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Mtodos recomendados para el estudio de susceptibilidaden Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulasa

negativa y Staphylococcus saprophyticus: Nuevospuntos de corte e interpretacin de resultados

ELIZABETH PALAVECINO R.*

RECOMMENDATIONS ON THE SUSCEPTIBILITY STUDIES OFStaphylococcus aureus, COAGULASE NEGATIVE Staphylococcus AND

Staphylococcus saprophyticus:NEW BREAKPOINTS ANDINTERPRETATION OF RESULTS

Key words: Staphylococcus, Susceptibility testing, Breakpoint.

Rev Chil Infect (2002); 19 (Supl. 2): S 119-124

* Department of Pathology, University Hospitals of Cleveland. Case Western Reserve University Cleveland OH, USA.

INTRODUCCIN

Los estafilococos son uno de los microorga-nismos ms frecuentemente aislados en el la-boratorio de microbiologa. Aunque forman par-te de la flora normal y en ciertas ocasionespueden ser slo contaminantes en una muestra,no hay duda que ellos causan infecciones seve-ras, especialmente en el paciente hospitalizado.

Los estafilococos presentan mecanismos deresistencia a los antimicrobianos que son difci-les de detectar usando los mtodos convencio-nales. Adems, el NCCLS recientemente cam-bi los puntos de corte para oxacilina y por lotanto, en este momento la interpretacin deresistencia a oxacilina es diferente dependien-do si el microorganismo causante de la infec-cin es Staphylococcus aureus o esStaphylococcus coagulasa negativa (SCN).Con estos nuevos puntos de corte es indispen-

sable que la identificacin de estas especiessea hecha en forma precisa y confiable.

Generalmente los laboratorios de microbio-loga utilizan la prueba de la coagulasa paradiferenciar S. aureus de las otras especies deestafilococos que conforman los llamados SCN.Debe sin embargo, tenerse presente que cuan-do se usa solamente la prueba de la coagulasarpida, la que detecta el clumping factor, cier-tas especies dentro del grupo de SCN puedendar una reaccin positiva, es el caso deStaphylococcus lugdunensis y Staphyloco-ccus schleiferi siendo errneamente identifi-cadas como S. aureus. Por fortuna estas espe-cies son aisladas muy espordicamente enmuestras clnicas, aunque se sabe que puedencausar infecciones oportunistas. En mi expe-riencia, estas especies de SCN se comportanclnicamente ms parecido a S. aureus y talvez deberan ser interpretados con los puntos

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de corte de S. aureus. Esto es todava un puntode controversia y en la actualidad, si seguimoslas guas del NCCLS, deben ser consideradoscomo SCN y la oxacilina debe ser interpretadacomo tal.

La coagulasa en tubo es una prueba bastan-te especfica para diferenciar entre S. aureus ySCN. Los mtodos automatizados son en gene-ral bastante confiable en la identificacin deestos microorganismos al nivel de especie. Enla actualidad existen cerca de 20 especies deSCN pero habitualmente son consideradas unsolo grupo. En la gran mayora de los casos laidentificacin de especie no es necesaria, ex-cepto para monitorear tendencias de los patro-nes de resistencia por motivos epidemiolgicoso para diferenciar bacteremias verdaderas decontaminacin en hemocultivos sucesivos.1 Anhoy, Staphylococcus epidermidis es la espe-cie ms frecuentemente aislada de muestrasclnicas y por lo tanto, la mayora de las reco-mendaciones del NCCLS para los SCN estnenfocadas a la evaluacin de susceptibilidad deesta especie.

En este artculo describiremos las recomen-daciones actuales del NCCLS para el estudiode susceptibilidad en estafilococos a oxacilina ya vancomicina as como tambin las nuevasinterpretaciones y puntos de corte.2

Estudio de susceptibilidad a oxacilina

Los estafilococos son resistentes a oxacilinapor tres mecanismos: produccin exagerada de-lactamasa, modificacin de las PBPs, y porla presencia de una nueva protena en la paredcelular denominada PBP2a. Este ltimo meca-nismo es el ms importante en las cepas querutinariamente se aislan en el laboratorio. Lapresencia de PBP2a est codificada por el genmecA.3 Las cepas que tienen este mecanismopresentan lo que se denomina una heterogenei-dad dentro de la colonia. Esto significa que unporcentaje muy bajo de los clones dentro de lacolonia son resistentes mientras que el resto dela poblacin es susceptible. Adems, los clonesresistentes crecen ms lento que los suscepti-bles, y por ello se requieren medios especiales ytemperaturas no mayores de 35 C para esti-mular su desarrollo in vitro y poder detectarlos.

Es muy importante detectar en forma eficientea los microorganismos resistentes dentro deesa poblacin causante de la infeccin porquesi el paciente es tratado con oxacilina, las cepasresistentes van a persistir en el sitio de la infec-cin. Debido a la complejidad de esta resisten-cia el NCCLS ha desarrollado mtodos que sonespecficamente diseados para detectarla (Ta-bla 1).

El mtodo considerado gold standard paraidentificar las cepas de Stafilococcus resisten-tes a oxacilina es la deteccin del gen mecA. Elgen mecA codifica la formacin de una PBPdenominada PBP2a la que tiene una baja afini-dad por meticilina y oxacilina y por lo tantoestas cepas son resistentes al tratamiento conestos agentes antimicrobianos3 El gen mecApuede ser detectado por RPC usando lospartidores que se han publicado previamente4 ose puede usar una sonda de ADN que detectala PBP2a. Sin embargo, estos mtodos todavano son usados de rutina en el laboratorio ya quepor lo menos en E.U.A. no han sido aprobadospor el FDA para el uso comercial.

La deteccin de resistencia se complica anms ya que el gen mecA existe en todas lascepas de S. aureus con una CIM a oxacilina> 2 g/ml y est ausente en aquellas cepas conuna CIM < 2 g/ml. El punto de corte que elNCCLS haba designado para oxacilina enStafilococcus era de 2 g/ml. Sin embargo,estudios hechos en SCN demostraron que ce-pas que tenan una CIM de 0,5 g/ml tenan elgen mecA y por lo tanto, deberan ser conside-radas resistentes.4 Adems, informes de fallasde tratamiento con estos agentes en infeccio-nes producidas por SCN con CIM de 0,5 a 1g/ml sugeran que estas cepas se comporta-ban clnicamente como resistentes a oxacilina.Por este motivo el ao pasado el NCCLS deci-di establecer diferentes puntos de corte paraoxacilina en S. aureus y en SCN (Tabla 2).

Cuando se informa la susceptibilidad de es-tafilococo es necesario tener presente si setrata de S. aureus o de SCN e interpretar elresultado de la oxacilina de acuerdo a la espe-cie. Tambin es necesario recordar que todaslas cepas de estafilococo que son resistentes aoxacilina (SAMR o SCNMR) deben ser infor-madas como resistentes a todos los -lactmi-

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Tabla 2. Nuevos puntos de corte para la oxacilina en Staphylococcus

Microorganismo CIM (g/ml) rea de inhibicin (mm)S I R S I R

S. aureus* < 2 - > 4 > 13 11-12 < 10SCN < 0,25 - > 0,5 > 18 - < 17

* En S. aureus los resultados de difusin por disco o de la CIM se pueden confirmar usando laplaca de screen. En Staphylococcus coagulasa negativa la placa de screen no debe ser usada ya queeste mtodo no detecta cepas de SCN resistentes a oxacilina.

Tabla 1. Mtodos recomendados por el NCCLS para la deteccin de resistencia a oxacilinaen el gnero Staphylococcus

Microorganismo Mtodo Medio Control de calidad

S. aureus Placa de screen* Agar de Mueller-Hinton + S. aureus ATCC 29213-Susceptible4% Na Cl + 6 g/ml oxacilina S. aureus ATCC 43300-Resistente

SCN++ Difusin por disco Agar de Mueller-Hinton S. aureus ATCC 29213

Microdilucin en caldo CAMHB*** S. aureus ATCC 292132% Na Cl

* El inculo debe ser preparado de suspensin directa ajustado a 0,5 McFarland. Para la inoculacin, se puede usar un asa de10 ml o una trula y se debe sembrar un rea de 10-15 mm de dimetro o un cuadrante de la placa.Para cada mtodo la incubacin debe ser a 350 C durante 24 h antes de interpretar los resultados.** Staphylococcus coagulasa negativa. *** CAMHB: Caldo de Mueller Hinton con ajuste de cationes.

cos y a las combinaciones de -lactmicos coninhibidores de -lactamasas.

Mtodos recomendados para detectarresistencia a oxacilina en S. aureus

El mtodo ms prctico y confiable paradetectar la resistencia a oxacilina en S. aureuses la placa de screening que contiene clorurode sodio y oxacilina. En la Tabla 1 se detallanlos requerimientos tcnicos. Esta placa se ino-cula con una suspensin bacteriana con unadensidad de 0,5 McFarland preparada disol-viendo un par de colonias directamente en cal-do de Mueller-Hinton. Se introduce una trulade algodn en el tubo que contiene la suspen-sin de microorganismos, se exprime el excesode lquido de la trula en el borde del tubo y sesiembra en una porcin de la superficie de agar

(la placa se puede dividir en ocho porciones).Las placas se deben incubar durante 24 hrs a35 C antes de informar una cepa como sus-ceptible. Si una cepa demuestra resistencia alas 18 hrs (una o ms colonias creciendo en elagar) se puede informar como tal, pero si no seobserva crecimiento se debe incubar hasta com-pletar las 24 hrs antes de informar. Este mto-do no necesita confirmacin.

Los otros mtodos recomendado por laNCCLS para detectar la resistencia a oxacilinaen S. aureus son el mtodo de dilucin en agarde Mueller-Hinton con 2% de NaCl y el mto-do de difusin por disco usando slo una placade agar de Mueller-Hinton (sin NaCl). El mto-do de difusin por disco detecta la mayora delos SAMR pero en algunos casos el resultadonecesita ser confirmado. Otro mtodo confiablees el E-test si se usa una placa de Mueller-Hinton con 2% NaCl.

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Tabla 3. Mtodos recomendados para la deteccin de resistencia intermedia avancomicina (CIM > 8 g/ml) en Staphylococcus spp

La placa de screen (BHI con 6 g/ml de vancomicina) incubada por 24 hrs puede ser usadacomo mtodo de screening. Este mtodo necesita confirmacin por un mtodo de CIM encepas que aparecen como resistentes. Adems debe ser realizado estricto control de calidadcon cepas de E. faecalis ATCC 29212 y con S. aureus ATCC 29213.

El mtodo recomendado por el NCCLS para confirmar resistencia es el mtodo de microdilucinpor caldo usando caldo de Mueller-Hinton con ajuste de cationes y una incubacin de 24 hrs.

Mtodos automatizados (Microscan, Vitek) detectan resistencia intermedia slo si se usaincubacin de al menos 16 hrs. Se recomienda que cepas de S. aureus con una CIM de > 4 g/ml con estos mtodos sean consideradas como posiblemente resistentes y deben ser enviadasa un laboratorio de referencia.

Un E-test realizado en placas de Mueller-Hinton y una incubacin de 24 hrs es tambinconfiable si se siguen las indicaciones del fabricante al leer e interpretar la CIM.

El mtodo de difusin por disco NO debe ser usado para el estudio de susceptibilidad deStafilococcus a vancomicina ya que este mtodo no diferencia cepas susceptibles de cepas conresistencia intermedia a vancomicina.

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Mtodos recomendados para detectarresistencia a oxacilina enStaphylococcus coagulasa negativa

Aunque muchas veces es difcil determinarla significancia real de la presencia de una cepade SCN en un cultivo de muestras clnicas, estegrupo se ha convertido en un patgeno impor-tante especialmente en infecciones intrahos-pitalarias. El aumento en la cantidad de proce-dimientos invasores y en el uso de cattereshan contribuido, sin duda, al aumento de infec-ciones causadas por SCN. En general S.epidermidis, Staphylococcus haemolyticus yStaphylococcus hominis son ms resistentesa los antimicrobianos que el resto de las espe-cies de este grupo.

La resistencia a oxacilina es an ms difcilde detectar en SCN que en S. aureus debido aque la colonia es ms pequea y a veces difcilde visualizar en la placa. Adems la heteroge-neidad de la colonia es an mayor que en elcaso de S. aureus ya que el nmero de micro-organismos que expresan resistencia dentro dela colonia es muy bajo. La placa de screeningno detecta en forma eficiente a cepas de SCNque son resistentes a oxacilina y por esta razn,este mtodo no se debe usar para evaluar resis-tencia a oxacilina en SCN. En la actualidad

para hacer el estudio de susceptibilidad aoxacilina en SCN, el NCCLS recomienda eluso del mtodo de dilucin en caldo o el mtodode difusin por disco usando los nuevos puntosde corte (Tabla 2).

Estudio de susceptibilidad deStaphylococcus a vancomicina

Hoy en da las infecciones producidas porcepas resistentes a oxacilina deben ser tratadascon vancomicina. Existe bastante preocupa-cin por parte de los mdicos clnicos y de losmiembros del control de infecciones intrahospi-talarias en tratar de reducir el consumo devancomicina dentro del hospital.

Como todos sabemos, cepas de S. aureusque presentan resistencia intermedia (CIM ma-yor o igual a 8 g/ml) a vancomicina han sidoaisladas de pacientes que en su mayora hanrecibido un tratamiento prolongado convancomicina. Estas cepas tambin presentanhabitualmente una susceptibilidad disminuida ateicoplanina y es por ello que se han denomina-do GISA que significa S. aureus con resis-tencia intermedia a glicopptidos. Las pri-meras cepas de GISA aisladas de muestrasclnicas eran todas SAMR, pero ltimamentese han aislado cepas con resistencia intermedia

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a vancomicina pero que son susceptibles aoxacilina (SAMS). Este hallazgo complica anms nuestra tarea en el laboratorio debindoserevisar cuidadosamente el resultado de vancomi-cina, incluso en aquellas cepas de SAMS.

El mecanismo exacto de resistencia avancomicina en S. aureus an no ha sido total-mente aclarado. Las cepas de S. aureus conresistencia intermedia aisladas en Japn y enE.U.A., tienen una pared celular gruesa y algu-nos precursores que participan en la sntesis dela pared estn aumentados en cantidad, peroan no se ha confirmado que estas modificacio-nes jueguen un papel en la resistencia avancomicina. S se sabe que la resistencia avancomicina en S. aureus no est mediada porlos genes que causan la resistencia avancomicina en enterococos.

Mtodos recomendados para detectar re-sistencia a vancomicina en S. aureus

En la actualidad el NCCLS recomienda elmtodo de la placa de screening para detectarlas cepas de S. aureus con resistencia interme-dia a vancomicina (Tabla 3). El mtodo dedifusin por disco no es confiable en la detec-cin de S. aureus con resistencia intermedia avancomicina ya que no diferencia estas cepasde cepas susceptibles. Por este motivo, elNCCLS no recomienda usar este mtodo. Encambio preconiza la placa de screening prepa-rada con agar de infusion cerebro corazn (BHI).Esta placa debe ser incubada durante 24 hrsantes de ser leda. Si una cepa de estafilocococrece en la placa de screening, esta cepa debeser confirmada como resistente usando el m-todo de dilucin en caldo para obtener la CIM(Tabla 3). En general, los mtodos automatiza-dos son capaces de detectar estas cepas si laincubacin ha sido de al menos 16 hrs, aunqueel ideal es usar una incubacin de 24 hrs. Siste-mas que usan perodos de incubacin menor a16 hrs no son confiables. El E-test tambindetecta cepas con resistencia intermedia avancomicina pero la CIM es generalmente unadilucin ms baja que con los otros mtodos.5Es importante seguir las indicaciones del fabri-cante para leer e interpretar el crecimiento finode colonias alrededor de la elipse.

En la actualidad el CDC en E.U.A. reco-mienda que aquella cepa de S. aureus con unaCIM a vancomicina > 4 g/ml sea clasificadacomo posiblemente resistente a vancomicinadebiendo ser enviada a un laboratorio de refe-rencia.

Recomendaciones actuales en elestudio de susceptibilidad enStaphylococcus saprophyticus

El NCCLS en su edicin de enero del 2001recomend por primera vez no realizar estudiode susceptibilidad en este microorganismo. Lasrazn principal para esta recomendacin pro-viene del hecho que muchas cepas de S.saprophyticus aparecen como oxacilina resis-tente in vitro, pero son clnicamente suscepti-bles. Esto es debido a que este microorganismoes un patgeno aislado slo en infecciones uri-narias y las concentraciones que los -lactmi-cos alcanzan en orina son mucho ms altas quelas obtenidas en el plasma y por lo tanto estosagentes son capaces de inhibir a las cepas de S.saprophyticus con CIMs por sobre el punto decorte. Por este motivo el NCCLS decidi quecomo las infecciones causadas por este micro-organismo responden al tratamiento habitual,no es necesario hacer estudio de susceptibili-dad. Sin embargo, sta no es una recomendacionfcil de poner en prctica en la rutina del labo-ratorio ya que los mdicos clnicos esperan eseinforme. Personalmente recomiendo que si sedesea hacer el estudio, se prueben aquellosantimicrobianos ms comnmente usados paratratar las infecciones urinarias. Pero debe ex-cluirse oxacilina ya que si el microorganismo esresistente in vitro se debiera infomar resistentea todos los -lactmicos (como discutiramosms arriba con los otros estafilococos), cuandoen la prctica la infeccin urinaria causada porS. saprophyticus todava puede ser tratadacon estos agentes.

En resumen, en este artculo hemos revisadolos mtodos recomendados para detectar enforma eficiente aquellas cepas de estafilococosresistentes a oxacilina y tambin hemos revisa-do los mtodos que se pueden usar para detec-tar y confirmar la presencia de resistencia in-termedia a vancomicina. Para una explicacin

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ms extensa de los otros agentes antimicrobianosque pueden ser estudiados en estafilococos re-comiendo revisar las ltimas ediciones delNCCLS.

BIBLIOGRAFA

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Correspondencia a:Elizabeth Palavecino RosalesEmail: epalavecino@hotmail.com