EVALUACIÓN DEL ADN EXTRAÍDO DE HOJAS Y RAMAS DE ...

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EVALUACIÓN DEL ADN EXTRAÍDO DE HOJAS Y RAMAS DE ESPECÍMENES DE

HERBARIO: ESTUDIO DE CASO EN ESPECÍMENES DE PSYCHOTRIA Y

PALICOUREA DEPOSITADOS EN EL HERBARIO FORESTAL UDBC.

Trabajo de Grado en modalidad Investigación – Innovación

JENNIFER CATHERINE CASTILLO REYES

JOHANNA CAROLINA PERALTA PARRADO

DIRECTORA

ROCÍO CORTÉS BALLEN

Ingeniera Forestal MSc. Ph.D

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y DE RECURSOS NATURALES

PROYECTO CURRICULAR DE INGENIERÍA FORESTAL

2019

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RESUMEN

Los especímenes botánicos depositados en los herbarios constituyen un recurso invaluable

de ADN que no se ha aprovechado lo suficiente. Las investigaciones sobre este tema se han

centrado en la extracción de ADN de las hojas de los especímenes, sin embargo, las ramas

no se han evaluado de manera exhaustiva. Con el objeto de conocer la posibilidad de extraer

ADN de las ramas de los especímenes de herbario, evaluamos el rendimiento de la extracción

en hojas y ramas comparado con tejidos de hoja deshidratados en sílica gel. Se utilizaron

especímenes de los géneros Psychotria y Palicourea depositados en la colección del herbario

UDBC. Aunque se obtuvieron valores de concentración y pureza de ADN mayores en los

tejidos deshidratados en sílica gel, también se pudo extraer ADN de las hojas y ramas de los

especímenes botánicos. Las ramas de los especímenes de herbario son un recurso valioso

como fuente de ADN que se debe explorar con más detalle ya que al ser comparadas con las

hojas, representan ventajas tales como afectar en menor grado la integridad de los

especímenes, no alterar de manera significativa la eventual descripción de las plantas y

disminuir la posibilidad de extraer ADN de un organismo diferente.

Palabras clave: CTAB, Extracción de ADN, especímenes de herbario, ramas, sílica gel

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ABSTRACT

Botanical specimens deposited in herbaria are invaluable sources of DNA not used

sufficiently. Research on this topic has focused on the extraction of DNA from specimen

leaves, however, branches have not been evaluated exhaustively. In order to know the

possibility of extracting DNA from branches of herbarium specimens, we evaluated the DNA

quantity and quality in leaves and branches of botanical specimens treated with alcohol,

compared to leaf tissues dehydrated in silica gel. We used specimens of the genera Psychotria

and Palicourea deposited in the collection of the UDBC herbarium. DNA concentration and

purity values were higher in dehydrated tissues in silica gel compared to DNA extracted from

leaves and branches of botanical specimens. Branches of herbarium specimens are valuable

sources of DNA that should be explored in more detail because, when compared to the leaves,

they represent advantages such as affecting the integrity of the specimens to a lesser degree,

not altering significantly the eventual description of the plants, and decreasing the possibility

of extracting DNA from a different organism.

Palabras clave: CTAB, DNA Extraction, herbarium specimens, branches, silica gel.

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TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN ........................................................................................................................................................ 2

ABSTRACT ...................................................................................................................................................... 3

ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................................................................... 4

ÍNDICE DE TABLAS ...................................................................................................................................... 4

AGRADECIMIENTOS ................................................................................................................................... 5

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................................ 5

MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................................ 9

RESULTADOS ................................................................................................................................................14

DISCUSIÓN .....................................................................................................................................................19

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................................................25

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura1. Protocolo de extracción de ADN ........................................................................... 12

Figura 2. Concentración de ADN promedio para los tres tejidos ......................................... 15

Figura 3. Pureza de ADN promedio para los tres tejidos (260/280) .................................... 16

Figura 4. Pureza de ADN promedio para los tres tejidos (260/230) .................................... 17

Figura 5. Análisis de correspondencia .................................................................................. 19

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Categorización de las variables concentración, edad y altitud ............................... 10

Tabla 2. Prueba de comparaciones múltiples para la variable de concentración.................. 15

5

Tabla 3. Prueba de comparaciones múltiples para la variable de pureza (260/280) ............. 17

Tabla 4. Prueba de comparaciones múltiples para la variable de pureza (230/260) ............. 18

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a la Universidad Distrital Francisco José de Caldas por su excelente aporte en

nuestra formación profesional, al Laboratorio de Biología Molecular y al Herbario Forestal

Gilberto Emilio Mahecha por la disposición y por permitirnos el desarrollo de esta

investigación. A nuestra directora Rocío Cortés Ballén por darnos la oportunidad de

participar en un proyecto que aporta gran conocimiento científico, por su continua

colaboración, sus enseñanzas, valiosos consejos, confianza y paciencia a lo largo de esta

investigación. A nuestro evaluador James R. Richardson. Al profesor Juan Camilo Dumar

por su importante asesoría en el análisis estadístico. A nuestros padres, hermanos y amigos

por creer siempre en nosotras, y demostrarnos su amor a través de la motivación y apoyo

incondicional. A la causalidad de poder realizar con éxito este trabajo en equipo, disponer de

las capacidades necesarias y la fluidez en su elaboración. A todas las personas que de una u

otra forma contribuyeron en el desarrollo de este trabajo.

INTRODUCCIÓN

El ADN antiguo (ADNa) es aquel obtenido de los restos de organismos muertos, así como

de las muestras tomadas a organismos vivos que han sufrido procesos autolíticos o

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diagenéticos, o que han sido fijadas de alguna forma (Herrmann & Hummel, 1994). El

ADNa incluye desde el tomado a tejidos de fósiles, momias, o insectos preservados en ambar,

hasta el de tejidos embebidos en parafina, fijados en líquido, o especímenes preservados en

colecciones biológicas (Hummel & Herrmann, 1994). En la década de los 80´s se realizaron

los primeros trabajos exitosos en la extracción de ADNa como por ejemplo el de Higuchi,

quien secuenció un fragmento de ADN a partir de un musculo disecado de Equus quagga,

una especie que llevaba extinta cerca de 100 años, o el caso de Pääbo, quien extrajo ADN

humano a partir de una momia egipcia de 2.400 años de antigüedad (Izagirre, Duran, De la

Rua, 1997; Saiz, Álvarez, Martínez, Álvarez & Lorente, 2012).

Los especímenes de herbario son una fuente potencial de ADNa. Las colecciones depositadas

en los herbarios constituyen un recurso invaluable de ADNa ya que en ellos se encuentran la

mayoría de plantas del mundo, incluyendo especies de distribución restringida, nuevas para

la ciencia, extintas o con algún grado de amenaza, a las que se puede acceder fácilmente sin

necesidad de invertir altos costos en recolectar material vivo en un punto geográfico

específico (Särkinen, Staats, Richardson, Cowan, & Bakker, 2012). Debido a que estas

colecciones son una fuente fundamental de material en estudios filogenéticos, desde la

década de los 90 se han realizado investigaciones relacionadas con la extracción de ADNa

de los especímenes de herbario (e.g. Savolainen, Cuinoud, Spichiger, Martínez,

Crevecoeur & Manen, 1995; Pääbo, Poinar, Serre, Jaenicke-Despres, Klause, Vigilant

& Hofreiter, 2004; Adams, 2011; Mazo, 2011). Teniendo en cuenta que los especímenes

nunca fueron colectados con la intención de extraer ADN, existen limitaciones para la

obtención de ADNa amplificable (Erkens, Cross, Maas, Hoenselaar, & Chatrou, 2008;

Staats et al., 2011). Dentro de los factores que afectan la extracción de ADNa de los

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especímenes se encuentran, por ejemplo, la edad (el tiempo desde su colección), las

condiciones de secado, la preservación y almacenamiento de las muestras, la interacción que

ha tenido con sustancias químicas, así como el pH y la humedad (Neubig et al., 2014).

A pesar de las limitaciones se ha logrado extraer ADN de material de herbario preservado en

diferentes condiciones y de diferentes edades (Drábková & Kirschner, 2002; Erkens et al.,

2008; Agostini, Lüdtke, Echeverrigaray & de Souz-Chies, 2011; Staats et al., 2011;

Särkinen et al., 2012). Sin embargo, se han detectado problemas tales como la degradación

del ADNa debido a los tratamientos químicos de preservación de los especímenes, que no

permite obtener concentraciones de ADN muy altas. Adicionalmente, un problema particular

en las plantas es la cantidad de metabolitos secundarios que poseen, especialmente

abundantes polifenoles, asi como azúcares, y otros posibles inhibidores de la PCR que

además pueden eventualmente provocar errores en las secuencias de ADNa. ( Drábková &

Kirschner, 2002; Erkens et al., 2008; Agostini et al., 2011; Staats et al., 2011; Särkinen

et al., 2012).

En las plantas, el tejido foliar es el que se ha preferido para la obtención de ADNa. Sin

embargo, existen registros de extracción de ADNa de tejidos lignificados, específicamente

de madera del tronco de especies arbóreas (Deguilloux, Pemonge, & Petit, 2004;

Deguilloux, Pemonge, Bertel, Kremer, & Petit, 2003; Deguilloux, Pemonge, & Petit,

2002; Liepelt et al., 2006). La extracción de ADNa de la madera representa un reto aún

mayor que la extracción en tejido foliar, considerando que una gran proporción de madera

está constituida por células muertas (duramen) y una menor proporción por células vivas

(albura). Al igual que el tejido foliar, el ADNa obtenido de la madera puede presentar un

porcentaje alto de sustancias que pueden inhibir la PCR ( Deguilloux et al., 2002). Existen

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varios estudios que evaluaron la extracción de ADNa de madera de roble (Quercus spp), con

muestras de diferentes edades y procedencias, que fueron sometidas a diferentes tipos de

secado, en los que se logró aislar ADNa amplificable, aunque solo en fragmentos cortos de

regiones con un gran número de copias (Dumolin-Lapègue, Pemonge, Gielly, Taberlet, &

Petit, 1999; Deguilloux et al., 2002; Deguilloux et al., 2003). Del mismo modo, se ha

podido aislar ADNa de madera Cyclobalanaposis spp. de la familia Fagacea (Ohyama,

Baba, & Itoh, 2001), así como de varias especies de Dipterocarpaceas tropicales

(Rachmayanti, Leinemann & Gailing, 2006; Rachmayanti, Leinemann, Gailing &

Finkeldey, 2009) y de diferentes especies de los géneros Eucalyptus, Pinus y Cupressus con

hasta 1000 años de edad (Liepelt et al., 2006), en donde se evidencia el éxito que puede tener

el tejido lignificado para la extracción de ADN amplificable.

Los tejidos de las ramas de los especímenes de herbario no se han evaluado de manera

exhaustiva como fuente de ADNa. Sólo se cuenta con un estudio de Asif & Cannon (2005),

quienes extrajeron ADN de la madera de diferentes procedencias de la especie Gonystylus

bancanus. Del total de muestras estudiadas, varias provenían de madera procesada, mientras

que sólo tres provenían de especímenes de herbario. En general, los resultados arrojaron alta

degradación en el ADN con fragmentos que oscilaron entre 50 pb y 10 kpb. Sin embargo, las

muestras obtenidas de ramas de especimenes de herbario obtuvieron el mejor rendimiento de

ADN (50 ng/µl) de todas las muestras analizadas.

Los géneros Psychotria y Palicourea son dos de los más grandes de la familia Rubiaceae.

Psychotria incluye alrededor de 1000 especies de distribución Pantropical (Taylor, 2016),

mientras que las cerca de 600 especies de Palicourea se restringen al Neotropico (Taylor,

2018). En el Catálogo de Plantas y Líquenes De Colombia, Delprete & Cortes-B. (2015)

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registraron 224 especies de Psychotria y 161 de Palicourea, sin embargo, cerca de 80 de las

especies incluidas en Psychotria han sido recientemente sinonimizadas bajo el género

Palicourea (eg. Taylor & Hollowell, 2016; Taylor, 2017, 2018). Los dos géneros se

encuentran bien representados en las colecciones de los herbarios del país. Por ejemplo, en

el Herbario Forestal UDBC se registran más de 500 especímenes de cada género. Teniendo

en cuenta la representatividad de los géneros en la colección del Herbario Forestal, así como

su cercanía filogenética, Psychotria y Palicourea constituyen un excelente modelo para

evaluar la posibilidad de extraer ADN de especímenes de Herbario.

Este proyecto comparó el rendimiento de la extracción de ADN en hojas y ramas de

especímenes de los géneros Psychotria y Palicourea depositados en la colección del herbario

UDBC. Específicamente, evaluamos la posibilidad de extraer ADN de las ramas de los

especímenes de herbario y estimamos las diferencias entre la concentración y pureza del

ADN obtenido en hojas y ramas de los especímenes. Además, evaluamos la influencia de la

edad y procedencia del espécimen en la concentración de ADN obtenido.

MATERIALES Y MÉTODOS

Diseño experimental

Se realizó un diseño experimental en arreglo factorial completamente al azar, con tres

tratamientos:

Tratamiento 1: Tejido foliar deshidratado en sílica gel (blanco), abreviado como “Sílica gel”

Tratamiento 2: Tejido de ramas tomado de espécimen botánico, abreviado como “Madera”

Tratamiento 3: Tejido foliar tomado de espécimen botánico, abreviado como “Herbario”

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Las variables analizadas fueron concentración y pureza, evaluada por las relaciones 260/280

y 260/230 y las variables independientes de edad y altitud. Se realizaron dos repeticiones con

sub-muestras de 51 especímenes en cada tratamiento.

Se realizó una previa categorización de las variables para facilitar los análisis respectivos, de

la siguiente manera:

Categoría/

Variable

Concentración

(ng/ul)

Edad(meses)

Altitud

(msnm)

Alta >500 >125 2001-3500

Media 100 - 500 68-125 1001-2000

Baja <100 <68 0-1000

Tabla 1. Categorización de las variables concentración, edad y altitud

Preparación del Material vegetal

A partir de la base de datos de la colección de tejidos deshidratados en silica gel disponible

en el laboratorio de Biología Molecular de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos

Naturales de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas se seleccionaron 102

ejemplares, 46 del género Psychotria y 56 del género Palicourea. Los ejemplares

seleccionados fueron sometidos al mismo proceso de colección usado en el Herbario Forestal

UDBC, en el cuál los especímenes se alcoholizan en campo con una solución de alcohol al

70% y posteriormente se secan a una temperatura de 60ºC durante 24 horas. De los 102

ejemplares seleccionados, el 80% fueron colectados en el año 2017, mientras que el 20% se

colectaron antes de esta fecha (Anexo 1). La altitud a la que fueron colectados los

especímenes se puede ver en el anexo 1. De cada espécimen de herbario se tomó una muestra

de hoja y de rama.

Los tejidos se procesaron de la siguiente manera:

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Tejido foliar deshidratado en silica gel: Se pesaron entre 19 y 23 mg de tejido en un tubo

eppendorf de 1,5 µl el cual contenía 3 perlitas de acero inoxidable.

Tejido foliar y de ramas tomado de especímenes botánicos: Con ayuda de pinzas y aguja de

disección se procedió a quitar los restos de pegamento que quedaban en las muestras a causa

del montaje del espécimen. Se pesaron de 19 a 23 mg tejido en un tubo eppendorf de 1,5 µl

el cual contenía 3 perlitas de acero inoxidable en el caso de las hojas y 0,417 g de arena estéril

en el caso de la madera. La madera se astilló lo más fino posible con un bisturí antes de

pesarla. Una vez pesados todos los tejidos se llevaron a la Biopulverizadora “Mini-

BeadBeater 16 Ring Rack”, por 30 segundos o hasta obtener un polvo fino.

Extracción de ADN

Con base en la técnica propuesta por Doyle & Doyle (1987), se utilizó el método de

extracción CTAB modificado. Las modificaciones siguieron los lineamientos señalados en

los protocolos internos del laboratorio de Biología Molecular del Jardín Botánico de

Edimburgo RBGE. Con base en los resultados de experimentos realizados previamente, las

muestras se mantuvieron a -20 ºC durante una semana antes de iniciar la fase de lavado del

ADN. En la figura 1 se muestra un resumen de protocolo utilizado en el proceso de extracción

de ADN.

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Figura1. Protocolo de extracción de ADN

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Concentración y Pureza del ADN

Se analizó la cantidad y pureza del ADN por nano-espectrofotometría en un nanodrop 2000

de Thermo Fisher, obteniendo datos de concentración de ADN en ng/uL y relación de

absorbancias 260/280 y 260/230 nm.

Análisis de la información

Se generó una base de datos con 238 especímenes, en donde se registró la siguiente

información: número de colección, nombre de colector, especie, fecha de colección, zona de

vida de la procedencia, altitud y edad del espécimen (tiempo transcurrido desde la fecha de

colección hasta la fecha de extracción). Finalmente se depuro la base a 102 especímenes, los

demás fueron descartados en su mayoría porque en alguno de los tres tejidos no había

respaldo o debido a que el material no alcanzaba el peso suficiente para realizar la extracción.

Se analizaron las media estadísticas y su desviación estándar en los parámetros de

concentración y pureza. Los Supuestos de normalidad se probaron mediante las pruebas de

Shapiro-Wilks y Kolmogorov- Smirnov. Se realizó un análisis de varianza de una vía no

paramétrica (prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis), y comparaciones múltiples con el

fin de evaluar la existencia de diferencias significativas para cada uno de los tratamientos.

Finalmente se realizó un Análisis de Correspondencia, para identificar si existía o no relación

entre los datos obtenidos y las variables independientes: edad y altitud usando el paquete

estadístico Past 3 para Windows.

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RESULTADOS

Concentración de ADN

Se realizaron un total de 306 extracciones. Se repitieron aquellas muestras que se alejaban

considerablemente de los datos obtenidos en la mayoría de las muestras con el objetivo de

descartar posible error humano. Para las muestras de sílica y herbario, la mayoría de los datos

de concentración varió entre 100 y 500 ng/µl, con una representación de 39% y 50%

respectivamente. En el caso de la madera, se encontraron concentraciones menores de 100

ng/µl en un 48 % de las muestras.

La concentración promedio de ADN obtenido presenta alta variación en cada uno de los

tejidos. Se evidencia que del tejido secado en sílica gel se extrajeron concentraciones más

altas con respecto a los otros tratamientos (promedio 452,42 ng/µl). Estos resultados

contrastan con los obtenidos en el tratamiento madera, en donde se obtuvieron menores

concentraciones de ADN (prom195,63 ng/µl) (figura 2). Aunque se presentaron diferencias

estadísticamente significativas (p=0,00**), se puede observar en el análisis de comparaciones

múltiples, que madera y hojas de herbario se comportan de manera similar mientras que el

tejido preservado en sílica gel presenta las mayores diferencias en la media de concentración.

(Tabla 2)

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Figura 2. Concentración de ADN promedio para los tres tejidos

TEJIDO SIGNIFICANCIA GRUPOS

HOMOGÉNEOS

SÍLICA 190,16 A

HERBARIO 145,86 B

MADERA 124,48 B

Tabla 2. Prueba de comparaciones múltiples para la variable de concentración

Pureza del ADN

Relación 260/280

Alrededor de 21.24% de las muestras poseen un valor de absorbancia entre 1,7 y 2 nm, por

lo cual se catalogan como muestras puras, libres de proteínas. De estas un 13.4% corresponde

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a sílica gel, un 2.29% a madera y 5.5% a muestras provenientes de hojas de herbario. Las

muestras contaminadas con proteínas representan el 78.76 % de total, de estas un porcentaje

menor corresponde al tratamiento de sílica gel con un 19.93%, un 31.04% de las muestras a

madera y un 27.77% a muestras a herbario.

Se encontraron diferencias significativas en la relación de absorbancia 260/280 (p=0,00**),

en donde únicamente el tratamiento sílica gel alcanzo valores promedio de pureza aceptables

de ADN con 1,7. Los tratamientos madera y herbario obtuvieron valores de pureza promedio

de 1,54 y 1,42 respectivamente, indicando la posible contaminación con compuestos

aromáticos o proteínas. (Figura 3). De igual manera las mayores diferencias se encuentran

entre el tejido de sílica gel y los tratamientos madera y herbario (Tabla 3).

Figura 3. Pureza del ADN promedio para los tres tejidos (260/280)

TEJIDO SIGNIFICANCIA GRUPOS

HOMOGÉNEOS

SÍLICA 196.42 A

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HERBARIO 135.77 B

MADERA 128.31 B

Tabla 3. Prueba de comparaciones múltiples para la variable de pureza (260/280)

En general, el tratamiento con mayor cantidad de muestras puras con absorbancias entre los

1,7 y 2 nm, corresponde al material almacenado en sílica gel, con 40,2% del ADN

considerado puro y un restante 59.8% impuro. Del mismo modo, el tratamiento herbario

presenta un total del 16,66% de las muestras puras y un 83,33% de muestras con ADN

impuro. En el tercer lugar en términos de pureza según la relación 260/280 nm, se encuentra

el tratamiento madera con tan solo un 6,86% de muestras con ADN puro.

Relación 260/230

Figura 4. Pureza del ADN promedio para los tres tejidos (260/230)

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Se encontraron diferencias significativas en la relación de absorbancia 260/230 (p=0.0031),

en donde ningún tejido alcanzó valores promedio de pureza aceptables (>2,0nm). El

tratamiento sílica gel obtuvo un promedio de pureza de 0.60, el tratamiento de madera un

valor promedio de 0,45 y el tratamiento de herbario obtuvo un valor promedio de 0.52,

indicando la posible contaminación con compuestos fenólicos, sales y otros contaminantes

(Figura 4). De igual manera las mayores diferencias se encuentran en el tejido de sílica gel.

(Tabla 4).

TEJIDO SIGNIFICANCIA

RANGO

GRUPOS

HOMOGÉNEOS

SÍLICA 173.6 A

HERBARIO 155.15 AB

MADERA 131.78 B

Tabla 4. Prueba de comparaciones múltiples para la variable de pureza (230/260)

En resumen, para la relación de 260/230 nm, se consideraron un 100% de las muestras

impuras, excepto para el material secado en sílica gel con una única muestra pura, que

representa el 0,98% del total de las muestras.

Análisis de la altitud de la colección y edad de las muestras

En el Análisis de Correspondencia para los diferentes tejidos, se pueden ver comportamientos

similares entre la relación de la concentración-edad. En las edades mayores se encuentran un

total de 21 especímenes, que representan 63 datos de concentración, de los cuales 20

concentraciones se ven afectadas por la edad. En la Figura 5 se puede observar que

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indistintamente del tejido, las concentraciones se van agrupar de acuerdo a su categoría de

concentración, en donde las concentraciones altas tienen una mayor varianza y muestran una

relación con altitudes y edades altas.

Figura 5. Análisis de correspondencia entre las variables altitud y edad para los tejidos

sílica gel, madera y herbario

DISCUSIÓN

La madera de especímenes de herbario como fuente de ADN

De acuerdo a los resultados obtenidos, es posible extraer ADN proveniente de madera de

especímenes de herbario que han sido alcoholizados en campo. Aunque en varios estudios se

había logrado extraer ADN de madera seca (e.g. Dumolin et al., 1999; Deguilloux et al.,

2003; Deguilloux et al., 2002; Liepelt et al., 2006; Rachmayanti, et al., 2009), sólo se

registra un estudio en el que se extrajo ADN de la madera proveniente de especímenes de

herbario, en el cual se usaron tres colecciones (Asif & Cannon, 2005) que, aunque fue un

buen indicio, no es un número estadísticamente representativo. Por el contrario, reportamos

por primera vez el éxito en la extracción de ADN de madera de 102 especímenes de herbario.

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Teniendo en cuenta que los especímenes fueron alcoholizados en el momento de la colección,

que es una técnica generalizada en la recolección de material botánico, los resultados

obtenidos demuestran que las ramas de los especímenes de herbario constituyen un recurso

valioso como fuente de ADN.

La mayoría de los estudios que han evaluado la extracción de ADN de especímenes de

herbario utilizan tejido foliar (Drábková & Kirschner, 2002; Agostini, Lüdtke,

Echeverrigaray & de Souz-Chies, 2011; Erkens et al., 2008; Staats et al., 2011; Särkinen

et al., 2012). Sin embargo, la posibilidad de extraer ADN de las ramas de los especímenes

de herbario presenta ventajas respecto al tejido foliar relacionadas con la integridad de los

especímenes, con la reducción del número de caracteres morfológicos que se “pierden” al

mutilar el espécimen botánico, así como con el aumento de la probabilidad de extraer ADN

del organismo deseado. La extracción de ADN de las ramas de las colecciones botánicas

afecta en menor grado la integridad de los especímenes ya que el área de tejido que se toma

es mucho menor al área tomada a una muestra de hoja. Mientras que para obtener entre 19 y

23 mg de tejido se utilizó un área entre 3 y 5 cm² de tejido foliar, dependiendo de la textura

de la hoja, para la obtención de la misma cantidad de tejido de madera se utilizó un área de

la rama que osciló entre 0.6 y 1.2 cm². Una ventaja adicional de extraer ADN de la madera

de la rama de especímenes es que, contrario a las hojas, las ramas tienen pocos caracteres

morfológicos que se incluyen en las descripciones botánicas. En una descripción taxonómica

promedio se describe solamente la forma, textura y presencia de indumentos de las ramas,

mientras que de las hojas se describen muchos caracteres, por ejemplo, la forma, el margen,

los diferentes grados de venación, el indumento y la textura, entre otros (e.g. Taylor, 2016,

2017, 2018). Además, las ramas de los especímenes tienen la ventaja de disminuir la

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probabilidad de extraer ADN de un organismo diferente asociado al tejido colectado. La

mayoría de las veces las ramas de los especímenes de herbario se encuentran libres de

hepáticas, musgos, hongos y líquenes, mientras que las hojas suelen tener en la superficie

diversas especies asociadas. Por todas las razones señaladas, al comparar los tejidos de hojas

y ramas de las colecciones botánicas para la extracción de ADN, el uso de una porción de

alrededor de 2 cm de la rama de un espécimen afecta en menor grado su integridad, no altera

significativamente la eventual descripción de la planta, y disminuye la posibilidad de extraer

ADN de un organismo diferente.

La madera versus las hojas de especímenes de herbario como fuente de ADN

De todos los tejidos evaluados, las porciones de hoja deshidratadas en silica gel presentaron

la mayor concentración y pureza (relación 260/280) de ADN. Estos tejidos fueron colectados

intencionalmente para la extracción de ADN, y no sufrieron los procesos de degradación

causados por el secado a altas temperaturas, o por la aplicación de alcohol, que se consideran

dos de las principales causas de la degradación del ADN en los especímenes de herbario (e.g.

Pyle & Adams, 1989; Neubig et al., 2014). Desde la propuesta hecha por Chase & Hills

(1991), de colectar hojas en silica gel en el campo, esta práctica se generalizó debido a lo

útil, barata y práctica que resulta ser. Nuestros resultados reafirman lo valioso de esta

práctica, y confirman los resultados obtenidos por Särkinen et al. (2012), quienes evaluaron

diferentes métodos de preparación de especímenes para la obtención de ADN, y concluyeron

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que la deshidratación en sílica gel era el mejor método de secado comparado con el uso de

calor o alcohol.

No se obtuvieron diferencias significativas al comparar la concentración y pureza del ADN

obtenido de las hojas y madera de los especímenes previamente alcoholizados. Se podría

esperar que los tejidos más resistentes protegerían de una mejor forma el ADN, tal como lo

señalan Herrmann & Hummel (1994) en el caso de huesos y semillas. En nuestro caso, la

corteza de la madera podría actuar como una barrera de protección contra el efecto del

alcohol. En este sentido, Asif & Cannon (2005) encontraron que el ADN de la madera se

encontraba mejor preservado que el de las hojas y lo atribuyeron al secado rápido de las

muestras, que pudo haber afectado más a las hojas que a la madera. Por otra parte,

considerando que todas las células del tejido foliar se encontraban vivas al momento de la

colección, mientras que en la madera algunas células ya se encontraban muertas, podría

esperarse una mayor concentración de ADN en el tejido foliar. Teniendo en cuenta que no

encontramos diferencias significativas en la concentración y pureza del ADN obtenido de

tejido foliar y de madera, podríamos considerar que la corteza no actúa como una barrera de

protección, ni que el número de celulas muertas al momento de la colección influyeron en la

concentración y pureza de ADN de los especímenes previamente alcoholizados.

Se encontró que es indiferente el tratamiento que se use para la extracción de ADN, pues el

valor de concentración se mantuvo entre los rangos asignados, es decir, sin importar si la

fuente de ADN provenía de material de herbario ( madera u hoja), o provenía de tejido foliar

almacenado en el banco de sílica gel, el resultado de la concentración obtenida se mantuvo

dentro del rango alto, medio o bajo para cada espécimen, por lo tanto el material de herbario

es una fuente de ADN equiparable con el tejido foliar deshidratado en sílica gel y teniendo

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en cuenta, para el caso específico de colecciones botánicas almacenadas en herbarios, las

ventajas que sobresalen en el uso de madera sobre las hojas, este resultado demuestra que es

posible hacer uso de la madera de especímenes de herbario como fuente de ADN con la

posibilidad de obtener un resultado de concentración de ADN equiparable al obtenido del

material deshidratado en sílica gel.

La Edad del espécimen en la obtención de ADN

De las 306 muestras evaluadas, sólo 63 tenían edades mayores a un año. Por consiguiente,

no contamos con una muestra suficiente para determinar el efecto de la edad en la

concentración y pureza de ADN de especímenes de herbario. Sin embargo, los resultados

muestran una tendencia inversa entre la edad y la concentración de ADN. Es decir, que se

obtuvo ADN más puro y en mayores concentraciones en los especímenes más jóvenes. Estos

resultados concuerdan con los obtenidos por Erkens et al. (2008), quienes encontraron una

disminución en la concentración de ADN por cada año de aumento de la edad en muestras

de diferentes especies de Zehneria sp. Para poder evaluar la influencia de la edad en la pureza

y concentración de ADN, es necesario evaluar ejemplares que abarquen un rango de tiempo

más amplio. En nuestro caso no fue posible debido a que la edad se limitaba a los especímenes

de herbario que tuvieran muestra de tejido en el banco de sílica gel.

A pesar de que se muestra una relación entre las variables edad y altitud en una categoría alta

con la variable concentración en esta misma categoría, cabe aclarar que debido a la falta de

estandarización en el número de especímenes por cada edad evaluada e igualmente el número

24

de especímenes por altitud registrada, no se establece una relación directa entre estas

variables con el resultado de concentración obtenido.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Las ramas de los especímenes de herbario son un recurso valioso como fuente de ADN, pues

al ser comparado con las hojas, afecta en menor grado la integridad de los especímenes, no

altera de manera significativa la eventual descripción de la planta y disminuye la posibilidad

de extraer ADN de un organismo diferente. Teniendo en cuenta que no se encontraron

diferencias significativas en la concentración y pureza del ADN extraído de tejido foliar y de

madera de los especímenes, se podría pensar que la corteza de la madera no actúa como

barrera de protección del ADN, ni que el número de células muertas de la muestra en el

momento de la colección influyen en la concentración y pureza del ADN. Se evidenció una

tendencia en la disminución de la concentración del ADN con el aumento de la edad de los

especímenes, en donde las mayores concentraciones y la mayor pureza de ADN se

encontraron en los especímenes más jóvenes.

Se recomienda evaluar un mayor número de variables tales como el grosor y el color de las

hojas, la relación corteza-madera en la rama, así como un rango mayor de edad de los

especímenes, con el objeto de aprovechar el invaluable recurso que representan los

especímenes botánicos como fuente de ADN.

25

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Anexo 1. Lista de los especímenes del Herbario Forestal UDBC evaluados

N° Nombre científico Colector N° colección

Año Región Altitud

(msnm)

1 Palicourea acuminata M. Reina 60 2018 Santander 1850

29

2 Palicourea acuminata S. Combita 77 2018

Santander 2086

3 Palicourea angustifolia R. Cortés 2420 2018

Santander 2000

4 Palicourea aschersonica

R. Cortés 3371 2014

Cundinamarca 2174

5 Palicourea berteroana R. Cortés 3316 2005

Antioquia 573

6 Palicourea berteroana R. Cortés 3327 2017

Antioquia 678

7 Palicourea bertieroides R. Cortés 3336 2017

Antioquia 719

8 Palicourea brachiata R. Cortés 3312 2017

Antioquia 573

9 Palicourea brachiata R. Cortés 3319 2017

Antioquia 573

10 Palicourea guianensis J. Ruiz 124 2017

Meta 498

11 Palicourea guianensis R. Cortés 2636 2017

Tolima 495


Boyacá 1295


Boyacá 1277


Cundinamarca 1703


Cundinamarca 1703

16 Palicourea nitidella R. Cortés 3234 2008

Vaupés 193

17 Palicourea nitidella R. Cortés 3243 2008

Vaupés 193

18 Palicourea ovatistipula R. Cortés 3313 2007

Antioquia 573

19 Palicourea quadrilateralis

R. Cortés 3325 2003

Antioquia 678

20 Palicourea quadrilateralis

R. Cortés 3326 2005

Antioquia 678

21 Palicourea racemosa R. Cortés 3388 2008

Chocó 5

22 Palicourea rosea R. Cortés 3310 2008

Antioquia 573

23 Palicourea sanluisensis R. Cortés 3315 2008

Antioquia 573

24 Palicourea sanluisensis R. Cortés 3321 2008

Antioquia 865

25 Palicourea schlimii R. Cortés 2458 2008

Santander 2000

26 Palicourea solitudinum J. Richardson

2017-16 2008

Chocó 5

27 Palicourea solitudinum J. Richardson

2017-17 2009

Chocó 5

28 Palicourea sp. J. Ruiz JRM3 2010

Meta 498

30

29 Palicourea sp. R. Cortés 2479 2012

Boyacá 2739


Valledupar 2000


Antioquia 678


Antioquia 719


Cundinamarca 2286


Cundinamarca 2176


Cundinamarca 2176


Cundinamarca 2176


Cundinamarca 2176


Cundinamarca 2176


Cundinamarca 2176


Cundinamarca 2125


Cundinamarca 2174


Cundinamarca 1703


Cundinamarca 1703


Cundinamarca 1703


Cundinamarca 1703


Cundinamarca 1703


Chocó 5


Choco 5

49 Palicourea stellata M. Medina 362 2017

Santander 2415

50 Palicourea triphylla R. Cortés 3220 2017

Vaupés 289


Vaupés 192


Vaupés 192


Vaupés 192

54 Palicourea violacea R. Cortés 3103 2017

Boyacá 1600

55 Palicourea violacea R. Cortés 3105 2017

Boyacá 3200

56 Palicourea woronowii R. Cortés 3263 2017

Vaupés 192

31

57 Psychotria aff. carthagenensis

R. Cortés 2834 2017

Guajira 500

58 Psychotria aff. sylvivaga

R. Cortés 2419 2017

Santander 2000

59 Psychotria aff. sylvivaga

R. Cortés 2460 2017

Santander 2000

60 Psychotria anceps R. Cortés 3101 2017

Boyacá 1231

61 Psychotria anceps R. Miranda 137 2017

Meta 498

62 Psychotria aschersoniana

M. Reina 310 2017

Santander 2000

63 Psychotria brachiata J. Navarro 229 2017

Antioquia 573

64 Psychotria brachiata M. Correa 2732 2017

Caquetá 242

65 Psychotria brachiata R. Cortés 3108 2017

Boyacá 1101

66 Psychotria brachiata R. Miranda 196 2017

Meta 498

67 Psychotria carthagenensis

R. Cortés 3286 2017

Vaupés 192

68 Psychotria carthagenensis

R. Cortés 3344 2017

Antioquia 201

69 Psychotria cf sylvivaga R. Cortés 3409 2017

Magdalena 650

70 Psychotria cf tendlen R. Cortés 3414 2017

Magdalena 650

71 Psychotria cooperi R. Cortés 2660 2017

Chocó 43

72 Psychotria cuspidata M. Reina 292 2017

Santander 1850

73 Psychotria erythrocephala

S. Ángel 226 2017

Santander 2000

74 Psychotria glomerulata J. Richardson

2017-13 2017

Chocó 5

75 Psychotria hejdada W. Ariza 8004 2017

Santander 1200

76 Psychotria humboldtiana

R. Cortés 3290 2017

Vaupés 190

77 Psychotria longicuspis R. Cortés 3252 2017

Vaupés 192

78 Psychotria longicuspis R. Cortés 3259 2017

Vaupés 192

79 Psychotria luxurians S. Ángel 219 2017

Santander 2000

80 Psychotria micrantha W. Ariza 8013 2017

Santander 1200

81 Psychotria microbotrys R. Cortés 3251 2017

Vaupés 192

82 Psychotria poeppigiana J. Richardson

2017-12 2017

Chocó 5

32

83 Psychotria poeppigiana R. Cortés 3227 2017

Vaupés 193

84 Psychotria rosea W. Ariza 8040 2017

Santander 1200

85 Psychotria sacciformis R. Cortés 3348 2017

Antioquia 201

86 Psychotria saltatrix R. Cortés RC2463 2017

Santander 2000

87 Psychotria sp. E. Sastoque 139 2017

Meta 498

88 Psychotria sp. J. Richardson

2017-28 2017

Chocó 5

89 Psychotria sp. J. Richardson

2017-47 2017

Chocó 5

90 Psychotria sp. R. Cortés 1693 2017

Meta 467


Guainía 200


Caquetá 147


Vaupés 180


Vaupés 180


Antioquia 573


Antioquia 573


Antioquia 865


Antioquia 865


Magdalena 650

10

0

Psychotria sp. S. Ángel 295 2008

Nariño 1409

10

1

Psychotria sp. S. Ángel 302 2009

Nariño 1409

10

2

Psychotria violacea J. Mendoza 137 2009

Meta 498

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