchar, en consecuencia nace la necesidad de proporcionar alternativas de
mejoramiento y aprovechamiento a partir de nuevas fuentes de energía renovables.
Un producto secundario de procesos agroindustriales que actualmente genera
grandes acumulaciones y posteriores problemas es el tamo de arroz, un desecho para
algunos inservible pero que se puede llegar a aprovechar de una manera amigable
para el medio ambiente. El arroz es el tercer producto agrícola en extensión en
Colombia, la industria arrocera colombiana origina 400’000 toneladas de arroz por
año de los cuales por cada kilogramo de arroz paddy producido se generan 0.83 kg de
tamo de arroz (Nguyen, 1998) aproximadamente un 15% de este desecho es
aprovechado como combustible y un 10% es distribuido en establos, lo que significa
que una gran parte de esta fibra es incinerada inútilmente o peor aún arrojada a
caudales, la incineración causando por su parte liberación de gases altamente nocivos
para la atmosfera y para la salud humana, y el desecho a ríos y lagunas generando
toxicidad en los suelos colombianos. Por estas razones es necesario crear nuevas
ideas de aprovechamiento de estos desechos, ideas que generen energía y que al
mismo tiempo contribuyan al mejoramiento de los cultivos y el medio ambiente.
El proyecto de investigación surge de las necesidades anteriormente mencionadas,
abarca las zonas arroceras de Colombia principalmente en los departamentos de
Tolima y Meta y es estudiado en el Instituto de Biotecnología de la Universidad
Nacional de Colombia. El grupo de bioprocesos y bioprospección, realizó el
aislamiento de 436 bacterias, 55 hongos celuloliticos y 3 hongos lignoliticos a partir
de muestras de rizosfera provenientes de suelo de arroz de Tolima y Meta. En total
estos 494 aislamientos microbianos fueron evaluados cualitativamente y
cuantitativamente, seleccionando 9 aislamientos fúngicos y 1 aislamiento bacteriano.
Debido a su elevada actividad celulolitca Penicillium sp. HC1 fue escogido como un
microorganismo con gran potencial para la formulación de un próximo producto
capaz de degradar el tamo de arroz y generar compuestos inorgánicos solubles para
poder ser reincorporados en el suelo. El objetivo principal es obtener un producto
formulado con la forma reproductiva del hongo Penicillium sp. HC1, los conidios,
estructuras encargadas de iniciar la biodegradación del tamo de arroz.
Desde su aislamiento comenzaron diferentes investigaciones exploratorias enfocadas
al mismo objetivo, como la evaluación de su actividad enzimática, caracterización del
microorganismo, pruebas en campo, evaluación de las condiciones en fermentación
sumergida entre otras. Y adicionalmente se llevó a cabo esta investigación
contribuyendo a la utilización de la mejor combinación de fuente de carbono y de
nitrógeno para la inducción y/o aceleración de la conidiogénesis y la posterior
evaluación de la calidad de los conidios obtenidos frente a diferentes temperaturas.
3. MARCO TEORICO
3.1 Cultivo de Arroz (Oryza sativa)
El cultivo de arroz ocupa el segundo lugar de producción de cereales en el mundo,
supera los 500 millones de toneladas anuales producidas y el 90% de estas es
consumida en Asia. Este cereal proporciona entre el 25 y 80% de las calorías
necesarias para una persona, ya que es un carbohidrato complejo y cuenta con
proteínas, fibra, ácido fólico, tiamina, hierro, vitamina E, entre otros, además de no
contener colesterol, grasas ni sodio (Benavides & Segura, 2005).
Según la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura,
Colombia es actualmente el segundo productor de arroz en Latinoamerica y el Caribe,
con una distribución en todo el país pero sobresaliendo departamentos como Huila y
Tolima con el mayor número de hectáreas sembradas. Hace parte del fondo
latinoamericano para arroz de riego (FLAR) y es anfitrión del centro internacional de
agricultura tropical (CIAT). En cuanto a su producción se cuenta con dos maneras de
hacerlo: Manualmente y mecánicamente, siendo el principal y hoy utilizado por el
95% de agricultores el sistema mecanizado.
3.1.1 Tamo de Arroz
Dentro del proceso de producción después de la recolección se obtienen tres
productos: el principal y de mayor interés el arroz blanco, el arroz integral y el tamo
de arroz. Este último, es un tejido vegetal compuesto de una matriz amorfa que
contiene pectina, proteínas, lignina, celulosa y hemicelulosa, cuenta aproximadamente
con un 54% de porosidad, gracias a estas características es utilizado como abono para
cultivos y como alimento para animales (Linda,1997).
3.1.1.1 Problemática
El tamo de arroz a pesar de ser aprovechado naturalmente en escasas ocasiones, es
considerado por la mayoría de productores como un desecho, debido a su gran
producción se acumulan considerablemente y se vuelve en un subproducto difícil de
eliminar. Debido a que deshacerse de él es complicado y costoso, la mayoría de
agricultores recurren a la incineración al aire libre de este desecho por periodos de 15
a 20 días provocando indirectamente una contaminación ambiental por gases
resultantes de la combustión. Además de ser la forma más fácil y económica, la
incineración les da el agregado de poder eliminar esporas de hongos patógenos como
Pyricularia oryzae, bacterias y semillas de mala hierba asimismo de reincorporar al
suelo algunos compuestos importantes como el Nitrógeno, fósforo, potasio y sílice
(Navarro, 2008).
3.1.1.2 Posibles soluciones
Dejar de incinerar este compuesto es lo adecuado y necesario para la atmosfera ya
que es importante generar nuevas ideas de aprovechamiento sin afectar el medio
ambiente. Muchos autores proponen incorporar estos desechos de nuevo al suelo,
utilizando en conjunto fertilizantes químicos como N, P2O5, K2O, entre otros,
evitando las emisiones de metano y remineralizando el suelo con Nitrógeno y Fosforo
(Sarkar, 1997). Estos fertilizantes químicos aunque favorecen y proporcionan nuevos
nutrientes para el suelo tienen un alto costo, además de ser tóxicos en altas
concentraciones pueden también llegar a producir sustancias aún más recalcitrantes
de lo que se esperaba (Vieira,1999).
Por eso en la actualidad se imponen nuevas ideas en contra del usual y constate uso de
fertilizantes químicos, una de ellas son los bioinoculantes o inoculantes del suelo, son
enmiendas agrícolas que utilizan beneficiosos microorganismos para promover la
salud de las plantas y el suelo sin generar compuestos químicos altamente tóxicos ni
recalcitrantes.
3.2. Generalidades de Penicillium sp.
Penicillium sp., uno de los géneros de hongos más abundantes en el suelo, es un hongo
filamentoso, heterótrofo, aerobio facultativo, capaz de degradar celulosa, quitina,
almidón, azúcares, lignina, entre otros, es utilizado en diversos campos de la industria
principalmente en alimentos, farmacéutica y biotecnología (Carrillo, 1999)
3.2.1 Clasificación Taxonómica
Reino: Fungi
Subdivisión: Ascomycota
Clase: Eurotiomycetes
Orden: Eurotiales
Familia: Trichocomaceae
Género: Penicillium
3.2.3 Características morfológicas y fisiológicas
En cuanto a su morfología, Penicillium sp. cuenta con conidióforos simples o
ramificados, terminados por racimos en fialides en forma de botella, las
ramificaciones con que cuenta se ubican formando verticilos, el patrón de
ramificación puede ser sencillo (no ramificado o monoverticilado) con dos
ramificaciones (biverticilado) y de tres o más ramificaciones. (Carrillo, 1999)
Sus formas reproductivas son los conidios producidos como una alternativa de
dispersión cuando en el punto de crecimiento se agotan los nutrientes, generados en
el ápice de la fialide debido a la división del núcleo formando cadenas con un orden de
producción del conidio basipetalo, estos conidios se desprenden fácilmente de la
célula que le da origen, son inmóviles y no se forman por segmentación del
citoplasma, ni dentro de una estructura o saco. (Carillo, 1999)
El crecimiento óptimo de Penicillium sp. se obtiene a 25°C en medios de cultivo como
Czapek o malta. Sus colonias crecen rápidamente en tonos blancos y amarillos cuando
su micelio esta joven y tornándose verdoso cuando demuestra su madurez. Su
macroscopia demuestra tener textura aterciopelada, pulverulenta y ligeramente
algodonosa.
3.2.3.1 Conidiogenesis
Es la secuencia de eventos que resultan en la formación de conidios y las células que lo
producen. Se tiene en cuenta el origen del conidio, el origen de la pared del conidio, el
orden de producción y arreglo de los conidios, el proceso de proliferación de la célula
conidiogénica y la presencia de células conidiogénicas especiales.
La formación de conidios en especies de Penicillium implica la diferenciación del
compartimento apical en una célula reproductora especializada llamada fialide, que
se somete a sucesivas divisiones mitoticas, cada una dando lugar a una nueva célula
hija especializada llamada conidio. (Cole et al, 1969)
Roncal et al, describieron cuatro etapas sucesivas del proceso de conidiogenesis para
Penicillium cyclopium, comienza con un crecimiento apical en las hifas vegetativas,
después de cuatro horas la célula apical se delimita por un tabique o una división y
comienza a hincharse y a formarse algunas ramas, a las seis horas aparece la primera
diferenciación de la célula apical en una fialide y finalmente ocurre una división del
núcleo en el apice de la fialide y se produce el primer conidio a las siete horas. (Roncal
et al, 2002)
3.2.3.2 Germinación
La germinación puede ser considerada como uno de los pasos principales del
desarrollo de un hongo, consiste básicamente en los eventos secuenciales e
irreversibles que transforman el contenido de la espora fúngica a su forma somática.
En este proceso ocurren cambios morfológicos y fisiológicos, como hinchazón del
conidio o espora, división del núcleo, incremento en el número de ribosomas y
mitocondrias, aumento significativo en la cantidad de retículo endoplasmático y
desaparición de cuerpos lipídicos.
Luego de que el conidio o la espora germinan, uno o más tubos germinales se forman a
partir de esta, este tubo germinal se ubica en cualquier punto de la superficie de la
espora o desde un poro ya determinado por la pared del conidio, este aumenta poco a
poco de tamaño y se extiende lentamente migrando los organelos y el núcleo al tubo
germinal permitiendo por medio de una extensión apical el origen y desarrollo del
micelio (Griffin, 1981).
3.3 Factores importantes en la conidiogésis de Penicillium sp.
Son muchos los parámetros y factores que afectan el desarrollo del hongo, entre los
que encontramos la cantidad de inóculo, la fuente de carbono y de nitrógeno, la
relación C:N, la humedad y la actividad del agua, la aireación y la transferencia de
oxígeno, la regulación de la temperatura y del pH, entre otros.
Un medio de cultivo es un soporte primordial y fundamental para el desarrollo de un
microorganismo, así como para sus estructuras vegetativas y reproductivas, aportan
macronutrientes y micronutrientes que estimulan o al contrario desfavorecen su
crecimiento y desarrollo. Los hongos pueden crecer en diversos sustratos, es por ello
que los nutrientes utilizados y las condiciones nutricionales de cultivo son factores
realmente importantes en el desarrollo del hongo ya que pueden afectar sobre la
producción de biomasa, de micelio y de formas reproductivas.
3.3.1 Fuente de carbono
Los organismos fotosintéticos, y los microorganismos que oxidan compuestos
inorgánicos, utilizan como fuente de carbono su forma más oxidada (CO2). Los otros
organismos, obtienen el carbono fundamentalmente de materiales orgánicos. Gran
parte del carbono de los materiales orgánicos, es utilizado como fuente de energía y es
excretado de la célula como CO2, que es el principal producto de la respiración.
Cuando el mecanismo productor de energía es la fermentación, parte del carbono es
excretado como CO2 y compuestos orgánicos. Las sustancias orgánicas cumplen un
doble papel nutricional, son fuente de carbono y fuente de energía. No existe en la
naturaleza, ningún compuesto orgánico que no pueda ser utilizado como fuente de
carbono y energía por algún microorganismo.
Diversos autores han estudiado el proceso de conidiogénesis y su comportamiento
frente a diferentes fuentes de carbono, siendo fundamental iniciar con una
concentración de glucosa (10g/L) para Penicillium camemberti como mínimo ya que
para lograr la maduración de los conidios (capacidad de germinación y color verde)
requiere también una concentración inicial suficiente de glucosa (más de 10 g/L) en el
medio
La mayoría de autores toman como objeto de estudio fuentes simples y no complejas
como glucosa, sacarosa entre otras, ya que estimulan el crecimiento con mayor
rapidez y con menos gasto de energía, al contrario las complejas tendrán un mayor
gasto de energía al utilizar mecanismos propios para poder asimilar de forma más
simple este nutriente, pero aportaran más nutrientes, vitaminas y estimulantes de
forma natural y algunas podrán servir de soporte para el crecimiento del hongo. De
Aquino et al comparan una fuente compleja como el almidón con tres fuentes simples
como maltosa, dextrosa o glucosa y sacarosa, obteniendo un mayor crecimiento y
esporulación con sacarosa, en cuanto combinaciones proponen sacarosa con nitrato
de potasio (reportado también por Krasniewski et al). Y peptona y sacarosa para
Penicillium sclerotigenum.
En cuanto a las fuentes complejas, se encuentra el salvado de trigo que ha sido
reportado por Camassola et al, utilizado como fuente para la producción de celulasas y
hemicelulasas obteniendo satisfactorios resultados, en cuanto a la harina de arroz se
espera una buena asimilación sus componentes al igual que el salvado de trigo le
proveen de energía necesaria para su crecimiento pero no se ha comprobado que
induzca de algún modo la conidiogenesis.
3.3.2 Fuente de nitrógeno
El nitrógeno en los compuestos orgánicos de las células se presenta en estado
reducido como grupo amino. La gran mayoría de los organismos asimilan el nitrógeno
en estado inorgánico como nitratos, que posteriormente son reducidos. Muchos
organismos no fotosintéticos como bacterias y hongos también pueden asimilar el
nitrógeno como nitrato, otros microorganismos son incapaces de llevar a cabo esta
reducción y utilizan como fuente de nitrógeno formas reducidas de este. Las
necesidades de nitrógeno se cubren frecuentemente con materiales orgánicos que
contienen nitrógeno en estado reducido
Para Penicillium sp. ha sido de gran interés la fuente de nitrógeno y al igual que la de
carbono ha sido también estudiada, por ejemplo, Krasniewski et al. propone fuentes de
nitrógeno como fosfato de amonio y nitrato de potasio, triplicando el índice de
esporulación a fuentes como Sulfato de amonio y nitrato de sodio, teniendo en cuenta
que la limitación de este macronutriente favorece la conidiogénesis para Penicillium
camemberti y otras especies.
3.3.2 Crecimiento en medio solido
El crecimiento en medio sólido indica un cultivo aerobio o anaerobio de
microorganismos que crecen en la superficie o al interior de una matriz sólida porosa.
Esta matriz puede estar constituida por un sustrato humidificado capaz de absorber
los nutrientes que se encuentran disueltos en una solución sin escurrimiento de
líquidos. EI soporte sólido procura la porosidad al medio de cultivo mientras que el
agua lleva disuelta la solución nutritiva con las fuentes de carbono y de nitrógeno y los
demás factores de crecimiento (Roussos,1996).
La naturaleza del sustrato sólido empleada es la más importante factor que afecta el
crecimiento del microorganismo y su selección depende de varios factores,
principalmente relacionados con el costo y la disponibilidad y por lo tanto puede
implicar la proyección de varios residuos agroindustriales (Roussos,1996).
3.3.3 Crecimiento en medio liquido
La formación de conidios de especies de Penicillium sp. en medio líquio ha sido de
interés por mucho tiempo, principalmente en cultivo sumergido que permite una
mejor homogeneidad de la biomasa y un proceso de escalamiento más fácil y
automático. Tales estudios han demostrado que la formación de conidios se puede
mejorar principalmente por:
La adición de calcio
Tipo de fuente de nitrógeno
La limitación de glucosa
Compuestos intermediarios y derivados del ciclo de Krebs .
Además, la mayoría los hongos filamentosos desarrollan totalmente micelio
vegetativo en un medio sumergido, lo cual es consistente con los hallazgos que
diferenciaban estructuras, en algunos casos no se encuentra diferenciación debido a
varios factores importantes.
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
Evaluar el efecto de diferentes fuentes de carbono y de nitrógeno sobre la
conidiogénesis de Penicillium sp. HC1 en medio sólido y líquido
4.2 Objetivos específicos
4.2.1 Determinar el efecto de diferentes fuentes de carbono y nitrógeno sobre la
producción de conidios, la morfología y la velocidad de crecimiento de Penicilliium sp.
HC1 en medio sólido y líquido.
4.2.2 Determinar el efecto de la mezcla de fuentes de nitrógeno orgánicas e
inorgánicas sobre la producción de conidios, y la velocidad de crecimiento de
Penicillium sp. HC1 en medio sólido y líquido.
4.2.3 Evaluar la tolerancia a temperatura de los conidios obtenidos en diferentes
combinaciones de fuente de carbono y nitrógeno.
5. METODOLOGÍA
El presente trabajo se desarrolló en el laboratorio de Fermentaciones del Instituto de
Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia en la ciudad de Bogotá D.C.
5.1 Microorganismo
5.1.1 Reconstitución de la cepa
Se llevó a cabo la reactivación de la cepa nativa de Penicillium sp. HC1, conservada en
glicerol al 25% (v/v) a -20°C. Se reactivó en medio PDA (agar papa dextrosa) por
siembra masiva con 250 µl de suspensión, y se incubó por ocho días a 25°C.
5.1.2 Producción de inóculo
A partir de las cajas previamente reactivadas, se procedió a realizar una recolección
de conidios, con solución salina al 0,85% (p/v) y tween 80 (0,1%) removiendo
delicadamente micelio y conidios con un rastrillo de vidrio, se recolectó la solución
resultante y se filtró directamente con una jeringa de 50 ml con algodón.
Posteriormente se realizó por duplicado lavado con solución salina y tween 80 y se
centrifugó a 5000 rpm por 15 minutos, se desechó el sobrenadante y se reconstituyó
el sedimento con solución salina y tween 80. Finalmente, se procedió a realizar el
recuento en Cámara de Neubauer para obtener el recuento inicial del inóculo, que se
estandarizó en una concentración de 108 conidios/ml.
5.1.3 Fuentes de Carbono y de Nitrógeno evaluadas
Se evaluaron cinco fuentes de carbono, clasificadas en fuentes simples: sacarosa y
glucosa y fuentes de carbono complejas: almidón de yuca, salvado de trigo y harina de
arroz, cada una de las fuentes complejas fueron analizadas en el Laboratorio de Suelos
de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional donde se determinó el
porcentaje de nitrógeno y carbono total de cada fuente compleja de carbono (Anexo
1).
En cuanto a las fuentes de nitrógeno se evaluaron cuatro, dos orgánicas: triptosa y
extracto de levadura y dos inorgánicas: fosfato de amonio y nitrato de potasio. Al final
se obtuvieron 20 combinaciones para ser evaluadas mostradas en la siguiente tabla:
Cada uno de los medios propuestos se diseñó con una relación C:N de 10:1 con
limitación de nitrógeno, se realizó la conversión molar a partir de cada componente.
Los medios se prepararon con cada una de las fuentes de carbono y nitrógeno como
macronutrientes y adicionalmente se adicionó una solución de sales y micronutrientes
mostradas a continuación:
Sales para cada uno de estos medios:
MEDIO
Fuente de
Carbono
Concentración
(g/L)
Fuente de
Nitrógeno
Concentración
(g/L)
ME1 Sacarosa 20 Triptosa 7,98
ME2 Sacarosa 20 Ext. Levadura 9,18
ME3 Sacarosa 20 (NH4)PO4 4,07
ME4 Sacarosa 20 KNO3 7,08
ME5 Glucosa 20 Triptosa 7,58
ME6 Glucosa 20 Ext. Levadura 8,72
ME7 Glucosa 20 (NH4)PO4 3,86
ME8 Glucosa 20 KNO3 6,73
ME9 Almidón de Yuca 21,59 Triptosa 7,88
ME10 Almidón de Yuca 21,59 Ext. Levadura 9,6
ME11 Almidón de Yuca 21,59 (NH4)PO4 4,57
ME12 Almidón de Yuca 21,59 KNO3 7
ME13 Salvado de Trigo 27 Triptosa 7,42
ME14 Salvado de Trigo 27 Ext. Levadura 9,04
ME15 Salvado de Trigo 27 (NH4)PO4 4,3
ME16 Salvado de Trigo 27 KNO3 6,58
ME17 Harina de Arroz 21,31 Triptosa 5,67
ME18 Harina de Arroz 21,31 Ext. Levadura 6,9
ME19 Harina de Arroz 21,31 (NH4)PO4 3,28
ME20 Harina de Arroz 21,31 KNO3 5,033
Concentración (g/L)
MgSO4 7H2O 0.5
KCl 0.5 KH2PO4 1 CaCO3 0.5
Micronutrientes (µl/L) 100
Micronutrientes
Concentración
(g/L) FeSO4 2 CaCl2 2
CoCl2 6H20 0.2 CuCl2 2H20 0.01 NiCl3 6H20 0.2 MnCl2 4H20 0.03 ZnSO4 7H20 0.1
H3BO3 0.3 NaMoO4 2H20 0.03
En solución 0.1 N de HCl
Se ajustaron a pH 5,5 y fueron servidos en cajas de Petri. Para los medios líquidos se
utilizaron Erlenmeyers de 100 ml manejando una relación 1/5 con 20 ml de volumen
de caldo.
5.1.4 Siembra
En cada uno de los medios sólidos se realizaron pozos centrales de aproximadamente
8 mm de diámetro y en cada uno de ellos se sembraron 50 µl de inóculo con agar agua
(50% inóculo + 50% agar agua), se incubaron durante 8 días a 25°C. El diseño
experimental fue completamente al azar con medidas repetitivas en el tiempo y tres
repeticiones por tratamiento.
En los medios líquidos se inoculó el 10% con suspensión de conidios de Penicillium sp.
HC1 (numeral 5.1.2), es decir se inocularon 2 ml en cada Erlenmeyer, y se dejaron
durante 8 días a 150 rpm a 25°C, se realizaron tres réplicas a diferentes tiempos. Se
realizaron tres repeticiones por tratamiento.
5.2 Parámetros Evaluados
5.2.1 Medio sólido
5.2.1.1 Crecimiento Radial
Se realizaron mediciones a los 2, 4, 6 y 8 días de crecimiento, se tomarón 3 colonias y
se midió el diámetro 4 veces en diferentes direcciones y se procedió a hallar el
promedio de las 4 mediciones.
5.2.1.2 Recuento de Conidios
A los ocho días de crecimiento se midieron todas las colonias, posteriormente se
adicionaron 10 ml de solución salina 0,85% p/v + Tween 80 0,1/ v/v, y con rastrillo se
raspó la superficie de cada colonia, se recolectó la suspensión resultante y se filtró
directamente con una jeringa de 50 ml con algodón. Posteriormente se realizó por
duplicado un lavado con solución salina y tween 80 y se centrifugó a 5000 rpm por 15
minutos, se desechó el sobrenadante y se reconstituyó el sedimento con solución
salina y tween 80. Finalmente, se procedió a realizar el recuento en cámara de
Neubauer para obtener el recuento final para cada medio. El resultado se expresó en
conidios/mm2 realizando la siguiente formula
5.2.1.3 Microscopía
Al cuarto día de crecimiento se observó una colonia representativa de cada
tratamiento, por impronta en el microscopio óptico LEICA DM1000 utilizando lentes
𝑅𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑡𝑜 . 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑖𝑡𝑢𝑖𝑑𝑜
á𝑟𝑒𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 =
𝑪𝒐𝒏𝒊𝒅𝒊𝒐𝒔
𝒎𝒎𝟐
de 40 y 100x. Se observaron las estructuras reproductivas propias de Penicillium sp.
HC1, adicionalmente se tomaron fotografías con la cámara digital Leica modelo ICC50
HD y se realizaron mediciones del conidióforo, los conidios y fialides en el programa
Las EZ.
5.1.2 Medio líquido
5.1.2.1 Recuento de Conidios
Al finalizar el crecimiento de 8 días de cada tratamiento se muestrearon 10 ml de los
20 ml de cultivo, estos 10 ml se sometieron al mismo procedimiento del numeral
5.2.1.2. Finalmente, se procedió a realizar el recuento en Cámara de Neubauer para
obtener el recuento obtenido para cada tratamiento.
5.1.2.2 Biomasa
Para los ocho medios con fuente de carbono simple: sacarosa y dextrosa y para los
cuatro medios con almidón de yuca como fuente compleja de carbono se midió
biomasa por peso seco, se muestrearon los 10 ml restantes de cultivo y se
centrifugaron a 6000 rpm a 4°C, se descartó el sobrenadante y el sedimento se secó
en un horno a 60°C hasta peso constante, teniendo en cuenta el peso inicial del tubo
falcon vacío.
5.1.2.3 Microscopía
Al octavo día de crecimiento se observó, en el microscopio óptico LEICA DM1000
utilizando lentes de 40 y 100x. Se observaron las estructuras reproductivas propias
de Penicillium sp. HC1, adicionalmente se tomaron fotografías con la cámara digital
Leica modelo ICC50 HD y se realizaron mediciones del conidióforo, los conidios y
fialides en el programa Las EZ.
5.2 Pruebas de Germinación
Cada suspensión obtenida tanto de los medios sólidos como los líquidos fue sometida
a las pruebas de germinación a 45 y 50°C.
Se partió de una concentración de 1x108, para los medios líquidos fue necesario
concentrar la muestra debido a sus bajos recuentos y para los sólidos fue necesario
diluir por los altos recuentos. Se tomó 1000 µl de suspensión en un tubo eppendorf
por duplicado y se sometieron durante una hora a 45°C en baño termostático, se
repitió el mismo procedimiento pero con exposición durante una hora a 50°C. Luego a
cada muestra se le realizaron dos diluciones 1:10, y se procedió a sembrar de la
última dilución 5 µl en agar agua. Se incubó de 18 a 22 horas y se realizó la lectura de
cada muestra sembrada, observando directamente la fracción de agar agua donde fue
sembrada la muestra.
5.3 Análisis estadístico
Los resultados fueron analizados con el programa GraphPad Prism 5 y SPSS. Donde se
realizó un ANOVA de una vía y se realizó comparación de medias de Tukey al 0,05 de
significancia.
5.4 Combinación de fuente de nitrógeno orgánicas e inorgánicas
Después de haber sido evaluados los 20 medios del numeral 5.1.3 se escogieron los
cuatro mejores medios realizando una tabla de ponderación (Anexo) con las variables
de respuesta basados en los resultados del análisis estadístico mencionado en el
numeral 5.2. En el caso de los medios sólidos se evaluaron: Crecimiento (30%),
Producción de conidios (35%) y Germinación (35%). Para medios líquidos:
producción de conidios (50%) y germinación (50%). Cada Variable de respuesta tenía
una ponderación de 1 a 3 siendo 1 el de menor calificación y 3 el de mayor calificación.
Gracias a esta tabla de ponderación se escogieron los medios ME11, ME13, ME15 y
ME19 como los tratamientos con mayor calificación para ser luego ser evaluados
observando el efecto de la combinación de fuentes orgánicas e inorgánicas de
nitrógeno conservando la misma relación C:N. Como variables de respuesta en medio
sólido se evaluaron crecimiento radial y recuento de conidios (conidios/mm2) y en
medio líquido recuento de conidios (conidios/ml). Las combinaciones evaluadas se
muestran en la siguiente tabla
Fuente de Carbono Fuentes de Nitrógeno
ME11m Almidón de Yuca E. Levadura (NH4)PO4
ME13m Salvado de Trigo Triptosa (NH4)PO4
ME15m Salvado de Trigo E. Levadura (NH4)PO4
ME19m Harina de Arroz E. Levadura (NH4)PO4
5.5. Evaluación cualitativa de solubilización de fosfatos.
Esta prueba se realizó adicional al trabajo en mención debido a la evidente presencia
de halos a los dos días de crecimiento en los medios con fuente inorgánica de
nitrógeno fosfato de calcio. Se realizó evaluación cualitativa en medio SMRS y NBRIP,
sembrando como control negativo una cepa de Trichoderma viride, control positivo
Penicillium janthinellum¸ y como cepa de estudio Penicillium sp. HC1.
Se realizaron pozos de aproximadamente 8 mm y se depositaron 50 µl de suspensión
de cada uno de estos hongos, se incubo durante 5-6 días a 25°C, y se observó el halo
de solubilización.
6. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1 Efecto de la fuente de carbono y de nitrógeno sobre la conidiogénesis de
Penicillium sp. HC1
Con el propósito de observar diferencias y comportamientos característicos en la
conidiogénesis de Penicillium sp. HC1 se evaluaron diferentes fuentes de carbono y
nitrógeno determinando su efecto sobre la producción de conidios, crecimiento radial
y morfología del hongo, en medio sólido; y producción de conidios, biomasa y
morfología en medio líquido.
6.1.1 Medio sólido
El crecimiento en estado sólido se define como el proceso realizado en un material no
soluble que actúa como soporte físico y fuente de nutrientes en ausencia de flujo libre
de agua (Pandey,1992).
Los nutrientes empleados y su naturaleza son factores importantes en el proceso de
crecimiento de un microorganismo e influye directamente en su desarrollo. La
selección de estas fuentes de nutrientes está relacionada principalmente por el costo y
su disponibilidad es por esto que son de gran interés algunos residuos agro-
industriales de bajo costo o fuentes naturales con gran contenido nutricional que
proporcionen lo necesario para el crecimiento del microorganismo (Bapat et al, 2003).
En este estudio se utilizaron dos fuentes simples de carbono: glucosa y sacarosa y tres
fuentes complejas como lo son: Almidón de yuca reserva natural de la yuca en sus
raíces, salvado de trigo producto de refinar el grano de trigo y harina de arroz que es
arroz blanco o integral molido, estas tres fuentes complejas además de proveer
carbono y nitrógeno, cuentan con vitaminas y minerales que pueden llegar a
favorecer, o tal vez pueden ser tóxicos para el microorganismo, se necesita de un
estudio de caracterización de todos los compuestos encontrados en cada una de estas
fuentes para saber el efecto sobre el desarrollo de un microorganismo según sus
requerimientos nutricionales.
En cuanto a Penicillium sp. la fermentación en estado sólido es la indicada para la
producción de conidios, pero no es la establecida en la industria por su alto costo de
escalamiento, problemas con la esterilidad y falta de control en la humedad,
facilitándole a la fermentación líquida una alta reproducibilidad, facilidad para escalar
y bajos costos (Bockelmann,1998).
6.1.1.1 Efecto sobre la producción de conidios
Al evaluar el recuento de conidios resultantes en diferentes fuentes de carbono y de
nitrógeno se obtuvo que el microorganismo creció y generó conidios en todos los
tratamientos mostrando recuentos en la mayoría de tratamientos de 1x105
conidios/mm2 como se observa en la Figura 6.1, lo que confirma que todos los medios
contaron con un balance nutricional para el crecimiento y conidiogénesis de
Penicillium sp. HC1.
La comparación de medias de Tukey al 0,05 de significancia detectó diferencias
estadísticas en los tratamientos. Los medios ME7, ME17, ME18 y ME5, se ubicaron en
el grupo de menor significancia con los mas bajos recuentos con 8,2x104, 9,9x104,
1,46x105 y 1,5x105 conidios/mm2 respectivamente. Los tratamientos ME7 y ME5
coinciden en tener como única fuente de carbono glucosa corroborando los resultados
de Aquino et al 2005, donde evaluaron el efecto sobre la conidiogénesis de Penicillium
sclerotigenum de diferentes fuentes de carbono y nitrógeno, mostrando bajos
recuentos de conidios con glucosa en comparación con la sacarosa; al igual los medios
ME17 y ME18 corresponden a una misma fuente de carbono: Harina de Arroz, una
fuente natural y compleja que contiene una gran cantidad de ácidos grasos saturados,
poliinsaturados y monoinsaturados, que pueden llegar a inhibir el crecimiento y
esporulación de Penicillium sp. HC1. En cuanto a los mejores recuentos el salvado de
trigo demostró ser un buen sustrato para la producción y viabilidad de los conidios
como lo fue estudiado por Ludemann et al, 2010, por su parte el almidón junto con el
extracto de levadura obtuvo un buen recuento de acuerdo con lo reportado por Li y
Holdom (1995) que reportaron un buen crecimiento de M. anisopliae con almidón
soluble sugiriendo su uso para la producción masiva del microorganismo.
En cuanto a la fuente de nitrógeno de estos cuatro medios con escasa producción de
conidios encontramos el efecto de dos fuentes orgánicas como lo son la triptosa y el
extracto de levadura y una fuente inorgánica como lo es el fosfato de amonio, se
atribuye este bajo recuento en gran proporción a la fuente de carbono ya que estas
mismas fuentes de nitrógeno reportaron los mejores recuentos de conidios en los
tratamientos ME15, ME13, ME10 y ME14, pero con diferentes fuentes de carbono.
La influencia de las cuatro fuentes de nitrógeno evaluadas: triptosa, extracto de
levadura, fosfato de amonio y nitrato de potasio no afectaron de manera radical en el
recuento de conidios en medio sólido ya que estuvieron distribuidas tanto en bajos,
medianos y altos recuentos de conidios en los 20 tratamientos, además de ser factores
limitantes de crecimiento y esporulación que en altas concentraciones no tienen
efecto sobre la esporulación (Krasniewki et al., 2006). A pesar de no encontrar un
efecto marcado en estas fuentes de nitrógeno las dos fuentes orgánicas evaluadas:
triptosa y extracto levadura en combinación con la sacarosa, el salvado de trigo y el
almidón mostraron recuentos de 6,46x105, 5,93x105 y 5,63x105 conidios/mm2
respectivamente, estas fuentes orgánicas favorecen el crecimiento hifal ya que son
necesarias para comenzar el crecimiento vegetativo del microorganismo, la célula
pierde su reserva endógena de nitrógeno cuando la utiliza para la síntesis de
proteínas de novo, estas fuentes orgánicas suplen la necesidad de nitrógeno, utilizadas
durante los eventos iniciales de la germinación (Smith et al, 1981)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
3
4
5
6
Medio
Lo
g10 C
on
idio
s/m
m2
Figura 6.1 Producción de conidios en medio sólido a los 8 días de crecimiento
(conidios/mm2 (Log10)). Los dos tratamientos resaltados en rojo indican los medios
con menor recuento de conidios/mm2
6.1.1.1 Efecto sobre el crecimiento radial
El crecimiento radial o diametral es uno de los métodos para evaluar y evidenciar
físicamente la capacidad de un hongo para invadir y adaptarse a los nutrientes sobre
un sustrato, al igual la velocidad de crecimiento indica el desplazamiento que puede
alcanzar para colonizar algún sustrato en un determinado tiempo (Gutierrez et al,
1999). El medio se inocula en el centro ya sea por punción central u otras técnicas
para evitar crecimiento de colonias secundarias, y posteriormente el hongo crece
como una colonia heterogénea circular, compuesta de diferentes secciones en cuanto
a morfología y algunas actividades metabólicas. La formación de conidios se produce
principalmente en la zona más madura situada en el centro donde fue inoculado, el
desarrollo de conidioforos y producción de conidios tiene lugar simultáneamente en
la superficie de la colonia ya la diferenciación de la hifa para formar el conidióforo
comienza con la elongación hacia la periferia de una hifa, además de contar con una
secreción abundante de proteínas en la periferia de la colonia (Krijgsheld et al, 2012).
Al evaluar el crecimiento radial de Penicillium sp. HC1 con diferentes fuentes de
carbono y de nitrógeno, se observaron diferencias en cuanto a su macroscopía
(observar Figuras 6.2 y 6.3), además estadísticamente se encontraron diferencias
significativas. El mayor crecimiento radial a los ocho días se encontró en los medios
ME5 y ME6, se infiere que no es directamente proporcional con el recuento de
conidios ya que como se mencionaba en el anterior numeral estos medios con glucosa
hacen parte de los más bajos recuentos, se corrobora una vez mas que no hay
proporcionalidad encontrando en los medios ME13 y ME14 un menor diámetro a los 8
días de crecimiento y a la vez encontrándose en los recuentos de conidios más altos.
Esto indica que la teoría de apreciación que entre más diámetro tenga la colonia va a
tener mayor recuento de conidios es falsa.
Figura. 6.2 Crecimiento radial en fuentes simples de carbono combinadas con fuentes orgánicas e inorgánicas de nitrógeno. (A) Dos días de crecimiento (B) Cuatro días de crecimiento (C) Seis días de crecimiento (D) Ocho días de crecimiento. La tabla naranja indica el orden de cada sección con su medio respectivo.
Figura. 6.3 Crecimiento Radial de fuentes complejas de carbono combinadas con fuentes orgánicas e inorgánicas de nitrógeno. (A) Dos días de crecimiento (B) Cuatro días de crecimiento (C) Seis días de crecimiento (D) Ocho días de crecimiento. La tabla naranja indica el orden de cada sección con su medio respectivo. En cuanto al efecto de la fuente de nitrógeno no se aprecia una diferencia notable, ya
que la triptosa y el extracto de levadura acompañados de diferentes fuentes de
carbono se encuentran tanto en los mas altos como los mas bajos diámetros de colonia
a los 8 días de crecimiento como se observa en la Figura 6.4, se ha reportado que el
extracto de levadura (fuente de nitrógeno orgánico y fuente de vitaminas) es
requerido para el crecimiento hifal de algunos hongos filamentosos como, Hirsutella
strigosa, Hirsutella sp., Metarhizium sp. y Nomuraea sp (Vimala Devi, 1994). No se
corroboró la afirmación de Aquino et al, 2005 que el nitrato de potasio junto a la
sacarosa favoreció el crecimiento y la esporulación de Penicillium sclerotigenum.
Figura. 6.4 Crecimiento Radial de fuentes complejas de carbono combinadas con fuentes orgánicas e inorgánicas de nitrógeno a los ocho días de crecimiento. Los tratamientos con color azul indican los crecimientos radiales ubicados en el grupo con mayor significancia; los rojos con menor significancia.
Los resultados de cada tratamiento se sometieron a un análisis de regresión,
obteniendo la pendiente que indica la velocidad de crecimiento, en la mayoría de
regresiones los coeficientes de correlación estuvieron cercanos a 1 mostrando un
comportamiento lineal coherente con el crecimiento de un hongo. En la tabla 1 se
observan los valores de las velocidades obtenidas para cada medio, ordenadas de
mayor velocidad a menor. Medios como ME6, ME19, ME5 y ME12 representantes de
las cuatro fuentes de nitrógeno encabezan las mayores velocidades de crecimiento,
concluyendo que la fuente de nitrógeno no afecta ni al recuento de conidios, ni al
crecimiento radial ni a la velocidad de crecimiento. La velocidad de crecimiento a nivel
industrial juega un papel importante ya que evita posibles contaminaciones por el
largo tiempo de incubación y al igual disminuye tiempos en el proceso de
fermentación (Gutierrez et al, 1999).
Tabla 1. Velocidad de crecimiento radial de Penicillium sp. HC1 con diferentes fuentes de carbono y de nitrógeno.
Al observar y analizar los datos de producción de conidios y crecimiento radial se
puede afirmar que el medio solido sirve como el soporte perfecto para la producción
de conidios, que la fuente de carbono afecta directamente sobre el recuento y sobre el
diámetro de la colonia, pero la fuente de nitrógeno no tiene efecto alguno sobre estas
variables, fuentes como el salvado de trigo muestran una buena eficiencia al tener
recuentos de conidios altos con diámetros de colonia reducidos, pero con velocidades
de crecimiento bajas. Una de las mejores respuestas a las tres variables evaluadas fue
el Almidón de yuca como fuente compleja de carbono, ya que con las cuatro fuentes de
nitrógeno clasifico en los grupos con mayor significancia en recuento de conidios,
crecimiento radial y velocidad de crecimiento.
6.1.2 Medio Líquido
El crecimiento y esporulación de especies de Penicillium sp. en fermentación
sumergida ha sido de gran interés para la producción de antibióticos y otros
metabolitos secundarios (Foster et al, 1945). También ha sido estudiado
Medio Velocidad
mm/día Medio
Velocidad
Mm/día
6 8,4666 9 6,5388
19 8,4183 18 6,3875
5 8,0181 3 6,2909
12 7,9665 8 6,2226
11 7,5438 15 5,6688
20 7,2096 4 5,5602
1 7,1575 16 5,5458
2 6,9071 10 5,0854
17 6,8438 13 4,379
7 6,7984 14 4,1083
detalladamente el proceso de inducción de la esporulación en fermentación
sumergida por autores como Bockelmmann, Ludemann, entre otros, mostrando
variables importantes como la adición de calcio al medio, limitación de nitrógeno,
altas y bajas concentraciones de glucosa, entre otros.
6.1.2.1 Producción de conidios
Fisiológicamente el desarrollo de Penicillium sp. en medio líquido comienza desde la
germinación de los conidios, después de 12 horas de ser inoculados empiezan a
germinar y a las 24 horas la gran mayoría están germinados formando un micelio
joven(Bockelmann et al,), en medio sólido el hongo encuentra las condiciones optimas
para su diferenciación ya que la hifa esta expuesta directamente al aire protegida por
la hidrofobina activando la ruta de señalización de la esporulación involucrando genes
reguladores como fluG y rodA, en medio líquido el desarrollo de este proceso no es tan
fácil, cuando la hifa es sumergida en el medio y por su constante agitación reprime
genes que activan directamente la ruta de esporulación y al contrario activa la vía de
señalización de la proteína G directamente implicada en crecimiento vegetativo (Park,
2012), por estas razones no es fácil obtener recuentos tan altos como en la
fermentación sólida, por lo que es de gran interés estudiarlo para la industria.
En la figura 6.5 se observan los recuentos obtenidos en medio líquido después de 8
días de crecimiento, evidenciando notablemente el efecto de fuentes simples y
complejas de carbono, los tratamientos señalados con color rojo indican los medios
ubicados en el grupo con menor significancia en cuanto a conidios/ml dentro de los
que encontramos los primeros 8 tratamientos pertenecientes a fuentes simples de
carbono, como sacarosa y glucosa, aunque la mayoría de autores reporten la
importancia de la glucosa en la esporulación no hay comparaciones con fuentes
complejas como las evaluadas en este trabajo, Krasniewski et al ,2006, afirman la gran
importancia de la presencia de glucosa en el medio ya que sin glucosa el recuento de
esporas es de 60-70 veces menor que en la presencia de glucosa, mientras que otros
autores reportan que sin glucosa pero con adición de acetato y citrato como fuentes
de carbono aumenta la ramificación y la producción de conidios (Bockelmann et al,
1999).
En los medios con fuentes complejas como el almidón de yuca, el salvado de trigo y la
harina de arroz muestran recuentos hasta de 1x107 conidios/ml, demostrando que la
compleja composición de estos sustratos posiblemente proporcionó los
requerimientos nutricionales óptimos para la conidiogénesis del microorganismo.
Además sustratos como el salvado de trigo permiten que el hongo pueda adherirse a
esta estructura y colonizarla, sirviéndole de soporte para su crecimiento.
Figura. 6.4 Recuento de conidios de Penicillium sp. HC1 después de 8 días en diferentes combinaciones de fuentes de carbono y de nitrógeno.
En cuanto a la fuente de nitrógeno es posible que algunos de los aminoácidos
contenidos en estas fuentes complejas induzcan la expresión de los genes que
controlan la conidiogénesis, ya que para que ocurra esta reproducción asexual se
requiere de la activación de cerca de 30 genes implicados en este proceso (Roncal et
al, 2002). Se afirma por varios autores que la limitación de nitrógeno es uno de los
factores más importantes para la conidiogénesis en medio líquido para diversas
especies de Penicillium sp.. Tampoco se observaron diferencias significativas entre
fuentes orgánicas e inorgánicas aunque en microorganismos como P. cyclopium, F.
solani y A. oryzae se reportó la importancia del fosfato de amonio para la formación de
conidios.
1 2 3 4 5 6 7 8 910
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
4
5
6
7
8
Medio
Lo
g 1
0 C
on
idio
s /
ml
Finalmente es importante la presencia de iones calcio en el medio, la mayoría de
autores afirman que es algo esencial en concentraciones (10 mM-14mM) ya que este
se absorbe en las pareces de la célula y acelera la esporulación reprimiendo el
crecimiento vegetativo, al igual en el desarrollo de la fialide se incrementa el gasto en
los niveles de calcio ya que incrementan de 32 nM a 128nM (Bockelmann et al). En
este estudio aunque no se evaluó el efecto del calcio en el crecimiento de Penicillium
sp. HC1, en todos los tratamientos se adicionó como fuente de calcio, carbonato de
calcio en concentración 0,5 g/L, adicionalmente las fuentes complejas de carbono
contaron en su composición con la presencia de calcio, en el caso del salvado de trigo
cuenta con 73 mg de calcio por cada 100 g y la harina de arroz 10 mg por cada 100g,
siendo una variable adicional del porque estas fuentes complejas tuvieron mayores
recuentos de conidios.
6.1.2.2 Biomasa
Una de las variables más importantes en un proceso biológico es la determinación de
biomasa ya que indica indirectamente la eficiencia del proceso en cuestión. Esta
variable de respuesta puede llegar a indicar el consumo y degradación de nutrientes,
tasas de producción y encontrar el balance de masas del sistema, pero también
dependiendo de la naturaleza del sustrato puede llegar a indicar variaciones en los
resultados o no mostrar datos confiables. En este estudio se hallo esta variable
mediante peso seco, excluyendo datos de fuentes complejas de carbono como el
salvado de trigo y la harina de arroz, ya que no se degradaban por completo y
mostraban datos sin normalidad. En la figura 6.5 se muestran los medios con mayor
producción de biomasa como el ME3, demostrando que hubo una degradación del
sustrato y un mayor crecimiento micelial, también coincide en ubicarse como uno de
los tratamientos con mayor recuento dentro de las fuentes simples de carbono y
generar mayor biomasa.
Figura. 6.5 Biomasa (g/L) de Penicillium sp. HC1 después de 8 días en diferentes combinaciones de fuentes de carbono y de nitrógeno. El tratamiento de color azul mostrando una mayor respuesta frente a los demás medios, y el rojo mostrando la más baja respuesta.
6.1.3 Efecto sobre la morfología en medio líquido y sólido
La morfología es una de las variables en las que más se puede observar el efecto de los
nutrientes en que se desarrolla un hongo, en este estudio se evidenciaron diferencias
notorias en la morfología de las fuentes complejas de carbono en cuanto a las simples,
ya que en el caso de las fuentes complejas los conidióforos contaban con mas de 18.
fialides como se puede evidenciar en la figura 6.6, mientras que las fuentes simples
como máximo alcanzaron 10 fialides por conidióforo. El efecto de la fuente de
nitrógeno es importante ya que luego de que el conidio germina requiere de una
fuente exógena de nitrógeno que permita el crecimiento reproductivo y vegetativo
previniendo su autolisis (Papagianni, 2004).
La diferencia entre las morfologías de los medios sólidos con los líquidos es notable,
como anteriormente se ha mencionado son muchas las variables implicadas para
inducir este proceso en fermentación sumergida. El calcio es importante en el medio
líquido ya que al momento de iniciar la germinación del conidio aparece el tubo
germinal y a su vez el microrganismo consume los nutrientes del medio, pero el
MEDIO SOLIDO LIQUIDO MEDIO SOLIDO LIQUIDO
ME1
ME5
ME2
ME6
ME3
ME7
ME4
ME8
ME9
ME13
ME10
ME14
ME11
ME15
ME12
ME16
ME17
ME18
ME19
ME20
Figura 6.6 Formación de estructuras de reproducción en
diferentes fuentes de carbono y de nitrógeno en medio líquido y sólido
crecimiento vegetativo se restringe a una zona específica del conidio y la tasa de
crecimiento depende del flujo de calcio citoplasmático que modula el citoesqueleto,
que controla su extensibilidad. Estos eventos están totalmente relacionados con la
expresión o represión de genes encargados de prender o apagar rutas de esporulación
o rutas de crecimiento vegetativo.
Aunque en la mayoría de microscopias en medio líquido se observa solo crecimiento
vegetativo en algunos medios como el ME8, ME1, ME4 y ME3 se observan estructuras
reproductivas, mostrando conidióforos con escaso número de fialides y con muy
pocos o nulos conidios, en el caso de las estructuras de reproducción para los medios
con más altos recuentos se infiere que estas estructuras fueron lisadas o degradadas
al momento de tomar las fotografías pues se observaron al octavo día de crecimiento
6.2 Efecto de la combinación de fuentes orgánicas e inorgánicas de nitrógeno
sobre la conidiogénesis de Penicillium sp. HC1
La fuente de nitrógeno es uno de los macronutrientes necesario para los hongos para
sintetizar aminoácidos, proteínas y ácidos nucleicos necesarios para el desarrollo y
formación del protoplasma. La mayoría de hongos prefieren fuentes de nitrógeno
orgánicas como urea, gracias a todos los aminoácidos que permiten un rápido
crecimiento del microorganismo. En ocasiones a los medios de cultivo con fuentes
inorgánicas de nitrógeno es necesario adicionar algunos aminoácidos como
asparagina y glutamato que permitan realizar procesos de transaminación a partir de
estos aminoácido (Griffin, 1981).
En pocas ocasiones han sido estudiadas mezclas de nitrógeno orgánico e inorgánico,
en algunos casos han sido utilizadas para contrarrestar la disminución del pH,
utilizando combinaciones como sulfato de amonio/urea y nitrato/urea, neutralizando
el pH. (Rousos,1996).
6.2. 1 Medio Sólido
6.2 .1.1 Crecimiento radial
En este estudio se realizó la mezcla de fuentes orgánicas de nitrógeno (extracto de
levadura y triptosa) con una fuente inorgánica como lo fue el fosfato de amonio,
debido a que individualmente no se obtuvo un efecto notable y se quiso corroborar el
efecto que tenían si se mezclaban. Los resultados no mostraron diferencias
significativas comparandose con los primeros tratamientos, en medio sólido se
obtuvieron macroscopias similares a los medios originales como se observa en la
figura 6.7 y en el crecimiento radial los valores oscilaron igual a los primeros como se
observa en la figura 6.8. Indicando que Penicillium sp. HC1 puede utilizar una variedad
de fuentes de nitrógeno, ya sean fuentes orgánicas, inorgánicas y la mezcla de estas
dos.
Figura 6.7 Crecimiento Radial de ME13m, ME11m, ME15m y ME19m a los 2, 4 y 6 días de crecimiento.
Figura 6.8 Crecimiento Radial de ME13m, ME11m, ME15m y ME19m a los 8 días de
crecimiento
6.2.1.1 Recuento de conidios
Al evaluar el recuento de conidios resultantes en diferentes mezclas de nitrógeno se
obtuvo que el microorganismo creció y produjo conidios en todos los tratamientos
mostrando recuentos en la mayoría de tratamientos de 1x105 conidios/mm2 como se
observa en la Figura 6.9, lo que confirma que todos los medios contaron con un
balance nutricional para el crecimiento y conidiogénesis de Penicillium sp. HC1.
11 13 15 19
30
40
50
60
70
80
Medio
Cre
cim
ien
to R
ad
ial (m
m)
11 13 15 19
3
4
5
6
Medio
Co
nid
ios/m
m2 (
Lo
g10)
Figura 6.9 Producción de conidios con mezclas organicas e inorgánica de nitrógeno. Medio 11 (Almidón-Ext. Levadura-Fosfato de amonio) Medio 13 (Salvado de Trigo-triptosa-fosfato de amonio) Medio 15 (Salvado de Trigo-E. levadura-fosfato de amonio) Medio 19 (Harina de arroz-Ext. Levadura-Fosfato de amonio)
6. 3 Pruebas de Germinación
La temperatura, el contenido de humedad de los conidios y la humedad de la
atmosfera durante la latencia son los principales factores que influyen en la viabilidad
de los conidios (Hong et al, 1997). La capacidad de germinación o su viabilidad
disminuye a medida que la temperatura o la humedad relativa aumentan, esto se
corrobora claramente con los resultados evaluados tanto de los medios sólidos y
líquidos ya que para la mayoría sometiéndose a estrés térmico a 50°C la germinación
reduce trascendentalmente, como se observa en la figura 6.6, las tablas con los datos
correspondientes se encuentran en el anexo 3.
(b)
(c)
(a)
(d)
Figura 6.10 Porcentajes de Germinación de conidios de Penicillium sp. HC1, después de ser sometidos a estrés térmico. (a) % Germinación en medio sólido a 45°C. (b) % Germinación en medio sólido a 50°C. (c) % Germinación en medio líquido a 45°C. (d) % Germinación en medio líquido a 50°C.
Es importante observar el efecto notable de la fuente de nitrógeno en medio líquido
en cuanto a su viabilidad como se observa en la figura 6.6 (d) los medios ME11, ME15,
ME19 y ME20, corresponden a fuentes inorgánicas de nitrógeno y diferentes fuentes
de carbono, se puede inferir que estas fuentes le proveen un estrés mayor,
acumulando compuestos intracelulares generados en condiciones de estrés como la
trehalosa y el manitol que le ayudan a generar mayor resistencia y tolerancia a altos
niveles de temperatura como 50°C, corroborando que el aumento de la temperatura
disminuye la viabilidad de las esporas de hongos, mientras que las temperaturas más
bajas (por encima de cero) aumentan la viabilidad ( Hong et al, 1997).
6.4 Solubilización de fosfatos
Siendo el fósforo uno de los componentes más importantes en los ciclos
biogeoquímicos y un factor nutricional limitante en los suelos por su lenta movilidad,
es necesario adoptar técnicas para ayudar a retornar los fosfatos del suelo y así
obtener un mayor aprovechamiento por las plantas. En esta investigación se decidió
hacer este estudio secundario debido a que a los dos días de crecimiento en los
medios con fuentes inorgánicas de nitrógeno se observaban halos notables.
Figura 6.11 Prueba cualitativa de Solubilización de fosfatos para Penicillium sp. HC1. (a) Medio SMRS (b) Medio NBRIP.
Se realizó la prueba cualitativa en medios como SMRS y NBRIP medios con una única
fuente de fosforo disponible como lo es el fosfato tricálcico, y en el caso de SMRS con
indicador de pH purpura de bromocresol, en ambos medios se observaron cambios
como se observa en la figura 6.8, y los controles positivo y negativo fueron correctos,
en medio SMRS hubo un viraje de color debido al cambio de pH tal vez atribuido a la
producción de ácidos orgánicos como mecanismo para solubilizar fosfatos, en cuanto
al medio NBRIP se observo un halo significativo en comparación con el control
positivo. Todo esto confiere una cualidad adicional a esta cepa de Penicillium sp.,
además de contar con mecanismos enzimáticos de degradación de celulosa y
hemicelulosa, según estos estudios cualitativos podría ser un potente solubilizador de
fosfatos.
7. CONCLUSIONES
La alta producción de arroz en Colombia genera la misma o mayor cantidad de
residuos pos-cosecha como el tamo de arroz. Este desecho cuenta con un escaso nivel
de aprovechamiento y en la mayoría de ocasiones es incinerado al aire libre,
generando problemas ambientales. El uso de un futuro bioinoculante con Penicillium
sp. HC1 mejorará esta problemática ya que gracias a los sistemas enzimáticos con que
cuenta es capaz de degradar este tamo de arroz siendo transformado para ser
reincorporado de nuevo al suelo, para la formulación de este producto fue necesario
evaluar el efecto que tiene la fuente de carbono y de nitrógeno sobre la conidiogénesis
del microorganismo.
En todas las fuentes de carbono y de nitrógeno evaluadas el microorganismo creció y
produjo conidios, demostrando que todas las fuentes le proporcionaron los
requerimientos nutricionales necesarios para su desarrollo. Hubo un efecto marcado
por en la fuente de carbonoe ya que fuentes como harina de arroz y glucosa
repercutieron negativamente en el recuento de conidios en medio solido mientras que
el salvado de trigo y el almidón de yuca mostraron en medio sólido y líquido ser
fuentes que favorecen la producción de conidios.
El efecto de la fuente de nitrógeno sobre la producción de conidios, el crecimiento
radial y la morfología demostró no tener un efecto marcado, ya que las fuentes
orgánicas e inorgánicas evaluadas se distribuyeron homogéneamente en los más altos
y bajos recuentos y diámetros de colonia, por lo tanto ninguna fuente mostró más
afinidad frente a las demás. Si hubo un efecto notable del Fosfato de amonio en medio
líquido en cuanto a la calidad de los conidios, ya que las fuentes complejas en
combinación con esta fuente de nitrógeno demostraron influir en la calidad de los
conidios siendo más tolerantes a 45°C y 50°C.
El desarrollo en medio líquido de este hongo, demostró ser completamente diferente
al del medio sólido ya que las condiciones de crecimiento obligan al microorganismo a
tomar la ruta de crecimiento vegetativo y a evitar la diferenciación, esto se corroboró
con los recuentos y con la notable diferencia en la morfología en medio sólido y
líquido.
Los anteriores hallazgos permiten evidenciar que la fuente de carbono es una variable
clave en el crecimiento y desarrollo de Penicillium sp. HC1, que la fuente de nitrógeno
no influye notablemente sobre la conidiogénesis, y que los conidios pueden ser
tolerantes a temperaturas hasta 45°C pero son más susceptibles en temperaturas
mayores.
8. RECOMENDACIONES
Después de evaluar el efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la
conidiogénesis de Penicillium sp. HC1, es necesario evaluar diferentes relaciones C:N
para evaluar también que efecto tiene sobre las mismas variables evaluadas en esta
investigación.
Debido al destino que tendrá este hongo celulolitico, sería recomendable evaluar su
crecimiento y desarrollo en condiciones similares donde va a ser probado, en un
medio con tamo de arroz como fuente de carbono.
Finalmente es recomendable evaluar algunos de los tratamientos evaluados en esta
investigación a mayor escala en medio líquido para favorecer a la formulación del
producto.
9. BIBLIOGRAFIA
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ANEXOS
ANEXO 1. Caracterización de Fuentes Complejas de Carbono
Harina de arroz
Salvado de trigo
Almidón de yuca
ANEXO 2. TABLA DE PONDERACIÓN PARA ELECCION DE MEDIOS MODIFICADOS
CON MEZCLA FUENTES DE NITROGENO
SÓLIDO
LÍQUIDO
MED
IO
CR
ECIM
IEN
TO
(30
%)
PR
OD
UC
CIO
N D
E
CO
NID
IOS
(35
%)
GER
MIN
AC
ION
50
°C (
35
%)
PUNTUACIÓN TOTAL
MED
IO
Bio
mas
a (3
0%
)
PR
OD
UC
CIO
N D
E
CO
NID
IOS
(35
%)
GER
MIN
AC
ION
50
°C (
35
%)
PUNTUACIÓN TOTAL
MED
IO
PR
OD
UC
CIO
N D
E
CO
NID
IOS
(50
%)
GER
MIN
AC
ION
50
°C (
50
%)
PUNTUACIÓN TOTAL
1 2 1 2 1,65
1 2 1 2 1,65
1 1 2 1,5
2 2 1 2 1,65
2 1 1 2 1,35
2 1 2 1,5
3 2 1 2 1,65
3 3 1 1 1,6
3 1 1 1
4 2 1 2 1,65
4 2 1 2 1,65
4 1 2 1,5
5 3 1 2 1,95
5 2 1 2 1,65
5 1 2 1,5
6 3 1 1 1,6
6 2 1 2 1,65
6 1 2 1,5
7 2 1 1 1,3
7 2 1 2 1,65
7 1 2 1,5
8 2 1 2 1,65
8 2 1 1 1,3
8 1 1 1
9 2 3 3 2,7
9 2 1 2 1,65
9 1 2 1,5
10 2 2 3 2,35
10 2 2 2 2
10 2 2 2
11 2 1 2 1,65
11 2 3 3 2,7
11 2 3 2,5
12 3 1 2 1,95
12 2 3 2 2,35
12 2 2 2
13 1 2 1 1,35
13 3 2 2,5
14 1 2 2 1,7
14 2 2 2
15 2 2 2 2
15 2 3 2,5
16 2 1 2 1,65
16 2 2 2
17 2 1 3 2
17 2 2 2
18 2 1 2 1,65
18 2 2 2
19 3 1 1 1,6
19 3 3 3
20 2 1 1 1,3
20 1 3 2
ANEXO 3. PRUEBAS DE GERMINACION MEDIOS SÓLIDOS
MEDIO
CONTROL 45°C 50°C
%G %NG %G %NG %G %NG
ME1 93,7 95,88 91,79 6,3 4,12 8,21 85,69 83,89 86,03 14,31 16,11 13,97 19,51 17,28 17,79 80,49 82,72 82,21
ME1(2) 95,5 94,43 94,35 4,5 5,57 5,65 90,72 88,67 91,54 9,28 11,33 8,46 18,67 16,08 17,21 81,33 83,92 82,79
ME2 88,5 95 87,17 11,5 5 12,83 79,18 77,86 78,99 20,82 22,14 21,01 11,34 16,75 13,49 88,66 83,25 86,51
ME2(2) 92,95 86,79 94,28 7,05 13,21 5,72 82,23 83,56 83,44 17,77 16,44 16,56 12,34 13,78 12,76 87,66 86,22 87,24
ME3 94,47 92,56 94,35 5,53 7,44 5,65 83,86 82,56 84,13 16,14 17,44 15,87 18,83 16,08 20,18 81,17 83,92 79,82
ME3 (2) 97,67 95,3 97,93 2,33 4,7 2,07 86,12 87,11 85,55 13,88 12,89 14,45 19,67 18,43 19,45 80,33 81,57 80,55
ME4 79,19 76,34 82,45 20,81 23,66 17,55 73,43 71,56 74,23 26,57 28,44 25,77 8,52 9,45 7,42 91,48 90,55 92,58
ME4 (2) 82,65 85,87 84,23 17,35 14,13 15,77 71,22 72,39 80,54 28,78 27,61 19,46 9,77 11,45 10,11 90,23 88,55 89,89
ME5 87,25 91,23 88,12 12,75 8,77 11,88 85,71 86,05 86,87 14,29 13,95 13,13 15,74 10,92 12,67 84,26 89,08 87,33
ME5 (2) 91,17 92,04 89,56 8,83 7,96 10,44 84,64 83,56 84,11 15,36 16,44 15,89 13,56 12,34 14,76 86,44 87,66 85,24
ME6 89,67 85,64 92,27 10,33 14,36 7,73 83,78 81,75 83,94 16,22 18,25 16,06 8,54 6,89 7,34 91,46 93,11 92,66
ME6(2) 85,5 82,56 83,23 14,5 17,44 16,77 79,66 84,21 83,23 20,34 15,79 16,77 7,86 8,91 6,78 92,14 91,09 93,22
ME7 81,05 79,56 79,53 18,95 20,44 20,47 75,87 78,03 70,83 24,13 21,97 29,17 7,41 6,57 5,89 92,59 93,43 94,11
ME7(2) 84,64 82,44 83,22 15,36 17,56 16,78 72,62 77,43 74,56 27,38 22,57 25,44 6,87 6,23 7,24 93,13 93,77 92,76
ME8 95,38 95,34 92,86 4,62 4,66 7,14 86,64 85,45 83,12 13,36 14,55 16,88 17,23 20,13 14,53 82,77 79,87 85,47
ME8(2) 95,78 92,86 95,33 4,22 7,14 4,67 82,96 85,06 84,04 17,04 14,94 15,96 18,45 17,46 17,67 81,55 82,54 82,33
ME9 93,99 93,13 93,33 6,01 6,87 6,67 91,71 92,79 97,31 8,29 7,21 2,69 39,16 34,25 37,69 60,84 65,75 62,31
ME9 (2) 92,78 92,78 94,67 7,22 7,22 5,33 94,34 93,21 94,35 5,66 6,79 5,65 37,04 34,19 37,11 62,96 65,81 62,89
ME10 96,75 95,12 94,87 3,25 4,88 5,13 93,54 95,65 94 6,46 4,35 6 31,48 34,81 33,84 68,52 65,19 66,16
ME10(2) 95,34 95,45 96,12 4,66 4,55 3,88 93,54 95,65 94,03 6,46 4,35 5,97 35,87 34,32 34,67 64,13 65,68 65,33
ME11 95,75 97,88 95,36 4,25 2,12 4,64 95,87 97,87 97,43 4,13 2,13 2,57 12,58 10,05 14,12 87,42 89,95 85,88
ME11(2) 95,58 95,5 94,56 4,42 4,5 5,44 97,57 92,98 96,81 2,43 7,02 3,19 10,47 13,34 10,71 89,53 86,66 89,29
ME12 92,6 91,27 94,83 7,4 8,73 5,17 82,76 80,56 80,11 17,24 19,44 19,89 5,4 11,26 10,38 94,6 88,74 89,62
ME12(2) 90,37 93,15 94,11 9,63 6,85 5,89 81,25 82,04 80,56 18,75 17,96 19,44 8,97 11,57 9,4 91,03 88,43 90,6
ME13 93,66 90,63 87,07 6,34 9,37 12,93 97,27 95,91 90,53 2,73 4,09 9,47 6,23 5,97 4,8 93,77 94,03 95,2
ME13(2) 95,88 93,34 93,45 4,12 6,66 6,55 98,09 95,74 96,76 1,91 4,26 3,24 3,78 8,38 5,67 96,22 91,62 94,33
ME14 92,43 95,07 92,86 7,57 4,93 7,14 95,72 95,55 95,38 4,28 4,45 4,62 20,44 19,79 17,82 79,56 80,21 82,18
ME14(2) 93,78 92,38 93,42 6,22 7,62 6,58 94,86 95,21 95,98 5,14 4,79 4,02 18,34 19,45 20,33 81,66 80,55 79,67
ME15 94,67 95,12 94,23 5,33 4,88 5,77 86,76 84,67 81,34 13,24 15,33 18,66 14 14,87 12,24 86 85,13 87,76
ME15(2) 94,34 96,71 92,56 5,66 3,29 7,44 82,45 83,56 86,43 17,55 16,44 13,57 13,66 15,55 13,88 86,34 84,45 86,12
ME16 86,34 94,45 87,88 13,66 5,55 12,12 96,11 96,13 93,18 3,89 3,87 6,82 9,1 8,77 10,24 90,9 91,23 89,76
ME16(2) 95,51 95,38 88,39 4,49 4,62 11,61 95,83 95,88 97,2 4,17 4,12 2,8 8,57 9,45 10,11 91,43 90,55 89,89
ME17 97,06 95,776 97,14 2,94 4,224 2,86 87,78 88,76 94,97 12,22 11,24 5,03 26,04 22,05 22,79 73,96 77,95 77,21
ME17 (2) 94,22 91,89 93,11 5,78 8,11 6,89 88,56 91,87 90,26 11,44 8,13 9,74 24,56 23,45 24,65 75,44 76,55 75,35
ME18 97,08 96,36 98,5 2,92 3,64 1,5 96,08 98,13 97,1 3,92 1,87 2,9 13,18 12,78 14,13 86,82 87,22 85,87
ME18 (2) 96,23 97,45 92,34 3,77 2,55 7,66 96,98 95,34 96,45 3,02 4,66 3,55 13,89 14,52 12,34 86,11 85,48 87,66
ME19 87,81 82,85 84,53 12,19 17,15 15,47 86,6 82,34 90,34 13,4 17,66 9,66 6,51 6,58 7,22 93,49 93,42 92,78
ME19 (2) 85,57 87,64 85,07 14,43 12,36 14,93 89 84,33 89,56 11 15,67 10,44 7,01 6,45 6,89 92,99 93,55 93,11
ME20 95,48 90,77 90,35 4,52 9,23 9,65 95,81 92,39 95,71 4,19 7,61 4,29 7,85 6,19 6,89 92,15 93,81 93,11
PRUEBAS DE GERMINACION MEDIOS LIQUIDOS
MEDIO
CONTROL 45°C 50°C
%G %NG %G %NG %G %NG
ME1
50,6
6
55,4
3 46,2 49,34 44,57 53,8
37,8
9
38,5
4 36,44 62,11 61,46
63,5
6 1,16 4,42 0,88
98,8
4
95,5
8 99,12
ME1(2) 48,67 51,34 49,34 51,33
48,6
6
50,6
6
40,8
6
36,3
5
35,8
9 59,14
63,6
5 64,11 1,59 1,43 0,49 98,41
98,5
7 99,51
ME2 30,7
9 30,12 32,78 69,21 69,8
8 67,22 17,34 18,23 17,99 82,6
6 81,77 82,01 6,76 4,29 5,51 93,2
4 95,71 94,4
9
ME2(2)
33,4
6 34,1 31,78
66,5
4 65,9
68,2
2 16,54 13,45 15,55
83,4
6
86,5
5
84,4
5 4,31 5,98 4,34
95,6
9
94,0
2
95,6
6
ME3 20 16,33 18,88 80
83,6
7 81,12 0,23 1,4 1,67 99,77 98,6
98,3
3 0 0 0 100 100 100
ME3 (2) 21,33 18,33 17,34 78,67 81,67
82,6
6 0,87 0,88 1,43 99,13 99,12
98,5
7 0 0 0 100 100 100
ME4
26,8
2
28,3
3 25,12 73,18 71,67
74,8
8 10,17 11,56 14,23
89,8
3
88,4
4 85,77 9,1 8,77 10,24 90,9 91,23
89,7
6
ME4 (2) 26,7
8 23,5
6 27,8 73,22 76,44 72,2 11,22 12,39 20,6 88,7
8 87,61 79,4 8,57 9,16 11,13 91,43 90,8
4 88,8
7
ME5 32,77
24,5
6 24,7 67,23 75,44 75,3 22,31 21,98 18,52 77,69
78,0
2 81,48 12,72 10,45 11,34
87,2
8
89,5
5
88,6
6
ME5 (2)
26,7
8
24,9
8 28,44 73,22 75,02 71,56 19,56 20,7 18,34
80,4
4 79,3 81,66 13,22 12,87 14,67
86,7
8 87,13
85,3
3
ME6
83,9
6 87,27 81,81 16,04 12,73 18,19 61,11
62,2
3
62,9
3
38,8
9 37,77 37,07 1,66 1,89 1,45
98,3
4 98,11
98,5
5
ME6(2) 79,31 77,77 83,77 20,6
9 22,23 16,23 62,7
8 63,9
8 60,8
7 37,22 36,0
2 39,13 2,67 3,04 1,98 97,3
3 96,9
6 98,0
2
ME7
79,6
5
82,0
5 81,31
20,3
5 17,95 18,69
67,0
8
66,7
8
63,8
7
32,9
2
33,2
2 36,13 0,56 1,34 2,34
99,4
4
98,6
6
97,6
6
ME7(2) 83,12
80,8
7 79,11 16,88 19,13
20,8
9 68,21 67,52
63,8
9 31,79
32,4
8 36,11 1,45 1,78 0,56
98,5
5
98,2
2
99,4
4
ME8
26,0
5 21,19 25,43
73,9
5 78,81 74,57 19,31 24,57
23,9
8
80,6
9 75,43
76,0
2 0,28 0,66 1,34 99,72
99,3
4
98,6
6
ME8(2)
28,7
8
25,9
9 26,34 71,22 74,01
73,6
6
29,8
7 21,45
23,4
9 70,13
78,5
5 76,51 1,04 1,77 0,78
98,9
6
98,2
3
99,2
2
ME9 73,87 81,34 76,92 26,13 18,66 23,0
8 83,2
2 82,11 84,3
8 16,78 17,89 15,62 2,86 2,45 3,42 97,14 97,5
5 96,5
8
ME9 (2) 77,34
78,2
3 79,31
22,6
6 21,77
20,6
9 81,99
85,3
4
80,0
3 18,01 14,66 19,97 1,77 2,67 3,28
98,2
3
97,3
3 96,72
ME10 31,23 30,21 33,11 68,77
69,7
9
66,8
9
27,8
9
23,0
2 22,78 72,11
76,9
8 77,22 11,76 12,34 19,3
88,2
4
87,6
6 80,7
ME10(2) 30,17 31,56 33,45
69,8
3
68,4
4
66,5
5
22,8
2 21,48 23,24 77,18
78,5
2 76,76 15,32 13,21 18,4
84,6
8
86,7
9 81,6
ME11 41,58 32,3
3 38,56 58,4
2 67,67 61,44 80,61 71,97 79,45 19,39 28,0
3 20,5
5 71,64 80,5
7 83,0
2 28,3
6 19,43 16,98
ME11(2) 39,11
36,8
7 37,55
60,8
9 63,13
62,4
5
76,5
6 78,34 81,65 23,44 21,66 18,35 75,45 78,21
89,3
2 24,55 21,79 10,68
ME12
23,8
9
22,7
8 26,56 76,11 77,22 73,44 19,37 13,29 14,34
80,6
3 86,71
85,6
6 11,56 12,78 11,89
88,4
4 87,22 88,11
ME12(2)
24,5
6 23,12 25,67 75,44
76,8
8 74,33 18,56 18,45 16,99 81,44 81,55 83,01 12,01 11,65 11,78
87,9
9
88,3
5
88,2
2
ME13 77,12 71,2 74,36
22,8
8 28,8
25,6
4
52,0
8
60,8
3
55,2
8 47,92 39,17 44,72
37,6
3
30,4
3
34,5
6 62,37
69,5
7 65,44
ME13(2) 76,3
3 73,4
8 72,98 23,67 26,5
2 27,02 56,7
8 55,8
7 53,9
8 43,22 44,13 46,0
2 36,7
8 35,5
4 34,9
8 63,2
2 64,4
6 65,0
2
ME14
94,5
9
92,3
8 93,21 5,41 7,62 6,79 38,18
36,6
6 37,19 61,82
63,3
4 62,81 4,49 5,26 4,28 95,51 94,74 95,72
ME14(2) 91,78 93,21 92,67 8,22 6,79 7,33
42,8
9 41,8 40,13 57,11 58,2
59,8
7 8,97 6,87 4,56 91,03 93,13 95,44
ME15 29,41 34,8
3 31,87 70,5
9 65,17 68,13 92,5
5 85,4
2 88,6
7 7,45 14,58 11,33 96,18 93,12 89,7
9 3,82 6,88 10,21
ME15(2) 33,21 32,12 34,76
66,7
9
67,8
8
65,2
4
90,7
8
89,3
4 88,21 9,22 10,66 11,79 92,13
90,4
5 94,77 7,87 9,55 5,23
ME16 71,9
62,3
9 71,67 28,1 37,61
28,3
3 77,77 64,81 74,83 22,23 35,19 25,17
48,9
4
39,3
3
38,8
8 51,06
60,6
7 61,12
ME16(2)
60,5
4 71,78 62,99
39,4
6 28,22 37,01
83,7
8 78,18 73,87 16,22 21,82 26,13 42,87
40,5
6
46,5
8 57,13 59,44 53,42
ME17
89,3
9
92,8
7 90,3 10,61 7,13 9,7
88,2
9
84,6
2 86,81 11,71 15,38 13,19 7,87 8,67 9,87 92,13 91,33 90,13
ME17(2) 93,6 92,11 90,54 6,4 7,89 9,46 84,91 85,9
2 86,7
8 15,09 14,08 13,22 12,33 7,87 9,78 87,67 92,13 90,2
2
ME18 77,18
79,8
6 78,46 22,82 20,14 21,54 71,76
84,4
8
82,6
3 28,24 15,52 17,37 6,54 8,23 6,78
93,4
6 91,77
93,2
2
ME18(2)
83,2
3
82,6
7 85,78 16,77 17,33 14,22 81,87
80,3
4
83,4
6 18,13 19,66 16,54 8,58 9,34 8,22 91,42
90,6
6 91,78
ME19
66,0
5 57,91 61,24
33,9
5
42,0
9
38,7
6 81,61 72,22 77,54 18,39 27,78 22,46
80,9
8 77,06 79,34 19,02 22,94
20,6
6
ME19 (2) 52,17 55,5
4 59,88
7 47,83 44,46 40,11
3 77,52 82,8
3 78,23 22,48 17,17 21,77 81,23 79,3
4 78,21 18,77 20,6
6 21,79
ME20 90,14
90,5
4 90,32 9,86 9,46 9,68 85
83,6
2 87,77 15 16,38 12,23
79,6
6
74,8
6
80,8
9
20,3
4 25,14 19,11
ME20
(2)
89,4
5 91,45 90,23 10,55 8,55 9,77
90,9
7
86,3
4
83,4
5 9,03 13,66 16,55 77,7 73,45 78,23 22,3
26,5
5 21,77
