“Estudio de las moléculas de adhesión en condiciones fisiológicas y patológicas”

Dra. Consuelo Macías Abraham

Instituto de Hematología e Inmunología

Hipótesis

Las moléculas de adhesión se encuentran implicadas en la actividad y regulación funcional de las células

NK humanas y en la fisiopatogenia de las enfermedades que cursan con inflamación y

activación del endotelio vascular por procesos oclusivos de diferente origen como son

el Síndrome coronario agudo y la Anemia drepanocítica

Objetivos Específicos

-Evaluar los niveles de expresión y la actividad funcional de las moléculas de adhesión β2 integrinas leucocitarias y VLA-4 en las células NK humanas en diferentes estados de activación.

-Estimar los niveles de concentración de las moléculas de adhesión endoteliales solubles ICAM-1, E-selectina y VCAM-1 en los enfermos con SCA y analizar su relación con el daño miocárdico.

-Evaluar las posibles alteraciones de las moléculas de adhesión leucocitarias, endoteliales y en hematíes en enfermos con AD en sus dos estados clínicos, estado basal y crisis vasooclusivas dolorosas (CVOD) y analizar su implicación en la fisiopatogenia de la enfermedad.

Anti CD11aAnti CD49dX63

92.33 91.91%45.91 2.40%

145.55 99.68%36.62 5.23% 135.63 96.59%

112.93 93.72%

Anti CD11b Anti CD11c

76.78 65.74% 99.83 93.31%

67.76 37.0% 58.12 53.46%

Histogramas de citometría de flujo de (A) Células NK frescas y(B) cultivadas después de la incubación con IL-2 (20-50 u/m) durante 3 días (células LAK).

A

B

(A) Células LAK (30% de agregación) en presencia de IL-2.

(B) Células LAK no agregadas en presencia de AcMos contra la molécula LFA-1 e IL-2.

(C) Células NK frescas no agregadas en presencia del AcMos anti-4 (HP1/7), AcMos inhibidores para la molécula LFA-1 e IL-2.

(D) Agregación celular (60%) inducida sobre células LAK mediante el AcMo anti-4 (HP1/7) en presencia de AcMos específicos contra la molécula LFA-1 e IL2.

(E) Agregación celular (70%) inducida sobre células cultivadas mediante AcMo anti-4 (HP2/4) en presencia de AcMos dirigidos contra la molécula LFA-1 e IL-2.

(F) Células LAK no agregadas (10%) en presencia de AcMos dirigidos contra la molécula LFA-1, AcMo no inductor de agregación anti VLA-4 (HP2/1) e IL-2.

(G) Células LAK no agregadas en presencia de AcMos contra la molécula LFA-1, anticuerpo de isotipo similar como control inespecífico e IL-2 .

Porcentajes de células NK frescas y células LAK adheridas a fibronectina (50g/ml). La adhesión al plástico se utilizó como control positivo y la albúmina como control negativo. *Ensayos de inhibición utilizando los AcMos W6/32 (10g/ml), P1D6 (10g/ml) y HP2/1 (10g/ml) y 20g/ml de fragmentos peptídicos de FN CS1 y CS2. Esta unión fue bloqueada cuando las células se incubaron con el AcMo HP2/1 (anti 4) y el fragmento peptídico de la FN, CS1.

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10

20

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100

Porc

enta

jes

de a

dher

enci

a ce

lula

r

Plastico Albúmina Fibronectina W6/32* P1D6* HP2/1* CS1* CS2*

Células NK frescas Células NK activadas

MOLÉCULAS DE ADHESIÓN ENDOTELIALES EN EL SCA

Pacientes y grupos de estudios

- 43 pacientes diagnosticados y tratados en el Instituto de Cardiología y Cirugía Cardiovascular de la Habana

- 32 con IAM típico

- 11 con AI

- 37 sujetos sanos

Moléculas de

Adhesion(ng/ml)

Controles normales

Angina inestable Infarto agudo de miocardio

Admisión 10 días después Admisión 10 días después

VCAM-1 15.3 6.1

34.6 19.8*† 24.4 13.2*† 24.3 14.1** 25.3 14.4**

E-selectina 3.2 1.4 5.9 2.4*‡ 5.0 2.4*‡ 3.8 1.6‡ 3.2 1.1‡

ICAM-1 18.5 6.9

26.6 21.1 24.9 10.6 27.7 12.4*** 29.4 8.8***

Valores de las moléculas de adhesión endoteliales solubles en la angina inestable y el infarto agudo de miocardio al diagnóstico y 10

días después

*p<0.05, **p<0.01,*** p<0.001, cuando ambos grupos de pacientes se compararon con los controles†p<0.05, cuando los pacientes con angina se compararon en el momento de la admisión y 10 días después‡p<0.05, cuando ambos grupos de pacientes se compararon al momento de la admisión y 10 días después.

CIRCULACIÓN ENDOTELIOCIRCULACIÓN ENDOTELIO

Flujo sanguíneo disminuido Respuesta inflamatoria

Evento isquémico Activación endotelial

activación de neutrófilos

Liberación de E-Selectina Sobre-expresión de en la circulación E-selectina en las

células endoteliales

Incremento de IL-1

Mecanismo secuencial en el que se observa cómo una reacción de activación endotelial podría prolongar los altos valores de E-Selectina soluble

en sangre en la Angina Inestable

MOLÉCULAS DE ADHESIÓN EN LA ADMOLÉCULAS DE ADHESIÓN EN LA AD

-38 pacientes adultos con el diagnóstico de AD atendidos en el 38 pacientes adultos con el diagnóstico de AD atendidos en el Instituto de Hematología e InmunologíaInstituto de Hematología e Inmunología

-20 en estado basal-20 en estado basal

-18 con CVOD osteomioarticulares, abdominales y lumbares-18 con CVOD osteomioarticulares, abdominales y lumbares

-20 individuos supuestamente sanos-20 individuos supuestamente sanos

0

10

20

30

40

50

60

70

CD3 CD19 CD57

Controles normales Enfermos en estado basal Enfermos en CVOD

****

Expresión de las moléculas CD3, CD19 y CD57 en células mononucleares de controles normales, enfermos con anemia drepanocítica en estado basal y en crisis vasooclusiva dolorosa

(CVOD)

Diferencias significativas: p < 0.05* Comparación entre controles y enfermos en estado basal** Comparación entre controles y enfermos en CVOD*** Comparación entre ambos grupos de enfermos

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CD11a CD18 CD49d CD29 CD54 CD62L

Controles normales Enfermos en estado basal Enfermos en CVOD

* **

****

*

*

*

*

**

*****

Expresión de moléculas de adhesión en células mononucleares de controles normales, enfermos con anemia drepanocítica en estado basal y en crisis vasooclusiva dolorosa (CVOD)

Diferencias significativas: p < 0.05* Comparación entre controles y enfermos en estado basal** Comparación entre controles y enfermos en CVOD*** Comparación entre ambos grupos de enfermos

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CD11a CD18 CD49d CD29 CD54 CD62L

Controles normales Enfermos en estado basal Enfermos en CVOD

**** *

*****

*

***

Expresión de moléculas de adhesión en neutrófilos de controles normales, enfermos con anemia drepanocítica en estado basal y en crisis vasooclusiva dolorosa (CVOD)

Diferencias significativas: p < 0.05* Comparación entre controles y enfermos en estado basal** Comparación entre controles y enfermos en CVOD*** Comparación entre ambos grupos de enfermos

INFLAMACIÓN VASCULAR OCLUSIÓN VASCULARINFLAMACIÓN VASCULAR OCLUSIÓN VASCULAR

Liberación de citocinas Interacción eritrocito/endotelio

VLA-4/VCAM-1 CD36/trombospondina/CD36/VNR

GPIIbIIIa/factor von Willebrand/VNR Activación endotelial

Incremento de adhesión Plaquetas Leucocitos Eritrocitos

Activación de la

coagulación Isquemia

Formación de trombos Daño endotelial

Vías funcionales de inflamación y oclusión vascular en la fisiopatogenia de la anemia drepanocítica.

Novedad de la investigación Profundiza por primera vez en aspectos de la regulación

funcional de las células NK en diferentes estados de activación, como la expresión de las moléculas 2 integrinas y VLA-4, el efecto de los AcMo específicos para estas moléculas como inductores de agregación celular, su acción sobre la proliferación y actividad citotóxica y la capacidad de estas células de adherirse a la matriz extracelular.

Se demuestran los mecanismos independientes de agregación homotípica de estas células mediados por LFA-1 y VLA-4 y la participación diferencial de las mismas en la actividad citotóxica de las células NK.

Novedad de la investigación Se enriquece el conocimiento precedente sobre el vínculo entre

niveles circulantes de las moléculas de adhesión y el daño isquémico miocárdico. En especial la evidencia del incremento de E-selectina en la AI durante los 10 primeros días tras el episodio agudo a diferencia del IAM, como posible marcador sindrómico, de potencial valor pronóstico y terapéutico.

En la AD se ofrece una nueva descripción integradora de las moléculas de adhesión que median la interacción leucocito/endotelio/eritrocito, identificándose diferencia entre la condición basal de la enfermedad y las CVOD lo que apoya el papel primario de los fenómenos derivados de la interacción intercelular en los eventos oclusivos e inflamatorios de esta patología

Publicaciones internacionales

Macías C, Ballester JM, Campanero MR, López-Botet M, de Landázuri MO, Sánchez- Madrid F. Expression and functional activity of the VLA-4 molecule on human natural killer cells. Exp. Hematol 1995; 23: 917.

Macías C, Ballester JM, Hernández P. Expression and functional activity of the very late activation antigen-4 molecule on human natural killer cells in different states of activation. Immunology 2000;100:77-83.

Macías C, Villaescusa R, del Valle L, Boffil V, Cordero G, Hernández A, Hernández P, Ballester JM. Moléculas de adhesión endoteliales ICAM-1, VCAM-1 y E-selectina en pacientes con síndrome coronario agudo. Rev Esp Cardiol 2003;56:137-44.

Macías C, del Valle L, Socarrás B, de León J, Badía T, Hernández P, Ballester JM. Expresion of adhesion molecules in sickle cell disease. Pediatric Blood and Cancer (en revisión).