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Tesis de Posgrado

Estudio de las bacteriasEstudio de las bacteriasfermentadoras del género Bacillus,fermentadoras del género Bacillus,

AerobacillusAerobacillus

Giambiagi, Nélida

1950

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasNaturales de la Universidad de Buenos Aires

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Cita tipo APA:Giambiagi, Nélida. (1950). Estudio de las bacterias fermentadoras del género Bacillus,Aerobacillus. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0639_Giambiagi.pdf

Cita tipo Chicago:Giambiagi, Nélida. "Estudio de las bacterias fermentadoras del género Bacillus, Aerobacillus".Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1950.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0639_Giambiagi.pdf

Tesis

-....

..2ÉI.I:{I.S..,T_EEJ;Q.QBJDHQACAQÍ.BUEÍ‘IQÉAlï-‘áïi

UIT.C_I.ï2".N.C_I¿ï.S.Ets-¿.0‘2.2¿sJ_F.LaI_C¿¿s__,v-__;

gqïgdio de las bacterias fiermontadoras

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.5?)de género ggg¿;LHg (Lerobucillu

ra optar al tíïulo de"Doctor un CienciasNatur¿.3s" presuntcda por

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¿gradczco al Doctor Alfr do Sordclli su Cñflstïn‘¿w asesoraflivnto y ¿uuda. Ellos han hecho Posible1:. r2:;¿1‘izac€.<'>;_ u;th tra-¿343m

LUJÁLÁLJÏ 1...9_.‘—».-.—¿“u-v..- .“..

Capitulo I. Introducción Pag. 3" II Estudio de la literatura " 4

" III Parte Experimental " ll

l) {plicación de los métodos corrientes parael aislamiento de 3nglxgxïg y BL¿geeerqnsde materiales de la naturaleza.Sus resultados.

2 ) Estudio de nétodos apropiados para reconocerla presencia y asegurar el aislamiento de fi:¿Elxgl¿g. Sus resultados

V3 Estudio de métodos apropiados para reconocerla presencia y asegurar el aislamiento del32.118.;0.9

a) 1racaso de gran números de ensa­O n.

b) ¿plicación de una propiedad carec­teristica del fi¿_qscergns (pro­

ción enzimática de dextrinascristalinas) para reconocer supresencia en la naturaleza y pa­ra su a'slamicnto.

c V Áétodo de aislamiento del Bamaïcerans.

Capitulo IV: Discusión de resultados. Pago 44

Capitulo V: Resumen-Conclusiones-Matcrialcs y Métodos.47

Bibliografia Pag. 51

.5. ,0 oc. On. .. oo0 . 4 o u o .o. . no oo a'o ' c ‘l o o 0.a o. . a 'Co o. y oa O o. . O o a o . .0.O O 0.o o s o ¡.0.. . .

9...t°-_.ï_i-°_I._T._U_.L_.Q .1".—-\ _-- -... .-_.. .._.. _——-—.—_a .—.-.—

níjïTROfifiCCIOÏcI

En el curso de una investigación preliminar acer­

ca de la dispereión de bacterias esporuladas nnaerobias

fermentsdorcs de hidrñtos de carb>no, encortrdmos una es­')

5‘) Q .Jpenie aerobia ¿ltrtivü, gran productora de gas, cuya iadentificaciói fue relativrwente f50il.dn un principio prouyectamos rea izar un trtbajo de tesis estuliendo l? varian

ción de las propiedades biolófiieas de dichas bacterias fer"montadores aerobies provenienteo de distintos "habita s”

en la naturaleza, por entender que debia ser muysencillo

su aislamiento,tan difitiïtg fue la realidad que decidimos

llevar a cabo en ese trabrjo, un estudio de le dispersión

de dichas bacterias, lo que importó, previenente, el estu­dio de los métodos de aislamiento

J(l) Jn el preSenue trabajo se utiliza el término”fermenteución" para inlioer.la formación de ácido y gas e partirde hidratos de ocrboeo.

.C. .112..I-.T__-U_.I¿_9 LI.n o ..- g.-. q... ..—

ÑESEUQLQ..D.ELa literatura sobre las especies del género Egpillus

fermentadoras de hidratos de carbono no es muy abundanteni muyclara.

Distintas especies han sido descriptas o incluidasen este grupo.50n ellas;gliqatrigiyflz.¿some/1% Pra zmow‘ski1880­

fiqgiiigq_ïggieeggggiige Russell 1892 (considerado sinóni­mo de B.polymyxa por Gottheil 1901

QïñfiïlQPÉQÉQÉ.ÉQLK%ÏZÉ Beijerink 1893Eggilige_egpgqgeropigs Migula 1900 ( considerado sinóni­

no de B.polymyxa por Gottheil L901;Bacillus polynyxa (Praznowski) Migula 1900Begiiiquagterqqgorgg Migula 1900 ( ¿stasia asteroepora

Ïeyer 1892).grgqqiooqcterJgoquxgq_yar. mucosumy var tenax Beijerink

Van Delden 1902

3.3.2.1.11.9.b;_.3619_l%111}¿í. .e.o__e.t_9..r_1.i.9_}¿5Bréau dat 1906

¿3223338.35É610a12qms._31212€;-Iéeeilyezra.¿213429.14em“Basi.­¿ngugioqïriqioiqeg descriptos por Hasselhoff y Bredemannen 1906 y considerados yor Bredemann variantes deimgigg—terosporus en 1909.38.93.1128..¿melzeqltilgfi Voisenet 1911Bgoiilgg_gg;lgzïg Beijerink y den Dooren de Yong 1923Aerobacillus_gplxgz¿g(3r¿znowski) Donker 1926íiezppeszifllluss. .v_1.<.>.1.a.1:i_u.-'-9.( Breau-dat ) Donker 1926

.ele_1.".932ï19}}.1.‘215r.ÉÏÉKEÉQÏYlÉ-ï.-(‘íeïléenet ) nor-Iker 1926,o

.ïkïgi.l.l.u¿.esnrnelaoïae Greer 1928242.921.122 ..9?CQ%0.1¿11}2¿L..1.Q.L&5;Pribram 1933 (.ïéégillfié;.Mcpifiiefi

var=.9ma_e.?c_l.1xl_ii.c.aía'J'Iasner 1916)¿moler-.6.Corbet1930

QegiiigewflaqenÉLS Schardin¿er 1904Baeillus qcetqetnyiigng Horthro*.Asche y Senior 1919

.QSLerobacii __nqgerqnq uchardinger Donker 1926¿1929.b.aï9.íi.1l.U-fi.«ac.sü¿9pjü.iw;l.i.c1ae ( Northro 13) Donker 19 26F cillus“tngpnggfiyigiïfiigne Coolhoas k1928) según FoïüerE._.--:‘¡.h Y 'n h , I I i lmuyetnilcr al b. macerans pero mas termofilo)zïggpqqiiingmnqqengng (Schardinger) Kluyver y Van Niel1936

Basi] .5.musa112124399312'F-isenbere 1942

Donker (1926) incluyó a la mnyoria de estas eSfecies den­tro de cinco solamente y dió la siguiente lista de sinó­nimos:

l- nerobacillus polymyia ( Prazmowski)DonkerSinónimos:_g¿gqy;iginnukqix@XEg Prazmowski

Ezraïikalgheqte}:¿(11121522E Beia' erinkBáiiállüillglmïffi Beiáerink y denDooren de. YongBaciilus asteiospcpue (¿eyer)ïigu1'

2- ¿eïqhggiilus acetoetnglicus (Nor'hrop) DonkerSinónimo: Bacillus aceioethylicns Northrop

3- .1.:-._e.I.ïQ.b.ï=l°.i.1.1_.U.-f=‘__ï?1%9.€.ï.9.ïlfi( Schardincs‘or’ vnker

Sinónimo; Bacillus macerens Schardinger4- ¿ae_r_ojea_c_i.l.l.u.:s;.xiolsaïgkgn( Bréa'=-dat > Donker

Sinónimo; ÉÉÉLÉLRÉ.ÏÉQÉÉÉÉEÉMPEÉÉQHÁQRQJB¿e&h“dat.

5- .4':_<2.I;o_9e9.i;¿.1¿1_s_.aszagzáqayésae(Voisenet )DonkerSinónimo: Eggiiigqügmingqnïigg (Voisenet)

Ïorter, Ho Cleskey y Levine(l937) incluyen a todaslas especies en dos "rupos% uno del g¿_ggixglzg y otrodel g¿_ggggggngque diferencian en base a tests" fisioló­gicos. Los sinónimosy las características de diferencia­

ción que establecieron son las biguientes:1 ¿erobaciiiqe“yoilgzïa(ïraamowski)D onker 1926

Sinónimos: gigggriqygglgggygga Prazmovski 188092e22229e9teeueekneree fleiáerink 1893

gaciiinaugoixgxfia Eeijerink y den Dooren de Yong 1923Bacillus asterosporus (Meyer ) Higu1a1900) especie tipo._-un... _-r. . -.-.-.-. -... --—.—

Bacillus mycoides var_9ygaggnxiiggg JagLer 1916Eeeillee_eeaeeeeage Creer 1928Caracteristicas fisiológicasv VonesProskauer positivo

Ramnosay Sorbitolá ni áci­do ni gas.No crece a ¿5 9 sino a 209

° ÁCÉQÉQEÁlL%É.QÉEÉÉÉEE(Schardinser> vonkerSinónimos: gagiiigg¿fi¿ggrang ó chardinger 1905

especie tipoBÉEÁilEÉJÉQSÉQQÉhïlÉQ%ÉNortnrop 1919

ÁREQgígiilERJíCQ?QQtFKLÉQ%ñ(Northrop)Donker 1926

Característicau fisiológicas: Vogeslroskauer negativv0.3aanosa y Soybitolacido y gas.Buen crecimiento a 459y no a 209g

Estos investigadores no pudieron trabajar con 3¿Xig¿a.332? ÉSÉÉQQÉSEÉni C°ÚÉ¿.ÉHÉEÉSEXÉÉÉPues las 09935 Origi­

'na1es parecen haberse perdido.El trabajo de Porter, McClekey y Levine es el más

completo de los que tratan de bacterias esporuladas fermentadoras y es el que ha servido de ,base a estudios poste­riorgs.

Él Bergey'a Manual (1939) considera, sin embargo, al3¿_Qan@rg comootra especie distinta deifit.golxgxïa y del.@¿_@acerans.Tambiénconsidera al Bï_yig;arigguacegonicgs,ÏbÉHÉÉÉÉEYÁBÉ9ÉL_9XQÉ;ÉÉQXÉÉEEÉ.y 31_ÉÉÉ9ÉRQÉQÉ variantesdel ÉxiRQleïñÉ Y al Ennéáíïïïïfillifiïï variante del ÏHHEÉ‘22229€"

En su edición de 1948 el Bergeyb manual supone al B.__na.ad:9.1:euna Probable Variante de _B.=...3e01.:z.m;y;x_asr al Bavie­

1alïiss.,a9.eiü_qr.1.ipsey 3.3.-.¿ïííïlïi9rllilíí Probables sinónimos delmismobacilo.Tambien supone al Et schuylkilliensisL descripta comoespecie en l942(posterior al trabajo de lorter)una probable variante de B. nacerans

É n lo que respecta a diferenciación fisiológica,Smith, Gordon y Clark no pudieron comprobar totalmente lasdiferencias establecidas por Porter para los dos grupos,pues trabajaron con cepas de g¿mgolynxïa que fermentabansorbitol y rannosa con producción de ácido y gas.TanbienLadingham, ¿dans y Stanier(l945) trabajaron con cepas dedicho bacilo que fermentaban r.mn sa con froducción de á—cido y gast­

Tilden y Hudson(l942) demostraron que las dos especiesL3¿ngl1ng a yflgflmgaqerans) pueden ser separadas de acuer­do a la naturaleza de sus amilasas.

Katznelson (1944) estableció que estas dos especiesfueden ser diferenciadas en base a sus requerimientos vita­Winicos pues en medios sintéticos, el B. glygyxa requieresolamente biotina, mientras que el B. Jacarans tiene nece­sidad de biotina más tiamina para desarrollar“

En cuanto a la unicación de estas esjecies dentro dela clasificación qeneral de bacterias: Donkerpropuso(l926que un nuevo género se creara para incluir las bacteriasesgoruladas, facultativas, móviles por medio de flagelospcritricos, con esporangio en forma de Clostridio, que pro­ducen catalasa y fermentan hidratos de carbono.E l sugirió

el nonbre genérico de gergbacillus Ïrihrgg(l929 y 1933)utilizó el mismonombre genérico de Aerobacillus para in­cluir en él especies que no concuerdan con la caracteriza­ción dada por Donker a dicho género.TambiénJanke (1930) hizo una descripción de ¿erogacillugque no responde a la original.Es sin onbargo, a Donker, aqu mmcorresponde prioridad en el nombre.

Kluyver y Van Niel (1936) incluyen al género ¿gropelC..i..ÍJ-.u.s.en la "oI"—bu__51a.qil.l.9ee. y colocan al .s=‘-.a.c_e_r.6}35enun ¿enero aparte dentro de lo nieta tribu

XI Tribu z Bacillael- gggillne Cohnn1872

s en 539%¿q3%9:¿áïïo?o?geinágááles, ya Jó­úe flagelos ¿critricos.Fornan endoeporassviles por n o

Óuinioheter ofvs oxidan v-rios compuestos orgánicnon capaces de fermentar hidratos de carbsno siendo el 2,3 butelene glicol y el alcohol etilico, sus principales;roductoe.50n gran p sitives.E epecie tipo; ¿erobeoillgg

221171333" ZIHQQÉQÉLÉEÉ90J°iïflh

Bacilos móviles o innóviles, en el priner caso flage­los peritricos. Forwenendoeporae.euimiohoterótropoe oxi­dan veriou compuesto“ o:¿ínic0e y son capaces de fer enterhiezgtoe de carbeno siendo los principales proiuctos obtenidos alcohol etilico y ¿cid acético.Gram positivo.Espe—cie tai-po _ïy¿iczï-zafi<zi}l}w.. .19:;?-..C.?.'+2=7-Z.1.. (Schardinger).

iEl Bergey s manual (1939) coloca dentro del gRacillue el " Group Lerobacillus" y en él reune las esoe­ciee que tienen la caracteristica de fermentar hidratcarbono con producción de ácido y gas. En este grtyoincluidps tree especies y establece la siguiente elecación dentro del género:

VI o...¿'r.e}:9.ba.e.i..‘+.l_9_=:=:90111201" Group

e. Ísgz‘a-sén.elzeoielzoieci¿las < Van Niel)89- 35.-..129_l;ï_ezí.x2

B. Subgenero: ¿inochillqg ( Van Niel)90o .-._;9.é-*-.r.1.sï.9.:91

91. Balacera-ne.El mismoBergey‘s ¡anual en su edición de 1948 conside­

ra, comoya hemos dicno al g¿_2;nqorg un¿ probable varian­te del B. polymyxa y hace del , polynyxe y delgnmnqqerengdos especies más en lo larga serie de especies del género

-\ .Baeillgg, sin tomar en cuenta le propiedad distintiva defermentar nidreto; de carbono que es comúne ambas.

31,3¿mnggngxágha sidonuy estudiado en estos últi­n s años porque produce, e partir de hidratos de carbono2,5 butilene-glicol y etanol.

El 2,3 butilcne-glicol tiene ampli? ¿filicación indusáïïütrial porque puede ser convertido en butadieno, precursoresencial del caucho sintético y también por su propiedadde no ccngel;r( usede en anticongelantes).

El butediano que se obtiene ¿odiantc este fermentaeición tiene la pa ticularidad de ser un isómero puro, levo­rotatorio, con ( *.)56: - 13,34 ( Heish, 1945).

Én Canadá esfecialnmnte, durante la última guerra,:fieron estidiedas las condiciones de 'ejor rendimiento

- -'. J ' 1 ' .. .. ...,. ' I . - . _industrial de ¿a fermenu501on por B. polymyxa.TI¿ambiene: cit; en le biblio¿rafia al ïtholxnïïg como

/productor €e la polymyzine, un antibiótico activo sobre"nf ¿ramnegativas.

e

e

El En q_ceg¿¿g tiene la propiedad caracteristica ymuyinportante de dar dextrinas cristalinas no reductorascomoproducto de degraración del elmidón.És la única enzi­ma conocida en l: naturaleza capaz de darlas. Schardinger(1908) fue el :rimero que estudió y obtuvo dichas dextri­nas.1aubién Eilden y Hudson(l9399 1942) y Kerr (1943) tra­bajan con diche enzima.Tratan de establecer si las dextrimnas obtenidas por su intermedio (ci y A ) son verdaderoscomponentes de la molécula de almidón.

Con este becilo se obtienen ,como productos finalesde le fermentación de azúcares, acetonu y etanol, por loque tiene importancia industrial,

También se conoce al g¿¿gígergng por tener propieda­des enriadoras.

Del ÉLQÉnQQEÉ,quesegún Corbet, es el bacilo responsa­ble del importante Cambio que ocurre durante la coagula­

_ lo ­

ción natural del flgyeaIIatqï,no nemosencontrado posterio­res trabajos

Tal es el estado actual de la li;era'ura de las bac­terias estudiadas. EllleChO de que su posición sistemáti­ca nollaya sido aún definitivamente establecida y el deser las únicas bacterias esporuladas aerobias que fermen­tan hidratos de carbono con producción de ácido y gas,mien­t as las anaerobias del mismo¿énoro presentan este hechocasi general, son entre otros motivos por los que el temacuyo estudio iniciamos, no está dosprovisto de interés.

.-¡..¡.’ . . .. _ -v-.

_ 11 _

C 1;er .1.2.9.9.2 SLI.munn-¡.-_.._...a w...-...a... ____.__,

El estudio experimental fué realizado para conseguirlos objetivos expuestos en el plan.El encabezamiento y su­cesión de los distintos problemas planteados determinó,comoee natural, l; realización de ciertos experimentosque se exponen a continuación.

l) ¿MÁQÉEÏLÉJÏ-lfl.(1.1.9?¿35/1119 9.0.1lïlïb'lt 232?: Elf}; 5:.¿enigma A? 33-1391:wa y macerans de ;-'=1*?;Í5.9ï11‘.13:.1_.e.á..<?-_9.-.laRÉÏGEÉQJFEE _,Sas;

Los métodos generalmente usados para el aiábmientode bacterias esporuladas aerobiss tienen aplicación direc­ta en Remi-¿mm yB-_,1r1<39?raee­

Los principios en que eutos nátoáos ee basan son losque fluyen naturalmente de las propiedades de las bacte­

,...J.rias esporul>das en su forma de esporas. Consiguen:l) En producir la psporulación de las bacterias2) En destruir las formes vegetativas e una temperatura

inferior a la de la muerte de las esporas.3) Siembra para el aislamiento

En cualquiera de los tienpos,antes o deSpuee-del gri­mero, o antes o despues deltercero, se pueden utilizarmétodos de desarrollo diferencial que son conocidos comométodos de enriquecimiento.

La aplicación de los métodos, expuesta cn forma ¿ene ­ral se hizo de la siguiente manera:19) El primer experimento consistió en poner parte delmaterial de ensato a secar en estufa de 509 en ca as deJ

Eetri durante 48 horas más o mcnos, con el objeto dc ha­cer csporulnr al bacilo y parte se utilizó en condicio­nes naturales con el objeto de comprobar si cl bacilo seencontraba esporulado ya en la n turaleza. Luego se pas-­teurizó el material y se n¿ntuvo otro parte sin pasteu-.rizar para ver si tanoi n así sc ¡odia aislar aerobacilos:

Material de fiEnsayo.v’/- \ *‘.

. " " \‘Secar a 509 Natura;

\ qin 1/.Pastcúrizar iastouri- “asteurl_ Pastemrl'

zar zur y zar.10' -809 10)«309

Est s muestr¿s oe incubaban en celïo lactosado a 379durante 48 horas. Los tubos que crogcn ¿ban fermentacións: sembraban un Czjfis de Úndo, ¿gar Rojo Neutro (rccomen—dado por Ledingham para ¿islor É. polymyxa) y agar extrac­o lactosado con BromoCresol Púrpura. Se ¿islaban las co­

-onias que acidificaban el medio o que tomaban el color enel caso del agar Rojo neutro. i

29) Otro método en el que se toma en cuenta, a mas de lacaracteristica del bacilo de ser esporulcdo y fermenta­

dor de hidratos de carbono, la de ser anaerobio facultati­vo:

Secar el material a 509(para provocar la es­porulación)

Calentar a'809- 10'

Siembra en Lnacrobiosis Siembra en cajas aerobias(Lactcsa) (Lactosa e indicador)

si fermenta si vira

Caja aerobia Lislar en anacrobiosis(lactosa)

- 13 _

39) Otro método semejante al anterior:

Secar el materiel a 509 "QQ%:th[ Enriquecerloen caldoSiembrï en "n“erobio­

n ,3 .J Q Q w ' . z. c. (A03°“r “ 50 —-m——u—"80 lo SIS (lactosaMezclar con

. J.-. ... «a...

tierra seca Siembra en Aerobio­csteril en ca- Sis(Lactosa mas 1nd1­ja de Petri) cador)

49) Otro esquema de aislamiento que se siguió se besó enel hecho de que el becilo es un esporuleJo que desarrollaen aneerobioeis y se trató de ¿is erlo comotal:

Material netiral lo llamamos(l)Material secado e 509 lo ll¿mamos (2)

(para csporular)Se siembra este metcriel en caldo lacto

lO') durante 48 horas con el objeto de mcer d sarrollarsado ( hervido

e

las bacterias anaerobias. O sea:Enriquccer (l) Obtencmos (El)

" (2) Obtenemos (E2)

Luego Siembra en placa con 20 c.c. de a­El n_._ 'Secar a 509. gar en diluciofi

_Siembre en tubo de agar en profun­didad ( herviao lO‘)Siembro en p1c0e con 20 0.o. de a­

_ /, gar en diluciónE Secar a >09 - . - A i . -. . , ­g-.lm SlGMDrLcn tubo en grofundided(her­

Vido durante 10')

íumeroeos ensayos fueron hechos con cada uno de losmétodosïeecriptos, utilizando meterielcs diferentes; tie­rra, desperdicios, agua de cenille, son; de elbañal,zanaho­ria, papa, czucariachicoriL, trigo, haiz, abono, cáscara de¿rveja leche, flor de limón,acclge_renoleche, ccbolle,porrocoliflor, cáscara de naranja, flor de heliotropo. margaritamelvón,geranio flor de conejito, flor de cebolla, rosa, ru­da, cala,iloja de enredadera, flor de romeopasto,papa des­compuesta etc.

_ 14 _

El total de estos ensáyos entes de llegar a a elec­ción de un metodo definitivo fué de 150 más o menos, loque, como puede compreidcrse, llevó un trabajo de variosmeses.

Es comprensible también que, en la elección del ma­terial de la naturaleza primers el conocimiento,nunqueescaso,que existe en la literatura acerca de su habitat"

Por otra parte no es dificil, a priori, suponer quetales bacterias esporuladas tengan une difusión extraordineri; cuandosu principal"nhbitat es la tierra pues sudifusión bajo fornes de expores permite su permanencia enlos mis diversos materiales.

La existencie de bacterias esporuladas aerobias pro­Iv o CJ U. Hductores de Wes, que ÉJHto B polymyxa,B.me 3­

rans, u otra estecic desconocida, fufi investigada, desp­pues dc muchosfrecasos, por el trocedimiento adoptado fi­nulnente que nos jerritió hacer hallazgos positivos en la

l — .gran mayoria de loe1nater1el's enseyados.Antes de adoptar un método de aiil miento definitivq

tomemos en cuente todas las observaciones que los ensayosanteriormente descriptos nos pernitieron hacer. Pudimosdeducir por ellos que no era necesario secar el materiala 509 puesto que las bacterias ya se hallan esnoruladas

Ien la naturaleza con lc 3 al acort nos la duración del me­todo de aislamiento en 48 hores nás o menos. Además, en llos primeros ensayos utilizábamos n terinl pesado de cadauna de las muestras ( l o 5 gr.).Decidinos despues que es­ta cantidad era excesiva pues la abundancia del bacilo enla n?turaleza es tel que permite obtener aislamientOspo­

sitivos con. muypequeñas cantidades de muestra.Suprimi­os la pesada inicial y en vez de suspender el material en

agua estéril y, despues de agitar tomar 5 ml. y llevarloa tubo esteril donde ee lo panteurize lO' a 809 y luego

pasar al medio de enriquecimiento comorecomienda Ledin­gham (1945), decidimos colocar el materialdirectamentc enese medio y pisteurizarlo inmediatamente, con lo cual el

_ 15 _

método se hizo mfs práctico.Tambiénconcluimos que se frcilit ba el aislamiento

1colocando el míterial en un medio de enriquecimiento masrico que e caldo 1 ctosado y adoptanos el agua de leva­1

dura lectoeado o ¿ua de levadura salieina por h ber ob­servado que, ;or lo menosel 3¿_leïgxïg desarrolluba mu­cho mejor en ese medio que en el anterior.

Ademássuprimimoe la siembra en ¿gar extrrcto lactosa­'1do con 3romo-Cresol-Púrpura porque la acidi cación delp.

.L

ucdiose efectusba en ¿mpli¿s zonas o por toda la caja sinindividualizar e les colonias acidificantes. Sembremosen­tonces en agar rojo neutro porque allí podíamos individua­

4lizar el_j¿upolquïg y en Ende porque pens.oenos que allípodíamosaislar tento al 3.;Eolygxre comsel_3. nicerfing .

Las cepas aisladas en todos estos casos fueron exami­nadas pere deterainrr su naturaleza utilizando las siguien­

ates propiedades fundancnt les que sirven p:r¿identificaro distinguir al Q¿Mtogfigzfiadclá¿¿yg¿qqyls (reacción dede Vogeséïroskaner, crecimiento a 459 y desarrollo enSorbitol y Ramnosa).Las cepas ailedas (19) resultaroncorresponder u ;&_¿5gfiggggi.

La falta de crecimiento de 3¿_n;eerans en todos losensayos realizados, nos permite concluir que los métodosgener les para aisl miento de b>cterias escoruladas notiene aplicación Esra el u'slamiento de B. macerens.

2 ) Estggig_@ejnétodos apropiados_pqrï“reconocer_lamessage“; La estirar 01--”islami ent o. 51.6..J.3.«_._3¿Q1M_X.ea­s­.-...... .....

Keep-.139}..El examen de los resultados expuestos y otros más ob­

tenidos d spués, nos pa“flitió estzblecer un métodoapropia­do para reconocer la presencia asegurar el aislamientode 3.301ymyx: de todos los asteriules ensayados vinculadosde alguna fiancra, al suelo.

El método de aislamiento adoptado que resultó selecé

-16­

tivo para el B. polïggre fué el si¿uicntc:19) .gigqbrí de; ¿átgrigls una pequeña parte de l“ mues­tra se coloca en tubos de a¿ua de levadura leetosada oagua de levadura salicina( Greer, 1928).Estos tubos tienencampanita. Antes de incubarlos se los somete e la29) lïgteurigggién z en baño maria c 809 durante lO'39) ¿Enriguqciqientoslos tubos pesteurizados sc incuban

e 379 durante 48 horas.49) gbseryícién de los tubos que prcnenten fermentación59) giggbrg del msterial de esos tubos en c ¿as de agar

agua de levadur¿ lïCÉOSFÓE con Rojo Neutro o de EndoQ_serïqeián de colonias rojas en ambas cejasAislamiento y siegbra de estas coloni¿s en estrie de

agar a¿ua de levadura l ctcsadc con Rojo Neutro y entubo de agua de pepton? lactoseda con campanita.

89) ¿Exige?iáisaqién.-.del. 319.133.119.212= 1:: Presencia de espo­ras en el ¿gur estria y lu presencia de ¿cido y gas en eltubo de lactosa identifican al Cerobacilo.

33151395?ón.i019l....1zec}}.q=se Risk-ron 22.--;qelgzmdetierra,maiz, zanahort ar e35, lino, chaucha,apio, remola­cha y papa podrida, lo que indica su amplia distribución.

.131‘221.ïad.ï-.-.<19s

Una vez en posésión de un Jétodo de aislamientode gL_RggnggÉnos fué posible realizar el estudio compa­rativo de sus propiedades con le finalidad de establecerlos límites de posible variación de las distintas cepasde B¿ polymyxe aislados. Tambien se solicitó 3. polymyxasy: cl sificcdrs a distintas instituciones con el objetode com;ar.rlas con las obtenidas en el laboratorio.Sc tra­bajó con 28 cepas, la procedencia dc las cuales es la si­Huicntc:U

-17...

N9 de Copa Procedencia

1 tierra de jardin2 H H H

3 I H H

4 H H Il

5 ll H H

6 Maíz (Zea Mays)7 Zanahoria (Daucus carota)8 Chaucha (Phaseolus vulgaris9 - ««_u-—m«m-—w—vmuwu-«-Arveja (Pisum arvense)

10 Zanahoria ( Dmlcus carota)ll Tierr¿ de jardin12 .. _ - _ ._..-.-_.._. -_-__.._ H n n

13 —m-—— Lino (Linum usitatissimus)14 Papa macerada15 - — —--———- —Remolacha (Beta vulgaris)

16 —-m—-«"——-*— - — -—-—Apio ( Lpium graveolens)

17 —-———"-“"umm—- —-— Papa Mgcerada18 .._._.__ . .-. __.... -- -_ ___ n n

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8523 l..T.C.C.(Es’tados Unidos)8519 L.TtC.C. " "7070 A.T.C.C. " "455/5 Div.of bact.and dairy res

(Canadá)C 42/3 __i__- ........................ _ n n n uC 2(1) -—-- " " II u

47 ___. .._ u n u u

331-1 Instituto de la NutriciónBS.AS).

19-2

-18­

Hubiéscmos deseado trabajar tambien con cepas delas bacterias designadas por 3¿@Egnqor¿yQLuscnnX:lgillicnsiis va que su sinonimi: no es aún nuy clara pero no las

Con estas cepas hemos podido coaprobür lo dicho cncratura sobre este bacilo.El bacilo polymyxa os un bacilo Gramnegativo,fino,

c Present; ¿encrvlacnue aislédo, raras voces en cauc­gorqu es;orvngios tipo clostriiium, la capora c3 cen­

tralo :lvo excéntrica ( os muycomúnverla en forma dc ra­lar csporas son grandes, ovoides, con p rado; teñi­

blcs más bionCrCn positivas. Se puede ver tanbién cn losprcpïrudos, bacterias sin teñir. Son baciloe móviles, conflagelos peritricos.

Essaltmllo ..d_e.1....'r¿ï-".C.j1.li9.311.733.651.195.-sóli.@9.%=.­

¿gar gïtr gta: las colonias en este medio, a las 24ho'as son chicas, ¡ás o nano; circul rca, convcxas, bri­llantas sapcrficic lisa, color blfinquccinoo transparente,borde irre¿ulcr, estructura finahcnto ¿ranular.

.ngrmgrtrgc g 5¿j¿_2a: el crecimiento es escaso, blan­quecino o transparente.

iggrflggjgfigtg ¿lgflqsggo el crecimiento es muymucoso.

!a¿€;r..-.€u<5.tl.ï«_..sí5...l.eñca.d:sa.LL.1.e-.9.t.o.s¿a.®1_9.o.r1..3910“.-1"Ï.2I.1.i%:9 Colo­

nias circulares, elevadas muyconvcxas, brillantes, muco­sas, borde entero toman cl color rojo del medio y son di­fícilcs de disolver.

¿arisriazsvs -É?;_1._‘v;Y:-1‘Éï.u.11ï..l_r-*-..c_’s.9..'-2ai.ü.9__c_r:_-_n_.__3_0_379.¿{Quim mida)

el desarrollo cs iuy y undLL'c, brillcülü espeso, colorrojo o rosado, de consistencia viscosc.

¿fases-I...c-.g¿aï¿_9.2,l©x:. -.1_ï—.=.9_i.:._0.9.r¿30.3.0...l*3.ui1:9. ( Función)fermenta el agar lo que significa us desarrolla bien enanacrobiosis.

_mgqlgtiní licuan cn forma estratiformc, cratcriformco en dedo de guante. Alrededor del séptimo dia dc desarro­

llo licuan totalmente, algunas lo nao n más lentamentefake inoculgndo un; papa con una suspensión de B.

_golfig[¿g por medio de una pipeta Ïasteur, se puede obher­var que e ella fernenta al par que se licúa prcoontandoun líquido pcrdo.Eete líquido se SC¿reja por el punto deinoculación y allí se endurece formando una costra.

Tambien ObSCÏVhÁOSque senbra.do el bacilo en estría

11'. -—m..r _J;.

dc napa cruda ( cort¿da sterilmentc/ y en estria deÁ esterilizada en uutoclave, se ;one par a la papa cru­da y queda complet.mente blanca la esterilizada.

‘zñngnorig: buen desarrollo, es;eeo brillcnte viscosotransparente.

.De_::s.a.r:=.::9_l..1,0._..e_n_..}1r1d.i.0.S..._1.Í.9L¿i@.qg

gqlqo.ertrggtgo ligera turbidez, no forma películafii.@.rgï.gs¿...qï_9¿Gabriele

Almidon : fermenta ( más efectiva la fermentacióncon N orgánico que con el anoniacal.

Haltosa: fermenta( iguálucnte efectiva con N org.que con ol amoniacal.

Dextrina: fermenta ( algo más efectiva con N org.Glucosa' fermentLactosa: ferqcrta ( mas efectiva con N org.)Sacarosn: fermentaMelibiosao fcrmenta¿afinesz- ya seu con Ñ org. como con el amonia­

cal el E¿_Bglxml¿3acidifica el mediosin producir, casi practicamente gas(El Bergey 's manual dice que produce¿cido y gas’.

Dulcitol; no fermentc.lgggg_ Reduce. En lrs primeras exteriencias que realiza­mos con las cepas citadas digirieron sin coagul r pero enlas realizadas áltinanente co:gul"ron y produjeron gas.¿X33?.QQEuQxÉPQQQÉR-QQNQfilQÁQabundante fermentaCiónEma. 2 poi'si"üiv0Indol: negativo.

Reduce N03“ a no;No produce SH2No utiliza QÉÉÉQÏpQg_flg como fuente de carbono

9.2.3.9}.17-11531111‘23‘:.Éc;:3m9.r:;;t.tïlt€ï-.531-1121.@11t.9=f= 24 horas no seoñscrva desarrollo;despues de 3 o 4 días el desarrollo esmuy bueno.ggggámgqug¿í_ííg a las 24 horas no hay desarrollo.Conpro­bamos que, de los nodlos ensaysdos, el JCJOÏ para el desa­rrollo del B. polymbx: f1é ol preparado con levadura depan autolizadr, yuptCAJ, 1 ctosa y Rojo Neutro.

B.POLYMYXA

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Despues de muchos sucesivos pasajes por agar aguade lcv*durs l ctosado con Rojo Dentro de las ceca'g¿nglx¿xgg estudiadas, en las que sielpre a; rccisn colo­nias bien rojas, circulïres, eicvrdas y mucosas desarro­llaron, un buen día, :n l: gran mayoria de las cepas dostipos diferentes de colonias. Para ccrcidnrnos de que nosc tr taba de una cont minación volvimos a preparar cejasy nuevflflcnte obtuvimos los tismos resultados. Decidimosentonces estudiar estas dos v ri.ntcs y ver si se mente­nian estables y si se observnb:n diferencias en las pro;pied dos bioq:ífliCíS ¿e sebas.

Ledinghmm,nd:üs y Stenier (1945) hablan de variantesen este bacilo, diciendo que la; Carácter sticzs del cul­tivo oriüinsl fueron extrcsodanensc variadas y, en lasúltima generaciones s; disociaron en VLTiOSti os,Noso­tros no observamos más que dos tipos bien diferenciadosde colonias y, en algunos caSOs, un: v rirble intermediacon carpctcristicas de uno y otro,

A las variantes obtenidas l.s denominamosEipg_l_ yTipo g y las caracteristicas dc las colonias de ambasson:en ¿FET asueiss.lsrid¿ïs L Qt’saQQ..RHM3Q19_ÉEÉÉÉ9

Tipo l: colonias rojas circulsr=s, elevadas, convexas,bor­de ligeramente onduludo, esposas, brillsntes.difi­ciles de suspender en agua y medios de cultivo.

Tipo 2: colonias transparentes, con puntos de relejo azu­ado brillantes, no convcxas, borde algo irregular

no mucosas, fÏciles de suspender en agua y mediosde cultivo.

ensesrsiresïae. se seres.Tipo l: colonias blancas, circulares, chicas, convexasy

brillantesTipo 2: colonias transparentes, chicas, circulares, no con­

vexes, '

-26­

En amboscasos las Variantes son ffciles de identifi­car por el color. Microscópiceuente hemos observado quelas colonias Tipo l( en agar extracto) corresponden abacterias casi totalmente esporulrdas, mientras que lascolon'ns Tipo 2 a bastones sin esporularKEsta observacióncoincide con la hechu por Mascotti en una publicación re­ciente(l950).

Respectoa le estabili'ad de estas veriantes, ade muchosintentos, no hemos podido observarla.nl repifiucar una colonia de una variehte dada, obteníamos, sin re­gularidad, ya lr mismavariente en forma pura, ya 1° otravariante oía veces,dos tipos de colonia un: de las cua­s

les parecía internedia por sus características, entre lesvariantes pues presentgbs aspectos comunesa una y a otrao tanbien observr os colonias Tipo l y colonias Tipo 2, ha­biendo partido sieapre de una sola de ellas.

L pesar de este, y nientrns conseguíanos una variantepura enseyamos estudiar sus propiededes bioquímicas, sibien no pudimos constat r si el tipo de variante sembrado,

se mantenía en el no io líquido inoculado.'e en el cuadro, no obtuvimos dife­

6

Comopuede observarsrencias apreciables en las prepiednfies de las variantes.

26(61'1)

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3 >ES'F FEQLQ-519. .mÉ‘ÏQdPfi. ..’-ï‘-.2.3.1".9,ï:‘.i_5-.É1.0.5. :..1.".¿'-..1109.949.991: .,1É; .PEÉ"

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’ -. ,_ - -a) Fraceso .€19_332:"2E1..ïl%?:2r.932ens:mos-“8.2.-91.e.s_012129.1.0..n.

Ya hemos comentado en elcapítulo anterior como ennuestros primeros ensayos pensfbñmos:isl-r con igual pro­abilidad y con el mismo método, ye E1391X3x55, ya E¿mï­

cernns y cómotodos los brcilos fermentadores obtenidosresultaron ser exclusivnlente_fi¿polymïgg.

Ante la dificultad de aisl r Ï¿_cherfins por los méto­dos gcnerales empezamosa buscar algún método en la lite­ratura descripto p:r: ese fin, pero tampocoencontramosallí ningunï técnica indicada.

Decidimos entonces conseguir cepus de B. macerans dealgunas instituciones estudiar su biologia y ver si porello se podi: deducir ‘lgún método dc aislamiento.

' as cepas que recibimos teninn un desarrollo excesivavamcnte pobre.Nuestro primer problema fué entonces tratarde conseguir un medio de cultivo adecuado a su desarrollo.Ensayamos pc o ello sembrar les cepas en los medios de cul­tivo más diversos, por ejemplo: agua de levadura lactosa«da a distintos pH; extracto de Balta a distintas dilucio­nes; infusiones de higo, zanahori”, uva, remolzcha tierra,tomate, fruto de rosa; en mznzan , jugo de naranja, huevoextrrcto de carne, ¿gñr azul de Hetileno-eosina, medio deSalle, medio de Voisenet, medio de É ndo, al¿unos mediossintético etc.

En todos ellos obtuvimos siempre el mismo resultñdo nerg¿tivo.H;st¿ que un dia,h:ciendo e;sayos de siembra enpuré de papn con CO3Ca, despues de v rios pzsajes, comen­zaron a desarrollar bien todzs l(s cepas. Se volvió a repe­tir el ensayo y nuevamente, despues de sucesivos pasajespor papa, partiendo de estrías póbrísimas se obtuvieroncstrias de desarrollo bueno. Ya creíamos h ber soluciona­

.¡do cl problemn dcl ocscrrollo del. 3:._.¿11.€¿c¿c_rea.r__1_scuando, l

onsavar la fordcntrción dc ¿Líc.rcs con cstïs spas vimosque ninguna de cllhs los fcrïcntlbsn.8upusimos que h bíanperdido su :ctividrd cnzimftics o intcn (nos re2ctivarloscon "host shock" o con sicwbrñs cn otros Acdios de cultivodistintos, pero no conseguiïos cl objetivo buSCñdO.

Todas las cogus presentaban lr otractorísticc dc mace­rarlas pa as inoculqdas, sin cib¿r¿o, dichas papis, no pre­scntrron nunca 315405 de forncstrc1ón, ni s: puio obtenera ptrtir do cllís cnziu: c paz de ÏÏÍJSÏOTEÏT 51midón cndextrinas CÏiLtLLinCS. Úospuos dc VfiriCS observ201onos llo­grfios a la Conclusiós oc que las cepas con que ostchmostrtb ¿ando pertenecían al E¿ guailqs,copñ con lt que se noshabrian coutoninñdo tOdOs los 3¿_ggqotigs cn las dos ve­ces quc croimos h"borlos rc? tivado.

Este hecho ÁLDÏÚVOdesoricntcdo nuestro tr bajo duran­te arios meses pues nosotros trrtÏbazos de aislar dc dis­tintos a terisles, las colonias que Ascer.baulk papa conlas característicos obscrvadas en las papas inoculadas enol liborptorio con 1=s cagas que, equivocadamente, creímosser 28.:.¿2599.1:sï.11.8.«

Supusiuos que le pag: sería un buen medio dc enri­quecimiento p¿ra dicho bacilo y, csi, por ejemplo, un en­sayo de aislamiento que prncticamos_c0usistió en buscarpapas podridas con las caracteristicas ya mcncionadas,yde allí preparar suspensiones en agua «stéril que luegoPCStcurizábamos y a'slfbamos s*gúr ol método descripto enel cn ítulo antcrior.

Otro procedimiento comastió cn tonrr pcdscitos de li­no cnriado ( ya que al B‘ maccrrns sc lo cita por sus pro­piedcdcs enrizdoras) y colocarlo sobre una rodñja de papacruda cortada cstorilmente cn cnjr dc Petri estéril, incuwbar luego v trrtmr de aislar Ellí donde la papa se presen­‘J

tase macerada.

- 2 9 _

Estos estudios, antes de llegar a l: conclusión deque -et'bamos equivocados, nos llevrron más de medio año dde trabajo, viíndonos obligados, despues de este tiempo, erecomenzwrlos desde elprincigio.

Nuevamente obtuvimos ceras de B.macerans de E.É.U.U.y comenzamosa traba; r con ellas: Éste v;z mentuvimos lascepas en medio de avena y CO3Ca ( Tilden y Hudson 1942)y tuvinos muybuenos desarrollos. E stes respondian, porsus reacciones, a l descripción del B. n cerhns dada enla literatura.

Comoprimer intento de "isl miento, enseyamos recupe­rar estas cepas des;ués ¿e haberlas mezcledo con tierrv es­téril, o de h*ber inoculcdo papas con ellas;

_ lcvteurizar cajaestufe ° u»unas gotas P 449r 909-10'Tierra es- de una sus- ' _,

. '9- _‘ . "‘“W' hasta.teril yen51ón de secar 1“' (4 _..l'uB.macerans . F- tierra con

el objeto No pasteurizen_ cajade hacer es­porular albacilo­

Pasteurizar._mfi caja909-10'

r1 ñ '3 .._ . hPapa ino- lOWÏTmLte ÉstuIarihl de e- ñ oculada conrwhm- . fl ñ ‘ (a 44­

PI” fi Sa, Pr.p:.. y "hn-'B./uceruns _ n.. mezclar con N , t M- ñ.

tierra estéril :ñghs euL1fi“a_caga(­

TomarmaterialP1 . inoculfidï de 161 ana .

(Pe ¡n La: -**r i L°‘ Iï* y ---——_Pcst.e ‘ caJecon B. LaCCÏunS hecer un“ sol. ¡mmm.. m . acuosa 90%-10

En los tres casos e bncilo fue recuïerado.El segundo paso, en nuestrointento de recuperación del

B. macerans, consistió en mezclar tierra natural +_gggagg;Egg y tratar de recu;ernrlo.8eguimos un procedimiento ana­

-30 _

logo al primero de los descriptos nís arriba,pero el ba­cilo no fue aisled0.Intentanos otra experiencia vrliéndonosde l? propiedrí que tiene c1 orcilo de ser 1n’erobio fa­cultativo? p“rñ ciïo, nczcl nos; 3¿_ggcgrqns + BLQQiXEZEQ( ambos annerobios fvcultïtiVOS) + fi._ceregs 4'g¿myggiqes(aerobios absolutos) con tierrc cstéril.Sembrruos por di­lución en en.crobiosis en tubos de ¡gar agua de levaduraque h bien hervido ¿ar nte 10' Despues de 48 horas de in­cubados, reunimos eltubo y SÍC'HdOmeteri l del fondo delager con un ¿nsn,nicinoe pl ees(:erobi s). Según lo previs­to, etnggxeoiges y el Éfidccreqs se habian separado de los

.53otros dos en el cuitivo n erobio, y, en lis cejns ¿ueimosreconocer las colonies del gtjificgrgng

Teniendo en cuentr c1 resultado anterior, pensanosrislar alfi¿n¿qsr¿ns de la n turaleza wediïntc un procedi­miento nnálogo.Elreteri51utilizado fue tierrr. Pensábamosenel primer pïso(cultivo cnaerobio) eliminzr las bacgeriaseerobias y en el se3undo paso( cultivo en cejas cerobinsdel materixl anaerobio) seleccioncr las bacterias acrobiasfacultativas.

Sin embrrgo, tampoco con este ensayo obtuvimos resul­tados positivos.

Todos estos fracasos se explicerian por la exigenciade elementos nutritivos que :resentc cl bacilo para subuen desarrollo, pues, hasta est? altura de la tesis no em­3leanos el medio de avena( que resultó excelente para elcultivo del g¿¿qqcerqns ) para enriquecimiento, en ningunode los experimentos.

_ 31 _

bV 4’-pli.c.=ï._c.i.ár¿ p.115; .'.'=_:::.o.:.>.i.c:d.u.051;r.c_fü,0.ltí.5.t.i.qü .de_1..B..-.

mi"c eras _.(;21:qd.'46.0.ió.n_emm. ¿tics .de. .óqutrincïs "0.11155?­7. 2099.11.09. su. ¿arg-sm0.1.'. 9.2.1.1 .n;‘.t_u_1“..¿‘-.1.ÉZ?;_}L

3117€; "-39;¿Fil? -.=:1.i.91,1.t.q..

¿qui hicimos un brava p«r¿ntcsis 3 r. estudiar lapropicdad caractcriatisa deL fi¿qchpgug dc producir cazi­mos CPpces de tr nsformïr el almidón cn dextrin s crista­.in?s no rcductcrhs. Est“ enzinu,únicr conocida hrmt; hoyen la nituralcza, uirvc ;ar8 individualizar al B.uaco_nns

. . . . . g .. — . _ .Ientre todos las dosis csPLCios de bfiCtGÏiPS exiatentcs.

Ponsamn entonces afilicvr dicha propiedad cn cl ais­amicnto dclbccilo.0b crv nos que ost: propicdud ¿e mrni­

fest b: cuando cl bccilo desarrollona cn un ucdi rico co­no lo es el dc CVLMCcon CO3Ca.

Basíndonos en ensayos yz:v¿ns cn los que comprobamosque ni el 33.2.z.¿o_l.;«;íïl;y;¿_0-«_z.ni el .c.r¿I:0.=_1.tó.ni el say.c.o.i__d.«2:¿

producían dicha cnzimn, fuimos glanificando nuestro trpbamjo de la siguiente Jane afPusimos on cajas de Ictri,

. . . ShoreTierra esnéril + suspen51ón-m»«*»Estufa a 379wmuw4 Sde B.macerans ¿P.ra naccrlo

csporular¿

Tierra esféril + suspensión de + suspensión dc un“ EstufaB.maccrans Bmmycoides a 379

48 horas.

Tierra esteril + suspensión + su; cnsión .-mwEstufa 9379de B.macerans de B.cereus

--- 48 horas.

Tierra estéril + suspensión + suspensión ——uEstufa379dc B.macorans dc B. polymyxa

48 horas.m...­

Tierre estéril + suspensión + suspensión + suspensiónde B.macerens de B. mycoidos de P.cercus

_ 32 _

+ suspensión de u-«—» Estufa a 379 -m«‘»«z“ 48 horas.B.polymyxa

Despues dc 48 horas pusimos 1 o 2 ansas de este note­ricl cn tubos con l c.c. de agus estéril y los pcstcurizu­mos en baño a 909 / 5 ‘ Despues sewbrafios cn avena. A1 ca­bo de 3 o 4 dias nicinos " test" par“ comprobar la presen­cia de enzimas cap ces de transforuar almidón en dextrinas,en todos los cultivos.

_Dicho "test" consiste en colocar cn tubo de ensvyol c.c. de solución de ¿lnidón al 4 por ciento ( esteriliza­do según Tiláen y Hudson, 1942 ) y 0.5 c.c. del cultivo, dedejar cn baño mari? a 409 y, a dstintos tiempos, sac,r u­na goza deltubo,y coloc :1: en un porta objeto.Colocnr alcostado de la got? unos cristvlcs de I metálico y, por ac­ción de los varores delanisno cristalizan los dcxtrinas( silas hay) en forma de Ljujas y exágonos que se pueden verfícilmente con c1 microscopio.

El"tcst" resultó positivo para toios los tubos ensaya­dos, lo que significó que esta propiedad nos sirve para in­dicar la prescncic de B. macerans en una mezcla de bacte»rias, y t ¿bien que dicha enzima no se inhibe en presencia

de ellas.

En base a esta observación hicimos otr: experiencia:

Mezclamostierra natural + B.macerans

Sccnmos en estufa a 379

o obtuvimosstteurizamosn-uPlacas (l}-mq19 ¿assess-.42lO'-30

¿vena vú-—«nPlacas k2)—wwrecuperamosBin};'dió dextrinas

positivas

* consoguinou así recuperar el_3.ggqorgngfl inoculado a laorr; nutnr l gorokl blando LuriunCidO cl cultivo porcmora en el madio ge avena.

No lo consoguinos, en cmibio, en las pl&cas (l) he­chas e partir de tiurra inoculrác, caforulcda y p;stouri—

zadq quo no hnbih pasado por ol medio de onriquocimientoapropiado para fi.gqqqrgnq .

Ésto nos condujo fin liente, des nos de thtos fr:c;«sos a un método do aislamiento pure B¿3gqgrgns que sorítratado con detallo a continuación

C V P-ïiït.<.>.<.í.0...d1s..a.i..s_1.c2r'-I.i_9.lïl.t.q_9.94522

El método de aislami¿nto aproyi do os el siguiente:l) Soorr el materinl en ¿stufa a 379 nar. o;;orularlo(tr¿­tfndose de vegotglos, esto lo hicimon cn dcsecador a vu­cio, mezclandoel macerialiriturado con tiorra estéril)

29) Colocnr un ansa de este 1:scri¿l en tubos oo nodio; deavena

39 Pasteurizar estos tubou colocándolos en baño maria a 80809 durante 10' llevar a estufa.

49) Ensayar "tests" para la formación de doxtrinas crista­linrs por acción sobre el almidón después de unos dias( 3 o 4}do cultivo a 379.

59) Hacer cajas por dilución de los tubos positivos

69) Sislar en tubos de ¿vena las colonias circulares, trans­parentes¡pequefi¿s, brillsntes.

79) lggniificgoión Gol ággqqquQSSEroducciónde doxtrinascristalinas a pnrtir de esc tubo y, comooomplemonto,

la formación de burbujos en ese mismomodio y 'as propieda­des morfológicas observadas por coloración de Gram.

_ 34 _

Dggïggaiou_: se ostrblcció le prescncic de_figqgggïmm.tiorri, p.pa(áqi¿gqq_poocpoggg),linoenriado, hoja y:3

or de rL1‘«‘-nJ¿=(_7.í;EI¿Ls.9.124.915.151) 01113?- (Ha‘gisa 23911038

d'Q:¡‘5(.3

1

e zannhori¿ (_Qogc g cggofii) flor de margarta (gggxggg:hemqplfipqtescoos) flor de corona de novia (Sproa sp) y.-...

www-K 5.13.131:'.C.i.--;.-9.1_e_r.a;02'c2>G)

lïRWQÏïlfilgïnlïSj le: rs dictintc .9 c c;-21:2<3 .Bgcnigzlyg pijcqrans;..

con que treb james son Las siguientes;N9 dc copa Procedencia

7068 A.T.C.C. 'Il482/9 N.R.R.L504/6 n503/10 "

Estas epas ¿e noo contauincron todas con Ebqugiigg,las perdimos. Recibimos nueva1ent; de:

N9 dc cepa .Proccdcncic

B. 171 Cult. Coll. Northorm Re¿.Res..‘b. Peoria, Illinois

B. 172 "B_ ll3.429 "3.430 "3.432 "3.433 "3.434 "B.436 "3-19 Inst. de Micf. Agricola

Ministerio de Agricultura(Bs.¿s).

_ 35 _

Y aislamos las siruientes1'79 .66 3.911€". .Iïr.<>_c_9.d.:c.n.9.'31

20 Tierra21 Lino(Linum usitalissimum22 Tierra23 Eargarita(Ch santhemum

frutescens)

qufiolggig: todas las<3cpus son bastones Grau negativosfinos (0.6 x 3 ) _En estrías de agar Rojo Neutro lacto­

sado jóvenes se ¡resentun comobastones finos, l¿rgos,Gran negativoL, con ¿rínulos internos Gran positivos,° hveces se .rescnt"n en cadenas cortas.Eeporas ovoidee. Esporcngios tipo clostridio, cn ÍOTAEde raquetas.¿ veceslas esporas ¿resenth wgubr na teñiblc, otras no. En sucewsivoe pueages por fiar'zxtracto, c1 cultivo se a debili­tïflmü Y puüifioz observar en él, bastones con una protube­rencia centrcl o, :.veces terminal, que es bien teñible yno presenta aspecto de espera. rareccria un nudo hecho conle bacteria. Observnïos trlbifin que pasando el cultivo deestría a estria de agar extracto, a más de perder el goderde desarrollo pierde tanbien 1; fucultad de esporular. .e­síndolo, en cawbio, por medio ge ¿vena adquieren uno y unr‘otra.

Sonnóviles,con flagelos peritricos.

Desalzr_°..l.19. ¿53.1. Pi- 91.12.29 119511.05.-€é.é.l.idp.%_

¿gqr_ggtrggtqmdggarden: colonias circulares, peque­ñas de borde :l¿o irregular, cl ras con reflejo azulado,brillantes y convexas

Aaa}: ¿"ua .‘l‘?..-1.0..V.ï’:.dlvl.1‘F-ï...C.0.n_1.3.9.3.0.fleuirpfi Colonias roc­

quefias, circul¿res o ¿150 irregulares,muy brillentcs inco­loras o ligeramente rosadas, elevadas, bordes nítidos.

29 %_inoculadgi aparece una zona obscura en el punto“g.

de inoculación y la papa se VlOlVCblanda en esa zona,despucs s;grega un líquido oscuro con burbujas por esaWisï punto.

Ggïqïigg : no licúa.

“esarrolisa 31.351.193líquidos}.

.ggqu: ligert turbidez,no forma pelícucquhgi en general coagula y proáu e gas

Medio dc [vena 35s CO3Ca : fiesarrolla muy bien, sc­grcgaïïa_&ñïïdgïsaai€'iflïfïca tóda la parte Sólida del me­dio en la pcrta infcrior del tubo con la consi teneis dcun engrudo, quedando la-perte suycrior comp_ctumeate trans­parense.En este medio se siente olor a acetona cuando elcultivo cstf bisn descrrollcdo.Este medio resultó exce­lcnta para el dcsarrollo del gggggqïqgg y'fué el adopta­do para su cultivo.

Eigpqïgs_gc ggppqgg : las cepas sembradas en mediode RTGHSTrozoat n ¿bund¿n;c ferncntación, sin embargo,en ¿sus de pepton¿ más un azuczr, con campanita, no de­muestran poseer una gran ¿ctividadú ferñont tiva. ¿cidi­fican siezwro, pero, en cc1bio,so observa muypoco gps enla ca1panit;.

¿ggíqágz fcrúcntnron todos las cepas con producción'de ácido y fi?S.

¿5.?;‘.3.É".1Í°.S.a_v..5*-QÉbltP}.2. s, Else 0.82y. .Ï‘í‘jl'3955 forflsntgn con producción de ácido y algunas con pro­ducción de gas en mayor o mnuor grado según la cepa,otras cepas no lo producen en la mayor parto de los azú­cares ensayados.

-- 37 —

VOfiLIGELÏJLQÉLK;11.913 ¿WJoativo

Reduce F03” a 302“

gg;gggqïmiqïïq g {59 no nos y reció un carfctcr im­portanté como par duna característipre crocian ñ 45CZ.

a lïerenciarlo del Qïflgggxglïg.-No esa muy fija

báe'arrollos.

r chñfly¿_gyanq pues no siem­1cn g1¿¿n¿s veces ootuvimos buenos

. .....¿ie-.91“ er? t 11:“u. G. Q3Q¿gpte: no desarrolla en 24 horas.

«oT-y... Ï' '0,1/¿’5'90xw

II-"flov-h"nn“m”au'i‘-í«-*93¡”a'9'fl-"¡aíyaw,¡"aAw

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Dext rmag.-c.1:i.ï»:'b.a.liee&;..

Según hemos jodido observar en nuestros ensayos, lapropiedad distintiva-¿el lg¿_ngcergngque sirve para iden­tifiC¿IlO, es lr de ¿reducir enzimas Capaoes de trunsformarnar el almidón en dextrinas cristalinas no reductores.Por esta razóninuos estudicdo con al¿ún detenimiento dichapropiedad.

Para producir y reconocer les dextrines cristalinasnemos utilizado el método propuesto por Tilden y Hudson(1942) con ligeras Variantes. Dicho método consiste enpreparar unL solución de ¿lflifión al 4 por ciento en un.balon aforado sin llevar a Volumcn( con más o monos la mi­tad de ¿gue neces:rie), se coloca en baïo ¡aria hirvientey se lo h.ce rotar h st: (clarar le solución.Desyues jun­to con un balón con eguc destilvda, se pone a esterilizaren nutoclavc y: crliente, n 1259 durante una hora, termi­n¿da 1a cual se llLVu inmediatamente a volumen con el e­gua recien esterilizadc, se ¿gitu y la solución queda lis­ta para ser tr nsforzuda luego en doxtrine por la enzima dedel

"Test" para comprobar le presencia de doxtrinas: dela solución de almidón se tono csteriluente l c.c. y secoloca en un tubo de ensayo junto con 0.5 c.c. de una s

o

us­PenSión de avenu con cultivo de fi¿_gqcergns de más menos3 dias de incubación a 379 aSe coloca a baño Meri? a 409 yse hace el reconocimiento de las dextrinas a los 15' 30' ouna hori de actuar 1 cnzim; sobre el almidón( a los 15' yase pueden observar generalmente, las dextrines).Él recono­cimiento de las misuas se efectúa, según Tildcn y Hudson,agregando une gota de une solución ¿e I N/lO a 3 gotas de

Ila solución de almidón ILSdextrina, se deje evaporar en

-39­

un porta y se observa al microscopio.Nosotros sustituimosla solución de I por crist.les de l, que se colocan a uncost¿do dclporta.Los Vaporcs de ellos provocan la crista­lización de les dextrinas.Estas cristalizan, de preferen­ci:-7 en 10s bordes de lt gota.

Según Tilden y Hudson se pueden observar distintosestados en el desrrrollo de las dextrinas según el tiempoque rctúa la enzina sobre el almidón,hsí, observen unagrimera etapa de color azul violado con c1 lugol, y decristales exa¿onalc en obsc;vación microscópica; una se­gunda etapa en la que cl color empieza a hacerse violeta ycomienza e verse grzn c ntidad de rgujas en el microsco­pio best: que, cn la etapa final cl color se hïce mzrrónVioleta y las agujas, lergas cubren toda el arca de lagota.

Cristalizando las dextrinas con vapores de I ( en vezde lugol) estas observaciones no pudieron ser comprobadasParece que el I favorece le crist lización en forna de a­gujas, ya aún desde los primeros instantes en que rctúa leenzima sobre el almidón y, en cuanto al color este se men­ticne siempre cn un tono azul V101ud0nás oscuro que el ob­servedo con lugol en los primeros estados.

Despues dc comprobrr la forueción de dextrinas por to­das las cepas de_gggácgr¿ns que teníamos, probamos 1? for­mación de las mismas con otras bacterias (ELÉQQtiligt É;cereus, B. mcgatherium y B. mycoides) obteniendo rogulta—

dos negativos.? nsayanos lu go con una 1€ZClüde estas bact;terias y 3L¿3¿¿gr¿ns,obscrvando en estos experimentos, lasdextrinas.

En igual forma ensayauos la acción sobre el almidónde las füilñsas de la sclive y de la diastasa( que obtuvi­nos a partir de cebada Herrinada, puesta a secar despuesde un cierto grado de crecimiento, molida luego y colocadaen nn balón con agua y cloroforno),0bservanos en ellas laforuación de dextrinas, el color de la ¿0ta con el I y el

_ 4o _

poder reductor, a los 30' de rotupr la enzima sobre elalflidón en baño de 409 ObserV?ción Color Poder

n I ­Microscoplca Reduc­' Y

_ icon I 004 I tor _.rr...“ r J..l 0.o. de almi‘ón 2‘ pollcnla . s. n lenatlvo4 %(controlï Violotn gruesa azul l J

á g°g'cd°dflïígéïa;n Granospïrdos Incoloro positivoo o a x: n.) ".2

Incoloro1 0.0, de almidón 9 Ho se vo absolu- (con lige- Posi­O 5 C do “filiva tamente nada ro tinte tivo° “C ‘ b“ ’ amarillo)

Com'robando do ente manera ne tan ooo estas enzimas7

formondextrinas cristalinrs no reducto ás.

E 1 líquido Bupornfd nte dolïEdio de avena sembradocon_3¿gqqerínq_ no sense la presencia de dextrinns en ol ennsayo con I pese 5 que on dicho medio hubo almidón Serviránlas dextrinas de alimento r los mismos ÉLEgggrgng? o noÍorncrá dextrinas cristxlínhs de ese alnidón?

¿demósal tritar de observar la noción de dos enzi­nes diferentes sobre el alwidón (3¿g¿ggrqnfix diastasa oEn nigering y saliva ) no menos podido tampoco observardoxtrinns al terminar ol ensayo: C010? Podqr__u

_Qbs.micr. con I ¿lfioductorl 0.o. do almidón + 0.5 “”‘—“"Ï “‘"“' “‘-"

0.o. de enzima de E¿ggqorgná “o+ 0.5 0.o. de saliva filtra» huy dex* Incoloro positivotrinnda por Seitz

l 0.o. de almidón +O.5 c.c.de enzima de B.iager¿¿ïú 40.5 c.c. do diastasa

Eensumos entonces, que Enya talvez enzimas(9ún produci­

_ 41 _

dns por el mismobacilo) capaces de desdoblar las dextri­nas cristalinas.

Con el objeto de ¿01;rur este punto tratamos de ob»tener cristales de dextrincs a y de dextrines para uti­lizarlas comohidratos de cerbono en un medio de cultivoy ver si podian ser ferüentadcs por bectcrias.

Pa a obtener las dextrinas seguimos la té nice indicacada por Tilden y Hudson (1942) que consiste en toner, porejemplo,l40 c.c. de solución dc almidón al 40/0 (prepa­rada según fórmula indicada) mezclarla con 60 c.c. de lnenzina y colocrrla en baño de 40 9 hasta que el "test"con lugol de color pardo, que cs según los autores citsdosíndice de ln tcnnineción del utaquc,Luego se agrega 10 c.c. de tricloroetileno y se agita el líquido en recipientecon hielo durante 2 o 3 hores, se forna así preCipitadoabundante. Sc deje en he] de a durante 2 o 3 dias.8e se­para el líquido por decantación o por filtro y se guarda

cl precipitcdo en l: heladera; S e concentrr el líquido al1/4 se agrega tricloroetileno y nucvrnente se re ite la o­perución ya indicada. Se uezclrn los dos procioitados,

se lavencon cgua fria y e las 24 horas se l s peseinámedos¡e agrega, entonces lO c.c. de cgua por onda grano de pe­

so del precipitado y se coloca le suspensión en É rlenmeyer en baño maria,hirvicndo y rgitando bajo campana, hastala disolución de dicho precipitado. S e agrega un poco decarbón, se filtra húmedo, se pone en la heladera y se sepe­ran los cristales formados, que constituyen las dextrinas

A Se concentra el iquido al 1/5 en vacio y sc pone alcristalizar de nuevo. Se separa el liquido que quod: y selo concentra hasta la consistencia de jarabe, se agrega a1­cohol poco a poco cn 2 o 3 dias es a obtener una concen­tración del70 por ciento, precipic n así las dextrinas .Se purifican las ,3 dextrinas por r cristalización enagua hirvionte. Se purifican las doxtrines por recris­talización en ¿gun c lr que se agrega alcohol hasta el 70por ciento.

l 42 m

..?rco¿mos elpoder reductor dc nnbas dextrinas cristavcon azul de Mctilono e hidróxido de sodioaNinguna

dos doxtrines de yo.cr reductor. Iaeenos luego lahidrólisis oe las ioxtrinas con acido sulfúrico N/l en eau

y amoos tubos adquieren poder roiuctcr.

Conestas dextrinas eIistalizaíes preparamos el mo­dio de cultivo; neu: de oentona His xtrina con indicamo J .. 7

EELLXHDEÉE°F:..9°ÉÏÉRS

de

dor y campanita. Sombra os en ellos g¿.Bmincerqns y gg Ïyggiges Sin embargo no llegamos con ‘s—tos ensayos, a obtener una conclusión definitiva.

Tinalmcntc quisimos ver si inoculando una papa con B.ggegríús se producía la transformvción de los granos dealmidón de la misma en dextrinas.

Despues de vrrios dias de cultivo tomamosmit-rial conun ansa de la zona blanda de la papn,extcndimos este mate­rial en un poxa,hicimos llegar a este vapores de I y enla observación microscopioa vimos los granos de almidóncaracterísticos, de color azul, sin ningun; deformación°Pensamos ent nces que o bien la enzima capaz de atacnral almidón no era producida por elgb_jgáqernns_ en papa,obien que el al idón crudo no ore atacable por la misma uncaso de ser producida.

Para ver siíubia enzima introdujimos un pedazo de pa­pa, cultivada con el bacilo, en l etc, de solución de al­midón y despues de 15’ ya habin lindisimos cristales,Luewgo, cl 3¿3Qgergngs produce dicha onzina en papa.

¿ara probar si el almidón por ser crudo no ere cta"aáopor ln onzinr, preparamos una solución de almidón el 4 %en frio e hicimos actuar sobre l c.c, de la misma, enzimasde varias cepas dietintqs de ggggggrgng. Hicimos la compa­ración con el alnidón codido ¿spucs de 1 hora de actuarla enzima sobre ellos;

_ 43 _

¿21111031.3.13% ¿9.119.699.909 1.519. I“ '0 °01Observa-;roder Color con Obs rvu on

Cgigr ción ¿iReduo. _'Micros-Z.-tor Lu301 ' MlcroscopiuLugol copica ca

Precipi GranosNo Ihrdo | ¿

3m19 2:22 ne pardo tiene eY-gonosr roji- h Marron ,zo |

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17; " . " f " “ exágonos' i _ .a y agugas

_. 2

433 - Casi " É “ . " exágonos.¿incolo- = i' -ro

con lc que se compruebala hipótesis v a mas justificaU

.‘la prcpnr ción de ¿a sol. de almidón dada por Tildon yHudsonque la esterilizan durtnte l hora a 1259 hñciéndniade esta manera atacablo por la enzima.

l-M.-h---O .—-.-——

_ 44 ­

_C__¿¿_11_I_.‘12..U. .L. ..0. _I_v.w ..,..-A--.“ -_._..

25.031an 2L: _R_Es:¿I¿-72¿s.1295

Hemoshecho hasta aquí el estudio del Étgixmxïe ydel gggggerggs, de su aislamiento, su dispersión, sus anamlogias y diferencias. Henos comprobadogran parte de lapublicado en la literatura por diversos autores sobre losaerobacilos.

Én cuanto e les diferencias esteblecidas por Porter,McCleskcy y Levine para distinguir al É¿Rgixnïïg del B.macerens,nosotros hemos observado que:

l) La reacción de Voges Proskeuer siempre nos resultó po­sitiva para el B. polymyxe y negativa para el E¿Egggríngpor lo que la coneieeranos una reacción ca‘acterística ydiferencial entre las dos esgecies.

2) El crecimiento a 459 delg¿mgperens_ comocarácter dife­rencial y el crecimiento e tenperatura ambiente del B.p0mlymyxa, fueron carceseres que no se manifestaron consten­tes en los diferentes ensayos que hicimos, por lo que nonos parece que estos sean de importancia fundamentsl en lediferenciación de aibos bacilos.

3) Le ferment¿ción de Sorbitol y Ramnosapor parte delg¿_mgcgrqngexclusivanente, tnnyoco nos pareció un caráctermuyinportrnte en l¿ diferencicción, pues si bien ningunade nuestras cepas de Ézgglymxxe fermentó dichos azúcares(10 que confirma e Porter), existe el antecedente de queni Smith ni Ledinghampudieron corroborar dicha afirmación.

Por otrd parte, las cepas de g.ngcercns con que nosotrosotr bajamos, sembr das en S rbitol o ?“m““** no dieron gas

cn centidïd ¿preeieble comoparc consiee:.r diehh fermenntación muyefectiva ni muydecisiva en l; identificaciónde las especies.

Respecto a la difCÏCJCiR entre afibaa :species eswtablecida por Tilden y Hudson, basude en las distintasamilasas producides por ellas, es deiinigivc, segun lo henmos comprobado.Nos pprece también que es la diferenciaaés interesante pues dichr propiedad n; solo sirve paradistinguir al g¿gíggr¿ns delflipogggïrq’siro tambien paraindividualizar al g¿¿gïcer¿ns de toda otra bacteria concecida.Concluimos pues que solamente la reacción de VoguesProskaucr y la producción de enzimas capaces de transfor­mar al almidónen dextrinas cristslinas son significati­ves para distinguir entre si e los aerobacilos.

En uuanto a la denominción de estes bacterias, lacreación del nuevo género:¿erghggi¿ius no nos parece jus«tificeda,puesto que la única diferencin que permite distinnguirlo del_góncrogggiiius sería la existencia de un sistema capaz de transformar hidratos de eer‘ono con produc—ción de hidrógeno y anhídrido corbónico.Si esta propiedadque en verdad es muyimportante, pudiera ser instituidacomo fundamento de la creación dc un ¿enero en este grupode bacterias esporuladas, ¿130 análogo debiera aceptarsepare elgéncro gigïtridiug, separfndelc en los grupos deespecies con producción de anhídrido carbónico e hidróge­no y en otro grupo sin producción de anhídrido earbónicoe hidrógeno de los hidrntos de carbono.

Respecto al g¿_pgngoggy EL schuïghjjliensig,que fuerondescriptos como especies y eo sideradas un el SergeyManual (1949) probebles v riantes de_3¿pogzgzïg y de g¿_ggggrgns respectivamente, tiene, en las descripciones oríginaleS, a mós de la PrOPiedad de fermentár hidratos decarbono, las siguientes características d Ltiniiïgs¿que

-45­

llevgron a los tutores a considerarlas especies nuevas:

B. schqylkrlllegclgw (Eisenberg)No produce Qeetil netilcarbinolNofcr¿ente sorbitolLicúa gelatinaProduce SH2

Y de éstas ni l¿ producción de S H2 ni la licuaciónde gelatina fueron dddFS por ningún .utor como de impor­tancia fundancutrl en la C€racterización de las es;eciesaquí -ctudiafias; adezás el hecho de no fernent r :orbitolyaïezos color do que tampoco parece tenerl“, de ¿onde re­

-\ ¡'Isalta q;c la ánic¿ reacción dada, realmente ciierencial,

es la de no proíucir ecetil-mctil-carbinol y és nos per­tamite inclulr al É¿_gggïlklllgggg¿g dentro del a, mgggrñggtal comoebtí considerada en el Bergey‘s Manual, no jus­tificando, en canbio, la nueva especie“

*fi¿.QQQQq:l_(Corbet) produce {cido sin ¿es de glucosaPor faltar un; de las reacciones importrntes, su deberip­ción no germite incluirlo, se ún nos parece en ninguna deh)

las dos esyccies existente.

QAÏÁÁHÉÉ.XJw...- —-.-4-—‘.-. _.-¿.-- _._..

mm W -.-\ *1-n'-.:._ -.-r1I-rw;u­¿DLÁJN- cohortliunq)

l-l\_/

Se detalla un métodopsr: rislíhicnto de_3¿”2olzgxïanque consiste en senbrar el fléterialen ïCdiO de enrique­cimiento,prsteurizer p;r; eliminar bacterias no esporu­ladas y ¿isl-r por dispersión en place.n

2 'v Se detalla un ñétodo per¿ ¿islaniento de fi¿flgcorqns queconsiste en utilizar cultivo de crriquecimiento, pasteu­riznr,com3robar l; exi tencia de la enzima especificay aislar por dispersión cn placa,

3) Se establecen las yropio”¿des caracteristic s fundamen­a

isa y ÉQELÉCE'tales que sirven pa a diferenci r :lfiggglggy

4) Se adopta el medio de agua de levcdura lactosado conRojo Neutro y el de avenm y c rbonuto de calcio como másadecuados para el desarrollo del 3¿Eglzgïfig y_3¿3iggrgngrespectivenente.

59)Sc observaron en B. polymyxa dos tipos de variantes quesicnpre resultaron reversiblcs.

6) Se hizo un pequeño núnero de observaciones con las dex­trinas cristalinLS no reductores obtenidas a Jartir delalmidón con la enzima yroducidt por elQL_¿gggrqns.

7)Se discute 1a conveniencia de la creación del género

Aerobacillus__y se dan los fundamentos nara una deci­sión contraria.

-ï_=-’-_"b;9.l:i_«2—_l.c:s:z T-ïétoqga

A continuación se dotfillnn algunos "o los ¿odiosr2.Lde cultivo utilizados en el yrogcntc u ‘baio.

¿La-.qr‘agra-‘t..9.._0_0.I1. .17"Ju“61:o.= ( (1012"G2-1­7.‘2.-._....7.: .-._.- ._. -......_.. A-.- .. . . _

do para ol desarrollo delg.pogfigfigï) Utilizamos ol medio

Almiáóno lrctosa........ 20 gr.Popton¿........o..:°...‘, lOgr.Éxtr. de levadura(seco).e 5 gr.RojoNoutro..........o... 0‘05gr.¿gar..................... 15.gAgua.....,..........mu.. 1000c.c.

Luego utilizaaon aguu de levadura í vor descripciónmas abajo) en proyorción de lOO0.o. en sustitución delos 5 gr. de extracto ¿e levadura soco.Ens:y9nos el mediocon lovudura de corveza y con lovndura de oan y observg­mos mejor desarrollo on ol medio preparado con esta últinEa.­

l’ïéïyïïacgán.9;; 5.1.9.l. .d_e_ 5':th PoSedes­I

menuza 500 gr. do levadura do pan prensa a y se colocai 'ndo­en un balón en estufa de 509 duranïo 48 horas, ag t,

‘ a las 24 horas varias vocas. La lovudu": sufro una au­'sis y la maSLsólidazn transforma cn un líquido espu­

\

1

so que se u luyo rltérmino de 48 horas con audio litro de‘iiltra por pajcl ;10"*á0 y o líquido claro quo,.f.‘

L og.»agua. Seqen gener?l, iilüra muy ¿cutrucuü37 se lleva a pH 7 con hi"

dróxido de sodio.?o esteriliza a 1109 durante treinta Ji­nuton.Ésta agua de lodeur¿ suelo ser designada en ol ln­borñtorio cono extructo de levaduru a1 medio.

_ 49 _

.QRQÉQQÁáR.Éqnñfiïgqumlqïififlïa_QQ"9ÉÏÏQZ3.ÉHÉQ1ÉÉÉdÉsc prepara de iJual mcncra quo 1¿ doscripta pera la lovamdura de pan.É n goncral la autólisis comienza muy rápida­mento y l; Lasa qucda mucho más fluida al cabo de las 48hores dc nutólisis.

Me.d.i.0_d..9_.¿=rsaa...qqra973112.0;52399.22 921.1232: la í'órrmla 9dida­por Tildcn y Hudson es:

Avena........ 5 grCOjCa........ 2 "llguaoaoooqaooo CaCo

Con este Jedio so suelo presentar clinconvenicnto dcla distribución entubos por 1a sedimcn+ación rápida de laavena. Se puede obviar este inconveniente agitando Íuortcmmente l: mezcla en cl balón y tientras sc agita tonar conwipcta 5 c.C. * y ponerlo en cada uno de los tub s.

Tambien usamos al procedimiento dc h¿cer una :üzclauniforme do ¿vena y carbonato do calcio en un mortero,distribuirla en tuntas pertes iguales comotubos se quie­ro preparar y añ¿dir ¿jua en la csntidad requeridac aesterilización se hace 120Qdurante 20 minutos; cn genc­ral se mojan los tacones a posar de todas las precaucionesque sc adopten para evitarlo.

Para la estcrilización dc cantidades másgrandes dcmedio, en balones, esto inconvenicitc sucia cstar agra­vadopor la expulsión del tapón dc algodón.Para resolver es­ta dificultad se J nüunu cl balón cn autoclevc un buontiempo hasta que ol medio tone con"istcncia de engrud‘oFa­gitándolo aLgunas voces. Luego se cstcrili'a a 1209 duran­te unos pocos minutos, se trpa apenas disminuida ls prosión y se lo ostcriliza a 1209/20’.

s-.-’ —,...

I oculacióqlgc_gágíñ¿ sc cligcn papas sanas,9 sin lesionesni orotcb que puedan dificultar el lavado melas mismas ydc tamaño más bicn chico dc modo quc flüdJfl scr conservnadas cn cajas oc Petri estériles para su incubación una VUZinoculadas( s> usan os tazas o dos fondos dc caja estó­d

rilcs juntos pucs asi la altura dc la caja se hace mayor).sPara inocularla c procede así: sc l?Vc la papa

gua y jabón varias vcccs, se cuju¿ga con ¿gun, se seun trapo bicn limpio y se coloca cn una caja estéril. Luc"¿o sc elige cl junto dc inoculación y se echa sobrc él u­nas gotas dc lugol. Tambien sc puede fleacar dicha porciónpasándola rígidancntc por mechererna vc¿ hccno esto sc to­ma un? suspensión cn agua de lc bactcric qua sc quiere inomcular y con una pipcta Pasteur bien finita sc toma matc­rial de esc liquido y sc introduce cn la papa quc queda a“sí inoculada.

Inedcn hacerse dos o tres inoculaciones dc la mismasuspcnsión cn la mismapapa si sc quicrc, luego se llevaa estufa pnra incubar, dentro dc la caja dc Petri.

Otros medios dc cultivo utilizados comúnmentecn cl)rcscnte trabcjo fucrcn: ¿var extracto de carne, medio deh

Endo, agua dc peptona cuyas fórmulas fueron tomadas delStandard ncthods.Para colorear bactcrias fué utilizado cngeneral el método dc GranmNicollc.

_ 51 _

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Explicación dc las fotografias (l)

Se hace la salvedad que dada la escasez de material fo­tográfico disponible actualmente,no se pudo ilustrar el traba"jo de la manera deseada‘

Fotografia N9l: Bacillus polymyxa.x 1000 aproxi«madamente

" " 2: Bacillus macerans x lOOOaproxi­madamentekEnella pueden obser­

varse las protuberan­cias,generalmente cen­trales, de las que dacuenta el texto.

32Bacillgg ÜQCÉEHEÉx 1000 aproxi­nadanenteBsporangios.

" " 4: golgnia de Bacillus polxmzxa enagar extracto de carne x 1000aproximadamente

" " 5:Colonia de Bacillus macerans enagar extracto de carne x 1600 a­proximadanente.

" " 6: Dextrinas cristalinas obtenidaspor acción de la enzima del B.gacerans sobre el almidón.x ÉOOaproximadamente

’1)Fotografías obtenida: por gentileza de mis compañerosdelInstitute a Éaelos y Agrotecnia señores" G.Causa y M.Médici

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