EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS ... · de plaguicidas como terbufos (89% de...
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EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS EN MIEL DE ABEJAS PROVENIENTES DEL MUNICIPIO DE SANTUARIO, RISARALDA, COLOMBIA. SAMIR ALBERTO GALLEGO JIMENEZ CRHISTIAN MAURICIO ARENAS MARIN UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGÍA ESCUELA DE QUÍMICA PEREIRA 2015
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EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS
ORGANOFOSFORADOS EN MIEL DE ABEJAS PROVENIENTES DEL
MUNICIPIO DE SANTUARIO, RISARALDA, COLOMBIA.
SAMIR ALBERTO GALLEGO JIMENEZ
CRHISTIAN MAURICIO ARENAS MARIN
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FACULTAD DE TECNOLOGÍA
ESCUELA DE QUÍMICA
PEREIRA
2015
EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS
ORGANOFOSFORADOS EN MIEL DE ABEJAS PROVENIENTES DEL
MUNICIPIO DE SANTUARIO, RISARALDA, COLOMBIA.
SAMIR ALBERTO GALLEGO JIMENEZ
CRHISTIAN MAURICIO ARENAS MARIN
Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de Químico
Industrial
Director:
Juan Pablo Arrubla Vélez
Qco. MSc. PhD c
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FACULTAD DE TECNOLOGÍA
ESCUELA DE QUÍMICA
PEREIRA
2015
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NOTA DE ACEPTACIÓN DEL TRABAJO DE GRADO
EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS
ORGANOFOSFORADOS EN MIEL DE ABEJAS PROVENIENTES DEL
MUNICIPIO DE SANTUARIO RISARALDA COLOMBIA
Presentado por:
SAMIR ALBERTO GALLEGO JIMENEZ
CRHISTIAN MAURICIO ARENAS MARIN
Los suscritos director y jurado del presente trabajo de grado, una vez revisada la
versión escrita y presenciado la sustentación oral, decidimos otorgar:
La nota de: ____________________________________________
Con la connotación: ____________________________________________
Para constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy:
Director:
Juan Pablo Arrubla Vélez _______________________________________
4
Jurado:
Firma _______________________________________
Jurado:
Firma _______________________________________
5
AGRADECIMIENTOS
Queremos agradecer a todas las personas que han hecho posible la
realización de este proyecto, en especial a nuestras familias por su
apoyo constante, su buen ejemplo y su amor puro.
A nuestro director de tesis Juan Pablo Arrubla por su asesoría, apoyo y
gestión sin la que no hubiera sido posible llevar a cabo nuestro trabajo
de grado.
A Alejandro García Ríos y al grupo de investigación de plaguicidas y
salud de la universidad del Quindío, por su constate amabilidad a la
hora de necesitar ayuda en la ejecución del proyecto.
A los apicultores del municipio de Santuario por su interés en el
proyecto, su calidad humana y su disposición para ayudarnos.
6
CONTENIDO
Pag.
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 11
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................. 13
3. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................. 15
4. OBJETIVOS .................................................................................................... 17
4.1. Objetivo general. ....................................................................................... 17
4.2. Objetivos específicos. ............................................................................... 17
5. MARCO TEÓRICO .......................................................................................... 18
5.1. Proceso productivo de la miel ................................................................... 18
5.1.2. Conducta de la Apis mellifera ................................................................ 18
5.1.3. Composición de la miel de abejas ......................................................... 20
5.1.4. Cosecha de la miel ................................................................................ 21
5.1.5. Mercado de la miel a nivel nacional e internacional .............................. 22
5.2. Contacto de las abejas con los plaguicidas .............................................. 24
5.3. Caracterización de la zona ....................................................................... 26
5.4. Bibliometría ................................................. ¡Error! Marcador no definido.
5.5. Técnicas de preparación y extracción de plaguicidas en miel de abejas .. 30
5.5.1. Extracción líquido-líquido (LLE) ............................................................. 30
5.5.2. Extracción en fase sólida. (SPE) ........................................................... 31
5.5.3. Micro extracción en fase sólida (MSPE) ................................................ 33
5.5.4. Extracción por fluidos supercríticos (SFE) ............................................. 33
5.5.5. Modo de extracción en fase sólida dispersiva (QuEChERS). ................ 33
7
5.6. Métodos analíticos utilizados para la determinación de plaguicidas en miel
de abejas ............................................................................................................ 34
5.6.1. Cromatografía líquida (LC) .................................................................... 34
5.6.2. Cromatografía de gases (GC) ............................................................... 35
5.6.2.1. Detector de ionización de llama (FID) ................................................ 36
5.6.2.2. Detector de captura de electrones (ECD) .......................................... 37
5.6.2.3. Espectrometría de masas .................................................................. 38
5.7. Toxicidad de los plaguicidas ..................................................................... 40
6. METODOLOGÍA .............................................................................................. 42
6.1. Toma de muestras .................................................................................... 42
6.2. Estándares y reactivos.............................................................................. 43
6.3. Preparación de muestra............................................................................ 44
6.4. Extracción en fase sólida (Clean up) ........................................................ 46
6.5. Análisis cromatográfico ............................................................................. 47
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 50
7.1. Análisis cualitativo .................................................................................... 50
7.2. Porcentaje de Recuperación ..................................................................... 52
7.3. Análisis cuantitativo .................................................................................. 53
7.4. Curva de calibración ................................................................................. 55
7.5. Recolección de muestra y caracterización de la zona .............................. 58
7.6. Análisis de muestras ................................................................................. 63
8. CONCLUSIONES ............................................................................................ 67
9. RECOMENDACIONES ................................................................................... 68
10. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................ 69
8
ÍNDICE DE TABLAS
Pag.
Tabla 1. Principales componentes de la miel de abejas ........................................ 20
Tabla 2. Exportaciones de miel durante los últimos años, cifras en toneladas de miel
............................................................................................................................... 22
Tabla 3. Importaciones de miel durante los últimos años, cifras en toneladas de miel.
............................................................................................................................... 23
Tabla 4. Conteo de apicultores, colmenas y apiarios en Colombia........................ 23
Tabla 5. Categoría toxicológica de los plaguicidas ................................................ 40
Tabla 6. Características de los plaguicidas presentes en el patrón Restek Catalogo
# 31867. ................................................................................................................. 41
Tabla 7. Apiarios incluidos en el trabajo ................................................................ 43
Tabla 8. Plaguicidas identificados, tiempos de retención e iones moleculares
principales .............................................................................................................. 50
Tabla 9. Tiempos de retención (CG-µECD) .......................................................... 54
Tabla 10. Áreas de los plaguicidas a las concentraciones de la recta de calibración
............................................................................................................................... 55
Tabla 11. Resultados de sensibilidad, R2, desviación estándar, desviación estándar
relativa, límite de detección y de cuantificación. .................................................... 57
Tabla 12. Puntos de georeferenciación de las muestras recolectadas .................. 59
Tabla 13. Información de los apiarios .................................................................... 60
Tabla 14. Concentraciones obtenidas de los plaguicidas. ..................................... 64
9
ÍNDICE DE FIGURAS
Pag.
Figura 1. Abeja en labor de pecoreo. .................................................................... 19
Figura 2. Abejas nodrizas alimentando las larvas. ................................................ 19
Figura 3. Principales vías de contaminación de la miel de abejas para consumo
humano. ................................................................................................................. 26
Figura 4. Mapa de Santuario y su ubicación en el país y el departamento. .......... 27
Figura 5. Zona cultivada en café del municipio de Santuario ................................ 27
Figura 6. Número de publicaciones por año sobre plaguicidas en miel ................ 28
Figura 7. Número de publicaciones por país sobre plaguicidas en miel ............... 29
Figura 8. Extracción líquido-líquido ....................................................................... 31
Figura 9. Extracción en fase sólida. ...................................................................... 32
Figura 10. Diagrama general de un cromatógrafo de gases ................................. 35
Figura 11. Diagrama general del detector de captura de electrones. .................... 37
Figura 12. Componentes básicos de un espectrómetro de masas. ...................... 38
Figura 13. Colmena y marco de apiario visitado ................................................... 42
Figura 14. Fotografías del proceso del método. .................................................... 44
Figura 15. Metodología de extracción utilizada. .................................................... 46
Figura 16. Diagrama del (Clean-up) con C18. ........................................................ 47
Figura 17. Cromatograma. Detector de masas, patrón Restek catálogo No 31867.
............................................................................................................................... 50
Figura 18. Espectro de masas obtenido del clorpirifós e identificación de los iones
más abundantes. ................................................................................................... 51
Figura 19. Cromatograma (GC-MS) muestra contaminada a 1ppm. ..................... 52
Figura 20. Cromatograma. Detector de microcaptura de electrones patrón Restek
catalogo No 31867. ................................................................................................ 54
Figura 21. Recta de calibración para el malatión. ................................................. 55
Figura 22. Ubicación de los apiarios sobre el mapa de Santuario ........................ 59
Figura 23. Diagrama de barras de los tipos de cultivos cercanos a los apiarios ... 60
10
Figura 24. Gráfico circular que muestra el porcentaje de apiarios con y sin cultivos
cercanos. ............................................................................................................... 62
11
1. INTRODUCCIÓN
La miel es un fluido dulce y viscoso producido por las abejas a partir del néctar de
las flores o de secreciones de partes vivas de plantas, las abejas lo recogen,
transforman y combinan con la enzima invertasa que contiene su saliva, lo
almacenan en los panales donde madura y posteriormente los apicultores la
recolectan para su comercialización (White, 1962).
Santuario es un municipio de Risaralda que centra su economía en cultivos como
café y caña (CARDER, 2015) En estos se manejan plaguicidas organofosforados,
causando que las abejas se puedan contaminar fácilmente con estos debido a que
visitan múltiples cultivos diariamente, llevándolos a la miel que producen.
Actualmente, la sociedad necesita que los alimentos que se consumen no causen
daño a su salud, ya que existen sustancias que en forma accidental pueden
contaminarlos, tales como, plaguicidas, fertilizantes agrícolas, conservantes, etc.
(Niell et al., 2012).
Debido a esto, las nuevas condiciones del mercado requieren la adopción de
sistemas de producción con estrictos controles de calidad (Ramírez Vásquez, 2012).
Estos procedimientos deben considerar las actividades que se realizan en la
obtención de la materia prima, hasta la venta del producto. Su correcta aplicación
no depende solamente de la implementación de programas gubernamentales, sino
de la participación comprometida de productores y comercializadores.
La miel, cuenta con un amplio reconocimiento como alimento puro y natural, el cual
no debería perderse. Se hace necesario hacer un muestreo de la miel producida en
los apiarios de Santuario para su posterior estudio en busca de contaminantes como
plaguicidas que puedan afectar la salud humana. Para la separación, detección y
cuantificación de plaguicidas en miel de abejas se han utilizado técnicas
cromatográficas modernas, para este estudio se implementó una metodología para
12
el análisis por cromatografía de gases propuesto por Rodríguez López, Ahumada,
Díaz y Guerrero (2014).
Se visitaron nueve apiarios y se analizaron las muestras de miel. El método utilizado
consistió en una extracción líquido-líquido con acetato de etilo, después se realizó
una extracción en fase sólida con cartuchos C18 y fase líquida de acetato de etilo:
hexano como eluyente, se determinó la presencia de 5 plaguicidas de los cuales 4
son cuantificables en las muestras de miel, encontrando principalmente incidencia
de plaguicidas como terbufos (89% de las muestras) y detectando altas
concentraciones de este (5,64 mg/Kg en la muestra A4). Se obtuvieron porcentajes
de recuperación entre 24,56 y 67,83 %, límites de cuantificación LQ en el rango de
0,042 mg/Kg para clorpirifós y 0,393 mg/Kg para terbufos y límites de detección LD
en un rango de 0,015 mg/Kg en clorpirifós hasta 0,14 mg/Kg en Terbufos, las 9
muestras excedieron el límite máximo de residuos establecido para plaguicidas
como el forato, terbufos, diazinón y malatión en la regulación (EC) No 396/2005 del
Parlamento Europeo en la cual se basa el Codex Alimentarius (CODEX STAN 12-
1981). De acuerdo con los resultados de las encuestas, es probable que la
contaminación de las mieles producidas en los apiarios bajo estudio, sea causada
por las prácticas agrícolas desarrolladas alrededor de las colmenas instaladas.
13
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La apicultura es la técnica de criar abejas para aprovechar sus productos, como la
miel, la cera o la jalea real. Esta y la agricultura son actividades complementarias,
ya que los servicios de polinización de las abejas ayudan al mantenimiento de las
plantas y simbolizan billones de dólares anualmente para la agricultura a nivel
mundial (Chauzat et al., 2006).
El mercado mundial de la miel de abejas ha presentado un crecimiento constante
desde inicios de la década de los noventa debido a que las personas empiezan a
buscar endulzantes naturales que sean saludables. De acuerdo a la FAO, China,
Estados Unidos, Argentina, Turquía y Ucrania son los principales países
productores y consumidores de miel de abejas en el mundo. Colombia, por su parte,
ocupa el puesto 42 de producción. En el 2004 se reportaron 2.550 toneladas de miel
producida internamente, mientras que China y Estados Unidos reportaron 304.990
toneladas y 82.000 toneladas, respectivamente (Rodas Arias, 2009). En promedio
Colombia exporta por año 30 toneladas de miel de abejas, principalmente a
Venezuela (58%), Alemania (21%), Ecuador (14%) y Estados Unidos (5%) (Rodas
Arias, 2009).
En el departamento de Risaralda se origina el 14% de la miel producida a nivel
nacional, debido a que la agricultura es una actividad de producción para beneficio
humano susceptible al ataque de plagas, el uso de plaguicidas para contrarrestar la
acción de las plagas, indirectamente las abejas entran en contacto con estos
contaminantes, llegando hasta la miel. Existe evidencia de la disminución de la
población de abejas a causa del contacto del plaguicida con estas que puede alterar
su sistema nervioso central modificando su comportamiento y produciendo el
14
síndrome de colapso de colonia y muerte de estas y la desaparición de algunas
especies (Riedl et al. , 2006).
La miel que se puede adquirir en Risaralda en su mayoría no posee los estudios
suficientes para que el consumidor conozca las condiciones de inocuidad, aspecto
muy importante ya que su desconocimiento podría incidir en la salud de las
personas. Por esto, se debe corroborar el cumplimiento de la norma para miel
Codex Alimentarius (CODEX STAN 12-1981), donde se reglamenta las
concentraciones mínimas para la contaminación por plaguicidas y límites máximos
permitidos en este alimento. La contaminación del medio ambiente y los alimentos
por plaguicidas ha recibido especial atención durante la última década debido a la
toxicidad de estos compuestos para los animales y el ser humano (Cárdenas, Silva,
Morales, & Ortiz, 2005).
En el proyecto se estudió la presencia de plaguicidas organofosforados en la miel
producida de diferentes apiarios del municipio de Santuario Risaralda para
contribuir al conocimiento de la interacción entre apicultura y agricultura, y aportar
a los apicultores del municipio de Santuario un mayor conocimiento sobre la calidad
de la miel comercializada y fortalecer así el vínculo entre productor y universidad,
para la solución de problemáticas locales conociendo la calidad de los productos
comercializados a la luz de la legislación vigente.
15
3. JUSTIFICACIÓN
La agricultura hace un uso cada vez mayor de plaguicidas en el control de insectos,
hongos, ácaros y malas hierbas para así garantizar altos rendimientos, por otro lado
también se genera la necesidad de monitorear la presencia de dichos compuestos
para generar información que permita mejorar cada vez el conocimiento de estas
sustancias y su presencia en el ambiente. Los productos de la colmena como cera
y miel son desde el punto de vista ambiental reservorios de información muy valiosa
sobre la calidad del ambiente en el que se encuentra la colmena, tanto es así, que
las abejas (Apis mellifera) y la colmena se utilizan en Europa como bioindicador de
calidad ambiental de una región (Niell et al., 2012).
El apiario “El Vidente”, el apiario “Hermanos López”, apiario “T&C Gourmet” y otros
apiarios sin registro ubicados en el municipio de Santuario Risaralda el cual dedica
aproximadamente el 30% de su territorio al cultivo del café (CARDER, 2013),
además de otros cultivos como plátano y tomate, estos apiarios se encuentran
expuestos a los plaguicidas utilizados en estos cultivos, siendo los organofosforados
los más usados.
La presencia de residuos de sustancias utilizadas en el agro como plaguicidas en
los alimentos, en cantidades que superen determinados límites puede afectar a la
salud de los consumidores y por lo tanto la Comisión del Codex Alimentarius del
programa conjunto de la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación
y la Agricultura en compañía con la Organización Mundial de la Salud (FAO/OMS)
establece las normas que los regulan, mediante la comparación de los resultados
con esta normatividad se puede garantizar la calidad del producto.
Para la determinación de plaguicidas en miel existen varias técnicas funcionales,
que permiten la extracción y detección de los plaguicidas organofosforados, siendo
la extracción líquido-líquido, acompañada de una limpieza con cartuchos de C18 una
técnica de extracción ampliamente usada, y la cromatografía de gases con detector
16
de microcaptura electrónica la técnica analítica que ofrece límites de detección
relativamente bajos, lo que permite cubrir los rangos de concentración estipulados
en la normatividad internacional.
Este estudio pretende identificar el grado de contaminación por los plaguicidas
forato, terbufos, diazinón, malatión y clorpirifós en la miel proveniente del municipio
de Santuario siendo esta importante no solo como un indicador del estado del
ambiente (Niell et al., 2012), sino también como un producto de consumo humano,
para contribuir al conocimiento de la interacción entre apicultura y agricultura, y dar
a los apicultores del municipio una visión sobre la calidad de su miel, a la luz de los
organismos de control tales como el Instituto Nacional de Vigilancia de
Medicamentos y Alimentos (INVIMA).
17
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general.
Evaluar la presencia y concentración de plaguicidas organofosforados en la
miel de abejas proveniente del municipio de Santuario Risaralda mediante
cromatografía de gases con detector de micro captura de electrones y
cromatografía de gases acoplada a espectrómetro de masas.
4.2. Objetivos específicos.
Adaptar una técnica de extracción líquido-líquido con limpieza (clean up)
mediante cartuchos de C18 para el análisis de plaguicidas organofosforados
en miel.
Adaptar la técnica de cromatografía de cromatografía de gases acoplada a
espectrómetro de masas para la cualificación y cromatografía gases con
detector de microcaptura de electrones para la cuantificación de plaguicidas
organofosforados en miel de abejas.
Verificar la calidad de la miel producida en apiarios de Santuario Risaralda,
mediante la comparación de los datos obtenidos, con los límites
internacionales para plaguicidas organofosforados en miel de abejas.
18
5. MARCO TEÓRICO
5.1. Proceso productivo de la miel
5.1.1. Biología de la Apis mellifera
Una colonia de abejas está constituida generalmente de una reina, entre 15.000 y
60.000 obreras y del 1% a 2% de la colonia son machos. Los huevos fecundados
dan origen a las obreras, mientras que los no fecundados dan origen a machos. El
sistema nervioso de las abejas melíferas es de estructura simple, lo que explica sus
acciones, así, cada mañana sale un grupo de obreras a pecorear las mismas flores
de la cercanía. Siendo esta una actividad rutinaria, la reacción automática de las
señales del sistema nervioso y no un razonamiento (Philippe, 2008).
5.1.2. Conducta de la Apis mellifera
El pecoreo de las abejas consiste en la recolección de néctar, polen, propóleos y
agua fuera de la colmena, las abejas encargadas de esta labor tienen más de 20
días de edad, por lo general las pecoreadoras se encargan de la recolección de un
solo tipo de planta si el botín es abundante ejemplo de esto los monocultivos; en
este caso se concentran en recorrer de 500 a 600 metros alrededor de la colmena,
también se conoce que las abejas pueden recorrer más de 6 kilómetros para
pecorear flores más atrayentes. La abeja necesita menos tiempo para realizar un
cargamento completo de polen con respecto al néctar. En una media de 10 minutos
para el polen y 35 minutos para el néctar. La abeja obrera al pecorear consume un
tercio de la energía que recolecta, lo que explica la baja producción de miel cuando
los cultivos están alejados de la colmena. En la imagen 1 se observa una abeja
19
obrera recolectora de polen donde este se adhiere de los vellos del cuerpo de la
abeja (Philippe, 2008).
Figura 1. Abeja en labor de pecoreo. Fuente: Autor.
Las obreras regresan al nido con la carga de néctar y lo transmiten boca a boca a
diferentes obreras dentro de la colmena y regresan a pecorear, las obreras que
recibieron el néctar lo regurgitan en unos 20 minutos y lo depositan en pequeñas
gotas en celdas donde dejan que se evapore el agua. En una colmena los alimentos
se transmiten de obrera a reina, de obrera a zánganos jóvenes, obreras a otras
obreras y de zánganos a obreras, esta alimentación reciproca se da durante toda la
vida de las abejas logrando prosperar juntas en la colmena. En la Figura 2 se puede
observar una abeja obrera joven (nodriza) alimentando las larvas (Philippe, 2008).
Figura 2. Abejas nodrizas alimentando las larvas (Salamanca Grosso, Osorio Tangarife, & Reyes Méndez, 2013).
20
5.1.3. Composición de la miel de abejas
La composición de una muestra de miel va a depender de dos factores principales;
de la composición del néctar o néctares y o de factores externos. La primera
depende de las especies de plantas que utilizan las abejas obreras para recolectar
el néctar, y la segunda, los factores externos pueden ser: tipo de suelo, clima,
manejo apícola y manejo de la miel una vez cosechada por el apicultor. La tabla 1
muestra la composición aproximada de un conglomerado de 490 muestras de miel
de abejas de Estados Unidos de América (EE.UU) (White, 1962):
Tabla 1. Principales componentes de la miel de abejas
Componente Promedio Desviación estándar Rango
Humedad 17.2 0.5 13.4-22.9
Levulosa 38.2 2.1 27.2-44.3
Dextrosa 31.3 3.0 22.0-40.7
Sacarosa 1.3 0.9 0.2-7.6
Maltosa 7.3 2.1 2.7-16.0
Azúcares mayores 1.5 1.0 0.1-8.5
Ácido libre (Glucónico) 0.43 0.16 0.13-0.92
Lactona (Gluconolactona) 0.14 0.07 0.0-0.37
Ácido total (Glucónico) 0.57 0.20 0.17-1-17
Cenizas 0.169 0.15 0.02-0.028
Nitrógeno 0.041 0.026 0.00-0.133
pH 3.91 ----- 3.42-6.10
Diastasa 20.80 9.8 2.1-61.2
21
5.1.4. Cosecha de la miel
La apicultura es una buena fuente de ingreso en Santuario Risaralda debido a que
la miel de abeja tiene buena demanda a nivel nacional y para obtener un producto
de buena calidad es preciso conocer las técnicas que se desarrollan antes, durante
y después de la cosecha de miel de abeja.
Cosecha de miel de abeja:
1. Un operador del apiario es encargado de esparcir humo en torno al cajón que
contiene los marcos donde las abejas construirán sus colmenas, y se
empiezan a introducir las abejas.
2. se deja que las abejas construyan su colmena.
3. se introducen los panales cosechados en el cajón y se sella hasta que las
abejas carguen los panales con miel.
4. inmediatamente es trasladado el cajón a un ambiente preparado para la
extracción.
Una vez dentro del ambiente preparado para la extracción de la miel, se procede al
desoperculado de los panales, que consiste en la acción de romper en forma
superficial las celdas de los panales que contienen la miel, dejando descubierta la
misma y lista para ser extraída. Una vez realizada la desoperculación, se coloca el
marco con el panal y la miel dentro de la maquina centrifuga, que permite extraer
íntegramente la miel del panal adherido al cuadro (Philippe, 2008).
Al girar la centrifuga mediante una palanca, la velocidad del giro aumenta
rápidamente. Esto posibilita que la mayor parte de la miel contenida en el panal se
desprenda y caiga dentro del recipiente, donde es colectada. A los pocos minutos,
Una vez se extrae totalmente toda la miel, los panales son cargados nuevamente
en el cajón vacío y devueltos inmediatamente a las colmenas (Philippe, 2008).
La miel es filtrada, para lo cual se recurre a filtros de diferentes medidas de mallas
superpuestas, especialmente fabricados para apicultura. Estos se colocan sobre la
22
boca de un contenedor, para filtrar la miel que caerá a través del orificio que la
centrifuga tiene en la parte baja de su tambor. Con esto se obtiene un producto libre
de cuerpos extraños, que permite su conservación por largos periodos de tiempo y
con una buena presentación para el consumidor. Una vez filtrada la miel es
depositada en contenedores y se deja madurar aproximadamente por 10 días.
Finalmente en la planta se hace el envasado del producto (Martinez Anzola, 2006).
5.1.5. Mercado de la miel a nivel nacional e internacional
El mercado de productos apícolas se encuentra dividido en países productores y
consumidores. Los principales países productores son Argentina y China, los cuales
exportan más de 50 mil toneladas de miel (tabla 2) de bajo precio la cual es vendida
alrededor de 1.3 dólares el kilogramo. Existe un mercado de mieles especiales como
son la miel de Manuka de Nueva Zelanda que tiene propiedades terapéuticas y la
miel orgánica proveniente de Cuba.
Entre los países consumidores encabezan la lista Estados Unidos que consume el
25% de todas las compras de miel en el mundo (ver tabla 3), Alemania que consume
el 80% de las 90 mil toneladas de miel que produce (Martinez Anzola, 2006).
Tabla 2. Exportaciones de miel durante los últimos años, cifras en toneladas de miel
(Statistics Division Food and Agriculture Organization, 2014).
País 2009 2010 2011 2012
China 71831 101138 99988 110158
Argentina 57969 57317 72356 75135
México 26984 26512 26888 32040
Brasil 25987 18629 22399 16707
Los datos para Colombia no se encuentran actualizados desde el 2007 de acuerdo
a la FAOSTAT.
23
Tabla 3. Importaciones de miel durante los últimos años, cifras en toneladas de miel
(Statistics Division Food and Agriculture Organization, 2014).
País 2009 2010 2011 2012
EEUU 95473 114128 130495 141017
Alemania 82575 89548 77361 84414
China 2420 2189 2468 3368
Argentina 41 296 119 139
Colombia 12 0 0 73
A nivel nacional se pueden observar en la tabla 4 como están distribuidos los
apicultores, colmenas y apiarios en los diferentes Departamentos del país.
Tabla 4. Conteo de apicultores, colmenas y apiarios en Colombia (Martinez Anzola,
2006).
Departamento Apicultores Colmenas Apiarios
Amazonas 110 silvestres 0
Antioquia 43 1227 0
Boyacá 42 2614 0
Caquetá 8 0 0
Cauca 129 1753 0
Cesar 6 250 0
Chocó 7 0 0
Cundinamarca 65 1001 92
Guaviare 1 10 1
Huila 205 2300 0
Magdalena 75 570 0
Meta 22 478 60
Norte de Santander 100 0 0
Risaralda 136 1767 0
Santander 75 1970 0
Sucre 75 2228 104
Tolima 86 3716 472
Valle del Cauca 150 3500 0
TOTAL 1295 23384 624
Respecto a la tabla 4. Se puede observar que los departamentos con mayor
actividad apícola son: Tolima, Valle del Cauca, Boyacá, Huila, Sucre, Santander y
Risaralda.
24
La cadena apícola en Colombia presenta bajos niveles de producción y, como
consecuencia, bajo nivel de inserción al mercado mundial. Una de las razones es la
poca credibilidad en el negocio, la otra es el bajo conocimiento del proceso. Para
dar solución a esto, por medio del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural junto
con FENAPICOL se creó la Secretaría Técnica de la Cadena Apícola, con la cual
se quiere eliminar la tendencia tradicional de producción que no cumple con los
requisitos sanitarios básicos para la manipulación y comercio del producto,
mediante el adelanto de programas de investigación para el manejo de abejas,
asistencia técnica, enseñanza a apicultores campesinos de la implementación de
buenas prácticas de manufactura para la elaboración de productos libres de
contaminación (Ramírez Vásquez, 2012)
5.2. Contacto de las abejas con los plaguicidas
La apicultura y la agricultura son consideradas prácticas agropecuarias
complementarias, pues existe un beneficio mutuo. La agricultura moderna depende
cada vez más del uso de agroquímico para el control de insectos, hongos, ácaros y
malas hierbas para así garantizar altos rendimientos. Las abejas visitan estos
cultivos frecuentemente y se exponen a estos químicos (Vanengelsdorp & Meixner,
2010).
En el mundo se aplican alrededor de 2.5 millones de toneladas de plaguicidas al
año (van der Werf, 1996) sobre los cultivos agrícolas muchos de estos pueden ser
perjudiciales para las abejas y también para los demás polinizadores (Potts et al.,
2010). No solo las abejas pueden entrar en contacto con plaguicidas fuera de la
colmena, como es el caso de los acaricidas aplicados para tratar la enfermedad
Varroasis, suelen ser perjudiciales para las abejas ya que afectan el sistema
nervioso y reproductivo de estos insectos (Haarmann, Spivak, Weaver, Weaver,
& Glenn, 2002).
25
Las principales condiciones en las que las abejas se exponen a los plaguicidas son
(Jivan, 2013):
La exposición a través de la ingestión de alimentos contaminados que se
traen a la colmena, estos son utilizados por toda la colonia por lo que se
pueden ver afectadas todas las castas: obreras, zánganos y reinas (Villa,
Vighi, Finizio, & Serini, 2000).
La exposición a través del contacto: puede cruzar tegumento de la abeja en
vuelo durante la aplicación de tratamientos químicos, entran en contacto con
los residuos en las plantas tratadas, por posarse en superficies contaminadas
o por consumir aguas contaminadas(Jivan, 2013).
Contaminación en el tiempo con las dosis sub-letales estas pueden causar
efectos crónicos letales (Desneux, Decourtye, & Delpuech, 2007).
Las regulaciones a plaguicidas se han visto enfocadas en el envenenamiento
directo de las abejas, sin embargo, debido a la gran variedad de plaguicidas que
aparecen en el presente la toxicidad aguda no es la única amenaza, los efectos sub-
letales como parálisis, desorientación o cambios de comportamiento cada vez serán
de más interés. (Desneux et al., 2007; Vanengelsdorp & Meixner, 2010). Además,
muchos de los plaguicidas son aplicados de forma cercana, como normalmente
ocurre. Lo más preocupante de esto son las complejas interacciones que puedan
presentar estos compuestos en el ambiente debido a la posible sinergia, es decir,
que un compuesto aumente su toxicidad por la presencia de otro (Glavan, 2013).
26
Figura 3. Principales vías de contaminación de la miel de abejas para consumo
humano (Rodríguez López, 2011).
5.3. Caracterización de la zona
El municipio de Santuario (Risaralda) (Figura 4 y 5 ) está ubicado en la región
centro occidental del departamento en la vertiente oriental de la cordillera
Occidental entre los 900 y los 3950 m.s.n.m., el casco urbano se localiza sobre la
cuchilla La Esmeralda que se extiende en dirección SE, a una altura de 1575
m.s.n.m. El municipio tiene una superficie de 201 km2 aproximadamente y el
casco urbano está localizado a 65 Km de Pereira, limita con los municipios de
Apía y Pueblo Rico por el norte, con Viterbo (Caldas) y Apía por el oriente,
con Balboa y La Virginia al sur y con el departamento del Chocó al occidente
(CARDER, 2015). El municipio presenta una amplia diversidad de climas, cálido el
9.9 %, clima medio el 60.7 %, clima frio el 11.5 %, páramo 17.7 %, su precipitación
media anual es de 2.750 m.m.
27
Figura 4. Mapa de Santuario y su ubicación en el país y el departamento.
Fuente: Modificado de Alcaldía de Santuario, Risaralda. Oficina de planeación.
Mayo 2015.
La agricultura es la principal actividad económica del municipio de santuario, siendo
el principal cultivo el del café, este se extiende por aproximadamente el 30% (Figura
5) del territorio y brinda la mayor demanda de mano de obra; este cultivo es seguido
por las actividades ganaderas y cultivos de caña de azúcar (CARDER, 2015).
Figura 5. Zona cultivada en café del municipio de Santuario
Fuente: Alcaldía de Santuario, Risaralda. Oficina de planeación. Mayo 2015
28
5.4. Bibliometría.
Este instrumento permite hacer un análisis de la producción científica cuantificando
las investigaciones relacionadas con el proyecto investigativo presentado, por
medio de la base de datos de Scopus donde se procedió a introducir palabras
claves y su posterior búsqueda obteniendo los siguientes datos:
Idioma de búsqueda: inglés.
Fecha de búsqueda: 09/08/2015.
Año de publicación: 2005-2014.
Ecuación de búsqueda: ALL.
Palabras de búsqueda: pesticide honey.
Documentos encontrados: 4723.
Scopus
Año No. Documentos
2005 162
2006 199
2007 283
2008 319
2009 407
2010 478
2011 519
2012 731
2013 745
2014 880
Figura 6. Número de publicaciones por año sobre plaguicidas en miel
Fuente: Búsqueda en base de datos Scopus.
Con base a los datos obtenidos en la figura 6 se puede ver una tendencia creciente
de publicaciones relacionadas con los plaguicidas en miel, mostrando el interés
29
mundial respecto al tema lo que permite evidenciar que el trabajo está a la
vanguardia en la comunidad científica.
Idioma de búsqueda: inglés.
Fecha de búsqueda: 09/08/2015.
Año de publicación: 2005-2014.
Ecuación de búsqueda: ALL.
Palabras de búsqueda: pesticide honey.
Documentos encontrados: 4723.
País No. Documentos
United States 931
China 876
Spain 388
United Kingdom 314
France 261
Brazil 246
Germany 240
Canadá 214
Italy 211
India 188
Colombia 12
Figura 7. Número de publicaciones por país sobre plaguicidas en miel
Fuente: Búsqueda en base de datos Scopus.
En la figura 7 se puede observar que los países con mayor número de publicaciones
relacionadas con plaguicidas en miel son China y Estados Unidos esto
probablemente debido a la evidencia de la disminución de la población de abejas a
causa del contacto del plaguicida con las abejas provocando la muerte de estas y
la desaparición de algunas especies (Riedl et al., 2006). Además los países de la
Unión Europea son de los principales consumidores de miel y tienen reglamentos
30
estrictos que regulan la comercialización de este producto, en los cuales se
establecen límites máximos de residuos (LMR) para una gran cantidad de
contaminantes (Unión Europea (UE), 2005) y dan pie a la investigación y publicación
de artículos referentes a plaguicidas en miel.
5.5. Técnicas de preparación y extracción de plaguicidas en miel de
abejas
La muestra se debe preparar con el fin de aislar el analito de otros compuestos que
dificulten la detección, este proceso es de suma importancia para obtener una
detección inequívoca del compuesto de interés, un trato incorrecto de la muestra
puede ocasionar la invalidación de todo el ensayo, por esto la importancia de
seleccionar el tipo de extracción que sea más eficiente y práctico para culminar con
éxito el análisis (Y. Chen, Guo, Wang, & Qiu, 2008). A continuación algunos tipos
de extracción usados para el análisis de plaguicidas en miel:
5.5.1. Extracción líquido-líquido (LLE)
Se basa en la transferencia y distribución del compuesto de interés, logrando así la
separación de componentes en solución por su distribución entre dos fases
inmiscibles líquidas (Y. Chen et al., 2008) como se muestra en la figura 8. Para la
extracción líquido-líquido de plaguicidas en miel es recomendable antes de
comenzar la extracción solubilizar la matriz (miel) en agua para disminuir su
viscosidad y lograr así homogenizar el analito para su posterior extracción con el
solvente.
31
Los solventes orgánicos usados para la extracción del analito de la matriz pueden
ser: acetato de etilo, diclorometano, hexano, éter de petróleo o mezclas de benceno-
isopropanol, hexano-acetona, hexano-ácido acético glacial, n-hexano-2-propanol y
agua-acetona-ácido fórmico. El método de extracción líquido-líquido aplicado
correctamente ofrece bajos límites de detección y cuantificación, una de las
desventajas radica en que se emplean grandes cantidades de solventes (Rodríguez
López et al., 2014).
Figura 8. Extracción líquido-líquido
5.5.2. Extracción en fase sólida. (SPE)
Es usada para aislar los analitos de una matriz sólida o semisólida por medio de un
cartucho o columna de empaquetamiento adsorbente que sea capaz de retener el
compuesto de interés, y posteriormente se eluye el analito retenido en un solvente
orgánico (Y. Chen et al., 2008) como se observa en la figura 9. Para disminuir la
viscosidad de la miel y permitir un paso de esta por la fase sólida es necesario
disolver la miel en solventes como agua o metanol (Kujawski & Namieśnik, 2008) o
su mezcla agua-metanol (Albero, Sánchez-Brunete, & Tadeo, 2004).
32
Figura 9. Extracción en fase sólida.
Las fases sólidas reportadas para alimentos son: florisil usados para plaguicidas
como los organoclorados, organofosforados, piretroides y carbamatos (Koci, Yigit,
Das, Gurel, & Yarali, 2008), entre otros. columnas de C18 usadas para análisis de
residuos de plaguicidas como los organoclorados, organofosforados,
organonitrogenados, piretroides y carbamatos, estos cartuchos dan buenos
porcentajes de recuperación para los plaguicidas organofosforados diazinon y
clorpirifos obteniendo porcentajes entre 78-114% (Bushway & Fan, 1998), otros
análisis de OPs en miel de abejas también con C18 reportaron un porcentaje de
recuperación mayor al 86%(Albero et al., 2004). Una vez retenido el analito este es
eluido en solventes como: acetato de etilo, n-hexano, entre otros (Albero et al.,
2004).
Esta técnica presenta desventajas como la limitación en la cantidad de muestra que
pueda pasar por el cartucho, pérdida por retención irreversible de los analitos en
algunas fases polares del sólido adsorbente y elución de residuos provenientes del
polímero del cartucho (Rial-Otero, Gaspar, Moura, & Capelo, 2007).
33
5.5.3. Micro extracción en fase sólida (MSPE)
Consiste en la absorción del analito de interés, en este caso el plaguicida
organofosforado sobre una fibra que está recubierta con una fase estacionaria,
posteriormente el analito viaja al inyector del cromatógrafo de gases. La extracción
se puede hacer sumergiendo la fibra en la muestra líquida, o en espacio de cabeza
del contenedor de la muestra. La principal ventaja es la eliminación de disolventes
(Simplıcio & Vilas Boas, 1999) y su inconveniente es desconocer los efectos que
pueda tener la matriz sobre el proceso (W. Chen, Poon, & Lam, 1998).
5.5.4. Extracción por fluidos supercríticos (SFE)
Este método tiene como ventaja una extracción del analito usando bajas cantidades
del extractante al aumentar la difusividad de este, además de ser un método muy
selectivo para plaguicidas organoclorados y organofosforados, a través de un
montaje a alta presión como se ve en la figura 3. Se ha reportado el uso de
compuestos extractores como el CO2 supercrítico para plaguicidas organoclorados,
organofosforados, órganonitrogenados y piretroides en miel a una presión de 400
bar, una temperatura de 90ºC y acetonitrilo como modificador (Rissato, Galhiane,
Knoll, & Apon, 2004).
5.5.5. Modo de extracción en fase sólida dispersiva (QuEChERS).
Como su abreviación lo indica es un proceso (Quick, Easy, Cheap, Effective,
Rugged, y Safe) (rápido, económico, efectivo, robusto y seguro). Que consta de dos
etapas: extracción y (clean up). Es utilizado ampliamente para la extracción de
residuos de plaguicidas en alimentos, algunas de sus ventajas son la buena
34
recuperación tolerando una alta gama de polaridades y bajas cantidades de
solventes orgánicos haciendo de este un método de extracción amigable con el
medio ambiente (Nguyen, Yu, Lee, & Lee, 2008), se ha utilizado en estudios de
contaminación de plaguicidas como fipronil, imidacloprid, thiamethoxam,
dimethoate, carbendazin, tebuconazole, amitraz, τ-fluvalinate en miel de abejas
obteniendo porcentajes de recuperación mayores al 70% (Tomasini et al., 2012),
también en análisis multiresiduos (Nguyen et al., 2008).
5.6. Métodos analíticos utilizados para la determinación de plaguicidas
en miel de abejas
Las técnicas cromatográficas son las más utilizadas para el análisis de plaguicidas
organofosforados. La cromatografía es una técnica para la separación de mezclas
de compuestos con el propósito de obtener información sobre su composición
molecular y su concentración. En esta se ponen en contacto dos fases inmiscibles
(una estacionaria y otra móvil), la muestra es incorporada en la fase móvil y es
transportada a través de la fase estacionaria, en este traslado cada uno de sus
componentes experimenta interacciones repetidas, aquellos componentes que son
retenidos con mayor fuerza por la fase estacionaria tendrán un flujo más lento, como
resultado de esto los componentes de la mezcla se separa discriminadamente lo
cual permite su posterior análisis cualitativo y cuantitativo.
5.6.1. Cromatografía líquida (LC)
La LC permite una rápida y eficiente determinación, esta separa los componentes
de la muestra con base en su polaridad, además admite el estudio de plaguicidas
termolábiles. La LC posee la ventaja de poder determinar componentes como los
plaguicidas independientemente de su volatilidad o termoestabilidad (Juan A, Picó
35
Y, 2003). Los detectores más utilizados en la cromatografía líquida son: el UV-visible
el cual es universal aunque poco selectivo ya que muchas moléculas absorben a la
misma longitud de onda (Laganà, D’Ascenzo, Fago, & Marino, 1997). El detector de
fluorescencia que contrario al anterior es selectivo para su utilización en plaguicidas
organofosforados deben ser sometidos a un proceso de derivatización debido a que
no son compuesto fluorescentes (Hogendoorn, Ossendrijver, Dijkman, & Baumann,
1999). Para el análisis de plaguicidas organofosforados en miel de abejas, la
cromatografía líquida ha sido aplicada principalmente acoplada al espectrómetro de
masas, diversos estudios reportan su uso obteniendo límites de detección de 10
ppb (Al Naggar et al., 2015; C. Blasco, Font, & Picó, 2007; Fernández, Picó, &
Mañes, 2002; Sharma, Nagpal, Pakade, & Katnoria, 2010).
5.6.2. Cromatografía de gases (GC)
La figura 10 muestra el diagrama de un cromatógrafo de gases, en esta técnica la
fase móvil es un gas inerte el cual fluye a través de una columna que contiene la
fase estacionaria, la cual puede ser un sólido poroso (Gas- Sólido) o una película
líquida delgada (Gas-Líquido).
Figura 10. Diagrama general de un cromatógrafo de gases
36
La cromatografía gas – líquido ha tenido una gran aplicación en el análisis de gran
variedad de muestras tales como petroquímicos, aceites, productos alimenticios,
farmacéuticos y naturales, entre otros. Para el análisis de plaguicidas
organofosforados en muestras de alimentos la cromatografía de gases se ha
convertido en la técnica más usada debido a la volatilidad y termoestabilidad de
estos (Juan A. et al., 2003). En estos análisis se han utilizado detectores como:
5.6.2.1. Detector de ionización de llama (FID)
El detector de ionización de llama se suele utilizar una llama de hidrógeno, en la
cual se oxidan los diferentes componentes de la muestra, lo que produce moléculas
cargadas eléctricamente (iones), los iones generados son proporcionales a la
concentración de las especies orgánicas en el flujo estos iones son conducidos con
electrodo tubular donde son detectados por un pico amperímetro de alta
impedancia.
El detector FID se encuentra entre los detectores más utilizados para la
cromatografía de gases, su uso se ha extendido a varios tipos de industrias debido
a su poca selectividad lo cual permite hacer estudio de un gran número de
compuestos diferentes. Ha sido utilizado para el análisis de diferentes
contaminantes ambientales (Klee, 2012), entre ellos, los plaguicidas donde se ha
explorado su funcionamiento para diferentes matrices como frutas y vegetales
(Sharma et al., 2010), miel de abejas (Bernal, Jiménez, del Nozal, Higes, & Llorente,
2000; Fernandez Muiño et al., 1997), agua y tierra (Naeeni, Yamini, & Rezaee,
2011), entre otros.
37
5.6.2.2. Detector de captura de electrones (ECD)
El ECD (Figura 11) está basado en la emisión de partículas β (electrones) producida
por los átomos de 63Ni y absorbidas sobre una placa de platino o titanio, las
moléculas provenientes de la columna atraviesan el detector capturando algunos de
estos electrones, lo que produce una reducción en la corriente medida que es
proporcional a la cantidad de analito
Figura 11. Diagrama general del detector de captura de electrones.
Este es un detector altamente selectivo, y bastante sensible a las moléculas que
posee grupos electronegativos. El ECD permite límites de detección del orden de
ng/kg (Klee, 2012). Es por esto, que ha encontrado una amplia aplicación en el
análisis de plaguicidas en diferentes tipos de matrices (Sharma et al., 2010), en el
análisis de miel de abejas también ha sido utilizado para la detección de varios tipos
de plaguicidas principalmente organoclorados (Liu & Min, 2012) y organofosforados
(Jiménez, Bernal, del Nozal, Toribio, & Martın, 1998) alcanzando límites detección
del orden de partes por billón (ppb).
38
5.6.2.3. Espectrometría de masas
La espectrometría de masas es una de las más poderosas herramientas en el
análisis químico, debido a que suministra gran variedad de información sobre la
estructura de la molécula, además de poder evidenciar la composición cualitativa y
cuantitativa de analitos en muestras complejas.
Figura 12. Componentes básicos de un espectrómetro de masas.
Un espectrómetro de masas necesita cumplir esencialmente tres funciones (Figura
12). Primero una fuente de iones somete las moléculas del analito a un proceso de
ionización, para este fin se han utilizado principalmente dos métodos:
Ionización por impacto electrónico: las moléculas del analito son impactadas por un
haz de electrones de alta energía. Como resultado de esta colisión pueden darse
varios casos, siendo el primero el más probable de todos.
1) Eliminación de un electrón:
𝐴𝐵𝐶 + 𝑒− ⟶ 𝐴𝐵𝐶+ + 2𝑒−
2) Eliminación de dos electrones:
𝐴𝐵𝐶 + 𝑒− ⟶ 𝐴𝐵𝐶2+ + 3𝑒−
Sistema de entrada
•Directo
•Columna capilar
Fuente de Iones
•Impacto electronico
•Ionizacion quimica
•Electrospray
Analizador de masas
•Sector magnetico
•Cuadrupolo
•Tiempo de vuelo (TOF)
•Trampa de iones
Detector
•Multiplicador de Electrones
•Copa de Faraday
Analizador y procesamiento
de datos
39
3) Captación de un electrón:
𝐴𝐵𝐶 + 𝑒− ⟶ 𝐴𝐵𝐶−
4) Disociación de la molécula:
𝐴𝐵𝐶 + 𝑒− ⟶ 𝐴𝐵+ + 𝐶− + 𝑒−
5) Formación del ion metaestable:
𝐴𝐵𝐶+ ⟶ 𝐴𝐵+ + 𝐶
Después de estar cargados los iones son conducidos por un campo
electromagnético hacia un analizador de masas, la función de este es la de separar
los iones según su relación masa/carga (m/z) los instrumentos más utilizados para
este propósito son los de sector magnético y los de cuadrupolo; los primeros usan
un electroimán para dispersar los iones en función de su relación m/z; los selectores
de cuadrupolo consta de cuatro barras cilíndricas que actúan como electrodos, los
iones son acelerados provocando que la mayor parte de ellos incidan en las barras
y sólo los de determinado valor de m/z llegan al detector (de Hoffmann, 2000).
El detector convierte el haz de iones en una señal eléctrica que puede procesar y
almacenar, el instrumento más utilizado con este fin es el multiplicador de
electrones, donde los iones inciden sobre un caso sustrayendo electrones, después
pasan por una serie de dinodos con potenciales cada vez más altos lo cual amplifica
la corriente electrones.
En el análisis de plaguicidas el espectrómetro de masas ha sido aplicado
ampliamente en diferentes tipos de matrices incluida la miel (Fernández et al., 2002;
Nguyen et al., 2008), tanto en la cromatografía de gases como en la cromatografía
líquida, donde encuentra una amplia aplicación en el análisis de múltiples tipos de
residuos debido a su baja selectividad, la cual permite analizar simultáneamente
diversos sustancias con límites de detección del orden de ppb (C. Blasco et al.,
2007; Nguyen et al., 2008; Rodríguez López et al., 2014; Walorczyk & Gnusowski,
2009).
40
5.7. Toxicidad de los plaguicidas
Para su clasificación se tiene en cuenta la dosis letal 50 (DL50), la cual se define
como la cantidad de una sustancia que al ser suministrada a animales de
experimentación por lo general ratones, mata al 50% de esa población de acuerdo
con la DL50 se pueden clasificar en diferentes categorías toxicológicas como se
aprecia en la Tabla 5 (Fernández A., Mancipe G., & Fernández A., 2010).
Tabla 5. Categoría toxicológica de los plaguicidas.
Color Etiqueta Equivalencia
clasificación OMS
DL50 oral en
mg/Kg Característica
Rojo IA <5 Sumamente
peligroso
Rojo IB 5-50 Muy peligroso
Amarillo II 50-500 Moderadamente
peligroso
Azul III 500-2000 Poco peligroso
Verde IV >2000 Normalmente no
ofrecen peligro
En la tabla 6 Se hace una clasificación de los plaguicidas analizados, con su
respectivo número de registro CAS, que es una identificación numérica única para
compuestos químicos, Fórmula y estructura química, su respectiva categoría
toxicológica y por último su respectiva dosis letal media DL50 de ingestión que nos
dan una idea de lo tóxico que puede ser cada plaguicida.
41
Tabla 6. Características de los plaguicidas analizados.
Nombre (IUPAC)
#CAS Formula y estructura Categoría toxicológica
DL50 ingestión mg/Kg ratas (ref.)
Clorpirifos (O, O-dietil O-3, 5, 6-tricloropiridin-2-il fosforotioato)
2921-88-2
C9H11Cl3NO3PS
II 280 (CropScience, 2015)
Diazinon (O,O-Dietil-O-(2-isopropil-6-metil- pirimidin-4-il) fosforotioato)
333-41-5
C12H21N2O3PS
III 1950 (Rady, 2009)
Forato
(O,O-Diethyl S-[(ethylsulfanyl)methyl] phosphorodithioate)
298-02-2
C7H12O2PS3
IA
1,1-3,7(EXTOXNET, 2015)
Malatión 2-[(dimetoxifosforotioil)sulfanil]butanodioato de dietilo
121-75-5
C10H19O6PS2
IV 2800(IRET, 2015)
Terbufos
(S-((tert-Butiltio) metil)- O,O-dietilfosforoditioato)
13071-79-9
C9H21O2PS3
IA 1,5-9,2(DLEP, 2015)
42
6. METODOLOGÍA
6.1. Toma de muestras
Figura 13. Colmena y marco de apiario visitado
Se tomaron nueve muestras (Tabla 7) de aproximadamente 10 gramos,
provenientes de apiarios ubicados en el municipio de Santuario, Risaralda. Las
muestras fueron recolectadas directamente de las colmenas, en el momento de
43
recolección de miel del apiario (Figura 13), estas fueron refrigeradas desde el
momento de recolección hasta su análisis a una temperatura inferior de los 14 ºC,
con el fin de minimizar la degradación de los analitos. Se tomó en cuenta a la hora
de recolección de la muestra: Los cultivos cercanos, si se frecuentaba el uso de
plaguicidas en estos y si se observan abejas visitando los cultivos.
Tabla 7. Apiarios incluidos en el trabajo
Nombre # de colmenas Vereda
Apiario Casero A1 1 La Bamba
Apiario Don Joaquin A2 6 Corosal
Apiario Hermanos López A3 24 La Palma de Cundina
Apiario de los Arroyave A4 30 Orofino
Apiario San Rafael A5 6 Buenos Aires
Apiario Hermanos Vargas A6 4 Barcinal
Apiario El Vidente, La Marina A7 14 La Marina
Apiario El Vidente, La Bretaña A8 52 La Bretaña
Apiario T&C Gourmet A9 30 San Gabriel
6.2. Estándares y reactivos
Se utilizó el estándar de plaguicidas organofosforados compuesto por una mezcla
de 9 plaguicidas, marca RESTEK, Canadian Drinking Water OP Pesticides Mix
Hexano/Acetona, catalogo No 31867 Lot No. A095110, en el Anexo 1 se
encuentra el certificado del estándar.
Los solventes grado HPLC utilizados fueron: metanol (Merck), etanol (Merck),
hexano (Mallinckrodt) y acetato de etilo (Mallinckrodt). La extracción en fase sólida
se realizó con columnas BAKERBOND™ SPE Octadecyl (C18) (J.T.Baker). Y los
filtros manejados fueron Millex-GV 0.22 µm, PVDF, 13 mm, (Merck).
44
6.3. Preparación de muestra
Para la extracción de plaguicidas en las muestras de miel de abejas se empleó una
metodología desarrollada previamente por Rodríguez et ál. (2014) para el
tratamiento de múltiples tipos de plaguicidas en miel de abejas como se muestra en
la figura 15. Primero, se pesó 1 g de muestra este se diluyó en 1.5 mililitros de
metanol y en 1 mL de una solución buffer de ácido cítrico/citrato (pH = 5.5) después
de esto la muestra fue agitada por 15 minutos. Después de esto se agregan un 10
mL de acetato de etilo, y se procedió a aplicar de nuevo la muestra para luego
centrifugarla durante cinco minutos a 4500 rpm. Todo el proceso se observa en la
figura 14.
Figura 14. Fotografías del proceso del método.
La metodología seguida implementa una segunda extracción con 1.5 mL de metanol
y 5 ml de acetato de etilo, seguidos por una nueva centrifugación en las condiciones
45
anteriores. Esto con el fin de mejorar la recuperación del método. Después se
reunieron en un vaso de precipitados los extractos para llevarlos a ser concentrados.
A diferencia del método original, los extractos no fueron concentrados mediante el
uso de rota evaporador, en lugar de este se utilizó un flujo de nitrógeno lento y
constante para no perder muestra y lograr así evaporar el solvente a temperatura
ambiente. Mediante este método las muestras fueron llevadas a un volumen de
aproximadamente 5 mL.
46
Figura 15. Metodología de extracción utilizada.
6.4. Extracción en fase sólida (Clean up)
Para la limpieza de las muestras se emplearon columnas desechables de octadecil
(C 18) de 500 mg, estas se montaron sobre un equipo de extracción en fase sólida
47
con vacío y se ajustó el conteo a 2 mL por minuto, las columnas fueron
acondicionadas con 3 ml de etanol y 3 ml de metanol. Después se procedió a
adicionar la muestra la cual fue eluída con 9ml de una solución acetato de etilo:
hexano (1:1.25) la cual también es utilizada en el método seguido (Rodríguez López
et al., 2014). El extracto se concentró hasta 1 ml y se llevó a un vial de
cromatografía, pasándolo antes por el filtro de 0.2 micras, el procedimiento se
muestra en la figura 16. Después de esto fue llevado a análisis cromatografico.
Figura 16. Diagrama del Clean-up con C18.
6.5. Análisis cromatográfico
El análisis cualitativo de las muestras se implementó un cromatógrafo de gases
acoplado a espectrómetro de masas GC-2010 marca SHIMADZU, ubicado en el
laboratorio de análisis instrumental de la Universidad del Quindío. El cromatógrafo
48
se encuentra equipado con un puerto inyección automática AOC-20 i/s y con un
espectrómetro de masas GCMS-QP2010 Ultra. Las condiciones del cromatógrafo y
del detector se dan a continuación:
Temperatura del inyector: 280 º C Volumen de inyección: 2 µL Gas de arrastre: Helio Modo de inyección: splitless Tiempo de muestreo: 0.5 min. Flujo de purga: 4.0mL/min Velocidad lineal: 39.5 cm/s Flujo total: 5.2 mL/min Presión: 80.8 KPa Flujo de columna: 1.2 mL/min Temperatura de la fuente: 300 ºC Temperatura de la interfase: 320 ºC Ganancia del detector: 1.05 kV Tiempo para el corte del solvente: 3 min
Para el espectrómetro de masas:
Tiempo de inicio: 3 min. Tiempo final: 39 min. Modo ACQ: Scan Velocidad del scan: 10000 m/z inicial: 40 m/z final: 500
El análisis cuantitativo fue realizado por medio de un equipo de cromatografía de
gases GC-2014 marca SHIMADZU ubicado en el Laboratorio de la Escuela de
Química de la Universidad Tecnológica de Pereira. Este cromatógrafo se encuentra
equipado con un puerto de inyección automático AOC-20i marca SHIMADZU
split/splitless, una columna capilar MTX-5 con longitud: 30m, diámetro interno:
0.25mm, espesor de película: 0.50µm. Las especificaciones del método se anexan
a continuación:
49
Modo de inyección: splitless Temperatura del inyector: 250.0°C Gas de arrastre: Helio Flujo de purga: 3.0mL/min Velocidad lineal: 19.1cm/s Flujo total: 4.8mL/min Presión: 69KPa Flujo de columna: 0.61mL/min Columna capilar MTX-5 serie 508529G1 (Longitud: 30m, Diámetro interno: 0.25mm, Espesor de película: 0.50µm) Detector: Captura electrónica con isotopo radioactivo Níquel 63, ECD 63Ni. Temperatura del detector: 330°C Velocidad de muestreo: 40ms Programación de temperatura del horno: 40°C (Durante 2 min.) hasta 330°C @ 10°C/min. (Durante 10 min.)
50
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1. Análisis cualitativo
Se realizó un scan del patrón con el fin de identificar los plaguicidas presentes en
este debido a que no se lograron obtener todos los picos de los plaguicidas
contenidos en el estándar. La figura 17 muestra el cromatograma obtenido:
Figura 17. Cromatograma. Detector de masas patrón Restek catalogo No 31867.
El cromatograma mostró una buena separación en los picos lo cual permitió la
identificación segura de los picos, los compuestos encontrados por el espectrometro
de masas, basandose en la comparacion con bases de datos, en la tabla 8 muestra
los plaguicidas del patrón identificados:
Tabla 8. Plaguicidas identificados, tiempos de retención e iones moleculares
principales.
#Pico tR (min) Nombre m/z
1 17.83 Forato 75
2 18.75 Terbufos 57 231
3 18.98 Diazinón 179 137 152
4 20.71 Malatión 125 173 93 127
5 20.95 clorpirifós 97 197 199 29
Los espectros de masas se encuentran en el ANEXO 2, la figura 18 muestra el
espectro de masas obtenido para el clorpirifós y el origen de los iones más
51
abundantes basándonos en la ionización molecular producida por el espectrómetro
de masas.
Figura 18. Espectro de masas obtenido del clorpirifós e identificación de los iones
más abundantes (Hong, Kim, & Paeng, 2000).
52
7.2. Porcentaje de Recuperación
Para el cálculo de los porcentajes de recuperación se realizó un análisis en el
cromatógrafo de gases acoplado a masas de una muestra fortificada a 1ppm, la
figura 19 muestra el resultado obtenido.
Figura 19. Cromatograma (GC-MS) de muestra contaminada a 1ppm.
Los porcentajes de recuperación se calcularon usando la siguiente ecuación:
%𝑅 =𝐴𝑅
𝐴𝑃∗ 100
Dónde:
AR es el área del analito medida en la muestra fortificada a 1ppm.
AP es el área del analito para el patrón diluido a 1ppm.
Tabla 9. Porcentajes de recuperación.
N° Compuesto Área patrón
1ppm Área muestra fortificada
Porcentaje de recuperación
1 Forato 668509 453474 67,83
2 Terbufos 869179 213457 24,56
3 Diazinón 883913 482707 54,61
4 Malatión 518985 232969 44,89
5 clorpirifós 937637 540896 57,69
53
El porcentaje de recuperación adecuado para un método de análisis de alimentos
establecido por la unión europea debe estar entre 70-120 %. Los porcentajes
obtenidos para estos plaguicidas no cumplen con este requerimiento, solo el forato
se acerca a este valor. Este hecho es atribuible a la columna de extracción en fase
sólida utilizada en este método, esto se afirma con base en los porcentajes
reportados en el método en el que se basó este estudio (Rodríguez López, 2011),
el cual reporta como ejemplo porcentajes de recuperación cercanos al 90% para el
clorpirifós, para la extracción mediante silica gel/florisil. Un estudio de plaguicidas
en miel realizado en España y Portugal donde se realizó SPE con C18 mostraron
porcentajes que oscilan entre el 40% y el 92% (Cristina Blasco et al., 2003). Cabe
mencionar que la miel presenta porcentajes de recuperación menores a los
obtenidos en otros tipos de matrices (Rodríguez López, 2011) y que el método
utilizado no está diseñado para la extracción de plaguicidas organofosforados, es
un método multiresiduo que abarca un gran espectro de plaguicidas.
7.3. Análisis cuantitativo
Los plaguicidas identificados con el detector de masas fueron posteriormente
analizados, con el fin de obtener los tiempos de retención para el cromatógrafo de
la Universidad Tecnológica De Pereira, el cual está equipado con µECD en donde
se realizaría el análisis cuantitativo, para esto nos basamos en el orden de salida
anteriormente obtenido en el cromatógrafo de gases masas.
54
Figura 20. Cromatograma. Detector de microcaptura de electrones patrón Restek
catalogo No 31867.
Tabla 10. Tiempos de Retención (CG-µECD).
N° de Pico
Compuesto tR
1 Forato 21.331
2 Terbufos 22.251
3 Diazinón 22.348
4 Malatión 24.190
5 clorpirifós 24.524
La figura 20 y la tabla 10 muestran que los compuestos presentan señales
cromatográficas en ambos detectores, aunque presentan tiempos de retención
diferentes, esto se debe a la diferencia de columnas para el análisis cualitativo y
para el cuantitativo. Sin embargo, la selectividad brindada por ambos equipos
cromatográficos proporciona una poderosa herramienta de identificación, donde se
puede tener confiabilidad de la identificación de los analitos forato, terbufos,
diazinón, malatión y clorpirifós con sus respectivos tiempos de retención.
55
7.4. Curva de calibración
Para realizar la curva de calibración se realizaron diluciones sucesivas del patrón a
1ppm, 0.5ppm, 0.1ppm, 0.05ppm, 0.01ppm, las áreas obtenidas se muestran en la
tabla 11, la figura 21 muestra la recta de calibración obtenida para el malatión. Las
demás curvas de calibración se encuentran en ANEXO 3, y los cromatogramas de
la curva en el ANEXO 4.
Tabla 11. Áreas de los plaguicidas a las concentraciones de la recta de calibración.
Nivel Concentración (ppm)
Área
Forato Terbufos Diazinón Malatión clorpirifós
1 0,01 2787 3076 5727 20856
2 0,05 14951 11831 20262 6862 139334
3 0,1 27584 20250 30920 14531 226713
4 0,5 82341 67650 86782 69880 664164
5 1 135126 107685 127725 133932 1044784
Figura 21. Recta de calibración para el malatión.
y = 133656x + 1168,1
R² = 0,9995
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
Are
a
Concentración
Malatión
56
Para cada curva de calibración se determinaron los criterios cuantitativos
necesarios, son términos numéricos que sirven como parámetros de calidad; estos
son necesarios a la hora de validar un método cromatográfico y dan luz sobre la
seguridad en los datos obtenidos. Los parámetros calculados para este fin son:
R2: coeficiente de correlación
SD: desviación estándar
RSD: desviación estándar relativa
Sensibilidad
LD: límite de detección
LC: límite de cuantificación
El coeficiente de correlación, la desviación estándar, la desviación estándar relativa
y la sensibilidad fueron calculados mediante el software de análisis cromatográfico
Shimadzu GC solutions 2.3.
Se calcularon los límites de detección y cuantificación mediante la extrapolación de
la recta de calibrado a concentración cero donde se obtuvo la pendiente de la curva
(b) a continuación se realizó una corrida por triplicado (n=3) del blanco de donde se
calculó el valor promedio de la respuesta del blanco (Ybl), y la desviación estándar
de la señal (Sbl). Después se utilizaron las siguientes ecuaciones para calcularlos
𝐿𝐷 =𝑌𝑏𝑙 + 3 ∗ 𝑆𝑏𝑙
𝑏∗
1
√𝑛
𝐿𝑄 =𝑌𝑏𝑙 + 10 ∗ 𝑆𝑏𝑙
𝑏∗
1
√𝑛
Los datos obtenidos se presentan en la tabla 12
57
Tabla 12. Resultados de Sensibilidad, R2, desviación estándar, desviación estándar
relativa, límite de detección y de cuantificación.
ID# Nombre Sensibilidad R2 SD (Área) RSD (%) LD (ppm) LQ (ppm)
1 Forato 130128 0,9859 75008 32,516 0,035 0,093
2 Terbufos 104394 0,9851 80033 40,432 0,140 0,393
3 Diazinón 119705 0,9700 180023 56,667 0,061 0,150
4 Malatión 133656 0,9994 4799 3,452 0,044 0,128
5 clorpirifós 999170 0,9792 709506 37,293 0,015 0,042
Evaluar la linealidad busca valorar algunos de los parámetros más relevantes para
la construcción de las curvas de calibración. En la literatura, se encuentran varios
métodos para la evaluación de estos parámetros, en el presente trabajo se utilizarán
los métodos utilizados en estudios previos de plaguicidas organofosforados
implementados en la universidad (Rubio Cárdenas & Vallejo Reyes, 2014).
La sensibilidad del método fue medida en base a la pendiente de la recta obtenida
a partir de la curva de calibración.
Como primer parámetro tenemos el coeficiente de linealidad donde se obtuvo un
promedio para R y R2 de 0.9919 y 0.9839, siendo el mayor el de malatión con 0.9994
y el menor para el clorpirifós con 0.9792. Estos valores están cercanos al valor ideal
de 1, con lo cual se tiene certeza de una buena linealidad en las curvas de
calibración (Walorczyk & Gnusowski, 2009).
Para determinar la precisión del método se emplearon los parámetros de desviación
estándar (SD) o la desviación estándar relativa (RSD), estas presentaron valores
altos para la mayoría de plaguicidas exceptuando la curva del malatión la cual
presentó un valor de 3.45% para la desviación estándar relativa. El valor más alto
lo presentó el diazinón con un 56.667 % y en segundo lugar el terbufos con 40.432%
58
esto se puede deber a que factores como desgaste y contaminación de la columna,
deterioro continuo del inyector entre secuencias de inyección, entre otros, aumentan
la dispersión de las medidas en función del tiempo, por lo cual, se obtiene desviación
estándar relativa alta (Walorczyk & Gnusowski, 2009). Este hecho ha sido reportado
por otros autores con anterioridad en el trabajo con miel (Rodríguez López, 2011;
Walorczyk & Gnusowski, 2009), donde se proponen dos puntos críticos que pueden
afectar este fenómeno el primero es la columna cromatográfica donde en un estudio
de plaguicidas multiresiduo se tuvo que acortar varias veces la columna con el fin
de mantener el sistema en buenas condiciones; como segundo punto proponen el
detector de ECD debido a su gran sensibilidad lo cual afecta el proceso de
integración (Rodríguez López, 2011).
Los límites de detección (LD) y cuantificación (LQ) son relativamente bajos siendo
el de mayor valor en ambos el terbufos con 0.140 ppm para el LD y 0.393 ppm para
el LQ, el resto se sitúan en un valor medio dentro de los estudios para plaguicidas
organofosforados consultados (Jiménez et al., 1998; Mosquera Ayala, 2012;
Rodríguez López et al., 2014; Rubio Cárdenas & Vallejo Reyes, 2014).
7.5. Recolección de muestra y caracterización de la zona
Las muestras fueron georeferenciadas en el momento de ser tomadas (Tabla 13),
los puntos fueron ubicados sobre un mapa de Santuario (Figura 22) teniendo en
cuenta las áreas de acción de las abejas, las distancias que recorren las abejas en
promedio tanto en época de buen alimento (rojo fuerte), como cuando recorren una
mayor distancia en búsqueda de comida (rojo claro).
59
Tabla 13. Puntos de georeferenciación de las muestras recolectadas.
Muestra N° de
Colmenas Vereda
Fecha de recolección
Latitud Longitud
A1 1 La Bamba 20/04/2015 5° 4,235' N 75° 59,555' O
A2 6 Corosal 12/04/2015 5° 4'9.88"N 75°57'33.15"O
A3 6 La Palma de
Cundina 10/04/2015 5° 3'44.97"N 75°58'17.77"O
A4 30 Orofino 20/04/2015 5° 4'45.03"N 75°58'24.85"O
A5 6 Buenos Aires 27/04/2015 5° 5,637' N 75° 5,813' O
A6 4 Barcinal 28/04/2015 5° 4,235' N 76° 0,139' O
A7 14 La Marina 16/04/2015 5° 4'16.86"N 75°57'6.62"O
A8 52 La Bretaña 17/04/2015 5° 2'41. 04''
N 75° 57' 48.
71''O
A9 30 San Gabriel 31/04/2015 5° 2'7.44"N 75°57'7.08"O
Figura 22. Ubicación de los apiarios sobre el mapa de Santuario
60
En el momento de recolección de las muestras se tomaron otros datos con el fin de
dar una mayor comprensión sobre los factores de exposición a los plaguicidas de
las colmenas, los datos obtenidos se presentan en la tabla 14 con su respectivo
diagrama de barras figura 23, donde se puede observar que predominan los cultivos
de café:
Tabla 14. Información de los apiarios
Muestra Cultivos cercanos Hay cultivos agrícolas cerca
de sus colmenas
En estos cultivos se aplican plaguicidas
Las abejas visitan estos
cultivos
A1 Café, Plátano Si Si Si
A2 Café, Plátano Si Si Si
A3 Café, Plátano, potreros Si Si Si
A4 Café, Plátano Si Si Si
A5 Café, Plátano, tomate(poco) Si Si Si
A6 Café, Plátano Si Si Si
A7 Café, Caña Si Si Si
A8 Café, Caña Si Si Si
A9 No
Figura 23. Diagrama de barras de los tipos de cultivos cercanos a los apiarios
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Café Platano Caña Tomate Ganaderia
Cultivos cercanos a los apiarios
61
La actividad económica que ocupa el primer puesto en santuario es la agrícola, la
principal fuente de ingreso es el cultivo de café, seguida por cultivos como el de
caña de azúcar, y cultivos transitorios como el de maíz, frijol, tomate y plátano, estos
cultivos transitorios son en general de autoconsumo y bajo nivel de comercialización
(CARDER, 2015).
La mayoría de cultivos de plátano (Musa sp.) son utilizados como barrera entre
parcelas de café y la aplicación de plaguicidas sobre este es mínima en su mayoría.
En los cultivos de plátano es común la utilización de plaguicidas organofosforados
como el terbufos que controla una amplia gama de plagas que atacan al plátano
como son los nematodos (radopholus similis) (Cayón Salinas & Salazar Alonso,
2001).
Para el cultivo de tomate es común la aplicación de plaguicidas con compuestos
activos como diazinón y clorpirifós, que combaten plagas como el pasador del fruto
(Neoleusinodes elegantalis), el cogollero (Tuta absoluta) y la mosca blanca
(Trialeurodes vaporarioum y Liriomyza sp.) (Restrepo, Cabrera, & Lobo, 2007).
Los cultivos de café son los que predominan en las cercanías a los apiarios, para el
control de plagas es frecuente la utilización de plaguicidas organofosforados como
clorpirifós que atacan plagas devastadoras para el café como la broca. Se ha
demostrado que los cultivos de café que son visitados por las abejas aumentan el
número de granos producidos por planta y la calidad de sus semillas (peso y aroma)
pueden aumentar gracias a la polinización cruzada mediada por abejas,
comprobando así la importancia de estos insectos como los principales
polinizadores de cultivos y plantas silvestres (Heard, 1999).
La ganadería por otra parte puede causar contaminación por fuentes veterinarias,
entre estos se pueden mencionar acaricidas y antibióticos (Rodríguez López, 2011),
también se utilizan plaguicidas a base de clorpirifós para controlar plagas en el
ganado como las garrapatas.
62
Figura 24. Grafico circular que muestra el porcentaje de apiarios con y sin cultivos
cercanos.
Los apiarios generalmente se ubican cerca de los cultivos con la finalidad de
aprovechar los beneficios ecológicos de las abejas como son la polinización que
ayuda a los sistemas de producción sostenible y a una buena producción agrícola
acelerando el desarrollo productivo de varios cultivos. Aunque esto conlleva a que
los apiarios que se encuentran cerca de cultivos en los cuales se emplean
plaguicidas en exceso como son los cultivos de tomate, algodón, plátano, etc. Se
vean afectados indirectamente con la muerte de abejas y la contaminación de los
productos derivados de la colmena (Sánchez & Patricia, 2012).
De los 9 apiarios visitados 8 tienen sus colmenas cerca de sus cultivos de café,
tomate, plátano o caña con la finalidad de aprovechar los servicios de polinización.
Los apiarios que se encuentran en la vereda san Gabriel se encuentran retirados de
cultivos alrededor de 4 hectáreas de distancia del cultivo más cercano, así que las
colmenas se encuentran rodeadas de flora silvestre.
89%
11%
Existen cultivos cercanosa los apiarios ?
Apiarios concultivos agricolascercanosApiarios sincultivos agricolascercanos
63
7.6. Análisis de muestras
En la tabla 15 se analizan las concentraciones de las muestras analizadas de la A1
hasta la A9, las muestras con una concentración inferior al límite de detección (LD)
son no detectables ND, las muestras de concentración mayor al LD y menor al límite
de cuantificación (LQ) son <LQ y las muestras con una concentración mayor al LQ
son cuantificables y a estos últimos se les determina la concentración real (cm) que
se da en mg/Kg. Los cromatográmas de las muestras se encuentran en el ANEXO
5.
Para determinar la concentración real de los plaguicidas analizados se utilizó la
siguiente ecuación:
𝒄𝒎 =𝑪𝒆𝒙𝒕 ∗ 𝑽𝒆𝒙𝒕
(%𝒓𝒆𝒄𝟏𝟎𝟎 ) ∗ 𝒎
Dónde:
%Rec: porcentaje de recuperación obtenido
Cm: Concentración de la muestra real (µg/g)
Cext: Concentración obtenida en el equipo (µg/mL)
Vext: Volumen final a la que se concentró (mL)
m: Masa de la muestra de miel (g)
64
Tabla 15. Concentraciones obtenidas de los plaguicidas.
CONCENTRACIÓN DE PLAGUICIDAS (mg/Kg)
COMPUESTO A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9
Forato ND ND <LQ <LQ 0,1747 <LQ 0,1415 0,8617 ND
Terbufos 3,0293 0,9711 ND 5,6454 0,9243 <LQ <LQ 1,3498 ND
Diazinón 1,3459 ND 0,1996 0,9641 0,6141 0,314 0,8927 0,7224 0,1556
Malatión <LQ ND ND <LQ <LQ <LQ <LQ 0,1838 ND
Clorpirifós ND ND ND ND ND ND ND ND ND
De acuerdo a los datos obtenidos en la tabla 15 se puede observar que en la
mayoría de muestras (A1, A3, A4, A5, A6, A7, A8 y A9) hay presencia del plaguicida
diazinón en un rango de concentración real de 0,1556-1,3459 mg/Kg. En el 88% de
las muestras se obtuvieron señales del compuesto, el cual es un insecticida
ampliamente utilizado para el control de ectoparásitos en la ganadería como son la
sarna, melófagos, las moscas, piojos, garrapatas, entre otros (Rady, 2009).
En las muestras A1, A2, A4, A5 y A8 hay presencia del plaguicida terbufos, la
muestra A4 presenta la mayor concentración de 5,6454 mg/kg, siendo esta la
concentración más alta de los plaguicidas analizados.
El plaguicida forato hace presencia en seis muestras y es cuantificable en las
muestras A5, A7 y A8 con un rango de concentración de 0,1415-0,8617 mg/Kg. Es
usado para el control de insectos masticadores y chupadores, ácaros y algunos
nemátodos en algodón, arroz, café, caña de azúcar, fríjol, maíz, ornamentales, papa
y tomate. Tiene una vida media de 82 días en suelo y tiene un alto potencial de
bioacumulación (Nieto Z., 2001).
En las muestras de la A1 a la A9 no hay presencia de clorpirifós. Esto se puede
deber a que los tiempos de fumigación para la broca (Hypothenemus hampei),
donde es utilizado principalmente este plaguicida, se realiza 90 días después de la
floración esto disminuye la exposición de las abejas (Bustillo Pardey, 2006).
65
El plaguicida malatión presentó el mejor comportamiento en el método por lo tanto
se puede tener plena confianza en los resultados obtenidos, este se encontró
presente en 6 de las 9 muestras, aunque solo es cuantificable en la muestra A8 con
una concentración de 0,1838 mg/Kg, el cual se encuentra por encima del límite
establecido por la unión europea (Unión Europea (UE), 2005). Es muy utilizado en
la agricultura como insecticida y acaricida para combatir insectos succionadores en
cultivos como frutales, floricultura, verduras, plantas ornamentales y arbustos.
También es usado para controlar plagas caseras y parásitos externos de los
animales domésticos, tales como pulgas, zancudos, garrapatas y hormigas
(Peñuela, López, & Stavro, 2005).
Límite Máximo de Residuos (LMR) es la cantidad máxima de residuos de
determinado plaguicida sobre determinado producto permitido por la Ley. Es decir,
la cantidad que no puede ser sobrepasada para que el producto pueda ser puesto
en circulación o comercializado.
Debido a que investigaciones como esta han encontrado residuos de contaminantes
en la miel, un alimento producido en diferentes partes del mundo, la unión europea
ha establecido un LMR para un gran número de plaguicidas, como está expuesto
en el Reglamento (CE) No 396/2005 del parlamento europeo y del consejo con
fecha del 23 de febrero de 2005, y última modificación en el reglamento (CE) No
1050/2009 de la comisión del 28 de octubre de 2009. Los plaguicidas presentes en
las muestras de miel analizadas (forato, terbufos, diazinón y malatión) no poseen
un LMR especifico establecido para la miel por ninguna agencia regulatoria se toma
un LMR por defecto de 0,01 mg/Kg como indica el reglamento de la unión europea
mencionado anteriormente (Gevany Paulino de Pinho, 2010).
Como los LQ obtenidos oscilan entre 0.042 - 0.393 mg/Kg los cuales son suficientes
para demostrar la presencia de plaguicidas que tienen concentraciones mayores a
este LQ, se puede observar que las muestras de la A1 a la A9 sobrepasan el LMR
establecido y no podrían ser exportadas por no cumplir este límite máximo de
residuos.
66
Se deben tener en cuenta varios factores que pueden influir en estos resultados el
primero de ellos se refiere a la desviación estándar encontrada para las rectas de
calibración del diazinón y del terbufos las cuales presentan valores altos, lo cual no
permite dar completa certeza del método para estos casos, esto sumado al hecho
de los límites de detección altos en comparación con otros estudios, el equipo de
cromatografía utilizado es implementado en diversos análisis dentro de la escuela
de química por lo que se pueden presentar interferencias en varios puntos del
equipo; otro factor a tener en cuenta para el análisis de plaguicidas es el efecto
matriz, este se define como la variación de la respuesta cromatográfica inducida por
los compuestos de la matriz, este efecto varía dependiendo de los plaguicidas y en
varios estudios se ha demostrado el aumento o reducción de la señal de ciertos
plaguicidas en miel (Kujawski & Namieśnik, 2008).
67
8. CONCLUSIONES
Se adaptó el método para ser realizado mediante una extracción en fase
solida con C18, obteniendo porcentajes de recuperación que oscilan entre
24.56% y 67.83%.
Los plaguicidas detectados fueron analizados exitosamente mediante la
cromatografía de gases con detector de microcaptura de electrones y
cromatografía de gases acoplada a masas, logrando límites de detección
desde 0.015 ppm hasta 0.140 ppm y límites de cuantificación entre 0.42 y
0.393.
Se logró aplicar el método para la extracción y purificación sobre las muestras
de plaguicidas recolectadas de los apiarios del municipio de santuario
Risaralda y se determinó que las concentraciones de plaguicidas
sobrepasaban los LMR permitido por la unión europea(Unión Europea (UE),
2005) siendo la muestra A9 la menos contaminada debido a su distancia con
los cultivos.
68
9. RECOMENDACIONES
Se recomienda utilizar columnas diferentes tipos e implementar las que
presenten porcentajes de recuperación más altos para el análisis de
plaguicidas en miel de abejas.
Se recomienda Implementar estándares que contengan más plaguicidas,
para que así permitan identificar un mayor número de señales obtenidas
mediante este método, y que se sospecha que podrían ser plaguicidas
debido al amplio espectro de plaguicidas que pueden ser extraídos mediante
esta metodología.
Se recomienda realizar un seguimiento continuo del contenido de plaguicidas
en los productos de colmena (miel, cera, polen, etc.), que permita entender
mejor la presencia de estos contaminantes en el ambiente, y posibilite una
integración efectiva de apicultores, agricultores y académicos para buscar
alternativas de producción más limpias.
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80
ANEXOS
ANEXO 1: Certificado del estándar de plaguicidas organofosforados
81
82
ANEXO 2: Reporte (CG-MS) del patrón de plaguicidas a 1 ppm
83
84
85
ANEXO 3
Curvas de Calibración de todos los plaguicidas analizados
y = 130129x + 9354,9
R² = 0,9859
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
Are
a
Concentración
Forato
y = 104394x + 7439,7
R² = 0,9851
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
Are
a
Concentración
Terbufos
86
y = 119706x + 14541
R² = 0,97
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
Are
a
Concentración
Diazinón
y = 133656x + 1168,1
R² = 0,9995
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
Are
a
Concentración
Malatión
y = 999171x + 87446
R² = 0,9792
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
Are
a
Concentración
Clorpirifós
87
ANEXO 4
Cromatogramas curva de calibración
Cromatograma de patrón a 0.01 ppm
Cromatograma de patrón a 0.05 ppm
88
Cromatograma de patrón a 0.1 ppm
Cromatograma de patrón a 0.5 ppm
89
Cromatograma de patrón a 1 ppm
ANEXO 5
Cromatogramas de las muestras de miel
90
91
92
