MIEQB Sandra Marín San Román

Mónica Martínez Junquera

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Aplicación RMN

Estudio metabolómico con HRMAS-RMN de H1 para evaluar la calidad y trazabilidad de queso

mozzarella de leche de búfala.

Introducción

La producción de mozzarella en la región de Campania (Italia) es relevante para mantener la

economía agroalimentaria de la región, así como la denominación de origen. La alta demanda

del consumidor de este queso, la cantidad limitada de leche búfala disponible y el alto precio de

mercado, convierten a este producto en uno de los más afectados por los fraudes y las

adulteraciones.

Con el fin de evaluar la autenticidad, trazabilidad y calidad de este producto, se ha empleado la

RMN-HRMAS (High Resolution Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance) en

combinación con análisis de componentes principales (PCA).

Esta técnica RMN consiste en hacer girar a la muestra a una velocidad superior que la habitual

consiguiendo unos espectros mono y bidimensionales de gran calidad, se utiliza para materiales

semisólidos permitiendo examinar directamente los metabolitos del producto alimentario sin

pretratamiento de muestra.

Preparación muestra

Para ello se analizaron 37 muestras de queso, todas ellas obtenidas a partir de leche de búfala

producida por animales criados en la fábrica “La perla del mediterráneo” y 12 muestras con

denominación de origen de un mercado local.

Las 37 muestras provenientes de la fábrica se trataron y se guardaron por individual dentro de

un paquete sumergido en suero de mozzarella y almacenado a 25 °C hasta su análisis por RMN-

HRMAS, después se devolvió a su envase original almacenándolo durante dos días en las mismas

condiciones tras los que se realizó un análisis RMN-HRMAS de la muestra envejecida.

Experimentos RMN

Todos los experimentos se llevaron a cabo a una temperatura de 25 ± 1°C en un espectrómetro

Bruker Avance de 400MHz equipado con una sonda 1H-13C HRMAS Bruker que hace girar al rotor

a 5KHz utilizando como disolvente D2O.

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La identificación estructural de los metabolitos de las muestras se consiguió a partir de espectros

de RMN bidimensionales:

1. Homonuclear 1H-1H COSY (COrrelation SpectroscopY) y TOCSY (Total COrrelation

SpectroscopY).

2. Heteronuclear 1H-13C HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation)

Resultados RMN

El espectro 1H HRMAS convencional no discernía entre las muestras de queso por ello se

aplicaron dos secuencias de pulso eDiff (Diffusion measurement) y eCPMG (Carr-Purcell-

Meiboom-Gill) que eliminaron los metabolitos específicos y por lo tanto las señales de las

moléculas de movimiento lento (compuestos lipídicos). Esta simplificación permitió una

observación más clara de picos y multipletes de moléculas relativamente más rápidas

(aminoácidos, ácidos orgánicos, carbohidratos…), a pesar de la reducción parcial de la intensidad

de la señal, y en ocasiones la resolución de la constante de acoplamiento (J).

Figura 1. Espectros 1H HRMAS de muestras de mozzarella a) espectro de 1H convencional; b) eDiff; c)

eCPMG

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Figura 2. Espectros de 1H eCPMG a) Muestras de la fabrica; b) Muestras del mercado local; c) Muestras

de la frabrica envejecidas de dos días.

Tabla 1. Desplazamientos químicos especficos de cada metabolito.

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Conclusiones

En este trabajo se demostró que la técnica RMN-HRMAS es una herramienta eficiente, poderosa

y rápida para caracterizar la composición molecular de quesos.

Las condiciones adoptadas para los espectros eCPMG y eDiff modificados proporcionan

espectros simplificados pero significativos que revelaron las señales necesarias para un estudio

metabolomico.

Las muestras de fábrica (a) tienen más cantidad de β-galactosa y β-lactosa, mientras que las del

mercado local (b) tienen un mayor contenido de ácido acético, esto se debe al proceso de

transformación.

Entre a) y c) se puede observar como aparece un pico correspondiente al alcohol isobutílico, y

crecen los picos correspondientes a ácido acético y ácido láctico de las muestras envejecidas.

La base de datos obtenida en este experimento sirve como una herramienta para probar y

evaluar la calidad molecular de este tipo de queso, rastrear su origen geográfico, evitar posibles

fraudes y adulteraciones y estudiar su envejecimiento.