EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD FOTOSINTÉTICA DE Heliconia psittacorum (L.f.) ASOCIADA A Rhizophagus irregularis y Aspergillus niger

EN SUELOS IMPACTADOS POR CADMIO

DIANA MARCELA AGUILLON ALMARIO STEFANÍA GARCÍA CASTRO

UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES y AGROPECUARIAS

PROGRAMA MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BUCARAMANGA

2018

EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD FOTOSINTÉTICA DE Heliconia psittacorum (L.f.) ASOCIADA A Rhizophagus irregularis y Aspergillus niger

EN SUELOS IMPACTADOS POR CADMIO

DIANA MARCELA AGUILLÓN ALMARIO STEFANÍA GARCÍA CASTRO

Tesis presentada como requisito para otorgar el título de Microbiólogas Industriales

DIRECTORA PhD. BEATRIZ ELENA GUERRA SIERRA

CO- DIRECTOR JAIDER MUÑOZ GUERRERO Biólogo

Especialista en Ingeniería Ambiental

UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES y AGROPECUARIAS

PROGRAMA MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BUCARAMANGA

2018

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AGRADECIMIENTOS Principalmente le agradecemos a Dios que es nuestro guía y por darnos constancia, fortaleza y sabiduría para alcanzar cada una de nuestras metas y por todas las enseñanzas que tuvimos durante la realización de este proyecto. A la Dra. Beatriz Guerra, directora del Laboratorio LIIBAAM de la Universidad de Santander, por toda su ayuda, paciencia, colaboración y confianza quien nos inspiró para realizar este proyecto y darnos la oportunidad de adquirir nuevos conocimientos. Agradecemos al Profesor Jaider Muñoz por su valiosa colaboración y orientación en cada uno de los procedimientos de extracción y cuantificación de la clorofila durante el transcurso de este proyecto. Al profesor Giampaolo Orlandoni, por su apoyo en los análisis estadísticos del presente trabajo. Agradecemos a FEDECACAO por las instalaciones ofrecidas del vivero, al laboratorio de investigación Agroambiental LIIBAAM de la Universidad de Santander. Y gracias a todos nuestros familiares por el apoyo incondicional y amigos quienes nos brindaron su valiosa amistad durante nuestra formación académica.

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DEDICATORIA

Dios, por darnos la oportunidad de vivir y por estar con nosotros en cada paso que dimos, por fortalecer nuestro corazón e iluminar nuestra mente y por haber puesto en nuestro camino a aquellas personas que han sido de soporte y compañía durante todo el periodo de este estudio. Dedicamos este trabajo en especial a nuestros familiares por ser el pilar fundamental en todo lo que somos, en toda nuestra educación, tanto académica, como de la vida, por su incondicional apoyo perfectamente mantenido a través del tiempo.

Todo este trabajo ha sido posible gracias a ellos.

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CONTENIDO

Pág.

GLOSARIO ............................................................................................................ 12 RESUMEN ............................................................................................................. 14 ABSTRACT ............................................................................................................ 15 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 16 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .............................................................. 17

3. JUSTIFICACIÓN .............................................................................................. 19 4. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES ......................................................... 20 4.1 HELICONIA PSITTACORUM (L.F.) ................................................................. 21

4.1.1 Generalidades ............................................................................................ 21 4.1.2 Descripción botánica ..................................................................................... 21 4.1.3 Ubicación taxonómica y principales especies ............................................... 22 4.2 FOTOSÍNTESIS ............................................................................................ 25 4.2.1 Definición ............................................................................................ 25 4.2.2 Proceso de fotosíntesis ................................................................................. 25

4.2.3 Conversión de Energía Lumínica a Energía química .................................... 26 4.2.4 Fase Luminosa ............................................................................................ 27

4.2.5 Fase Oscura ............................................................................................ 30 4.2.6 Fotorespiración ............................................................................................ 31 4.2.7 Características generales de los pigmentos fotosintéticos ............................ 33 4.3 HONGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES (HMA) ................................ 34 4.3.1 Generalidades ............................................................................................ 34

4.3.2 Clasificación taxonómica............................................................................... 35 4.3.3 Mecanismos y proceso de micorrización....................................................... 35 4.3.4 Simbiosis Micorrízica en la familia Heliconeaceae. ....................................... 37

4.3.5 Influencia de las micorrizas arbusculares en la absorción de nutrientes por la planta. ............................................................................................ 38 4.4 METALES PESADOS ................................................................................... 39 4.4.1 Cadmio ............................................................................................ 41 4.4.2 Fuentes de contaminación ............................................................................ 41 4.4.3 Ingreso del cadmio en la cadena trófica ....................................................... 42

4.4.4 Mecanismo de transporte y acumulación de cadmio .................................... 43 4.4.5 Toxicidad de metales pesados en plantas .................................................... 44 4.4.6 Acumulación del cadmio en plantas .............................................................. 47

4.4.7 Hiperacumulación y Fitoextracción de cadmio .............................................. 47 4.4.8 Mecanismo de estrés por metales pesados. ................................................. 48 4.5 MECANISMOS DE PROTECCIÓN VEGETAL ............................................. 48 4.5.1 Glutatión ............................................................................................ 49

4.5.2 Proteínas de almacenamiento de metales .................................................... 49 4.5.3 Quelación de metales por pequeñas moléculas ........................................... 49 5. HIPÓTESIS ............................................................................................ 51 5.1 HIPÓTESIS NULA ........................................................................................ 51

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5.2 HIPÓTESIS ALTERNATIVA ......................................................................... 51 6. OBJETIVOS ............................................................................................ 52 6.1 OBJETIVO GENERAL .................................................................................. 52 6.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 52 7. METODOLOGÍA ........................................................................................... 53 7.1 TIPO ESTUDIO ............................................................................................ 53 7.2 SITIO DEL ESTUDIO .................................................................................... 53 7.3 CONDICIONES DEL SUELO ........................................................................ 53 7.3.1 Suelos ............................................................................................ 53 7.3.2 Preparación del inóculo micorrízico para adicionar a los rizomas de H. psittacorum: ............................................................................................ 53 7.3.3 Esterilización del suelo: ................................................................................ 53 7.3.4 Condiciones y Montaje del experimento. ...................................................... 54 7.3.5 Número total de muestras y unidades experimentales: ................................ 54 7.3.5.1Planta hospedera ........................................................................................ 54 7.3.5.2 Diseño del experimento ............................................................................. 54 7.4 TRATAMIENTOS .......................................................................................... 55 7.4.1 Tratamiento expuesto iluminación solar ........................................................ 55 7.5 CUANTIFICACIÓN DE LA SIMBIOSIS MICORRÍZICA EN RAÍCES DE H. PSITTACORUM ............................................................................................ 56 7.5.1 Tinción de raíces para observar la colonización micorrízica ......................... 56 7.5.2 Porcentaje de simbiosis micorriza ................................................................. 57 7.6 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE CLOROFILA TOTAL EN EL ÁREA FOLIAR DE HELICONIA PSITTACORUM EN SIMBIOSIS CON HONGOS MICORRÍZICOS BAJO CONDICIONES DE FOTOPERIODOS Y SOMBRA, EN TRES TIPOS DE SUELOS CACAOTEROS CONTAMINADOS NATURALMENTE POR CADMIO. ............................................................................................ 57 7.7 ESTABLECIMIENTO DE LAS DIFERENCIAS FISIOLÓGICAS EN EL CRECIMIENTO DEL ÁREA FOLIAR Y TALLOS EN LOS DISTINTOS TRATAMIENTOS EVALUADOS ............................................................................ 59 7.8 ESTIMACIÓN DE LA BIOMASA RADICULAR DE HELICONIA PSITTACORUM EN TODOS LOS TRATAMIENTOS. ...................................................................... 60 7.8.1 Determinación del peso seco radicular ......................................................... 60 7.9 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ............................................................................... 60 8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................... 61 8.1 ANÁLISIS FISICOQUÍMICO DE SUELOS ..................................................... 61 8.2 SIMBIOSIS MICORRÍZICA EN RAÍCES DE H. PSITTACORUM .................... 62 8.2.1Cuantificación simbiosis micorrízica .............................................................. 63 8.2.2 Diferencias fisiológicas en el área foliar y tallo .............................................. 65 8.2.3Determinación de clorofila total ...................................................................... 69 8.2.4Evaluación de la biomasa seca radicular de Heliconia Psittacorum .............. 71

9.CONCLUSIONES ............................................................................................... 74 10.RECOMENDACIONES ..................................................................................... 75 11.BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 76 12.ANEXOS .............................................................................................. 86

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LISTA DE FIGURAS

Pág. Figura 1. Fisiología de Heliconia psittacorum ........................................................ 22 Figura 2. Proceso general de la fotosíntesis .......................................................... 26 Figura 3. Procesos de captación de energía lumínica mediante la intervención de reacciones del fotosistema II (PSII), fotosistema I (PSI) y el transporte electrónico de electrones ......................................................................................................... 29 Figura 4. Proceso de fijación de CO2, tiene lugar en el estroma del cloroplasto. ... 30 Figura 5. Esquema representativo de las tres etapas del ciclo del Calvin o fase independiente de luz. ............................................................................................. 31 Figura 6. Procesos de fotorrespiración y ciclo de Calvin cuando dependen de la molécula gaseosa que reacciona con la enzima RubisCO .................................... 32 Figura 7. Estructuras moleculares de los pigmentos de clorofila a y b ................... 33 Figura 8. Proceso de colonización y micorrización en plantas ............................... 36 Figura 9. Tipos de asociación micorrízica arbuscular. a) Tipo Arum, caracterizado por hifas que crecen de forma intercelular (cabeza de flecha). b) Tipo Paris, caracterizado por hifas con crecimiento intracelular (cabeza de flecha). Se aprecian vesículas (v); el apresorio (A); hifas (flechas) y arbúsculos (dos cabezas de flechas). ............................................................................................................................... 37 Figura 10. Interacción de contaminantes metálicos en suelos agrícolas y plantas. ............................................................................................................................... 41 Figura 11. Imágenes representativas de las fuentes de contaminación por Cadmio ............................................................................................................................... 42 Figura 12. Acumulación del cadmio en cultivos vegetales de interés agrícola. ..... 43 Figura 13. Representación esquemática de los mecanismos de absorción translocación del Cd en raíces. .............................................................................. 46 Figura 14. Esquema de la respuesta celular al cadmio: producción de ROS, daños oxidativos y señalización. ...................................................................................... 46 Figura 15. Respuesta vegetal a estrés por metales pesados ................................ 50 Figura 16. Proceso de esterilización de suelos cacaoteros por el método de solarización fraccionado en el Vivero Santa Mónica- San Vicente de Chucuri. ..... 54 Figura 17. Crecimiento de H. psittacorum en todos los tratamientos. A) tratamientos expuestos a condiciones de luz, B) tratamientos expuestos a polisombra de 75% de luz. ......................................................................................................................... 55 Figura 18. Proceso de tinción de raíces colonizadas por micorrizas ..................... 56 Figura 19. Procedimiento para la extracción y cuantificación de la Clorifila Chl a, Chl b clorofila total (Chl a + b). ..................................................................................... 58 Figura 20. Esquema representativo de las medidas lineales de largo y ancho de las hojas ...................................................................................................................... 59 Figura 21. Simbiosis micorrizica en raíces de H. psittacorum; (I) espora de Rhizophagus irregularis; (II) Vesículas e hifas intracelulares; III) Micorrización tipo Arum en Heliconia psittacorum (a) hifa intercelular; (b) arbúsculos ....................... 62 Figura 22. Representación gráfica del porcentaje de simbiosis micorrízica en los diferentes factores luz y sombra, suelos (1. 0,095 ppm ,2. 1,075 ppm, 3.18, 83 ppm)

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e inóculos (1.R. irregularis. 2. A.niger. 3. R. irregularis+ A.niger) .......................... 64 Figura 23. Representación gráfica del comportamiento del área foliar bajo los diferentes factores luz y sombra, suelos (1. 0,095 ppm, 2. 1,075 ppm, 3.18, 83 ppm) e inóculos (1.R. irregularis. 2. A.niger. 3. R. irregularis+ A.niger). ......................... 67 Figura 24. Representación gráfica del comportamiento de la longitud del tallo en los diferentes factores luz y sombra, suelos (1. 0,095 ppm ,2. 1,075 ppm, 3.18, 83 ppm) e inóculos (1.R. irregularis. 2. A.niger. 3. R. irregularis+ A.niger) ............... 68 Figura 25. Representación gráfica de la determinación de la clorofila total bajo los diferentes factores luz y sombra, suelos (1. 0,095 ppm, 2. 1,075 ppm, 3.18,83 ppm) e inóculos (1.R. irregularis. 2. A.niger. 3. R. irregularis+ A.niger). ......................... 70 Figura 26. Representación gráfica de la evaluación de la biomasa seca radicular bajo los diferentes factores luz y sombra, suelos (1. 0,095 ppm,2. 1,075 ppm, 3.18,83 ppm) e inóculos (1.R. irregularis. 2. A.niger. 3. R. irregularis+ A.niger) .... 72 Figura 27. Efecto de la simbiosis micorrízica en la biomasa radicular en Heliconia psittacorum. A) Tratamiento bajo sombra y concentración de 0,96ppm Cd, B) tratamiento bajo luz y concentración de 0,96 ppm Cd. .......................................... 73

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LISTA DE TABLAS

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Tabla 1. Principales especies de Heliconias nativas de Colombia ........................ 23 Tabla 2. Clasificación actual de los hongos micorrízicos arbusculares .................. 35 Tabla 3. Esquema de los tratamientos ensayados en presencia de luz (igual número de tratamientos se ensayaron bajo sombra) .......................................................... 55 Tabla 4. Fórmulas para determinar la concentración de clorofilas mediante las absorbancias.......................................................................................................... 59 Tabla 5. Caracterización fisicoquímica de los suelos cacaoteros .......................... 61 Tabla 6. Análisis de varianza de la simbiosis micorrízica en los tratamientos evaluados .............................................................................................................. 63 Tabla 7. Análisis de varianza del área foliar en los tratamientos evaluados .......... 65 Tabla 8. Análisis de varianza de la longitud de tallo en los tratamientos evaluados ............................................................................................................................... 66 Tabla 9. Análisis de varianza de la determinación de la clorofila total en los tratamientos evaluados .......................................................................................... 69 Tabla 10. Evaluación de la biomasa seca radicular en los tratamientos evaluados ............................................................................................................................... 71

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LISTA DE ANEXOS

Pág. Anexo 1. Prueba de tukey en simbiosis micorrizica ............................................... 87 Anexo 2. Tabla de mínimos cuadrados medios para simbiosis micorrizicos con 95,0% intervalos de confianza ............................................................................... 88 Anexo 3. Prueba de Tukey área foliar .................................................................... 90 Anexo 4. Tabla de mínimos cuadrados medios para área foliar con 95,0% intervalos de confianza........................................................................................................... 91 Anexo 5. Prueba de Tukey longitud del tallo .......................................................... 94 Anexo 6. Tabla de Mínimos Cuadrados Medios para longitud del tallo con 95,0% intervalos de confianza .......................................................................................... 95 Anexo 7. Prueba de Tukey Clorofila ...................................................................... 97 Anexo 8. Tabla de mínimos cuadrados medios para Clorofila con 95,0% intervalos de Confianza .......................................................................................................... 98 Anexo 9. Prueba de Tukey Biomasa Radicular.................................................... 100 Anexo 10. Tabla de mínimos cuadrados medios para biomasa radicular con 95,0% intervalos de confianza ........................................................................................ 101

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GLOSARIO

Biorremediación: Buscar resolver problemas de contaminación ambiental mediante la utilización de microorganismos capaces de degradar los compuestos que dañan en el medio ambiente.

Fitorremediación: Hace referencia a una serie de tecnologías que se basan en el uso de plantas para limpiar o restaurar ambientes contaminados como aguas, suelos e incluso aire. Fito estabilización: Técnica que permite Fitoestabilización permite inmovilizar contaminantes en el suelo a través de su absorción y acumulación en las raíces o bien, por precipitación en la zona de la rizosfera. Este proceso reduce la movilidad de los contaminantes y evita su migración a las aguas subterráneas o al aire. Glomalina: Es una glicoproteína indicadora de la calidad del suelo y sensible a las perturbaciones, es producida por las paredes de las hifas de los hongos micorrízicos arbusculares (HMA). Metal pesado: Elemento químico metálico que tiene una densidad relativamente alta y es tóxico o venenoso en concentraciones bajas. Fotosíntesis: Proceso químico que tiene lugar en las plantas con clorofila y que permite, gracias a la energía de la luz, transformar un sustrato inorgánico en materia orgánica rica en energía.

Fotosistema I: Se localiza principalmente en las membranas de los tilacoides no apilados, en contacto con el estroma. El centro de reacción tiene dos moléculas de clorofila. Fotosistema II: Se localiza en la grana. Su centro de reacción contiene dos moléculas de clorofila Estroma: Tejido de sostén o soporte del tejido que cumple la función específica de un órgano. Cloroplasto: Es el orgánulo donde se realiza la fotosíntesis en las células eucariotas vegetales. El conjunto de reacciones de la fotosíntesis es realizado gracias a todo un complejo de moléculas presentes en el cloroplasto. Heliconia: Es un género que agrupa más de 100 especies de plantas tropicales, originarias de Suramérica, Centroamérica, las islas del Pacífico e Indonesia. Se les llama platanillo por sus hojas. Simbiosis: Se aplica a la interacción biológica, a la relación estrecha y persistente

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entre organismos de diferentes especies. Micorriza Arbuscular: Es una asociación endosimbiótica, lo que significa que el “hongo” invade el interior de la raíz. Energía lumínica: Es la energía que generan y transportan las ondas de luz. Cuando la luz se traslada puede actuar como una onda electromagnética o como una partícula, ya que puede interactuar con otras materias. Esas partículas se denominan fotones. Energía química: Energía interna que posee un determinado cuerpo y si bien siempre se podrá encontrar en la materia, solo se nos mostrará cuando se produzca una alteración importante de ésta. Suelo: El suelo es la capa superficial de la corteza terrestre en la que viven numerosos organismos y crece la vegetación. Es una estructura de vital importancia para el desarrollo de la vida. Fango: Barro blando y viscoso, mezclado a veces con restos orgánicos, que se forma en el fondo de una corriente o depósito de agua, o en un lugar en el que queda circunstancialmente agua estancada. Rizoma: Es un tipo de tallo que crece de manera subterránea y en sentido horizontal, dando lugar al surgimiento de brotes y raíces a través de sus nudos. Cadmio: Es un metal pesado el cual posee una tonalidad azul, de consistencia mórbida, éste se encuentra estrechamente asociado con el zinc.

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RESUMEN

Título: Evaluación de la capacidad fotosintética de Heliconia psittacorum (L.f.) asociada a Rhizophagus irregularis y Aspergillus niger en suelos impactados por Cadmio Autor: Diana Marcela Aguillon Almario, Stefanía García Castro Palabras claves: micorrizas, fotosíntesis, cadmio, clorofila, biomasa, Heliconia psittacorum Descripción: La presencia de una cantidad excesiva de cadmio en el suelo causa diversas sintomatologías en las plantas, como la reducción del crecimiento, especialmente el crecimiento de la raíz, alteraciones en la nutrición mineral y metabolismo de carbohidratos y, por lo tanto, puede reducir fuertemente la producción de biomasa. Esta reducción de la biomasa debido a la toxicidad de cadmio (Cd) podría ser una de las consecuencias más importantes en la inhibición de la síntesis de clorofila y de la disminución de la tasa fotosintética de las plantas. Es por ello que la asociación de hongos micorrízicos arbusculares con la planta confiere beneficios nutricionales y resistencias a diferentes factores de estrés tanto bióticos como abióticos. El objetivo del trabajo de investigación fue estudiar la capacidad de producción fotosintética en plantas de Heliconia psittacorum en asociación con hongos micorrízicos bajo condiciones de luz y de sombra, en tres suelos impactados naturalmente por cadmio (0,96, 1,075, 18,83 ppm) presentes en los suelos nativos de San Vicente de Chucuri. Se evaluaron las variables respuesta como simbiosis micorrízica, cantidad de clorofila total, diferencias fisiológicas en el crecimiento foliar y longitud de tallo y cuantificación de la biomasa radicular. Los factores evaluados permitieron evidenciar que en cada uno de los tratamientos para cada factor como concentración de cadmio, inóculos y fuente lumínica hay correlación y presentan diferencias significativas entre sí. En conclusión, el uso de las micorrizas en suelos contaminados con cadmio aumenta la capacidad fotosintética y favorece el crecimiento y desarrollo de la planta al igual que su biomasa radicular, ya que esta simbiosis ayuda a retener el cadmio evitando que se trasloque a otras partes de la planta, así mismo es importante mencionar que la tasa fotosintética no fue afectada por la concentración de cadmio presente en el suelo en condiciones de luz.

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ABSTRACT Title: Evaluation of the photosynthetic capacity of Heliconia psittacorum (L.f.) associated with Rhizophagus irregularis and Aspergillus niger in soils impacted by Cadmium Author: Diana Marcela Aguillon Almario, Stefanía García Castro Keywords: mycorrhizae, photosynthesis, cadmium, chlorophyll, biomass, Heliconia psittacorum. Description: The presence of an excessive amount of cadmium in the soil causes various symptomatology in plants, such as reduced growth especially root growth alterations in mineral nutrition and carbohydrate metabolism and can therefore strongly reduce biomass production. This reduction of the biomass due to the toxicity of cadmium (Cd) could be one of the most important consequences in the inhibition of chlorophyll synthesis and in the decrease of the photosynthetic rate of the plants. That is why the association of arbuscular mycorrhizal fungi with the plant confers nutritional benefits and resistance to different stress factors, both biotic and abiotic. The objective of the present was to study the capacity of photosynthetic production in plants of Heliconia psittacorum in association with mycorrhizal fungi under light and shade conditions, in three soils naturally impacted by cadmium (0.96, 1.075, 18.83 ppm) present in the native soils of San Vicente de Chucuri. In this work the response variables were evaluated such as mycorrhizal symbiosis, total chlorophyll amount, physiological differences in leaf growth and stem length and quantification of root biomass. The factors evaluated allowed to show that each of the treatments for each factor such as concentration of cadmium, inoculated and light source is correlated and present significant differences among themselves. In conclusion, the use of mycorrhizae in soil contaminated with cadmium increases the photosynthetic capacity and favors the growth and development of the plant as well as its root biomass, since this symbiosis retains help to retain cadmium, preventing it from being disturbed to other parts of the soil. The plant, likewise it is important to mention that the photosynthetic rate was not affected by the concentration of cadmium present in the soil.

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1. INTRODUCCIÓN La presencia de una cantidad excesiva de cadmio en el suelo causa diversas sintomatologías en las plantas, como la reducción del crecimiento especialmente el crecimiento de la raíz, alteraciones en la nutrición mineral y metabolismo de carbohidratos (Moya et al. 1993) y, por lo tanto, puede reducir fuertemente la producción de biomasa. Esta reducción de la biomasa debido a la toxicidad de cadmio (Cd) podría ser una de las consecuencias más importantes en la inhibición de la síntesis de clorofila (Padmaja et al. 1990) y de la disminución de la tasa fotosintética de las plantas (Bazzaz et al. 1975; Baszynski et al. 1980). Se ha reportado una marcada reducción en la tasa fotosintética para diferentes especies de plantas debido a la exposición de cadmio en suelos agrícolas (Sawhney et al. 1990; Sheoran et al. 1990a, 1990b). Las plantas que crecen en suelos con alto nivel de cadmio son afectadas en sus procesos fotosintéticos (Baszynski et al. 1980; Padmaja et al. 1990; Satyakala, 1997), y así mismo se ven afectadas las actividades de enzimas relacionadas (Ascencio and Cedeno- Maldonado, 1979; Weigel, 1985a, 1985b; Ouariti et al. 1997a, 1997b). De otro lado en los suelos existe una mutua dependencia entre las plantas y los hongos micorrízicos arbusculares, esta relación consiste en que el macrosimbionte (planta) representa una fuente directa de carbono y nitrógeno para el desarrollo del microsimbionte (hongo); así el macrosimbionte forma una red fúngica laxa con desarrollo intra e intercelular en la corteza. En otras palabras, las micorrizas funcionan como un sistema de absorción que se extiende por el suelo proporcionando a la planta agua, así como algunos nutrientes (nitrógeno y fósforo). Por su parte, el hongo recibe de la planta azúcares y carbohidratos provenientes de la fotosíntesis, elementos fundamentales para su desarrollo y crecimiento y también se ha evidenciado que la simbiosis micorrízica protege a la planta en suelos impactados por metales pesados. El objetivo de este proyecto fue evaluar la capacidad de producción fotosintética en plantas de Heliconia psittacorum en asociación con hongos micorrízicos arbusculares bajo condiciones de luz y de sombra en tres suelos impactados naturalmente por cadmio provenientes del Municipio de San Vicente de Chucuri.

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2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La contaminación de los suelos por metales pesados a nivel mundial se ha convertido en una problemática debido a que las partículas contaminantes se diseminan por corrientes de aire que pueden ser absorbidos por las plantas y el suelo, realizando una movilidad de intercambio catiónico en el suelo (Rodríguez et al. 2008), de tal manera que llegan fácilmente a las raíces y puede ser traslocado a los animales y a las personas a través de la cadena trófica (Díaz, 2005). Sin embargo, existen diferentes fuentes de contaminación ya sean naturales o antropogénicas; como los insumos agrícolas, los lodos, sedimentos residuales de la combustión del carbón y del petróleo, industrias químicas y desechos urbanos e industriales (Orozco et al. 2005). Las altas concentraciones de cadmio que se presentan en los suelos depende principalmente de sus características físico-químicas, ya que este permite determinar la disponibilidad del metal, así como en la capacidad genética de la planta para reaccionar ante los elementos abióticos que estresan el ecosistema (Khudsar et al. 2004). Existen algunas plantas resistentes que son capaces de tolerar metales pesados o evitar su captación, mientras que la planta sensible ante el metal altera su sistema fisiológico como el comportamiento de las membranas, procesos bioquímicos de respiración y fotosíntesis que conlleva al bajo rendimiento de la síntesis de clorofila (Linger et al. 2005), es por esto que el cadmio tiene mayor influencia en alterar cultivos ya que este elemento no puede ser degrado por métodos químicos o biológicos (Nigam et al. 2001). Sin embargo, los hongos de vida libre como Aspergillus niger y hongos simbiontes como micorrizas arbusculares han sido estudiados por su capacidad de bioacumular. La región de San Vicente de Chucuri (Santander-Colombia) es conocida principalmente por su cosecha de cacao, obteniendo así semillas de buen sabor y calidad (FED ECACAO, 2017). Para el cultivo, sus suelos deben representar un papel importante en el crecimiento y sostenibilidad de los frutos ya que son materia prima para su producción agroindustrial. Las características del suelo dependen de la macro fauna ya que ésta es sensible a cambios ambientales y es un indicador de contaminación si se encuentra deteriorada; El cadmio es acumulado por los hongos micorrízicos en sus tejidos y en su proteína de excreción Glomalina. El pH acido del suelo favorece la absorción del metal pesado en el suelo (FAO/OMS, 2007). Algunos trabajos realizados en Colombia Martínez y Palacio (2010) reportan concentraciones de Cadmio en suelos con valores de 0,53 y 3,03 mg/Kg; estos suelos se encuentran impactados por la presencia de altas concentraciones de cadmio lo cual indica que los valores se encuentran por fuera del rango permitido para suelos agrícolas (0,01 a 0,5 mg/kg, (Berg, et al.2012). Por otro lado, para

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remediar este tipo de problemática, en recientes investigaciones se han encontrado que la asociación de hongos micorrízicos con las raíces de la planta incrementa la tolerancia de los factores ambientales tales como el estrés hídrico, salino, exceso de metales pesados y sustancias fitotóxicas (Ruscitti et al., 2011). Además de esto, se conoce que los hongos micorrízicos intervienen en los cambios en la fotosíntesis y en el metabolismo de los hidratos de carbono en las plantas. De acuerdo con los anteriores conceptos, se plantea la siguiente pregunta de investigación ¿La asociación de micorrizas y hongos de vida libre en el suelo ayudan a incrementar la tasa fotosintética de H. psittacorum en suelos contaminados por cadmio?

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3. JUSTIFICACIÓN

En las últimas décadas, ha aumentado el número de estudios ambientales que buscan reducir la contaminación de suelos agroindustriales con metales pesados siendo la presencia de estos metales peligrosos por su alta toxicidad y retención de las plantas (Janouskova et al. 2006). Existen diferentes medios de biorremediación para los suelos que se encuentran contaminados por metales pesados como la fitorremediación. En este proceso las plantas son seleccionadas principalmente por su potencial fisiológico, su capacidad de asimilar sustancias tóxicas, sus elevadas tasas de crecimiento, la profundidad de sus raíces y su habilidad para bioacumular y/o degradar contaminantes (Peña y Salamanca 2005). Heliconia psittacorum (L.f.) ha sido ampliamente estudiada por su capacidad de bioacumular metales pesados, descriptivamente es una planta monocotiledónea, herbácea, neo tropical, perteneciente al orden Zingiberales y es utilizada ampliamente como ornamental. Colombia posee la mayor diversidad de especies endémicas (Peña et al., 2009) Por otra parte, la asociación de Heliconia psittacorum (L.f.) con hongos micorrízicos tiene la capacidad de acumular contaminantes metálicos gracias a las estructuras vesiculares de los hongos así como las hifas presentes en las raíces y la producción de una glicoproteína denominada Glomalina la cual ha demostrado su potencial al momento de establecer enlaces con moléculas de alta toxicidad como en el caso de los metales pesados, lo que constituye una barrera eficaz que acumula metales en la masa micelial sin permitir que ingresen a las células vegetales (Hildebrandt et al. 2007; González-Guerrero, 2005). Es de resaltar que esta asociación favorece la tasa fotosintética al secretar enzimas con capacidad de acelerar la absorción de minerales indispensables para la nutrición de la planta (Kong, 2014). Esta planta crece de manera natural en suelos agrícolas dedicados al cultivo del Cacao en Santander y en estudios de biorremediación de aguas ha mostrado su capacidad de retención de metales pesados por lo cual fue seleccionada para este estudio.

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4. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES El cadmio es un contaminante metálico altamente tóxico que no tiene ningún uso metabólico, su nivel ha aumentado enormemente en los últimos tiempos en el medio natural y agrícola principalmente a través de la actividad industrial, combustibles fósiles, efluentes municipales, aplicación de pesticidas y fertilizantes fosfatados en suelos agrícolas; por otro lado el suelo cargado con exceso de concentración de cadmio inhibe la germinación de las semillas, el desarrollo de los niveles de las enzimas antioxidantes de las plantas y el crecimiento de las raíces. Sin embargo, la toxicidad del cadmio también conduce al estrés hídrico y a la absorción restringida de nutrientes esenciales. Estos cambios inducidos conducen a la inhibición del crecimiento o la muerte de la planta (Mobin and Khan, 2007). Una de las alternativas para reducir el efecto tóxico del cadmio, es la combinación de tecnologías biológicas como son la fitorremediación y micorremediación. Las plantas con asociación micorrízica tienen la capacidad de acumular contaminantes metálicos en las vesículas, así como en hifas de hongos presentes en las raíces, por lo tanto, estos contaminantes metálicos se inmovilizan, no inhiben el crecimiento de la planta y la absorción de fósforo y otros micronutrientes es eficiente. Los hongos micorrízicos también liberan diversos ácidos orgánicos que aumentan la solubilizarían de compuestos de fosfato insolubles presentes en el suelo (Garg and Aggarwal, 2011). El papel del nitrógeno como nutriente esencial y componente estructural de moléculas como la clorofila en plantas ha sido ampliamente documentado en varias especies debido a la importancia en los procesos de crecimiento y producción agrícola (Makino and Osmond, 1991; Volenec et al. 1996; González et al. 2003; Reigosa et al. 2003; Lattanzi et al. 2004). El nitrógeno es uno de los factores de mayor estrés en plantas tropicales ya sea por deficiencia o por exceso. Se reconoce que el nitrógeno puede ser un factor limitante del crecimiento y de la eficiencia fotosintética de las plantas, especialmente, bajo condiciones de déficit de nitrógeno las cuales tienden a disminuir el peso seco, el número de hojas y el área foliar (Ciompi et al. 1996; Taiz and Zieger, 1998). En el caso de la eficiencia fotosintética, se puede ver limitada al disminuir el contenido de Rubisco y la clorofila en las hojas, así como la producción cuántica de la fotosíntesis. La correlación entre el contenido de nitrógeno y la eficiencia fotosintética varía dependiendo del hábitat de la planta y de factores ambientales como la temperatura y la radiación (Toth et al. 2002; Lamsfus et al. 2003). Algunas plantas tienen la capacidad de acumular metales y otras sustancias como una respuesta de adaptación a la contaminación en la biosfera (Lamsfus et al. 2003). Dentro de este grupo, existen plantas hiperacumuladoras que pueden vivir en ambientes con altas concentraciones de nutrientes, agentes tóxicos y son ampliamente utilizadas en procesos de fitorremediación (Shiny et al. 2004). Esta estrategia requiere de especies con características especiales como la asimilación excedente de partículas y una alta producción de biomasa en estas condiciones. Teniendo en cuenta lo anteriormente

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mencionado, se pretende dar a conocer a través del referente teórico cada uno de los conceptos que hacen parte de la temática de la capacidad fotosintética de Heliconia psittacorum (L.f.) a partir de micorrizas arbusculares en suelos cacaoteros impactados por metales pesados como el cadmio.

4.1 HELICONIA PSITTACORUM (L.F.) 4.1.1 Generalidades Las Heliconias son especies neotropicales de uso comercial, que desde los años 70’s se han cultivado debido a su gran valor ornamental (Lamsfus et al. 2003). La mayoría de las especies del género Heliconia, se encuentra ubicadas en el Neotrópico, desde el sur de México hasta el norte de Argentina, incluyendo las Islas del Caribe. Colombia es considerada el país con mayor diversidad de especies del género Heliconia, con 94 especies que equivalen a aproximadamente el 50% del total de especies descritas. En el país, las especies de este género alcanzan la mayor diversidad entre los 500 y los 1500 m.s.n.m. (metros sobre el nivel del mar) y tienen dos sitios altamente diversos: la vertiente pacífica y los Andes (Kress et al. 1993). Este género de plantas constituye grandes dimensiones con hojas de nervadura pinnada, cuyos nervios se prolongan paralelos hacia los bordes del limbo, esta característica y la ausencia de un tejido de refuerzo en los márgenes, hacen que ellos se desgarren en forma típica de lacinias. Su verdadero tallo está constituido por un vigoroso rizoma provisto de yemas vegetativas y abundantes, largas y fuertes raíces fibrosas (Neville, 1996). Investigaciones realizadas por (Ascuntar y Toro, 2007) donde se evaluó el papel de la especie Heliconia psittacorum en la remediación de aguas residuales encontrando efectos positivos en la biorremediación, además se demuestra H. psittacorum es muy tolerante a un amplio espectro de condiciones ambientales, por lo que la hace una especie atractiva para su uso en sistemas naturales contaminados. 4.1.2 Descripción botánica

Se ha reportado que las Heliconias son plantas monocotiledóneas, herbáceas, perennes, con rizoma simpodialmente ramificado (emite brotes o vástagos) y un pseudotallo aéreo, erecto, formado por un eje recubierto por las bases de hojas alternas que se solapan (posición dística). El hábito de crecimiento, según la forma y disposición de las hojas, puede ser musoide (hojas orientadas verticalmente con largos pecíolos), zingiberoide (hojas en la mayoría de los casos séciles y dispuestas en posición horizontal con pecíolos cortos) o cannoide (hojas oblicuas con pecíolos medios o cortos). El ángulo de inserción foliar permitirá una mayor o menor actividad fotosintética, lo cual quedó demostrado al encontrar una menor eficiencia

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en el PIS en hojas dispuestas en ángulo horizontal, (figura 1) (He, Chee y Goh, 1996). Figura 1. Fisiología de Heliconia psittacorum

Fuente: autores del proyecto

La inflorescencia resulta extremadamente interesante y llamativa, de 35 a 50 cm de longitud, es una cima terminal helicoide erecta (encima de las hojas o entre ellas) o péndula. Está formada por un pedúnculo y estructuras modificadas en forma de hoja, llamadas brácteas cincinales, distribuidas a lo largo de un raquis rígido o flexible, en forma dística o espiral con ángulo de inserción variable. Dentro de cada bráctea hay un número variable de flores hermafroditas dispuestas de forma alterna a lo largo de un eje, cada una de ellas protegida por una bráctea floral (Berry, 1991). La estructura exótica y el colorido de las brácteas cincinales de estas inflorescencias constituyen el principal atractivo ornamental de las heliconias, ya que las verdaderas flores y brácteas florales (blancas, verdes o pálidas) solo a veces contribuyen a su valor estético, pero otras son poco vistosas.

4.1.3 Ubicación taxonómica y principales especies

Las Heliconias están agrupadas botánicamente en el orden Zingiberales, este orden lo componen ocho familias: Heliconeaceae, Strelitziaceae, Musaceae, Costaceae, Lowiaceae, Marantaceae, Zingiberaceae Cannaceae. El grupo de plantas pertenecientes a la familia Heliconeaceae se ubicaban en la familia Musaceae, sin embargo, Nakai (1941), las separó como Heliconeaceae. Posteriormente, Kress (1994) propuso un nuevo sistema de clasificación en subgéneros y secciones, basado en características morfológicas, ecológicas y genéticas. Esta familia solo está representada por el género Heliconia y el 98 % se

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encuentran distribuidas en el centro y sur de América y en el Caribe (Maza, 2000). Dentro del género de Heliconia se han descrito más de 250 especies, de las cuales 97 se encuentran distribuidas en Colombia y 48 de estas han sido descritas como endémicas, ubicándolas como el centro de diversidad más grande de este género en el mundo (Berry, 1991). En Colombia, las regiones con mayor número de especies son la Vertiente Occidental Andina, con el 35%; el Valle del Río Atrato, las Vertientes del Río Magdalena y la Región Oriental Andina con un 25% en cada una. Aproximadamente la mitad de las especies que crecen en Colombia son endémicas. Las regiones con mayor proporción de endemismo son la Andina con el 75 % y la Pacífica con el 20 %.Proexport (2003), menciona que las principales especies comerciales de Heliconias en Colombia se encuentran: H. bihai, H. latispatha, H. stricta, H. psittacorum, H. wagneriana, H. caribea, H. rostrata, H. collinsiana, entre otras, como se puede observar en la tabla 1, cabe resaltar que las dos últimas especies mencionadas anteriormente presentan inflorescencia péndula. Tabla 1. Principales especies de Heliconias nativas de Colombia

Nombre científico Región Imagen

Heliconia Golden

VALLE DEL CAUCA

Heliconia stricta

ANTIOQUIA

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Heliconia bihai

QUINDIO

Heliconia orthotricha

QUINDIO

Heliconia wagneriana

RISARALDA

Heliconia caribea

VALLE DEL CAUCA

Heliconia latispatha

CUNDINAMARCA

Fuente: adaptado de Ramírez, 2012

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4.2 FOTOSÍNTESIS 4.2.1 Definición El proceso de fotosíntesis consiste básicamente en la absorción de la energía luminosa y su transformación en energía química (ATP) la cual será utilizada para construir moléculas orgánicas como son polímeros de azúcar de seis carbonos (sacarosa o almidón) a partir de dióxido de carbono, nitratos o bien sulfatos y agua. (Pérez, 2009), para que se lleve a cabo la fotosíntesis necesita de los siguientes

elementos: Sol (energía solar), gas carbónico (CO2) que entra por las estomas de

las hojas, Clorofila, Agua y Sales minerales (absorbidas por las raíces).

4.2.2 Proceso de fotosíntesis La fotosíntesis oxigénica es un mecanismo bioquímico que usa agua, dióxido de carbono del aire (CO2) y luz para formar carbohidratos y liberar oxígeno (O2) a la atmósfera. Este mecanismo es vital para el planeta porque completa el ciclo global de intercambio gaseoso que ocurre entre los seres vivos. Dicho de otro modo, mientras ciertos organismos (como nosotros los humanos) consumen O2 y liberan CO2 a la atmósfera, los organismos fotosintéticos (como plantas, algas y cianobacterias) realizan básicamente el proceso complementario en el que consumen CO2 y liberan O2 a la atmósfera (Almeraya, 2015). Así mismo, este proceso es primordial para todos los organismos vivos ya que consiste en el empleo de la energía lumínica para biosintetizar los componentes celulares, así pues, la energía solar se constituye como fuente energética para las plantas verdes, autótrofos fotosintéticos y organismos heterótrofos (Mota, 2011). Por otra parte, las plantas poseen la capacidad de captación del CO2 atmosférico mediante los procesos fotosintéticos para la obtención de azucares y otros compuestos que requieren para su ciclo vital. En otras palabras, por medio de la fotosíntesis extraen el carbono de la atmosfera en forma de CO2 y lo convierten en biomasa, esta al descomponerse se convierte en parte del suelo en forma de humus a través de la respiración de los microrganismos que procesan la biomasa (Mota, 2011). Los compuestos reducidos de carbono, se utilizan como estructura básica para la incorporación de elementos primordiales como nitrógeno, fosforo y azufre, generando monómeros, organismos simples como aminoácidos, nucleótidos, ácidos grasos y otros carbohidratos más complejos para formar lípidos,

polisacáridos, proteínas y ácidos nucleicos. Wang et al. (2011), mencionan que la

fijación de CO2 requiere mayor carga energética mediante la fotosíntesis, ya que esto se lleva a cabo por una compleja ruta metabólica, como lo es el ciclo de Calvin (véase figura 2).

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Figura 2. Proceso general de la fotosíntesis

Fuente: Autoras, 2018

4.2.3 Conversión de Energía Lumínica a Energía química La fotosíntesis en las plantas ocurre dentro de los orgánulos llamados cloroplastos, que se encuentran en las células de los tejidos verdes y a su vez poseen unos pigmentos que son clorofila (verde), xantofila (amarillo) y carotenoides (anaranjados) capaces de absorber energía luminosa procedente del sol (Almeraya, 2015). La conversión de energía se debe en que las raíces absorben los nutrientes y agua del suelo, en el cual es impulsada hacia arriba para facilitar la caída libre de gotas con mucho más fuerza, así los electrones de la clorofila cuando son excitados por la luz consiguen niveles superiores de energía y facilitan la liberación del exceso de energía para dar inicio a una serie de reacciones químicas que culminan con la síntesis de moléculas de adenosina tri fosfato (ATP) y nicotinamida dinucleotido fosfato (NADPH). Es decir, la energía luminosa se transforma en energía química. Esta fase de la fotosíntesis se conoce como fase luminosa o dependiente de la luz. (Almeraya, 2015). De modo que, este proceso fotosintético ocurre en dos fases: la primera fase es un proceso que depende de la luz (reacciones luminosas o de luz). Esta fase requiere la energía directa de la luz para generar energía química y reductora que serán utilizadas en la segunda fase. La fase independiente de la luz (fase de oscuridad), se realiza cuando los productos

de las reacciones de luz son utilizados para que a partir del CO2, formen enlaces

covalentes carbono-carbono (C-C) de los carbohidratos mediante el Ciclo de Calvin (Mota, 2011). Este fenómeno comprende dos reacciones globales diferenciadas, en la primera se realiza la transducción de energía y en la segunda la reducción y fijación del

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carbono. Este conjunto complejo de dos reacciones ha sido objeto de intensa investigación y ha resultado en la postulación de dos conceptos fundamentales para las reacciones fotoquímicas; el primero se refiere al concepto de unidad fotosintética y el segundo el concepto de dos fotosistemas. De acuerdo al primer concepto en todos los sistemas foto sintetizadores (bacterias, algas verdes unicelulares y plantas) los pigmentos que absorben la luz se dividen en dos grupos, los que absorben y transfieren la energía hacia el centro de reacción y los que conforman este centro que constituyen un tipo particular de moléculas de clorofila (Chl a P700 y Chl a P680) y que llevan a cabo la reacción fotoquímica (Melgarejo, 2010). Cabe señalar que la luz induce una transferencia de electrones sobre la planta, en lo que conlleva la participación de dos fotosistemas llamados (PSI y PSII) los cuales funcionan como maquinaria fotoeléctrica, en este proceso el agua actúa como donador de electrones que pasan por los dos fotosistemas que

provocan reacciones para reducir y fijar el CO2 a moléculas orgánicas y así iniciar

el proceso fotosintético (Melgarejo, 2010). Algunas plantas absorben CO2 atmosférico durante la noche y lo acumulan en vacuolas que luego utilizan durante el día en la producción de CO2, este tipo de plantas se han acondicionado al clima agreste de zonas desérticas y almacenan agua durante el día cuando sus estomas están cerrados (Melgarejo, 2010). Cabe mencionar, que las reacciones bioquímicas se realizan en el estroma del

cloroplasto, la energía almacenada en forma de ATP y NADPH se usa para reducir

el CO2 a carbono orgánico, esta función se lleva a cabo en el ciclo de Calvin, en

este ciclo entra una molécula de CO2 donde primeramente se combina con un

azúcar de carbonos llamados ribulosa 1,5-difosfato para formar dos molecular de tres carbonos (3- fosfoglicerato, luego dos moléculas de gliceraldehido 3- fosfato se combinan para formar glucosa (Salisbury, 2004). 4.2.4 Fase Luminosa Es la primera etapa de la fotosíntesis que convierte la energía solar en energía química y está en ATP, se realiza en orgánulos llamados cloroplastos que contiene clorofilas, estos compuestos están organizados en unidades llamadas tilacoides, en el interior de estos, los pigmentos se disponen en subunidades llamadas fotosistemas conformados por dos complejos cada uno: complejo antena y centro

de reacción (Almeraya, 2015). A su vez, se halla la cadena de transporte de electrones, ATP responsables de la conversión de la energía lumínica en química y de generación del poder reductor NADPH. Concretamente, las moléculas de ATP y NADPH transfieren energía hacia otras moléculas para asegurar la continuación de diferentes eventos bioquímicos. En otras palabras, las moléculas de ATP y NADPH funcionan como medida de cambio al interior de las células, pues por cada evento de transferencia se lleva a cabo una

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reacción química. La mayoría de las moléculas de ATP y NADPH formadas durante

la fase luminosa suministran la energía necesaria para incorporar el CO2 en la

segunda fase de la fotosíntesis, la cual se conoce como fase oscura, ocurre independientemente del estímulo luminoso; es decir, cuando ya se han formado ATP y NADPH (Almeraya, 2015). Esta fase depende de la luz ya que el receptor son cloroplastos de las células vegetales y que son absorbidos por medio de la clorofila, esta energía lumínica descompone el agua en oxígeno e hidrógeno, liberándose dos moléculas por medio del movimiento de sus electrones de un nivel a otro liberando energía para producir

la molécula de ATP y el poder reductor que es la molécula NADPH2 que aportan a

la fase siguiente energía química para la transformación de CO2 en hidratos de

carbono (Ocampo, 2014). Como se ha mencionado, existen dos tipos de reacciones luminosas asociadas a tipos de complejos fotosintéticos: los fotosistemas (I y II) en el PSII, se produce la fotolisis del agua y la liberación de oxígeno; sin embargo, ambos fotosistemas operan en serie, transportando electrones, a través de una cadena transportadora de electrones; mientras que el PSI se transfiere dos electrones a la molécula de NADP+ y se forma NADPH, en el lado de la membrana del tilacoide que mira hacia el estroma externa. Los dos fotosistemas generan protones para la síntesis de energía química en forma de ATP. Así mismo, la Radiación Fotosintéticamente Activa (RFA) regula la actividad de diversas enzimas fotosintéticas en los cloroplastos; dichas enzimas se activan durante el día y disminuyen su actividad en

la oscuridad. Por lo tanto, la producción de carbohidratos a partir de CO2 se

interrumpe durante la noche a causa de la actividad enzimática, además del cierre estomático y de una deficiencia en la producción de ATP y NADPH (Benjumea, 2011). Cabe señalar, que la energía luminosa es atrapada primero en el Fotosistema 2 (PSII) y los electrones son transferidos a un receptor, el vacío que dejan es sustituido en el Fotosistema 2 (PSII) por electrones procedentes de molecular de agua, reacción que va acompañada de liberación de oxígeno. Así mismo, los electrones recorren una cadena de transporte que los conduce al Fotosistema 1 (PSI) y en el curso de este fenómeno se genera un ATP rico en energía. La luz es atraída por el Fotosistema PSI pasa a su centro de reacción y los electrones energéticos son transferidos a su aceptor (Gonzales, 2009). Por tanto, la membrana tilacoide es responsable de la captación de la energía lumínica gracias a la presencia de clorofilas y de otros pigmentos que están asociados a estos fotosistemas como se aprecia en la figura 3.

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Figura 3. Procesos de captación de energía lumínica mediante la intervención de reacciones del fotosistema II (PSII), fotosistema I (PSI) y el transporte electrónico de electrones

Fuente: Autoras, 2018

En resumen, la fase luminosa consta de cuatro etapas en la conversión de energía solar a energía química en la cual:

- La etapa 1, Foto excitación de la Clorofila: La luz, llega inicialmente en forma de paquetes llamados Fotones al complejo antena del fotosistema II ,pasando posteriormente al centro de reacción, liberando este último 2 electrones, los cuales se van a ir la cadena transportadora de electrones; lo mismo va a ocurrir con el fotosistema I, llega los fotones, se transmiten a lo largo del complejo antena y cuando llegan al centro de reacción, este último libera dos electrones que se van a la cadena transportadora de electrones, donde empiezan a saltar (Benjumea, 2011).

- Etapa 2 Foto Reducción del NADP+: En esta etapa, los electrones liberados por la cadena transportadora del fotosistema I, son recogidos por el NADP+, el cual viene oxidado y se reduce a NADPH (Benjumea, 2011).

- Etapa 3 Fotólisis del agua: Se rompe la molécula de agua, por acción de la

energía lumínica. En la fotolisis se obtiene H2 + ½ O2

- Etapa 4 Fotofosforilación del ATP: Los electrones perdidos por el fotosistema I son sustituidos por los enviados por la cadena de transporte de electrones del fotosistema II. La reacción en presencia de luz termina con el almacenamiento de

la energía producida en forma de ATP y NADPH2 (Benjumea, 2011).

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4.2.5 Fase Oscura

Es la fase independiente de la luz y las moléculas formadas en la fase luminosa

(ATP y NADPH2), participa en la reducción del dióxido de carbono (CO2) mediante

una serie de reacciones en el “Ciclo de Calvin”. Este fenómeno acontece en el estroma o matriz del cloroplasto como se muestra en la figura 4 allí se encuentran

las enzimas necesarias que catalizan la conversión de dióxido de carbono (CO2) en

glucosa utilizando los protones aportados por la coenzima NADPH más la energía del ATP (Ocampo, 2014). La fuente de carbono empleada es el dióxido de carbono, mientras que como fuente de nitrógeno se utilizan los nitratos y nitritos y como fuente de azufre, los sulfatos (Heldt, 2004). Figura 4. Proceso de fijación de CO2, tiene lugar en el estroma del cloroplasto.

Fuente: Neyoy Siari, 2012

En primer lugar, se produce la fijación del dióxido de carbono que comienza con la fase de carboxilación. En el estroma del cloroplasto, el dióxido de carbono atmosférico se une a la pentosa ribulosa-1,5- bisfosfato, gracias a la enzima RubisCO y origina un compuesto inestable de seis carbonos, que se descompone en dos moléculas de ácido-3-fosfoglicérico, se trata de moléculas constituidas por tres átomos de carbono, por lo que las plantas que siguen esta vía metabólica se llaman C3. Si bien, muchas especies vegetales tropicales que crecen en zonas desérticas, modifican el ciclo de tal manera que el primer producto fotosintético no es una molécula de tres átomos de carbono, sino de cuatro (un ácido dicarboxílico) constituyéndose un método alternativo denominado vía de la C4, al igual que este tipo de plantas con orden se produce la reducción del dióxido de carbono fijado. Por medio del consumo de ATP y del NADPH obtenidos en la fase luminosa, el ácido

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3-fosfoglicérico se reduce a gliceraldehído 3- fosfato. Así mismo, este puede seguir dos vías, consistiendo la primera de ellas en regenerar la ribulosa 1-5-difosfato o bien, servir para realizar otro tipo de biosíntesis: el que se queda en el estroma del cloroplasto comienza la síntesis de aminoácidos, ácidos grasos y almidón. Seguidamente, el que pasa al citosol origina la glucosa y la fructosa, que al combinarse generan la sacarosa (azúcar característico de la savia) mediante un proceso parecido al glucólisis en sentido inverso. Pérez (2009), reporta que la regeneración de la ribulosa-1,5-difosfato se lleva a cabo a partir del gliceraldehído 3-fosfato, por medio de un proceso complejo donde se suceden compuestos de cuatro, cinco y siete carbonos, semejante a ciclo de las pentosas fosfato en sentido inverso (en el ciclo de Calvin, por cada molécula de dióxido de carbono que se incorpora se requieren dos de NADPH y tres de ATP) ver figura 5. Figura 5. Esquema representativo de las tres etapas del ciclo del Calvin o fase independiente de luz.

Fuente: http://mabydg.blogspot.com/2007/11/fotosintesis.html

4.2.6 Fotorespiración

Es el proceso mediante el cual las plantas iluminadas utilizan el oxígeno (O2) y

producen dióxido de carbono (CO2), para realizar dicho proceso necesita consumir energía. Además de esto, se podría tratar de un mecanismo de protección del aparato fotosintético frente a la fotooxidación en condiciones de alta iluminación,

bajas concentraciones de CO2 y elevadas de O2 (Pérez, 2009). Así pues, las plantas

realizan fotosíntesis con el objetivo de almacenar la energía solar en compuesto orgánico altamente energético, por esto, las plantas fijan el dióxido de carbono del

aire y liberan oxígeno. Sin embargo; la fotorrespiración es el lado contrario, es decir,

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consume O2 y genera CO2 como lo menciona (Pérez, 2009). Este fenómeno que hace parte de la fotosíntesis consume parte del ATP y el NADPH originados en la

fase luminosa, y el CO2 generado permanece dentro de la hoja ya que es capturado

por las eficientes reacciones fotosintéticas dentro de los cloroplastos. Inicialmente, cuando existe abundante dióxido de carbono, la enzima RubisCO (mediante su actividad como carboxilasa) introduce el compuesto químico en el ciclo de Calvin con gran eficacia. Pero cuando la concentración de dióxido de carbono en la hoja es considerablemente inferior en comparación a la de oxígeno, la misma enzima es la encargada de catalizar la reacción de la RubisCO con el oxígeno (mediante su actividad como oxigenasa), en lugar del dióxido de carbono. Esta reacción es considerada la primera fase del proceso fotorrespiratorio, en el que los glúcidos se oxidan a dióxido de carbono y agua en presencia de luz. Además, este proceso supone una pérdida energética notable al no generarse ni NADH ni ATP principal rasgo que lo diferencia de la respiración mitocondrial (Lallana, 2003). Cuando una molécula de RubisCO reacciona con una de oxígeno, se origina una molécula de ácido fosfogliceraldehido y otra de ácido fosfoglicólico, que prontamente se hidroliza a ácido glicólico. Este último sale de los cloroplastos para posteriormente introducirse en los peroxisomas (orgánulos que albergan enzimas oxidativos), lugar en el que vuelve a reaccionar con oxígeno para producir ácido glioxílico y peróxido de hidrógeno (la acción de la enzima catalasa catalizará la descomposición de este compuesto químico en oxígeno y agua). Sin embargo, el ácido glioxílico se transforma en glicina, aminoácido que se traspasa a la mitocondria para formarse una molécula de serina a partir de dos de ácido glioxílico este proceso conlleva la liberación de una molécula de dióxido de carbono (Lallana, 2003) como se representa en la figura 6. Figura 6. Procesos de fotorrespiración y ciclo de Calvin cuando dependen de la molécula gaseosa que reacciona con la enzima RubisCO

Fuente: Almeraya, 2015.

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4.2.7 Características generales de los pigmentos fotosintéticos Los pigmentos fotosintéticos son la base fundamental en los procesos fisiológicos de las plantas; existen dos pigmentos principales las clorofilas a y b (verdes) estas son moléculas con una gran capacidad de absorber los fotones de la energía lumínica y así facilitar el proceso fotosintético, es decir, sustancias capaces de captar energía lumínica y de transformarla en energía química mediante la fotosíntesis. Estos pigmentos se constituyen en estructuras captadoras de luz denominadas antenas, establecidos por pigmentos unidos en proteínas y que a su vez están conectados a fotosistemas PSI y PSII a través de un centro de reacción que contiene los aceptores y transportadores de electrones necesarios para así llevar los electrones excitados por los fotones absorbidos hasta sus finales aceptores, las moléculas de NADP oxidado que pasara a NADPH reducido como los describe (Manrique, 2003). Las clorofilas son los pigmentos de mayor importancia, ya que son moléculas cromóforas que intervienen directamente en el proceso de absorción y conversión de la energía luminosa, en este se pueden clasificar en dos clorofilas a y clorofila b, se ubican en las membranas tilacoidales, su color es verde- amarillo. Estas moléculas están constituidas por estructuras policiclicas planas, formados por cuatro anillos pirrolicos cíclicos con un anillo de ciclopentanona fusionado al pirrol III, donde se encuentran los cuatro átomos de nitrógeno que posee cuatro anillos ligados a un átomo de Mg+2, como se muestra en la figura 7. También, tiene una cadena terpenoide constituida por el alcohol fitol, esterificado en el cuarto anillo,

este alcohol de 20 átomos de carbono con un doble enlace (C20 H39 OH) confiere

a la molécula la característica de ser altamente hidrofóbica el cual le otorga la propiedad de unirse a los dominios apolares de las proteínas que anclan el sistema a la membrana tilacoidal como lo menciona (Rosas, 2007). Figura 7. Estructuras moleculares de los pigmentos de clorofila a y b

Fuente: Raven, 2007

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4.3 HONGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES (HMA) 4.3.1 Generalidades La microbiota del suelo juega un papel fundamental en la regulación de los ecosistemas terrestres, influyendo en la productividad, diversidad y estructura de las comunidades vegetales (Van Der Heijden et al. 2008). La materia orgánica es descompuesta por la actividad de diferentes especies de bacterias y hongos que liberan los nutrientes al suelo, dejándolos disponibles para que sean nuevamente absorbidos por las plantas. La absorción puede ser directa a través de las raíces o indirecta a través de los microorganismos que forman simbiosis con las raíces (hongos formadores de micorrizas). Las micorrizas de tipo arbusculares representan entre el 5 a 50% de la biomasa de los microbios del suelo y son considerados como una comunidad biológica diversa y activa esencial para incrementar la sostenibilidad de los agroecosistemas, representando las simbiosis de mayor relevancia en los sistemas agroecológicos. Los hongos formadores de micorrizas arbusculares (HMA), son asociaciones ecológicamente mutualistas entre hongos del phyllum Glomeromycota y el 80% de las plantas de las plantas (cultivadas y silvestres). Se trata de una simbiosis prácticamente universal, no sólo porque casi todas las especies vegetales son susceptibles de ser micorrizadas sino también porque puede estar presente en la mayoría de los hábitats naturales. Así mismo, estos microorganismos del suelo que forman simbiosis con el 80% de las plantas terrestres, pueden formar arbúsculos, vesículas (en algunas especies) e hifa (micelio interno), dentro de las células corticales de las plantas que colonizan (González, 2004). Su distribución además de amplia, se encuentran en todos los ecosistemas y suelos, puede ser muy heterogénea en un mismo sitio en cuanto a variedad y cantidad, lo que es un requisito importante para que la planta obtenga el máximo beneficio de la asociación. Esta asociación simbiótica entre el hongo y la planta, actúa como un complemento de la raíz de la planta en la toma de nutrientes, especialmente en la absorción de fósforo, aumento de la tolerancia a condiciones de estrés abiótico, mejoramiento de la calidad del suelo, fijación de nitrógeno y aumento en la diversidad y productividad de las plantas en un ecosistema determinado (Van der Heijden et al., 1998). Por otro lado, desde el punto de vista nutricional, el crecimiento de la planta es debido al aumento en la absorción de fósforo ya que este es el principal beneficio que obtiene del HMA. Sin embargo, si el fósforo no es un elemento limitante en el suelo, la simbiosis puede llegar a ser reducida o hasta inhibida si se encuentran altos niveles en el suelo. También es importante mencionar que los HMA permite a la planta usar de manera más eficiente los nutrientes del suelo, razón por la cual se pueden reducir los problemas de contaminación debido al exceso de fertilizantes químicos (Blanco y Salas, 1997). Los hongos micorrízicos arbusculares (HMA), se

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caracterizan por presentar una morfología específica en su crecimiento intracelular e intercelular en la corteza de la raíz y por formar dos tipos de estructuras, arbúsculos y vesículas. La importancia de los HMA en la agricultura radica en que por su extenso micelio extra radical, se forma un vínculo entre la planta y el suelo debido a que al darse la asociación planta-hongo, las plantas micorrizadas presentan ventajas en cuanto a la absorción de nutrientes de poca movilidad (como el fósforo) con respecto a las plantas no micorrizadas, ya que en las primeras el micelio externo se extiende a una mayor distancia en el suelo que los pelos radicales de las plantas no micorrizadas (Blanco y Salas, 1997). 4.3.2 Clasificación taxonómica Los hongos micorrízicos arbusculares se clasifican en nueve familias; hasta el momento se han descrito a nivel mundial alrededor de 200 especies. Tabla 2. Clasificación actual de los hongos micorrízicos arbusculares

Fuente: Adaptado de Schübler et al., (2001).

4.3.3 Mecanismos y proceso de micorrización Son diferentes etapas las que abarcan el proceso de micorrización en de una planta iniciando desde la raíz, además para los diferentes tipos de micorriza que existen se da el mismo proceso (véase figura 8).

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Figura 8. Proceso de colonización y micorrización en plantas

Fuente: Ramos, 2010

ETAPA PRIMERA: Se produce la diferenciación de la espora, propagación del hongo e identificación mutua entre la planta y el hongo, y viceversa, en la rizosfera, o en regiones próximas a las raíces nutricias o pelos radicales. Este reconocimiento lo facilitan, al parecer, sustancias exudadas o emitidas por la raíz, que provocan el crecimiento del micelio y un biotropismo positivo del mismo hacia la raíz, al igual que ocurre con las interacciones planta – microorganismo con especies de los géneros Rhizobium. (Ramos, 2010). ETAPA SEGUNDA: Consiste en el acercamiento y acoplamiento progresivo y gradual del micelio y la raicilla produciéndose el contacto intercelular, al formarse una estructura que adhesiona ambos especímenes. (Ramos, 2010). ETAPA TERCERA: Se realiza la colonización, produciéndose cambios morfológicos y estructurales tanto en los tejidos colonizados por el hongo, como en la organización de la pared celular de la raíz. Posteriormente se produce la integración fisiológica de ambos simbiontes (hongo-raíz), y por último se produce una alteración de las actividades enzimáticas, que se coordinan entre los simbiontes para integrar sus procesos metabólicos. De todas formas, la forma en la que se producen estos cambios fisiológicos es diferente en endomicorrizas que en ectomicorrizas, ya que en ectomicorrizas las hifas solo entran en las células corticales por el espacio intercelular, mientras que en endomicorrizas algunas hifas entran dentro de algunas células corticales, formando arbúsculos y/o vesículas. (Ramos, 2010). Este proceso de asociación para formar Micorrizas, provoca alteraciones morfológicas y anatómicas en las plantas colonizadas tales como: cambios en la relación tallo raíz, en la estructura de los tejidos radicales, en el número de

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cloroplastos, aumento de la lignificación, alteración de los balances hormonales, etc. Efectos que no son sólo explicables, como una simple mejora nutritiva de la planta, debido al aumento de eficacia en la absorción de nutrientes por la raíz, gracias a la formación de la Micorriza, sino que, responde a cambios metabólicos más profundos y complejos, debidos a la integración fisiológica de los simbiontes (Ramos, 2010).

4.3.4 Simbiosis Micorrízica en la familia Heliconeaceae. Los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) se caracterizan por presentar un crecimiento intra e intercelular en la corteza de la raíz, llamado morfología Paris y Arum respectivamente como se evidencia en la Figura 9 formando dos tipos de estructuras: arbúsculos y vesículas. Los arbúsculos son hifas que se dividen dicotómicamente, son invaginados por la membrana plasmática de las células corticales y presentan periodos de vida cortos, mientras que las vesículas son estructuras de almacenamiento que se forman en la parte terminal de las hifas. Los géneros Gigaspora y Scutellospora no producen vesículas, en lugar de ellas forman células auxiliares (Peterson, 2004).

Figura 9. Tipos de asociación micorrízica arbuscular.

a) Tipo Arum, caracterizado por hifas que crecen de forma intercelular (cabeza de flecha). b) Tipo Paris, caracterizado por hifas con crecimiento intracelular (cabeza de flecha). Se aprecian vesículas (v); el apresorio (A); hifas (flechas) y arbúsculos (dos cabezas de flechas). Fuente. Rocha, 2009

Las hifas externas pueden ser de tres tipos según su morfología y las funciones que llevan a cabo: las hifas infectivas, son las que inician los puntos de colonización en una o varias raíces; las hifas absorbentes son las que se encargan de explorar el suelo para la extracción de nutrientes y las hifas fértiles son las que llevan las esporas. (International Culture Collection of Vesicular Arbuscular Mycorrhizal Fungi; http://invam.caf. wvu.edu/.).

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En la figura 9, se puede apreciar dos tipos morfológicos de colonización: el tipo “Arum” donde las hifas presentan crecimiento intercelular y los arbúsculos se encuentran dentro de las células corticales de la raíz; y el tipo “Paris” en el cual las hifas presentan crecimiento intracelular al igual que los arbúsculos, pero forman enrollamientos cuando están dentro de la célula (Barker, 1998). El crecimiento del hongo de manera asimbiótica se da entre una o dos semanas hasta que hace contacto con la raíz del hospedero, formando una estructura llamada apresorio por donde ingresa las hifas a las células corticales de la raíz, para formar los arbúsculos e incrementar el área de contacto entre la planta y el hongo (Bago, 2000). Cuando las plantas son invadidas por microorganismos del suelo, se inician una serie de cambios fisiológicos y bioquímicos que no ocurren cuando un HMA coloniza la planta, esto soporta la hipótesis de que el hongo emite señales que reconoce la planta para que esta no inicie una reacción de defensa (Gadkar, 2001). Adicionalmente, la planta también libera compuestos de naturaleza volátil o difusible (exudados) que estimulan el crecimiento de la hifa en diferentes puntos de control mientras se da la colonización fúngica (Gadkar, 2001). Según Elias y Safir (1987), la estimulación de los exudados sobre la elongación hifal es mayor en plantas deficientes en fósforo (P). En resultados obtenidos por ellos, se presentaron grandes diferencias en cuanto al crecimiento hifal en plantas con ausencia de este elemento a las dos semanas de iniciado el experimento, lo que sugiere que la acción estimulante sobre el crecimiento hifal se debe a la calidad de los exudados de las plantas desprovistas de P más que a la cantidad liberada, debido a que en este tiempo la longitud del sistema radical y la cantidad de exudados tanto de plantas deficientes y no deficientes en P fue similar.

4.3.5 Influencia de las micorrizas arbusculares en la absorción de nutrientes

por la planta. Uno de los nutrimentos que más se ha estudiado en relación con su absorción mediada por micorrizas arbusculares, es el fósforo (Yong- Guan et al., 2003), debido a que las plantas lo requieren en relativamente grandes cantidades, pero que también se encuentra en concentraciones muy bajas en la solución del suelo. La razón principal para este fenómeno, es que los iones de fosfato inorgánico se unen rápidamente a coloides del suelo o se fijan como sales de fierro o aluminio volviéndose relativamente inmóviles además de que una gran proporción del fósforo inorgánico total está normalmente en forma insoluble, no disponible fácilmente para las plantas. Además, En los ecosistemas y agroecosistemas, los HMA, son de gran importancia debido a que mediante la simbiosis las plantas pueden obtener nutrientes minerales

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del suelo, mejorar su tolerancia a estreses bióticos y abióticos, reducir competencia entre plantas mediante la transferencia de carbono a través de la red de hifas extraradical (Simard et al., 1997; Simard y Durall, 2004) y modular la diversidad y productividad de plantas (van der heijden et al., 1998). Los beneficios de la simbiosis en el hospedero se observan en supervivencia, productividad (cantidad y calidad) (Goverde et al., 2000), morfología de planta y capacidad reproductiva (Xiaohong y Koide, 1994). Diferencias en crecimiento micelial y estrategias de toma de fósforo observadas entre especies de HMA pueden jugar un papel importante (Smith et al., 2000), y podría incluso significar que una amplia diversidad de HMA, puede estar relacionada con un incremento en la eficiencia de extracción de nutrientes y por lo tanto en los beneficios al hospedero (KerNaghan, 2005) y explicaría la presencia de diversos HFMA en suelos y en raíces (LODGE, 2000). La fisiología de la planta micorrizada cambia completamente cuando se asocia al hongo. Mediante el micelio externo, el contacto entre las raíces y el medio se incrementa considerablemente. Las inoculaciones con hongos formadores de micorrizas son conocidos por incrementar el crecimiento de muchas especies de plantas. Es atribuido un incremento en la toma de nutrientes, especialmente los de difusión limitada tales como: P, Zn, Cu, etc.; producción de sustancias promotoras de crecimientos, tolerancia a estrés hídricos; salinidad, estrés por trasplante; resistencia a plantas por fitopatógenos e interacción sinérgica con otros microorganismos benéficos del suelo (Azcón y Barea, 1996; Boby, et al; 2008). Las plantas micorrizadas crecen mejor que las no micorrizadas en suelos infértiles, por producir un incremento en la nutrición mineral a través de las hifas, quienes ayudan a explorar un mayor volumen de suelo que los pelos radiculares de las mismas plantas (Rajan et al., 2000). El incremento en la nutrición mineral aumenta los contenidos de clorofilas y como consecuencia una alta tasa fotosintética (Bian et al., 2001; Feng et al., 2002). Los HMA interactúan con una amplia diversidad de microorganismos del suelo en las raíces, en la rizosfera y en la masa del suelo. La interacción puede inhibir o estimular, aunque estos hongos no pueden fijar biológicamente el nitrógeno atmosférico, incrementan la fijación de este compuesto porque interactúan positivamente con los fijadores de nitrógenos (Barea et al., 1992). Combinación de inoculación de hongos micorrízicos con microorganismos solubilizadores de fosfatos produce una mayor absorción de nitrógeno y fósforo e incrementa la producción de las plantas en suelos deficientes con nutrientes (Singh y Kapoor, 1999).

4.4 METALES PESADOS El concepto de metal pesado hace referencia a cualquier elemento químico metálico que tenga una relativa densidad e incluso ser tóxico en concentraciones

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mínimas. Los ejemplos de metales pesados incluyen el mercurio (Hg), cadmio (Cd), arsénico (As), cromo (Cr), talio (Ti), plomo (Pb), entre otros. (Lucho et al., 2005a). Estos metales pesados son un grupo de elementos de prioridad sanitaria, debido a su alta toxicidad sobre la mayoría de los organismos, y su ubicuidad ya que pueden bioacumularse en diferentes cultivos y a través de las cadenas tróficas en ecosistemas acuáticos y terrestres (Salomons, 1995). Este fenómeno, significa un aumento en la concentración de un producto químico en un organismo vivo en cierto plazo de tiempo, comparada a la concentración de dicho producto químico en el ambiente. (Angelova et al., 2004). Sin embargo, se pueden encontrar generalmente como componentes naturales de la corteza terrestre, en forma de minerales, sales u otros compuestos en el cual no pueden ser degradados o destruidos fácilmente de forma natural o biológica ya que no tienen funciones metabólicas específicas para los seres vivos (Abollino et al.,2002). En los suelos se pueden encontrar diferentes metales, que forman parte de los minerales como son silicio (Si), aluminio (Al), hierro (Fe), calcio (Ca), sodio (Na), potasio (K), magnesio (Mg) y manganeso (Mn); algunos de estos metales son esenciales en la nutrición de las plantas ya que son indispensables en el fotosistema y activación de algunas enzimas para el metabolismo vegetal (Prieto et al., 2009). No obstante, existen metales pesados como plomo, cadmio, cromo, mercurio, zinc, cobre, y la plata que constituyen un grupo de gran importancia ya que algunos de ellos son esenciales para las células, pero en grandes concentraciones pueden resultar tóxicos para los seres vivos, organismos del suelo, plantas, animales y el hombre (Spain, 2003). Por otro lado, el movimiento de los metales de manera general se da desde el suelo a la raíz y posteriormente a través de las membranas de las células corticales de ahí a la xilema y finalmente desde las hojas al floema como lo menciona (Acevedo et al., 2005) figura 10 cabe resaltar que dependiendo del metal pesado en cuestión pues no todos siguen la misma ruta. Otro mecanismo de ingreso de sustancias potencialmente tóxicas para la planta, ocurre a nivel foliar, dependiendo de la morfología y tasa de respiración de la planta que permite su ingreso a partir de su acumulación y la variación en los gradientes de concentración.

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Figura 10. Interacción de contaminantes metálicos en suelos agrícolas y plantas.

Fuente: Adaptado de Velásquez, 2017

4.4.1 Cadmio El cadmio (Cd) es un metal que forma parte del grupo IIB de la tabla periódica, es un elemento metálico blanco plateado que se puede moldear fácilmente (Ganiveth et al., 2008). Este metal es considerado el más móvil en el ambiente acuático y una de sus principales características es que es bioacumulativo y persistente en el ambiente, se encuentra en aguas superficiales y subterráneas (Ganiveth et al., 2008). Cabe mencionar que este metal pesado también tiende acumularse en la superficie de los suelos (Sánchez et al., 2009). Así mismo, es un contaminante metálico altamente tóxico que no tiene ningún uso metabólico. Es un oligoelemento con una vida media biológica larga. Su nivel ha aumentado enormemente en los últimos tiempos en el medio natural y agrícola principalmente a través de la actividad industrial, combustión de combustibles fósiles, efluentes municipales y aplicación de pesticidas y fertilizantes fosfatados al agro suelo. El cadmio es absorbido por la raíz y translocado a diferentes partes de la planta. Además, el suelo cargado con una concentración excesiva de cadmio inhibe la germinación de las semillas, el desarrollo del nivel de las enzimas vegetales y el crecimiento de las raíces. La toxicidad del cadmio también conduce al estrés hídrico y a la absorción restringida de nutrientes esenciales.

4.4.2 Fuentes de contaminación El cadmio es un elemento no esencial y poco abundante en la corteza terrestre y a

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bajas concentraciones puede ser tóxico para todos los organismos vivos. La contaminación ambiental por cadmio ha aumentado como consecuencia del incremento de la actividad industrial afectando de forma progresiva a los diferentes ecosistemas. Entre los factores antropogénicos de contaminación de cadmio están:

Emisiones atmosféricas. Se originan a partir de las minas metalúrgicas, ya que el cadmio se extrae como subproducto del Pb, Zn, Cu y otros metales, las incineradoras municipales, y emisiones industriales procedentes de la producción de pigmentos para cristales, anticorrosivos, baterías de Ni/Cd, e insecticidas (McLaughlin y Singh, 1999).

Depósitos directos. El uso de fertilizantes fosfatados es la principal fuente de contaminación de Cd en suelos agrícolas. Otra fuente de Cd la constituyen los fangos procedentes de aguas residuales que se utilizan en agricultura (Alloway y Steinnes, 1999).

Contaminación accidental. Ocurre eventualmente debido a la contaminación de tierras por procesos industriales, residuos de la minería y corrosión de estructuras galvanizadas (véase figura 11). (Aguilar et al., 2003).

Diversas actividades Industriales fuentes de Cd: Productos y aguas residuales de galvanoplastia y fabricación de baterías. Figura 11. Imágenes representativas de las fuentes de contaminación por Cadmio

Fuente: Guerra y Muñoz, 2018

4.4.3 Ingreso del cadmio en la cadena trófica

Químicamente, el cadmio se puede encontrar disuelto en el agua contenida en el suelo, adsorbido en superficies orgánicas e inorgánicas, formando parte de minerales, precipitado con otros compuestos del suelo o incorporado a estructuras

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biológicas. Sin embargo, la biodisponibilidad del cadmio para la planta depende de numerosos factores físicos, químicos y biológicos que modifican su solubilidad y el estado del metal en el suelo. Uno de los principales factores es el pH del suelo, el potencial redox, la temperatura y el contenido en arcillas, materia orgánica, y agua como lo menciona (Christensen y Haung 1999). Así mismo, es importante destacar el tipo de cultivo del que se trate, ya que no todas las plantas acumulan cadmio en igual medida. En la figura 12 se muestra la capacidad para acumular cadmio de distintas especies vegetales de interés agrícola.

Figura 12. Acumulación del cadmio en cultivos vegetales de interés agrícola. Fuente: Adaptado de Serrano et al, 2008

4.4.4 Mecanismo de transporte y acumulación de cadmio En algunos trabajos de investigación han sido predestinados a aclarar la entrada de cadmio en las plantas, en cual destacan la existencia de una competencia de cationes esenciales como el Zn2+ y el Ca2+ por la entrada a la planta (Aravind y Prasad, 2005) Por tanto, se considera que el Cd es un metal no esencial se asume que no existen mecanismos de entrada específicos para el cadmio. Dentro de los mecanismos para la incorporación del metal, están las proteínas responsables de la entrada de cadmio a la célula, en la que se destaca el transportador específico de calcio LCT1 (Clemens et al. 1998), y la proteína IRT1, perteneciente a la familia de transportadores de Zn y Fe (ZIP) (Colanguelo, 2000). Otra familia de transportadores implicados es la Nramp, localizada en la membrana de la vacuola, por lo que probablemente tenga una función en la movilización del metal y no en el

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ingreso del mismo a la raíz (Thomine et al. 2003). Una vez dentro de la célula el cadmio puede coordinarse con ligandos de S como glutatión (GSH) o fitoquelatinas (PCs) y ácidos orgánicos como el citrato (Clemens 2006; Domínguez-Solís et al. 2004). Otras posibles moléculas responsables de la quelación del cadmio son pequeñas proteínas ricas en cisteína denominadas metalotioneínas (MTs). De esta forma, los complejos Cd-ligando pueden ser transportados al interior de la vacuola o a otras células (Shah, 2007). En la planta, el cadmio se acumula preferentemente en la raíz secuestrado en la vacuola de las células, y sólo una pequeña parte es transportada a la parte aérea de la planta concentrándose en orden decreciente en tallos, hojas, frutos y semillas (Chan y Hale 2004). Una vez en la raíz, el cadmio puede pasar la xilema a través del apoplasto y/o a través del simplasto formando complejos (Clemens et al 2002). En la figura 12 se muestra un esquema del ingreso del cadmio a través de las células de la raíz, hasta llegar a la xilema.

4.4.5 Toxicidad de metales pesados en plantas

La toxicidad puede resultar de la unión de metales a grupos sulfhídricos en proteínas, conduciendo a una inhibición de actividades o defectos en la formación de la estructura de las células, o desplazando un elemento esencial dando como resultado deficiencias en el metabolismo de las plantas. Además, el exceso de metales pesados puede estimular la formación de especies reactivas con oxígeno, resultando en estrés oxidativo, las plantas tienen diversos mecanismos potenciales a nivel celular que pueden estar involucrados en la detoxificación y de esta manera en a la tolerancia a metales pesados. (Dietz, 1972). Sin embargo, los efectos tóxicos del cadmio sobre las plantas, han sido ampliamente estudiados (Sanitá di Toppi, 1999) de manera que, los mecanismos de su toxicidad aún no se conocen completamente. En general el Cd interfiere en la entrada, transporte y utilización de elementos esenciales (Ca, Mg, P y K) y del agua, provocando desequilibrios nutricionales e hídricos en la planta (Sandalio et al. 2001) El Cd también reduce la absorción de nitratos y el transporte de los mismos de la raíz al tallo, además de inhibir la actividad nitrato reductasa en tallos (Gouia et al. 2000). Las plantas expuestas a suelos contaminados con cadmio presentan modificaciones en la apertura estomática, fotosíntesis y transpiración (Sandalio et al. 2001). Uno de los síntomas más extendidos de la toxicidad por cadmio es la clorosis producida por una deficiencia en hierro (Benavides et al. 2005), fosfatos o por la reducción del transporte de Mn (Goldbol y Hutterman 1985). El tratamiento con cadmio produce reducción de la actividad ATPasa de la membrana plasmática, (Astolfi et al., 2005), alteraciones en la funcionalidad de la membrana plasmática (Sandalio et al., 2001) y desequilibrios en el metabolismo del cloroplasto, inhibiendo la síntesis de clorofila y reduciendo la actividad de enzimas implicadas en la fijación de CO2 (Astolfi et al., 2005).La toxicidad por metales

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pesados se debe en parte al estrés oxidativo producido por las especies de oxígeno reactivo (ROS) generadas a través de diferentes mecanismos dependiendo del metal de que se trate (Sandalio et al., 2001). Los cationes metálicos Cd2+ y Pb2+ no experimentan cambios redox y, por lo tanto, a diferencia del Fe2+ o Cu2+, no actúan directamente en la generación de ROS. Sin embargo, pueden actuar como per oxidantes a través de la reducción del contenido de GSH, necesario para la síntesis de PCs, disminuyendo así su disponibilidad para la defensa antioxidante (Pinto et al. 2003). El estrés oxidativo producido por el cadmio se manifiesta por daños oxidativos a membranas tales como peroxidación lipídica (Lozano- Rodríguez et al. 1997) y también se han descrito daños oxidativos a proteínas por formación de grupos carbonilo. Las actividades de las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa (SOD), glutation reductasa (GR), ascorbato peroxidasa (APX), peroxidasas (POD) y la catalasa (CAT), encargadas de la defensa celular frente a las ROS, experimentan reducciones o incremento de su actividad en función de la concentración de cadmio incluida en el medio de crecimiento, la duración del tratamiento, el tipo de tejido y la especie vegetal de que se trate (Sandalio et al. 2001). En la figura 13 se muestra un esquema que resume la respuesta al Cd de la planta, teniendo en cuenta los resultados obtenidos por distintos autores (Romero et al.

2004). Según este esquema, el Cd podría inducir la NADPH oxidasa de membrana

y las ROS que se formarían (O2- y H2O2) podrían intervenir en la lignificación de la pared celular que actúa como barrera de entrada del metal (Sanitá di Topi 1999). Las ROS pueden ser eliminadas por los sistemas antioxidantes, pero cuando la intensidad y duración del tratamiento superan la barrera antioxidante, se produce un exceso de ROS que se traduce en daños oxidativos a membranas y proteínas. Los daños a membranas van acompañados de un incremento en la síntesis de

etileno y jasmónico (JA), que junto con el H2O2 van a regular la expresión de un

gran número de proteínas de defensa (HSPs, quitinasa o antioxidantes, entre otras). Recientemente se ha demostrado un importante papel regulador del NO en distintos procesos de desarrollo en vegetales (véase figura 14), (Rodríguez et al. 2006). El papel de esta molécula está siendo estudiado y parece ser que el Cd reduce considerablemente la acumulación de NO en tratamientos largos, si bien no se conocen los mecanismos implicados en este proceso (Rodríguez et al. 2006).

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Figura 13. Representación esquemática de los mecanismos de absorción translocación del Cd en raíces.

Fuente: Nazar, 2012

Figura 14. Esquema de la respuesta celular al cadmio: producción de ROS, daños oxidativos y señalización.

Fuente: Serrano, 2008.

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4.4.6 Acumulación del cadmio en plantas

La acumulación del metal en la planta depende de la capacidad de entrada del mismo y de la existencia de sitios de unión dentro de las células. En cualquier caso, la concentración y afinidad de las moléculas quelantes de metales, así como a la selectividad de los transportadores, afectan a la acumulación del metal dentro de la planta. Las estrategias para evitar la toxicidad del metal son diversas. La primera barrera frente al Cd, se localiza a nivel de la raíz, mediante la inmovilización del metal por medio de la pared celular y carbohidratos extracelulares como son el mucilago y calosa (Rodríguez et al. 2006). Los iones Cd parecen ser inmovilizados en la molécula de pectina y grupos histidina de la pared celular. Sin embargo, la importancia de estos mecanismos puede variar en función de la concentración de cadmio suministrada, del tiempo de exposición, de la especie vegetal, etc. Por tanto, la prevención de la entrada de Cd al citoplasma a la célula a través de la membrana plasmática es a través de la exclusión de los cationes de la pared celular. Otro mecanismo utilizado por algunas plantas consiste en la acumulación del metal en los tricomas de la superficie foliar, como ocurre en Brassia (Salt y col., 1995ª). 4.4.7 Hiperacumulación y Fitoextracción de cadmio

Las plantas hiperacumuladoras son, en muchos casos, endémicas de suelos ricos en metales pesados. El contenido en Cd de estas plantas es aproximadamente 100 veces superior al de plantas no hiperacumuladoras cultivadas en las mismas condiciones (Brooks 1998). La mayoría de estas plantas pertenecen a los géneros Thlaspi, Silene o Arabidopsis. Los mecanismos responsables de la hiperacumulacion pueden variar dependiendo de la especie, por ejemplo. En Thlaspi caerulescens la hiperacumulacion de Cd y Zn se debe a una estimulación del transporte de los metales a la raíz y alteración del transporte intracelular con disminución de la acumulación del metal en la vacuola y aumento del transporte a la parte aérea (Shah, 2007). Diferentes autores han propuesto aprovechar la característica inusual de estas plantas para la limpieza de terrenos contaminados (Shah, 2007). Sin embargo, la limitación principal de este tipo de Fitoextracción es la pequeña biomasa de estas plantas, y el escaso tamaño y poca profundidad de sus raíces. Es por ello, que se ha potenciado el uso de plantas de mayor biomasa y crecimiento rápido modificadas genéticamente para sobreexpresar genes responsables de la hiperacumulación (Shah, 2007). Así, se han obtenido plantas transgénicas tolerantes que sobre expresan genes que codifican enzimas del metabolismo del glutatión, fitoquelatinas, o transportadores de cationes (Shah, 2007). El estudio de los mecanismos de tolerancia en nuevos mutantes, así como la identificación de sensores de metales y factores de transcripción implicados en la respuesta celular a metales serán de gran relevancia en un futuro para el desarrollo de nuevas

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+

estrategias de fitorremediación.

4.4.8 Mecanismo de estrés por metales pesados.

Algunos metales como como el Mn+2, Fe+3, Zn+2 y Cu+2 son esenciales para el desarrollo normal de las plantas que son componente est ructura l y/o catalítico de proteínas y enzimas. Sin embargo, los metales como el Cr, V, Ti, Co y Se; a pesar de no ser esenciales, son beneficiosos. Por otro lado, la actividad humana libera, sobre todo al suelo, grandes cantidades de metales. El exceso de Al +3, Cd+2, Hg +2, As +2 o Pb+2 resultan de especial relevancia toxica para las plantas. Así mismo, la fitoxicidad por metales tóxicos se manifiesta particularmente en suelo ácidos y afecta tanto el crecimiento como la formación de raíces laterales y secundarias. Actualmente, se conocen un poco los mecanismos específicos de absorción de metales pesados por las membranas vegetales. Sin embargo, se sabe que por difusión flujo en masa e intercambio catiónico, los metales alcanzan fácilmente la raíz para seguir la ruta apoplástica o la ruta simplástica. Este órgano constituye la entrada principal de metal pesado en plantas superiores. La raíz posee cargas negativas en sus células rizodermicas, pertenecientes a polímeros como los grupos carboxilo del ácido péctico y diversas proteínas estructurales y enzimáticas. Estas cargas negativas, al unirse en el espacio de la rizosfera a cargas positivas, como las de los cationes metálicos como el Cd+2 forman una interfase en equilibrio. Estos cationes entrarán por la pared celular que es hidrófila y facilita el transporte e intercambio de iones y una vez allí, se unirá a las cargas negativas de la pared celular y serán transportados radialmente, en parte por la vía apoplástica y en parte por la vía simplástica. En las zonas apicales jóvenes la banda de Caspari no se ha formado y todo el metal pasa a plásticamente hasta la zona vascular, lo que no sucede con las raíces adultas, donde la diferenciación de tejidos y formación de endodermis y exodermis obliga a abandonar la vía apoplástica y utilizar la simpática (Barceló et a., 2005). 4.5 MECANISMOS DE PROTECCIÓN VEGETAL Existe un rango amplio de mecanismos de protección en las células vegetales que sirven para eliminar algún tipo de oxígeno reactivo (ROS) antes de que puedan dañar partes sensibles de la máquina celular. Los mecanismos se dividen en dos grupos: antioxidantes-no-enzimáticos (tocoferoles, carotenoides, componentes del ácido ascórbico (AsA) y glutatión (GSH), incluyendo sus formas oxidadas antioxidantes) y enzimáticos (catalasa, peroxidasa y superóxido dismutasas (SOD), además de las enzimas del ciclo ascorbato-glutatión tales como ascorbato peroxidasa (APX), glutatión reductasa (GR) (Wou, 2003). Una vez dentro de las células vegetales los metales pesados en exceso y no

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necesarios para el metabolismo, son almacenados para evitar toxicidad. Este mecanismo es llevado a cabo por diversas proteínas y péptidos específicos y por varias moléculas orgánicas pequeñas (Hall, 2002)

4.5.1 Glutatión El glutatión (GSH) es un tripéptido que contiene un enlace peptídico inusual entre el grupo amino de la cisteína y el grupo carboxilo de la cadena lateral de glutamato. Es un antioxidante, y protege a las células de toxinas tales como los radicales libres (Wou, 2003).). Esta proteína se encuentra casi exclusivamente en su forma reducida, ya que la enzima que lo revierte a partir de su forma oxidada (GSSG), el glutatión reductasa, es constitutivamente activa e inducible en condiciones de estrés oxidativo. De hecho, la proporción de glutatión reducido respecto a la de glutatión oxidado dentro de las células se utiliza a menudo científicamente como una medida de toxicidad celular (Navarro et al., 2007).

4.5.2 Proteínas de almacenamiento de metales

Las principales proteínas responsables del almacenamiento y detoxificación de metales pesados son: las ferritinas y metalotioneínas. Las ferritinas son proteínas multiméricas de almacenamiento de hierro capaces de secuestrar varios miles de átomos de hierro por molécula. En las plantas, son codificadas por una pequeña familia de genes y se localizan en los plástidos. Constituyen un importante componente de la respuesta al estrés oxidativo y probablemente participen en la protección de los plástidos contra el estrés, almacenando un exceso de hierro libre, el cual incrementa la concentración de dehidroascorbato y disminuye la concentración de ascorbato. Las metalotioneínas son pequeñas proteínas que secuestran el exceso de ciertos metales, más frecuentemente: zinc, cobre y cadmio, por coordinación de estos metales con residuos de cisteína. Estas proteínas han recibido gran atención en el último decenio porque se creía la quelación intracelular de metales era llevada a cabo exclusivamente por las fitoquelatinas (Navarro et al., 2007). Las fitoquelatinas también llamadas metalotioneínas de clase III, a nivel celular son sintetizadas en el citosol y transportadas a las vacuolas.

4.5.3 Quelación de metales por pequeñas moléculas Un gran número de compuestos de muy poco peso molecular juegan un importante papel en el manejo de metales pesados en las plantas. Entre ellos, algunos ácidos orgánicos, aminoácidos y derivados fosfatados son de particular interés. El citrato, por ejemplo, tiene una gran capacidad de quelatación con hierro, níquel y cadmio. Algunos aminoácidos y derivados son muy buenos quelatantes. Esta propiedad le confiere resistencia al vegetal ante concentraciones tóxicas de metales pesados. Algunas estrategias para evitar el aumento de metales pesados pueden ser a nivel

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extracelular como la aparición de micorrizas y exudados en la pared celular. Los mecanismos de tolerancia pueden involucrar la membrana plasmática, ya sea reduciendo la captación o por la estimulación de las bombas de eflujo de metales pesados que han entrado a la célula. Dentro del protoplasto existen una variedad de mecanismos para la reparación de proteínas dañadas por el estrés con la participación de las proteínas del choque de calor (HSP) o metalotioneínas y la quelación de metales por aminoácidos, ácidos orgánicos o péptidos, o su compartimentalización hacia las vacuolas (Navarro et al., 2007). Por tanto, la tolerancia a los metales pesados puede definirse como la habilidad para sobrevivir en un suelo que es tóxico para otras plantas y se manifiesta por una interacción entre genotipo y ambiente. Tal tolerancia adaptativa al MP estaría gobernada por un pequeño número genes. Aún queda por resolver si un cambio único bioquímico o molecular es requerido para producir la tolerancia a un MP específico y los estudios siguen en auge para conocer más a fondo todos los procesos que se dan en las plantas por diferentes tipos de estrés abiótico (Jonak et al., 2004).

Figura 15. Respuesta vegetal a estrés por metales pesados

Fuente: Gonzales Guerrero, 2008.

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5. HIPÓTESIS

5.1 HIPÓTESIS NULA

La fotosíntesis de Heliconia psittacorum no se ve afectada cuando crece asociada a inóculos microbianos bajo diferentes condiciones de luz en suelos impactados por cadmio. 5.2 HIPÓTESIS ALTERNATIVA

La fotosíntesis de Heliconia psittacorum se ve afectada cuando crece asociada a inóculos microbianos bajo diferentes condiciones de luz en suelos impactados por cadmio.

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6. OBJETIVOS

6.1 OBJETIVO GENERAL

Estudiar la capacidad de producción fotosintética en Heliconia psittacorum asociada a R. irregularis y A. niger bajo condiciones de luz y de sombra, en tres suelos impactados naturalmente por cadmio. 6.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

● Cuantificar la simbiosis micorrízica en raíces de H. psitacorum en todos los tratamientos

● Establecer diferencias fisiológicas en el área foliar y longitud de tallos en los diferentes tratamientos.

● Determinar la concentración de Clorofila total en el área foliar de Heliconia psittacorum en simbiosis con R. irregularis y biomasas de A. niger bajo condiciones de fotoperiodos y sombra, en tres tipos de suelos cacaoteros contaminados naturalmente por cadmio.

● Evaluar la biomasa seca radicular de H. psittacorum en simbiosis con R. irregularis y biomasas de A. niger en todos los tratamientos.

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7. METODOLOGÍA

7.1 TIPO ESTUDIO Experimental 7.2 SITIO DEL ESTUDIO El experimento fue llevado a cabo en la granja Villa Mónica del municipio de San Vicente de Chucuri ubicada 6ºN 51´48.265 y Oeste ww76º24´47.971, altura 879 metros sobre el nivel del mar, humedad relativa 84%, precipitación: 2338 mm, temperatura 23ºC y brillo solar 1642 horas-luz. 7.3 CONDICIONES DEL SUELO 7.3.1 Suelos Para este estudio se utilizaron tres suelos ácidos (pH: 4,5 a 5,0) provenientes de la región cacaotera de San Vicente de Chucuri con concentraciones de Cadmio 0,96, 1,075 y 18 ppm respectivamente, proporcionados por FEDECACAO y caracterizados físico - químicamente por el laboratorio de suelos Agrosoil- Bogotá. 7.3.2 Preparación del inóculo micorrízico para adicionar a los rizomas de H.

psittacorum: H. psittacorum: Se utilizaron para cada una de los tipos de suelos, un inóculo de 10 gramos compuesto p o r aproximadamente 300 e s p o r a s R. irregulares cepa 145 suministrado por el laboratorio de investigación en Biotecnología Agroambiental (LIIBAAM-UDES) Así mismo, se utilizaron inóculos mixtos compuestos de biomasa fúngica de Aspergillus niger ATCC®6275 (10g), junto con el inóculo. R. irregulares cepa 145 (10 gramos), por bolsa de suelo. Se consideró el inóculo de Aspergillus niger ATCC®6275 (10g), por su capacidad de adsorber Cd (Guerra et al., 2014). Los suelos fueron dispuestos en bolsas con capacidad de 2 kg, conteniendo los diferentes inóculos (micorrizas/mixto) y los rizomas de H. psittacorum. 7.3.3 Esterilización del suelo: La esterilización del suelo se realizó fraccionadamente por el método de solarización, durante 10 días consecutivos, con volteos periódicos.

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Figura 16. Proceso de esterilización de suelos cacaoteros por el método de solarización fraccionado en el Vivero Santa Mónica- San Vicente de Chucuri.

Fuente: Imágenes de archivo, Grupo Microbiota, 2017.

7.3.4 Condiciones y Montaje del experimento.

En el vivero se controló las condiciones de temperatura, humedad relativa y radiación solar, con régimen natural de luz (día-noche) y el riego por nebulización sin permitir el lixiviado de la maceta. La fertilización se realizó con una concentración mínima de nutrientes (Hoagland), preparado según recomendaciones de FEDECACAO para plantas en vivero. Las condiciones ambientales fueron monitoreadas y controladas semanalmente por el auxiliar de campo (FEDECACAO) y se tomaron datos de crecimiento y características anatómicas en las diferentes condiciones durante el periodo experimental.

7.3.5 Número total de muestras y unidades experimentales:

Para este estudio fueron utilizadas un N total= 72 muestras y la unidad experimental consistió en 1 bolsa de capacidad 2 kg de suelos (para cada tipo de suelo) por triplicado para cada tratamiento (tabla 4). 7.3.5.1 Planta hospedera Se utilizaron rizomas homogéneos de Heliconia psittacorum de tamaño: 2 cm

7.3.5.2 Diseño del experimento

Se utilizó un diseño de factores así: 33X 21 X 31x 11 En este trabajo se evaluaron tres factores: los suelos con diferentes concentraciones de cadmio 0,96ppm, 1,075ppm y 18.83 ppm provenientes de San Vicente de Chucuri; la exposición de Luz y Sombra; el tipo de inóculo: R. irregularis,

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A. niger y mixto con sus respectivas variables respuesta: Clorofila total, Porcentaje de micorrización, Área foliar, tamaño de tallo y biomasa seca de raíz.

7.4 TRATAMIENTOS 7.4.1 Tratamiento expuesto iluminación solar Tabla 3. Esquema de los tratamientos ensayados en presencia de luz (igual número de tratamientos se ensayaron bajo sombra)

Tratamientos Unidad experimental: 3 bolsas de 2kg: rizoma de

H. psittacorum

SUELO 1 ( 0,96 ppm Cd)

T0 sin inocular ( control)

T1 R. irregularis

T2 A. níger

T3 R. irregularis + A. níger ( inóculo mixto)

Tratamientos Unidad experimental: 3 bolsas de 2kg: rizoma de H. psittacorum

SUELO 2 ( 1,075 ppm Cd)

T0 sin inocular ( control)

T1 R. irregularis

T2 A. níger

T3 R. irregularis + A. níger ( inóculo mixto)

Tratamientos

Tratamiento compuesto en total de 3 bolsas de 2kg: rizoma de H. psittacorum

SUELO 3 ( 18 ppm Cd)

T0 sin inocular ( control)

T1 R. irregularis

T2 A. níger

T3 R. irregularis + A. níger ( inóculo mixto)

Figura 17. Crecimiento de H. psittacorum en todos los tratamientos. A) tratamientos expuestos a condiciones de luz, B) tratamientos expuestos a polisombra de 75% de luz.

Fuente: Imágenes, grupo microbiota, 2017

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7.5 CUANTIFICACIÓN DE LA SIMBIOSIS MICORRÍZICA EN RAÍCES DE H. PSITTACORUM

Para la evaluación de la simbiosis micorrízica se utilizó 1 g de raíces de la planta en estudio al final del experimento, éstas fueron colectadas totalmente al azar, por cada tratamiento (luz y sombra). Posteriormente, se empleó la tinción de raíces propuesta por Philips y Hayman (1970) modificado por Koske y Gemma (1989), para la cuantificación de la simbiosis se utilizó un Microscopio fotónico de luz, (marca Nikon i19).

7.5.1 Tinción de raíces para observar la colonización micorrízica Las raíces fueron sometidas a un procedimiento de clareo y tinción descrito por Philips y Hayman (1970) modificado por Koske y Gemma (1989). Inicialmente se pesó 1 gramo de raíces secundarias, terciarias y cuaternarias, posteriormente se procedió a lavar estas raíces con el fin de eliminar residuos del suelo y se enjuago con varios cambios de agua; luego las raíces fueron sumergidas en KOH a 120°C por 15-30 minutos en autoclave, posteriormente se eliminó el KOH enjuagando con agua dos o tres veces, seguido de esto se sumergieron en HCl al 1% por cinco minutos , en este paso no se eliminó el exceso de HCl ya que las raíces deben estar acidificadas para tener una tinción adecuada, finalmente las raíces se tiñeron en una solución de glicerol ácido con azul de tripano a 120°C por cinco minutos, luego se descargó la solución colorante y se mantuvieron las raíces en glicerol acidificado (sin azul de tripano) o agua a temperatura ambiente o 4 ºC.

Figura 18. Proceso de tinción de raíces colonizadas por micorrizas

Fuente: Rocha et al., 2009

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7.5.2 Porcentaje de simbiosis micorriza En todos los tratamientos evaluados fueron tomadas de 15 a 20 raicillas al azar de H. psittacorum, posteriormente las raíces teñidas con azul tripano, fueron observadas bajo Microscopio óptico (Nikon eclipse Ni) 1 y se observó 100 campos para el análisis de la simbiosis en cada tratamiento, siguiendo la metodología propuesta por Treseder (2004). La simbiosis se midió al final del experimento en H. psittacorum y el porcentaje de colonización micorrízica se obtuvo mediante la fórmula sugerida por Treseder, (2004):

% Colonización= Campos colonizados *100

Campos totales

7.6 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE CLOROFILA TOTAL EN EL

ÁREA FOLIAR DE HELICONIA PSITTACORUM EN SIMBIOSIS CON HONGOS MICORRÍZICOS BAJO CONDICIONES DE FOTOPERIODOS Y SOMBRA, EN TRES TIPOS DE SUELOS CACAOTEROS CONTAMINADOS NATURALMENTE POR CADMIO.

Para la extracción de la clorofila a y b se realizó el protocolo de acuerdo a lo propuesto por Lichtenthaler (1987). Se determinó a partir de la extracción con acetona al 80% previamente enfriada a -10ºC. Inicialmente, se preparó el reactivo de acetona-agua 80% (v/v), esta debe encontrarse libre de agua, así que antes de preparar la solución al 80%, para

eliminar el agua presente en la acetona se agregó 5g de un agente secante como

el Na2SO4 anhidro en un litro de acetona, luego, se dejó reposar un día completo, y posteriormente se filtró (Vogel, 1989). Finalmente, se preparó la solución de acetona al 80% en un balón aforado, se almacenó en frasco oscuro y se dejó 10ºC para su uso inmediato. Seguidamente, se colecto las hojas frescas de cada uno de los tratamientos en estudio, esta toma de muestras se realizó cada 3 meses para así determinar el proceso fotosintético durante el tiempo experimental mediante la extracción de la clorofila. Los tratamientos estaban expuestos a luz solar y sombra con una polisombra de 75% de luz. Una vez recolectadas las hojas a cada uno de los tratamientos se le eliminaron las venas mayores y se cortaron en pedazos pequeños con la ayuda de un bisturí estéril. Posteriormente, en un mortero el cual estaba ubicado sobre cama de hielo, se colocó 1g de las hojas frescas previamente cortadas, luego se añadió nitrógeno líquido sobre el material vegetal y se procedió a macerar la muestra hasta obtener un polvo muy fino. Durante el proceso se realizó en un sitio con baja luminosidad. Una vez macerado el material vegetal se tomó una masa de 0,1g

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aproximadamente, se registró el peso exacto de la muestra, posterior a esto, se colocó en tubos de falcón debidamente rotulados; seguido de esto se realizó el siguiente proceso: se adicionó 1,5 mL de acetona 80% v/v a -10ºC; luego se homogeneizó la muestra mediante el equipo vórtex durante dos minutos para cada tratamiento asegurando así el completo contacto del material vegetal con la acetona; seguidamente se traspasó la mezcla del material vegetal a tubos eppendorf, luego de ello, se centrifugó durante tres minutos a 10000 rpm y 4ºC, posterior a esto se retiró el sobrenadante usando una micro pipeta 500 µl y se colocó en el respectivo frasco ámbar para evitar la exposición de luz. Luego se rotuló y se cubrió con papel aluminio, se obtuvo un sobrenadante libre de materiales en suspensión. Se transfirió el sobrenadante recuperado, que fue almacenado en el frasco ámbar, a un balón aforado de 10 ó 25 mL de acuerdo al número de lavados y se aforó con acetona 80% (v/v) previamente enfriada. Finalmente, se realizó y registró las lecturas de absorbancia por triplicado a las longitudes de onda 663 nm (clorofila a) 647 nm (clorofila b); se tuvo en cuenta que si la absorbancia a 663 nm supera 0,600 se debía realizar una dilución tomando 500 µL y se llevará a 1mL con acetona al 80% v/v. luego se midió la absorbancia nuevamente. El contenido de clorofilas se reportó como mg de clorofila /g material vegetal. El blanco analítico fue acetona al 80% v/v (Lichtenthaler y Buschmann, 2001).

Figura 19. Procedimiento para la extracción y cuantificación de la Clorifila Chl a, Chl b clorofila total (Chl a + b).

Fuente: autoras del proyecto

Una vez obtenido los resultados de las absorbancias para la Clorofila Chl a, Chl b para cada uno de los tratamientos expuesto en luz solar y sombra, se realizó la cuantificación mediante las siguientes ecuaciones desarrolladas por Lichtenthaler (1987) para obtener la concentración de clorofila en mg /L.

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Tabla 4. Fórmulas para determinar la concentración de clorofilas mediante las absorbancias.

Clorofila a = (12,25 x A663nm) – (2,79 x A647nm)

Clorofila b = (21,5 x A647nm) – (5,1 X A 663nm)

Clorofila total = (7,15 x A663nm) + (18,7 x A647nm) Fuente: Melgarejo, 2012

7.7 ESTABLECIMIENTO DE LAS DIFERENCIAS FISIOLÓGICAS EN EL CRECIMIENTO DEL ÁREA FOLIAR Y TALLOS EN LOS DISTINTOS TRATAMIENTOS EVALUADOS

Durante el proceso experimental se realizaron riegos diarios a cada uno de los tratamientos experimentales, los cuales permitieron mantener esta población en buenas condiciones de campo, posteriormente con la población experimental establecida, las mediciones se realizaron al finalizar el experimento. Se tomaron muestras de cada uno de los tratamientos, donde se registraron y evaluaron tamaños de tallos y área foliar. El índice de área foliar se midió al azar en cada uno de los tratamientos, considerando al menos 3 plantas por tratamiento, para la medida del área foliar se retiró el pecíolo a cada una de las hojas y se midió el largo total de la hoja (Lh), para el valor del ancho de la hoja (Ah), se tomaron en tres puntos diferentes, considerando la parte más amplia de la lámina foliar y promediando los valores obtenidos. Con los datos de largo de la lámina foliar (Lh), ancho máximo de la lámina foliar (Ah), el producto del largo por el ancho (LhxAh), se procedió a realizar los respectivos análisis varianza para las variables en referencia respecto al área individual de la hoja, mediante el uso del programa estadístico Statgraphics 18 centurión®. Versión gratuita. Figura 20. Esquema representativo de las medidas lineales de largo y ancho de las

hojas

Fuente: autoras, 2018

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7.8 ESTIMACIÓN DE LA BIOMASA RADICULAR DE HELICONIA PSITTACORUM EN TODOS LOS TRATAMIENTOS.

7.8.1 Determinación del peso seco radicular Para esta determinación se escogieron 3 plantas totalmente al azar por tratamiento y al final del experimento. A las raíces totales de cada una de las plantas se les retiró manualmente los residuos de suelo y se pesaron en fresco, luego se empacaron por separado en bolsas de papel, de acuerdo a los tratamientos y se colocaron a secar en el horno de aire seco a una temperatura de 70 °C durante dos días, de acuerdo a lo propuesto por Javot, et al. (2007). Resultados obtenidos se analizaron mediante el uso del programa estadístico Statgraphics 18 centurión®. Versión gratuita".

7.9 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Factores que influyen sobre la capacidad fotosintética de H. psittacorum en simbiosis:

Tipo de suelos: tres niveles o diferentes concentraciones de Cd

Influencia de la luz: 2 niveles (sombra y luz)

Parámetros a evaluar (variable-respuesta) - Simbiosis micorrízica - Cantidad clorofila total - Área foliar y tamaño de tallo - Biomasa seca de raíz

Para el análisis de los datos se utilizó un análisis ANOVA y la correlación y las variables respuesta, utilizando el paquete estadístico Statgraphics 18 centurión®. Versión gratuita y la prueba de Tukey, al nivel ≤0,05 de significancia.

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8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

8.1 ANÁLISIS FISICOQUÍMICO DE SUELOS El estudio de suelos es una herramienta fundamental para evaluar la calidad del suelo, su capacidad productiva y es la base para definir la dosis de nutrientes a aplicar. En el presente estudio se realizó un análisis físico- químico teniendo como datos importante la concentración de Cadmio y el pH ya que estos suelos son naturalmente contaminados por metales pesados, como se evidencia en la tabla 7. Tabla 5. Caracterización fisicoquímica de los suelos cacaoteros

Características físico químicas del suelo

Parámetros unidades Suelo 1

Suelo 2 Suelo 3

TEXTURA F Ar A F Ar A F Ar A

pH 5,94 4,36 5,0

MATERIA ORG (%) 4,08 2,18 5,31

NITRÓGENO (N) (%) 0,20 0,11 0,27

FÓSFORO (F) (ppm) 20,22 6,97 51,34

POTASIO (K) (meq/100 mg) 0,14 0,14 0,12

MAGNESIO (Mg) (meq/100 mg) 0,84 0,53 2,27

CALCIO (Ca) (meq/100 mg)

0,90 3,05 22,3

SODIO (Na) (meq/100mg) 0,28 0,12 0,16

AZUFRE (S) (ppm) 32,25 16,17 10,82

HIERRO (Fe) (ppm) 68,5 69,75 72,73

BORO (B) (ppm) 0,57 0,37 0,15

COBRE (Cu) (ppm) 0,40 2,93 2,50

MANGANESO (Mn)

(ppm) 2,80 28,44 1,25

ZINC (Zn) (ppm) 3,85 10,11 19,55

CADMIO (Cd) (ppm) 0,96 1,075 18,83 Fuente: Laboratorio de suelos AgroSoil Bogotá, Adaptado autoras, 2018

En los resultados obtenidos en la caracterización se muestra que el pH de estos tres suelos empleados es ácido, según la (ATSDR, 2012), La movilidad de los metales pesados depende de varios factores tales como el pH, el potencial redox y la cantidad de materia orgánica, los cuales varían según el entorno local. Generalmente, el cadmio se une fuertemente a la materia orgánica en el suelo; de esta manera puede ser absorbido por las plantas e incorporarse entrando a las cadenas tróficas.

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Los suelos utilizados en este estudio se consideran ácidos, a estos pH se favorecen el intercambio y la disponibilidad para las plantas. Así mismo, la cantidad de cadmio unido a materia orgánica y la fracción residual (inmóvil) de los metales trazas parecen ser relativamente estables en el suelo. Como se observa en la tabla 7, las concentraciones de Cd en los diferentes suelos fueron de 0,96, 1,075, y 18,83 ppm respectivamente, estos valores se encuentran por fuera de los valores permitidos en suelos agrícolas y no son recomendables, puesto que podrían estar causando un efecto tóxico en la planta, así como en la calidad nutricional de las planta; esto concuerda con lo mencionado por (Miransari, 2011), quien asegura que cuando el Cd sobrepasa los límites permitidos puede causar un mal funcionamiento enzimático, estrés oxidativo y reemplazo de nutrientes esenciales en la planta. Otros efectos causales del Cadmio es la incrementación de la permeabilidad de las membranas a los iones y al agua, suprimir la actividad mitótica, división celular, inhibir el crecimiento, desintegración de la estructura del cloroplasto, obstaculiza la absorción de los nutrientes esenciales y deteriora la actividad fotosintética en las plantas, según los descrito por (Kirkham, 2006).Todos estas consecuencias son debido a la similitud química del cadmio con algunos cationes esenciales (Fe+2, Cu+2, Zn+2, Mn+2 y Ca+2 quienes pueden utilizar las mismas vías de entrada del cadmio para el desarrollo de funciones biológicas vitales de la planta (Andosh et al., 2012). 8.2 SIMBIOSIS MICORRÍZICA EN RAÍCES DE H. PSITTACORUM

Figura 21. Simbiosis micorrizica en raíces de H. psittacorum;

(I) espora de Rhizophagus irregularis; (II) Vesículas e hifas intracelulares; III) Micorrización tipo Arum en Heliconia psittacorum (a) hifa intercelular; (b) arbúsculos

En el suelo se encuentra una alta gama de interacción microbiana entre especies de microorganismos, uno de ellos son los hongos micorrízicos arbusculares (HMA), los cuales entran en asociación con las raíces de la planta otorgándole múltiples beneficios a la planta, como son mayor eficiencia de captación de nutrientes protección contra patógenos, resistencia a metales pesados y contaminantes ambientales. Así mismo, al asociarse con una especie vegetal, obtiene un ambiente

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libre de competencia en el interior de las raíces y alimento por medio de los hidratos de carbono generados mediante el proceso fotosintético de la planta (Ramos et al., 2010). Respecto a la micorrización de las raíces como se muestra en la figura 21 (I), Rhizophagus irregularis, fue el hongo utilizado para este experimento, el cual es una de las especies de HMA más estudiadas, empleada como organismo modelo de análisis en investigación agrícola. Pertenece al filo Glomeromycota y se caracteriza por su crecimiento rápido y significativo de su micelio (Maherali y Klironomos, 2007), así como también por su abundancia y naturaleza ubicua en ecosistemas y agroecosistemas alrededor del mundo (Öpik et al., 2006). Por otro lado, se afirma que es el único con información disponible de su genoma secuenciado (Tisserant et al., 2013), el cual coloniza de manera eficiente las raíces de la mayoría de las plantas, es resistente a prácticas de manejo agronómico y su crecimiento es posible usando cultivo in vitro en condiciones monoxénicas, (Declerck et al., 2005). Esto ha permitido lograr recientemente el diseño de estrategias biotecnológicas a través de la producción masiva de inóculo de R. irregularis para ser empleado en cultivos agrícolas. Rhizophagus irregularis, como se ilustra en la figura 21 (I), coloniza las raíces de H. psittacorum manteniendo la integridad las células corticales de la planta, a su vez esta especie tiene la capacidad de formar vesículas ovoides las cuales pueden formarse inter o intracelularmente; estas constituyen el sitio de almacenamiento de sustancias de reserva y polifosfatos figura 21 (II). Además, se observaron hifas intercelulares arbúsculos y vesículas intracelulares que indican colonización del tipo Arum, figura 21 (III).

8.2.1 Cuantificación simbiosis micorrízica

Tabla 6. Análisis de varianza de la simbiosis micorrízica en los tratamientos evaluados

Source Sum of Squares

Df Mean Square

F-Ratio P-Value

MAIN EFFECTS

A:Inoculo 1,298E5 3 4,328E4 2562,80 0,0000

B:Suelo 832,1 2 416,1 24,64 0,0000

C:Luz 7,132E4 1 7,132E4 4223,17 0,0000

INTERACTIONS

AB 1698, 6 283,0 16,76 0,0000

AC 3,078E4 3 1,026E4 607,54 0,0000

BC 848,1 2 424,1 25,11 0,0000

ABC 1992, 6 332,0 19,66 0,0000

RESIDUAL 5674, 336 16,89

TOTAL (CORRECTED) 2,43E5 359

Fuente: Análisis de datos con el paquete estadístico Statgraphics 18 centurión®. Versión gratuita

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Una de las formas de asociación simbiótica, es la establecida entre las raíces de las plantas y hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA), esta asociación confiere un efecto benéfico en la planta, incrementando longevidad, tamaño y biomasa de la raíz, características que permiten un aumento en la absorción y retención de nutrientes, principalmente en hábitat con baja disponibilidad de nutrientes desempeñando un papel importante sobre las características físicas del suelo, al incrementar la agregación de partículas y estabilidad del suelo (Khan, 2006). El análisis de varianza para en la simbiosis micorrízica, se evidencia que en todos los tratamientos existe una diferencia significativa con un valor de P ≤ 0,05 con un nivel de confianza del 95%. Indicando que los tratamientos de luz hay diferencias significativas en cuanto a sus controles así mismo para loas tratamiento en condición de sombra.

Figura 22. Representación gráfica del porcentaje de simbiosis micorrízica en

los diferentes factores luz y sombra, suelos (1. 0,095 ppm, 2. 1,075 ppm, 3.18,

83 ppm) e inóculos (1.R. irregularis. 2. A.niger. 3. R. irregularis+ A.niger)

En relación con la colonización micorrízica alcanzó un porcentaje de colonización considerable (69,84 %) para los tratamientos en presencia de luz y baja concentración de cadmio (0,96- 1,075 ppm), esto es debido a que la función de la simbiosis se basa en la influencia en las respuestas de las plantas a sus condiciones bióticas y abióticas; en la mayoría de los casos las raíces micorrizadas

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muestran una mayor resistencia a los patógenos y tolerancia a la planta en condiciones adversas del suelo, como es la contaminación por metales pesados; sin embargo, se puede observar en la figura 22 que para el tratamiento donde se utilizó el inóculo mixto (R. irregularis + A.niger) bajo condiciones de luz y en concentraciones menores de cadmio presenta un buen porcentaje de colonización de 52,47 – 67,78 %. Esto es debido a la disponibilidad de P (fosforo) en el suelo es baja, por lo tanto, exudados provenientes de la raíz como el isofavonoide- ormononetina estimulan la germinación de esporas, aumentado el crecimiento y colonización de la raíz por HMA (Nair et al., 1991). Estudios realizados por Valentino et al, (2001) reportan que la biomasa es mayor en plantas micorrizadas en comparación con las plantas no micorrizadas. Los resultados obtenidos en suelos de concentraciones altas cadmio (18 ppm), no se vio afectada la colonización micorrízica se puede decir que esta concentración de metal pesado no afecta la colonización micorrízica. Ahora bien, respecto a los tratamientos bajo condiciones de sombra en comparación con los tratamientos bajo luz, se evidencia una diferencia significativa, ya que bajo sombra el porcentaje de micorrización es bajo, esto significa que el factor luz incide en el proceso de fotosíntesis para la generación de carbohidratos, ya que este nutriente es esencial para que se genere el proceso de micorrización en la planta. Finalmente, dentro de la microbiota presente en el suelo, los HMA benefician el establecimiento y crecimiento de las plantas mejorando la absorción de nutrientes, minerales y de difícil disponibilidad para las plantas. Además, estos hongos suministran las plantas una gran resistencia frente a elementos adversos tanto bióticos como abióticos (Ocampo, 2014), reduciendo la concentración de elementos tales como, Cu, Zn, Cd, Mn (George et al., 1994). Hay que mencionar además que los HMA se caracterizan por ser contribuyentes en las movilizaciones de los metales pesados dentro del suelo a través de exudados de glicoproteína como la glomalina, según Khan, 2006, reporta que las hifas de los hongos micorrízicos pueden secuestrar el cadmio, impidiendo que este pase a través de las raíces hasta el área foliar de la planta. 8.2.2 Diferencias fisiológicas en el área foliar y tallo

Tabla 7. Análisis de varianza del área foliar en los tratamientos evaluados

Source Sum of Squares

Df Mean Square

F-Ratio P-Value

MAIN EFFECTS

A:Inoculo 8312, 3 2771, 66,30 0,0000

B:Suelo 1,43E4 2 7148, 171,03 0,0000

C:Luz 6,245E5 1 6,245E5 14943,92 0,0000

66

INTERACTIONS

AB 1188, 6 198,0 4,74 0,0001

AC 8144, 3 2715, 64,95 0,0000

BC 5803, 2 2901, 69,42 0,0000

ABC 2605, 6 434,1 10,39 0,0000

RESIDUAL 1,321E4 316 41,79

TOTAL (CORRECTED)

7,576E5 339

Fuente: Análisis de datos con el paquete estadístico Statgraphics 18 centurión®. Versión gratuita

Tabla 8. Análisis de varianza de la longitud de tallo en los tratamientos evaluados

Source Sum of Squares

Df Mean Square

F-Ratio P-Value

MAIN EFFECTS

A:Inoculo 446,4 3 148,8 72,54 0,0000

B:Suelo 1119, 2 559,5 272,74 0,0000

C:Luz 3720, 1 3720, 1813,59 0,0000

INTERACTIONS

AB 40,42 6 6,737 3,28 0,0037

AC 65,16 3 21,72 10,59 0,0000

BC 104,3 2 52,13 25,41 0,0000

ABC 24,57 6 4,096 2,00 0,0656

RESIDUAL 687,2 335 2,051

TOTAL (CORRECTED)

6199, 358

Fuente: Análisis de datos con el paquete estadístico Statgraphics 18 centurión®. Versión gratuita

Conocer el área foliar de una planta es importante ya que esta nos muestra la capacidad que tiene la planta para transformar la energía luminosa en energía química, así mismo se encuentra asociada en la mayoría de procesos biológicos, ambientales y fisiológicos en la cual incluye el análisis del crecimiento, la fotosíntesis, la transpiración, la interceptación de luz, la asignación de biomasa y el balance de energía, como lo menciona (Kucharik et al. 1998). Las Tabla 9 y 10 muestran los resultados del comportamiento del área foliar con los inóculos ensayados, bajo los diferentes condiciones de luz y sombra en los tres diferentes concentraciones de suelos impactados por cadmio, en esta tabla se muestra a grandes rasgos que existe una correlación entre los factores suelos (0,96, 1,075,18,83 ppm de cadmio respectivamente),inoculo ( R. irregularis; A.niger y mixto) y fuente (luz y sombra), estos resultados fueron soportados por un análisis estadístico de varianza realizado a través de una prueba ANOVA, en la cual se obtuvo una P ≤ 0,05 con un nivel de confianza del 95%.esto mismo se comprueba

67

con el test de Tukey (anexo 3), lo que significa que estos factores están correlacionados entre sí. En la tabla 10 se puede inferir que en la interacción de los tres factores (Inóculo A, Suelo B, fuente C) no presenta una correlación debido a que P ≥ 0,05, ya que los valores de las medias se encuentran entre 10,64 - 21,65. Figura 23. Representación gráfica del comportamiento del área foliar bajo los diferentes factores luz y sombra, suelos (1. 0,095 ppm, 2. 1,075 ppm, 3.18, 83 ppm) e inóculos (1.R. irregularis. 2. A.niger. 3. R. irregularis+ A.niger).

Los factores ambientales pueden causar distintos cambios morfológicos, fisiológicos y bioquímicos en los cultivos, determinando una variación en su rendimiento, ya que la interacción entre estos factores y los procesos fisiológicos inciden en el mejoramiento de las prácticas de producción, al optimizar la fotosíntesis e incrementar la productividad de las plantas (Restrepo et al.,2010); Ahora bien, en la figura 23 se puede observar la interacción de los diferentes factores analizados como son concentración de suelo, inóculos y fuente lumínica. Con respecto, al crecimiento del área foliar, se puede evidenciar que existe una diferencia en cuanto a los tratamientos de luz en comparación a los de sombra ya que este último no presenta diferencia en ninguno de los factores evaluados con respecto al control debido a que las medias de los datos se encuentran en un rango de 46,72- 68,85 como se observa en el (anexo 4). La utilización de la malla polisombra de 75% de disminución de la luz en el experimento provoco una consecuencia en la reducción del área foliar, en relación con el presentado por las plantas control; esto se puede afirmar por lo dicho por Schnyder y Nelson, (1988) que en términos de crecimiento de la hoja, se ha encontrado que la reducción en la cantidad de luz puede ser causal tanto de la

LUZ SOMBRA

68

reducción como del incremento en la expansión, debido a que el sombreado de las plantas causa una frecuencia reducción en la temperatura de las hojas, lo que podría tener un impacto sobre el crecimiento y expansión foliar (Granier et al., 2002). Por otro lado, en la fuente de luz se aprecia que presentó un mayor crecimiento del área foliar utilizando los tratamientos de micorriza (R. irregularis) y mixto (R. irregularis A. niger), expuestos a menores concentraciones de cadmio (0,96 y 1,075 ppm), esto indica que las bajas concentración de cadmio en el suelo no afecta en el crecimiento del área foliar. Por otro lado, como se observa para los tratamientos con una concentración de 18,83 ppm no presentan diferencias en relación con los controles, tal y como se evidencia en la figura 23, es por esto que el exceso de cadmio puede producir efectos tóxicos sobre las plantas, inhibiendo el crecimiento del área foliar, causando clorosis de hojas e incrementando la liberación de electrolitos de las células por daño a las membranas celulares Murphy y Taiz, (1997). Este metal tiende a acumularse en la raíz, con baja translocación a la parte aérea provocando alteraciones en el crecimiento y la morfología de la raíz (Marschner, 1995). La sensibilidad de las plantas a los metales no depende solamente de la concentración sino también del estado de desarrollo de la planta al ser expuesta al mismo (Liu et al., 2005).

Figura 24. Representación gráfica del comportamiento de la longitud del tallo en los diferentes factores luz y sombra, suelos (1. 0,095 ppm ,2. 1,075 ppm, 3.18, 83 ppm) e inóculos (1.R. irregularis. 2. A.niger. 3. R. irregularis+ A.niger)

69

La figura 24 de manera general se puede apreciar que los tratamientos no presentan diferencias significativas, sin embargo en el tratamiento con micorrizas expuesto a menor concentración de cadmio y expuestas a luz tuvieron una mayor longitud de tallo con una media de 20,72 cm (Ver anexo 7), esto se evidencia debido a que las micorrizas tienen la capacidad de infectar células del tallo, otorgándole intercambio de nutrientes de manera bidireccional (los nutrientes minerales son trasvasados disueltos en agua desde el hongo a la planta, mientras ésta cede al hongo los azúcares procedentes de su actividad fotosintética) o unidireccional (Brundrett, 2002). Cabe resaltar que los tratamientos expuestos bajo sombra, con una concentración de cadmio mayor (18,83 ppm) y en presencia del inoculo mixto (R. irregularis + A.niger) presentaron una longitud de tallo menor con una media de datos de 11,88 cm, lo que indica que la sombra es un factor influyente al igual que la presencia de cadmio en la planta ya que no permite que se expresen las propiedades fisiológicas normales de la planta lo que evita un buen crecimiento y absorción de nutrientes.

8.2.3 Determinación de clorofila total Tabla 9. Análisis de varianza de la determinación de la clorofila total en los tratamientos evaluados

Source Sum of Squares

Df Mean Square

F-Ratio P-Value

MAIN EFFECTS

A:Inoculo 37,43 3 12,48 137,48 0,0000

B:Suelo 21,61 2 10,81 119,08 0,0000

C:Luz 101,2 1 101,2 1115,63 0,0000

INTERACTIONS

AB 3,547 6 0,5912 6,51 0,0000

AC 12,39 3 4,13 45,51 0,0000

BC 14,25 2 7,125 78,50 0,0000

ABC 3,451 6 0,5751 6,34 0,0000

RESIDUAL 30,49 336 0,09075

TOTAL (CORRECTED) 224,4 359 Fuente: Análisis de resultados con el paquete estadístico Statgraphics 18 centurión®. Versión gratuita

El papel del nitrógeno como nutriente esencial y componente estructural de moléculas como la clorofila en plantas ha sido ampliamente documentado en varias especies debido a la importancia en los procesos de crecimiento y producción agrícola (Volenec et al., 1996; González et al., 2003; Reigosa et al., 2003; Makino y Osmond, 1991; Lattanzi et al., 2004). El nitrógeno es uno de los factores de mayor estrés en plantas tropicales ya sea por deficiencia o por exceso, es por ello que se reconoce que el nitrógeno puede ser un factor limitante del crecimiento y de la

70

eficiencia fotosintética de las plantas, especialmente, bajo condiciones de déficit de nitrógeno, las cuales tienden a disminuir el peso seco, el número de hojas y el área foliar (Taiz y Zieger, 1998). Ciompi et al., 1996). En el caso de la eficiencia fotosintética, se puede ver limitada al disminuir el contenido de la clorofila en las hojas, así como la producción quántica de la fotosíntesis. La correlación entre el contenido de nitrógeno y la eficiencia fotosintética varía dependiendo del hábitat de la planta y de factores ambientales como la temperatura y la radiación (Evans, 1989; Toth et al., 2002; Lamsfus et al., 2003). En la tabla 11 los resultados obtenidos en el análisis de varianza muestran diferencias significativas para cada uno de los tratamientos ya que el valor de P ≤ 0,05 con una confianza del 95%, lo que significa que existe una correlación en todos los tratamientos analizados para este factor.

Figura 25. Representación gráfica de la determinación de la clorofila total bajo los diferentes factores luz y sombra, suelos (1. 0,095 ppm, 2. 1,075 ppm, 3.18,83 ppm) e inóculos (1.R. irregularis. 2. A.niger. 3. R. irregularis+ A.niger).

Con respecto a la figura 25 los tratamientos tanto de luz como de sombra tuvieron una tasa fotosintética buena , donde se evidencio diferencias significativas en los tratamientos; cabe resaltar que en condiciones de luz se evidencia que en el tratamiento con micorriza (R. irregularis) y mixto (R. irregularis + A.niger) en suelos con bajas concentraciones de cadmio (0,96 y 1,075 ppm) presentaron una mejor cuantificación de clorofila la cual se encuentra entre 3,64-3,67 mg/g-1 , A su vez, se visualiza que en condiciones de estrés con Cd las plantas micorrizadas presentaron un mayor contenido de clorofila que las no micorrizadas.

71

Los resultados obtenidos coinciden según lo descrito por (Yurekli y Porgali, 2006) quienes encontraron que la síntesis de clorofila es alterada por altas concentraciones de metales pesados como el cadmio, así como se observó en las plantas no micorrizadas. Esto puede ser el resultado de la inhibición de una enzima de la ruta biosintética o por la modificación de la absorción de un nutriente importante como lo es el hierro (Fe). Por otro lado los metales pesados tales como el Cu, Co, Pb y Cd causan una disminución en el contenido de clorofila y de proteínas en las plantas; También se ha encontrado que el contenido de clorofila y las proteínas se reducen con el aumento de la concentración de Cd Mientras tanto, el efecto moderador de los HMA como una posible expresión de la acción protectora contra el estrés por metales pesados, fue mayor en las más altas concentraciones de Cd, evitando la degradación tanto de clorofila como de proteínas, de acuerdo con (Ruscitti et al., 2011). (Abdul Razak 1985) determinó una disminución de la actividad fotosintética y en la síntesis de clorofila por la acumulación de metales pesados. Finalmente, se puede evidenciar en la figura 25 que en los tratamientos bajo sombra la tasa fotosintética se ve afectada negativamente cuando la planta fue sometida a altas concentraciones de cadmio (18 ppm), lo que indica que la presencia de metales pesados en el suelo, influyen en el comportamiento del proceso de la fotosíntesis y como se mencionó anteriormente en la micorrización , la cual se observa en la fisiología de la planta, es decir una disminución en el área foliar, longitud de tallo y una baja biomasa radicular.

8.2.4 Evaluación de la biomasa seca radicular de Heliconia Psittacorum

Tabla 10. Evaluación de la biomasa seca radicular en los tratamientos evaluados Source Sum of

Squares Df Mean

Square F-Ratio P-Value

MAIN EFFECTS

A:Inoculo 1,424E4 3 4747, 207,79 0,0000

B:Suelo 4520, 2 2260, 98,92 0,0000

C:Luz 1,612E5 1 1,612E5 7054,39 0,0000

INTERACTIONS

AB 1119, 6 186,5 8,16 0,0000

AC 6704, 3 2235, 97,82 0,0000

BC 119,4 2 59,71 2,61 0,0748

ABC 1482, 6 247,1 10,82 0,0000

RESIDUAL 7676, 336 22,85

TOTAL (CORRECTED)

1,97E5 359

Fuente: Análisis de resultados con el paquete estadístico Statgraphics 18 centurión®. Versión gratuita

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La relación raíz /área foliar es un buen indicador del efecto del hongo micorrízico sobre la morfología de las plantas inoculadas, esto indica la proporción en que las raíces crecen con respecto a la producción de biomasa, en términos de crecimiento vegetal. También existe un efecto de hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA) sobre un sistema suelo-planta en suelos contaminados con cadmio en etapa de vivero. Como se aprecia en la tabla 12 la mayoría de los tratamientos presentan diferencias significativas con valor de P ≤ 0,05 con un nivel de confianza del 95%, excepto la interacción entre los factores suelos y luz la cual no presenta diferencias significativas ya que el valor de P ≥ 0,0748, esto indica que la fuente lumínica no altera el proceso de micorrización y por lo tanto no afecta el crecimiento radicular. Figura 26. Representación gráfica de la evaluación de la biomasa seca radicular bajo los diferentes factores luz y sombra, suelos (1. 0,095 ppm, 2. 1,075 ppm, 3.18,83 ppm) e inóculos (1.R. irregularis. 2. A.niger. 3. R. irregularis+ A.niger)

Como se evidencia en la figura 26 los resultaron mostraron en general un incremento en la biomasa radicular en las plantas micorrizadas y especialmente en suelos con concentraciones de cadmio de 0,096 1,075 ppm, estos resultados estarían demostrando los beneficios que ofrece la simbiosis en la captación de nutrientes y minerales del suelo, la transferencia de carbono a través de las hifas extraradicales como los ha expresado (SIMARD, 2004). Así mismo esta asociación en las raíces de la planta produce diversos cambios/modificaciones a nivel fisiológico, en el que se destaca el aumento en la actividad fotosintética por efecto

73

de la mayor capacidad de fijación del CO2 y el incremento de la tasa de crecimiento y biomasa producida (Alarcón y Ferrera-Cerrato, 1999). Cabe señalar, que para nuestro estudio se evidencia un mayor crecimiento de las raíces, debido al efecto de R. irregularis, esto permite una mayor toma de nutrientes del suelo, lo cual mejora la estabilidad nutricional de las plantas micorrizadas comparadas con las no micorrizadas, lo cual coincide con lo reportado por Cuenca (2007; Vierhelig (2004) y Sierverding (1986). Sin embargo, una mayor toma de nutrientes, puede implicar también una mayor toma de cadmio, debido a que por su similitud química con algunos elementos esenciales para la planta, puede ser absorbido a la par con ellos y con esto se puede observar una mayor absorción del metal pesado por las plantas. En relación con lo dicho anteriormente se puede apreciar en la figura 27 las diferencias fisiológicas en cuanto a la biomasa radicular en la fuente de luz y de sombra inoculada con micorrizas, en la cual se observa un considerable aumento en el tratamiento de luz en comparación con los tratamientos de sombra Figura 27. Efecto de la simbiosis micorrízica en la biomasa radicular en Heliconia psittacorum. A) Tratamiento bajo sombra y concentración de 0,96ppm Cd, B) tratamiento bajo luz y concentración de 0,96 ppm Cd.

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9. CONCLUSIONES

Los análisis de raíces micorrizadas en H. psittacorum con R. irregularis,

mostraron un patrón morfológico característico del tipo “Arum”, caracterizado por la presencia de vesículas, hifas intracelulares y formación de arbúsculos

Todos los tratamientos evaluados presentaron diferencias significativas P≤

0,05, e influyeron directamente sobre el desarrollo foliar y sobre los parámetros morfológicos de H. psittacorum, además Los análisis de raíces micorrizadas en H. psittacorum con R. irregularis , mostraron un patrón morfológico característico del tipo “Arum”, caracterizado por la presencia de vesículas, hifas intracelulares y formación de arbúsculos

Los análisis de los resultados mostraron que la tasa fotosintética de H.

psittacorum no fue afectada por las diferentes concentraciones de cadmio presentes en el suelo en presencia de luz y de inóculos microbianos, comparada con el control. Estos resultados estarían confirmando la hipótesis nula planteada

H. psittacorum es una especie que requiere la luz para su normal desarrollo, en

general este factor afecto significativamente las variables respuesta evaluadas. El factor concentración cadmio no afecto el desarrollo de la planta, sugiriendo que esta especie es resistente a la presencia de cadmio cuando crece en suelos impactos hasta 18,8 ppm de cadmio (concentración máxima evaluada en este trabajo) cuando se desarrolla en condiciones de luz.

75

10. RECOMENDACIONES

Para la planta H. psittacorum se recomienda evaluar diferentes fuentes de sombrío menor a un 60%, ya que porcentajes mayores a este afectan las características morfológicas y fisiológicas de la planta. Se recomienda evaluar la capacidad fotosintética de H. pssittacorum en asociación con otras especies de hongos micorrízicos arbusculares a las mismas concentraciones de cadmio ensayadas.

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11. BIBLIOGRAFÍA

Abdul Razak, V. (1985). Physiological y biochemical aspects of metal tolerance in Arachis hypogea. PhD Thesis. L. MPhil, Tirupati AP, Sri Venkateswara University, AP, India. Abollino, O., Aceto, M., Malandrino, M., Mentaste, E., Sarzanini, C. y Barberis, R. 2002. Distribution y Mobility of Metals in Contaminated Sites. Chemometric Investigation of Pollutant Profiles. Environmental Pollution, 119: 177 Acevedo, E., M. Carrasco, O. León, E. Martínez, P. Silva, G. Castillo, I.Ahumada, G. Borie y S. González. (2005). Criterios de calidad de suelo agrícola. Ministerio de Agricultura, Santiago. Agency for Toxic Substances & Disease Registry (ATSDR). Public Health Statement for Cadmium, 2012. Alarcón A., R. Ferrera-Cerrato. (1999). Manejo de la micorriza arbuscular en sistemas de propagación de plantas frutícolas. Terra. Volumen 17 número 3, páginas 179 – 191. Almeraya, E. (2015). Adaptaciones fotosintéticas en las plantas para mejorar la captación del carbono. Revista ciencia, 66(3), pp.74-79. Andosch, A., Affenzeller, M. J., Lütz, C., & Lütz-Meindl, U. (2012). A freshwater green alga under cadmium stress: Ameliorating calcium effects on ultrastructure y photosynthesis in the unicellular model Micrasterias. Journal of Plant Physiology, 169(15), 1489–1500. https://doi.org/10.1016/j.jplph.2012.06.002. Andrade, S., P. Gratão, R. Azevedo, A. Silveira, M. Schiavinato y P. Mazzafera. (2010). Biochemical y physiological changes in jack bean under mycorrhizal symbiosis growing in soil with increasing Cu concentrations. Environ. Exp. Bot. 68, 198-207. Angelova V., Ivanova, R., Delibaltova, V. y Ivanov, K. (2004). Bio- accumulation y distribution of heavy metals in fibre crops (flax, cotton y hemp). Industrial Crops y Products, 19: 197–205. Aravind.P, Prassad MNV (2005). Cadminum-Zinc interactions in a hydroponic system using Ceratophyllum demersum adaptive ecophysiology, biochemistry y molecular toxicology. Braz J Plant physiol 17:3-20. Ascúntar R., D., Toro V., A. F. (2007). Estudio del comportamiento hidrodinámico

77

de humedales de flujo subsuperficial para el tratamiento de aguas residuales domésticas. Trabajo de Grado, Ingeniería Sanitaria. Universidad del Valle. Cali – Colombia. Astolfi, S., Zuchi, S., Passera, C. (2005). Effect of cadmium on H (+) ATPase activity of plasma membrane vesicles isolated from roots of different S-supplied maize (Zea mays L.) plants. Plant Science 169:361-368. Bago, Berta; Pfeffer, Philip y Shachar-HILL, Yair. (2000). Carbon metabolism y transport in arbuscular mycorrhizas. Journal of Plant Physiology, 124:949-957. Barceló.J. (2003). Perspectivas actuals de la fitoremediación. Anuari Reial. Academia de farmacia de Catalunya. 47:13-45. Barker,.S; Tagu. D; Delp. G. (1998). Regulation of root y fungal morphogenesis in mycorrhizal symbiosis. Plant Physiology. Apr 1998,116 (4) 1201-1207; DOI: 10.1104/pp.116.4.1201 Berry, F. y Kress, W. J. Heliconia. (1991). An identification guide. Smithsonian Institution Press, Washington. 1991. 334 p. Blanco. F; Salas, E. (1997). Micorrizas en la agricultura: contexto mundial e investigación realizada en Costa Rica. Agronomía Costarricense 21(1): 55-67. Brundrett, M.C. (2002). Coevolution of roots y mycorrhizas of land plants. New Phytologist 154: 275-304. https://doi.org/10.1046/j.1469-8137.2002.00397.x. Chapín FSIII. (1980). The mineral nutrition of wild plants. Annu Rev Ecol Syst 11:233-60. Institute of Arctic Biology, University of Alaska, Fairbanks, Alaska 99701. Christensen. H; Haung. P. (1999). Solid phase cadmium and the reactions of aqueous cadmium with soil surfaces. in: Cadmium in Soils and Plants (eds. McLaughlin, M.J. y Singh, B.R.), pp. 65-96. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, The Netherlands. Colanguelo, E. y M. Guerinot. (2006). Put the metal to the petal: metal uptake y transport throughout plants. Plant Biol. 9, 322-330. Curtis. H, Barnes S., Schnek A. y Massarini A. (2008). Biología. Capítulo 9: fotosíntesis Luz y vida 7ª Edición. Editorial Médica Panamericana. Da Silva-Junior JP, Siqueira JO. (1997). Aplicaçao de formononetina sintética ao solo como estimulante da formaçao de micorriza no milho e na soja. Rev Bras Fisiol Veg 9:33-39.

78

Declerck, S., D. G. Strullu, J. A. Fortin (2005). In Vitro Culture of Mycorrhizas. New York, NY: Springer-Verlag, Berlin Heidelberg. doi: 10.1007/b138925. Diets,K-J, Baire,M, Kramer. U. (1999). Free radical y reactive oxygen species as mediator af heavy metal toxicity in plan. EN MNV Prasad, J. Hagenmeyer, eds. Heavy Metal Stress in Plant. From Molecules to ecosystems. Springer VErlag, Berlin. Pp 73-97. Dietz F. (1972). Enrichment of heavy metaks in submerged plants. Adv water pollut Res Proc Int Cont. Pp 53-72. Egamberdiyeva, D; Jurceva. S; Poberejskaya, O. Myuchina, P. Teryuheva, L. Seydalieva, y A. Aliev. (2004). Improvement of wheat y cotton growth y nutrient uptake by phosphate solubilizing bacteria. 26th Southern Conservation Tillage Conference for Sustinable Agriculture. North Carolina. Elias. KS; Safir.GR. (1987). Hyphal elongation of Glomus fasciculatus in response to root exudates. Applied Environmental Microbiology, Aug: 53(8): 1928- 33. Evans JR. (1989). Photosynthesis y nitrogen relationship in leaves of C3 plants. Oecología. 1989; 78: 9-19. Felici, C., Vettori, L., Giraldi, E., Costantina, L., Toffanin, A., Taglicasacchi, A., Nuti, M. (2008). Single y co-inoculation of Bacillus subtilis y Azopirillum brasilense on Lycopersicon esculentum: Effects on plant growth y rhizosphere microbial community. Applied Soil Ecology 40 260-270. Gadkar. V; Rakafet. D; Talya K; Yoram. K (2001). Arbuscular mycorrhizal fungal colonization. factors involved in host recognition. Plant Physiology, 27: 1493-1499. https://doi.org/10.1104/pp.010783. Goldbol, D.L., Hutterman, A. (1985). Effect of zinc, cadmium and mercury on root elongation on Picea abies (Karst.) seedlings and the significance of these metals to forest die-back. Environmental Pollution 38:375-381. Gonzales. S. (2009). Enverdecimiento de la Espata de Spathiphyllum wallisii Regel. Instituto de enseñanza e investigación en ciencias agrícolas. Montecillo. Texcoco, Edo de México. González. M., Carrillo. F., Wright, S y Nichols, K. (2004). The role of glomalin, a protein produced by arbuscular mycorrhizal fungi, in sequestering potentially toxic elements. Volume 130, Issue 3, August 2004, Pages 317-323 https://doi.org/10.1016/j.envpol.2004.01.004 González-Guerrero, M. (2005). Estudio de los mecanismos implicados en la

79

homeostasis de metales pesados en el hongo formador de micorrizas arbusculares Glomus intrarradices. Tesis de doctorado. Universidad de Granada, Granada, España. Guerra B., Muñoz J. (2018). Boletín informativo cacao, cadmio y biorremediación. Grupo de investigación de biotecnología agroindustrial MICROBIOTA. Universidad de Santander UDES. En prensa. Guerra, B., Sandoval, A., Manrique, L & Barrera, S. (2014). Ensayos preliminares in vitro de biosorción de cadmio cepas fúngicas nativas de suelos contaminados. Bucaramanga. Revista Innovaciencia: 2:1 Gunse. B; Poschenrieder. C y Barceló, J. (1997). Water transport properties of roots y root cortical cells in proton- y Al- stressed maize varieties. Laboratorio de Fisiologia Vegetal, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Barcelona, E-081 93 Bellaterra, Spain Plant Physiol. (1 997) 11 3: 595-602. Hall, J. L. (2002). Cellular mechanism for heavy metal detoxification y tolerance. Journal of Experimental Botany, Vol. 53, No 366, 1 January 2002, Pages 1–11. https://doi.org/10.1093/jexbot/53.366.1. He, J.; Chee, C. W. y Goh, C. J. (1996). ‘Photoinhibition’ of Heliconia under natural tropical conditions: the importance of leaf orientation for light interception y leaf temperature. Plant, Cell y Environment Vol. 19, No. 11, p. 1238-1248. Heldt. H.W. 2004. Plant Biochemistry y Molecular Biology. Dept og Plant Biology y Center for the Study of Early Events in Photosynthesis Oxford Oxford University. https://doi.org/10.1016/S1360-1385(98)01273-4. Jonak C., Nakagami H., Hirt H. (2004). Heavy Metal Stress. Activation of Distinct Mitogen-Activated Protein Kinase Pathways by Copper y Cadmium. Gregor Mendel Institute of Molecular Plant Biology, Austrian Academy of Sciences y Institute of Microbiology y Genetics, University of Vienna Plant Physiology, Vol. 136. Khan AG. (2006). Mycorrhizoremediation an enhanced form of phytoremediation. JZhejiang Univ Sci B 7(7):503-514 DOI: 10.1631/jzus.2006.B0503. Kirkham, M. B. (2006). Cadmium in plants on polluted soils: Effects of soil factors, hyperaccumulation, y amendments. Geoderma, 137(1). 19–32. https://doi.org/10.1016/j.geoderma.2006.08.024 Kucharik, Ch.J.; Norman, J.M.; Gower, S.T. (1998). Measurements of branch area y adjusting leaf area index to indirect measurements. Agric. Forest Meteorol. 91:69-88. Lallana, V.H. (2003). Reproducción sexual de Eryngium horridum Malme en

80

pastizalas naturalizados de Entre Ríos. 220 p. (inédito). Tesis Doctoral. Lazar, T. Taiz, L. y Zeiger, E. (2003). Plant physiology. 3rd edn. Annals of Botany, 91(6), 750–751. http://doi.org/10.1093/aob/mcg079. Liu, D., Zhai, L., Jiang, W. y Wang, W. (1995). Effects of Mg2+, Co2+, y Hg2+ on the nucleus y nucleolus in the root tip cells of Allium cepa. Bulletin Environmental Contamination Toxicology, 55:779-787. Lozano-Rodríguez, E, Hernández, L.E., Bonay, P., Cárpena-Ruiz, R.O. (1997) Distribution of Cd in shoot, and root tissues of maize and pea plants: physiological distribution. Journal of Experimental Botany 48:123-128. Lucho, C.A., Álvarez, M., Beltrán, R.I., Prieto, F. y Poggi, H. (2005). A multivariate analysis of the accumulation y fractionation of major y trace elements in agricultural soils in Hidalgo State, Mexico irrigated with raw wastewater. Environmental International, On Line: 0160- 4120- D 2004. DOI:10.1016/j.envint.2004.08.002. Maherali H. Klironomos JN. (2007). Influence of Phylogeny on Fungal community assembly y ecosystem functioning. Science 22;316(5832):1746-8. DOI: 10.1126/science.1143082. Manjarrez. G; Castro I y Padilla. L. (2008). “Bioacumulación de cadmio en ostras de la bahía de Cartagena”. Revista Ingenierías Universidad de Medellín volumen 7, No. 13, pp. 11-20 - ISSN 1692- 3324 - Julio-Diciembre de 2008/164 p. Medellín, Colombia. Manrique. E. (2003). Los pigmentos fotosintéticos, algo más que la captación de luz para la fotosíntesis. Ecosistemas. Revista científica de ecología y medio ambiente. Vol. 12, No 1. Maza. V; Builes. J. (2000). Heliconias de Antioquia guía de identificación y cultivo. Ed. Gráficas Ltda. Medellín. Melgarejo. L; Moreno. L; Solarte. M. (2010). Fotosíntesis y pigmentos vegetales. Laboratorio de fisiología y bioquímica vegetal. Departamento de biología. Universidad Nacional de Colombia. Meza.N. (2014). Fitorremediación de Plomo (Pb) y Arsenic (As) con higuerilla (Ricinus communis L.) en asociación con micorrizas. Tesis- Unidad Regional Universitaria de zonas áridas. Coordinación de estudios de posgrado. Universidad Autónoma Chapingo. Miransari M. (2011). Hyperaccumulators, arbuscular mycorrhizal fungi y stress of heavy metal. Biotechnol. Adv. 29, 645–653.0.1016/j.biotechadv.2011.04.00

81

Mobin, M. y N.A. Khan (2007). Photosynthetic activity, pigment composition y antioxidative response of two mustard (Brassica juncea) cultivars differing in photosynthetic capacity subjected to cadmium stress. Journal Plant Physiology, 164: 601-610. Mota. C; Alcaraz.C; Iglesias M; Carvajal. M. (2011). Absorción de CO2 por los cultivos más representativos de la región de Murcia. Departamento de nutrición vegetal- CEBAS- consejo Superior de investigaciones Científicas. Murcia, España. Nair, M. G., Safir, G. R., & Siqueira, J. O. (1991). Isolation y Identification of Vesicular-Arbuscular Mycorrhiza-Stimulatory Compounds from Clover (Trifolium repens) Roots. Applied y Environmental Microbiology, 57(2), 434–439. Navarro Aviñó, J.P., Aguilar Alonso, I., López-Moya, J.R. (2007). Aspectos bioquímicos y genéticos de la tolerancia y acumulación de metales pesados en plantas. Ecosistemas, vol. 16, núm. 2, Asociación Española de Ecología Terrestre. Alicante, España. Nazar. R; Iqbal. N; Masood. A; Khan. M, Syeed. S y Khan. N. (2012). "Cadmium Toxicity in Plants y Role of Mineral Nutrients in Its Alleviation," American Journal of Plant Sciences, Vol. 3 No. 10, pp. 1476-1489. doi: 10.4236/ajps.2012.310178. Neville, E. (1996). Jardinería Heliconias. Plantas Tropicales. Disponible http://www.grancanariaweb.com/edgar/botanica/heliconia/index.html Ocampo. N. (2015). Photosynthesis. Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo. Tomado de https://www.uaeh.ed Oehl F, Laczko E, Bogenrieder A, Stahr K, Bösch R, van der Heijden M,Sieverding E. (2010). Soil type y land use intensity determine the composition of arbuscular mycorrhizal fungal communities. Soil Biology y Biochemistry 42: 724–738. Öpik M, Moora M, Liira J, Zobel M. (2006). Composition of root- colonizingarbuscular mycorrhizal fungal communities in different ecosystems around the globe. Journal of Ecology 94: 778–790. Peña, E., Sandoval, H., Zuñiga, O y Torres, M. (2009). Estimates of carbon reservoirs in high altitude wetlands in the Colombian Andes. Journal of agriculture y rural development in the tropics y subtropics, 110(2):103-114. Pérez E. (2009). Fotosíntesis: aspectos básicos. Reduca (Biología). Serie Fisiología Vegetal. 2 (3): 1-47, 2009. Facultad de ciencias biológicas. Universidad Complutense de Madrid. Pérez. E. (2009). Fotosíntesis. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad

82

Complutense de Madrid Aspectos Básicos tomado: http://eprints.ucm.es/9233/1/Fisiologia_Vegetal_Aspectos_basicos.p df Peterson, Larry; Massicote, Hugues y Melville, Lewis. (2004). Mycorrhizas: Anatomy y cell biology. Ottawa: NRC Research press, 173. Pineda H. R. (2004). Presencia de hongos micorrízicos arbusculares y contribución de Glomusintraradices en la absorción y traslocación de cinc y cobre en girasol (Helianthusannus L.) crecido en un suelo contaminado con residuos de mina. Tesis doctoral. Universidad de Colima. Colima, México. Pinto, E., Sigaud-Kutner, T.C.S., Leitão, M., Okamoto, O.K., Morse, D., Colepicolo, P. (2003). Heavy metal–induced oxidative stress in algae. Journal of Phycology 39:1008-1018. Piromyou, P., Buranabanyat, B., Tantasawat, P., Tittabutr, P., Boonkerd, N., Teaumroong, N. (2011). Effect of plant growth promoting rhizobacteria PGPR) inoculation on microbial community structure in rhizosphere of forage corn cultivated in Thailand. European Journal of Soil Biology 47 44-54. Prieto M. J., González R. C., Gutiérrez R. A., Prieto G. F. (2009). Contaminación y fitotoxicidad en plantas por metales pesados provenientes de suelos y agua Tropical y Subtropical Agroecosystems, vol. 10, núm. 1, pp. 29-44, Universidad Autónoma de Yucatán México. Proexport Colombia e Instituto Alexander von Humboldt. (2003). Estudio de Mercado, Heliconias y follajes en el Estado de Florida – Estados Unidos. Instituto von Humboldt. Bogotá, Colombia. Ramírez Heyder (2012). Plantas exóticas: heliconias.Centro agropecuario y de servicios SENA. Mitú, Vaupés. Ramírez, A. (2002). Toxicología del Cadmio. Conceptos actuales para evaluar exposición ambiental u ocupacional con indicadores biológicos.” Facultad de Medicina 63:5164. Ramos. J; Marrufo. D; Guadarrama. P; Carrillo. L. 2010. Hongos micorrízicos- arbusculares. Biodiversidad y desarrollo humano en Raven, P. H.; Evert, R. F.; Eichorn, S. E. 2007. Biología vegetal. 7a ed. Editora Guanabara Koogan: Rio de Janeiro, 830 p. Restrepo. D; Melgar. J y Lombardini. L. 2010 “Ecophysiology of horticultural crops: an overview”. Agronomía Colombiana, vol. 28, no. 1, pp. 71-79, ISSN 0120-9965.

83

Reyes. M, Peña, Alvarado. A; Antuna. D; Vargas. A; Gonzales. L y Vásquez. E. 2010. “Metales pesados: importancia y análisis.”. Centro interdisciplinario de investigación para el desarrollo integral Regional, unidad Durango. Instituto Politécnico Nacional 15:10-17. Rocha. D; Ramos. F, C. 2009.Multiplicación de hongos micorrízicos arbusculares MA nativos de cultivo de Cacao (Theobroma cacao) en maíz (Zea mays) bajo distintos tratamientos agronómicos. Valledupar, 2009., 98p. Tesis de grado. (Licenciatura de ciencias naturales y educación). Universidad Popular del Cesar. Facultad de Ciencias básicas y educación. Rodríguez, M; Martínez de la Casa. M; Romero. L; Sandalio. M. 2008. Toxicidad del Cadmio en Plantas. Ecosistemas 17(3), 139-146. Romero-Puertas, M.C., Rodríguez-Serrano, M., Corpas, F.J., Gómez, M., del Río, L.A., Sandalio, L.M. 2004. Cadmiuminduced subcellular accumulation of O2 ·- and H2O2 in pea leaves. Plant Cell and Environment 27:1122-1134. Rosas. C. 2007. Pigmentos fotosintéticos en la columna de agua determinados mediante técnica espectroscópicas y cromatografías (HPLC-RP) variabilidad espacio- temporal y efectos de radiación UV. Tesis. Universidad Austral de Chile. Facultad de Ciencias. Valdivia, Chile Ruscitti, M; Arango, M; Ronco, M; Beltrano, J. 2011. Inoculation with mycorrhizal fungi modifies proline metabolism y increases chromium tolerance in pepper plants (Capsicum annuum L.). Braz. J. Plant Physiol., 23, 15-25. Sadava. D; Heller. G, Orians. G, Purves. W. 2009. The life: the science of biology. Editorial Médica Panamericana, S. A. Collection: 8th Edition / 1376 pages. Salisbury F.B., Ross C.W. 1994. Fisiología vegetal. Interamericana. McGraw-hill, México. Salt.D; Prince R.C; Pickering. J; Raskin. I (1995). Mechanism of cadmiun mobility y accumlation in Indian mustard. Pp 109: 1427- 1433. DOI: 10.1104/pp.109.4.1427 Sánchez, N; Subero.N y Rivero. C. 2011 “Determinación de la adsorción de cadmio mediante isotermas de adsorción en suelos agrícolas venezolanos.” Acta Agron. Volumen 60, Número 2, p. 190-197, 2011. ISSN electrónico 2323-0118. ISSN impreso 0120-2812 Sandalio, L.M., Dalurzo, H.C., Gómez, M., Romero-Puertas, M.C., del Río, L.A. 2001. Cadmium-induced changes in the growth and oxidative metabolism of pea plants. Journal of Experimental Botany 52:2115-2126. Sanitá di Toppi, L., Gabbrielli, R. 1999. Response to cadmium in higher plants. Environmental and Experimental Botany 41:105-130.

84

Sauve, S; Henderson. W; y Allen. H.E. 2000. Solid- Solution Partitioning of Metals in Contaminated Soils: Dependence on pH, Total Metal Burden, y Organic Matter. Environmental Science Technology, 34:1125–1131. Schüβler, A., Schwarzott, D., & Walker, C. (2001). A new fungal phylum, the Glomeromycota: phylogeny and evolution. Mycological Research, 105(12), 1413-1421. doi: 10.1017/s0953756201005196. Shah, K., Nongkynrih, J.M. 2007. Metal hyperaccumulator and bioremediation. Biologia Plantarum 51:618-634. Shiny. K; Remani. K; Jalaja.T; Sasidharan. V. 2004. Removal of Chromium by two aquatic pteridophytes. J Environ Sci Eng. 2004; 46(3):249-251. Simard, S., DuralL, D.2004. Mycorrhizal networks: a review of their extent, function y importance. Can J Bot 1140-65. Spain, A. 2003. Implications of Microbial Heavy Metals Tolerance in the Environment. Reviews in Undergraduate Research, 2:1-6, 2003. Tisserant, E., M. Malbreil, A. Kuo, A. Kohler, A. Symeonidi, R. Balestrini. 2013. Genome of an arbuscular mycorrhizal fungus provides insight into the oldest plant symbiosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 20117– 20122 Toxicidad del Cadmio en Plantas. Available from: https://www.researchgate.net/publication/39499785_Toxicidad_del_Cadmio_en_Plantas [accessed Jul 02 2018]. Treseder, K. 2004. A meta-analysis of mycorrhizal responses sponses to nitrogen, phosphorus, y atmospheric CO2 in fi eld studies. New Phytol, 347-355. Van der Heijden, M & et al. 1998. Mycorrhizal fungal diversity determines plants biodiversity, ecosystem variability y productivity. Nature, 396: 69-72. Volenec. J; Ourry. A, Joern.B. 1996. A role for nitrogen reserves in forage regrowth y stress tolerance. Physiologia Plantarum. An international Journal for plant Biology. https://doi.org/10.1111/j.1399- 3054.1996.tb00496.x Wang, J. y C. Chen. 2009. Biosorbents for heavy metals removal y their future. Biotechnol. Adv. 27, 195-226. Wang, Y., D. Duanmu,M. H. Spalding 2011. "Carbon dioxide concentrating mechanism in Chlamydomonas reinhardtii: inorganic carbon transport y CO2 recapture." Photosynthesis research 109(1- 3): 115-122.

85

Wua, F., Zhang, G., Dominy, P. 2003. Four barley genotypes respond differently to cadmium: lipid peroxidation and activities of antioxidant capacity. Environmenatl and Experimental Botany 50:63-78. Yadav, S.K. 2010. Heavy metals toxicity in plants: An overview on the role of glutathione y phytochelatins in heavy metal stress tolerance of plants. South African Bot. 76, 167–179. Yurekli, F; Porgali, ZB. 2006. The effects of excessive exposure to copper in bean plants. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 48/2: 7–13.

86

12. ANEXOS

87

Anexo 1. Prueba de tukey en simbiosis micorrizica

Suel o

Cou nt

LS Mean

LS Sigma

Homogeneous Groups

3 120 29,73 0,3751 X

2 120 31,28 0,3751 X

1 120 33,43 0,3751 X

88

Anexo 2. Tabla de mínimos cuadrados medios para simbiosis micorrizicos con 95,0% intervalos de confianza

Stnd. Lower Upper

Level Count Mean Error Limit Limit

GRAND MEAN 360 31,48

Inoculo

0 90 33,03 0,4332 32,18 33,89

1 90 47,27 0,4332 46,41 48,12

2 90 0 0,4332 -0,8521 0,8521

3 90 45,62 0,4332 44,77 46,47

Suelo

1 120 33,43 0,3751 32,7 34,17

2 120 31,28 0,3751 30,55 32,02

3 120 29,73 0,3751 28,99 30,46

Luz

1 180 45,56 0,3063 44,95 46,16

2 180 17,41 0,3063 16,8 18,01

Inoculo by Suelo

0,1 30 33,03 0,7503 31,56 34,51

0,2 30 33,03 0,7503 31,56 34,51

0,3 30 33,03 0,7503 31,56 34,51

1,1 30 48,23 0,7503 46,76 49,71

1,2 30 49,2 0,7503 47,72 50,68

1,3 30 44,37 0,7503 42,89 45,84

2,1 30 0 0,7503 -1,476 1,476

2,2 30 0 0,7503 -1,476 1,476

2,3 30 0 0,7503 -1,476 1,476

3,1 30 52,47 0,7503 50,99 53,94

3,2 30 42,9 0,7503 41,42 44,38

3,3 30 41,5 0,7503 40,02 42,98

Inoculo by Luz

0,1 45 44,6 0,6126 43,39 45,81

0,2 45 21,47 0,6126 20,26 22,67

1,1 45 69,84 0,6126 68,64 71,05

1,2 45 24,69 0,6126 23,48 25,89

2,1 45 0 0,6126 -1,205 1,205

2,2 45 0 0,6126 -1,205 1,205

3,1 45 67,78 0,6126 66,57 68,98

3,2 45 23,47 0,6126 22,26 24,67

Suelo by Luz

1,1 60 45,9 0,5305 44,86 46,94

89

1,2 60 20,97 0,5305 19,92 22,01

2,1 60 44,9 0,5305 43,86 45,94

2,2 60 17,67 0,5305 16,62 18,71

3,1 60 45,87 0,5305 44,82 46,91

3,2 60 13,58 0,5305 12,54 14,63

90

Anexo 3. Prueba de Tukey área foliar

Inoculo Count LS Mean LS Sigma

Homogeneous Groups

2 90 100,6 0,6814 X

0 80 105,0 0,7868 X

3 80 105,5 0,7868 X

1 90 113,9 0,6814 X

91

Anexo 4. Tabla de mínimos cuadrados medios para área foliar con 95,0% intervalos de confianza

Stnd. Low er

Upp er

Level Cou nt

Me an

Error Limi t

Limi t

GRAND MEAN 340 106 ,2

Inoculo

0 80 105 ,0

0,78 68

103, 4

106, 5

1 90 113 ,9

0,68 14

112, 6

115, 2

2 90 100 ,6

0,68 14

99,2 4

101, 9

3 80 105 ,5

0,78 68

104, 0

107, 1

Suelo

1 120 112 ,3

0,59 01

111, 2

113, 5

2 100 109 ,0

0,72 28

107, 5

110, 4

3 120 97, 44

0,59 01

96,2 8

98,6

Luz

1 180 151 ,2

0,48 18

150, 3

152, 2

2 160 61, 25

0,55 64

60,1 6

62,3 5

Inoculo by Suelo

0,1 30 109 ,3

1,18 107, 0

111, 7

0,2 20 107 ,1

1,66 9

103, 8

110, 4

0,3 30 98, 4

1,18 96,0 8

100, 7

1,1 30 117 ,9

1,18 115, 6

120, 2

1,2 30 116 ,8

1,18 114, 5

119, 2

1,3 30 107, 1,18 104, 109,3

92

0 7

2,1 30 107, 0

1,18 104, 6

109,3

2,2 30 104, 3

1,18 102, 0

106,6

2,3 30 90,5 2

1,18 88,1 9

92,84

3,1 30 115, 1

1,18 112, 8

117,5

3,2 20 107, 6

1,66 9

104, 3

110,9

3,3 30 93,8 3

1,18 91,5 1

96,16

Inoculo by Luz

0,1 45 142, 7

0,96 37

140, 8

144,6

0,2 35 67,2 2

1,24 4

64,7 8

69,67

1,1 45 165, 3

0,96 37

163, 4

167,2

1,2 45 62,5 5

0,96 37

60,6 5

64,44

2,1 45 143, 5

0,96 37

141, 6

145,4

2,2 45 57,6 5

0,96 37

55,7 5

59,55

3,1 45 153, 4

0,96 37

151, 5

155,3

3,2 35 57,5 9

1,24 4

55,1 4

60,03

Suelo by Luz

1,1 60 156, 5

0,83 46

154, 8

158,1

1,2 60 68,1 8

0,83 46

66,5 4

69,83

2,1 60 149, 1

0,83 46

147, 4

150,7

2,2 40 68,8 5

1,18 66,5 2

71,17

3,1 60 148, 1

0,83 46

146, 5

149,8

93

3,2 60 46,7 2

0,83 46

45,0 8

48,37

94

Anexo 5. Prueba de Tukey longitud del tallo

Inoculo Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups

2 90 14,96 0,151 X

0 89 15,16 0,1519 X

3 90 15,29 0,151 X

1 90 17,7 0,151 X

95

Anexo 6. Tabla de Mínimos Cuadrados Medios para longitud del tallo con 95,0% intervalos de confianza

Stnd. Lower Upper

Level Count Mean Error Limit Limit

GRAND MEAN

359 15,78

Inoculo

0 89 15,16 0,151 9

14,86 15,46

1 90 17,7 0,151 17,4 18,0

2 90 14,96 0,151 14,67 15,26

3 90 15,29 0,151 15,0 15,59

Suelo

1 120 17,75 0,130 7

17,5 18,01

2 120 16,12 0,130 7

15,86 16,38

3 119 13,46 0,131 3

13,21 13,72

Luz

1 180 19,0 0,106 8

18,79 19,21

2 179 12,56 0,107 1

12,35 12,77

Inoculo by Suelo

0,1 30 16,93 0,261 5

16,41 17,44

0,2 30 15,04 0,261 5

14,53 15,56

0,3 29 13,52 0,266 1

13,0 14,04

1,1 30 19,93 0,261 5

19,41 20,44

1,2 30 17,82 0,261 5

17,31 18,34

1,3 30 15,35 0,261 5

14,83 15,86

2,1 30 17,06 0,261 5

16,54 17,57

2,2 30 15,47 0,261 5

14,96 15,98

2,3 30 12,37 0,261 11,85 12,88

96

5

3,1 30 17,1 0,261 5

16,59 17,62

3,2 30 16,15 0,261 5

15,64 16,67

3,3 30 12,62 0,261 5

12,11 13,14

Inoculo by Luz

0,1 45 18,2 0,213 5

17,78 18,62

0,2 44 12,12 0,216 11,7 12,55

1,1 45 21,65 0,213 5

21,23 22,07

1,2 45 13,75 0,213 5

13,33 14,17

2,1 45 17,93 0,213 5

17,51 18,35

2,2 45 12,0 0,213 5

11,58 12,42

3,1 45 18,21 0,213 5

17,79 18,63

3,2 45 12,38 0,213 5

11,96 12,8

Suelo by Luz

1,1 60 20,6 0,184 9

20,24 20,97

1,2 60 14,9 0,184 9

14,54 15,27

2,1 60 20,1 0,184 9

19,74 20,47

2,2 60 12,14 0,184 9

11,78 12,5

3,1 60 16,29 0,184 9

15,93 16,66

3,2 59 10,64 0,186 5

10,27 11,0

97

Anexo 7. Prueba de Tukey Clorofila

Inoculo Count LS Mean LS Sigma

Homogeneous Groups

0 90 2,677 0,03176 X

3 90 3,304 0,03176 X

2 90 3,394 0,03176 X

1 90 3,51 0,03176 X

98

Anexo 8. Tabla de mínimos cuadrados medios para Clorofila con 95,0% intervalos de Confianza

Stnd. Lower Upper

Level Count Mean Error Limit Limit

GRAND MEAN 360 3,221

Inoculo

0 90 2,677 0,0317 6

2,615 2,74

1 90 3,51 0,0317 6

3,447 3,572

2 90 3,394 0,0317 6

3,331 3,456

3 90 3,304 0,0317 6

3,242 3,367

Suelo

1 120 3,461 0,0275 3,407 3,515

2 120 3,318 0,0275 3,264 3,372

3 120 2,885 0,0275 2,831 2,939

Luz

1 180 3,751 0,0224 5

3,707 3,796

2 180 2,691 0,0224 5

2,647 2,735

Inoculo by Suelo

0,1 30 3,005 0,055 2,896 3,113

0,2 30 2,698 0,055 2,59 2,807

0,3 30 2,328 0,055 2,22 2,437

1,1 30 3,641 0,055 3,533 3,749

1,2 30 3,602 0,055 3,493 3,71

1,3 30 3,287 0,055 3,178 3,395

2,1 30 3,525 0,055 3,417 3,634

2,2 30 3,675 0,055 3,567 3,783

2,3 30 2,98 0,055 2,872 3,089

3,1 30 3,673 0,055 3,565 3,782

3,2 30 3,296 0,055 3,188 3,404

3,3 30 2,943 0,055 2,835 3,052

Inoculo by Luz

0,1 45 2,942 0,0449 1

2,853 3,03

0,2 45 2,412 0,0449 2,324 2,501

1

99

1,1 45 4,139 0,0449 1

4,051 4,227

1,2 45 2,881 0,0449 1

2,792 2,969

2,1 45 3,86 0,0449 1

3,772 3,948

2,2 45 2,927 0,0449 1

2,839 3,015

3,1 45 4,065 0,0449 1

3,977 4,154

3,2 45 2,543 0,0449 1

2,455 2,631

Suelo by Luz

1,1 60 3,738 0,0388 9

3,662 3,815

1,2 60 3,184 0,0388 9

3,107 3,26

2,1 60 3,868 0,0388 9

3,792 3,945

2,2 60 2,767 0,0388 9

2,691 2,844

3,1 60 3,648 0,0388 9

3,571 3,725

3,2 60 2,121 0,0388 9

2,045 2,198

100

Anexo 9. Prueba de Tukey Biomasa Radicular

Inoculo Count LS Mean

LS Sigma

Homogeneous Groups

0 90 31,8 0,5038 X

2 90 40,89 0,5038 X

3 90 41,83 0,5038 X

1 90 49,54 0,5038 X

101

Anexo 10. Tabla de mínimos cuadrados medios para biomasa radicular con 95,0% intervalos de confianza

Stnd. Lower Upper

Level Count Mean Error Limit Limit

GRAND MEAN 360 41,02

Inoculo

0 90 31,8 0,5038 30,81 32,79

1 90 49,54 0,5038 48,55 50,53

2 90 40,89 0,5038 39,9 41,88

3 90 41,83 0,5038 40,84 42,82

Suelo

1 120 43,9 0,4363 43,04 44,76

2 120 43,13 0,4363 42,27 43,98

3 120 36,03 0,4363 35,17 36,88

Luz

1 180 62,17 0,3563 61,47 62,88

2 180 19,86 0,3563 19,16 20,56

Inoculo by Suelo

0,1 30 37,78 0,8727 36,07 39,5

0,2 30 32,84 0,8727 31,12 34,55

0,3 30 24,79 0,8727 23,07 26,51

1,1 30 50,27 0,8727 48,56 51,99

1,2 30 53,17 0,8727 51,45 54,88

1,3 30 45,18 0,8727 43,47 46,9

2,1 30 42,35 0,8727 40,64 44,07

2,2 30 41,59 0,8727 39,87 43,31

2,3 30 38,72 0,8727 37,0 40,43

3,1 30 45,18 0,8727 43,47 46,9

3,2 30 44,91 0,8727 43,19 46,62

3,3 30 35,41 0,8727 33,69 37,13

Inoculo by Luz

0,1 45 46,35 0,7125 44,95 47,75

0,2 45 17,26 0,7125 15,85 18,66

1,1 45 76,1 0,7125 74,7 77,5

1,2 45 22,98 0,7125 21,58 24,39

2,1 45 61,98 0,7125 60,57 63,38

2,2 45 19,8 0,7125 18,4 21,2

3,1 45 64,27 0,7125 62,87 65,67

3,2 45 19,39 0,7125 17,99 20,79

Suelo by Luz

1,1 60 65,01 0,6171 63,79 66,22

102

1,2 60 22,79 0,6171 21,57 24,0

2,1 60 65,01 0,6171 63,8 66,23

2,2 60 21,24 0,6171 20,02 22,45

3,1 60 56,5 0,6171 55,29 57,72

3,2 60 15,55 0,6171 14,33 16,76