Estudio funcional del receptor dopaminérgico D2 en …...neurotransmisor al espacio sináptico...

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Tesis de Posgrado

Estudio funcional del receptorEstudio funcional del receptordopaminérgico D2 en el sistemadopaminérgico D2 en el sistema

nervioso central de ratonesnervioso central de ratonesmodificados genéticamentemodificados genéticamente

Gelman, Diego Matías

2003

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasBiológicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Gelman, Diego Matías. (2003). Estudio funcional del receptor dopaminérgico D2 en el sistemanervioso central de ratones modificados genéticamente. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3579_Gelman.pdf

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Universidad de Buenos AiresFacultad de Ciencias Exactas y Naturales

Estudiofuncional del receptordopaminérgico DZ en el sistema nervioso

central de ratones modificadosgeneticamente.

Tesis de Doctorado:

Diego M. Gelman

Director:

Dr Marcelo Rubinstein

Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular(lNGEBl-UBA-CONICET)

Mayo 2003

Abreviaturas

AccAMPTAOBCélulas ESCOMTD2CD2LDADA'I‘DOPACEPGPcGPi6-OHDAhPLAPHVAHypLCL-DOPAMAONSTPKCSNCSNPSNpcSNprSTTHVMATVTA

Núcleo acumbens

ot-metil-p-tirosinaBulbo olfatorio accesorioCélulas totipotenciales embrionariascatecol O-metiltransferasaReceptor D2 cortoReceptor D2 largoDopaminaTransportador de dopaminaácido 3,4-dihidroxifenilacéticoEnfermedad de ParkinsonGlobo pálido externoGlobo pálido interno6-hidroxidopaminafosfatasa alcalina placentaria humanaácido homovainillínicoHipotálamoLocus coeruleusL-3,4-dihidroxifenilalaninaMonoamina oxidasaNúcleo subtalámicoProteína quinasa CSistema nervioso centralSistema nervioso periféricoSustancia nigra pars compactaSustancia nigra pars reticulataCuerpo estriadoTírosina hidroxilasaTransportador vesicular de monoaminasÁrea tegmental ventral

Tesis Doctoral. Diego M. Gelman.

Indice.

Introducción.

I. La Dopamina.l. l. Síntesis, Liberación y Degradación dela Dopamina.1.2. Sistemas Dopaminérgicos Centrales.l .3. Receptores Dopaminérgicos.

I.3. l. Clasificación.I.3.2. Estructura Genómica.I.3.3. Estructura Aminoacidica.1.3.4. Localización.

I.3.5. Segundos Mensajeros.¡.3.6. Propiedades Farmacológicas.

1.4. Receptor DZ.1.5. Anatomía yfisiología de los ganglios de la base.I.6. Enfermedad de Parkinson.I. 7. Modelo animal: lesión cerebral con 6-hidroxidopamina.1.8. Respuestas conductuales. Interacción Dl/D2.I.9. Otras Fisiopatologías Asociadas a la Neurotransmisión Dopaminérgica.

1.9.] Esquizofrenia.2. Sistema Cre-loxP.3. Animales transgénicos como herramienta de estudio.

Objetivos.

Resultados y Discusión.

Parte 1.1. Modelo animal para el estudio de lafimción dopaminérgica.

I. l. Establecimiento del modelo de lesión estriatal con 6-hidroxidopamina.I.2. Desarrollo de supersensibilidad conductual en ratones mutantes para el receptor DZ.

1.2.]. Establecimiento de Ia lesión estriatal.1.2.2. Desarrollo de supersensibilidad en ausencia del receptor DZ.I.2.3. Papel del receptor DI en la respuesta locomotora en ausencia de receptores D2.1.2.4. Efecto del bloqueo inespecífico de receptores "tipo D2 " sobre las respuestas

supersensibles.I.3. Análisis de las interacciones entre receptores de "tipo DI ”y “tipo DZ

Parte 2.i. Ratón transgénico TH-Cre.

l. I. Construcción de un transgén que expresa recombinasa Cre bajo el promotor detirosina hidroxilasa.

I.2. Producción de animales con el transgén —9THCre.1.3.Patrón de distribución de la proteína transgéncia Cre

1.3.¡Expresión de tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre en cerebro.I.3.2. Colocalización de tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre.l. 3.3. Detección de tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre por inmunojluorescencia.

2. Linea reportera Z/AP.2. I. Genotipi/ïcación de animales.

43

45

46464649495]54

5557


2.2. Expresión de LacZ.3. Ratones doble transgénicos.

3. l. Actividad de recombinasa Cre en cerebro de animales doble transgénicos.3.2. Expresióny actividad de la recombinasa Cre en retina.3.3. Expresióny actividad de recombinasa Cre en la médula a'e la glándula adrenal.3.4. Expresión de recombinasa Cre en estadio embrionario.

Parte 3.l. Introducción de una mutación condicional nula en el gen del receptor

D2 de ratón.l. l. Construcción de un vector de recombinación homóloga dirigido al exón 2

del gen del receptor de dopamina DZ.¡.2. Preparación defibroblastos y determinación de la presencia de Micoplasma.1.3. Preparación y titulación de mLIF. Puesta a punto del cultivo de células ES.1.4. Electroporación de células ES con el vector de recombinación homóloga pCON3.

Seleccióny determinación de clones positivos por Southern blot.1.5. Trans/¡accióntransitoria de clones positivos con un plásmido que expresa

recombinasa Cre para escindir a los marcadores de selección.I.5. l . Determinación de clones positivos por PCR y Southern blot.

1.6. Microinyección de blastocistos y obtención de quimeras.

Conclusiones.

Parte l.Parte 2.Parte 3.

Materiales y Métodos.

Parte l. Modeloanimal para el estudio de lafunción dopaminérgica.Animales y Bioterio.Lesión estriatal unilateral con 6-()HDA.Drogas y tiempos de inyecciónprevios alos análisis conductuales.Pruebas conductuales. Determinación de las rotaciones.Determinación del contenido de monoaminas y sus metabolitos.

Parte 2. Línea de animales TH-Cre.Construcción del transgén —9THCre.Técnicas de biologia molecular empleadas.Preparación del transgén para la microinyecciónpronuclear.Animales y bioterio.Obtención de embriones.Microinyecciónpronuclear.Transferencia embrionaria a hembras pseudopreñadas.Identificación de ratones transgénicos. Análisis de la presencia del transgén.Localización de Tirosina hidroxilasa y Cre por inmunohistoquimica.lnmunofluorescencia contra THy Cre.Obtención de animales doble transgénicos.Detección del gen LacZ en animales transgénicos reporteros Z/APy doble transgénicos.Determinación de la actividad de Cre evidenciadopor actividad de lafosfalasa alcalina.Determinación de TH, Cre y hPLAP en embriones de ¡3.5 d.p. c.

74

74

76

77

78

8]

84

858687


Parte 3. Ratón D2fl0x 108Clonado de unfragmento genómico que contiene al exón 2 del receptor dedopamina D2 de ratón. l 08Construcción del vector de recombinación homóloga del receptor de dopamina D2. ¡10Preparación defibroblastos embrionarios murinos resistentes aG4¡8. lllDetección de Micoplasma en cultivo defibroblastos embrionarios murinos (MEFs). 1/3Preparación de LIF. ll 4Titulación de LlF. Il 5Cultivo de células totipotenciales embrionarias murinas. [/6Electroporación de células ES. ll7Selección. repique, amplificación y almacenamiento de clones resistentes. [/8Transfección transitoria de células ES con un plásmido que expresa la recombinasa Cre. l l 9Congelada, almacenamiento y descongelado de células ES. II 9Diseñoy puesta a punto de una PCRpara la identificación de clonesportadoresde la recombinación. ¡20

Referencias. l 21

INTRODUCCION —

Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.

Introducción.

I. La Dopamina.

l,a función de la dopamina (DA) como un potencial neurotransmisor en vías

neuronales específicas del sistema nervioso central fue sugerida a fines de la década del 50

por el neurofarmacólogo Arvid Carlsson, que por este descubrimiento recibió el premio

Nobel de medicina en el año 2000. En sus trabajos demostró la existencia de Ia dopamina,

su distribución, locali7ación celular y posibles funciones fisiológicas de las catecolaminas

en el sistema nervioso central (Carlsson 1958, 1959). Posteriormente, Carlsson propuso la

existencia de receptores específicos para este neurotransmisor luego de anali7ar los efectos

de los neurolépticos clorpromazina y haloperidol en el cerebro de ratones (Carlsson y

l.indquist, ¡963). lla dopamina, la noradrenalina y la adrenalina, son las tres catecolaminas

con función biológica más estudiadas en vertebrados. El sistema catecolaminérgico central

se compone de 12 grupos de cuerpos celulares designados desde Al hasta A12, además de

los grupos Cl, C2 y C3 que producen adrenalina como neurotransmisor final (Dahlstrom y

Fuxe, 1964). Más de la mitad del contenido de catecolaminas del sistema nervioso central

está representado por la dopamina dentro de los grupos celulares de la sustancia nigra (A9),

el área tegmental ventral (AIO) y el hipotálamo (A12). El sistema dopaminérgico central ha

sido objeto de estudio no sólo por su relación con los efectos motores adversos producidos

en la enfermedad de Parkinson o por su asociación con desordenes psiquiátricos como la

esquizofrenia, sino también por la relación de la dopamina con comportamientos apetitivos,

de recompensa y de consumo compulsivo de sustancias adictivas.


I. I. Síntesis, Liberación y Degradación de la Dopamina.

La neurotransmisión dopaminérgica, como la totalidad de los neurotransmisores

dentro del sistema nervioso central, se encuentra regulada en múltiples pasos. En las

diferentes etapas de síntesis, almacenamiento en vesículas, liberación, recaptación y

degradación, existen variados puntos de control que permiten regular la neurotransmisión

dopaminérgica según los distintos requerimientos fisiológicos. El proceso de liberación al

espacio sináptico se produce de manera controlada, dependiendo de los potenciales

sinápticos de las neuronas y de la consiguiente entrada de Ca2+en los terminales. Por

último, la extinción de la señal de neurotransmisión dopaminérgica está regulada mediante

mecanismos de degradación y recaptación que limitan su accionar sobre la postsinapsis.

El primer paso de síntesis comien7a cuando el aminoácido L-tirosina es convertido

en el intermediario L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) por intermedio de la enzima

tirosina hidroxilasa (TH) (Figura l). La actividad hidroxilasa de esta enzima depende de la

presencia de tirosina y oxígeno como sustrato y de la acción de la tetrahidrobiopterina como

cofactor esencial (Daubner et aL, 1992, Zigmond 19893). La tirosina hidroxilasa catali7a el

paso limitante en la síntesis de catecolaminas, hidroxilando la tirosina a

dihidroxifenilalanina quien es subsecuentemente convertida a dopamina, norepinefrina y

epinefrina. Por lo tanto, TH es crítica para la adquisición del fenotipo catecolaminérgico.

En adultos TH es expresada en dos grupos importantes en el sistema nervioso periférico

(SNP) y en regiones discretas del sistema nervioso central (SNC) que son extremadamente

diversas. TH está presente en muchos sitios a nivel embrionario que no se mantienen a nivel

adulto como la médula espinal entre otros (Teitelman el a1., 1981; Price et aL, 1983;

Jonakait el a1., 1984; Foster e! aL, 1985; Katz er aL, 1990). Por lo tanto el patrón de

expresión en estadios embrionarios es diferente al que se observa en adultos. TH pudo ser

detectada en embriones de 8.5 días post coito en ratones (Thomas e! aL, 1995). Estudios en

grupos de células, como por ejemplo en la médula espinal ventral lateral de animales

neonatos, determinaron que TH está presente, pero no las catecolaminas, pues las otras

enzimas de la vía biosintética están ausentes (Foster et aL, 1985).

Tesis Docroral. Diego M. Gelman. Introducción.

l,a importancia de TH durante la gestación ha sido desestimada hasta que fue

demostrado que el 60 a 70% de los animales mutantes nulos para el gen de TH, mueren

entre los días de gestación embrionaria F, l 1,5 y E ¡4,5 con mas de 90% de letalidad al día

del nacimiento (Kobayashi e! aI., 1995; Zhou el aL, 1995). Como la inervación

catecolaminérgica de sus células blanco no se establecen hasta el nacimiento, el papel de

TH durante el desarrollo es diferente al de la vida adulta. La regulación espacial y temporal

de la transcripción de TH es regulada por una compleja interacción de proteínas y factores

de transcripción, actuando en sitios 5' del gen de TH de rata para activar la maquinaria de

expresión basal. Análisis mutacionales determinaron la presencia de regiones

amplificadoras que median en la expresión basal: un sitio AP-l en -205 pb y un sitio que

responde a AMPc (CRE) en —45pb (Wong e! aL, 1994). Además de los mencionados se

encontró una región entre la caja TATA y el sitio de iniciación de la transcripción. Las

secuencias AP-l , Cre y la del promotor proximal están conservadas en la región S'de todos

los genes de TH de mamíferos estudiados (O'Malley el aL, 1987; D'Mello el aL, 1988;

Patankar er aL, 1997). Para producir una expresión tejido especifica de genes reporteros

bajo el promotor de TH se hicieron animales transgénicos con longitudes variables del

promotor. Los estudios demostraron que aquellos animales con regiones del promotor

menores de 4 kb no producían un patrón de expresión comparable al gen de TH (Banerjee

et aL, 1992; Sasaoka et aL, 1992; Min et aL, 1994; Liu e! aL, ¡997). Sólo con regiones

mayores a 4,5 kb, se logró obtener una expresión comparable a la endógena con un mínimo

de expresión ectópica (Banerjee et aL, 1994; Liu el aL, ¡997;Min e! aL, 1994; Trocme e!

aL, 1998).

Como fue mencionado anteriormente, la hidroxilación de la tirosina es el paso

limitante en la biosíntesis de catecolaminas debido a la baja actividad relativa de esta

enzima. La reacción está regulada por dos procesos, uno que involucra la síntesis de nuevas

moléculas de TH y otro que involucra la activación de la enzima ya formada. La inducción

de la transcripción y traducción del gen de TH ocurre lentamente y es un proceso de larga

duración dependiente de la síntesis de ARNm y proteínas. Por el contrario, la fosforilación

de cuatro residuos de serina en la enzima es un proceso rápido, fácilmente reversible y es


dependiente de quinasas activadas por AMP-cíclico o por Ca2+(PKC o Ca-Calm-quinasa)

(Zigmond e! aL, l989b).

La fosforilación de la serina 40 de la enzima TH humana produce un cambio

conformacional que incrementa su actividad (Haavik el aL, 1990). Otro de los mecanismos

de control está determinado por la acumulación de producto final, capaz de frenar la vía de

síntesis. Las catecolaminas libres son capaces de inhibir competitivamente de manera

rápida y reversible a la enzima TH. Por el contrario, la liberación dopaminérgica a través

del terminal disminuye los niveles citoplasmáticos de dopamina y produce la desinhibición

de la enzima que transforma la tirosina en L-DOPA. La síntesis de L-DOPA se produce en

el citoplasma y puede ser fácilmente inhibida con drogas análogas de la tirosina, como la a

metil-p-tirosina (AMPT) que inhibe competitivamente a la enzima TH (Figura 2). El

siguiente paso lo produce la enzima DOPA-descarboxilasa que, utilizando como cofactor al

piridoxal fosfato, posee una alta eficiencia para rápidamente transformar a la I.-DOPA en el

producto final dopamina mediante la eliminación del grupo carboinO (Figura l).

L-Tlmlm

TlmlnlMi"...(Tohhldcoblopm'lmmxlgono)

HO

r4.

H0 CHJ':— coonH

L A Figura l:Camino biosintético de la dopamina. La

no” L-tlrosma‘es convertidaa L-pOl’A por Intermedio("Mon¡w) de la accron de la enzrma tirosma hidroxflasaen

presencia del cofactor tetrahidrobiopterina yoxígeno. Posteriormente, Ia L-DOPA estransformada por la enzima DOPA-decarboxilasa en

m W presenciade piridoxalfosfato para generar elneurotransmisor dopamina.

Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Introducción.

Luego de ser sinteti7ada, la dopamina es almacenada en vesículas para asegurar la

liberación controlada (Figura 2). Este almacenaje disminuye la posibilidad de que sea

degradada en el citoplasma y de la posible difusión fuera de la célula. F,n las neuronas, la

dopamina es incorporada en las vesículas a través del transportador vesicular de

monoaminas 2 (VMATZ), un transportador de alta afinidad constituido por una bomba

dependiente del pH que introduce una molécula de dopamina por cada dos protones

eliminados, requiriendo de la hidrólisis de ATP (Schuldiner er aL, 1994). Cuando un

potencial de acción produce la despolarización del terminal sináptico, se abren canales de

Ca2+ dependientes del voltaje con el consecuente influjo de iones, lo que promueve la

fusión de las vesículas con la membrana sináptica, produciéndose la descarga del

neurotransmisor al espacio sináptico (Figura 2). La anfetamina es una potente droga

simpaticomimética que estimula al sistema nervioso central y periférico mediante la

liberación de las catecolaminas de las vesículas almacenadas dentro de los terminales

sinápticos resultando en una difusión masiva del neurotransmisor fuera del terminal (Figura

2).

Los mecanismos de degradación de la dopamina involucran la deaminación

oxidativa por intermedio de la monoamina oxidasa A y B (MAO A y B), la O-metilación

mediante la catecol O-metiltransferasa (COMT) y la conjugación llevada a cabo por

sulfotransferasas y glucuronidasas. Los productos conjugados pueden ser eliminados en la

bilis o en la orina. Esta multiplicidad en los caminos de degradación permite una rápida

eliminación del neurotransmisor. Las vías de degradación dependen de la

compartimentalización de las enzimas metabólicas que se encuentran en diferentes células y

tejidos. Las MAO se encuentran dentro de las neuronas catecolamine'rgicas, existiendo dos

isoenzimas capaces de degradar a la DA: la MAO-A y la MAO-B. Ellas se diferencian por

la especificidad celular y de tejido, por sus propiedades immunológicas y por que su acción

es bloqueada por diferentes inhibidores (Figura 3). Ambas isoenzimas son expresadas por

diferentes genes que evolucionaron de un ancestro común y se encuentran fijadas a la

membrana externa de las mitocondrias (Zhu el aI., 1992). Aunque estas dos enzimas

comparten un 60% de identidad de secuencia a nivel del promotor, presentan grandes

POOOOOOOOOOOOOOOOOOO...OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOI

Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Introducción.

diferencias en la expresión espacio-temporal y tejido específica (Zhu et al., 1992). La

degradación de la dopamina por intermedio de la COMT se produce de manera extracelular.

Esta enzima se expresa en las membranas de prácticamente todas las células (Figura

3). Un solo gen de COMT codifica para la forma soluble (S-COMT) y para la enzima que

está sujeta a las membranas (M-COMT), que posee una extensión adicional de 50

aminoácidos con residuos hidrofóbicos (Lotta et al., 1995).

Presinapsis Cocaína Postsinapsis-OHDA

DA

AMPT %DA

NSD-1015\¿Tisma g. DAL-DOPA O. DA

DA . 4.DAnfetamina

D!T2 DADA 0%

o DA

DA

Reserpina DOPACDA

Figura 2: Sinapsis dopaminérgica. La dopamina sintetizada en el terminal es vesiculizada a través deltransportador VMAT-2. La liberación controlada de DA se produce por el influjo de Ca2+lo que provoca launión de las vesículas a Ia membrana externa. La DA, una vez liberada, puede actuar en los receptores pre- opost- sinápticos. La síntesis puede ser bloqueada por AMPT que inhibe a la TH. El VMAT-2 es bloqueadoirreversiblemente por la reserpina. El DAT produce una rápida ¡nternalización de la DA. El agente neurotóxico6-hidroxídopamina (6-OHDA) ingresa dentro del terminal a través del DAT y produce muerte celular poroxidación. La cocaína bloquea la acción del transportador.


Los principales productos de degradación de la dopamina son la 3-metoxitiramina, el ácido

3.4-dihidroxifeniIacético (DOPAC) y el ácido homovainillínico (HVA). Estos compuestos

finales pueden ser conjugados con sulfato y glucuronato para facilitar su eliminación.

(Clarke e! aL, 1994, Weinshilboum y Aksoy, 1994).

El proceso más eficiente de eliminación de la dopamina del espacio sináptico para

detener la transmisión dopaminérgica sobre la postsinapsis se produce a través del

transportador de dopamina (DAT) presente en el terminal presináptico (Figura 2). Este

transportador específico incorpora la dopamina extracelular dependiendo de un gradiente de

Na+ (Amara y Kuhar, 1993). Debido a que el transportador posee secuencias consenso de

fosforilación por proteína quinasa C (PKC) es sugerido que la fosforilación mediante PKC

produce la activación del mismo (Kitayama et aL, 1994). El receptor dopaminérgico D2

presináptico es capaz de sensar la dopamina presente en el terminal y su actividad permite

modular la acción del transportador, incrementando su actividad cuando el receptor detecta

grandes cantidades de dopamina extracelular (Dickinson e! aI., 1999). Una vez recaptada

del espacio extracelular la dopamina puede ser nuevamente almacenada en vesículas para

su reutiliïación o degradada por la MAO (Figura 2).

m m <3“0‘:- "N.

J-O-Metildopnmina HVAldeidoon 0-0'.

f’”ooou

Dopanin o... HVA|— °" °"__i——_>no con

f"¿no ooou

DOPAldeído DOPAC

Figura 3: Camino metabolico de degradación de la dopamina. lntracelulannente, la dopamina esdegradada por la enzima MAO generando el metabolito DOPAC. De fonna extracelular. por la enzima COMTque Ia transforma en 3-O-metildopamina y posteriormente es convertida en HVA.


1.2. Sistemas Dopamine'rgicos Centrales.

El estudio de los sistemas dopaminérgicos centrales ha tomado gran relevancia

durante las últimas décadas por estar involucrado en numerosas funciones fisiológicas

como la regulación del movimiento y la postura, la relación con los comportamientos

apetitivos, de recompensa y el abuso de estimulantes y las asociaciones con varios

desórdenes psiquiátricos (Civelli el al., 1993, Graybiel, 1990, Moore el al., 1987).

El sistema dopaminérgico central de los mamíferos está comprendido por cuatro

vías neuronales principales: la vía nigroestriatal (A9), la vía mesocortical (A10), la vía

mesolímbica (A10) y la vía tuberoinfundibular (A12) (Figura 4). Las funciones mediadas

por la neurotransmisión dopaminérgica pueden ser subdivididas en los diferentes circuitos

neuronales. F,sasí como las funciones motoras están principalmente reguladas através de la

vía nigroestriatal. La vía mesolímbica participa en la regulación de los aspectos

motivacionales y emocionales mientras que la vía mesocortical participa de la integración

de información del medio ambiente y de procesos cognitivos. Por último, la vía

tuberoinfundibular está relacionada con el control de la liberación de hormonas hipofisarias.

El tracto tuberoinfundibular es un sistema neuroendócrino compuesto por neuronas

cortas ubicadas en el núcleo arcuato del hipotálamo que proyectan hacia el lóbulo

intermedio de la hipófisis y hacia el final de la eminencia media donde se encuentran los

vasos portales que irrigan la hipófisis anterior (Figura 4). Así, la dopamina liberada por este

núcleo actúa como una hormona sobre la hipófisis anterior. El lóbulo intermedio recibe

inervación directa de neuronas provenientes del grupo de células dopaminérgicas A12 que

regulan la síntesis y liberación de prolactina (Moore et al., 1987). Alteraciones de esta vía

neuroendócrina modifican la liberación de hormonas hipofisarias como la prolactina

determinando problemas metabólicos, de fertilidad y lactancia, y además pueden conducir

al desarrollo de tumores hipofisarios y adenomiosis uterina (Kelly er al., 1997, Diaz-Torga

el al., 2002).

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Sistema:DopaminétgicoNr'groem'iaml y:

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Núcleo H. y " 7Acumbens ., z e Glandula

ofisária

Figura 4: Vías dopaminérgicas centrales. Las neuronas del sistena dopaminérgico nigroestríatal (A9)poseen los cuerpos celulares en la sustancia nígra en el cerebro medio y proyectan sus axones hacia el cuerpoestriado. Esta neuronas estan involucradas en la regulación del planeamiento, la iniciación y coordinación delos movimientos voluntarios. El sitema mesocortícolímbico posee los cuerpos celulares en el área tegmentalventral (AIO) y proyecta hacia el núcleo accumbens, el hipocampo, el tuberculo olfatorio, la corteza prefrontaly entorrinal controlando funciones emocionales, motivacionales y cognitivas. La vía más corta (A12) seorigina en el núcleo arcuato del hipotálamo e inerva sobre vasos portales de la hipófisis.

F,l tracto mesocorticolímbico (AlO) se origina en el área tegmental ventral del

cerebro medio y se divide en las vías dopaminérgicas mesocortical y mesolímbica (Figura

4). F,l sistema mesocortical proyecta principalmente hacia la corte7a prefrontal, la corte7a

cingulada y la corteza entorrinal; áreas corticales relacionadas con funciones emocionales,

motivacionales y cognitivas cuya disfunción se vincula a la etiología de la esquizofrenia

(Civelli el al., 1993). El sistema mesolímbico proyecta hacia otras zonas del cerebro

anterior como el núcleo accumbens, el tubérculo olfatorio, la amígdala y la corte7a

piriforme. Este sistema despertó un gran interés al demostrarse su participación en mediar

los efectos eufori7antes y de refuerzo producidas por drogas de abuso como la cocaína, el

alcohol, las anfetaminas y los opioides (White, 1996, Di Chiara, 1995).

La vía dopaminérgica central restante y de mayor interés para este trabajo es la

nigroestriatal. Se origina en las neuronas que se ubican en la sustancia nigra pars compacta

(A9) y proyectan hacia el cuerpo estriado, una estructura asociada con el planeamiento,

iniciación y coordinación de movimientos voluntarios, así como también con un repertorio

de conductas complejas. (Graybiel, 1990) (Figura 4). Todo movimiento voluntario resulta

de estimulaciones e inhibiciones neuronales reguladas a nivel central. La posibilidad de

reali7ar movimientos coordinados siguiendo un objetivo planeado depende de estructuras

neuronales interconectadas que incorporan los estímulos externos o claves del entorno

ambiental para estimar la distancia a los objetos que nos rodean y traducir esa imagen

espacial con movimientos precisos. Las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra

juegan un papel principal en el control de los movimientos mediante la correcta

estimulación de las neuronas estriatales.

En ratones, el sistema dopaminérgico mesencefálico esta determinado en el cerebro

medio ventral alrededor del día 12 de gestación embrionaria. El compromiso de esta región

para generar neuronas dopaminérgicas depende de la presencia de factores tempranos que

provienen de neuronas progenitoras de esa zona del cerebro y requiere de cascadas de

señali7ación particulares para la especificación de la identidad de neurotransmisor y para

desarrollar Ia integración adecuada del cerebro.


Aunque son conocidos una cantidad de genes, como engraíled l y 2, pax 2 y 5,

wm], shh y fgf8, que participan como organizadores tempranos del patrón general del

desarrollo del cerebro medio, poco se conoce acerca de los factores que participan en el

desarrollo del sistema dopaminérgico mesencefálico. Dentro de ellos se cuenta al factor de

transcripción Ptx3, cuya expresión se encuentra restringida a esta zona del cerebro y está

involucrada en determinar neuronas dopaminérgicas en la sustancia nigra, el receptor

nuclear Nurrl, miembro de la familia de receptores hormonales esteroideos-tiroideos, que

es esencial para la diferenciación terminal de las neuronas dopaminérgicas que se originan

en la sustancia nigra y el área tegmental ventral y el factor melb, quien constituye una

cascada molecular independiente de Nurrl y es esencial para el desarrollo de las neuronas

de esta región (Zetterstróm e! aL, 1997; Castillo et aL, l998;Smidt et aL, 2000; Nunes et

aL, 2003).

La proyección de las neuronas nigroestriatales se dividen en las que proyectan hacia

los estriosomas del caudado putamen, o las que hacen sinapsis sobre la matriz del estriado

(Graybiel et aL, 1994). Esta vía aporta el 70 % del contenido total de dopamina del cerebro

y su importancia está demostrada porque su degeneración conduce a la fisiopatología de la

enfermedad de Parkinson cuyos síntomas motores comien7an a hacerse evidentes una vez

que el contenido de dopamina disminuye por debajo del 25% de sus valores normales

(Homykiewicz, 1966).

Además de las mencionadas, existen intemeuronas dopaminérgicas cortas en el tallo

encefálico, el ganglio cervical superior, la retina, el bulbo olfatorio y los cuerpos carotídeos

(Mc Geer el aI., 1978).


1.3. Receptores Dopamine'rgicos

1.3.I. Clasificación

La primera clasificación sugirió la existencia de dos subpoblaciones de receptores

dopaminérgicos según su capacidad o no de estimular a la enzima adenilato ciclasa. Los

receptores DI estaban positivamente ligados a la activación de la adenilato ciclasa y los

receptores D2 no estaban ligados a esta enzima o lo hacían de una manera inhibitoria

(Kebabian y Calne, ¡979). Sin embargo, se hacía cada vez más dificil acomodar las nuevas

funciones atribuidas a la dopamina en la antigua clasificación Dl/D2. La utilización de

técnicas de biología molecular expandió los conocimientos con el clonado de nuevos

receptores para dopamina. El receptor D2 fue el primer receptor dopaminérgico clonado

mediante una técnica para descubrir nuevos receptores homólogos que se acoplan a proteína

G. Realizando hibridaciones con una sonda de receptores B-adrenérgicos a partir de una

biblioteca genómica de rata, en condiciones de baja rigurosidad, se obtuvo una secuencia

genómica parcial con una significante homología a los receptores B-adrenérgicos (Bunzow

etu1., ¡988). Esta secuencia fue uti|i7ada para obtener, a partir de una biblioteca de cerebro

de rata, el ADNc completo del receptor dopaminérgico D2 que codifica para una proteína

de 415 aminoácidos. Posteriormente, fue clonado el homólogo humano del receptor DZ

mostrando un 96 % de identidad presentando solo la eliminación de un aminoácido (Grandy

et aL, 1989). El conocimiento de esta secuencia permitió el clonado del receptor Dl de rata

y humano con una expresión tan abundante en el cerebro como la del receptor D2 (Zhou e!

aL, ¡990, Dearry el aL, 1990, Sunahara et aL, 1990). Luego se clonaron nuevos genes de

receptores dopaminérgicos menos abundantes. Así, se clonó el gen del receptor D3 de rata y

humano (Sokoloff e! aL, 1990, Giros et aL, 1990), el gen humano del receptor D4 (Van Tol

el aL, 1991) y el gen del receptor D5 humano y su contrapartida de rata (Sunahara el aL,

¡991, Tiberi el aL, 199]). El descubrimiento de S subtipos de receptores dopaminérgicos

necesitó replantear una nueva clasificación de los receptores que fueron divididos en los de

“tipo Dl” y los de “tipo DZ” (Tabla l). Esta clasificación se basa en la estructura genómica,

la secuencia primaria, el acople a segundos mensajeros y el perfil farmacológico de los

diferentes receptores.

l.0.00...0.00.0....O...OOOOCOOOOOOOOOOOOOOOOOO1


Actualmente los receptores de “tipo D1” comprenden al receptor D1 y D5, codificados

en humanos por genes que carecen de intrones (Sunahara et al., 1990 y 1991, Zhou et al.,

1990) (Tabla 1). También, existen en humanos dos pseudogenes del receptor D5 (Nguyen et

al., 1991). Los receptores de “tipo D2” incluyen al D2, D3, y D4. Estos tres genes comparten

características comunes como la presencia de intrones y exones (Tabla 1). El receptor D2 se

caracteriza por poseer principalmente dos variantes, D2 corto (D2C) y D2 largo (D2L)

producidas por la inclusión alternativa del 6toexón (Dal Toso et aL, 1989). El receptor D3 está

constituido por un gen que codifica para una proteína de 400 aminoácidos y también presenta

una variante corta D3gly9de 342 aminoácidos (Rietschel et al., 1995). El receptor D4 posee

múltiples variantes polimórficas que se encuentran en diferentes porcentajes dentro de las

distintas etnias (Líchter et al., 1993, Van To] et al, 1991, 1992). Todos los receptores

dopaminérgicos clonados pertenecen a la superfamilia de receptores que interactúan con la

proteina-G. La estructura de estos receptores predice, basados en el análisis de hidrofobicidad,

7 pasajes transmembrana con el grupo amino-terminal del lado extracelular y el carboxi

terminal dentro del citoplasma (Figura 5) (Sibley y Monsma, 1992). La presencia en todos los

subtipos de un residuo de aspartato en la región extracelular del 3erdominio transmembrana]

junto a 2 residuos de serína en el quinto, son candidatos importantes para explicar la unión de

los grupos amino y catecol de la dopamina al receptor (Javitch et al. , 1995).

Tabla l: Propiedades de los Receptores Dopaminérgicos

Cantidades de Homologla Localización Aeople a segundos Localización Propiedadesnmiotcidos de mensajeros farmacológicas

secuencia orgmiucionHumano Raton Dl Dz “0mm” m. vm General Selectiva Agonis- Anmgo

G efectoras las nisus

DI 446 446 - 44% cr. 5 Gs incrementa Cuerpo estriedo Amlgdala SKF 38393 SCH 23390carece de AMPc Núcleo ucumbens R (+) SKF SKF83566intrones Tuberculo . 8 l297

olfnorloD5 477 475 80% 46% cri4 Gs incrementa Hipocempo Núcleo dihidrexedina SCH 39166

carecede AMPc Hipotílemo pmfusiqlarintrones

2

D25/D2L 414/443 4 l5/444 44% ‘ cr. l l Gi/Go disminuye Cuerpo estrth SNpe (+) PHNO Rnelopride7 intrones AMPc Núcleo ¡cumhens VTA Pergolide Domperidone

2 ¡sofa-ms activa Tuberculoolfflorio Hipófisisemp canales K

altemetivo bloqueaanales Ce

D3 400 446 4l% 75% cr. 3 Gi/Go disminuye Núcleo ncumbens Isla de PD ¡28907 (+) S ¡42975 intrones AMPc Tuberculoolfehorio Calleja 7-0H-DPATvarimtes Hipotállmo SNpc 'd'une-dm VTA

D4 387 385 41% 53% cr. ll (ii/Go disminuye Cortez: prefiomal Corazon (+) PHNO Cloupina3 intrones AMPc Hipocampo CP 226269 PNU ¡01387

Dll] cantidad Cerebelo CP 2930l9de

14


1.3.2. Estructura Genómica.

El clonado de los cinco receptores dopaminérgicos permitió establecer similitudes y

diferencias que llevaron a agrupar a los receptores DI y D5 como los de “tipo Dl” y a los

D2, D3 y D4 como de “tipo D2”. Los genes de los receptores Dl y D5 humanos están

codificados en los cromosomas 5 y 4 respectivamente. La ausencia de intrones y la

conservación de sus secuencias indican un origen evolutivo común y diferente al de los

receptores de “tipo DZ”. El gen del receptor D] humano locali7ado en el cromosoma 5

posee al menos dos sitios potenciales de inicio de la transcripción y tres sitios posibles

fueron observados en el gen de rata (Monsma et aL, 1990, Zhou et aL, 1990). Existen dos

pseudogenes del receptor D5 que se encuentran en los cromosomas humanos l y 2, y

codifican para formas incompletas de ¡54 aminoácidos (Nguyen e! aL, 1991, Grandy et aL,

199]). En ambos casos un sitio de terminación prematura se encuentra luego del tercer

fragmento transmembrana. Se ha descripto una expresión muy baja de estos genes pero

hasta el momento se desconoce si estos péptidos cumplen algún papel fisiológico (Nguyen

et al. l99l, Grandy e! aL, 199]). La emergencia de dichos pseudogenes es un evento

reciente en la evolución de los mamíferos debido a que éstos no han sido encontrados en

diferentes especies de monos y sólo uno de ellos está presente en los gorilas (Marchese et

al.,l995). Los tres genes que codifican para los receptores de “tipo D2” poseen exones e

intrones. El gen del receptor D2, compuesto por 8 exones codificados en el cromosoma l l,

presenta dos variantes, una corta y otra larga, que se producen por empalme alternativo (Dal

Toso et aL, 1989). Este mecanismo de empalme permite eliminar o incorporar 29

aminoácidos del tercer dominio intracitoplasmático, una zona involucrada en el acople a

segundos mensajeros. Ambas variantes del receptor D2 son generadas en los mismos

tejidos tanto en humanos como en rata, ratón y bovino lo cual no predice un mecanismo de

regulación diferencial, sin embargo, la relación exacta entre las dos isoformas puede variar

significativamente (O’Malley el aL, 1990; Snyder el a1., 199]; Gandelman e! aL, 1991).

Ambas isofonnas poseen capacidades similares de inhibir la adenilato ciclasa (Di Marzo e!

(11..¡993), activar los canales de K+(Einhom el aL, 199]), potenciar la liberación de ácido

araquidónico (Kanterman e! aL, |99|) y mediar la represión transcripcional del gen de

prolactina de rata (McChesney el aL, 1991).


Sitios de unióndel

E ¿grupoamino

Sitios deglicosilación

grupo catecol

Pegado a proteínaG

largo en Dl y DS

Lado

Figura 5: Topología de los receptores dopaminérgicos. Estructura de 7 pasos transmembrana de losreceptores dopaminérgicos con el extremo carboxi-terminal del lado intracitoplasmático y el amino-terminaldel lado externo. El tercer dominio intracitoplasmático interactúa con la proteína G. Se muestran también lossitios de glicosilacíón externos y de fosforilación internos que regulan la actividad de los receptores. Tambiénse muestran las posiciones en los dominios transmembrana que son importantes para la unión a la dopamina.

El gen del receptor D3 también tiene múltiples exones y se encuentra en el

cromosoma 3 humano. El gen humano presenta una homología del 88% en su estructura

con respecto al de rata. El receptor humano carece de 46 aminoácidos en el tercer dominio

intracitoplasmátíco, resultando en una proteína de 400 residuos de largo. Existen por lo

menos dos variantes del receptor D3 que son producidas por empalme alternativo de exones

(Giros et aL, 1991). El gen del receptor D4 consta de 4 exones y está localizado en el

cromosoma humano 11 a] igual que el receptor D2. Sin embargo, se diferencia de los genes

de los receptores D2 y D3 por estar codificado por un menor número de exones y a su vez,

estos exones, estar comprendidos en una menor extensión del genoma (4 kb).

l,a homologia a nivel genómico con el receptor D2 es del 41% y del 39% con la del

receptor D3. El receptor D4 humano consiste de una proteína de 387 residuos que puede

cambiar debido a la presencia de diferentes variantes polimórficas que se locali7an en

secuencias codificantes (Van Tol et aI., 1992).

1.3.3. Estructura Aminoacídíca.

Los receptores dopaminérgicos pertenecen a la superfamilia de receptores de

neurotransmisores y hormonas que realizan funciones efectoras específicas acoplándose a

distintas proteínas reguladoras G. Los receptores de “tipo Dl” activan a la adenilato ciclasa

incrementando los niveles de AMPc intracelulares mientras que los receptores de “tipo D2”

ejercen una influencia inhibitoria sobre esta enzima (Andersen el aL, 1990) (Tabla l). Los

receptores de “tipo D2” se encuentran también ligados a la activación de canales de K+,a la

inhibición de canales de Ca2+y la reutilimción de fosfatidilinositol (Vallar y Meldolesi,

¡989). La secuencia de aminoácidos de los receptores dopaminérgicos revelan una

estructura de 7 segmentos transmembranales compuestos por aproximadamente 20 a 25

residuos hidrofóbicos cada uno que separan 3 dominios intracelulares y 3 extracelulares

compuestas por residuos altamente hidroñlicos (Figura 5). La región N-terminal es

extracelular y la C-terminal es intracelular. Las secuencias aminoacidicas de los receptores

dopaminérgicos dentro de sus segmentos transmembranales mantienen un 31% de

homología entre los 5 subtipos. Si se comparan entre si los receptores de “tipo Dl” este

porcentaje aumenta hasta el 75%, y hasta el 52% comparando entre si los receptores de

“tipo DZ” (Civelli e! aL, ¡993). El tercer dominio intracitoplasmático, importante para el

acople a proteína G, es mayor en los receptores de “tipo D2” quienes también tienen una

porción C-terminal más corta. Los mecanismos de regulación incluyen un sitio de

palmitoilación en un residuo de cisteína conservado en la porción C-terminal de los

receptores dopamine’rgicos, que le permite el anclaje a la membrana (O’Dowd e! aL, 1989),

y también la presencia de residuos de serina y treonina que pueden servir como sitios de

fosforilación regulatoria (Figura 5). Los cinco subtipos de receptores dopaminérgicos

presentan secuencias consenso para sitios de glicosilación en el dominio N-terminal y en

otras regiones extracelulares (Figura 5).

Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Inlroducción.

1.3.4. Localización.

Los estudios de loca|i7ación de los receptores dopaminérgicos en el cerebro

involucran técnicas de biología molecular como hibridación de Northern e hibridación in

situ que determinan la presencia de ARNm pero no necesariamente la expresión de proteina

en la membrana. Además, debido a que muchas neuronas dopamine’rgicas poseen sus

cuerpos celulares muy distantes de sus proyecciones axonales es importante discriminar la

presencia de ARNm de la expresión proteica en la membrana. Para observar la expresión en

la membrana se explotaron técnicas de farmacología realizando unión de ligandos marcados

y autoradiografia. Las primeras generaciones de ligandos no permitían una buena

discriminación entre los 5 diferentes subtipos de receptores dopaminérgicos, pero el

desarrollo posterior de nuevos fármacos y la utili7ación de técnicas de sustracción

permitieron estimar la localización y los niveles de expresión de los receptores (Tarazi e!

aL, 1997, Defagot et aL, 2000). Un aporte importante a la determinación exacta de la

ubicación de los receptores fue alcanzado con el desarrollo de técnicas inmunológicas y la

utili7ación de anticuerpos específicos contra diferentes subtipos de receptores (Ariano el

aL, 1997, Defagot el aI., 1997).

La distribución del ARNm del receptor Dl, determinada por hibridación de

Northem e hibridación in situ, mostró que las zonas de mayor expresión corresponden al

caudado putamen, al núcleo accumbens y al tubérculo olfatorio y ,en menores niveles, en la

corteza cerebral, el hipocampo, la amígdala, el hipotálamo y el tálamo (Fremeau et aL,

l99l ). No se detectó ARNm del receptor Dl en sustancia nigra pars reticulata, globo pálido

y núcleo subtalámico, aunque si una cantidad importante de sitios de unión, determinando

que estos receptores estarian expresados en neuronas aferentes de otras áreas del cerebro

(Le Moine el aL, 199]). Por otra parte no se detectó expresión de ARNm ni de proteína en

las dos áreas dopaminérgicas más importantes como la sustancia nigra pars compacta y el

área tegmental ventral, lo que descartaría una función de autoreceptor presináptico para el

receptor Dl (Fremeau et aL, l99l) (Tabla l).

La distribución del receptor DS es distinta de la del receptor D], presentando una

locali7ación acotada a estructuras limbicas dentro del sistema nervioso central (Tiberi et aL,

l99l). El ARNm del receptor DS se encuentra en el núcleo mamilar lateral y en el núcleo


GABAérgicas y también en neuronas piramidales de la corte7a prefrontal (Mrzljak e! aL,

1996) (Tabla l). Experimentos de inmunomarcación realizados en ratas también

determinaron una alta expresión de proteína en corte7a frontal y parietal y niveles menores

en el tálamo, globo pálido e hipocampo y niveles aún más bajos en el caudado-putamen

(Ariano el al. , 1997).

1.3.5.Segundos Mensajeros

Una de las grandes incógnitas que rodea a los receptores dopaminérgicos consiste en

determinar la existencia o no de una activación individuali7ada en la cascada de segundos

mensajeros. Los experimentos de transfección de células son una herramienta importante

para determinar las propiedades de transducción de señales de los diferentes subtipos de

receptores. Mediante esta técnica se puede expresar un único tipo de receptor en alta

densidad para estudiar los mecanismos de activación. Sin embargo, presenta la desventaja

de que los sistemas de transducción de señales intracelulares presentes en estas células

pueden no coincidir con los existentes en los distintos tipos neuronales que expresan a cada

receptor. Es sabido que los receptores de “tipo Dl” se acoplan de manera positiva a la

adenilato ciclasa, es decir que su estimulación induce el aumento de los niveles

intracelulares de AMPc (Grandy el a1., 199] , Sunahara e! aI., 1990). Los receptores de “tipo

D2” son menos uniformes en su actividad, si bien todos tienen la capacidad de inhibir la

formación de AMPc, el receptor D2 lo hace en todas las líneas celulares mientras que los

receptores D3 y D4 inhiben con menor eficiencia y sólo en algunas líneas. El receptor DZI,

es capaz de aumentar el inositol fosfato sólo en una línea celular de fibroblastos (Tang e!

aL, 1994). Otros estudios determinaron que el receptor D2 y el D4 pueden aumentar Ia

liberación de ácido araquidónico pero por vías diferentes. El primero lo hace por intermedio

de Ia activación de la proteína quinasa A y el segundo por intermedio de la proteína quinasa

C (Chio eta1., 1994; Di Marzo el aL, 1993).

20

Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Imroducción.

parafascicular del tálamo, como así también en algunas áreas del hipocampo (Tiberi et aL,

199]). En estudios realizados con anticuerpos se ha localizado la presencia del receptor D5

en intemeuronas colinérgicas dentro del cuerpo estriado de monos (Bergson e! aI., 1995)

(Tabla l). La ausencia de sitios de unión del receptor D5 en zonas donde se encuentra la

expresión del ARNm permite suponer que este receptor es sinteti7ado en los cuerpos

neuronales y transportado hasta los terminales sinápticos. Esto indicaría una localización

presináptica de los receptores D5 que rara ve7. se superponen o coexpresan con los

mensajeros del receptor Dl.

El otro receptor ampliamente expresado en el sistema nervioso central es el receptor

D2, cuyo ARNm se encuentra predominantemente en el caudado putamen, el tubérculo

olfatorio y en el núcleo accumbens (Gerfen et aL, 1990, Bunzow et aL, 1988). Otras zonas

de expresión de los receptores D2 son la sustancia nigra pars compacta y el área tegmental

ventral. La expresión en estas áreas posiciona al receptor D2 como el más importante en la

regulación presináptica de la actividad de las neuronas. El ARNm del receptor D2 ha sido

localizado en el lóbulo anterior e intermedio de la hipófisis cumpliendo un papel principal

en la regulación de la liberación de la prolactina y a-MSH, respectivamente (Rene el aL,

1994) (Tabla l).

La expresión del receptor D3 esta confinada a estructuras mesolímbicas inervadas

por neuronas dopaminérgicas del área tegmental ventral. F,l tubérculo olfatorio, las lslas de

Calleja y la cubierta del núcleo accumbens expresan el ARNm del receptor D3, indicando

que este receptor participa en funciones límbicas y podría ser un blanco primario de los

neurolépticos y antipsicóticos. Bajos niveles de expresión de ARNm fueron hallados en el

caudado putamen y a la vez altos niveles se encontraron en la sustancia nigra pars compacta

y en el área tegmental ventral (Tabla l). Aún no ha sido determinado si existe coexpresión

con las neuronas que expresan el receptor D2 aunque la expresión del receptor D3 es de un

orden de magnitud menor que la del D2 (Levant, 1997).

l.a mayor expresión del receptor D4 se observa en la corteza frontal, el mesencéfalo,

el hipotálamo y la amigdala; todas estas áreas inervadas por las neuronas dopaminérgicas

provenientes del área tegmental ventral (Van Tol et aL, 1991). Utili7ando anticuerpos

contra el receptor D4 en monos se determinó su localización específica en neuronas


1.3.6. Propiedades Farmacológicas.

Debido a la alta homología de secuencia existente entre los segmentos

transmembranales de los receptores dopaminérgicos dentro de una misma subclase, se

pueden observar similares propiedades farmacológicas. Estos sitios de gran identidad están

involucrados en la unión al ligando. En el caso de los receptores de “tipo Dl”, presentan

características distintivas como la alta afinidad por las benzacepinas (SCH 23390, SKF

38393) y baja afinidad por butirofenonas (espiperona, haloperidol) y ben7amidas sustituidas

(sulpirida). Una característica sobresaliente es que el receptor DS posee 3 veces mayor

afinidad por la dopamina que el receptor Dl. Las propiedades principales de los receptores

de “tipo D2” están determinadas por una alta afinidad por las butirofenonas, fenotiazinas

(clorpromazina) y las ben7amidas (raclopride, sulpirida y nemonapride) y presentan

también una baja afinidad por las benzacepinas. El receptor D4 presenta la particularidad de

desarrollar menores afinidades por la mayoría de los antagonistas dopaminérgicos. Sin

embargo, revela una afinidad lO veces superior por el neuroléptico atípico clozapina. Esta

característica condujo a la especulación de que el receptor D4 podría ser el mediador

principal de la acción de este neuroléptico (Van Tol el aL, 199]). La farmacología clásica

aún no ha podido generar herramientas para poder discriminar la acción de un solo subtipo

de receptor dopaminérgico. La existencia de reactividad cruzada en la acción de las drogas

específicas imposibilita determinar el aporte individual de los receptores a un

comportamiento observado. Sin embargo, se han desarrollado y generado modelos de

genética molecular para producir animales deficientes en la expresión de un solo subtipo de

receptor dopaminérgico. En estos ratones genéticamente modificados es posible estimar las

funciones específicas de los receptores eliminados, estudiando las alteraciones

comportamentales y neurofisiológicas producidas.

1.4. Receptor DZ.

Debido a que el presente trabajo involucra principalmente al receptor dopaminérgico

D2, a continuación se presenta una descripción más detallada de sus características y

propiedades.

2|

Alteraciones en el sistema dopaminérgico D2 han sido implicadas en una variedad

de desórdenes psiquiátricos y neurológicos que incluyen a la esquizofrenia, la enfermedad

de Parkinson, Huntington, hiperactividad y déficit de atención (ADHD) y la adicción a

drogas de abuso. Las drogas utilizadas habitualmente para el tratamiento de Parkinson o

esquizofrenia son agonistas o antagonistas D2 respectivamente, lo que sugiere que ese

receptor está desempeñando un papel muy importante en esas dos enfermedades.

Como fue mencionado anteriormente, existen dos isoforrnas del receptor

dopaminérgico D2: D2L y D2C (Bunzow et aI., 1988; Dal Toso e! aL, 1989; Giros el aL,

¡989; Monsma er aL, 1989; Chio el aL, 1990; Mack er aL, 1991). l-lllos son generados a

partir del mismo gen por empalme alternativo del sexto exón. El receptor DZL tiene una

inserción de 29 aminoácidos en su secuencia en la tercera porción intracitoplasmática, la

que está ausente en el D2C. La tercera porción intracitoplasmática de los receptores

acoplados a proteínas G es crítica para la interacción con efectores intracelulares (O'Dowd

el aL, 1988). En líneas de células transfectadas se demostró que el D2L y D2C se acoplan a

distintas proteínas G inhibitorias mostrando una afinidad diferente cada una de ellas (Dal

Toso e! aI., 1989; Senogles, 1994; Guiramand e! aI., ¡995; Boundy el a1., 1996). Las dos

isofonnas del receptor coexisten en el cerebro pero sin embargo la relación de expresión de

uno y otro varía en cada región. El D2L comprende el 80% del total del receptor D2 en todo

el cerebro, pero si se toma sólo el estriado ese valor llega al 90% del total (Mack el aL,

1991). Las diferencias en la estructura de la proteína, el patrón de expresión y la interacción

con efectores intracelulares, sugieren que las dos isofonnas tienen funciones particulares.

Por otro lado, la etiología de los déficits motores y las psicosis, involucran a diversas

regiones del cerebro y la relación de la expresión de cada isoforrna del receptor D2 en cada

una de ellas varía. Se ha demostrado por medio del uso de animales deficientes para el

receptor D21, que cada una de las variantes tiene funciones específicas y que ellas no se

superponen. La actividad presináptica del receptor D2, examinada por medio de la

administración de quinpirole, sigue siendo funcional en estos mutantes mientras que la

catalepsia mediada por haloperidol se pierde, sugiriendo que esta droga actúa,

principalmente, por medio de los receptores D2L (Wang et aL, 2000; Usiello el aL, 2000).


Por lo tanto, existe la posibilidad de que el D2], y D2C desempeñen papeles diferenciales

en las terapias anti psicóticas y anti Parkinsonianas.

l.a liberación y recaptación de la dopamina está severamente afectada por drogas de

abuso como cocaína y anfetamina y se postuló que niveles anómalos de dopamina son los

responsables de alteraciones vistas en enfermos psiquiátricos como los esquizofrénicos. Los

receptores de tipo 2, principales blancos de drogas antipsicóticas, se expresan como

receptores postsinápticos así como autoreceptores presinápticos. Como receptores

presinápticos están regulando los niveles extracelulares de dopamina. Los autoreceptores de

tipo 2 de dopamina que inhiben la liberación estímulo dependiente del neurotransmisor se

encuentran en las dendritas así como en las regiones terminales del axón (Cooper el al.,

1996; Saller y Salama, 1984; Nissbrandt et al., 1985; el Mestikawy y Hamon, 1986; Strait y

Kuczenski, 1986; Goldstein el al., 1990; Tepper y Groves, 1990; Westernik e! al., 1990;

Chen et al., l99l; Mercuri et al., 1992; Sesak et al., 1994). Debido a que se postuló que ese

tipo de autoreceptores participa en la acción de antipsicóticos (Hetey et al., 1991), drogas

psicoestimulantes (Brodie y Dunwiddie, 1990; Bemardini era1., 1991; Zhang et al., 1992;

Pitts el aI.. 1993; Silvia e! al., ¡994; Xue el al., 1994), y comportamiento sexual (Hull el

al., 1990) entre otros, los mecanismos por los cuales los autoreceptores están mediando la

liberación de dopamina han recibido gran atención. Los receptores presinápticos proveen un

importante control negativo durante la liberación de dopamina actuando sobre el nivel de

disparos de potenciales de acción de la neurona, la síntesis y la liberación (Roth, 1984;

Starke e! al., 1989). La inhibición presináptica previene la excesiva liberación de

neurotransmisor en condiciones normales y patológicas (Thompson el al., 1993) y juega un

papel muy importante en ajustar la fuer7a sináptica (lsaacson et al., 1993; Wu y Saggau,

1997). Además de regular la tasa de disparos, la síntesis y liberación de dopamina, se ha

propuesto en diversos trabajos que existe una interacción entre el autorreceptor de

dopamina y el transportador de dopamina posiblemente provocando efectos a largo plazo en

la expresión de dicho transportador (Meiergerd et al., 1993; Cass y Gerhardt, 1994;

Batchelor y Shenk, 1998; Kimmel e! al., 2001; Mayfield y Zahniser, 200]).


l. 5. Anatomía yfisiología de los ganglios dela base

El te'rmino ganglios de la base hace referencia a un grupo de estructuras

subcorticales que incluye los núcleos caudado, putamen, pallidum, núcleo subtalámico y la

sustancia nigra (pars compacta y pars reticulata; SNpc y SNpr). El caudado y el putamen

son dos estructuras separadas en primates, aunque en roedores están unidos en un conjunto

al que se denomina neostriatum, o simplemente estriado. El pallidum consta de dos partes,

globo pálido interno (GPi) y externo (GPe).

Estas estructuras se relacionan anatómicamente constituyendo un complejo circuito

que involucra además gran parte de la corte7a cerebral y varios núcleos talámicos (para

revisión ver Kawaguchi, 1997; figura 6). Pese a que poseen una compleja participación en

aspectos cognitivos y motivacionales de la conducta, la función más clara y mejor

comprendida de los ganglios basales está relacionada con el control del movimiento

incluyendo las etapas de adquisición, planeamiento, ejecución y coordinación del mismo.

Los ganglios de la base establecen un circuito de entrada y salida (loop) con la

corte7a cerebral. El estriado recibe aferencias de todas las regiones del córtex, y aún de

estructuras filogenéticamente antiguas como el hipocampo y la amígdala. Las fibras

corticales tienen un efecto excitatorio sobre las neuronas estriatales, mediado por el

glutamato a través de receptores tipo AMPA/kainato y NMDA (para revisión ver Calabresi

e! aL, 1996). La otra aferencia estriatal de gran relevancia funcional está constituida por los

axones dopaminérgicos provenientes de la SNpc. El 95% de las neuronas estriatales

pertenece a una misma categoría; se las conoce como neuronas espinosas estríofugales. Se

trata de células GABAérgicas con numerosas espinas dendríticas sobre las que terminan las

aferencias corticales y nigrales, que ejercen su acción inhibitoria fuera del estriado (para

revisión ver Chevalier y Deniau, 1990). Se reconocen dos subcategorías: a) un 50% que

proyecta sobre el GPe, expresa el receptor dopaminérgico D2 y uti|i7a como cotransmisor

del GABA una encefalina y b) el restante 50% envía sus axones al GPi o a la SNpr, expresa

el receptor dopaminérgico Dl, y utili7a como cotransmisor a los péptidos sustancia P y

dinorfina (para revisión ver Kawaguchi, 1997; figura 6). El restante 5% de las neuronas

estriatales son intemeuronas, entre las que se destaca un subtipo de grandes células

colinérgicas sin espinas dendríticas.

24

TesisDoctoral. Diego M Gelman. Introducción

CORTEZA CEREBRAL

l Frontal0 II A

ESTRIADO

YA (NúcleoAferente) LV02' ‘ V D1

VíaDirecta

sustancia P

V

GPe ’ __ o Tálamoo o iSNpc

NSTV GPiISNpr Y

TaIIo Cerebral (NúcleosEferentes)Médula Espinal

Figura 6. Diagrama de las conexiones entre los ganglios de la base y estructuras talamocorticales. Enrojo se representan neuronas GABAérgicas, en negro glutamatérgicas y en azul las dopaminérgicas de la víanigroestriatal. Los núcleos eferentes (globo pálido interno y sustancia nigra pars reticulata) se representanjuntos por su relación funcional, aunque constituyen estructuras anatómicamente separadas.

Mientras el estriado funciona como la estructura de entrada de información de los

ganglios de la base (núcleo aferente), el GPi y la SNpr conforman los núcleos de salida

(núcleos eferentes). El GPi y la SNpr también están constituidos por neuronas

GABAérgicas, que en este caso proyectan sobre núcleos talámicos y del tronco encefálíco.

Los núcleos eferentes reciben información del estriado a través de dos circuitos: el circuito

directo, representado por la proyección de las neuronas estriofugales que contienen

receptores D1, sobre el GPi y la SNpr; y el circuito indirecto, formado por las proyecciones

del estriado que poseen receptores D2, hacia el GPe, de éste al NST, y por fin del NST

25


hacia los núcleos de salida (para revisión ver Gerfen y Wilson, 1996; Wichman y Del.ong,

1996; figura 6). La composición de estos circuitos hace que el resultado de la aferencia

dopaminérgica hacia el estriado sea el mismo para las vías directa o indirecta: el tálamo es

liberado del tono inhibitorio y aumenta la liberación de glutamato cn la corteza.

Como ya mencionamos, prácticamente toda la corte7a cerebral tiene proyecciones

sobre el estriado. La proyección corticoestriatal está ordenada topográfica y

somatotópicamente, de tal modo que las regiones corticales motoras (áreas motora primaria,

premotora y motora suplementaria) se conectan con el putamen (distrito motor del estriado),

mientras las regiones asociativas de la corteza frontal, parietal y témporo-occipital lo hacen

con el núcleo caudado (distrito cognitivo). La segregación anátomofuncional observada a

nivel estríatal parece extenderse a los núcleos eferentes y a los territorios talámicos sobre

los que éstos se proyectan. La corteza frontal recibe el ‘resultado‘ del procesamiento de

información reali7ado en los ganglios basales (figura 6).

Cada neurona espinosa estríofugal recibe unos 10.000 contactos sinápticos

provenientes de más de 1.000 neuronas corticales. Los axones corticoestriatales terminan en

la cabeza de las espinas dendrítica y la liberación de glutamato es capaz de provocar la

descarga de potenciales de acción. Las sinapsis dopaminérgicas nigroestriatales se locali7an

en el cuello de las espinas dendríticas de las neuronas estriofugales, una posición desde la

que pueden regular selectivamente la influencia de las aferencias corticales (figura 7). La

DA no es capaz de producir por si sola grandes cambios de potencial postsináptico pero

ejerce un control aumentando o reduciendo la probabilidad de disparo de las neuronas

estríofugales, al actuar sobre receptores Dl o D2 respectivamente (Smith y Bolam, 1990;

Gerfen et a1., 1990).


Aferencias

pyglutamatérgicascorticales

Neuronaespinosaestriofugal Neuronas

dopaminérgicasnigroestriatales

lnterneuronascolinérgicas

Figura 7. Contactos sinápticos sobre las neuronas espinosas estríofugales. Las fibras corticalesdescendentes (glutamatérgicas, en rojo) hacen sinapsis en la cabeza de las espinas dendríticas distales. Encambio, las aferencias dopaminérgicas nigroestriatales (en azul) terminan en el cuello de estas espinasdendríticas. Las intemeuronas colinérgicas hacen contactos en posiciones más proximales al soma. (Adaptadode Feldman et al., 1997).

En cuanto a las proyecciones sobre los núcleos eferentes, el NST posee un tono

glutamatérgico excitatorio sobre las neuronas del GPi y la SNpr (figura 6), provocando una

descarga espontánea tónica de potenciales de acción (Robledo y Féger, 1990). Esto produce

una inhibición sostenida de los núcleos talámicos de relevo. Cuando las neuronas

GABAérgicas estriatales de la vía directa descargan una salva de potenciales de acción, las

neuronas del GPi y la SNpr son inhibidas, y consecuentemente, liberan al tálamo de esta

influencia inhibitoria tónica. Así, por desinhibición se produce la activación de un grupo de

neuronas talámicas, y de las neuronas corticales que ellas inervan. La activación de


diferentes grupos de neuronas talámicas y corticales se refleja en acciones conductuales o

fenómenos cognitivos. Los receptores D] estriatales actúan reforzando la activación de esta

vía directa.

La excitación de las neuronas estríofugales de la vía indirecta tiene un efecto

inhibitorio sobre el GPe, resultando en una liberación del NST y por lo tanto en una mayor

activación de los núcleos eferentes (para revisión ver Wichmann y DeLong, 1996). Esto

conduce a una inhibición más fuerte del tálamo, y menor activación de la corte7a frontal.

Los receptores D2 se oponen a este resultado por su efecto inhibitorio sobre la vía indirecta.

Por último, cabe recordar que los ganglios de la base poseen también funciones ‘no

motoras’. El núcleo caudado (el distrito cognitivo del estriado) está estrechamente

relacionado funcional y anatómicamente con la corte7a frontal asociativa, participando de

forma coordinada en procesos como la memoria de trabajo, la memoria de hábito y la

atención (Knowlton et aL, ¡996). También se ha implicado a los ganglios de la base, y en

particular al núcleo caudado, en las alteraciones obsesivo-compulsivas del comportamiento.

I.6. Enfermedad de Parkinson

En 1817 el me’dico londinense James Parkinson describió un grupo de pacientes con

desórdenes en la función motora en su “Essay on the shaking palsy”. La sintomatología

identificada incluía temblor, una postura contraida y dificultades en la iniciación de

movimientos voluntarios. El nombre usado por el médico inglés para designar por primera

vez este conjunto distintivo de síntomas clínicos fue más adelante reemplazado por el de

enfermedad de Parkinson, por iniciativa del neurólogo francés Charcot (para una revisión

histórica ver Kopin, 1993).

La enfermedad de Parkinson (EP) es un desorden neurológico degenerativo

progresivo e incapacitante que afecta predominantemente a individuos de más de 55 años

de edad, provocando una desmejora motora significativa. Me refiero específicamente al

Parkinson idiopático (de origen espontáneo o desconocido), relacionado con el

envejecimiento, que explica más del 90% de los casos. Su prevalencia aumenta

dramáticamente al analizar grupos de edad creciente; en individuos de más de 65 años es de

alrededor de 100 casos cada 100.000 habitantes. Sin embargo, no es infrecuente encontrar

Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Inlroducción.

pacientes con un comienzo de enfermedad a una edad por debajo de los 40 años (Parkinson

juvenil). La etiología de la EP es diversa y compleja. Algunos casos pueden ser atribuidos a

factores genéticos y en los últimos años se han descripto ciertos genes que, en caso de estar

mutados, conducen a una EP familiar (Dunnett el aL, 2000). Mutaciones en los genes que

codifican para parkina y UCH-Ll conducen a una enfermedad que es clínica y

patológicamente diferente a los casos de EP idiopática y la manera en que se relaciona a la

enfermedad clásica es poco clara aún. Ha sido demostrado que la parkina puede proteger a

las neuronas de la agresión provocada por la a-sinucleína, de disfunciones proteosomales y

de la citotoxicídad inducida por kainato. Una tercera mutación es la de a-sinucleína. una

proteína sináptica que se probó que forma parte de los cuerpos de Lewy. En ratones, la

sobreexpresión de a-sinucleína, resulta en una función motora disminuida, degeneración

neuronal y conduce a la formación de agregados de proteína, aunque estos no son

filamentosos como en los casos de los cuerpos de Lewy (Masliah e! aL, 2000; Van der

Putten el aL, 2000).

Los síntomas motores de la EP son temblor, rigidez muscular, movimientos

involuntarios. bradikinesia (movimientos lentos) y alteraciones posturales. Por tratarse de

una enfermedad progresiva, se pueden reconocer distintas etapas a lo largo de las cuales se

evidencia un deterioro de la función motora, hasta el establecimiento completo de la

neurodegeneración. En esta etapa los pacientes han perdido la capacidad de valerse por si

mismos. Pero no se trata sólo de alteraciones del movimiento; acompañando a los

anteriores síntomas existen diversos grados de disfunción cognitiva. Los problemas

alcanzan capacidades como la memoria, el pensamiento abstracto y el lenguaje, y en casos

extremos se arriba a diagnósticos de demencia subcortical.

Desde el punto de vista neuropatológico se observa una pérdida selectiva y severa de

neuronas pigmentadas de la SNpc, en donde los cuerpos neuronales (A9) degeneran junto

con las fibras nigroestriatales provocando un severo déficit de dopamina en los ganglios de

la base. Esta sería la base de los trastornos motores (Marsden, ¡982). Además se observa

una pérdida de DA en estructuras límbicas, el neocortex y el hipotálamo. Otros grupos de

neuronas también se ven afectados, como por ejemplo las fibras noradrenérgicas en el locus

ceruleus y en el núcleo dorsal del vago, neuronas serotoninérgicas del rafe dorsal, y

29


colinérgicas en el núcleo basal de Meynert y otros núcleos subcorticales. Estos cambios

patológicos estarían asociados a la aparición de algunos síntomas no-motores de la

enfermedad. F,ldiagnóstico patológico de la EP idiopática está acompañada por la presencia

de cuerpos de Lewy (Gershanik, 1997), inclusiones eosinófilas citoplasmáticas compuestas

de proteínas, ácidos grasos, esfingomielina y polisacáridos (Fomo e! aL, 1986).

Los trastornos motores no se manifiestan hasta que los niveles de DA estriatal

declinan al menos en un 70 u 80% (Agid et aL, ¡987). Esta ausencia de síntomas enmascara

el progreso de la enfermedad, y es debida en parte a la capacidad del sistema nigroestriatal

de sobrellevar el déficit, y a la aparición de mecanismos compensatorios en las postsinapsis

estriatales y en las fibras dopaminérgicas remanentes. La caida leve de los niveles de HVA

en comparación con la pérdida masiva de DA, es un reflejo de compensaciones metabólicas

que se interpretan como actividad aumentada de las neuronas aún funcionales (Hefti el a1.,

1980; Zigmond et aL, 1984). Esta hipótesis fue confirmada utilizando modelos animales de

Parkinson experimental, que muestran una relación HVA/DA aumentada. En dichos

modelos, el grado de compensación presináptica varía en función de la severidad de la

lesión. Los mecanismos de compensación postsináptica entran en juego luego de una

desnervación superior al 90%, por medio de aumentos en la sensibilidad y/o densidad de

receptores. A este fenómeno se lo denomina supersensibilidad postsináptica desnervatoria

(Homykiewicz, 1979 y l998). Existen evidencias en favor de un aumento de sitios de unión

D2 a pesar de la pérdida de los receptores presinápticos (Brooks, 1992), aunque lo mismo

no está aclarado para los receptores Dl.

Se puede comprender, dadas las caracteristicas fimcionales de los ganglios de la

base, de que’ manera la pérdida de inervación dopaminérgica en el estriado favorece la

aparición de síntomas parkinsonianos. Experimentos electrofisiológicos y de actividad

metabólica en modelos animales de la EP muestran un incremento en la activación de la vía

indirecta (cuerpo estriado-GPe-NST-GPi/SNpr-tálamo) y una disminución en la activación

de la vía directa (cuerpo estriado-GPi/SNpr-tálamo) (ver figura 6). Estos cambios, en

conjunto, resultan en un incremento en la actividad de los núcleos eferentes de los ganglios

basales (GPi/SNpr) hacia el tálamo, lo cual se traduce en un aumento de la inhibición de las

30


neuronas tálamocorticales que sería la responsable de uno de los signos principales de la

EP, la bradikinesia.

Existen diversas hipótesis para explicar la patogénesis de la F,P. Muchas de ellas

postulan mecanismos de estrés oxidativo en el origen de la neurodegeneración, aunque las

auténticas fuentes no hayan sido identificadas. l,os agentes oxidativos putativos incluirían

peróxido de hidrógeno producto de la MAO, productos de autoxidación de catecolaminas

en presencia de oxígeno molecular, y especies reactivas de oxígeno generadas en reacciones

de tipo Fenton que involucran iones del hierro. Otras explicaciones se basan en evidencias

indirectas que señalan a la mitocondria como productora del daño neuronal, o evidencias

directas acerca de la influencia de agroquímicos ampliamente utilizados. Una cantidad de

grupos demostraron que la administración en dosis bajas de ciertos agroquímicos como la

rotenona o el paraquat inducen Parkinson en roedores (Betarbet el aL, 2000; Thiruchelvam

et aL, 2000). La degeneración de la dopamina proveniente de la sustancia nigra inducida

por rotenona no es solo el resultado de la actividad disminuida o totalmente abolida del

complejo l mitocondrial , sino que participan también células del sistema inmune del

cerebro y la microglia (Gao e! aI., 2002). Recientemente se demostró que la actividad de la

NADPH-oxidasa de la microglia juega un papel fundamental, al ser el principal productor

del ion superóxido, en los efectos neurotóxicos de los agroquímicos como la rotenona y los

agentes inflamatorios como el lipopolisacárido (Gao et aL, 2003). Ninguna de estas teorías

es capaz de explicar la selectividad de la pérdida de células nerviosas. Probablemente, algún

tipo de agresión ambiental o externa contribuya a la pérdida natural, relacionada con la

edad, de fibras dopaminérgicas, llevando al individuo al desarrollo de la EP. Factores

genéticos podrían sentar las bases de la predisposición individual. Altemativamente, la

enfermedad se podría deber a mecanismos que nada tengan que ver con el envejecimiento

normal del cerebro (para revisión ver Gershanik, 1997).

El tratamiento farmacológico de la enfermedad de Parkinson está dirigido

actualmente al alivio de la sintomatología sin influenciar la historia natural de la

enfermedad. La mejoría en la calidad de vida de los pacientes determina indirectamente un

aumento de su expectativa de vida. La compensación del déficit dopaminérgico de los

pacientes parkinsonianos se persigue administrando precursores de DA (levodopa),

3l


derivados sintéticos o semisintéticos que mimeti7an las acciones de la DA sobre los

receptores (agonistas dopaminérgicos) y drogas que potencian, directa o indirectamente, la

transmisión dopaminérgica (agentes liberadores de DA, inhibidores de la recaptación

neuronal, inhibidores de la degradación enzimática de levodopa o DA). El progreso de la

enfermedad, más la administración prolongada de agentes poco selectivos, modifican la

sensibilidad de los receptores y hasta inducen expresión ectópica de algunos de ellos

(Schwartz et al., 1998). Esto conduce a cambios en el estado de equilibrio (interacciones)

entre los distintos receptores de DA y provoca fallas en el control motor, que se manifiestan

como efectos colaterales indeseables tales como los movimientos involuntarios anormales

(diskinesias). Es por ello que la comprensión detallada de la fimción dopaminérgica puede

conducir al desarrollo de herramientas terapéuticas más selectivas, que permitan restablecer

el delicado equilibrio de la estimulación dopaminérgica normal, con menores efectos

secundarios.

I. 7. Modelo animal: lesión cerebral con 6-hidr0xid0pamina.

Los modelos experimentales de la enfermedad de Parkinson cumplen dos filnciones

importantes. Por un lado, constituyen una herramienta fundamental en el desarrollo y el

ensayo de estrategias terapéuticas. En segundo lugar pueden realimr un aporte a la

dilucidación de los mecanismos desencadenantes de la enfermedad.

El presente trabajo comprende la utilización de un modelo de neurodegeneración en

ratones relevante a la F,P porque reproduce condiciones patológicas en los ganglios de la

base de enfermos parkinsonianos. Se utiliza una sustancias neurotóxica cuyo mecanismo de

acción puede arrojar lu7.sobre la posible etiología de la enfermedad.

El análogo de la DA, 6-hidroxidopamina, es captado por neuronas

catecolaminérgicas a través del recaptador presináptico y provoca la destrucción de

terminales nerviosas y de cuerpos neuronales (ver figura 2). El tratamiento con desipramina

provoca un bloqueo del recaptador de noradrenalina y favorece la desnervación

dopaminérgica selectiva. La inyección estereotáxica unilateral de 6-hidroxidopamina (6

OHDA) en el cuerpo estriado (Ungerstedt y Arbuthnott, 1970; Goodale e! al., 1985), la

substantia nigra (During el al., 1992) o el haz nigroestriatal (Gershanik et al., l983b)

Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Introducción.

constituye un modelo de EP descripto inicialmente en la rata, y que luego fue extendido al

ratón y otras especies de animales no roedores.

Los animales con esta lesión unilateral de las neuronas dopaminérgicas

nigroestriatales muestran una conducta motora asimétrica por un período corto de tiempo

post-cirugía, pero pronto recuperan su conducta normal. Sin embargo, la administración de

agonistas dopaminérgicos directos (L-DOPA, apomorfina) provoca rotaciones

contralaterales al sitio de la lesión; los agonistas indirectos como la anfetamina o la cocaína

producen rotaciones hacia el lado de la lesión (ipsilaterales). Esta conducta rotatoria puede

ser cuantificada en cajas de rotación (Ungerstedt y Arbuthnott, 1970). Su aparición se

explica por la pérdida de dopamina del lado lesionado, que al llegar al 80 o 90%

desencadena mecanismos neuroquímicos compensatorios (para revisión ver Zigmond et aL,

1990). Por un lado, los terminales presinápticos remanentes incrementan la producción de

DA y la liberación ante la llegada de un potencial de acción. Por su parte, en la postsinapsis,

se desarrolla el fenómeno de supersensibilidad dopaminérgica, que involucra un aumento

en la densidad de receptores y en la eficiencia de la transducción de señales (Zhen et aL,

2002). Los mecanismos compensatorios que entran en acción en este modelo animal

recapitulan aquellos que permiten que la sintomatología parkinsoniana se manifieste sólo

cuando la pérdida de neuronas de la vía nigroestriatal alcanza el 90%. La inducción de la

respuesta rotatoria en ratas o ratones con este tipo de lesión sigue siendo la prueba más

importante en la evaluación de agentes terapéuticos para la EP.

l,a administración sistémica de agonistas dopaminérgicos directos permite evaluar

conductualmente (por cuantificación de la actividad rotatoria) estos mecanismos de

compensación a nivel de receptores postsinápticos. La disponibilidad de herramientas

farmacológicas selectivas ha permitido dilucidar algunas bases del desarrollo de

supersensibilidad; sin embargo quedan dudas acerca de las atribuciones de cada miembro

de la familia de receptores dopaminérgicos, sus interacciones entre si y con otras familias

de neurotransmisores. Las drogas liberadoras de dopamina (agonistas indirectos) son

capaces de contribuir a la comprensión del funcionamiento del hemisferio no desnervado

(Gerlach y Riederer, 1996).

33


F,lmecanismo de la neurotoxicidad ejercida por la 6-OHDA no está suficientemente

aclarado. Por sus sustituciones dihidroxi en orto- y en para- la molécula es inestable en

solución acuosa y reacciona con el oxígeno formando especies químicas de alta reactividad.

Algunos de sus productos de oxidación son la quinona de la 6-OHDA, el radical

superóxido, el radical hidroxilo y el peróxido de hidrógeno (Heikkila y Cohen, ¡972), que

aparentemente interfieren con la cadena de transporte de electrones mitocondrial

conduciendo al daño neuronal irreversible. l.a conducta rotatoria sólo se manifiesta ante

pérdidas severas del contenido de DA estríatal, lo que sugiere que es necesaria una

desnervación significativa para poner en acción los mecanismos postsinápticos de

supersensibilidad (Heikkila el aL, 198] ).

I.8. Respuestas conductuales. Interacción DI/D2.

Hasta hace 15 años aproximadamente, el receptor D2 fiJe considerado como el único

subtipo de receptor dopaminérgico responsable de todas las respuestas mediadas por la DA

en el SNC. Mediante ensayos de unión de ligandos radiactivos se describió una fuerte

correlación entre la afinidad de ciertas drogas por los receptores D2 con la potencia de estos

compuestos en distintas pruebas conductuales y su grado de efectividad en la terapia clínica

vinculada a enfermedades extrapiramidales o a desórdenes psiquiátricos (Amt, ¡982). El

receptor Dl fue descripto por diversos autores como un “receptor en busca de función”

(Laduron, ¡983; Stoof y Kebabian, 1984). Sin embargo, gracias al desarrollo de drogas

selectivas Dl se encontraron evidencias incontrovertibles de la participación de los

receptores Dl en la mediación de respuestas conductuales y motoras (para revisión ver

Waddington el aL, 1994). Más aún, parte de estos hallazgos sugiere un papel crucial para el

receptor DI en las respuestas fisiológicas estudiadas, considerándose que el

restablecimiento de la función dopaminérgica se realiza a través de la estimulación de

ambos subtipos de receptores. A partir de entonces surgieron múltiples observaciones

demostrando una interacción funcional muy cercana entre los receptores Dl y D2 (para

revisión ver Waddington y Daly, 1993; Waddington e! aL, 1994).

Por un lado, la estimulación simultánea de ambos subtipos de receptores muestra

propiedades aditivas o sinérgicas en estudios de comportamientos estereotipados o conducta

34


locomotora. Gershanik y colaboradores (¡9833) demostraron en ratones akinéticos por una

dosis aguda de reserpina que la administración separada de agonistas selectivos Dl o D2

fue incapaz de revertir la akinesia. Sólo la inyección conjunta de ambos agonistas o de un

agonista mixto Dl/D2 permitió la expresión de respuestas locomotoras. Por otra parte, el

uso de agonistas y antagonistas selectivos reveló la existencia de efectos opuestos de los

receptores Dl y D2 en ciertas conductas en roedores. Estos hallazgos experimentales

podrían representar la contrapartida conductual de los efectos opuestos descriptos para los

receptores Dl y D2 en cuanto a la formación de AMPc. Existe un enorme volumen de

resultados de interacciones de tipo cooperativo (aditivo y sinérgico) u opuesto en todos los

frentes de abordaje en el estudio de la función de los receptores dopaminérgicos (para

revisión ver Rubinstein, 1989; Waddington y Daly, ¡993; Waddington y col., 1994).

Este campo se ha complicado aún más luego del reconocimiento de un número de

receptores dopaminérgicos superior al propuesto originalmente. Aún no contamos con

drogas totalmente capaces de diferenciar los subtipos de receptores dopaminérgicos dentro

de cada subfamilia pero sí existen agentes capaces de diferenciar entre las subfamilias Dl y

D2. Por lo tanto, este concepto clásico de “interacciones Dl/D2” no ha caído en desuso; por

el contrario, dicho concepto necesita ser readaptado, delineando los papeles relativos de

cada subtipo de receptor en estas interacciones.

I. 9. Otras Fisiopatologías Asociadas ala Neurotransmisío’n Dopamine'rgica

1.9.] Esquizofrenia.

Asi como la disfunción de las neuronas nigroestriatales producen un déficit en el

control de la ejecución y la motivación de los movimientos voluntarios evidenciada en la

enfermedad de Parkinson, desórdenes en el sistema corticolímbico están involucrados en

los desbalances perceptuales observados en la esquizofrenia.

Las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas que se originan en los núcleos AlO

conforman el sistema dopaminérgico mesolímbico y mesocortical involucrados en la

regulación de funciones emocionales y cognitivas. Durante los 20 años anteriores al

descubrimiento de los 5 subtipos de receptores dopaminérgicos, numerosos estudios habían

establecido que la esquizofrenia estaba asociada con una transmisión dopaminérgica

35


anormal en la vía mesocorticolímbica sugiriendo que esta enfermedad se encontraba

acompañada de un aumento del tono dopaminérgico (Creese el aL, 1976; Seeman el aI.,

1976; Snyder, 1974). Esta hipótesis se basó en que el grado de mejoramiento de los

síntomas psicóticos producidos por neurolépticos está en correlación directa con la potencia

de estas drogas como antagonistas de receptores dopaminérgicos D2 (Seeman el aL, 1975).

Los síntomas de la esquizofrenia más característicos son la aparición de alucinaciones

visuales y auditivas, paranoias, comportamientos excéntricos o violentos, alteraciones del

habla, depresión y retracción social. Si una manipulación farmacológica de los receptores

puede modular la transmisión dopaminérgica y reducir los síntomas psicóticos, se puede

especular con una anomalía tanto estructural como de expresión de dichos receptores con

prevalencia en la determinación de la esquizofrenia. lla esquizofrenia se caracteriza

principalmente por alteraciones emocionales y deficiencias cognitivas más que por

deficiencias motoras. La potencia terapéutica de las drogas antipsicóticas sin sintomatología

negativa (alteraciones motoras) correlaciona directamente con la afinidad de bloqueo de los

receptores DZ (Creese et a1., 1996, Seeman el aL, 1975). Con el clonado de los restantes

subtipos de receptores dopamínérgicos se generaron nuevas incógnitas acerca de la

participación de los receptores D2, D3 y D4 en este desorden. La observación de que la

clozapina, uno de los antipsicóticos más potentes, tiene una alta afinidad selectiva por el

receptor D4 y mejora los síntomas positivos y negativos de la esquizofrenia (alucinaciones,

paranoias, retracción social, etc.) sin producir efectos motores negativos permitieron

postular a este receptor como actor preponderante en la progresión de este desorden (Van

Tol el aL, 1991). Actualmente, se reconoce que los efectos antipsicóticos de los

neurolépticos se deben al bloqueo de los receptores de “tipo D2” corticales más que a los

receptores estriatales que estarían involucrados en los efectos colaterales motores adversos

(Broich e! aL, 1998). Ha sido demostrado que el tratamiento crónico con neurolépticos,

resulta en un incremento en la densidad de receptores D2 y de receptores D4 en cerebro de

rata (Seeman e! aL, 1993; Schoots e! aL, 1995). Los síntomas negativos de la esquizofrenia

están determinados por comportamientos de abstinencia social, apatía crónica, depresión y

deficiencias cognitivas (Moller, 1993; Buchanan era1., ¡994). Nuevos trabajos postulan que

estas deficiencias podrían ser producidas por una desensibilización de los receptores Dl


presentes en la corte7a como ha sido observado en pacientes esquízofrénicos no tratados

(Okubo et aL, 1997). Estos estudios sugieren que cambios en la estimulación

dopaminérgica y en los receptores de la cone7a cerebral deben ser tenidos en cuenta cuando

se evalúan las acciones en los tratamientos con drogas antipsicóticas. Es necesario

comprender las alteraciones al nivel de estimulación y funcionalidad de los receptores para

comprender la implicancia del sistema dopaminérgico en la determinación de la patología

de la esquizofrenia y en el mejoramiento de las estrategias terapéuticas.


2. Sistema Cre-onP.

La recombinación homóloga en células totipotenciales embrionarias de ratón

(células ES) y la generación de ratones mutantes se ha convertido en los últimos años en

una metodología muy popular y poderosa para el estudio de la función de genes in vivo.

Este abordaje, combinado con análisis anatómicos, electrofisiológicos y comportamentales

ha permitido comprender como ciertos genes participan en funciones tan complejas, como

el aprendizaje y la memoria (Fletcher, 1997; Mayford el.al., 1997). Sin embargo, ciertos

problemas restringen la utilidad de ésta técnica. Si el gen de interés está expresado de

manera temprana, su mutación puede resultar en defectos del desarrollo o incluso puede ser

letal. Mas aún, la ausencia de un gen puede llevar a mecanismos de compensación a nivel

génico o a nivel celular.

Para sobrepasar estos problemas se han desarrollado estrategias de recombinación

génica tejido específicas (Gu et.al., 1994) y mutaciones inducibles (Kuhn el.al., 1995).

Estos sistemas se desarrollaron utili7ando la actividad de la recombinasa Cre del

bacteriófago Pl (Abremski el.al., 1984; Hoess eta], 1982; Kilby el.al., l993) que permiten

evitar defectos durante el desarrollo, minimi7ar el período durante el cual se desencadenan

los mecanismos compensatorios y también la evaluación del comportamiento de un animal,

antes y después de que la mutación haya sido inducida, evitándose así, interpretaciones

derivadas de las diferencias existentes en la genética de los ratones mutantes y sus controles

(Silva et.aI., l997).

El bacteriófago Pl codifica para la proteína recombinasa Cre de 38 kDa que cataliza

la recombinación sitio específica del ADN entre secuencias de 34 pb repetidas llamadas

loxP (Stemberg el.al., l98l). Cre es un miembro de la familia de integrasas dentro de las

recombinasas, las que reconocen secuencias de nucleótidos específicos y funcionan a través

de una unión covalente transitoria del ADN con la proteína (Argos et.a1., 1986; Craig,

1988). Los sitios loxP son palindrómicos excepto por una secuencia central que le provee a

cada sitio una orientación unidireccional (Hoess et.al., 1986). Repeticiones directas de dos

sitios loxP provocan la escisión del fragmento contenido entre ellos, mientras que

repeticiones invertidas provocan una inversión (Abremski el.aL, 1983).

l,a actividad de la recombinasa Cre se desarrolla en ausencia de cofactores de alta

energía, actividad topoisomerasa, y/o replicación del ADN (Abremski et.al., 1983;

Abremski et.al., ¡984) lo que puede estar explicando su gran eficacia para producir la

escisión y recombinación del ADN tanto en bacterias (Stemberg, ¡990), levaduras (Sauer,

1987), células de mamífero (Sauer el.a1.,1988) como plantas (Odell et.al., 1990). F.n 1992

Orban y colaboradores desarrollaron el primer ratón que sufrió una recombinación tejido y

sitio específica, comprobando que el sistema era eficiente y reproducible. Ello ha sentando

las bases para la generación de mutantes con deleciones espaciales más finamente

controladas.

Múltiples laboratorios han ido desarrollando animales transgénicos que expresan la

recombinasa Cre con diferente especificidad tisular y temporal (consultar la pagina web:

http://www.mshri.on.ca/develop/nagy/Cre.html. Estos animales permiten llevar a cabo

alteraciones específicas del genoma, como knock ouls, aberraciones cromosomales

inducidas y activación condicional de transgenes de manera tal que las alteraciones sean

restringidas a tejidos específicos y a tiempos predeterminados.

Para determinar la utilidad de los ratones transgénicos que expresan Cre bajo el

control transcripcional de los distintos promotores, se crearon ratones reporteros que

permiten una lectura real de la expresión y actividad de la recombinasa Cre. Una de estas

líneas fue utilizada en nuestros estudios y es la llamada Z/AP (Lobe et aL, 1999) para el

análisis de la actividad de Cre. Este animal transgénico Z/AP (LacZ/fosfatasa alcalina

placentaria humana, hPLAP) utiliza un sistema de doble reportero que proporciona un

ensayo preciso y sencillo para la excisión a nivel celular. Antes de la excisión por parte de

la recombinasa Cre, las células expresan el gen ,B-galaclosidasa cuya actividad es

fácilmente detectable por medio de un ensayo utilizando el cromógeno X-gal. Al existir

actividad de Cre, el gen ,B-galactosidasa es escindido debido a que se encuentra flanqueado

por sitios loxP y comienza a expresarse el gen de la fosfatasa alcalina placentaria humana,

la cual no lo hacia antes de la actividad de Cre debido a que los tres sitios de

poliadenilación existentes luego de la secuencia del gen de B-galactosidasa no permiten su

expresión. Por lo tanto, en aquellas regiones en donde existe actividad de la recombinasa

Cre se ve un cambio en la expresión de marcadores, excisión dependiente, mediada por la

39


recombinasa Cre. Estudios detallados sobre esta línea mostraron que el transgén Z/AP se

expresa en todos los estadios embrionarios, lo cual permite analizar la ontogenia de la

expresión génica mediada por el promotor utilizado (Figura 8).

Amplificador

CMV LOXP. ' LOXP' '.————. —l [Tromotor3-. "a l pA l g"Actina Pollo

Amplificador vCMV hPLAP—_—->_

Promotor BActina Pollo

Figura 8: Genética del ratón reportero Z/AP. El esquema muestra la construcción que expresa Z/AP. Elamplificador de CMV, junto con el promotor de B actina de pollo, dirijen la expresión de los genes reporteros.El primer gen, B Geo, se expresa en ausencia de recombinasa Cre (a). Este reportero está seguido por trescopias de señal de poliadenilación y flanqueado por sitios LoxP, por lo que es removido por acción de larecombinasa. El segundo reportero, fosfatasa alcalina placentaria humana (hPLAP, de sus siglas en inglés) seexpresa sólo luego de la excisión de B Geo por Cre (b).

40

3. Animales transgénicos como herramienta de estudio.

Hacia fines de la década del 80 todos los efectos mediados por la dopamina eran

atribuidos únicamente a dos subtipos de receptores dopaminérgicos. La farmacología

clásica, mediante el diseño de drogas y la observación de sus efectos, proponían la

existencia de dos receptores dopaminérgicos, Dl y D2, en base a los efectos opuestos sobre

la adenilato ciclasa. Sin embargo, el desarrollo de técnicas de biología molecular, utili7ando

el clonado por homología de receptores con 7 pasos transmembrana, permitió entre el año

1988 y el 199] el descubrimiento de los 5 subtipos de receptores dopaminérgicos conocidos

actualmente. La ampliación de la familia de receptores dopaminérgicos mantuvo la

subdivisión de los receptores en los de “tipo Dl” y los de “tipo D2” según su estructura

genómica, aminoacídica y el acople a segundos mensajeros. Sin embargo, aún hoy, no

existen agentes farmacológicos que permitan activar o bloquear selectivamente a cada

subtipo de receptor dopaminérgico. La similitud estructural existente entre los receptores de

cada una de las 2 subfamilias, tipo DI y tipo D2, indica que tal situación ideal demore

muchos años más en alcan7arse. Debido a que cada receptor dopaminérgico está codificado

por genes y unidades transcripcionales independientes, se han podido desarrollar en los

últimos años nuevas herramientas que permiten eliminar específicamente un subtipo de

receptor y estudiar, in vivo, los efectos producidos por su pérdida. La generación de ratones

mutantes derivados de la mutagénesis dirigida en células embrionarias totipotenciales

permite estudiar los mecanismos moleculares y celulares que regulan los comportamientos

como la coordinación motora, el aprendizaje y la memoria, la agresión y los ritmos

circadianos, entre otros. Con el objetivo de descubrir las funciones de los diferentes

subtipos de receptores dopaminérgicos en este laboratorio se estudian, desde hace ya más de

6 años, ratones deficientes en la expresión del receptor D2 y D4. Los resultados presentados

en la primera parte de esta tesis corresponden particularmente al estudio de la función del

receptor D2 en aspectos relacionados con la conducta motora. A mediados de la década del

noventa se desarrollaron, independientemente, dos líneas de mutantes nulos para el receptor

dopaminérgico D2. Su análisis inicial mostró que presentan una marcada akinesia y un

menor número de movimientos espontáneos y fue presentado como un modelo de

Parkinson experimental (Baik et aL, 1995). Un estudio más detallado en linajes genéticos

4|


uniformes, mostró que la actividad motora está determinada por la carga génica, la

uniformidad génica de la cepa en estudio y adaptaciones del desarrollo (Kelly el aL, 1998) y

que los fenotipos motores observados poco se parecían a los presentes en la enfermedad de

Parkinson. Los ratones mutantes para el receptor dopaminérgico D2 mostraron también una

reducción en el consumo y sensibilidad al etanol (Phillips et aL, 1998) y la ausencia de

efectos de recompensa por el consumo de opiáceos (Maldonado el aI., 1997). Utili7ando

estos animales mutantes se demostró la participación del receptor D2 en la autoinhibición

de la liberación de dopamina (Benoit-Marand el aI., 2001).

Este modelo de animal mutante nulo ha sido de gran utilidad para la determinación

de la participación del receptor dopaminérgico D2 en funciones motoras y límbicas pero su

uso está limitado debido a que sufre compensaciones adaptativas durante el desarrollo. Por

lo tanto, es deseable contar con un animal que pueda evitarlas. Una manera de lograrlo es

por medio del uso del sistema Cre-loxP. De esa manera se puede inducir la mutación en el

animal adulto luego de que completó su desarrollo.

OBJETIVOS

Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Objetivos.

Objetivos.

La variada gama de funciones reguladas por la dopamina y las patologías asociadas

a desbalances del sistema dopaminérgico, como la enfermedad de Parkinson, hacen que

exista un grán interés por caracteri7ar acabadamente cada uno de los receptores

participantes en estos sistemas. Uno de ellos es el receptor dopaminergico DZ.

Para contribuir al esclarecimiento del papel que desaiTolla dicho receptor, los

objetivos de este trabajo son:

o Evaluar la participación de los diferentes subtipos de receptores

dopaminérgicos en el desarrollo de supersensibilidad conductual en

ratones deficientes en receptores D2.

o Generar una línea de ratones transgénicos que dirijan la expresión de

la recombinasa Cre bajo el control transcripcional del promotor de 9

kb de tirosina hidroxilasa de rata.

o Generar una línea de ratones mutantes que lleven sitios loxP a los

lados del exón 2 del gen del receptor dopaminérgico D2.

Finalmente, a partir del cru7amiento de las dos líneas generadas, obtener

una línea de ratones que sean mutantes nulos para el receptor de dopamina

DZ presináptico.

RESULTADOS Y DISCUSION -—

Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Resultados y Discusión.

Resultados y Discusión.

Parte I.

I. Modelo animal para el estudio de Iafunción dopaminérgica.

1.1. Establecimiento del modelo de lesión estricta! con 6-hidr0xíd0pamina.

Para evaluar la función dopaminérgica nigroestriatal en ratones, se estableció un

modelo de animales rotatorios por medio de lesiones unilaterales intraestriatales con el

agente neurotóxico 6-hidroxidopamina (6-OHDA), que entra a los terminales sinápticos

dopaminérgicos a través del transportador de dopamina y promueve la muerte neuronal por

inducir un estado hiperoxidativo. Cinco días después de la inyección de 25 ug de 6-OHDA

en el cuerpo estriado derecho, los ratones fueron examinados y se detectó conducta

rotatoria espontánea en sentido ipsilateral al lado lesionado. Estas rotaciones se

interpretaron como locomoción inducida por una mayor cantidad de dopamina endógena

actuando sobre receptores nonnosensibles del hemisferio no lesionado. Los animales

respondieron de manera dosis dependiente con rotaciones contralaterales luego de la

administración aguda del agonista dopaminérgico mixto apomorfina (Figura 9). La pérdida

de terminales dopaminérgicos de la vía nigroestriatal fue confirmada por

inmunohistoquímica contra tirosina hidroxilasa (TH). La densidad de terminales TH

positivos fue sensiblemente menor en los estriados lesionados comparado con el lado sin

lesionar (Figura 10a). Un análisis inmunohistoquímico de la substantia nigra por medio de

un anticuerpo anti-tirosina hidroxilasa en secciones coronales de animales lesionados,

mostró la pérdida significativa de cuerpos neuronales dopaminérgicos (Figura lOb).

Los ratones lesionados recuperaron su postura y peso normal poco tiempo después

de ser sometidos a la cirugía, mantuvieron una sobrevida normal y continuaron exhibiendo

rotaciones al ser tratados con apomorfina hasta seis meses después de la operación.

El contenido de dopamina, dos meses después de la lesión, fue significativamente

menor en los estriados lesionados comparado con los contralaterales intactos (Figura ll).

Determinaciones por llPLC, indicaron 7772 i 577,2 pg/mg de tejido de DA para los

hemisferios control y de 3909 i 493,2 pg/mg para los lesionados (p=0.0006, test t de

46

Tesis Docmral. Diego M. Gelman. Resultados y Discusión.

Student). En los tres genotipos (Drd2+/+, Drd2+/', Drd2'/') se observó una disminución

comparable de los niveles estriatales de dopamina debido a la lesión. Los niveles de

dopamina en el lado intacto mostraron un contenido similar al existente en ratones

nonnales no lesionados. La disminución en los valores del metabolito de la dopamina

DOPAC en estriado de cerebro de animales lesionados, también mostró una disminución

respecto a los valores de DOPAC del lado no lesionado.(Figura l l).

Conlralalcralcs

¡25

¡001

0

.25Nro.rotaciones/5min.

-50lpsilalerales

0 0.25 0.37 0.50

Apomorfina (mg/kg, s.c.)

Figura 9: Evaluación conductual de la lesión. El número de rotaciones en animales lesionados con 6OHDA fue determinado 5 minutos después de la administración del agonista mixto apomorfina (0 a 0.5mg/kg). Las barras representan Ia media i el error estándar de 4 experimentos.

La inmunohistoquímica contra tirosina hidroxilasa demuestra que la acción de la

toxina se extiende desde el estriado hasta los cuerpos neuronales de la substantia nigra

produciendo la muerte de dichas neuronas. Esta desnervación es el origen del desarrollo de

supersensibilidad en el modelo de enfermedad de Parkinson del ratón rotatorio. La

disminución de la cantidad de dopamina en el lado lesionado, y no su desaparición total,

podría estar representando lesiones locales dentro del estriado lo que demuestra una

limitación del molde utili7ado para generar las lesiones cerebrales o una difusión despareja

de la toxina al momento de la operación.

47

ÏOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOÓÓOOOOOOOOOOOOOOC


La medida conductual de la desnervación es congruente con estos resultados pues

las rotaciones espontáneas ipsilaterales son interpretadas como locomoción unilateral

producida por activación del lado no lesionado.

La obtención de este modelo experimental de la enfermedad de Parkinson nos

permite estudiar el desarrollo de supersensibilidad postsínáptica en ratones salvajes para el

receptor de dopamina D2 o con la mutación nula para dicho receptor.

Control Lesionado

a

Figura 10: Lesión estriatal con 6-OHDA. Detección inmunohístoquímicade tirosina hidroxilasa en un cortecoronal a. del cuerpo estriado (A=]0X) y b. la sustancia nigra (A=100X) de ratones control y lesionados con6-OHDA.

48

Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Resullados y Discusión.

sus, :soo

4250

7500 oïa —|000e 8su zz 5000 n, - 450 aO o:

-500 32500

—250

0- <2DA oomc

-l,ado control :1 Ladolesionado

Figura ll: Determinación del contenido de DA y DOPAC. El contenido de DA y DOPAC en estriadoscontrol y lesionados con 6-OHDA proveniente de ratones operados (n=5) fue determinado mediante HPLC.Las barras representan el promedio i el error estándar. *" vs control: p< 0.005, " vs control: p< 0,05

¡.2. Desarrollo de supersensíbilidad conductual en ratones mutantes para el receptor

dopamine'rgico D2.

1.2.I. Establecimiento dela lesión estriatal.

Una vez puesta a punto la lesión intraestriatal para la generación del modelo de

animales rotatorios, fueron operados ratones de la cepa congénica C57BL/6J (n=8),

normales (+/+), mutantes heterocigotas (+/-) y mutantes nulos homocigotas (-/-) (Figura 12)

con una inyección de 25 pg de 6-OHDA en el estriado derecho. La existencia de

alteraciones en la vía dopaminérgica nigroestriatal fue evaluada por medio de ensayos

bioquímicos y conductuales.

a s A A Ï ¡lt blocus. Drd 2. t B FI

endógeno ¡_ 22a, _+ ./. -t-/- -t/+

I ' 2.2kbv d p s s s A s A P ' /ccmrc ' -="' ¡Skbdirecciona- - -\ i

miento-‘ uzEn‘- nz EIC

s s A s A ‘- "'° - Rccombinanlc 1 |homólogo 4-1334

Figura l2: Ratones mutantes para el receptor dopaminérgico D2. a. Se muestra un esquema de larecombinación homóloga en el locus del receptor DZ. b. Fotografia de un gel de agarosa expuesto a luz UVconteniendo los productos de PCR para los alelos normales (2,2 kb) y mutado (1,8 kb) obtenidos con losprimers esquematizados en a.

49

Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Resultados y Discusión.

Seis días después de haber sido operados, los animales de los tres genotipos

exhibieron niveles moderados, aunque sostenidos, de rotaciones espontáneas ipsilaterales

(Figura l3). El menor nivel de rotación de los ratones mutantes en comparación con los

normales está en coincidencia con el déficit motor que afecta a estos ratones (Kelly et.al.,

1998), pero hay que destacar que en este caso usamos una cepa congénica C57BL/6J n=8

para los estudios mientras que en el citado trabajo se hicieron con animales F2 (129sv x

C57BL/6J). A pesar de existir una clara tendencia en todos los animales de iniciar

rotaciones espontáneas ipsilaterales, la comparación por ANOVA de una vía reveló que las

diferencias entre los tres genotipos no son estadísticamente significativas (p=0,l 79).

¡0.07.s’EIn 7.5mtud)EE 5.0OQ.md)

8 2.5l:O

'GSe 0.0

e‘ —/— +/- +/+Z Drd 2

Figura ¡3: Rotaciones espontáneas ipsilaterales. El número de rotaciones espontáneas ipsilaterales enanimales lesionados de los tres genotipos (-/-. n=9; +/-, n=30; +/+,n=23) fue detenninado 6 días después degenerarse la lesión. Las barras representan el promedio i el error estándar.

En animales de los tres genotipos se evidenció una disminución en la

inmunomarcación de tirosina hidroxilasa al comparar el hemisferio lesionado con la toxina

6-OHDA y el hemisferio control (Figura lO). Existe asimismo una disminución en los

niveles de dopamina y DOPAC en animales de los tres genotipos cuando se compara el

lado lesionado del cerebro con respecto al no lesionado (Figura ll). Estos resultados

demuestran que la 6-OHDA actúa sobre los terminales presinápticos independientemente

de la dosis génica del receptor de dopamina D2 provocando perdidas significativas de la

dopamina estriatal.

1.2.2.Desarrollo de supersensibilidad en ausencia del receptor D2.

La administración del agonista mixto Dl/DZ apomorfma (0,5 mg/kg) 7 días después

de la operación provocó rotaciones contralaterales en animales Drd2i/+ y Drd2+/', pero no

tuvo efectos locomotores en los ratones knock oul (Drd2m', n=6; Drd2+/', n=l7; Drd2'/',

n=8) (Figura 14). Existe diferencia significativa (p<0,005) entre los animales knock out con

respecto a los +/+ y a los +/- pero no entre estos dos últimos según el análisis post-hoc de

Tukey. Inicialmente, esto fue interpretado como ausencia de mecanismos compensatorios

postsinápticos luego de la lesión desnervatoria en animales mutantes nulos para el receptor

D2.

La repetición del mismo ensayo el día 20 luego de la operación reveló la aparición

de rotaciones contralaterales en los portadores de los dos alelos nulos (Figura l4) en

comparación con el día 7 y se produjo, además, un aumento en el número de rotaciones de

los animales Drd2+/+y Drd2+/' y se detectaron diferencias significativas entre genotipos

(p=0,001 por ANOVA, Drd2*’*,n=5; Drd2+", n=l 7; Drd2'l', n=8), que se interpreta como la

existencia de distintos niveles de compensación postsináptica. Sin embargo, no hubo

diferencias en las comparaciones individuales entre los animales Drd2'l' y los Drd2“+ ni

tampoco entre estos últimos y los Drd2+/' (p>0,05 por post-hoc de Tukey). Cuando se hizo

nuevamente la prueba 17 días más tarde, es decir 37 días luego de operados, la respuesta

rotatoria de los animales Drd2"' se mostró aún más alta y ya no se registraron diferencias

entre genotipos (p=0,l42 por ANOVA; Drd2m, n=5; Drd2+/', n=16; Drd2'/', n=6) (Figura

l4).

El test con apomorfina fiJe repetido en distintos puntos temporales a lo largo de los

tres meses siguientes a la operación, con el fm de determinar la evolución de la respuesta

supersensible para cada genotipo. A partir de los valores obtenidos en dichas pruebas, se

realizaron ajustes a funciones polinómicas de tercer orden (Figura ¡5). Cada punto

representa el promedio de una prueba realizada con 4 a 7 animales Drd2+/+,14 a l7 Drd2H'

y 6 a 8 Drd2'/'. Existen diferencias significativas entre los tres conjuntos (ANOVA de dos

vías) explicadas por el genotipo (p=0,0001) y por el tiempo (p<0,000] ).

5|

Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.

l 00

- +/+

Nro.rotacionescontralaterales/lOmin.

Día7 Día 20 Día 37

Figura 14: Evolución de la respuesta supersensible. 7, 20 y 37 días después de la operación, animales delos tres genotipos fueron inyectados con apomorfina (0,5 mg/kg). El número de rotaciones contralaterales enestos animales fue determinado luego de lO minutos de la administración de la droga. Las barras representanel promedio i el error estándar de grupos de animales de entre 5 y 17 individuos (ver texto).** vs +/+ día 7, p<0,01, ns vs +/+, p> 0,05

Rotacionesconnalaterales/IOmin

Dim después de operados

Figure 15: Evolución del desarrollo de supersensibilidad conductual. El test con apomorfina fue repetidoen distintos puntos temporales a lo largo de los tres meses siguientes a la operación. Cada punto representa elpromedio de una prueba realizada con animales de los tres genotipos (+/+, n=4 a 7; +/-, n= 14 a 17; —/-,n=6 a8). Las funciones se obtuvieron por el mejor ajuste para regresiones no lineales (funciones polinómicas detercer orden; +/+, R2=0,9827; +/-, R2=0,9918; -/-, R2=0,9679).

52

Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Resulrados y Discusión.

Globalmente estos resultados demuestran que los ratones deficientes en receptores

D2 son capaces de desarrollar una respuesta compensatoria luego de la lesión de la vía

dopaminérgica nigroestriatal. Los ratones Drd2'l' exhibieron una respuesta supersensible

comparable a la de los normales al ser tratados con el agonista mixto apomorfina a partir

del día 37 posterior a la operación. La diferencia existente con los controles en las

mediciones previas sugiere la existencia de un período compensatorio temprano en el que la

presencia de receptores D2 sería esencial para la expresión de una máxima

supersensibilidad. Durante el período de máximo desarrollo de supersensibilidad, entre los

días 20 y 50 (Figura 15) la actividad rotatoria es menor en los animales Drd2'/',

probablemente porque en los ratones Drd2+/+y Drd2+/', la interacción sinérgica entre los

receptores Dl y D2 supera ampliamente a los mecanismos compensatorios de los mutantes.

A partir de la semana lO, los ratones de los tres genotipos mostraron una respuesta

supersensible estabili7ada en un nivel similar. Estas observaciones experimentales sugieren

que el componente Dl de la respuesta supersensible es de desarrollo más tardío con

respecto al D2, pero, una vez instalado, sería predominante. Estos resultados contrastan con

las explicaciones del desarrollo de supersensibilidad basadas únicamente en un aumento de

la densidad de receptores D2 estriatales (Creese et.al., 1977; Rogue et.al., 199]; Martres

et.al., 1992) y/o en el aumento de la eficiencia de la transducción de la señal de este subtipo

de receptor.

El comportamiento de los animales heterocigotas para el receptor D2, que poseen la

mitad de los sitios de unión D2 que los animales normales (Kelly et.al., 1997), revela que

un menor número de receptores D2 no perjudica el desarrollo de respuestas locomotoras

supersensibles y que por el contrario, permite la manifestación de rotaciones contralaterales

desde el primer desafío agudo con apomorfina en el día 7. En el período de respuesta

máxima, que abarcó desde el día 20 al 50, el nivel de rotación de los ratones heterocigotas

fue, aún superior a los controles (Figura 15).

Este resultado implica que el desarrollo de supersensibilidad conductual es un

proceso plástico sujeto a una dinámica temporal dependiente de la dosis génica del receptor

D2, como se puede observar en la figura 15.

53


1.2.3. Papel del receptor DI en Ia respuesta locomotora en ausencia de receptores D2.

Para estudiar el mecanismo subyacente a la respuesta supersensible de ratones

deficientes en receptores D2, se sometieron a animales de los tres genotipos a diferentes

dosis del antagonista Dl SCH23390 previo a la administración de apomorflna 0,5 mg/kg.

Este experimento, al igual que el de las secciones siguientes, fue reali7ado luego del día 40

después de la lesión con 6-OHDA, es decir, cuando la supersensibilidad postsináptica ya

había alcan7ado la respuesta máxima en los tres genotipos y había comen7ado a

estabilizarse. En el día l del experimento, los animales de los tres genotipos fueron

testeados con una dosis de apomorfina para seleccionar a los rotadores y establecer un valor

de referencia del 100%. Dos días después se pretrataron con dosis diferentes del antagonista

SCH23390, 30 minutos antes de la inyección de apomorfina. Los resultados se expresaron

como porcentaje de las rotaciones respecto del día l (Figura 16). El día 4 se repitió la

inyección de apomorfina para verificar la recuperación de la respuesta inicial (del día l).

Cuando se utilizó una dosis baja (0,01 mg/kg) del antagonista Dl SCH23390, la

respuesta rotatoria de los animales Drd2'l' descendió casi un 60% en promedio respecto del

día l, mientras que la de los controles bajó menos de un 25%, aunque ésta disminución no

representó una diferencia estadísticamente significativa (p=0,059, Drd2+/+ n=4, Drd2'/'

n=5). Con una dosis más alta del antagonista (0,05 mg/kg), la respuesta de los animales

Drd2"' fue prácticamente anulada, llegando a un 10% respecto del día l, mientras que la de

los controles fue un 50% de la original resultando significativamente distinta respecto del

día l (p<0,001, Drd2+/+n=5, Drd2-'/' n=6, prueba t de Student). Los heterocigotas (Drd2+/')

se comportaron en ambos casos de manera similar a los controles Drd2+l+(p>0,05, n=l4).

Estos resultados demuestran que en ausencia de receptores D2, la estimulación de

los receptores dopaminérgicos Dl, es esencial para la expresión conductual de

supersensibilidad. El bloqueo del componente Dl en ratones normales provocó un descenso

parcial en las rotaciones, pero las dosis de antagonista empleadas no anularon la expresión

de supersensibilidad. Los mutantes nulos fueron incapaces de mantener una respuesta

rotatoria supersensible por mecanismos independientes del receptor D].

IOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOCÓOOOOOOOOOOOOOOOOOG


150—

214.|25- 7 _+/.

T —+/+

Nro.rotacionescontralaterales/10min

(%delcontrol)

Dial Día3 Día3 Día4Apo 0,50 SCH 0,01 SCH 0,05 Apo 0,50

Apo 0,50 Apo 0,50 (Recuperación)

Figura 16: Efecto del antagonista Dl SCH23390 en las rotaciones inducidas por apomorfina. Luego deldía 40 después de la operación, animales lesionados de los tres genotipos fueron sometidos a diferentes dosisdel antagonista D] SCH23390 previo a la administración de apomorfina 0,5 mg/kg. El número de rotacionescontralaterales en estos animales fue determinado luego de lO minutos de la administración de apomorfina.Las barras representan el promedio i el error estándar de grupos de animales de entre 4 y 14 individuos (vertexto).*, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001 vs día l del mismo genotipo.-/- vs +/+ día 3 SCH 0,01, p=0,059; -/- vs +/+ día 3 SCH 0,05, p<0,01

1.2.4. Efecto del bloqueo inespect’fico de receptores “tipo D2” sobre las respuestas

supersensibles.

Para determinar el efecto del bloqueo de los receptores dopaminérgicos de “tipo

D2” sobre la conducta rotatoria, se administró raclopride a los animales de los tres

genotipos, un antagonista tipo D2 con preferencia por receptores D2 y D3. Raclopn'de a una

dosis de 2 mg/kg produjo un descenso en la respuesta a apomorfina en los tres genotipos

(Figura 17). La inhibición promedio fue superior al 75% en ratones Drd2+/+ y Drd2+/'

(p<0,05, n=4 y p<0,0001, n=9 respectivamente, prueba t de Student) y superó el 50% para

los Drd2"" (p<0,05, n=5) en todos los casos con respecto al valor de referencia de 100% del

día 1. Los tres genotipos recuperaron la respuesta al ser tratados con apomorfina sola (0,75

mg/kg) 5 días después, luego del lavado completo del antagonista.

55

DOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOÓOCOOOOOOOOOOOOI


El efecto del raclopride en ratones deficientes para el receptor D2 es un resultado

sorprendente que sugiere la participación de otro u otros receptores de la subfamilia en la

respuesta supersensible. El estudio del receptor D3, tanto fisiológico como por respuestas

de knock out o knock down, señala su papel inhibitorio sobre respuestas de actividad en

locomoción (Daly y Waddington, 1993; Accili et.al., 1996; Menalled et.al., 1999), aunque

existen evidencias de su expresión estriatal ectópica relacionada con la sensibilización a L

DOPA que le atribuyen un papel opuesto (Schwartz et.al., 1998). Por otra parte, existen

niveles detectables de expresión D4 en el cuerpo estriado, aunque su importancia fiincional

no ha sido aclarada (Tarazi et.al., 1998; Cohen et.al., 1992; Van Tol et.al. 1991). Si bien el

raclopride es un antagonista con mucha mayor afinidad por receptores D3 (Ki<0.5 nM) que

D4 (500 nM<Ki<5 nM) la dosis empleada en nuestros experimentos podría estar afectando

a ambos subtipos de receptores.

.Ea 1502 :I-/E -+/E -+/+3 A7‘: g 100J: aa og Omg 75o atS:.3 V8 50O‘

- üo ¡til!|z 25

0..Dial Día 3 Día 8

Apo 0.75mg/kg Rac 2mg/kg Apo 0.75mg/kgApo 0.75mg/kg (Recuperación)

Figura ¡7: Efecto del antagonista tipo D2 raclopride en las rotaciones inducidas por apomorfina. Luegodel día 40 después de la operación, animales lesionados de los tres genotipos fueron sometidos al antagonistatipo D2 raclopride (2 mg/kg) previo a la administración de apomorfina 0,75 mg/kg. El número de rotacionescontralaterales en estos animales fue determinado luego de 10 minutos de la administración de apomorfina.Las barras representan el promedio i el error estándar de grupos de animales de entre 4 y 9 individuos (vertexto).*, p<0,05; ***, p<0,0001 vs día 1 del mismo genotipo.

56


1.3.Análisis delas interacciones entre receptores de "tipo DI ”y “tipo DZ”.

Ratones de los tres genotipos fueron tratados con el inhibidor reversible de la

tirosina hidroxilasa a-metil-p-tirosina (AMPT) en dosis de 200 mg/kg i.p. tres horas antes y

100 mg/kg i.p. una hora antes de la administración de agonistas. Este tratamiento, produce

una disminución severa de los niveles de catecolaminas (Dziewczapolski et.al. 1997). Al

momento de la administración de los diferentes agonistas, los animales mostraron una

profunda akinesia. En ese momento fueron sometidos a la prueba l, en la que les fue

suministrada una dosis del agonista Dl SKF 38393 (SKF) (Figura 18). Los ratones+/+normales Drd2 (n=lO) no exhibieron conducta rotatoria inducida por la estimulación Dl

en ausencia de dopamina endógena, mientras que los Drd2+/' y los mutantes nulos Drd2'/'

rotaron de manera pobre y despareja (Drd2+/': 8,1 i 2,6 rotaciones / lO min, n=15; Drd2'/':

9,1 i 6,5 rotaciones / lO min, n=8). El número de rotaciones para cada genotipo no

representó diferencias significativas (p>0.05, ANOVA seguido de test de Dunnett).

Transcurridas tres horas del primer experimento realizamos la prueba 2 (Figura l8). Se

reasignaron los animales a dos grupos de los cuales el primero recibió nuevamente SKF

38393 lO mg/kg más una inyección de solución salina mientras que el segundo recibió SKF

38393 lO mg/kg más una inyección del agonista tipo D2 quinpirole 0,6 mg/kg i.p. Al tratar

ratones Drd2“, Drd2+/'y Drd2"' con SKF y solución salina, se obtuvo un resultado similar

al de la prueba l, comprobando que en el intervalo de tiempo entre los experimentos, no se

había producido una recuperación de la dopamina endógena. Los animales Drd2“+ y

Drd2+/' experimentaron aumentos significativos de la actividad rotatoria al recibir SKF y

quinpirole (Drd2+/+:62,0 j: 5,6 rotaciones / lO min, n=5; Drd2“? 85 i- lO rotaciones / lO

min, n=9; p<0,0001 según prueba de t). En cambio, los animales Drd2'l' no fueron

afectados por la administración conjunta de SKF y quinpirole (¡4,4 i- 8,2 rotaciones / lO

min, n=5; p>0,3 comparando con la prueba l por el test de t)

En este experimento, la estimulación conjunta Dl y D2 fue capaz de revertir la

akinesia, inducida por el tratamiento con el inhibidor de la síntesis de catecolaminas

AMPT, en ratones normales y heterocigotas para la mutación en el locus D2, pero no así en

los mutantes nulos. La medida de reversión de la akinesia utili7ada fue la inducción de

conducta rotatoria en condiciones de supersensibilidad que se manifestó en un aumento


sinérgíco en animales Drd2+/+y Drd2+/' tratados con una combinación de SKF 38393 y

quinpirole.

Por otro lado, el comportamiento de los Drd2’/' resultó paradójico. Si bien estos

animales fueron capaces de manifestar una respuesta dopaminérgica supersensible

comparable a la de sus hermanos normales, que depende del receptor D1, según los

resultados descriptos anteriormente, se observó que la estimulación tipo D1 fue incapaz de

revertir la akinesia inducida por AMPT. Incluso cuando se aumentó la dosis de quinpirole a

15 mg/kg, los animales Drd2'/' no iniciaron una respuesta rotatoria apreciable (n=5, datos

no exhibidos). La administración simultánea de SKF y quinpirole produjo una respuesta

minima que no difirió significativamente del resultado nulo obtenido con SKF solo.

100-1 “i I:l-/-+/

2 -+l+\ 75"éa:ES

g 508.5ée 25e'z

0

SKF(lOmg/kg) + + + + + + + + +SALINA + + +QUlNPlROLE + + +(I mg/kg)

prueba l prueba 2 prueba l prueba 2 prueba l prueba 2

Figura 18: Análisis de interacciones Dl/D2 en ausencia de dopamina endógena. Ratones lesionados delos tres genotipos fueron tratados con el inhibidor reversible de la TH, AMPT, previo a la administración deagonistas. En la prueba l, los animales fueron sometidos a una dosis del agonista D1 SKF 38393 y al cabo de10 minutos se determinó el número de rotaciones contralaterales. En la prueba 2, se les suminstró a un grupode animales, SKF más solución salina, mientras que otro grupo recibió SKF más un agonista tipo DZ,quinpirole, y al cabo de 10 minutos se determinó el número de rotaciones contralaterales. Las barrasrepresentan el promedio i el error estándar de grupos de animales de entre 5 y 15 individuos (ver texto).** vs prueba 1 del mismo genotipo, p<0,0001, * vs +/+ mismo tratamiento, p<0,05

58

P0000000.0000000000000.00000000ÓOOOOOO0.0.0.0.1


Para evaluar las interacciones Dl/D2 en presencia de catecolaminas endógenas, es

decir, sin el pretratamiento con AMPT, se sometieron a ratones de los tres genotipos a una

dosis del mismo agonista D1 utilizado anteriormente, SKF 38393, a una concentración de 6

mg/kg. Los resultados se muestran en la figura 19. Ninguno de los grupos respondió con

rotaciones contralaterales a este tratamiento, hasta 40 minutos luego de la inyección del

agonista (DrdÏ/Jr n=4; Drd2+/' n=8; Drd2'/' n=5). Luego se trataron a los animales con SKF

6 mg/kg más una dosis de quinpirole de 0,6 mg/kg. Este tratamiento produjo niveles de+/+ +/

rotación considerables en los Drd2 y en los Drd2 y nuevamente la respuesta rotatoria

de estos últimos fiJe mayor con respecto a los animales normales, pero fue incapaz de

producir rotaciones en los ratones Drd2'/' (p<0,05, ANOVA). Sin embargo, al aumentar la

dosis de quinpirole a 3 mg/kg, administrado junto con el SKF 6 mg/kg, se observó una

respuesta supersensible en los tres genotipos. Los animales Drd2+/+ y Drd2+/' no

aumentaron la respuesta observada con la dosis inferior de quinpirole, sugiriendo que ella

ya era la máxima. Los heterocigotas se diferenciaron de los normales (p<0,01), reforzando

la idea de que la dosis génica D2 cumple un papel crucial en las interacciones Dl/DZ. Los

knock out alcanzaron un nivel de rotación similar al de los ratones normales (p>0,05,

ANOVA seguido de test de Dunnett).

2 |00\ l: -/¿”3 — +/e 75% su - +/+Tu

Eo 50oU)fl)3:.9fé 25- ns80'hZ 0-_____ — ....__..._

SKF 6 mg/kg SKF 6 mg/kg SKF 6 mg/kgQP 0,6 mg/kg QP 3 mg/kg

Figura 19: Evaluación de interacciones Dl/D2 en presencia de catecolaminas endógenas. Un grupo deratones lesionados de los tres genotipos file tratado con una dosis del agonista Dl SKF 38393 mientras queotro grupo fue tratado conjuntamente con SKF y el agonista tipo D2 quinpirole. Al cabo de 10 minutos de laadministración de los agonistas se determinó el número de rotaciones contralaterales. Las barras representanel promedio i el error estándar de grupos de animales de entre 4 y 8 individuos (ver texto).ns vs +/+ mismo tratamiento, p>0,05** vs +/+ mismo tratamiento, p<0,0]

59


En conjunto, estos resultados apoyan una explicación basada en la necesidad de

estimulación de “tipo D2” para la expresión de conducta rotatoria en ausencia del receptor-/

D2. La akinesia inducida por AMPT en los ratones Drd2 , resistente al tratamiento con

dosis elevadas de SKF 38393, señala concluyentemente que la estimulación dopaminérgica

Dl no basta para la inducción de rotaciones. La incapacidad del SKF 38393 para inducir

rotaciones en condiciones normales, es decir sin el pretratamiento con AMPT, nos obliga a

descartar una explicación basada en el déficit de otras catecolaminas. La administración de

SKF fue incapaz de inducir rotaciones en los knock out incluso a dosis de 12 mg/kg (datos

no exhibidos). La inducción de respuesta rotatoria se produjo sólo cuando al agonismo Dl

se agregó una fuerte estimulación “tipo D2” que favorece la activación de receptores D3

y/o D4.


Parte 2.

1. Ratón transgénico TH-Cre.

1.1. Construcción de un transgén que expresa recombínasa Cre bajo el promotor de

tirosina hidroxilasa.

Para dirigir la expresión de la recombínasa Cre del bacteriófago Pl hacia células

catecolaminérgícas se construyó un vector portando el transgén que contiene la secuencia

codificante de la recombínasa Cre bajo el control transcripcional del promotor de 9 kb de la

tirosina hidroxilasa de rata. Este transgén, denominado —9THCre(Figura 20) fue purificado

y luego liberado del vector por medio de doble digestión con las enzimas SalI y NotI. El

inserto fue finalmente preparado para microinyección pronuclear.

Región 5’ flanqueante. Promotor de TH de rata.

Cre

S Sonda Nl l

l kb Creó Cre2

327 pb

Figura 20: Estructura del transgén TH-Cre. La línea roja representa el promotor de la tirosina hidroxilasade rata de 9 kb de longitud, la azul, al gen de la recombínasa Cre del bacteriófago Pl y la verde, la secuenciade poliadenilación. Cre 6 y Cre 2 son los primers a partir de los cuales se hace la genotipificación de animalestransgénicos amplificando una banda de 327 pb. S (Sall) y N (NotI) son las enzimas utilizadas para laliberación del transgén del plásmido. Sonda indica el fragmento de ADN utilizado para la genotipificación porDot Blot.

6]


1.2. Producción de animales con el transgén —9THCre.

El transgén —9THCrese microinyectó en el pronúcleo de ovocitos fertilizados de

ratón. Éstos se transfirieron al oviducto de hembras pseudopreñadas y a las tres semanas del

nacimiento se analizaron las crías en búsqueda del transgén. En total nacieron 23 animales

de embriones microinyectados resultando dos hembras transgénicas. La presencia del

transgén fue detectada por Dot Blot hibridando con un fragmento BamHI y BglII del gen de

la recombinasa Cre marcado radioactivamente y también por medio de PCR al amplificarse

una banda de 327 pb que abarca parte del gen de la recombinasa Cre (Figura 21).

Para establecer una colonia de animales transgénicos, las hembras transgénicas

obtenida por microinyección (F0), fueron apareadas con ratones no transgénicos. Una de las

hembras resultó ser estéril. El ADN de las crías de la hembra fértil se analizó por PCR y

Dot Blot para detectar la presencia del transgén. El transgén se transmitió a la filiación 1

(Fl), indicando que este se integró en los embriones de la F0 en un estadio que aseguró la

presencia del transgén en las células germinales y el evento de integración fue anterior a la

primera división mitótica de la cigota microinyectada, debido a que el porcentaje de

transgénicos Fl es cercano al 50%.

Por lo tanto, se obtuvo una línea de animales portadora del transgén que contiene la

recombinasa Cre del bacteriófago Pl bajo el promotor de la tirosina hidroxilasa. A

continuación, se describe la determinación del patrón de distribución de la proteína

transgénica Cre, comparándola con la endógena TH.

SinADN Control #90)

Figura 21: Genotipificación de animales transgénicos TH-Cre. En la figura a se muestran las señalescorrespondientes a animales positivos para Cre y la correspondiente al control positivo (ADN plasmídico) enun Dot Blot. El ADN de esos animales transgénicos fue sometido a una PCR (b) para determinar la presenciade una banda amplificada de 327 pb correspondiente a un fragmento interno del gen de la recombinasa Cre.

62

Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Raw/lados y Discusión.

1.3.Patr0’nde distribución dela proteína transgéncia Cre

El animal transgénico producido es portador del transgén construido puesto que éste

se detectó por los métodos indicados anteriormente, pero fue necesario determinar si el

promotor de la tirosina hidroxilasa era capaz de dirigir la expresión de la recombinasa Cre

de manera correcta en dicha línea.

1.3.¡Expresión de tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre en cerebro.

Primeramente, se analizaron cerebros de animales transgénicos TH-Cre. Secciones

coronales y sagitales de 30 a 50 um de espesor obtenidas por cortes en vibrátomo o

micrótomo fueron sometidas a inmunohistoquímica para determinar el patrón de expresión

de la proteína endógena tirosina hidroxilasa y la transgénica Cre.

La expresión fue analizada en la sustancia nigra y el área tegmental ventral, en el

bulbo olfatorio y en el núcleo arcuato del hipotálamo en cortes coronales de cerebros de

animales transgénicos TH-Cre. En la figura 22 puede verse que el patrón de expresión de la

recombinasa Cre es plenamente coincidente con el de la proteína endógena tirosina

hidroxilasa. Puede verse que TH, al ser una proteína citoplasmática, se distribuye en toda la

célula marcándose las proyecciones hacia el cuerpo estriado correspondientes a las fibras

ascendentes del sistema nigroestriatal. Por el contrario, la recombinasa Cre cuenta en su

secuencia con una señal de anclaje al núcleo lo que implica que su inmunomarcación sea

más puntual y ceñida al núcleo celular. Por otro lado, se hizo una inmunohistoquímica

contra TH y Cre en secciones sagitales para determinar la distribución de la expresión de

cada una de estas proteínas en el locus coeruleus. Una vez más se observó que el patrón de

expresión de Cre es coincidente al de TH en este núcleo.

En resumen, el análisis de la expresión de la proteína recombinante Cre en cerebro

de animales transgénicos indicó que el transgén es activo en los núcleos neuronales que

expresan tirosina hidroxilasa. Se observó la expresión de Cre en las neuronas de la

sustancia nigra del sistema dopaminérgico nigroestriatal. También en las neuronas del área

tegmental ventral del sistema corticolímbico y en las neuronas del núcleo arcuato del

hipotálamo del sistema tuberoinfundibular. Asimismo, se determinó la expresión de Cre en

la capa periglomerular del bulbo olfatorio y en el núcleo A6 (locus coeruleus) compuesto

principalmente por células TH positivas noradrenérgicas.

63

rOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOÓOOOOÓOOOOOOOOO0.0.01

TesisDoctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.

Figura 22: Localización de TH endógena y recombinasa Cre transgénica en diferentes áreas. Seccionesseriadas de 50 pm de espesor de cerebros de animales transgénicos TH-Cre a nivel del locus coeruleus(células A6, a y b), sustancia nígra pars compacta y área tegmental ventral (A9 y A 10, c y d), núcleo arcuatoy periventrícular del hípotálamo (A12 y A14, e y f) y en la capa periglomerular del bulbo olfatorio (A16, g yh), fiieron sometidas a inmunohistoquímíca utilizando anticuerpos anti-TH (paneles de la izquierda) o antiCre (paneles de la derecha) como primer anticuerpo. A=100X.

64

ÏCOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOCOOCOOOÓOOOO0.00.0.0001


1.3.2. Colocalizacio'nde tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre.

Para determinar si las células que expresan tirosina hidroxilasa también expresan

recombinasa Cre, se hizo un ensayo de colocalización con anticuerpos policlonales

específicos contra cada una de las proteínas. En una doble inmunohistoquímica en

secciones sagitales de cerebros de animales transgénicos se observo que, a bajo poder, el

patrón de expresión es coincidente en la sustancia nigra y área tegmental ventral, locus

coeruleus, bulbo olfatorio y núcleo arcuato del hipotálamo mientras que si se hace una

observación en alto poder, aquellas células que expresan tirosina hidroxilasa en su

citoplasma también expresan recombinasa Cre en sus núcleos (Figura 23).

La coexpresión de TH y Cre a nivel celular fue confirmada por la doble

inmunomarcación y así, la observación de un patrón coincidente a bajo poder fue

confirmada también a alto poder. La tirosina hidroxilasa muestra un patrón de expresión

citoplasmático mientras que la recombinasa Cre lo hace de manera nuclear.

Figura 23: Colocalización de tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre. Secciones sagitales de cerebros deanimales TH-Cre fueron sometidos a una doble inmunohistoquímica utilizando como primeros anticuerposanti-TH y anti-Cre. Panel a: la sustancia nigra y área tegmental ventral A=200X, b: sustancia nigra A=1000Xc: núcleo arcuato del hipotálamo A=1000X.

65

1.3.3.Detección de tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre por inmunofluorescencia.

La expresión de la tirosina hidroxilasa y la recombinasa Cre también fue evaluada

por inmunofluorescencia. Cuando se hace una observación a bajo poder a nivel de la

sustancia nigra y área tegmental ventral, locus coeruleus (Figura 24 d-j) y bulbo olfatorio

(Figura 24 j-I), se ve nuevamente los patrones de expresión coincidentes. Sin embargo, por

este método es posible detectar que en el caso del bulbo olfatorio, más precisamente en el

bulbo olfatorio accesorio, existe una región en la cual no existe coexpresión de las proteínas

(Figura 24 j-o). A nivel celular, puede confirmarse esa observación ya que se vió

claramente (Figura 24 o) que existen neuronas que expresan recombinasa Cre pero que no

están expresando tirosina hidroxilasa o neuronas que expresan tirosina hidroxilasa pero que

no expresan recombinasa Cre. Esto no ocurre en la sustancia nigra y área tegmental ventral

(Figura 24 a-c) o en el locus coeruleus (Figura 24 d-i) en donde más del 95% de las

neuronas TH positivas son Cre positivas.

Una posible explicación para el fenómeno observado en el bulbo olfatorio, es que

mecanismos post-transcripcionales pueden estar controlando el nivel de traducción de ARN

mensajero de TH en este tejido y que esos mecanismos no son extensivos al mensajero de

la recombinasa Cre en el animal transgénico. Por otra parte, puede estar ocurriendo que la

secuencia de 9 kb, que dirige la expresión de TH a este área durante un estadio del

desarrollo, lo haga normalmente, pero le falten secuencias inhibitorias que hacen que no se

siga expresando cuando adulto. Cabe destacar que se han encontrado neuronas productoras

de TH en varias regiones del cerebro de muchas especies de mamíferos fuera de las

tradicionales regiones catecolaminérgicas (Gaspar et al., 1987; Gouras et a|., 1992). Este

mismo fenómeno fue observado en un animal transgénico que expresa I.acZ bajo el

promotor de 9 kb de rata (Min et.al., 1994). La detección de la expresión de Cre en esta

región puede estar indicando una zona de expresión auténtica de TH pero no detectable por

tratarse de una expresión muy basal. Sin embargo, fue posible observar expresión de TH en

el bulbo olfatorio accesorio por medio del anticuerpo monoclonal empleado.

66

P.OOOOOOOOOCOOOOOOOOOOOOOOOÓOOOOOOOOOO0.0.0.0.1


a

GL

AOB M)

Figura 24: Detección de tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre por inmunofluorescencia. Seccionessagitales seriadas de cerebros de animales TH-Cre fueron sometidos a una doble inmunofluorescenciautilizando como primer anticuerpo monoclonal anti-TH (paneles a, d, g, j y m) y policlonal anti-Cre (panelesb, e, h, k y n). Se muestran microfotografias superpuestas en los paneles c, f, i, l, y 0. Panel a-c: la sustancianigra y área tegmental ventral, A:1000X; d-i: locus coeruleus, A=40X y lOOOX;j-0: bulbo olfatorio, A=40Xy lOOOX.AOB: Bulbo olfatorio accesorio, GL: Capa periglomerular.

67

ÏOOOOOOOOOO0.00.0000...OOOOOOOOÓOOOOOOOOOOOOOOI


2. Línea reportera Z/AP.

Los animales transgénicos Z/AP fueron utilizados para cruzamientos con la línea

transgénica TH-Cre para determinar la actividad de la recombinasa Cre. Luego del

cruzamiento, fueron obtenidos los cuatro genotipos en proporción mendeliana. Por medio

de tinción de biopsias de orejas y PCR de ADN de colas se determinaron los animales

doble transgénicos portadores del gen Z/AP y TH-Cre, los que fueron utilizados para

ensayos de actividad de la proteína transgénica.

2.1. Genotipificacio'n de animales.

La línea transgénica Z/AP es genotipificada por medio de tinción de biopsias de

orejas. Luego de ser fijadas, las biopsias fueron sumergidas en una solución de coloración y

aquellas que fueron portadoras del transgén Z/AP se tomaron de color azul, mientras que

las que no lo portaban permanecieron inalteradas (Figura 25).

La determinación por PCR y la coloración de biopsias de orejas fue una técnica

adecuada para la determinación e identificación inequívoca de animales que fueron

sometidos a estudios posteriores.

Figura 25. Genotipificación de ratones de la línea Z/AP. Para identificar a los ratones transgénicos Z/AP,se hizo una tinción con el cromógeno X-Gal sobre biopsias de orejas. Aquellas provenientes de animalesportadores del transgén se tomaron azules (b), mientras que las demás permanecieron inalteradas (a).

2.2. Expresión de LacZ.

La expresión de LacZ fue evaluada en animales Z/AP para comprobar la ubicuidad

de la expresión de dicho transgén en la linea reportera. Para ello se sometieron a tinción a

embriones de 10,5 y 13,5 días post coito (d.p.c.). Se obtuvo expresión de B-galactosidasa en

todos los tejidos del animal, evidenciada por la coloración azul del embrión, lo que indica

68

TesisDoctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión,

que el transgén que portan se está expresando de manera ubicua debido al promotor que la

dirige (Figura 26). Asimismo, se hicieron cortes de cerebro para comprobar la expresión de

dicho transgén, evidenciándose una coloración azul en todas las secciones estudiadas (datos

no exhibidos).

13,5 d.p.c

Figura 26: Expresión embrionaria del transgén Z/AP. Embriones de 10,5 (a) y 13,5 (b) días postcoitumfueron sometidos a tinción para [3galactosidasa utilizando X-Gal como cromógeno.

3. Ratones doble transgénicos

La evidencia de la presencia de la recombinasa Cre en cada una de las áreas

estudiadas no garantiza que ella fuera enzimáticamente activa. Por ello fue necesario

determinar si era capaz de escindir un fragmento de DNA que se encontrara entre dos sitios

loxP. Con dicho objetivo se aparearon animales transgénicos TH-Cre con ratones de la

linea reportera Z/AP (ver Materiales y Métodos) y las crías dobles transgénicas (portadores

del transgén THCre y del transgén Z/AP) fueron sometidas a tinciones para fosfatasa

alcalina.

3.1. Actividad de recombinasa Cre en cerebro de animales doble transgénicos.

En un corte sagital de cerebro de un animal doble transgénico puede verse, luego de

la tinción para fosfatasa alcalina, que las áreas marcadas son aquellas en donde existe

actividad de la recombinasa (Figura 27). Cre file quien indujo la excisión del fragmento de

DNA que expresaba B-galactosidasa permitiendo que comience a expresarse hPLAP puesto

69


que los patrones de coloración son coincidentes con las regiones catecolaminérgicas en

estudio. Nuevamente se observa que existe actividad en el bulbo olfatorio, en el área

tegmental ventral y sustancia nigra, en el locus coeruleus y asimismo puede observarse

marca en las fibras ascendentes del estriado, puesto que la fosfatasa alcalina es una enzima

citoplasmática que puede desplazarse de forma anterógrada. Fue observada una baja

expresión del transgén hPLAP sin que se observara su contraparte de TH. Esta expresión

ectópica se detectó en la corteza piriforme, en el coliculo inferior, en el tálamo y en el

núcleo interpeduncular (Figura 27).

Figura 27: Actividad de Cre en cerebro de animales doble transgénicos. Secciones sagitales seriadas decerebro de animales TH-Cre Z/AP fueron sometidas a inmunohistoquímica utilizando anti-TH como primeranticuerpo (a) y a tinciones contra hPLAP (b). A= 10X . AOB: Bulbo olfaton’o accesorio, GL: Capaperiglomerular, VTA: área tegmental ventral, LC: locus coeruleus, SNpc: sustancia nigra pars compacta, St:cuerpo estriado, Acc: núcleo acumbens, Hyp: hipotálamo.

70


Gracias a la herramienta generada por Lobe y colaboradores es posible testear

prácticamente cualquier animal portador de un transgén que dirija la expresión de la

recombinasa Cre bajo algún promotor específico. En nuestro caso fue posible detectar la

actividad de la recombinasa Cre, que se encuentra bajo el control transcripcional del

promotor de 9 kb de la tirosina hidroxilasa de rata, evidenciada por la presencia de la

fosfatasa alcalina placentaria humana detectada por la coloración en secciones de cerebros

de animales dobles transgénicos. A continuación se detalla la actividad de la recombinasa

Cre, evidenciada por la actividad de la fosfatasa alcalina, en tejidos extra cerebrales.

3.2. Expresión y actividad dela recombinasa Cre en retina.

Un tejido extracerebral en donde se evaluó la expresión de la proteína endógena y

transgénica fue la retina, ya que las neuronas amácrinas expresan tirosina hidroxilasa.

En primer lugar se evaluó la expresión de tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre en

preparados de retina de ratón transgénico por inmunohistoquímica. Puede verse que la

tirosina hidroxilasa forma un cordón debido a la distribución citoplasmática de la misma a

lo largo de las fibras (Figura 28a). Asimismo, puede verse claramente el cuerpo de la

célula. En el caso de Cre se detectó sólo el núcleo de la neurona amácrina (Figura 28h). A

continuación, se realizó una detección por inmunofluorescencia y nuevamente se observó el

mismo patrón de expresión, tanto para TH como para Cre (Figura 28d,e). Cuando se hizo

una superposición de las imágenes, puedo determinarse que existe colocalización a nivel

celular en las neuronas amácrinas de la retina. (Figura 280.

También se hizo una determinación de la actividad de la recombinasa Cre en

animales dobles transgénicos. En la figura 28c se puede observar la actividad de la fosfatasa

alcalina luego de la tinción específica evidenciada por una coloración azul violácea en las

neuronas amácrinas. Por lo tanto, la recombinasa Cre, además de estar presente, es

funcionalmente activa en neuronas amácrinas de la retina de animales trangénicos.

7l


Figura 28: Expresión y actividad de Cre en retina. Preparados de retina de ratones doble transgénicosfueron sometidos a inmunohistoquímica utilizando como primer anticuerpo anti-TH (a) ó anti-Cre (b) ótinción contra hPLAP (c). Los paneles inferiores muestran la localización de TH (d), Cre (e) porinmunofluorescencia. En el panel f se muestra la colocalización de ambas proteínas. A: 400X.

3.3. Expresión y actividad de recombinasa Cre en Ia médula dela glándula adrenal.

Otro tejido extracerebral en donde fue evaluada la expresión de las proteínas en

estudio fiie la glándula adrenal. La zona periglomerular de la médula adrenal expresa

tirosina hidroxilasa. Por ello se hicieron tinciones por inmunohistoquímica contra TH y

recombinasa Cre en este tejido. La expresión de tirosina hidroxilasa fue clara en la médula

adrenal y la de la recombinasa Cre fue menos evidente pero, sin embargo, detectable en un

área coincidente (Figura 29a,b). Asimismo se realizaron ensayos de actividad para la

recombinasa Cre y se determinó que fue capaz de producir la escición del gen de [3

galactosidasa evidenciado por la actividad de la fosfatasa alcalina (Figura 29c).

Reportes bibliográficos indican que la expresión de transgénes en la zona

periglomerular de la glandula adrenal es muy variable y dependiente del nivel de expresión

del transgén en particular. En nuestro caso puede estar ocurriendo que la baja expresión se

deba específicamente a la línea obtenida del animal transgénico. Con un número mayor de

líneas para el mismo transgén podría hallarse alguna con una expresión más elevada en la

médula adrenal. Sin embargo, la presencia de recombinasa Cre en este tejido pudo ser

determinada por inmunohistoquímica y por actividad enzimática.

72

l.OOOOOOOOOOOOOOOOOO...OOOOOOOCOOOOOOOOOOOOOOOC


Figura 29: Expresión y actividad de Cre en la médula de la glándula adrenal. Seccionesde la glándulaadrenal fueron sometidas a inmunohistoquimica utilizando anti-TH (a) o anti-Cre (b) como primer anticuerpoo a tinciones contra hPLAP (c). A= ZOOX.

3.4. Expresión de recombinasa Cre en estadio embrionario.

Para evaluar si el transgén introducido en esta línea de animales es capaz de

expresarse de igual manera que el gen de TH desde el comienzo del desarrollo, se

determinó la expresión de TH y recombinasa Cre y la actividad de esta última en embriones

de 13,5 dias post coito (Figura 30). La expresión de Cre es coincidente con la de TH al

analizarse por medio de inmunohistoquímica en secciones de embriones. Por medio del

ensayo de actividad, se demuestra que la recombinasa Cre es activa en cerebro medio y

también en sistema nervioso periférico, evidenciado por la coloración en el ganglio cervical

superior y en el estelar. En la periferia se detectó inmunomarcación y actividad para Cre en

los ganglios de la raíz dorsal.

La expresión y actividad de la recombinasa Cre en la línea transgénica generada, se

superpone de manera similar a la del gen endógeno tirosina hidroxilasa aún desde las

primeras etapas del desarrollo.

Figura 30: Expresión yactividad de Cre en estadoembrionario. Secciones deembriones de 13,5 días post coitofueron sometidas ainmunohistoquímica utilizandocomo primer anticuerpo anti-TH(a y d) ó anti-Cre (b) ó a tincionescontra hPLAP (c y e). En lospaneles a, b y c se muestran losganglios de la raíz dorsalmientras que en d y e el gangliocervical superior. A=40X

73

Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Resultados y Discusión.

Parte 3.

I. Introducción de una mutación condicional nula en el gen del receptor DZ

de ratón.

I. I. Construcción de un vector de recombinacío'n homólogo dirigido al exón 2 del gen del

receptor de dopamina D2.

Para producir ratones con mutaciones nulas en el gen del receptor D2, se eligió

flanquear al exón 2 debido a que en él reside el sitio ATG de iniciación traduccional. Para

ello clonamos de una biblioteca genómica de la cepa de ratones 129 sv/ev un fago

conteniendo al exón 2 y regiones flanqueantes que permitieron construir un vector de

direccionamiento. Este vector consta de secuencias de homología 5’, de 5.5 kb de longitud

(brazo largo), y 3’, de 2.2 kb de longitud (brazo corto), que corresponden a secuencias que

flanquean al exón 2 del gen del receptor de dopamina DZ. Este vector de recombinación fue

llamado pCON3 y se preparó una purificación por gradiente de Cle y luego fue

linealizado con la enzima de restricción Sall (Figura 31).

l .2. Preparación deflbroblastos y determinación dela presencia de Micoplasma.

A partir de embriones de ratón de 13,5 días post coito se prepararon fibroblastos

siguiendo los procedimientos descriptos en la sección Materiales y Métodos. Los cultivos

de fibroblastos embrionarios murinos deben estar libres de micoplasma pues ellos pueden

interferir reduciendo o anulando por completo la participación de las células ES que han de

ser microinyectadas en blastocistos para producir ratones quime'ricos.

Por ello se determinó la presencia de micoplasma en los cultivos primarios de

fibroblastos. Utilizando la técnica de PCR anidada en dos etapas no fue posible comprobar

la presencia de marcadores genéticos de dicho microorganismo en cultivos que fueron

mantenidos libres de cualquier agente de selección durante dos pasajes consecutivos y

utilizando DNA control proveniente de Micoplasma pirum y Acholeplasma Iaidlawii. Los

fibroblastos fueron entonces inactivados con radiación gama o por un medio de cultivo

74

ÏOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOCOOOOOOOOOOOOOOO0.0.0....


conteniendo mitomicina C, fraccionados en criotubos de a 1 ml y almacenados en nitrógeno

liquido para su posterior utilización.

aExon2

"r r "H¡sv r i Ir RW? r ,,// l 3 Ï Ï Í I I I I I I | I/

bA BrazoLargo - BrmCorto

¡PRN Se E L A . “WPI l V I 7‘ Ñ V Vl l

o-——-————o o——-———oVector PGKNeo-HSVTK

C

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A B CA A A j' DigestiónSms]-SondaA- 7kb ' ' DigestiónBamHl-SondaBoC- ou; '

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e

1/ P i‘ 'ï' R)" sí “Mi”? 'f 1,Il I Í I l 7 Ï I I Í I]

Figura 31: Esquema del vector de recombinacíón homóloga y del locus endógeno. En la figura se muestra(a) el locus endógeno para el receptor dopamínérgíco D2 en la región del exón 2, el vector de recombinacíónhomóloga (b) con las secuencias que le confieren resistencia (PGK Neo y HSV-TK) y el locus luego de larecombinacíón (c). También se muestran las deleciones de tipo I (e) y Ii (d) debidas a la acción de larecombinasa Cre. A, B y C son las sondas utilizadas para la hibridación de los Southern blots.

75

D.OOOOOOOOOOOOOOOOOO...OOOOOOOOOOOOOCOOOCOOOOOG


1.3. Preparación y titulación de mLIF. Puesta a punto del cultivo de células ES.

El factor inhibitorio de la leucemia murina (mLIF) es utilizado para el

mantenimiento in vitro del fenotipo pluripotencial de las células embrionarias (ES) y

debido a su muy alto costo decidimos producirlo en nuestro laboratorio.

Luego de la preparación y purificación por los métodos descriptos en la sección

Materiales y Métodos, se corrieron una serie de fracciones en un gel de poliacrilamida para

comprobar la pureza de la proteína. En la figura 32a se muestra el gel en el que las bandas

de peso molecular de 20 kDa corresponden a la proteína recombinante mLIF en cantidad de

masa creciente. Puede verse que es la banda de presencia mayoritaria en el preparado

aunque existen otras inespecificas que corresponden a otras proteínas. El preparado se pasó

por filtros estériles de 22 um, se fraccionó y se congelaron las muestras a —20°Cpara su

almacenamiento.

43 kDa

29 kDa

18,4 kDa

¡4,3 kDa

Q". A ¡ii«¿y? Anf“?. , c- ; t," 4 ¡Thai ‘ A ‘ fl 4‘

Figura 32: Preparación de mLIF y cultivo de células ES. En a se muestra un gel de poliacrilamida en elque se sembraron diferentes diluciones del preparado de la proteína recombinante mLIF de aproximadamente20 kDa. Se observan bandas que corresponden a otras proteínas que copurificaron con la preparación. En elpanel siguiente pueden verse colonias de células ES sin diferenciar (b) y diferenciadas (c) sobre un cultivo defibroblastos.

76

DOOOOOOOOOCOOOOOOOO000......OOOOOOOOOOOOOOOOOOG


Rec.—>6,5 kb

Wt.—> í2,8 kb

Figura 33: Detección de clones resistentes por Southern blots. ADN genomico de clones resistentestransfectados con el vector de recombinación homóloga pCON3 fue digerído con BamHI (a), KpnI (b) y SmaI(c) y luego sometido a Southern blot. Se utilizaron las sondas B, C y A respectivamente (ver Figura 31). En lafigura se muestran las bandas correspondientes al alelo salvaje y al recombinante homólogo.

El porcentaje de recombinación homóloga es variable y depende de las secuencias

de los brazos de recombinación y, en definitiva, del locus en el cual se quiere hacer blanco.

En este caso, obtuvimos solo un recombinante homólogo de un total de 217 clones

analizados en la primera electroporación y uno entre 189 en la segunda, es decir 0.46% y

0.53% respectivamente. Estos porcentajes de recombinación se encuentran dentro de los

valores publicados en la bibliografía para la generación de otros animales mutantes.

1.5. Transfeccio'n transitoria de clones positivos con un plásmido que expresa

recombinasa Crepara escindir a los marcadores de selección.

Utilizando cultivos de 80% de confluencia de los clones Hl y BIO portadores de la

recombinación homóloga adecuada, se electroporó el vector pCAGGS-Cre, el cual expresa

la recombinasa Cre de manera constitutiva. En este caso, donde se busca expresar

78


transitoriamente a la recombinasa Cre, el vector fue electroporado en la forma

superenrollada. Nuevamente, se plaquearon las células y se siguieron los pasos descriptos

en la sección Materiales y Métodos hasta obtener las colonias resistentes al agente de

selección, que en esta segunda etapa es el Ganciclovir. Se obtuvieron en total 121 colonias

con la morfología adecuada para el clon H1, de las cuales crecieron solo 105 luego de ser

repicadas y 93 del clon B10. A continuación se preparó ADN de cada uno de ellos,

siguiendo los métodos descriptos, para detectar clones positivos.

1.5.1.Determinación de clonespositivas por PCR y Southern blot.

Para determinar rápidamente clones positivos se utilizó la técnica de PCR. A partir

de ella se detectaron 4 clones puros y 3 mixtos para los provenientes del clon H1 y sólo uno

puro positivo para aquellos provenientes del B10 (Figura 34). Estos tres clones mixtos

pueden ser causa de una segregación diferencial del plásmido que expresa la recombinasa

Cre entre células al dividirse, lo que provocó que en células hermanas exista una escición

heterogénea del cassette de resistencia dentro del mismo clon. La figura 34 muestra el

patrón de bandas del gel en donde se observan los clones positivos A8, E10, El l, G12 y los

mixtos A10, F7 y G8 entre otros clones negativos.

Del. Tipo IDel. Ti o II

> Wt. p

Figura 34: Detección de deleción de tipo I o ll por PCR. Luego de ser transfectados transitoriamente conun plámido que expresa recombinasa Cre, el ADN de los clones que sobrevivieron a la selección conganciclovir en el medio de cultivo fue sometido a una reacción de PCR. En la figura se ven las bandascorrespondientes al alelo wt (234 pb), al que contiene la deleción de tipo l (450 pb) y al de tipo II (369 pb),corridas en un gel de agarosa con bromuro de etídio. Se puede ver que en el caso del clon mixto existen lastres bandas. Como control positivo se utilizó el vector de recombinación homóloga pCON3.

79


A continuación, dichos clones positivos fueron testeados por Southern blot. El ADN

de cada uno de ellos fue digerido por separado con las enzimas de restricción BamHI, KpnI

y SmaI. Utilizando las sondas correspondientes (ver sección anterior) se hibridaron y la

figura 35 muestra el patrón de bandas obtenido. En el gel se incluyeron controles positivos,

negativos, un clon mixto y un revertante.

Wt.10,5kb

4- Del.TipoII 6,1kb

4- De].TipoI 5,1kb

Figura 35: Hibridación de Southern de clones positivos por PCR. ADN genómico de clones positivos porPCR que contienen la deleción de tipo II fue digerido con KpnI y luego sometido a Southern blot. Se utilizó lasonda C para la hibridación. Se incluyó ADN control y uno conteniendo la deleción de tipo I. En la figurapueden verse las bandas correspondientes al alelo wt (10,5 kb), al que lleva la deleción de tipo I (5,1 kb) y alos que llevan la deleción de tipo II.

Hasta aqui entonces, hemos obtenido 5 clones positivos para la introducción de los

sitios loxP flanqueando el exón 2 del gen del receptor de dopamina D2. Dichos clones

provienen de dos clones madre obtenidos de manera independiente, el H1 y el B10, y de

ellos se desprenden los clones definitivos. De] H1 se obtuvieron el A8, E11, E12 y 612

mientras que del B10 solo uno, al cual lo llamamos de la misma manera.

Cada uno de los clones fue amplificado y finalmente fraccionado en diferentes

criotubos y almacenados en nitrógeno liquido hasta el momento de su descongelado para la

microinyección de blastocistos.

80

Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Rem/lados y Discusión.

1.6. Microinyección de blastocistos y obtención de quimeras.

Los clones positivos obtenidos fueron microinyectados en blastocistos provenientes

de hembras C57BL/6J. Hasta el día de la escritura de esta tesis se reali7aron 7

microinyecciónes sobre un total de ¡68 blastocistos, los que fueron transferidas a l l madres

adoptivas. De ellas nacieron un total de 28 crías. En la tabla que se muestra a continuación

se detallan los datos de inyeccion de blastocistos y el registro de nacimientos.

Según puede verse (Tabla 2) la proporción de crías según el grado de quimerismo es

variado. Sólo se obtuvo una cría con un porcentaje de quimerismo mayor del 90%

proveniente del clon El l (Figura 36), pero la proporción de crías con porcentaje de

quimerismo entre el 60 y 90% es mayor. De aquellas dos provenientes del clon BIO, sólo

nacieron crías de pelaje negro, indicando que no portaban el gen de dopamina con los sitios

loxP flanqueantes. Las correspondientes a los clones El l y E12 debe esperarse a que estén

en edad de apareo y a que tengan crías para el análisis de la mutación.Tabla 2:


Figura 36: Quimeras. A partir de clones de células ES microiyectadas en blastocistos de ratones C57BL/6Jse obtuvieron animales quiméricos con el característico pelaje. En la foto se muestran tres ratones, uno negroC57BL/61, un agoutí y uno quime’rico.

A partir de dos animales quiméricos, un macho y una hembra, se hizo un análisis de

ADN por medio de la técnica de PCR, para detectar la presencia del alelo mutado en

diferentes tejidos. Los animales utilizados provenían de la microiyección de blastocistos

con el clon B10, los que fileron dejados en apareo y se aguardó por lo menos tres camadas

para sacrificarlos y extraer los diferentes tejidos. No se detectaron crias agoutí en ninguna

de las camadas, indicador de la transmisión de la mutación. En la figura 37 se muestra un

gel de agarosa en el que se corrieron los productos de PCR proveniente de cada tejido y se

puede observar que en cada uno de ellos existen las bandas correspondientes al alelo salvaje

y al que contiene la deleción de tipo II.

82

TesisDoctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.

Quimera macho Quimera hembra

:2 =©=°E 08°=:.2Ee =seEéfis‘ñüsgássüumoemoomuom

Figura 37: Detección del alelo mutado en tejidos provenientes de animales quimericos. ADN provenientede cola, riñón, corazón, cerebro, hígado y testículo, en el caso del macho, fue sometido a PCR para detectar lapresencia del alelo portador de los sitios loxP. En la figura se ve que todos los tejidos estudiados sonportadores del alelo Wt.y el que sufi‘íó la deleción de tipo II.

83

CONCLUSIONES —

Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Conclusiones.

Conclusiones.

Parte I.

A partir de los resultados obtenidos en esta primera parte del trabajo se puede concluir que:

l- Se obtuvo un modelo de inducción de enfermedad de Parkinson experimental en ratones

a través de un dispositivo especialmente diseñado para producir lesiones unilaterales en

el cuerpo estriado de ratón. Éste permite administrar la neurotoxina 6-OHDA en uno de

los cuerpos estriados e inducir la destrucción de una vía dopaminérgica nigroestriatal,

dejando intacta la vía contralateral.

2- La administración de 6-OHDA es igualmente eficaz en la destrucción de neuronas

dopaminérgicas de la vía nigroestriatal de ratones normales y de ratones deficientes en

el receptor D2.

u l Los ratones deficientes en el receptor D2 son capaces de desarrollar respuestas

supersensibles a agonistas dopaminérgicos luego de la desnervación nigroestriatal

evidenciada por medio de una conducta rotatoria cuantificable en sentido contralateral

al sitio lesionado.

4- A más largo plazo, los ratones deficientes en el receptor DZ, alcanzan niveles de

actividad locomotora supersensible comparables a los de los animales normales o

heterocigotas para la mutación. Estos resultados sugieren que la respuesta supersensible

temprana tendría un componente principalmente de tipo DZ, hecho que se ve reflejado

en la demora de la aparición de conducta rotatoria en los ratones con la mutación nula

para el receptor D2.

5- La estimulación del receptor dopaminérgico Dl es necesaria para la expresión de

supersensibilidad postsináptica en ausencia de receptores D2, hecho que ha quedado en

evidencia al utilizar antagonistas Dl y luego tratar animales con el agonista mixto

apomorfina. Bajo dichas condiciones, la conducta rotatoria de los animales Drd2'/'

disminuyó prácticamente en su totalidad.

6- La estimulación de receptores tipo DI no es suficiente para la expresión de respuestas

motoras en condiciones de supersensibilidad, siendo necesaria la estimulación

concurrentedereceptorestipoD2. M/ WDr. Marcelo RuÜIÏIsteln

INGEBI (UBA-CONICEI')


Parte2.

A partir de los resultados obtenidos en esta parte del trabajo se puede concluir que:

l- Se produjo una línea de ratones transgénicos que expresan la recombinasa Cre del

bacteriófago Pl bajo el control transcripcional del promotor de 9 kb de tirosina hídroxilasa

de rata.

2- El patrón de expresión de la proteína transgénica Cre es coincidente con el de la TH

endógena en las áreas del sistema nervioso central estudiadas, incluidas la sustancia nigra

pars compacta, el área tegmental ventral, el locus coeruleus y el núcleo arcuato del

hipotálamo.

3- En todas estas regiones se ha demostrado que existe colocali7ación de recombinasa Cre y

tirosina hídroxilasa a nivel celular, mediante el uso de doble inmunohistoquímica y

confirmación por inmunofluorescencia.

4- La recombinasa Cre en los ratones transgénicos es funcionalmente activa, puesto en

evidencia a través del uso de la línea reportera Z/AP, por la aparición de actividad de

fosfatasa alcalina placentaria humana, en animales dobles transgénicos THCre-Z/AP.

5- Se determinó que las neuronas amácrinas de la retina expresan la recombinasa

funcionalmente activa.

6- De la misma manera se determinó la presencia y actividad de la recombinasa Cre en la

médula de la glándula adrenal de ratones transgénicos.

7- La recombinasa Cre mostró niveles de expresión ectópica en células del hipotálamo

lateral, núcleo subincerto, septum, corteza piriforme, cuerpo estriado y colículo inferior.

8- F,l animal transgénico TH-Cre generado constituye una herramienta valiosa para

introducir mutaciones restringidas a neuronas catecolaminérgicas en ratones que porten

¿2,4%Dr.Marcelo Rublnsteln

lNGEBl (UBA-CONlCET)

alelos flanqueados por sitios loxP.

86


Parte 3.

A partir de los resultados obtenidos en esta última parte del trabajo se puede concluir que:

l- Se ha puesto a punto en nuestro laboratorio las técnicas necesarias para obtener cultivos

de células embrionarias totipotenciales (ES) no diferenciadas.

2- Se ha puesto a punto en nuestro laboratorio las técnicas necesarias para obtener cultivos

fibroblastos embrionarios murinos libres de micoplasmas, soporte fundamental para el

crecimiento de células embrionarias totipotenciales (ES), asi como la preparación,

purificación y titulación del factor inhibidor de la leucemia (LIF) de ratón, suplemento

fundamental para el cultivo de células ES, el cual inhibe la diferenciación de esta línea

de ce'lulas.

3- Se construyó un vector de recombinación homóloga para introducir sitios loxP a los

lados del exón 2 del receptor de dopamina D2.

4- Utilizando dicho vector , se electroporaron células ES y se detectaron clones resistentes

a G418 que incorporaron al vector por recombinación homóloga.

5- Por medio de una transfección transitoria con un plásmido que expresa la recombinasa

Cre, se eliminaron las secuencias que aportaban la resistencia de selección para

finalmente obtener clones de células ES donde dos sitios loxP flanquean al exón 2 del

gen del receptor dopaminérgico D2.

ONI Cuatro clones independientes fueron microinyectados en blastocistos de ratones

C57BL/6J y se obtuvieron ratones con distintos grados de quimerismo. Debido a que

hasta el momento de la escritura de esta tesis, ningún raton logró transmitir la mutación

a la línea germinal, el mismo vector de direccionamiento está siendo electroporado en

otras células ES.

A partir de uno de estos clones se obtendrá una línea de animales que porten sitios

loxP en el gen del receptor de dopamina D2 y se pondrán a aparear con los transgénicos

TH-Cre, para obtener ratones que sean deficientes en el receptor presináptico de dopamina.

El estudio de estos ratones mutantes contribuirá al esclarecimiento del papel desempeñado

por dicho receptor.

Dr. arcelo Rublnsteln

INGEBl (UBACOtÉlgET)

MATERIALES Y METODOS —

Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.

Materiales y Métodos.

Parte I. Modelo animal para el estudio de lafunción dopaminérgica.

Animales y Biolerio.

Los ratones utilizados para experimentación se encuentran en una sala exclusiva del

bioterio del Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME-CONICET). En esta

sala. los animales se mantienen con un sistema de ventilación permanente, un ciclo

luz/oscuridad de 12 hs (7:00 AM-7:00 PM) y una temperatura controlada que se mantiene

entre 19 y 23°C. Los ratones reciben una dieta comercial de mantenimiento. salvo las

madres en período de lactancia que reciben una dieta más rica en proteínas y grasas.

Para los experimentos de lesión y conductuales utilizamos la cepa de ratones

C57BL/6J con una mutación nula para el gen del receptor de dopamina D2. Estos animales

congénicos fueron generados mediante recombinación homóloga (Kelly et al, 1997) y

posteriormente retrocruzados ocho veces a la cepa C57BL/6J (Jackson Lab, USA) (n=8)

para unificar la carga genética de los animales salvajes y mutantes.

Lesión estriatal unilateral con 6-0HDA.

Para las lesiones se utilizaron animales adultos de entre dos y tres meses de edad

cuyo peso oscilaba entre los 20 y 25 g. Los ratones se anestesiaron con 2,2,2

tribromoetanol (300 mg/kg; Aldrich Chemical Company, Wi., USA) y se les suministró una

dosis i.p. de desipramina (12,5 mg/kg; Sigma Chemical C0., St. Louis, MO, USA) un

inhibidor del recaptador de noradrenalina. Entre 20 y 30 min después, los animales fueron

puestos en un molde de acrílico especialmente diseñado para la lesión. Este molde es un

dispositivo estereotáxico que permite inyecciones precisas y reproducibles en el núcleo

estriado de ratón. Fue diseñado para realizar lesiones en las coordenadas anteroposterior

+0,5 y lateral izquierdo o derecho +1,9 de acuerdo con el atlas de Franklin y Paxinos (1997)

y a una profundidad de 4 mm debajo de la calota. A cada animal se le inyectó l pl de 6

hidroxidopamina (6-OHDA hidrobromuro; Sigma) disuelto en ácido ascórbico 0,02% o l

ul de vehículo (Acido Ascórbico 0,02%) utilizando una jeringa de vidrio de lO ul

(Hamilton Company, Reno, Nevada, USA) acoplada por una cánula plástica a una aguja

89


Carpul de 0.3 x 25 mm (30G long; Bayer. Alemania) y a una velocidad de l ul/min La

aguja fue dejada en el lugar hasta un min después de la inyección para evitar el reflujo y

favorecer la difusión de la toxina. Se ensayaron diferentes concentraciones de 6-OHDA de

entre lO mg/ml hasta 50 mg/ml para finalmente utilizar la de 25 mg/ml basándonos en el

grado de lesión alcanzado. Luego de 4 dias los animales fueron separados de acuerdo a una

conducta rotatoria espontánea ipsilateral respecto al sitio de la lesión para los ensayos

conductuales y bioquímicos.

Drogas y tiempos de inyecciónprevios a los análisis conductuales.

Agonistas.

Apomorfina clorhidrato (Sigma) fue disuelta en solución fisiológica conteniendo 0,1% de

ácido ascórbico e inyectada de manera subcutánea 5 min antes del primer período de

medición.

SKF 38393 clorhidrato (Sigma) fue disuelto en solución fisiológica e inyectado

intraperitonealmente 5 min antes del primer período de medición.

(-)-Quinpirole clorhidrato (Sigma) fue disuelto en agua hexadestilada e inyectado

intraperitonealmente 5 min antes del primer período de medición.

Antagonistas.

SCH 23390 clorhidrato (Sigma) fue disuelto en agua hexadestilada e inyectado l h antes de

la administración de agonistas.

S(-)-Raclopride L-Tartrato (RBI) fue disuelto en agua hexadestilada e inyectado 25 min

antes de la administración de agonistas.

El inhibidor de la sintesis de catecolaminas a-metil-DL-p-tirosina metilester

hidrocloruro (AMPT; Sigma) fue disuelto en agua hexadestilada e inyectado dos veces: 3

hs y l h antes de la primera prueba conductual (200 mg/kg y 100 mg/kg i.p.

respectivamente).

Pruebas conductuales. Determinación de las rotaciones.

Luego de cinco días de la inyección de 6-OHDA los ratones fueron puestos

individualmente en jaulas circulares de 20 cm de diámetro inferior y 30 cm de diámetro

superior para cuantificar la actividad rotatoria espontánea en campo abierto, durante 5 min,

90

Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Mémdos.

por observación directa. Se consideró una vuelta completa a un giro de 360°. A partir del

día 7 luego de la operación se registró otro período previa administración de drogas que

poseen diversos mecanismos de acción relacionados con la función dopaminérgica. En este

caso se registró la actividad rotatoria entre el minuto 5 y lO y entre el 20 y 25 luego de la

inyección de la droga. Para los cálculos se consideró el mayor número de vueltas obtenido

en cada período o la suma de ambos. Para cada droga utilizada, se controló la actividad

rotatoria a lapsos mayores que 30 min, comprobándose que el pico de acción de la droga ya

había pasado. Los ratones fueron analizados regularmente con el agonista dopamine’rgico

mixto apomorfina para evaluar el progreso de la supersensibilidad a lo largo de los cuatro

meses post-cirugía.

Una curva dosis respuesta determinó que la dosis efectiva del 75% (DE75)

correspondía a 0,5 mg/kg (s.c.) y utilizamos ésta dosis en la mayoría de los experimentos.

Aquellos animales que en ninguna prueba superaron las 10 rotaciones contralaterales en lO

min fueron excluidos de los análisis. Antes de la realización de cada experimento

involucrando el uso de más drogas, se analizaron nuevamente a los animales con

apomorfina y se siguió el mismo criterio de selección. El valor obtenido en estas

selecciones fue tomado como la medida de referencia para evaluar el efecto de

antagonistas.

Determinación del contenido de monoaminas y sus metabolitos.

Se siguió una técnica similar a la descripta por Hall e! al. (1989). Brevemente, se

extrajo el cerebro de animales que habian sido operados con dos o más meses de

anterioridad y se disecaron el cuerpo estriado izquierdo y derecho. Ambos estriados se

homogeneizaron separadamente en ácido perclórico 0,3 N en frío y se centrifugaron a

10.000 X g por lO min utilizando el sobrenadante para realizar inyecciones de diferentes

volúmenes en un cromatógrafo de alta performance (HPLC). A partir de curvas estándar se

calcularon los valores incógnita de cada muestra los que fueron expresados como pg/mg de

tejido.

9l

Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materia/es y Métodos.

Parte 2. Línea de animales TH-Cre.

Construcción del transgén —9THCre.

Para la construcción del transgén, fueron llevados a cabo los siguientes pasos:

l.

b)

Un plásmido pBluescript SK (Stratagene, California, USA) conteniendo una secuencia

de poliadenilación del gen del antígeno T del virus SV40 fue digerido con la enzima de

restricción SmaI. (Vector l)

El plásmido pMCCrePGK-Hyg, conteniendo la secuencia codificante del gen de la

recombinasa Cre. fue digerido con la enzima Mlul. Se aisló el fragmento de 1,2 kb que

corresponde a dicho gen. (Inserto l)

El inserto fue tratado para generar extremos romos mediante una reacción de fill in y

luego ligado al vector previamente desfosforilado con fosfatasa alcalina.

El plásmido ligado en la orientación correcta fue digerido con la enzima Hindlll.

(Vector 2)

El plásmido pTH9,0 (Min e! aL. 1994), conteniendo 9 kb del promotor de tirosina

hidroxilasa de rata. fue digerido con Hindlll. Se aisló un fragmento de 9 kb. (lnserto 2).

Vector 2 e inserto 2 fueron ligados dando como resultado el plásmido pBS-9THCre.

El transgén —9THCre fue liberado del vector por doble digestión con las enzimas de

restricción Sall y Notl obteniéndose un fragmento de 10,5 kb. Este contiene 9 kb del

promotor de tirosina hidroxilasa de rata fusionado a la secuencia codificante completa del

gen de la recombinasa Cre del bacteriófago Pl.

Las técnicas de biología molecular utilizadas para la obtención de este plásmido

fueron las que se describen a continuación.

Técnicas de biología molecular empleadas.

Cortes con enzimas de restricción y aislamiento por electroelución.

La preparación de fragmentos y vectores para reacciones de ligación, fue realizada

mediante cortes con enzimas de restricción de acuerdo a las instrucciones del proveedor,

partiendo de 5 ug a 20ug del fragmento o vector deseado, y posterior electroelución en

geles de agarosa.

Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.

El aislamiento por electroelución de fragmentos y vectores fue llevado a cabo

mediante una electroforesis preparativa del ADN digerido, en geles de agarosa con 0,1

ug/ul de bromuro de etidio, utilizando TBE 0,5X (Tris borato 45 mM. EDTA l mM, pH-8)

como buffer de corrida. Luego de efectuada la separación, se identificaron las bandas con

un transiluminador de luz UV y se cortó, con una hoja de afeitar, el bloque de agarosa

conteniendo la banda deseada. Este fue colocado dentro de un tubo de diálisis de 6.25 mm

de diámetro (Gibco BRL, Bethesda, MD, USA) con buffer TBE 0,5X, se cerraron los

bordes con agarraderas y se realizó una electroforesis, orientando la membrana de forma tal

que el campo eléctrico generado sea perpendicular a la longitud máxima de la bolsa de

diálisis. La electroforesis se desarrolló durante 30 min a 10—l2V/cm; luego se extrajo el

medio líquido y se hizo una extracción con l vol. de fenol equilibrado con Tris—HCl.pH-8

cloroformo-isoamílico 25:24:] (PIC), seguida de una extracción con l vol. cloroformo

isoamílico 24:1 (IC) La fase acuosa se precipitó con 0,] vol. de acetato de sodio 3 M, pH

5.2 y 2,5 vol. de etanol 100%. Se mantuvo a -70°C durante 10 min y luego se centrifugó a

máxima velocidad durante 10 min. El precipitado se lavó con etanol 70% y se resuspendió

en 10-20 ul de TE (Tris-HCl 10 mM, pH-8, EDTA l mM) de acuerdo a la masa inicial.

Generación de extremos ramos.

Para generar extremos romos o blunr a panir de cortes con enzimas que dejan

extremos cohesivos. se utilizó el fragmento mayor (Klenow) de la polimerasa de ADN de

tipo I de E. coli (Gibco BRL). En el caso de extremos 5’ salientes, se hicieron reacciones de

rellenado ofill in, utilizando la actividad polimerasa de la Klenow, como se especifica a

continuación. En un tubo eppendorjf se agregó 0,5-l pg del fragmento de ADN con

extremos 5’ salientes, 0,5 mM de cada dNTP, el buffer apropiado y l UE de Klenow. Se

llevó a 30 pl con HzO y se incubó 15 min a temperatura ambiente. La reacción fue

terminada por extracción con l vol. de PIC incubándose por 5 min a temperatura ambiente

y luego se centrifugó a máxima velocidad. Se tomó la fase acuosa y, para eliminar trazas de

fenol. se hizo una extracción con l vol. de IC. Nuevamente, se volvió a centrifugar a

máxima velocidad por l min y se tomó la fase acuosa. El ADN fue precipitado agregando

0,1 vol. de una solución 3 M de acetato de sodio, pH-5,2 y 2,5 vol. de etanol 100%. Se

93

Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Mélodos.

incubó por 10 min a —70°Cy se centrifugó a máxima velocidad. El precipitado fue lavado

con etanol 70% y resuspendido en TE.

Los extremos 3'salientes fueron digeridos utilizando la actividad 3’—) 5’

exonucleasa de la enzima Klenow. como se detalla a continuación. En un tubo eppendorf se

agregó O,5—lug del fragmento de ADN con extremos 3’ salientes, el buffer apropiado y 5

UE de Klenow. Se llevó a 30 pl con H20 y se incubó 30 min a temperatura ambiente. La

reacción fue terminada y el ADN precipitado de la misma forma que para los extremos 5’

salientes.

Defosforilación de vectores.

Las reacciones de defosforilación se realizaron con la enzima fosfatasa alcalina

intestinal de ternero (ClAP; del inglés: Calf]ntestinal Alkaline Phospharase; Gibco BRL),

incubando en el buffer provisto por el proveedor, 0,01 UE de CIAP por pmol de ADN con

extremos 5’ salientes. a 37°C durante 30 min, ó l UE por pmol de ADN con extremos

romos. a 50°C por una h. La inactivación de la CIAP se realizó por medio de una doble

extracción con un volumen de PIC. Posteriormente se eliminaron las trazas de fenol y se

precipitó el ADN como se especificó anteriormente.

Reacciones de Iigación

Para realizar las reacciones de ligación se utilizaron 20 a 50 ng de vector. El inserto

se agregó en una proporción molar, con respecto al vector, de 3:1 (estas proporciones

fueron calibradas corriendo previamente inserto y vector en un gel de agarosa). La mezcla

de vector e inserto se incubó con l UE de la ligasa de ADN del fago T4 (Gibco BRL) en el

buffer de ligación provisto, que contiene ATP, en un volumen final de lO pl. Los tubos se

incubaron durante la noche a temperatura ambiente y luego se procedió a realizar la

transformación de bacterias competentes.

Preparación de bacterias competentes.

A partir de un stock de glicerol se obtuvieron colonias independientes de la cepa

DHSa de E. Cali. Con una de estas colonias se realizó un inoculo en 3 ml de medio LB

(1% de bactotriptona, 0,5% de extracto de levadura y 1% de NaCl) y fueron crecidas a 37°C

94

Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Mamriales y Mérodos.

con agitación hasta alcanzar una OD550 de 0,3. Con este cultivo se inocularon 100 ml de

medio LB y se creció con agitación a 37°C hasta alcanzar una OD550 de 0,48. El cultivo se

enfrió en hielo y se centrifugó a 3000 r.p.m. en rotor GSA (Sorvall, USA) durante 5 min a

4°C. El medio fue descartado y el precipitado resuspendido cuidadosamente en hielo con 40

ml de be l (30 mM acetato de potasio, 100 mM de KC], lO mM de CaClz, 50 mM de

MnC12 y 15% glicerol, pH-S,8 -ajustado 0,2 M de ácido acético—). Las muestras se

dejaron reposar brevemente en hielo y se centrifugan en tubos tipo Corex de 30 ml,

nuevamente a 3000 r.p.m. por 5 min a 4°C. El precipitado se resuspendió cuidadosamente

en hielo con 4 ml de be II (lO mM MOPS, 75 mM CaClz, lO mM KC], 15% glicerol. pH

6.5—ajustado l M de KOH—). Las células se dejaron reposar en hielo por 15 min y se

fraccionaron en tubos eppendorf estériles. Por último se guardaron a —70°Chasta su uso.

Transformación de células competentes.

Las bacterias competentes se descongelaron en hielo y se fraccionaron de a 50 pl en

tubos eppendorfestériles. Se agregó a las bacterias 5 pl del producto de la ligación y, sin

sacar las bacterias del hielo. se mezcló suavemente con una punta de pipeta estéril. Las

células se dejaron reposar en hielo por 30 mín y luego se procedió a realizar un shock

térmico. que consistió en colocar las bacterias a 42°C durante 90 seg. y luego enfriarlas en

hielo rápidamente. Las bacterias se recuperaron con 0,7 ml de LB fresco durante 30 min

con agitación y a 37°C. Posteriormente, se centrifugaron a 4000 r.p.m. durante 2 min, se

descartó el medio y se resuspendieron en 100 ul de LB fresco. Las células recuperadas se

plaquearon en medio LB ágar con 50 pyul de ampicilina y se incubaron al menos 16 hs a

37°C.

Identificación de colonias con el producto de Iigación deseado.

Para identificar las colonias que llevan el producto de ligación deseado, se procedió

a realizar un inóculo con colonias aisladas crecidas a partir de la transformación en 3 ml de

medio LB suplementado con 50 pg/ml de ampicilina. El cultivo se creció durante la noche

a 37°C y luego se procedió a aislar ADN plasmídico de los mismos como se describe a

continuación. Se repartieron los 3 ml de cultivo en 2 tubos eppendorf y las bacterias se

95

Tesis Doctoral. Diego M. (ie/man. Materiales y Métodos.

centrifugaron durante 30seg. a máxima velocidad. Ambos precipitados fueron

resuspendidos en 200 pl de solución Pl (Tris-HCI 25 mM, pH-8, EDTA 10 mM, 0,1 mg/ml

de RNAsa A (Sigma). Luego se agregó 200 ul de solución P2 (NaOH 0,2 N, SDS 1%) y se

mezcló suavemente por inversión, seguido de otros 200 pl de solución P3 (acetato de

potasio 3 M, pH-8), que se mezcló fuertemente por inversión. Los tubos se centrifugaron a

máxima velocidad durante 10 min. Se recuperó el sobrenadante y se le hizo una extracción

con l vol. de PIC seguido de una extracción con l vol. de IC. La fase acuosa se precipitó

con 0.8 vol. de 2-propanol con una suave agitación, se dejó reposar 5 min a temperatura

ambiente y se centrifugó a 14000 r.p.m. durante lO min. El precipitado fue lavado con

etanol 70%, secado y resuspendido en 40 ul de TE.

La identificación de las construcciones deseadas se realizó mediante cortes con

enzimas de restricción, como fue detallado más arriba, y por posterior visualización en

geles de agarosa con bromuro de etidio.

Preparación del transgén para la microinyeccio'npronuclear.

El transgén —9THCre a microinyectar se obtuvo a partir de la digestión de una

maxípreparación de ADN plasmídico. Esta preparación se realizó a partir de un cultivo de

500 ml en medio Terri/ic Brolh (bactotriptona 1,2%, extracto de levadura 2,4%, glicerol

0.4%), en presencia de ampicilina 50 pg/ml, crecido por 20 hs a 37°C. Una vez saturado, el

cultivo se enfrió durante 5 min en hielo, fue separado en dos mamaderas de 400 ml y

centrifugado en rotor Sorvall GS-3 a 5000 r.p.m. durante 5 min y 4°C. Luego se descartó el

sobrenadante y las células se resuspendieron en 50 ml de solución Pl. Posteriormente. se

agregaron otros 50 ml de solución P2, se mezclaron suavemente por inversión, seguido de

otros SO ml de solución P3 preenfriado, el cual también se mezcló por inversión, y se

incubó en hielo durante 30 min. Los tubos se centrifugaron durante 20 min a 7000 r.p.m. a

4°C y el sobrenadante fue filtrado a través de un embudo con una malla de lana de vidrio.

Posteriormente, se precipitó el ADN plasmídico con el agregado de 0,7 vol. de isopropanol

con una suave agitación, se dejó 20 min a temperatura ambiente y se centrifugó, en dos

mamaderas de 250 ml. en rotor Sorvall GSA a 10.000 r.p.m. durante 30 min a 4°C. El

precipitado se lavó con etanol 70%, se dejó secar y fue resuspendido con un total de 8 ml

de TE (4 ml por mamadera).

96


Para obtener una preparación limpia del ADN plasmídico, se hicieron dos

extracciones en gradiente de CsCl como se detalla a continuación. Al ADN plasmídico

resuspendido en TE le fueron agregados 50 pl de bromuro de etidio (10 mg/ml), y luego

CsCl sólido en una cantidad en peso equivalente al peso de la solución de ADN en TE. Se

disolvió a 37°C y se ultracentrifugó en tubos Beckman a 55.000 r.p.m. durante 20 hs en

rotor Sorvall T-865.l a 18°C.

Al finalizar la corrida, la posición de la banda de ADN plasmídico se ubicó en el

gradiente de CsCl con la ayuda de una lámpara de UV y se extrajo cuidadosamente con una

jeringa. El material extraído fue mezclado con una solución nueva de TE-CsCl (lg de CsCl

cada l ml de TE) y se volvió a ultracentrifugar como se explicó anteriormente. La banda se

extrajo nuevamente con jeringa, se colocó en tubos Corex y el bromuro de etidio fue

eliminado mediante extracciones sucesivas de butanol saturado en agua. Luego, la solución

de ADN obtenida se colocó en tubos eppendorf y, para eliminar las sales de cesio, se

precipitó, al menos dos veces, con 2,5 vol. de etanol 100%. El precipitado, luego de lavarlo

con etanol 70%. y secarlo, fue resuspendido en 500 ul de TE. Finalmente, el ADN se

cuantificó por espectrofotometría a 260 nm y en un gel de agarosa con bromuro de etidio.

El transgén —9THCrefue liberado de la secuencia plasmídica con las enzimas Notl y

Sall y aislado por electroelución, como se especificó anteriormente. Luego de la

precipitación, se resuspendió en 400 ul de solución de baja sal (Tris-HCl 20 mM, pH-7,4;

NaCl 0,2 M; EDTA l mM). Posteriormente, se pasó por una minicolumna de intercambio

iónico tipo elutíp (Schleicher & Schuell, Keene, NH, USA) y se eluyó, de acuerdo a las

instrucciones del proveedor, con buffer alta sal (Tris-HCl 20 mM, pH-7,4; NaCl l M;

EDTA l mM). Finalmente, el producto eluído se precipitó con 2 vol. de etanol 100%, se

centrifugó 10 min a máxima velocidad, se lavó con etanol 70% y se resuspendió en TE

microinyección (Tris-HCl 5 mM, pH-7,4; EDTA 0,1 mM). Fue cuantificado por

espectrofotometría a 260 nm y por gel, y se llevó a una concentración de 500 moléculas/pl

con el mismo buffer.

97

Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.

Animales y bioterio.

Las cepas endogámicas de ratones necesarias para la obtención de embriones

(C57BL/6J y CBA/J). la cepa exogámica de ratones Swiss Webster para la obtención de

hembras pseudopreñadas, la línea de ratones transgénicos híbridos THCre y la reportera

Z/AP se encuentran en una sala exclusiva del bioterio del Instituto de Biología y Medicina

Experimental (lBYME-CONICET) descripta anteriormente.

Obtención de embriones.

Para obtener embriones aptos para la microinyección se aparearon hembras

C57BL/6J con machos CBA/J y se obtuvieron híbridos de primera generación (Fl)

BóCBFl. Los machos Fl se mantuvieron en jaulas individuales y se los utilizó como

padrillos para fecundar hembras Fl superovuladas. La superovulación se indujo en hembras

BóCBFl jóvenes (entre 4 y 5 semanas de edad) mediante un tratamiento hormonal que

comenzó tres días antes de la recolección de óvulos fecundados con una inyección de 5 UI

i.p. de PMS (pregnant mare ’s serum) a las 2 PM. Dos días más tarde los animales

recibieron 5 Ul i.p. de hCG (human chorionic ganadolrophin) a la l PM. Inmediatamente

estas hembras fueron colocadas en jaulas individuales con machos BóCBFl. A la mañana

siguiente, las hembras que fueron copuladas por el macho (se verificó mediante la presencia

de un tapón vaginal de semen) se sacrificaron por dislocacíón cervical y mediante una

incisión abdominal se expusieron los tractos reproductivos. Los oviductos se aislaron y

colocaron en una placa de 35 mm con medio Whittens precalentado en un incubador a 37°C

y 5% C02. Mediante el uso de una lupa de disección, un par de fórceps y un par de agujas

de ZSG. se disociaron los oviductos para liberar los ovocitos fertilizados rodeados por una

masa de células del cumulus. Estos se aspiraron con una pipeta Pasteur previamente

estirada sobre una llama y se colocaron en una gota de medio Whittens con 1% de

hialuronidasa (Sigma) por 5 min para separar los embriones de las células del cumulus.

Posteriormente los ovocitos se pasaron a través de 4 o 5 gotas de medio Whittens y fueron

guardados en incubador en grupos de 20 hasta el momento de la microinyección. La

cantidad obtenida de ovocitos fertilizados aptos para ser microinyectados es, por lo general,

de aproximadamente 20 por hembra superovulada.

98

FOOOOOO0.0.0.0.0...OOOOOOOOOOOOOOOO...00.0.0001

TesisDoctoral. Diego M Gelman. Materiales y Métodos.

Microinyecciónpronuclear.

Para la microinyección pronuclear se utilizaron micropipetas sujetadoras e

inyectoras preparadas a partir de capilares de borosilicato y estiradas con un estirador

vertical de micropipetas.

Los ovocitos fueron colocados en una gota de medio Whittens equilibrado con Hepes

ubicada en el centro de una depresión semiesférica convexa de un portaobjetos, se

observaron bajo un microscopio y se seleccionaron aquellos que tenían ambos pronúcleos

bien visibles. Con la ayuda de la pipeta sujetadora y un micromanipulador se introdujo la

pipeta microinyectora en los embriones y se descargó 1-2 pl de la solución de ADN

(aproximadamente 500 moléculas del transgén/pl) dentro del pronúcleo más visible (figura

38). Los embriones microinyectados fueron colocados en el íncubador hasta el momento de

la transferencia. Se calcula que entre el 50 y el 70% de los embriones sobrevive a la

microinyección.

Figura 38: Microinyección pronuclear de ovocitos fertilizados. Fotografía de un embrión de ratón conambos pronúcleos bien visibles en el instante previo a la microinyección pronuclear. A la derecha se observala pipeta sujetadora que sostiene el embrión por presión negativa. A la izquierda la pipeta microinyectoracargada con una solución de ADN. Esta fotografia fue tomada en nuestro microscopio del INGEBI duranteuna sesión de microinyección.

Transferencia embrionaria a hembras pseudopreñadas.

Para obtener hembras pseudopreñadas se pusieron en contacto la noche anterior a la

recolección de embriones varias hembras jóvenes (de 6 y 9 semanas) con machos

vasectomizados. A la mañana siguiente se seleccionaron las hembras con tapón vaginal,

99


signo de copulación. Las hembras pseudopreñadas fueron anestesiadas con 2.2,2,

tribromoetanol (Avertina, Sigma) 300 mg/kg, i.p..

Luego de una incisión lateral de aproximadamente 1 cm y con la ayuda de una lupa, se

expuso el oviducto a transferir. Se rompió la membrana que recubre el oviducto. se

identificó la ámpula y se insertó a través de ella una pipeta Pasteur fina cargada con los

embriones. Se descargaron en total unos 10 a 15 embriones por oviducto. Luego de la

transferencia se cerró la incisión con sutura.

Identificación de ratones transgénicos. Análisis dela presencia del transgén.

Extracción de ADN.

Los ratones nacidos de embriones inyectados se apartaron de sus madres adoptivas a

los 18-20 días y fueron separados por sexo. Luego de ser anestesiados con 2,2,2

tribromoetanol (Sigma) 300 mg/kg i.p., se cortó la porción terminal de la cola (0,5-1 cm)

con un bisturí y se la cauterizó. Los ratones fueron marcados en las orejas para su posterior

identificación. Los segmentos de cola se incubaron a 55°C en buffer de digestión (Tris-HC]

50 mM, pH-8; EDTA 100 mM; SDS 0,5%; 0,5 myml proteinasa K, Gibco BRL) durante

12-14 hs. El ADN se extrajo por el método descripto por Low (1992). Brevemente, el

producto de 1adigestión se centrifugó para eliminar los pelos, se hizo una extracción con l

vol. de PIC seguida de 1 vol. de IC, y se precipitó con 0,7 vol. de isopropanol. El ADN fue

resuspendido en TE y se cuantificó espectrnfntnméïu' ‘ La presencia del transgén se

detectó por hibridación del ADN genómico con una sonda radioactiva, que reconoce

selectivamente al ADN foráneo (dot blot hybridization y Southern bIot hybridization) o

utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con oligonucleótidos específicos

de las secuencias transgénícas.

Southern Blot.

Para realizar los Southern blots, 20 ug de ADN genómico fueron digeridos con 50

UE de 1a enzima de restricción deseada por 12-14 hs. Luego se realizó una digestión

adicional por 2 hs, agregando 20 UE de la misma enzima. Las digestiones se precipitaron

con 2.5 vol. de etanol 100%, se resuspendieron en TE y luego fueron sembradas en geles de

agarosa 0,8% a 3-5 V/cm. Al finalizar la corrida, se le tomó una foto en la que se incluyo

100


un centímetro alineado en el punto de siembra y posteriormente los geles se depurinizaron

en una solución de HCl 0.25 M. luego se desnaturalizaron por 40 min (NaOH 0,5 N; NaCl

1.5 M), con agitación suave. Posteriormente. fueron sumergidos en una solución

neutralizante (Tris-HCl 0,5 M pH-8; NaCl 1,5 M; EDTA l mM), 2 veces por 30 min y se

transfirieron por capilaridad (Sambrok et aL, 1989) a membranas de nylon no cargadas.

Luego de la transferencia, el ADN se fijó a las membranas con luz UV (120 mJ/cmz) y

posteriormente se hibridó como se especifica más adelante.

Dot blot.

Para realizar los dot blots, se desnaturalizaron lO pg de ADN genómico obtenido de

la cola de cada ratón a 100°C y luego, las muestras se sembraron sobre una membrana de

nylon en forma manual o mediante una cuba de tipo mini fold conectada a una trampa de

vacio. Una vez sembradas todas las muestras, la membrana se pasó en forma sucesiva sobre

papeles Whattman 3MM embebidos en solución desnaturalizante (8 min) y luego en

solución neutralizante (2 x 7 min). El ADN fue fijado con luz UV (120 mJ/cmz) y se

hibridó como se detalla a continuación.

Hibridación de ADN.

Todas las sondas radioactivas para hibridar Southern blots y Dot blots, fueron

preparadas a partir de fragmentos de ADN mayores de 200 pb, aislados de los plásmidos

que los contienen, por digestión con enzimas de restricción seguida de electroelución, tal

cual se especificó anteriormente, o por PCR seguido de electroelución. Las sondas

radioactivas se marcaron por el método de iniciación al azar (random priming), utilizando

el kit comercial Rod-Prime (Gibco BRL) como se detalla a continuación. Se hirvieron 25

ng del fragmento a marcar en lO pl de agua en un tubo eppendorf durante 5 min, y luego se

colocó rápidamente en hielo. El fragmento se incubó en una mezcla de marcación

(preparada con reactivos e instrucciones provistas por el proveedor), que contiene

hexanucleótidos. dNTPs (excepto dCTP) y la enzima Klenow, conjuntamente con 5 ul de

a[32P]dCTP 10 pCi/ul (DuPont-NEN, Boston, MA, USA), durante 30 min a 37°C. La

reacción se detuvo con 5 pl stop buffer (provisto por el proveedor) y se precipitó agregando

lOl


l pl de ARN de transferencia 10 mg/ml, 50 pl de NH4Ac 5 M y 2,5 vol. de etanol 100%. Se

dejó a —70°Cdurante 30 min y luego se lo centrifugó a máxima velocidad. El sobrenadante

fue descartado y el precipitado se lavó con etanol 70% preenfriado y se lo volvió a

centrifugar a máxima velocidad por 15 min. Nuevamente se descartó el sobrenadante y se

dejó secar el precipitado que luego se resuspendió en agua con 1% de SDS. Finalmente se

guardó en hielo hasta ser utilizada.

Las prehibridaciones e hibridaciones se realizaron en botellas rotatorias dentro de un

horno de temperatura controlada. Las membranas fueron prehibridadas entre 1 y 2 hs en

una solución conteniendo 25 mM buffer fosfato, pH-7,2; SSC 6 X; EDTA 1 mM; Denhardt

5 X (0,1% ficoll, 0,1% polivinilpirrolidona, 0,1% seroalbúmína bovina); SDS 0,5% y 100

mg/ml de ADN de esperma de salmón. Las hibridaciones se llevaron a cabo en la misma

solución de prehibridación durante 16 hs con el agregado de la sonda, previamente hervida

por 5-10 min y enfriada otros 2 min en hielo. Al finalizar la hibridación, la membrana fue

sometida a una serie de lavados. Los mismos se realizaron de la siguiente manera: 2

lavados iniciales de 15 min cada uno con SSC 2 X. SDS 0,1%, a temperatura ambiente, y

dos lavados finales de alta rigurosidad con SSC 0,1 X, SDS 0,1%, a 65°C. Una vez

finalizados los lavados. las membranas se expusieron sobre películas autorradiográficas,

junto con pantallas intensificadoras de señal, a —70°C.El tiempo de exposición de las

películas autorradiográficas varió según la marca radiactiva detectada en los filtros luego de

los lavados.

Reacción en cadena dela polimerasa (PCR).

La detección de animales transgénicos TH-Cre se llevó a cabo mediante la

amplificación de una región interna del transgén de 327 pb (figura 9), utilizando los

primers Cre-2 (5' GCA TAA CCA GTG AAA CAG CAT TGC TG 3') y Cre-6 (5' AAA

ATT TGC CTG CAT TAC CG-3'). Las condiciones de reacción fueron: 200 ng de ADN

genómico, buffer PCR (Tris-HCI 20 mM; KCl 50 mM), dNTPs 0,2 mM; 2,5 mM de cada

primer, MgClz 3,3 mM y 1 UE de Taq polimerasa (Gibco BRL) en un vol. final de 30 pl.

Las muestras fueron amplificadas en un terrnociclador MJ Research (Waltham,

MA.. USA) como se detalla a continuación: un paso de desnaturalización inicial a 94°C por

5min. 20 ciclos que constaron de 1 min de desnaturalización a 94°C, 1 min de aparcamiento

|02

TaxisDoctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.

a 65°C bajando 0,5"C por ciclo y l mín de elongación a 72°C seguido de 20 ciclos que

constaron de l min de desnaturalización a 94°C, l min de aparcamiento a 55°C y l min de

elongación a 72°C seguidos de una elongación final a 72°C por 10 min. Los productos de

elongación fueron corridos en un gel de agarosa 1,5% con bromuro de etídio (0,1 ug de

bromuro de etidio/ul de agarosa) y se visualizaron a la luz UV.

Localización de Tirosina hidroxilasa y Cre por inmunohistoquímica.

La detección de las proteínas TH y Cre se realizó por inmunohistoquímica,

utilizando antisueros anti-TH o anti-Cre. Los animales utilizados para obtener los tejidos

fueron perfundidos, luego de hacer una punción cardiaca, con solución salina y a

continuación con 4% paraformaldehído en PBS. Las muestras extraídas se guardaron

durante la noche a 4°C con 4% paraformaldehído en PBS, en el caso que fueran destinadas

a cortes en vibrátomo. o con 4% paraformaldehído en PBS y 10% sacarosa, cuando fueran

destinadas a congelamiento y cortes en micrótomo. Las que fueron destinadas a micrótomo

también fueron sometidas a soluciones de concentración creciente de sacarosa para

deshidratarlos llegando a una solución de 30% de concentración final máxima. Las

muestras que fueron destinadas a vibrátomo se incluyeron en agarosa 2%. Luego de estar

equilibrados. los tejidos destinados a ser cortados en micrótomo se guardaron en un taco de

sacarosa 30% a -20°C. Los tejidos en tacos de agarosa o congelados se cortaron en

vibrátomo o micrótomo respectivamente y se colectaron en placas multipocíllo conteniendo

KPBS (NaCl 0,9%, K2HP04 16 mM y KH2P043,6 mM). Luego los cortes se sometieron a

2 lavados de 20 min en KPBS. Posteriormente se incubaron en H202 1% en KPBS por 60

min. se volvieron a lavar en KPBS (2 veces por 20 min) y se preincubaron por 2 hs en

Tritón X-IOO 0.3% y 2% de suero normal de cabra en KPBS. Luego se incubaron durante

toda la noche a 4°C con la dilución apropiada del antisuero anti-TH (Rabbit anti-Tyrosine

Hydroxylase policlonal, Chemicon Intl. Inc., USA, dilzl/SOO) o anti-Cre (Policlonal

Antibody, Cre Recombinase, Babco, USA, dil: 1/3000) en Tritón X-lOO 0,3% y 2% suero

normal de cabra en KPBS con agitación suave. El antisuero se lavó en KPBS (2 x 20min) y

los complejos antígeno-anticuerpo se incubaron con una solución de inmunoglobulinas

biotilinadas anti-conejo hechas en cabras (Biotinylated Anti-Rabbit lgG, BA 1000, Vector

Laboratories. USA) (1/200 en 0,3% Tritón X-100 en KPBS) por 2 hs a temperatura

103


ambiente. y luego de dos lavados de 20 min en KPBS se incubaron por l h con avidina

peroxidasa (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories. USA) (1/1000 en Tritón X—100

0.3%, 0,1% BSA en KPBS). Finalmente se lavaron 20 min en KPBS y 20 min en TBS

(Tris-HC] 50 mM pH-7.2 a 7.6, NaCl 150 mM) y se incubaron en una solución conteniendo

0.25 mg/ml de diaminobencidina (DAB, Sigma) en TBS conteniendo H202 0,05%. La

reacción fue detenida sumergiendo las secciones de tejido en KPBS y luego de ser

montadas en portaobjetos se dejaron secar al aire. A continuación se deshidrataron en una

serie de alcoholes con concentraciones crecientes (70, 95 y 100 %) y xileno y fueron

cubiertos con cubreobjetos utilizando Permount (Fisher, New Jersey, USA) como adhesivo

y se miraron al microscopio con campo claro.

Para aquellas secciones que fueron sometidas a doble marcación primero les fue

hecha la inmunohistoquímica contra Cre y a continuación, las muestras fueron incubadas en

una solución conteniendo anticuerpo primario policlonal anti TH hecho en conejo (12500) y

suero normal de cabra al 2% en KPBS 0.3% TritonX-lOO con agitación suave a 4°C durante

toda la noche. Al día siguiente se lavaron 2 veces en KPBS a temperatura ambiente para

luego incubar durante 2 hs con el anticuerpo secundario anti IgG de conejo hecho en cabra

(1:200) en KPBS 0,3% TritonX-lOO también a temperatura ambiente y con agitación suave.

Luego se lavaron 2 veces con KPBS durante 20 min y posteriormente se incubaron durante

1 h a temperatura ambiente con avídina-peroxidasa (Vector Lab). Al cabo de la incubación

se lavaron dos veces con TBS por Smin y tres veces con buffer fosfato de sodio 10 mM pH

6.0 por 5 min. Para fijar las secciones se incubaron por S a 10 min en 0,1% glutaraldehído

en buffer fosfato de sodio 10 mM pH-6,0. Para el revelado de la señal, se incubaron las

secciones durante 10 min a temperatura ambiente en una solución conteniendo 10 mg/ 100

ml de cloruro de bencidina (BDHC, Sigma) y 25 mg/ 100 ml de nitroprusiato de sodio en

buffer fosfato de sodio 10 mM pH-6,0, seguido de una solución conteniendo 10 mg/ 100 ml

de cloruro de bencidina (BDHC), 25 mg/ 100 ml de nitroprusiato de sodio y 0,005% de

“202 en buffer fosfato de sodio 10 mM pH-6,0. La aparición de color azul se observó entre

los 10 a 15 min posteriores. Las secciones fueron lavadas en KPBS y montadas en

portaobjetos. Se las dejó secar y luego se deshidrataron como se describió anteriormente

para finalmente ser cubiertas con cubreobjetos y observadas al microscopio.

104


Inmunofluorescencia contra THy Cre.

La preparación de los tejidos para ser sometidos a inmunofluorescencia se realizó de

la misma manera que se describió en la sección anterior.

Las secciones de tejido fueron sometidas a 2 lavados de 20 min en KPBS.

Posteriormente se incuban en H202 1% en KPBS por 60 min, se volvieron a lavar en

KPBS (2 veces por 20 min) y se preincubaron por 2 hs en 0,3% de Tritón X-100 y 2% de

suero normal de cabra en KPBS. Luego se incubaron durante toda la noche a 4°C con la

dilución apropiada del antísuero anti-TH (monoclonal) o anti-Cre (Policlonal Antibody,

Cre Recombinase. Babco) (1/500 o 1/3000 respectivamente) en 0,3 % de Tritón X-lOO y 2

% de suero normal de cabra en KPBS con agitación suave. El antísuero se lavó en KPBS (2

x 20 min) y los complejos antígeno-anticuerpo se incubaron por 2 hs. a temperatura

ambiente con agitación suave, con una solución de ínmunoglobulinas acopladas a

fluorógenos, Rhodamina (Anti-Rabbit lgG-Rhodamine from Goat, dil:1/200. Vector Lab.)

o Fluoresceina (Anti Mouse IgG-Fluorescein, dil:1/200, Vector Lab.). Dichos compuestos,

bajo luz ultravioleta, producen una coloración roja y verde respectivamente. Transcurrida la

incubación se lavó dos veces en KPBS por 20 min y luego se montaron en portaobjetos con

PBS. se dejó secar parcialmente, se cubrió con Fluorosave (FluorosaveTM Reagent,

Calbiochem. USA) y se miró en microscopio bajo luz ultravioleta.

Obtención de animales doble transgénicos.

Los animales de la línea transgénica THCre fueron apareados con los de la línea

reportera Z/AP para obtener animales doble transgénicos.

Detección del gen LacZ en animales transgénicos reporteros Z/APy doble transgénicos.

Para la detección del gen LacZ de animales reporteros Z/AP y doble transgénicos se

colectaron en una placa multipocillo biopsias de orejas de ratón y se las fijó en una

solución de glutaraldehído 0,25% en PBS durante 30 min. A continuación se lavaron 3

veces con PBS durante 5 min cada una para lavar el fijador. Por ultimo se tiñó con 0,5

mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-B-D-galactósido (X-gal) previamente disuelto en

diemtilsulfóxido (DMSO, Sigma), ferrocianuro de potasio 5 mM, ferricianuro de potasio 5

mM en una solución de lavado de LacZ que contiene MgClz 2 mM, deoxicolato de sodio

l05


0.01%. Nonidet P-40 0.02%, en fosfato de sodio 100 mM pH-7,3 o PBS. Una coloración

azul fue usualmente evidente a los 5 min de iniciada la tinción.

Determinación dela actividad de Cre evidenciadapor actividad de Iafosfatasa alcalina.

La actividad de la recombinasa Cre fue evidenciada por medio de una coloración

violácea producto de la actividad de la fosfatasa alcalina placentaria humana (hPLAP).

Para la tinción de fosfatasa alcalina se fijaron los tejidos en 0,25% de

glutaraldehido, 0,02% de Nonidet P-40, 0,01% de deoxicolato de sodio por 10 min a 4°C.

Las secciones se lavaron 3 veces en PBS y luego se inactivaron las fosfatasas endógenas

incubando en PBS a 75°C durante 30 min. Luego se dejaron enfriar a temperatura ambiente

por 1 o 2 min y se lavaron en PBS. A continuación ellas fueron incubadas en buffer AP

(Tris-HCl 100 mM pH-9,5; NaCl 100 mM, MgClz 10 mM) por 10 min. Los tejidos se

pusieron en una solución de coloración (Tris-HCl 100 mM pH-9,5, NaCl 100 mM,

MgC1210mM, deoxicolato de sodio 0,01%, Nonidet P-40 0,02%, 337 ug/ml de Nitro Blue

Tetrazolium (NBT, Sigma), 175 ug/ml de BClP (Sigma)) por 30 a 60min en oscuridad a

temperatura ambiente. Finalmente se lavaron en una solución MgCl; 2 mM en PBS. se

montaron en portaobjetos, se dejaron secar por 24 hs, se deshidrataron en una serie

creciente de alcoholes (70, 95 y 100%) y xileno cubriéndose con cubreobjeto utilizando

Per-mount(Fisher) como adhesivo.

Determinación de TH, Cre y hPLAP en embriones de 13.5 d.p.c.

Para determinar la expresión del transgén y su actividad durante el desarrollo

embrionario. se determinó el patron de expresión de TH y Cre en embriones de 13.5 dias

post coito.

Para ello se puso en apareo un macho y una hembra y los días subsiguientes se

chequeó durante horas de la mañana la presencia de un tapón de semen indicativo de la

actividad copulatoria nocturna que, cuando se observó, fue considerado día 0.5. A los 13

días después de la detección del tapón seminal, se mató a la hembra por dislocación

cervical. se humedeció el abdomen con etanol 70% y se expusieron las trompas uterinas por

medio de una disección abdominal. Se extrajeron los embriones y se los dejo en una

solución de fijación (4% PFA en PBS, pH-7,2) durante toda la noche. Posteriormente se los

106

Tesis Doc/oral. Diego M. (¡e/man. Materia/es y Métodos.

equilibró en soluciones de concentración creciente de sacarosa lO. 20 y 30%. Finalmente se

los embebió en sacarosa 30% para formar un taco congelándolo a —20°Cy se los cortó de

forma sagital y parasagital en micrótomo de congelación en secciones de 30 pm de espesor.

La presencia de TH y Cre se realizó por inmunohistoquímica según se describió

anteriormente así como también la actividad de la fosfatasa alcalina.

Taxis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.

Parte 3. Ratón D2flox

Clonado de un fragmento genómico que contiene al exón 2 del receptor de dopamina DZ

de rato'n.

Amplificación de una sonda homóloga para el exón 2 del receptor DZ.

Para la amplificación de una sonda capaz de reconocer secuencias genómicas del

receptor D2 se diseñaron dos adaptadores especificos (primers) correspondientes al exón 2

obtenido a partir de una búsqueda de secuencias del ARN mensajero (Mus musculus

mRNA. receptor dopaminérgico D2A, Número de acceso: X55674 NID g50648, Borrelli

E.) Esta reacción permitió obtener un fragmento de aproximadamente 300 pb. Para obtener

dicho fragmento se llevo a cabo una reacción de PCR utilizando los adaptadores D2ed-2.l (

5’-TCC ACT GAA CCT GTC CTG- 3’) y D2ed-2.2 ( 5’-CTC CAG ATA GAC GAC

CCA- 3’) en una concentración final de 1.25 uM cada uno, con 200 ng de ADN genómico

de ratón salvaje como molde, MgCl; 2 mM, dNTP’s 200 uM y 0,25 U Taq en un

termociclador de capilares Idaho 1605 (Idaho Technologies, Idaho, USA). La reacción

constó de 30 ciclos de amplificación con períodos de desnaturalización a 94°C durante lO

segundos, de apareo de los adaptadores a 64°C durante IO segundos y por último de

amplificación a 72°C durante 30 segundos. Los ciclos fueron precedidos por una etapa de

desnaturalización a 94°C durante 4 min. Se realizó una etapa de amplificación final a 72°C

por 4 min al finalizar los ciclos. El fragmento amplificado fue corrido en gel de agarosa

1.6% en TBE 0.5 X y eluido utilizando membrana de diálisis para su purificación según se

detalló en la sección Técnicas de biología molecular en la parte 2.

Rastreo de una biblioteca genómica de ratón.

El rastreo de los clones del gen del receptor D2 para la construcción de un vector de

recombinación en células embrionarias se realizó a partir de una biblioteca genómica de

ratón de la cepa l29/Sva construida en un derivado del fago A (Fago X-Dash, Stratagene)

que tenia un título de 3,5 x IO5 fagos/ul. La amplificación de los fagos fue realizada

utilizando la cepa bacteriana LE 392 donde la presencia de receptores para el fago A fue

inducida mediante el agregado de maltosa en el medio de crecimiento bacteriano. Las

bacterias susceptibles a la infección fueron crecidas en medio FRM (NaCl 85 mM, MgSO4

108


l mM. lO mg/ml de Peptona, 5 mg/ml de extracto de levadura, 2 mg/ml de maltosa) hasta

una OD600=O,5,centrifugadas a 2000 r.p.m. por 10 min, resuspendidas en MgSO4 lO mM y

mantenidas a 4°C hasta el momento de la incubación con los fagos. Las placas de 15 cm

donde se sembró la biblioteca de fagos fueron preparadas con LB + 1,5% ágar (LBA) y el

número de placas necesarias para tener representado 4 veces el gen buscado fue estimado

según: (n° bases del genoma de ratón /n° bases promedio del inserto)x n° genomas, esto es:

(3 x 109 bases / 1.8 x 104 bases)x 4= 12 x 105/ 1.8. Fueron sembrados 6x105 clones en 10

placas de 15 cm. Se incubaron 5x104 ufp con 600 pl de bacterias resuspendidas en MgSO4

10 mM (por cada placa de 15 cm a sembrar) durante 30 min a 37°C de forma de obtener

60.000 placas de lísis en cada una. El incubado de las células y fagos fue agregado a 10 ml

de top ágar (FRM + 0.7% agarosa) fundido a 55°C, homogeneizado por inversión e

inmediatamente distribuido de forma homogénea sobre cada placa de LBA manteniendo las

condiciones de esterilidad. Las placas permanecieron a temperatura ambiente durante 1 h

hasta que solidificó el top ágar y luego fueron incubadas a 37°C por 7 hs controlando el

crecimiento para evitar la confluencia de las placas.

Una vez crecidas a la densidad deseada, las placas fueron mantenidas por 2 hs a 4°C

antes de ser transferidas a los filtros. La transferencia se realizó durante 1 y 5 min, en los

filtros originales y duplicados respectivamente, utilizando membranas de nylon (Magna

NT. MSI. Micron Separation Inc.. USA). Durante la transferencia los filtros fueron

orientados respecto de las placas para permitir su posterior identificación mediante

perforaciones hechas con una aguja. Los filtros fueron inmediatamente desnaturalizados

por 7 min sobre un papel Wathmann 3 MM embebido en una solución desnaturalizante

(NaOH 0.5 M; NaCl 1,5 M) y luego neutralizados 2 veces durante 3 min en solución

neutralizante (Tris-HCl 0,5 M pH-7,5; NaCl 1,5 M, EDTA l mM). Después de la

neutralización las membranas fueron fijadas con UV por 30 seg a 120 mJ/cm2 (UV

Stratalinker 1800. Stratagene). Para identificar los clones del receptor D2 se utilizó la sonda

de 300 pb aproximadamente, descripta en la sección anterior, purificada luego de la

reacción de amplificación por polimerización en cadena correspondiente al exón 2. La

marcación con fósforo radioactivo del fragmento de ADN fue realizado mediante un ensayo

de iniciación al azar (Random priming, Gibco BRL). Los filtros fueron puestos

individualmente en el recipiente donde se realizó la hibridación con 100 ml de solución

109

Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Mélodos.

(Denhardt’s 5 X, ADN esperma de salmón 100 ug/ml, SSC 6 X, EDTA l mM, SDS 10%,

Na2P04 25 mM pH-7,2, forrnamida 50%) y 105-106 cpm de sonda por ml de solución de

hibridación. La hibridación se realizó durante 18-20 hs en un baño a 42°C. Los lavados

correspondieron a 2 cambios de solución (SSC 2 X, SDS 0,1%) a temperatura ambiente

durante 20 min y 2 lavados con cambio de solución (SSC 0,1 X, SDS 0.1%) durante 25 min

a 65°C. Las membranas fueron expuestas con una pantalla amplificadora por 48 hs a -70°C

y reveladas para evaluar la presencia de clones positivos que fueron reconocidos por el

aspecto de “cometa” en el film. Los clones identificados como positivos se tomaron de la

placa con un tip azul con el extremo cortado dejando un diámetro de 0,3 cm (taco de agar).

Los tacos de ágar se ubicaron en tubos de 1,5 ml con 200 ul de SM (MgSO4 10 mM, NaCl

100 mM, Tris-HCl pH-7,5 100 mM, gelatina 0,5%) y 10% de cloroformo por 12 hs a 4°C

para permitir la elución de los fagos al medio. Los tacos se titularon y replaquearon a una

densidad de 300 ufp por placa de 8 cm para el rastreo secundario. El plaqueo, la

transferencia y la hibridación se realizaron siguiendo los mismos pasos anteriores y

utilizando la misma solución de hibridación. Los clones positivos obtenidos fueron también

incluidos en SM-10% cloroformo para el rastreo terciario y aislamiento definitivo del clon.

Los tacos cuyo rastreo terciario mostraron la totalidad de las placas positivas fueron

considerados como clones aislados. Estos clones fueron sometidos a una maxipreparación

cuantitativa para determinar el mapeo, la caracterización y el posterior subclonado en

plásmido. Finalmente al clon conteniendo la secuencia del gen del receptor de dopamina

D2 fue llamado p6AD2.

Construcción del vector de recombinación homólogo del receptor de dopamina D2.

Para la construcción del vector de recombinación homologa se partió del plásmido

p6AD2 obtenido por el rastreo de la biblioteca de fagos, descripto anteriormente, que

contiene las secuencias que flanquean al exón 2 del receptor de dopamina D2.

El procedimiento seguido fue:

l- Un fragmento de 1,2 kb se liberó del plásmido p6AD2 por doble digestión parcial con

Xbal y EcoRl subclonandolo en un plásmido pBS (Stratagene) digerido con las mismas

enzimas. Dicho plásmido fue llamado pBSD2-l .2.

I|0


2- Se digirió el plásmido pflox (Priatel el aL, 1997) con la enzima de restricción BamHl y

luego se rellenaron los extremos salientes con Klenow. Por otro lado se libero el fragmento

de 1.2 kb del pBSD2-l.2 con las enzimas Xbal y EcoRV. se rellenaron los extremos

salientes con Klenow y se ligaron obteniéndose el plásmido pCONl.

3- Un fragmento de 2,6 kb se liberó del plásmido p6AD2 por doble digestión con EcoRI y

BamHl subclonandolo en un plásmido pBS abierto con las mismas enzimas. Dicho

plásmido fue llamado pBSD2-2.6.

4- El plásmido pCONl fue digerido con la enzima de restricción Xbal y luego se rellenaron

los extremos salientes con Klenow. Fue ligado con un fragmento de 2,2 kb proveniente del

plásmido pBSD2-2.6 digerido con las enzimas de restricción EcoRI y BamHl cuyos

extremos fueron tratados también con Klenow para rellenar los extremos salientes. Dicho

plásmido fue llamado pCON2.

5- Un fragmento de 5,5 kb se liberó del plásmido p6AD2 por digestión con la enzima de

restricción Xbal y se subclonó en un plásmido pBS abierto con la misma enzima. Dicho

plásmido fue llamado pBSD2-5.5+/-.

6- El plásmido pCON2 fue digerido con la enzima de restricción Xhol y se rellenaron los

extremos con Klenow. Fue ligado con el fragmento de 5,5 kb proveniente del plásmido

pBSD2-5.5+/- luego de haber sido digerido con Xbal al que se le rellenaron los extremos

salientes. Esta construcción final es la utilizada como vector de recombinación y fue

llamada pCON3.

Preparación defibroblastos embrionarios marinos resistentes aG4I8.

Los fibroblastos fueron preparados a partir de embriones de ratón de 12,5 a 13,5

días post coito provenientes de animales que portaban el gen de resistencia a neomicina

(Neor) bajo el promotor constitutivo de la enzima fosfogliceroquinasa.

Para ello se puso en apareo un macho y una hembra y los días subsiguientes se

chequeó durante horas de la mañana la presencia de un tapón de semen indicativo de la

actividad copulatoria nocturna que, cuando se observó, fue considerado día 0,5. A los l3

días después de la detección del tapón seminal, se mató a la hembra por dislocación

cervical. se humedeció el abdomen con etanol 70% y se expusieron las trompas uterinas por

medio de una disección abdominal. Ellas fueron puestas en un tubo de 50 ml de capacidad


conteniendo PBS con Penicilina y Streptomicina (Penicilina 50 U/ml; Estreptomicina 0,05

mg/ml, abreviado Pen/Strep). Se invirtió el tubo de manera de lavar las trompas. Luego la

disección continuó en un flujo laminar para garantizar la esterilidad de las células a

preparar. Las trompas uterinas fueron pasadas a una placa de cultivo conteniendo PBS

Pen/Strep. Utilizando tijeras de punta fina se abrieron las paredes del útero y cada embrión

fue liberado en su placenta. Los embriones con su placenta fueron nuevamente lavados en

PBS-Pen/Strep en un tubo de 50 ml de capacidad. A continuación se liberó cada embrión de

su placenta utilizando tijeras de punta fina y se volvieron a lavar. Se eliminaron los tejidos

blandos de cada embrión (hígado, pulmón, vísceras, etc.) y las carcasas remanentes se

cortaron con tijeras en pequeños pedazos en una solución de Tripsina-EDTA. Se dejó

actuar a la enzima durante 5 min y luego se agregó DNAsa I (Deoxyribonuclease I ,

Invitrogen) al medio y, con el auxilio de una jeringa con una aguja ZlG se aspiraron y

eyectaron los agregados celulares de manera de obtener células independientes. Una vez

que los agregados celulares fueron desarmados se inactivó la Tripsina por el agregado de

medio de cultivo (DMEM (Gibco BRL) +2,2 g/l NaHCO; pH-7,2, 10% suero de temero

neonato, Penicilina 50 U/ml; Estreptomicina 0,05 mg/ml) y se plaquearon en placas de 15

cm gelatinizadas (pretratadas con una solución de gelatina 0,1% estéril) y se dejaron crecer

a confluencia. Una vez crecidas a confluencia se hizo un repique y pasaje en una relación

1:4 a 4 nuevas placas. Esto se repitió hasta llegar al cuarto pasaje (p4). Por ultimo los

fibroblastos fueron inactivados por uno de los dos siguientes métodos:

a- Utilizando Mitomicina C (Sigma) l ug/ml como suplemento del medio de cultivo por

un lapso de 3 hs y luego lavando 3 veces con PBS pH-7,2, Pen/Strep para eliminar

cualquier traza del compuesto o.

b- Por medio de irradiación gama durante 40 min con rotación de las placas.

Una vez inactivados. los fibroblastos fueron cosechados y resuspendidos en medio

de congelación (DMEM (Gibco BRL), 2,2 g/l NaHC03, pH-7,2, 20% suero de ternero

neonato. Penicilina 50 U/ml; Estreptomicina 0,05 mg/ml, DMSO 10% (Dimethyl

Sulphoxide, D-2650, Sigma), cuantificados, fraccionados en criotubos y guardados a —70°C

hasta su utilización.

II2


Detección de Micoplasma en cultivo defibroblastos embrionarios marinos (MEFs).

La contaminación de cultivos con micoplasmas es de ocurrencia común. Los

micoplasmas pueden ser introducidos en cultivos de células por diferentes vias como por

ejemplo otros cultivos de células, personal de laboratorio, reactivos o tejido usado para

cultivos primarios. Su reducido tamaño les permite pasar por filtros de esterilización de 22

um y son resistentes a los antibióticos comunes. A diferencia de la contaminación con

bacterias u hongos, la contaminación con micoplasma es dificil de detectar y no produce

turbidez del medio. Sin embargo su presencia puede causar efectos adversos en los cultivos

llevando a resultados no reproducibles o dudosos. Por ello es de vital importancia la

determinación de la presencia de micoplasma en el cultivo de MEFs preparado para evitar

su uso. Dicha determinación se realizó por medio de una PCR anidada.

La muestra de células del cultivo primario de MEFS fue crecida durante por lo

menos dos pasajes en medio libre de antibióticos y luego se aspiró todo el medio excepto

lO ml. Con la ayuda de una varilla plástica estéril se removieron las células del fondo de la

placa y se resuspendieron en el medio de cultivo remanente sin el agregado de Tripsina o

EDTA. Se pasó l ml de la suspensión de células a un tubo de 1,5 ml de capacidad y se

centrifugó a máxima velocidad por 20 min a 4°C. Se descartó el sobrenadante y se

resuspendió en bufler de lisis (Tris-Acetato, pH-7,6 40 mM, EDTA l mM, lgepal 0,5%) y

se calentó por 10 min a 95°C. Esta solución final se utilizó como molde en las etapas de

PCR.

Para la reacción de PCR se utilizaron 5 pl de DNA muestra ó DNA control

proveniente de otras cepas de micoplasma, 45 pl de buffer PCR (Tris-HCl, pH-8,4 22 mM,

KCl 55 mM, MgClz 2,2 mM, 0,22 mM de la mezcla de dNTPs) 1 pl de adaptadores de

primera ronda (ATCC Mycoplasma Detection Kit) y 0,2 ul (l U) de polimerasa Taq. El

protocolo de PCR utilizado fue como se indica a continuación: 2 min a 94°C, luego 30

ciclos que constan cada uno de 30 seg. de desnaturalización a 94°C, 30 seg. de apareo de

los adaptadores a 55°C y 60 seg. de extensión a 72°C y por ultimo se mantuvo a 40C. El

producto de PCR de esta primera amplificación se utilizó como molde para una segunda

ronda utilizando los adaptadores de segunda ronda (ATCC Mycoplasma Detection Kit) y

siguiendo los mismos pasos descriptos mas arriba. Por ultimo, el producto de PCR de la

segunda ronda de amplificación se sometió a un corte con la enzima de restricción Vspl,

ll3

Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materia/es y Métodos.

para identificar la variante de Mycoplasma de acuerdo a un patrón de restricción

determinado, y se corrió en un gel de agarosa 2,5% con bromuro de etidio.

Preparación de LIE

El LIF (Ieukemía inhibitory factor) es un suplemento del medio de cultivo de las

células ES que tiene el fin de inhibir la diferenciación de dichas línea celular. Para la

preparación del LIF se partió del plásmido pGEX-ZT-MLIF cedido gentilmente por el Dr.

John Heath el cual consta de una proteína fusión entre Glutatión S-transferasa y el LIF bajo

un promotor inducible por un isopropil tiogalactosido. Con e'l, se transformaron y luego

plaquearon bacterias competentes de la cepa JM109 y una colonia aislada se la creció en

lml de LB ampicilina durante toda la noche. A continuación se diluyó ese cultivo en un

Erlen Mayer con 50 ml de LB ampicilina y nuevamente se lo dejó crecer durante la noche.

Al día siguiente se pasó ese cultivo a un Erlen Mayer con 500 ml de LB ampicilina y se lo

dejó crecer hasta una densidad óptica (OD) de 0,6 a l. Cuando se alcanzó la OD adecuada

se le agregó al medio IPTG para inducir la producción de la proteína fusión y se lo dejó

por un lapso de 3 hs. Se centrifugó 5 min a 5.000 r.p.m. y 4°C, se descartó el sobrenadante

y se resuspendió el precipitado en 5 ml MTPBS (NaCl 150 mM, NazHPO4 16 mM,

NaH2P04 4 mM) Se sonicó cuatro veces por un lapso de 15 segundos cada vez en frío para

romper las células y luego se agregó Tritón X-lOO a una concentración final de 1% y se

agitó vigorosamente. Se dejó en hielo 5 mín y se lo traspasó a un tubo Corex para

centrifugarlo a 10.000 r.p.m. por 5 min a 40€. El precipitado se descartó y el sobrenadante

se pasó a tubos de polipropileno y se congelaron en N2 liquido. En este paso ese

sobrenadante pudo ser almacenado si era necesario. Paralelamente debió equilibrarse la

resina de Glutatíon-Sefarosa (Glutathione Sepharose, Pharmacia) tomando

aproximadamente 5 ml de la misma por cada 500 ml de cultivo original y centrifugando por

2 min a 2.500 r.p.m. A continuación se lavó la resina 3 veces con 5 volúmenes de MTPBS,

se la resuspendió como una solución 50% (v/v) y se la guardó a 4°C hasta su uso.

Para la purificación se agregó 5 ml de solución de resina por cada 10 ml de

sobrenadante conteniendo la proteína fusión y se la dejó agitando 2 hs a 40C. A

continuación se depositó cuidadosamente la mezcla de resina en un tubo conteniendo una

solución 20% de sacarosa y se centrifugó por 5 min a 2.500 r.p.m. a temperatura ambiente.

l|4

Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Maleriales y Métodos.

También cuidadosamente se tomó el sobrenadante el que fue descartado. El precipitado se

lavó una vez con lO ml de solución de lavado l (1% de Tritón X-lOO en MTPBS), una vez

con 10 ml de solución de lavado 2 (Tris-HCl pH-8,5 50 mM, NaCl 150 mM) se lo eluyó

con lO ml de solución de elución (Tris-HCl pH-8,5 50 mM, NaCl 150 mM, CaClz 2,5 mM)

y se lo resuspendió en 750 ul de solución de elución. Luego, se agregó Trombina

(Thrombin, Sigma) a la resina en una relación final enzima : proteína fusión de 1:200 y se

lo incubó agitando o bien 6 hs a temperatura ambiente o durante toda la noche a 40C. La

digestión se centrifugó a 6.500 r.p.m. a 4°C y fue lavada 5 veces con 2 ml de solución de

elución guardando el sobrenadante y todos los lavados. Se hizo una centrifugación final

para eliminar la resina residual. La resina puede ser regenerada en este momento. La

proteína se concentró utilizando tubos concentradores Centricon Plus 10 (Amicon INC.

Beverly, Ma., USA). Finalmente se corrió una fracción de la proteína en un gel de

poliacrilamida de 15% para chequear tamaño y pureza, se filtró en esterilidad utilizando

filtros de 0.2 um, se prepararon fracciones y se congelaron a —20°Chasta el momento de su

utilización en los medios de cultivo previa titulación de su actividad.

Titulación de LIF.

Para comenzar la titulación. se descongeló la línea celular que fue utilizada como

prueba sobre una monocapa de fibroblastos (Feeder). Los siguientes dos pasajes fueron

plaqueadas en placas que habían sido previamente gelatinizadas utilizando una solución

0.1% de gelatina (Sigma) por un lapso de 2 hs, pero no sobre fibroblastos. Las células

fueron pasadas generalmente cada día de por medio o hasta alcanzar una confluencia del

80%. Por lo tanto. cuando se llegó a esa densidad, las células se tripsinizaron, centrifugaron

y finalmente se resuspendieron en medio de cultivo (ver más adelante) sin LIF, se las lavó

una vez y se volvió a resuspender en medio de cultivo sin LIF. Se las contó y resuspendió a

una densidad de 4000 células/ml de medio de cultivo sin LIF. Se agregó 0,5 ml de esa

suspensión en 24 pocillos de una placa multipocillo estéril previamente gelatinizada. Se

prepararon tantos pocillos de manera de tener duplicados o incluso triplicados de cada una

de las diluciones del LIF para poder obtener resultados reproducibles. Se prepararon

también una serie de pocillos en los cuales se utilizó el LIF control con un mínimo de 4

diluciones. Por último, las diluciones del medio con el LIF preparado estaban en el doble de

ll5


la concentración dado que al agregar 0,5 ml del medio condicionado a cada pocillo se llegó

a una concentración final de l X de la proteína recombinante. En este punto, se dejó crecer

las ce'lulas por 5 días, cambiando el medio cada día respetando las diluciones empleadas.

Para la tinción. las células fueron lavadas con PBS y luego se agregó una solución de azul

de metíleno 0.1%, se la dejó por 15 min, y finalmente fueron lavadas dos veces con PBS

dejándose secar antes de la observación y del conteo. Las colonias fueron contadas

basándose en la morfología y la densidad, usualmente reflejada en la intensidad de la

tinción.

Cultivo de células totipotenciales embrionarias marinas.

Las células totipotenciales embrionarias murinas (Embryonic Stem cells, celulas

ES) son células derivadas de la masa celular interna de los blastocistos de ratón. Utilizando

condiciones de cultivo adecuadas esas células pueden mantener su potencial de desarrollo

embrionario incluso aun después de una elevada cantidad de pasajes.

Las células ES se cultivan sobre una monocapa de fibroblastos embrionarios

murinos (MEFs), libres de micoplasmas e inactivados mitoticamente, en placas

previamente tratadas con una solución de gelatina 1% para facilitar la adhesión.

Un día antes de plaquear las células ES, se debe plaquear un número suficiente de

MEFs de modo que una vez adheridos estén en confluencia y a su vez otorgarles tiempo

suficiente para que adquieran su morfología característica y de esta manera darle un

sustrato adecuado a las células ES. Sobre los MEFs inactivados se plaquearon las células

ES en un numero adecuado de modo tal que no estuvieran “muy diluidas”, pues crecen mas

lentamente. ni “muy concentradas”, pues crecen mas rápidamente y se facilita la

diferenciación por contacto. Estas células son sensibles a los cambios de pH, falta de

nutrientes. concentración elevada de metabolitos, temperatura y concentración de C02 y

cualquiera de esos factores puede provocar la diferenciación. Por ello el medio de cultivo

de las células ES debe cambiarse diariamente y las placas mantenerse en estufa de cultivo a

37°C y 5% de C02. Para el cambio del medio de cultivo se utilizaron pipetas Pasteur

acopladas a una bomba de vacío de modo de aspirarlo y vaciar la placa. Luego se lavaron

dos veces con una solución de PBS pH-7.2 suplementado con antibióticos Pen/Strep

(Penicilina 50 U/ml; Estreptomicina 0,05 mg/ml) descartándolo cada vez. Finalmente se

ll6

agregó el medio de cultivo fresco. el cual esta formulado de la siguiente manera: DMEM

(Gibco BRL), 2,2g/l NaHCO3 pH-7.2; 15% Suero Fetal Bovino (HyClone Lab.); 50 U/ml

Penicilina; 0,05 mg/ml Estreptomicina; 10'6 M B-Mercaptoetanol (Sigma); Piruvato Sódico

(Gibco BRL) l mM; L-Glutamina (Gibco BRL) 2 mM; Aminoácidos no esenciales (Gibco

BRL) 0,1 mM; LIF (Gibco BRL o propio) 5000 U/ml.

Cuando las células ES crecieron formando colonias aisladas de un tamaño adecuado

debieron ser sometidas a un pasaje para seguir su amplificación. La dilución normal de este

tipo de ce'lulas ES de 1:4 o 1:5. Se debe registrar cada pasaje de las células ES pues este es

un índice de viabilidad de las mismas. Cuanto más alto sea el número de pasajes que hayan

sufrido. menor será la incidencia de ellas para contribuir en la línea germinal. Para el

pasaje, los cultivos fueron lavados dos veces con PBS pH-7.2 suplementado con Pen/Strep

y luego tratados con Tripsina-EDTA (0,25% de Tripsina; EDTA04Na en HBSS l mM,

Gibco BRL) durante 5 a 10 min en estufa a 37°C , 5% C02. Luego, la tripsina se inactivó

con medio fresco para Células ES, se pipeteó para disgregar los cúmulos celulares y se

plaqueó en 4 o 5 placas con fibroblastos inactivados crecidos a confluencia.

Electroporacio'n de células ES.

Porciones de ADN pueden ser introducidos en células ES por medio de la aplicación

de pulsos eléctricos de alto voltaje a una suspensión de células y ADN. Luego de la

aplicación de ese pulso, el ADN pasa a través de poros que transitoriamente se forman en la

membrana de las células. Ese procedimiento resulta, sin embargo, en una alta mortalidad

celular de alrededor del 50%. Los parámetros que influencian la eficiencia y la viabilidad

celular son el voltaje, la concentración de iones, la concentración de ADN y la

concentración de células.

Una placa de lO cm con células ES crecidas a un 80% de confluencia sobre MEFs

se lavó dos veces con PBS pH-7.2 suplementado con Pen/Strep y se tripsinizó en estufa por

lO min. Luego se inactivó la Tripsina con medio fresco y se colectaron las células

resuspendidas en un tubo cónico de 15 ml de capacidad. Se desagregaron los cúmulos

celulares pipeteando repetidas veces y se centrifugó por 5 min a 1.000 r.p.m. a temperatura

ambiente. El medio se descartó y el precipitado conteniendo las células ES se resuspendió

en OPTl-MEM (Opti-MEM reduced Serum Media, Gibco BRL) pipeteando suavemente

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Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Materia/es y Métodos.

repetidas veces. Este paso se repitió una vez mas para garantizar tener todas las células

uniformemente en el medio OPTI-MEM. Se hizo un conteo de las células en cámara de

Neubawer, para resuspenderlas luego de una ultima centrifugación, a una densidad de 2 x

107células/0.8 ml. Se resuspendieron suavemente las ce'lulas y se transfirieron 0,8 ml a una

cubeta de electroporación que contiene 25 ug de vector de recombinación linearizado en 20

ul de agua estéril. A continuación se seleccionó en el electroporador (Cell Porator, Gibco

BRL) para 330 uF y en posición de carga y baja resistencia se llevó el capacitor a 290-320

V de carga. Se cambió a la posición de descarga y con la cubeta en la cámara se disparó

cuando el voltaje estuvo en las cercanías de los 280 V. El voltaje debe bajar

inmediatamente a menos de lO V. Se desconectó el equipo y se dejó reposar la cubeta por

lO min a temperatura ambiente. A continuación se agregaron 0,8 ml de medio de ce'lulas ES

fresco y el total de la suspensión de células se transfirió a un tubo cónico de 15 ml. de

capacidad conteniendo 2,4 ml de medio, haciendo un total de 4 ml. Por ultimo se

plaquearon 1 ml en cada una de cuatro placas conteniendo MEFs inactivados y se dejaron

en estufa a 37°C y 5% de C02. Con l ul de la suspensión se hizo un conteo de células para

calcular la supervivencia.

Selección, repique, amplificación y almacenamiento de clones resistentes.

Las placas con células transfectadas fueron mantenidas, durante la primera etapa, en

medio de cultivo de células ES bajo selección suplementadas con Geneticina (G418 sulfate,

Geneticin. Gibco BRL) 180 ug de droga activa por ml de medio de cultivo. Las células

resistentes formaran colonias clonales que luego de 8 días de selección fueron repicadas

utilizando tips estériles y con la ayuda de un microscopio invertido en flujo laminar de

seguridad. Cada una de las colonias resistentes fue depositada en una placa de 96

multipocillos con fondo en U conteniendo 30 pl de Tripsina-EDTA y, luego de haber

completado la placa, se dejó en estufa a 37°C y 5% de C02 por 10 min para disgregar cada

colonia. Una vez completada la disgregación de cada colonia, con la ayuda de una pipeta

multicanal se inactivó la Tripsina con 90 ul de medio de cultivo fresco y se pipeteo,

aspirando y expeliendo el medio para tener células aisladas. De los 120 ul totales finales

que existe en cada pocillo, 60 ul fueron pasados a una placa de 96 multipocillos con fondo

plano conteniendo MEFs para crecerlos y obtener ADN para análisis de Southern o PCR y

118

Tesix Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.

los 60 ul restantes fueron cubiertos con aceite mineral (testeado para Células ES), envueltos

en film transparente y congelados lentamente a —70°Chasta su nueva utilización.

Transfección transitoria de células ES con un plásmido que expresa Ia recombinasa Cre.

Dadas las características del vector utilizado para la recombinación homóloga fue

necesario realizar una transfección transitoria con un plásmido que exprese la recombinasa

Cre del bacteriófago Pl bajo un promotor fuerte con el fin de eliminar el par de genes de

selección (Neor y TK). Para ello se utilizó el plásmido pCAGGS-Cre que expresa la citada

recombinasa bajo un promotor de actina con una zona amplificadora de la expresión

proveniente de un citomegalovirus y con una señal de poliadenilación de B-Globina. Para la

transfección transitoria se siguieron los mismos pasos que se mencionaron en la sección

Electroporación de células ES pero en este caso se utilizaron lO ug del plásmido pCAGGS

Cre que debe estar superenrollado y no linearizado. Una vez plaqueadas las células en 4

placas independientes se las dejó crecer por 60 hs aproximadamente, para darle tiempo a las

células de que sintetice la recombinasa Cre para producir la excisión, luego de las cuales se

las pasa a nuevas placas con MEFs en concentraciones crecientes de células. Luego de un

día. se las empezó a seleccionar con medio de cultivo suplementado con 2 mM de

Ganciclovir (Cytovene lV, Ganciclovir sodium, Roche Laboratories Inc.) por un lapso de 5

dias. Después de ese período se observaron colonias aisladas de células ES las cuales

fueron repicadas a placas de 96 pocillos y siguiendose los mismos pasos citados

anteriormente para tener los clones aislados.

Congelado, almacenamiento y descongelado de células ES.

Las células ES fueron congeladas como cualquier otro tipo de línea celular en medio

de cultivo conteniendo 20% de suero fetal bovino en lugar de 15% como esta formulado

para cultivo normal y con el agregado de 10% de DMSO (Sigma) como agente

criopreservador. Luego los viales conteniendo las ce'lulas fueron almacenados en tanques de

nitrógeno liquido. Pueden ser mantenidos así de manera indefinida. Como regla general el

congelado se hizo lentamente y el descongelado rápidamente, para eliminar el DMSO

presente en el medio que, en estado liquido y en contacto prolongado con las células,

resulta tóxico. Las Células ES. así como los MEFs, se congelan mejor a una alta densidad,

ll9


aproximadamente de 5 a lO x lO6 células/ml. Para el conteo se utilizó una cámara de

Neubauer.

Diseño y puesta a punto de una PCR para la identificación de clones portadores de la

recombinación.

Para la genotipificación de las células ES con la recombinación homóloga final y

para la genotipificación de los animales con el exón 2 del receptor de dopamina D2

flanqueado por sitios loxp se diseñó una reacción de PCR. Esta reacción amplifica una

región 5’ del exón 2 de 234 pb en el caso del gen del animal salvaje, de 369 pb en el caso

que exista una deleción de tipo ll y de aproximadamente 450 pb en el caso que exista una

deleción de tipo I, utilizando los primers Type l del. (5’TGC AAG ACT GCA TCA TCC

TC3’), Type ll del. (S’TGC TCA ACA CAC TCA CAT GC 3’) y TypeI&II del. (5’GCA

TTT GGA GCA ACT GGA AT3’). Las condiciones para la reacción fueron como se

describe a continuación: 200 ng de ADN genómico en buffer PCR (Tris-HCl 20 mM, pH

8.4; KCl 50 mM), MgClz 2,1 mM. dNTPs 0,2 mM, 1,3 uM de los primers Type I y Type Il

del.. 2 pM del primer Type l&ll del. y l U de polimerasa Taq (Promega) en un volumen

final de 30 ul. Las muestras fueron amplificadas en un termociclador (MJ Reserarch) con el

siguiente protocolo: 5 min de desnaturalización inicial a 94°C. Luego 15 ciclos de

amplificación que constaron de l min de desnaturalización a 94°C, l min de aparcamiento

comenzando a 67°C y disminuyendo lo/ciclo y l min de elongación a 72°C. A continuación

una nueva serie de 15 ciclos que constaron de l min de desnaturalización a 94°C, 1 min. de

aparcamiento a 52°C y l min de elongación a 72°C para finalmente dejar 5 min de

elongación a 72°C y sostener la temperatura en 4°C.

En cada caso los productos de elongación fueron corridos en un gel de agarosa 1,5%

con bromuro de etidio (0,1 ug de bromuro de etidio/ul de agarosa) y visualizados a la luz

UV.

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Estudio funcional del receptor dopaminérgico D2 en …...neurotransmisor al espacio sináptico...

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