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UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIA ESCUELA PARA GRADUADOS INSTITUTO DE REPRODUCCIÓN BOVINA CÓRDOBA (IRAC) ESPECIALIZACIÓN EN REPRODUCCIÓN BOVINA ESTUDIOS PRELIMINARES DE LOS PARÁMETROS SEMINALES DE UNA ORCA (ORCINUS ORCA). Med. Vet. Juan Pablo Loureiro CÓRDOBA, 2014

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIA

ESCUELA PARA GRADUADOS

INSTITUTO DE REPRODUCCIÓN BOVINA CÓRDOBA (IRAC)

ESPECIALIZACIÓN EN REPRODUCCIÓN BOVINA

ESTUDIOS PRELIMINARES DE LOS PARÁMETROS

SEMINALES DE UNA ORCA (ORCINUS ORCA).

Med. Vet. Juan Pablo Loureiro

CÓRDOBA, 2014

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INTRODUCCIÓN

La orca (Orcinus orca) es el delfín más grande de la actualidad, su nombre

científico deriva del latín orca u ork que significa monstruo misterioso de extraño

aspecto e inus que es un sufijo que significa parecido o perteneciente a (Bastida y

Rodríguez, 2003).

Mundialmente se reconoce una única especie cosmopolita, aunque algunos

científicos propusieron dos nuevas especies (Orcinus nanus y Orcinus glacialis)

producto del análisis de ejemplares capturados en la Antártida (Bastida y

Rodríguez, 2003).

La orca es probablemente uno de los cetáceos más fácilmente identificable,

debido a su coloración característica blanca y negra, los machos adultos llegan a

medir hasta 9 metros de longitud, con un peso aproximado de 9 toneladas. Son

animales de ciclo de vida largo que maduran sexualmente una vez pasado los 10

años de edad aproximadamente (Bastida y Rodríguez, 2003)

En Mundo Marino San Clemente del Tuyú, Buenos Aires Argentina se encuentra

un macho de Orca (Orcinus orca) Kshamenk, de 25 años de edad y un peso

aproximado de 6 toneladas, maduro sexualmente.

Este macho ha sido un ejemplar clave para la investigación de la especie en

ambientes controlados, desde estudios de comportamiento hasta el más reciente

de reproducción. También cabe destacar la importancia de difusión a nivel

educacional que cumple.

Estos individuos que se encuentran en ambientes controlados son una esperanza

de vida para la especie ya que frente a la problemática ambiental de sobrepesca,

degradación del hábitat y contaminación, muchas poblaciones hoy están siendo

amenazadas en la naturaleza (Taylor et al., 2013)

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La evaluación de la calidad seminal es de gran importancia para la preservación

de una especie. Muchos test de laboratorios han sido desarrollados para evaluar

la calidad seminal y correlacionarla con la fertilidad futura. Una de las

características de los espermatozoides que ha llamado la atención de los

investigadores durante mucho tiempo es la motilidad, para cuyo estudio

descripción y valoración se han desarrollado varias técnicas (Roberk et al., 2001).

El objetivo del presente trabajo es evaluar la calidad seminal y reproductiva de una

Orca (Orcinus orca) del hemisferio Sur en un ambiente controlado.

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MATERIALES Y MÉTODOS

Animal y colección de semen.

Mundo Marino cuenta con un único macho de orca (Orcinus orca) (Foto 1) llamado

Kshamenk el cual convive con una hembra de delfín nariz de botella (Tursiops

truncatus) de nombre Floopy ambos animales de 25 años de edad y sexualmente

maduros.

(Foto 1: Ejemplar macho de Orcinus orca)

Mediante estímulos discriminativos se condicionaron los animales para:

1. Kshamenk se relacione de manera tranquila mediante juegos con Floppy.

2. Floppy acepte y colabore con los juegos de Kshamenk.

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3. Diferenciar los juegos de la actividad sexual para reforzar esta última.

4. Condicionar ambos animales para que realicen esta actividad sexual en

presencia de los entrenadores en un momento específico del día, no

durante toda la jornada, por ejemplo no durante los shows.

5. Entrenarle a Kshamenk que se coloque en posición de “roll-over” cerca del

área de manejo para desensibilizar la zona genital.

6. Kshamenk permita que manipulemos el pene para secar el agua salada y

colocar el A.V. (vagina artificial).

7. La obtención y discriminación de las muestras mediante el refuerzo y la

constancia.

8. Floppy colabore en todas las instancias del comportamiento.

Para la colección del semen se designa un grupo de colección de 4 personas

llamado “colection team”. Una persona controla la posición de Floppy durante el

momento de trabajo con el macho y tres personas trabajan con el macho, una que

manipula el pene, otra que seca con toallas el agua salada y la tercera persona o

líder encargada de colocar el AV (vagina artificial) (Fotos. 2, 3, 4). Los horarios

elegidos para realizar el comportamiento fueron por la mañana, en el mismo lugar

del predio y respetando siempre la predisposición de los animales.

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(Foto. 2)

(Foto. 3)

(Foto. 4)

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Análisis del semen.

El análisis de la muestra de semen en el laboratorio se realizó primero en forma

macroscópica donde se observaron distintos parámetros como volumen, color,

densidad, osmolaridad, pH y cuerpos extraños.

Volumen: se observó directamente sobre tubo graduado, teniendo en

cuenta que los eyaculados hasta ahora registrados varían entre 1 ml a 42

ml.

Color: se consideraron normales los colores que van del blanco al

amarillento siendo patológicos los colores rosado, amarronado y verdosos.

Densidad: la densidad del semen varía desde un semen acuoso, lechoso

cremoso, hasta un cremoso, estando directamente relacionada con la

concentración.

Osmolaridad: se evaluó con micro osmómetro (the advance tm Micro

osmometer). La Osmolaridad aceptada para el semen de un cetáceo es

entre 335 a 375 mOsm/kg. (Foto 6).

Ph: se evaluó extrayendo una gota de semen del tubo y colocándola sobre

una tira indicadora de pH. Se considera un pH normal entre 6,8 a 7.

Cuerpo extraño: se evaluó observando el fondo del tubo para detectar la

presencia de algún cuerpo extraño, se considera como negativo o positivo.

Finalizada la evaluación macroscópica se realizó la evaluación microscópica de la

muestra de semen. Aquellos parámetros hasta ahora estudiados son motilidad

progresiva o motilidad individual, motilidad total, velocidad espermática o vigor,

concentración y porcentaje de vivos muertos a través de la coloración vital.

M.P. (Motilidad progresiva) o M.I. (Motilidad individual): para realizar

esta evaluación se colocó una gota de semen sin diluir en un portaobjeto

atemperado de 36° a 37° grados centígrados y se colocó sobre ésta un

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cubreobjeto también a la misma temperatura. Se observó al microscópico

siempre sobre platina térmica a 400 aumentos, se debe observar un campo

y valorar subjetivamente los espermatozoides que se mueven en forma

rectilínea progresiva siendo éstos los que atraviesan el campo de

observación. Los espermatozoides que giran en círculos o avanzan en

forma oscilatoria se consideron que tienen movimientos anormales.

El porcentaje que se indicó es el de los espermatozoides con movimiento

rectilíneo progresivo del total de espermatozoides aceptados.

M.T. (Motilidad total): se evaluó al mismo tiempo que la motilidad

individual y se observó la cantidad de espermatozoides que presentan

movimiento del total de la muestra. El porcentaje que solo se indica es el de

los espermatozoides con movimiento.

Velocidad espermática o Vigor: se evaluó el vigor al mismo tiempo que la

M.I. y la M.T, teniendo en cuenta la velocidad con la que estos

espermatozoides atraviesan el campo. La escala que se utilizó es de 0 a 5

evaluando como 0 los espermatozoides inmóviles y como 5 los que

avanzan rápidamente por el campo y son difíciles de seguir visualmente.

Dentro de estos parámetros se consideraron los puntos intermedios.

Concentración: para evaluar la concentración, se preparó previamente una

solución salina formolada al 2%. Se colocaron 10 microlitros de semen en 2

ml de solución salina formolada (1/200) y se homogenizó invirtiendo el tubo

varias veces. Una vez homogenizado, se tomó 14 microlitros

aproximadamente y se cargó una cámara de Newbawer por capilaridad, en

ambos retículos, teniendo en cuenta de cargar otros 14 microlitros para el

otro retículo volviendo a homogenizar entre cada una de las cargas.

Nota: para preparar la cámara, se humedecieron los bordes de esta antes

de colocar el cubrecamara y luego se presionó ejerciendo una leve fricción

para que el cubrecamara quede fijo y al invertir la cámara no se caiga. Una

vez cargada la cámara se debe dejar reposar unos minutos para permitir

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que todos los espermatozoides decanten y se ubiquen en el mismo plano

para contarlos.

Luego se procedió a ubicar el retículo de glóbulos rojos a 100 aumentos, y

una vez localizados, se pasó a 400 aumentos para realizar el conteo. Se

contaron todos los espermatozoides que se encuentran en las cuatro

cuadrículas de las puntas y la central (5 en total) teniendo en cuenta de

incluir a los espermatozoides sobre 2 de las triples líneas de cada

cuadricula ya sea la superior derecha o la izquierda inferior.

Se contaron los retículos de ambos lados de la cámara y se sacó un

promedio. Al número de espermatozoides contado se lo multiplicó por

10.000 obteniendo la cantidad de espermatozoides por mililitro cúbico de

semen.

Coloración Vital o porcentaje de vivos muertos: se realizó extrayendo

una gota de aproximadamente 10 microlitros de semen puro y colocándola

sobre la punta de un portaobjeto limpio y desengrasado atemperado a 36° a

37° C sobre una platina térmica. Sobre esta gota se colocó una gota de

aproximadamente 30 microlitros de eosina que debe estar a la misma

temperatura que el semen. Se mezcló suavemente con la punta de la pipeta

por aproximadamente 20 segundos. Se utilizó otro portaobjeto también

atemperado, y se apoyó sobre el borde de la gota para que por capilaridad

se distribuya sobre el porta objeto, se levantó y se desarrolló el extendido

en forma firme. El fundamento de la técnica es el siguiente: el colorante

penetra la membrana de los espermatozoides muertos, dejando sin teñir los

que se encontraban vivos al momento de realizar la tinción. Para sacar el

porcentaje de espermatozoides vivos se procedió a observar el frotis a 400

aumentos contando en guarda griega todo los espermatozoides de cada

campo evaluado, discriminando los que están teñidos como muertos y los

sin teñir como vivos. Se contaron más de 100 células y para obtener el

porcentaje. La valoración de la tinción vital se realizó en el mismo día ya

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que pasado un determinado tiempo todos los espermatozoides comienzan a

teñirse.

(Foto 5: Fotografía microscópica de una

muestra de semen)

(Foto 6: Microsmómetro)

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RESULTADOS

Se colectaron un total de 110 muestras de semen desde el año 2010 hasta el

presente año 2014. En la observación macroscópica de los espermatozoides se

obtuvieron los valores promedios, máximos y mínimos para cada una de los

parámetros evaluados (Tabla 1).

Tabla 1: Evaluación macroscópica de los espermatozoides.

PARÁMETRO

PROMEDIO ±

DESVÍO ESTÁNDAR

VALOR MÁS

ALTO

VALOR MÁS

BAJO

Volumen

8,5 ± 7,2 42 ml 0,4 ml

Color

100% blanco

Densidad Lechoso- cremoso

Osmolaridad

366,5 ± 46,4 687 mOsm 338 mOsm

PH

7,2 ± 0,3 8,4 6,5

Cuerpo extraños

100% negativo

Al igual que la evaluación macroscópica se realizó la evaluación microscópica de

los espermatozoides (Tabla 2)

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Tabla 2: Evaluación microscópica de los espermatozoides.

PARÁMETRO

PROMEDIO ± DESVÍO

ESTÁNDAR

VALOR MÁS

ALTO

VALOR MÁS

BAJO

Motilidad

progresiva

89,0 ± 12,3 98 % 20 %

Motilidad total

88,9 ± 11,1 98% 30%

Velocidad

espermática

4,2± 0,8 5 2

Concentración

1014,3 x 10 6 ± 565,1 x 10 6 2830 x 10 6 60 x 10 6

Porcentaje de

vivos muertos

88± 12,6 % 96% 20%

DISCUSIÓN y CONCLUSIÓN

La colección de semen, a través de condicionamiento operante con refuerzo

positivo, es una técnica no invasiva que ha permitido colectar buena calidad y

cantidad de semen demostrándose también que es bien tolerada en los Mamíferos

Marinos.

El análisis de semen es una forma directa de la evaluación de la condición

reproductiva de un individuo, cuyo conocimiento es importante para la planificación

de la cría y manejo de la población en ambientes controlados.

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La importancia de este trabajo es que sienta base de estudio y además permite

seguir trabajando y investigando sobre las características reproductivas de la

especie orca (Orcinus orca) que en el futuro podrá estar amenazada por el

hombre.

BIBLIOGRAFÍA

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