Evaluación de los efectos en la biomasa de la microalga Chlamydomonas reinhardtii en la captura de CO2 proveniente del proceso de producción de

hidrocarburos.

Dora Lucia Porras Ortiz, Andrés González Barrios Universidad de los Andes, Departamento de Ingeniería Química

Resumen

Las grandes emisiones de dióxido de carbono a la atmósfera contribuyen drásticamente con

la problemática ambiental que demandan la atención de toda la población. Chlamydomona

reinhardtii ha sido el organismo modelo para entender distintos mecanismos celulares y de

control y a su vez para estudiar su viabilidad en la fijación de carbono en su forma de CO2

para la producción de biomasa como producto de valor agregado. En este proyecto se busca

cuantificar la producción de biomasa evaluando el efecto del nivel de dióxido de carbono

en la velocidad de crecimiento y biomasa de la célula utilizando como fuente de carbono

CO2 proveniente de una chimenea industrial de ECOPETROL. Teniendo una

concentración de 1% de CO2 y una frecuencia de suministro cada 24 horas, no se logró un

crecimiento celular posiblemente debido a un déficit en la cantidad de CO2; se propone una

nueva metodología donde se aumenta la frecuencia de suministro de CO2 obteniendo un

crecimiento de la microalga con gas de chimenea y así lograr la extracción de lípidos,

proteínas, pigmentos y biomasa. Para el día 6 se observó la inhibición en el crecimiento

celular probablemente por la acumulación de sustancias tóxicas para las microalgas. Para el

día 10 de cultivo, la microalga recuperó el crecimiento celular producto de una adaptación

con las trazas presentes en el gas de chimenea. Por otro lado, para una alta concentración de

dióxido de carbono, se obtuvo una velocidad de crecimiento especifica de 0.185días-1

y

para el control se tiene 0.479días-1

, lo cual corrobora que a pesar de que si se logra un

crecimiento celular con gas de chimenea, este gas contiene trazas que inhiben el

crecimiento celular produciendo una menor cantidad de biomasa en comparación al control

con dióxido de carbono anaerobio.

Palabras claves: Chlamydomona reinhardtii, biomasa, fijación de carbono, chimenea

industrial, inhibición, crecimiento celular, velocidad de crecimiento especifica.

Introducción

En este siglo, la humanidad afronta una grave problemática debido al aumento de la demanda energética mundial, el agotamiento de los combustibles fósiles, el incremento del precio del petróleo y las dificultades ambientales causadas por los gases de invernadero (Garibay Hernández, Vázquez Duhalt, Sánchez,

Serrano Carreón, & Martínez Jiménez, 2009). Esta situación demanda urgentemente fuentes alternativas de energía basadas en procesos sustentables, renovables y amigables con el ambiente, que además posibiliten la captura de carbono. El problema de las altas emisiones de CO2 y la contaminación del aire no es una novedad. Las concentraciones de

dióxido de carbono en la atmósfera han superado el 40% del total de las emisiones que el planeta ha experimentado en los últimos 650000 años (Devanney, 2010). Gran parte del problema se debe al exceso de consumo de combustibles fósiles y procesos industriales ineficientes. Además, los combustibles fósiles son recursos no renovables y se están agotando rápidamente. Se necesitan fuentes alternativas de energía (Dunlap & Jorgenson, 2012). Los principales focos industriales de emisión de contaminantes a la atmósfera son las chimeneas. En ellas se emiten óxidos de azufre, nitrógeno y carbono, partículas, metales traza, hidrocarburos y compuestos de cloro y flúor (Matín Estevez, Melón Vega, & Sánchez Albiz, 2000). Todos los países industrializados, y un creciente número de países en vías de desarrollo, cuentan con chimeneas en sus procesos industriales. Por ende, la necesidad de buscar soluciones que permitan la prevención de la problemática ambiental. Aunque se han presentado diferentes soluciones, muchas de ellas no son muy factibles o terminan siendo muy costosas. Estos factores ambientales y económicos han generado la necesidad de considerar alternativas no convencionales de combustibles que cumplan con los requerimientos de ser fuentes de energía limpias y renovables. Actualmente hay una fuerte tendencia para emplear microalgas no solo para derivar componentes de interés como biocombustibles sino reciclar el CO2 liberado por plantas industriales y explotar las capacidades celulares ( Pedroche Sánchez, 2011). Las microalgas son adecuadas para dicha funcionalidad debido a que son células eucariotas unicelulares que tienen la capacidad de sintetizar macromoléculas a través de la fotosíntesis utilizando la luz del sol y el CO2 para producir

principalmente proteínas, lípidos, hidratos de carbono y pigmentos, que constituyen la biomasa (Harris, 2001). Además son capaces de desarrollarse mixotróficamente, es decir, de forma autótrofa produciendo su propio alimento o heterótrofa obteniendo su alimento de fuentes externas, según la disponibilidad de compuestos orgánicos y la intensidad lumínica. (Rivera Solis, Peraza Echeverría, & Herrera Valencia, 2011). Es por esto que implementar piscinas de microalgas, no sólo reduciría las emisiones de CO2 al ambiente, sino que adicionalmente generarían un producto de valor agregado. La biomasa de microalgas puede proporcionar una amplia variedad de compuestos de interés biotecnológico; está constituida por 20-30% de lípidos disponibles para la producción de biodiesel, 20-55% de carbohidratos para la producción de etanol, 40-50% de proteínas, y la parte restante la componen otras sustancias propias de cada cepa de microalga (Amaro, Guedes, & Malcata, 2011). La producción de biocombustibles es globalmente percibida como una opción viable debido a que intercepta tres objetivos estratégicos: seguridad energética, bienestar económico y estabilidad ambiental, por lo que especialistas alrededor del mundo se han enfocado en el estudio de nuevas alternativas que utilicen como materia prima biomasa (caña de azúcar, microalgas, entre otros), haciendo que el CO2 producto de la combustión pueda ser nuevamente fijado para la formación de nueva biomasa (González Delgado, Barajas Solano, & Kafarov, 2011). Recientemente, las microalgas verdes, y en particular la especie Chlamydomonas reinhardtii, han surgido como una alternativa nueva y atractiva para la producción de biomasa, debido principalmente a su cultivo fácil y

económico, su gran capacidad para acumular biomasa y son generalmente consideradas como inocuas para el ser humano. Además Chlamydomonas ha sido seleccionada como el organismo modelo para entender procesos de control celular, expresión genómica, y distintos mecanismos de sobrevivencia como el CCM (carbon concentration mechanism) (Rivera Solis, Peraza Echeverría, & Herrera Valencia, 2011). Hasta el momento, las investigaciones en microalgas y específicamente en Chlamydomonas se han limitado al entendimiento celular desde la perspectiva ómica, involucrando estudios genómicos, proteómicos y metabolómicos cuando se varían condiciones de crecimiento (como CO2, nitrógeno, longitudes de onda, entre otros). Sin embargo, publicaciones sobre la aplicabilidad de microalgas para biorremediación y tratamiento de aguas o ambientes contaminados es limitado. Además es importante recalcar que la gran mayoría de experimentos se han realizado a condiciones controladas empleando CO2 anaerobio, donde se ignoran trazas de sulfuros y otros contaminantes que se encuentran en los residuos industriales. Es por esto, la importancia de evaluar el potencial del uso de las microalgas, en particular la especie Chlamydomonas reinhardtii, en capturar carbono de las emisiones producto de chimeneas industriales con el fin de desarrollar un proceso viable para la reducción de CO2

a la atmósfera junto con la generación de un producto de valor agregado, como lo son los biocombustibles. Este proyecto está enfocado en la captura de CO2 emitido por la planta de Ecopetrol en Barrancabermeja. Busca caracterizar la producción de biomasa en la microalga Chlamydomonas reinhardtii cuando la condición de crecimiento es evaluada a diferentes concentraciones

de CO2 industrial, con el fin de evaluar el efecto del nivel de dióxido de carbono en la velocidad de crecimiento y biomasa de la célula para obtener conclusiones acerca de la viabilidad de utilizar microalgas en la captura del CO2 industrial y la producción de biomasa. Materiales y Metodología

- Crecimiento de la microalga

Chlamydomonas reinhardtii.

La cepa de la microalga Chlamydomonas

reinhardtii fue adquirida del laboratorio

de biotecnología ML 416, grupo de

Diseño de Productos y Procesos

presente en medio TAP sólido.

Para el crecimiento celular de la microalga Chlamydomonas reinhardtii se definió el medio de crecimiento como HSM, el cual es alto en sales y en deficiencia de acetato de sodio o cualquier otra fuente de carbono para permitir el crecimiento autótrofo. Está compuesto por una solución de sales (también conocida como solución de Beijetinck), una solución de fosfato y oligoelementos de Hutner. La composición del medio se muestra en la Tabla 1 (Sueoka, 1960): Las 3 soluciones se mezclaron en proporción 5:5:1 en su respectivo orden para un volumen final de 1L de medio HSM (solución stock). Los erlenmeyers se colocaron en un shaker con suministro de dióxido de carbono con concentración controlada. Para cada experimento se contó con un preinóculo que previamente había alcanzado el estado estacionario y fue renovado para cada corrida.

Tabla 1. Composiciones del medio HSM

Reactivos Cantidad (g)

Solución de sales (en 250mL de agua)

NH4Cl 49.991

MgSO4. 7H2O 2.029

CaCl2. 2H2O 1.096

Solución de fosfatos (en 250mL de agua)

K2HPO4 72.078

KH2PO4 36.11

Oligoelementos de Hutner´s (en 500mL de agua)

EDTA 6.25

ZnSO4. 7H2O 2.75

H3BO3 1.425

MnCl2. 4H2O 0.6325

CoCl2. 6H2O 0.20125

CuSO4. 5H2O 0.2

(NH4)6Mo7O24.4H2O 0.1375

FeSO4. 7H2O 0.65

Para determinar la concentración de CO2 al cual va a permanecer el sistema, se calculó el espacio libre de medio en el erlenmeyer y con esto se definió el volumen del sistema. Se calculó la cantidad de CO2 que debía estar presente para garantizar una concentración específica con respecto al aire contenido. Además, se llevó a cabo un análisis volumétrico empleando titulación para determinar la concentración de dióxido de carbono en el medio. El primer diseño experimental se muestra a continuación:

Tabla 2. Primer diseño experimental para Chlamydomonas reinhardtii

Experimento Condición de CO2 Réplica

Experimento 1 Baja Réplica 1

1% Réplica 2

El cual cuenta con un experimento biológico con 2 réplicas técnicas. El suministro de CO2 se hace cada 24 horas. En busca de generar un ambiente favorable de crecimiento a la microalga (concentración de CO2) se evalúa el aumento de la frecuencia en el suministro de dióxido de carbono, por tanto, se plantea el siguiente diseño experimental:

Tabla 3. Segundo diseño experimental para Chlamydomonas reinhardtii

Experimento Condición de CO2 Réplica

Experimento 1 Baja Réplica 1

3% Réplica 2

Experimento 2 Alta Réplica 1

25% Réplica 2

El cual cuenta con 2 experimentos biológicos, y cada uno de ellos con 2 réplicas técnicas. Para cada experimento biológico, se cuenta con un control positivo, el cual tendrá como fuente de carbono CO2 anaerobio proveniente del laboratorio. Además, para garantizar que la cantidad suministrada de CO2 industrial es equivalente a la concentración de dióxido de carbono en el control positivo, se lleva a cabo un análisis volumétrico por medio de titulación para determinar la concentración de CO2 en el medio, conociendo que la concentración de dióxido de carbono del gas proveniente de chimenea es de 80%

Figura 1. Montaje de experimentación. El montaje del experimento cuenta con un erlenmeyer de 1L y un tapón con un orificio para que por medio de jeringas se suministre el CO2.

Para obtener la curva de crecimiento, la supervisión se lleva a cabo cada 24 horas en el que se extrae una muestra de 1 mL para determinar la densidad óptica utilizando el espectrofotómetro a 750 nanómetros. Al mismo tiempo, el recuento de células se lleva a cabo mediante el uso de una cámara de Neubauer extrayendo una muestra de 500 µL y observando en el microscopio.

- Determinación de concentración de CO2 por titulación

Se busca establecer la concentración de CO2 durante la experimentación, teniendo en cuenta que el suministro de dióxido de carbono se hace cada 3 horas. Se lleva a cabo el siguiente diseño experimental:

Tabla 4. Diseño experimental para la titulación

Suministro de CO2

1 Hora Titulación

3 Horas Titulación

Suministro de CO2

4 Horas Titulación

6 Horas Titulación

Cabe aclarar que lo anterior se lleva a cabo en 4 erlenmeyers diferentes, con el fin de que todas las titulaciones estén a las mismas condiciones (igual cantidad de medio). El blanco es medio HSM, se hacen 2 réplicas y se emplea hidróxido de sodio al 0.1M.

- Caracterización y cuantificación de biomasa

Para la caracterización y cuantificación de biomasa se determina el peso seco de biomasa total. Se toman 50 mL y se centrifugan. El sedimento se limpia a partir de sales mediante la mezcla con agua desionizada y centrifugación. Se repite el procedimiento una vez más y después el sedimento se suspende con 2 mL de agua y la solución se transfiere a una caja de Petri para secar en un horno. El horno debe estar a 90°C y la muestra se incubará durante toda la noche. Los cambios de peso se determinan y una vez se establece la condición de biomasa máxima, se caracteriza y cuantifica la biomasa con el fin de compararla con la condición de referencia (bajo dióxido de carbono).

- Extracción de lípidos

En la extracción de lípidos, se emplea metanol y cloroformo para separar los lípidos de los carbohidratos. Para esto, se ubica un mortero en el congelador a 80°C, la muestra de cultivo se centrifuga a 3000 rpm por 5 minutos a 4°C. Se toma el mortero congelado, se ubica en una cama de hielo y se adiciona gota a gota el precipitado. Teniendo todo el

precipitado en el mortero, se comienza a macerar el precipitado congelado hasta descongelarlo, se colecta y se limpian los residuos del mortero con agua destilada. Se mide el nuevo volumen en el tubo. Teniendo el precipitado descongelado, se debe tomar 1 mL y agregarle 3.75 mL de la mezcla 1:2 (V/V) de Cloroformo/metanol y mezclar en el vórtex por 1 minuto. Además, adicionar 1.25 mL de cloroformo y seguir agitando por otro minuto. Se adiciona 1.25 mL de agua destilada y se agita por 1 minuto en el vórtex. Incubar en hielo por 5 min y centrifugar la mezcla durante 15 minutos a 4500 rpm a una temperatura de 3°C. Y por último, separar el sobrenadante en otro tubo y medir el volumen del mismo.

- Cuantificación de proteínas (Bradford, Marion, 1976)

En primera instancia, se prepara la solución de Bradford. Para esto, se deben diluir 100 mg de “Azul de Comassie G-250” en 50 mL de etanol (95%) y a esta solución adicionar 100 mL de ácido fosfórico (85% p/v) y aforar hasta 1 L con agua destilada. Por otra parte, se deben preparar 100 mL de solución buffer para extracción de TRIS 100 nM a pH de 7.5, EDTA 4nM, 2-mercaptoetanol 5nM, 10% glicerol y 0.05% de Trition X-100. Durante 10 min la muestra de cultivo a cuantificar se centrifuga a 4500 rpm a una temperatura de 4°C. Se adicionan 2 mL de agua y por 15s se agita en el vórtex. La muestra se vierte en un tubo falcón de 15 mL y se ubica en el sonicador por 10 min, con 10 pasos On y 50 pasos Off. Adicional a esto, se prepara una solución de 100 mg/L de suero de albumina bovina (SAB) y se almacenan alícuotas en tubos ependorf a -80°C. Se continúa a tomar una alícuota y preparar las

siguientes soluciones para la curva de calibración: Tabla 5. Soluciones de la curva de calibración

Sln. Inicial SAB (µL)

Volumen agua (µL)

Concentración (mg/L)

0 100 0

20 80 20

40 60 40

60 40 60

80 20 80

100 0 100

Se adiciona 2 mL de la solución buffer preparada anteriormente, por cada mililitro de la muestra macerada y se registra el volumen total de la muestra. Durante 10 min se centrifuga a 4500 rpm con una temperatura de 4°C. Se toman 0.1 mL del sobrenadante por réplica técnica y a cada solución sonicada anteriormente se adiciona 5 mL de la solución Bradford. Teniendo esto, se agita en el vórtex y a los 20s se mide la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm. Finalmente, se determina la concentración de proteínas de la muestra a partir de la curva de calibración preparada con el suero de albumina haciendo una interpolación de los datos.

- Cuantificación de pigmentos de la microalga Chlamydomonas reinhardtii. (Henriques, M, 2007)

Se inicia midiendo el volumen del precipitado. Con este valor registrado, se procede a adicionar 2 mL de agua destilada y se resuspende el precipitado con el vórtex. Por 5 min y a temperatura ambiente se centrifuga a 4000 rpm, y se repite el procedimiento mencionado. Posterior a esto, se adicionan 2 mL de etanol (98%) y se agita en el vórtex por 15s. Dejar en reposo 24 horas a 6°C y nuevamente por 5 min y a temperatura ambiente centrifugar a 4000 rpm.

Adicionar 2 mL de etanol (98%) y se agita en el vórtex por 15s. Dejar en reposo 24 horas a 6°C, al término de esto, centrifugar a 4000 rpm por 5 min y a temperatura ambiente. Medir la absorbancia del sobrenadante a 750, 663, 645 y 630 nm usando como blanco etanol. Finalmente, para cuantificar, se hace uso de la ecuación de Kaczman:

( )

( )

Donde V es el volumen de la muestra

(mL), es el volumen de etanol usado (mL) y es la longitud de la celda espectrofotométrica (cm) Los procedimientos para la cuantificación de biomasa, proteína y pigmentos, así como la extracción de lípidos, son desarrollos experimentales previamente establecidos por el departamento de ingeniería química de la Universidad de los Andes en el laboratorio de biotecnología (ML_416). Para las pruebas mencionadas anteriormente se tendrán en cuenta las siguientes cantidades:

Tabla 6. Cantidades en mL por prueba de laboratorio

Por réplica (mL)

Total (mL)

Biomasa 50 100

Lípidos y carbohidratos 100 200

Proteína 50 100

Pigmento 15 30

Total (mL) 430

Por lo que se decide que los erlenmeyers a utilizar deben ser de 1 L, a los cuales se les adiciona 470 mL de medio, teniendo en cuenta los 430 mL para las pruebas de pigmento, proteína, lípidos,

carbohidratos y biomasa; además de las muestras necesarias para llevar a cabo la curva de crecimiento de la microalga mencionadas con anterioridad y que en el momento de autoclavar los erlenmeyers, se presenta evaporación del medio. Resultados y Análisis Realizando el análisis volumétrico por titulación, se obtiene que la concentración de dióxido de carbono cuando se suministra 3mL de CO2 es 107.64 ppm y para 25mL de CO2 es 897 ppm. Estos valores son en promedio contantes durante toda la experimentación con una desviación estándar de 4.1526. La titulación permitió corroborar que el gas industrial presenta una concentración de 77.52% de CO2. Este dato fue importante para el diseño del control positivo y así mantener condiciones similares de crecimiento. Por tanto, para el experimento de alta concentración, se logran las mismas condiciones con 25mL de CO2 anaerobio en el control positivo y 35mL de CO2 industrial en las réplicas del experimento.

- Curvas de crecimiento Se llevó a cabo el proceso de obtención de la curva de crecimiento para el primer diseño experimental (Bajo CO2) con las respectivas réplicas y el control positivo. La figura de absorbancia no muestra la curva de crecimiento esperada, ya que no presenta ninguna tendencia a aumentar hasta llegar a la fase estacionaria. Los datos obtenidos se encuentran dentro de un rango cuya magnitud es muy pequeña presentando una desviación alta.

Días de cultivo

0 1 2 3 4 5 6

OD

75

0 n

m

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

Control

Exp1 R2

Exp1 R1

Figura 2. Absorbancia vs días de cultivo. 2 alicuotas de la muestra por día fueron promediadas para la evaluación de biomasa por absorbancia a 750nM.

A su vez, la figura de conteo celular es acorde con la de absorbancia, puesto que la cantidad de pigmentos está relacionada con el número de células. Cualitativamente se observó que las células presentaban una forma irregular, de tamaño menor al esperado y un color verde tenue mostrando inviabilidad celular.

Conteo Celular

Días de cultivo

0 1 2 3 4 5 6

No

. d

e C

élu

las

-2

0

2

4

6

8

10

12

Exp1 R1

Exp1 R2

Control

Figura 3. Número de células vs días de cultivo. 2 alicuotas de la muestra por día fueron promediadas para la evaluación de biomasa por conteo celular.

Los resultados experimentales sugieren que la condición baja de concentración de CO2 suministrada cada 24 horas a la microalga Chlamydomona reinhardtii no era suficiente para garantizar su crecimiento. Se sabe que la microalga Chlamydomona reinhardtii puede estar bajo condiciones de estrés cuando hay cambios en el pH, cuando está bajo temperaturas extremas o cuando hay restricción de nutrientes y favorecer, bajo ciertos parámetros, la producción de componentes celulares específicos como lípidos en el caso de deficiencia de nitrógeno (Martinez, Chen, & Ruan, 2009). Para el experimento de baja concentración, se puede decir que la microalga estuvo bajo condiciones de estrés asociado al déficit de carbono disponible, que en últimas determina su crecimiento. Los demás parámetros, como la temperatura y el pH fueron evaluados dando condiciones favorables de crecimiento (Temperatura ambiente y pH neutro). Por tanto, se evalúa el segundo diseño experimental, obteniendo los siguientes resultados: Para una concentración baja de CO2 se observa la tendencia esperada de crecimiento para una microalga, teniendo en primera instancia la fase inicial, seguido de la fase exponencial y una fase estacionaria entre los días 11 y 14 de cultivo. Además, para los últimos días de estudio se obtiene un aumento en la absorbancia tanto para el control como para las réplicas, lo que sugiere un crecimiento celular. Con respecto al número de células en el medio, se observa un mayor crecimiento por parte de las réplicas en la fase inicial del experimento. Para el día 6 el control positivo crece hasta generar una diferencia significativa en el número de células en la fase exponencial.

Figura 4. Absorbancia vs días de cultivo para baja concentración. 2 alicuotas de la muestra por día fueron promediadas para la evaluación de biomasa por absorbancia a 750nM.

Figura 5. Número de células por mililitro vs días de cultivo para baja concentración. 2 alicuotas de la muestra por día fueron promediadas para la evaluación de biomasa por conteo celular.

Para una concentración alta de CO2

(~25%) se tiene que:

Figura 6. Absorbancia vs días de cultivo para alta concentración. 2 alicuotas de la muestra por día fueron promediadas para la evaluación de biomasa por absorbancia a 750nM.

Con el aumento de la concentración de CO2 suministrado se obtiene una mayor absorbancia en tan sólo 4 días de cultivo en comparación con baja concentración de dióxido de carbono, en la que para obtener una absorbancia de 0.4 se necesitan 16 días.

Figura 7. Número de células por mililitro vs días de cultivo. 2 alicuotas de la muestra por día fueron promediadas para la evaluación de biomasa por conteo celular.

Al igual que para una baja concentración de CO2, para un suministro de aproximadamente 25%, se obtiene un

Dias

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

OD

750

nm

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Réplica1

Réplica2

Control

Dias

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

ce

lls/m

L

0,0

2,0e+5

4,0e+5

6,0e+5

8,0e+5

1,0e+6

1,2e+6

Réplica 1

Réplica 2

Control

Días

0 2 4 6 8 10 12 14 16

OD

750

nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Réplica1

Réplica2

Control

Días

0 2 4 6 8 10 12 14 16

ce

lls/m

in

0,0

5,0e+5

1,0e+6

1,5e+6

2,0e+6

2,5e+6

Promedio réplicas

Control

mayor número de células por mililitro para el control positivo. Se observa que inicialmente hay un crecimiento similar para el control y experimento pero al sexto día aproximadamente hay un descenso en el crecimiento que puede ser debido a contaminantes que inhiben el crecimiento celular. Es muy probable que se estén acumulando ciertas sustancias toxicas para las microalgas. Cualitativamente se observó que las células presentaban una forma regular, de tamaño igual al esperado y un color verde fuerte. Con un aumento en la concentración de CO2, se logra el crecimiento esperado para la microalga Chlamydomona reinhardtii, pero a su vez ese aumento de dióxido de carbono estará reaccionando con el medio, que en su mayoría es agua, produciendo ácido carbónico lo que genera una disminución del pH y del porcentaje de oxigeno durante toda la experimentación, además de que grandes cantidades de CO2 pueden superar la cantidad que puede metabolizar las células por fotosíntesis, generando la inhibición del crecimiento de la microalga. Los resultados muestran la inhibición del crecimiento de la microalga por parte del CO2 industrial debido a que este gas contiene trazas compuestas de óxidos de nitrógeno y de azufre que generan un estancamiento en el crecimiento de la microalga, lo que conlleva a que el número de células en el control positivo sea mayor que en las réplicas. Cabe resaltar que después de días de cultivo, la microalga entra en un proceso de adaptación con el medio y recupera el crecimiento celular (Cuaresma, 2011). A partir de los resultados de absorbancia, se puede afirmar que el aumento en la concentración de dióxido de carbono influye en la tasa de multiplicación celular

provocando la generación de más células que al estar relacionadas con la cantidad de pigmentos, generan una mayor pigmentación y por consiguiente una mayor absorbancia. La velocidad de crecimiento específica µ para la fase exponencial se determinó mediante la siguiente ecuación (Martinez, Chen, & Ruan, 2009):

(

)

( )

Y se obtiene: Tabla 7. Velocidades de crecimiento específicas para alta concentración

Velocidades de crecimiento (días-1)

Días 2-6 Días 9-13

CO2 chimenea 0,2378 0,0838

CO2 anaerobio 0,4274 0,0904

Los resultados anteriores indican que con la implementación de gas de chimenea como suministro de carbono para la microalga Chlamydomonas reinhardtii se logra un comportamiento similar del crecimiento celular en comparación al control positivo teniendo en cuenta que con el dióxido de carbono anaerobio se obtiene aproximadamente el doble de la velocidad de crecimiento especifica por encima de las réplicas del experimento de alta concentración. La microalga Chlamydomona reinhardtii crece en medio HSM en condiciones favorables si se suministra 1.2 g/L de acetato de sodio (fuente de carbono) (Sueoka, 1960). Para los 470 mL que se emplean en el experimento, se necesitaría lograr una concentración de 599.99ppm de carbono para el crecimiento de la microalga. Este valor

corrobora los resultados obtenidos para el crecimiento celular, en los que para baja concentración se tiene 107.64ppm, muy por debajo de este valor, generando sólo 562500 celulas/mL, por el contrario para alta concentración en la que se supera el valor teórico teniendo 897ppm, se alcanza un valor de 1922500 celulas/mL. En comparación a las velocidades de crecimiento, se tiene 0.089dias-1 para baja concentración, y 0.185días-1 para alta concentración. Después de establecer el crecimiento celular, y teniendo en cuenta que para el experimento con suministro de CO2 cada 24 horas no se logra un buen crecimiento, se decide realizar las respectivas cuantificaciones sólo para el segundo diseño experimental.

- Cuantificación de biomasa Para la cuantificación total de biomasa producida por la microalga se obtiene una mayor cantidad para el control positivo en comparación con las réplicas del experimento, tanto para baja como alta concentración de dióxido de carbono.

Figura 8. Cantidad de biomasa para el experimento de baja concentración del diseño experimental 2. 2 réplicas de la muestra fueron promediadas para la cuantificación de biomasa.

Figura 9. Cantidad de biomasa para el experimento de alta concentración del diseño experimental 2. 2 réplicas de la muestra fueron promediadas para la cuantificación de biomasa.

Debido a que la cantidad de células y la absorbancia para cada muestra están ligadas con la cantidad de pigmentos, lípidos, proteínas y biomasa que se produce, era de esperarse que con el alto crecimiento celular para la alta concentración de CO2 se obtuvieran grandes cantidades de estos productos de valor agregado en comparación con el de baja concentración.

- Cuantificación de lípidos

totales El aumento de la concentración de dióxido de carbono suministrado sugiere un aumento considerable en la cantidad de lípidos totales presentes en el medio, esto en base a los resultados mostrados a continuación. Se observa un incremento de aproximadamente un 50% en la cantidad de lípidos producidos por la microalga con el aumento de CO2 en el medio. Para el control se obtiene una cantidad superior de lípidos totales en comparación con las réplicas del

Baja Concentración

Experimento Control

Cantidad B

iom

asa m

g

0

5

10

15

20

Alta Concentración

Experimento Control

Cantidad B

iom

asa m

g

0

5

10

15

20

25

experimento, obteniendo casi el doble de la cantidad producida con el gas de chimenea.

Figura 10. Cantidad de lípidos para el experimento de baja concentración del diseño experimental 2. 2 réplicas de la muestra fueron promediadas para la cuantificación de lípidos totales.

Figura 11. Cantidad de lípidos para el experimento de alta concentración del diseño experimental 2. 2 réplicas de la muestra fueron promediadas para la cuantificación de lípidos totales.

La cantidad de lípidos, tanto para baja como para alta concentración, es mayor cuando se alimenta de CO2 anaerobio

(control positivo), ya que para baja concentración, se obtienen 2.58 mg por encima de los obtenidos para el experimento, y para el de alta concentración se obtienen 11.42 mg por encima del experimento. Estos resultados pueden deberse a que el gas industrial trae trazas de óxidos de nitrógeno, lo que conllevaría a una mala captación de nitrógeno por parte de las células reduciendo así la posibilidad de producción de lípidos, y esta diferencia entre el control y el experimento aumenta conforme se incrementa el suministro del gas.

- Cuantificación de proteínas

Para la cuantificación de proteínas es necesario realizar la curva de calibración con una solución de suero de albumina bovina.

Figura 12. Curva de calibración con una solución de 100 mg/L de suero de albumina bovina (SAB).

Se realiza un ajuste de los puntos con una regresión polinómica de orden 3 con un R² = 0,9924:

( )

Baja Concentración

Experimento Control

Líp

idos t

ota

les m

g

0

2

4

6

8

10

12

Alta Concentración

Experimento Control

Líp

idos t

ota

les m

g

0

5

10

15

20

25

30

Teniendo la ecuación que relaciona la absorbancia de la muestra con la concentración de proteína, se determina la concentración de cada muestra.

Figura 13. Concentración de proteína para el experimento de baja concentración del diseño experimental 2. 2 réplicas de la muestra fueron promediadas para la cuantificación de proteína total.

Figura 14. Concentración de proteína para el experimento de baja concentración del diseño experimental 2. 2 réplicas de la muestra fueron promediadas para la cuantificación de proteína total.

Como se observa en las figuras anteriores, se obtiene una diferencia significativa entre la concentración del control y las réplicas del experimento ya que utilizando CO2 anaerobio del laboratorio se alcanza aproximadamente el triple de concentración que si se utiliza CO2 industrial. Aunque un aumento en la cantidad de gas industrial suministrado sugeriría un aumento en la concentración de proteínas debido a la presencia de nitrógeno en el medio por parte de las trazas, los resultados arrojan lo contrario ya que para el experimento de alta concentración se obtiene una concentración de 107.96 mg/L para el control y solo 29.96 mg/L para el experimento. Esto en parte debido a que lo tóxico que resultan las trazas del gas, además estos resultados, junto con estudios sobre la influencia del incremento de CO2 en las microalgas, sugieren que estas alteraciones afectan la disponibilidad de nitrógeno intracelular provocando su desplazamiento (Baba & Shiraiwa, 2012)

- Cuantificación de pigmentos Teniendo la ecuación 1, estableciendo los volúmenes para cada muestra, disolviendo en 2mL de etanol y utilizando una celda con longitud de 2cm se obtienen los siguientes resultados: Para una baja concentración de dióxido de carbono se obtiene más cantidad de clorofila para el control positivo, en cambio para una alta concentración, el suministro de CO2 industrial permite una mayor producción de pigmentos en la microalga.

Baja Concentración

Experimento Control

Concentr

ació

n m

g/L

0

5

10

15

20

25

Alta Concentración

Experimento Control

Co

nce

ntr

ació

n m

g/L

0

20

40

60

80

100

120

140

Figura 15. g de clorofila por mililitro de medio para el experimento de baja concentración del diseño experimental 2. 2 réplicas de la muestra fueron promediadas para la cuantificación de clorofila.

Figura 16. g de clorofila por mililitro de medio para el experimento de baja concentración del diseño experimental 2. 2 réplicas de la muestra fueron promediadas para la cuantificación de clorofila.

Conclusiones Se puede concluir que a bajas concentraciones de CO2 la microalga Chlamydomona reinhardtii no crece satisfactoriamente debido a que se generan condiciones de estrés por la

ausencia de nutrientes. Además, el hecho de suministrar CO2 cada 24 horas acrecienta el ambiente hostil dentro del erlenmeyer. El segundo diseño experimental, en dónde se suministra CO2 tres veces al día con una mayor concentración, demostró resultados positivos en las curvas de crecimiento por conteo celular y por absorbancia. Al aumentar la frecuencia de suministro de CO2, además de la concentración del mismo, se generó un aumento en el número de células obtenidas por días de cultivo, además de una mayor cantidad de biomasa, proteína, pigmentos y lípidos. Es necesario tener en cuenta que al aumentar considerablemente la concentración de CO2 producto de la empresa de Ecopetrol, puede generarse un aumento de residuos como sulfuros, óxidos de nitrógeno que generan efectos de crecimiento tardío en la microalga

Chlamydomona reinhardtii.

La microalga Chlamydomona reinhardtii logró crecer teniendo como fuente de carbono CO2 proveniente de chimenea, con una velocidad de crecimiento en la fase exponencial por debajo de la obtenida con CO2 anaerobio, además las cantidades totales de biomasa, lípidos, proteínas y pigmentos estuvieron siempre inferiores a las cantidades producidas con el control positivo, lo que conlleva a afirmar que las trazas toxicas del gas de chimenea inhiben el crecimiento de la microalga generando una disminución en la cantidad de biomasa producida. Como trabajo futuro se plantea la necesidad de caracterizar el gas y determinar que componentes son los que afectan el crecimiento de la microalga Chlamydomona reinhardtii. Además de considerar un pretratamiento del gas para disminuir en gran medida los porcentajes de las trazas toxicas, y

Baja Concentración

Experimento Control

g c

loro

fila

/mL m

edio

0

50

100

150

200

250

300

350

Alta Concentración

Experimento Control

g c

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/mL m

edio

0

50

100

150

200

250

evaluar la viabilidad de implementar otra especie de microalga que permita una mejor adaptación con respecto a las trazas y así evitar los costos de un pretratamiento del gas de chimenea. Agradecimientos Quiero agradecer a mis padres Edgar Porras Díaz y Dora Ortiz y a mi hermano Edgar Fernando Porras Ortiz por todo el apoyo brindado, por creer en mí y en mis sueños, a mi sobrino Alejandro Porras Ávila por llenar mi vida de alegría. También quiero agradecer a todas las personas que estuvieron involucradas en la realización de mi proyecto de grado, en especial al profesor Andrés González Barrios, y a David Páez ya que sin ellos no hubiera sido posible la realización de este trabajo.

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