Estudio y Reporte de FrotisSanguíneo

( Lámina Periférica )

Lic TM Boris Valdivia V.

Servicio de Hematología

HNGAI - Essalud

Extensiones Sanguíneas

• El frotis sanguíneo consiste en la extensión uniforme de una gota de sangre sobre un portaobjetos; la misma que se lleva a cabo con otro portaobjetos

• El frotis sanguíneo se realiza de forma manual y automatizada ( spinner )

Partes de una extensión• Cabeza

- es la zona inicial de la extensión- es la región mas gruesa- en esta región se encuentra el mayor número de linfocitos y GR apilados- No es una zona de lectura

• Cuerpo - es la zona media del frotis- su espesor es el apropiado- en ella existe una adecuada proporción de leucocitos- contiene la zona ideal de observación, que corresponde a la zona que limita con la cola

• Cola - es la zona final de la extensión- suele tener un aspecto redondeado- es la región mas fina- mayor proporción de leucocitos grandes, hematíes deformados y tonalidad uniforme

• Características de un buen frotis- la cabeza ha de estar cerca de uno de los extremos del porta- la cola debe estar cerca de uno de los bordes- toda la extensión ha de ser fina y homogénea- los bordes laterales han de estar separados de los bordes del porta por 1 mm aproximadamente- presencia de barbas en el extremo terminal

Defectos de una extensión

• Presencia de escalones o estrías. originado por una falta de uniformidad en el momento de realizar la extensión

• Un lámina con zonas huecas redondeadas por efecto de restos de grasa y suciedad

• Excesiva longitud y escaso grosor o escasa longitud excesivo grosor

• Error en el tamaño de la gota• Error en la velocidad de la extensión• Error por causa de un ángulo inapropiado• Se debe tener en cuenta el Hto del paciente,

dependiendo de esta, se aplicará el ángulo apropiado de extensión

Coloraciones Hematológicas

• Las coloraciones hematológicas son un conjunto de procesos que conducen a la coloración de las estructuras que componen las células sanguíneas

• Esto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y esto permite observarlas con mayor facilidad

• Las tinciones hematológicas se pueden clasificar en :

• De acuerdo al nivel de vitalidad de lo que se quiere coloreara . Vitalesb . No vitales

• De acuerdo a su frecuencia :a . Rutinab . Especiales

Tinciones Habituales

• Colorantes ácidos: tienen especial afinidad por las estructuras alcalinas de las células, como por ejemplo la hemoglobina. El principal de ellos es la eosina.

• Colorantes básicos : especial afinidad por las estructuras ácidas de las células, como por ejemplo los ácidos nucleicos. Uno de ellos es el azul de metileno

• Colorantes neutros : son los que no tienen afinidad con las estructuras ácidas o básicas, uno de ellos es el Sudán III

• Existen también combinaciones de colorantes que dan origen a tinciones polícromas

• El primero de ellos fue Romanowsky, y todos los colorantes hematológicos de la actualidad suelen derivar del que él preparó

• Estos colorantes constan de un colorante ácido (eosina) y otros básicos (tiacinas).las tiacinas son el azul de metileno y los azures

• También existen tinciones panópticas rápidas que producen una coloración fácil y rápida en las estructuras celulares

• Estructuras acidófilas : son aquellas que fijan colorantes de naturaleza ácida. Si captan la eosina se llaman eosinófilas. Con las tinciones habituales adquieren un color rosado

• Estructuras basófilas : son aquellas que fijan colorantes de naturaleza alcalina. Con los tinciones habituales adquieren un color azulado.

• Si se tiñen de lila o púrpura con colorantes de tipo azur, se llaman azurófilas.

Tinciones especiales

• Solo se usan en condiciones específicas • Tinciones fluorescentes : emplean colorantes

(fluorocromos) que se fijan a las células y que, cuando son estimulados por LUV, emiten una radiación visible caracteristica.

• Tinciones Citoquímicas : demuestran la presencia, mas o menos abundante, o la ausencia de determinadas sustancias y/o enzimas, localizadas en el interior de los gránulos citoplasmáticos de los leucocitos.

• Sirven para reconocer células normales de las anómalas, y por tanto, reconocer una leucemia de otra. Por ejemplo : PAS, Sudan Black, MPO, alfa – Naftilestearasa, etc

Coloración Ácida

Coloración Básica

Causas de Error en las Tinciones Habituales de Frotis Sanguíneo

Si la tinción de una extensión sanguínea es demasiado rosa, probablemente se deba a :

• Un pH bajo de colorante• Un tiempo de coloración insuficiente• Un lavado excesivamente prolongado

Si la tinción es demasiado azul probablemente sea por :

• Un empleo de portas sucios• Falta de filtración del colorante• Una coloración excesivamente prolongada• Un secado del colorante durante al tinción• Un lavado insuficiente

Preparación del Colorante de Wright ( Merck )• Pesar 2 – 3 gr del colorante en polvo comercial• 1000 ml de metanol• Glicerina ( 5 ml ) – opcional• Colocar en un mortero el colorante y añadir la glicerina• Añadir de a pocos el metanol al mortero e ir machacando hasta que

adquiera una coloración azul intensa y luego verter a un frasco color caramelo o ámbar, previo filtrado con papel filtro

• Repetir la operación hasta que se acabe el metanol• Guardar en lugar oscuro, fuera de la luz para evitar su oxidación por aprox.

una semana hasta que madure• Luego de cumplido el tiempo filtrar nuevamente• Listo para su uso

técnica de tinción :• Cubrir el frotis con el colorante por 1 – 3 minutos• Agregar agua tamponada pH 7.2 – 7.4 por 5 – 7 minutos ( homogenizar )• Verificar la formación de una película plateada sobre el colorante• Lavar con agua corriente y dejar secar• Leer con objetivo de inmersión

• Un aspecto clave es el grosor del extendido. Una extensión de calidad no debe ser gruesa ni muy delgada

• Una extensión gruesa dificultará la observación de la morfología eritrocitaria y la diferenciación entre linfocitos y monocitos. Además de dificultar al ojo inexperto la tinción de las células sanguíneas

• Por el contrario, si es muy fina, la mayoría de neutrófilos y monocitos se hallarán en las áreas periféricas. Esto alterará la relación normal de la distribución celular leucocitaria

• Se recomienda entonces, que el grosor ideal, es aquel que nos permita leer a través de la extensión

Para tener en cuenta

Estudio de Lámina Periférica

• El estudio de lámina periférica comprende la evaluación morfológica de las tres líneas celulares ( elementos formes ) que componen la sangre

• Serie Blanca : Leucocitos

• Serie Roja : Hematíes

• Serie Trombocítica : Plaquetas

Procedimiento del Diferencial Manual de Sangre Periférica

Examen ocular a bajo aumento ( 10X )• Determinar las características de la tinción• Determinar la distribución celular

a. verificar si hay presencia de agregadosplaquetarios que pueden producir errores de conteo en los equipos o llevar a conteos bajos falsos b. Verificar la presencia de Rouleaux en GRc. verificar la presencia de agregados leucocitarios causados por inadecuada mezcla de sangre después de su colección

• Seleccionar la mejor área para una detallada evaluación morfológicaa. buscar una distribución homogénea donde los eritrocitos no se sobrepongan unos a otrosb. evitar áreas huecasc. evitar áreas extremas donde los eritrocitos adopten forman geométricas

• Lectura a mediano aumento ( 40X o 50X )este tipo de lectura nos sirve para tener una visión panorámica y completa del frotis y es de utilidad para el personal adiestrado en el reconocimiento celular, porque nos permite lecturas a mayor velocidad, sin sacrificar la precisión. Se recomienda su uso para láminas de pacientes leucopénicos.

• Algunas personas inclusive pueden calcular el numero de leucocitos pmmc contando las células blancas normales y rotas, contando 10 campos, luego obteniendo su media y posteriormente multiplicandolo por 3000

Lectura a mayor aumento ( 100x )• Se lleva acabo usando un tabulador o contómetro, manual o digital. • Deben incluirse todas las células de la serie blanca, maduras e

inmaduras.• No deben incluirse en el recuento de 100 leucocitos a los GR

nucleados y megacariocitos nucleados• Cualquier leucocito conteniendo una inclusión anormal deberá ser

reportado pero con un conteo en paralelo por las 100 células contadas

• Ejemplo : Ud observó 60 neutrófilos en su conteo de100 de los cuales 20 de ellos tenían cuerpos de Döhle, ud deberá informar al final del recuento : neutrófilos (60%), y cuerpos de Döhle 20%

• Se deberá reportar los siguientes inclusiones : - cuerpos de Döhle- cuerpos de Auer- anomalía de Pelger Huet- anomalía de May – hegglin- inclusiones de Alder – Reilly- inclusiones Chediak – Higashi- granulaciones tóxicas - vacuolas citoplasmáticas o degenerativas

• Usted deberá reportar cualquier célula anormal o indiferenciada que observe

• Deberá reportar GR nucleados si estos exceden al 6% y corregirá su recuento de leucocitos con la siguiente formula :

Leucocitos contados / mm3 x 100 = leucocitos corregidos / mm3

100 + Nº hematíes nucléados

Ejemplo : si un paciente tiene un conteo de 15,000 leucocitos pmmc y 35 % de GRN, su conteo corregido será de 11,111 pmmc

Evaluación de la Serie Roja

• En este punto el observador deberá reportar su minucioso examen de los GR, indicando la presencia de Hipocromía, Anisocitosis y Poiquilocitosis.

• Deberá reportar también inclusiones eritrocitarias y hemoparásitos si los hubiera.

• Tambien indicará la presencia de células inmaduras de la serie roja si las hubieran

MADURACIÓN

SERIE

ROJA

• Hipocromía : cuando una célula roja individual contiene un área pálida central que es mayor a la tercera parte de su diámetro se denomina célula hipocrómica

• Rango medio para denominar hipocrómía en 10 campos microscópicos ( 100 – 160 hematíes por campo )

a. normocromía : 0 - 5b. leve hipocromía : 6 - 15c. moderada hipocromía : 16 - 30d. marcada hipocromía : > 30

• Nota : la hipercromía no esta reportada aquí pero se relaciona con la presencia de esferocitos.

• Hipercromía : se denomina así a las células rojas profundamente coloreadas en relación al resto, y esto debido a su alto contenido en hemoglobina, mayor al que debería contener

• Anisocitosis : cuando se presenta en el campo eritrocitos de diferentes tamaños

• Normocítos :diámetro longitudinal : 7 – 8 µ– Diamatro transversal

( espesor )periférico : 2 µcentral : 1 µ

- Superficie : 120 - 140 µ- Volumen : 80 – 95 µ

• Microcitosis : hematíes con un diámetro inferior a 7 µ y un volumen inferior a 80 µ3

• Macrocitosis : hematíes con un diámetro superior a las 8 µ y un volumen superior a las 100 µ3

• Megalocitos : hematíes con diámetro superior a las 11µ

Rango medio para anisocitosis / 10 campos

Normal Leve Anisocitosis Moderada Anisocitosis Marcada Anisocitosis

0 - 5 6 - 15 15 - 30 > 30

• Poiquilocitosis : cuando se presentan varias formas diferentes en los hematíes en un campo microscópico

• Si se observa solo un tipo leve de anormalidad la poiquilocitosis será leve, pero si coexisten diferentes formas de hematíes, entonces será marcada, no importando que individualmente sean leves

• Se recomienda que cada forma anormal sea evaluada separadamente

Rango medio para tipificar poiquilocitosis /10 campos

• Normal : 0 - 1• Leve : 1 - 5• Moderada : 6 - 15• Marcada : > 15

Acantocitos • AHA• A. sideroblástica• AHM• Enfermedad hepática• Enfermedad renal • Post- esplecnotomía

Drepanocitos • Células facliformes• A. drepanocítica• Enfermedad Hb S - C

Esquistocitos

• Son GR fragmentados• AHM• A. megaloblastica• Talasemia mayor• A. hemolíticas• Leucemia aguda• Hiperesplenismo

Megalocitos

• Anemias megaloblasticas

• Diámetro > a 11 micras

• ANEMIA MEGALOBLASTICA• ELIPTOCITOSIS HEREDITARIA• MIELOFIBROSIS• TALASEMIA MAYOR• TRAUMA MECANICO

Rouleaux • Cuando los GR se

presentan en fila de moneda

• Mieloma Multiple• Incremento de

gamma globulina • Macroglobulinemia de

Waldenstrom

Dianocito Célula en Tiro al Blanco

• ESTOMATOCITOSIS HERDITARIA• LEUCEMIA AGUDA• ALCOHOLISMO CON ENFERMEDAD HEPÁTICA• ARTEFACTOS• TALASEMIAS

Anillo de Cabot Cuerpos de Pappenheimer

Punteado Basófilo Cuerpos de Heinz

Reticulocitos

Policromatofilía

Cuerpos de Howell JollyPappenheimer

• El recuento diferencial leucocitario suministra información sobre aspectos cualitativos y cuantitativos de los diferentes leucocitos de la sangre y permite la detección de células anormales

• Se basa en la observación microscópica de 100 a 200 leucocitos dispuestos en una extensión de sangre ( frotis ) convenientemente teñida

• La calidad de la extensión de la sangre es de vital importancia para la realización de una correcta lectura de la lámina.

Serie Blanca

• La fórmula leucocitaria es la denominación usual que se da al recuento porcentual de los diferentes leucocitos que circulan en la sangre

• En condiciones de normalidad esta constituida por 5 poblaciones de leucocitos :

• Neutrófilos ( en su gran mayoría segmentados )• Eosinófilos • Basófilos • Monocitos • Linfocitos

Variables que pueden influir en la formula leucocitaria realizada mediante el método

visual

• Distribución irregular y no aleatoria de los leucocitos en la extensión

• Realización de la lectura en una zona inapropiada• Variaciones de la calidad y las características de la

tinción ( tinción ácida o básica )• Observación de un número insuficiente de células• Pericia del observador en la identificación celular

– neutrófilos segmentados Vs neutrófilos en banda– monocitos Vs linfocitos activados o atípicos– formas inmaduras de granulocitos neutrófilos

SERIE

MIELOIDE

Mieloblastos :• Es redondeado• Diámetro entre 15 – 20 µ• Su núcleo es grande,

redondeado, rojizo y tiende a centrarse

• Su cromatina es laxa y contiene de 2 a 3 nucleolos visibles

• Su citoplasma es basófilo y algunas contienes finas granulaciones azurófilas

Promielocito :• Se origina por maduración y

maduración del mieloblasto• Es redondeado• Diámetro de 16 – 25 µ• Núcleo grande,

redondeado, menos rojizo y tiende a excentrarase

• Cromatina laxa y generalmente se observa nucleolos en ella, puede presentar zonas de condensación

• Citoplasma abundante, repleto de gránulos primarios muy azurófilos

MIELOCITOS

JUVENILES O METAMIELOCITOS

METAMIELOCITOS

Metamielocitos Vs No Segmentados

Regla de la Mediana : Si al completar mentalmente la circunferencia nuclear y trazamos una línea media imaginaria y esta muestra la hendidura antes de la media estamos frente a un juvenil o metamielocito. Si por el contrario la hendidura esta detrás de la línea media, estamos frente a un abastonado

Juvenil No Segmentado

Metamielocitos Vs No segmentados

Regla del Diámetro : esta se basa en el ancho del núcleo. Si la anchura de esta es similar a la mitad de la longitud del núcleo estamos frente a un metamielocito o juvenil, en cambio si el ancho nuclear es menor a la mitad de la longitud ´ del núcleo, estamos frente a una célula en banda.

Juvenil No Segmentado

CÉLULAS EN

BANDAO

EN CAYADO

OABASTONADOS

Células Neutrófilas en Banda

Neutrófilos Vs No Segmentados

Regla del Tercio• Si la estrangulación

de la continuidad nuclear es menor a un tercio de la parte mas ancha del mismo núcleo, entonces es un segmentado

Regla del Filamento• Se dice que estamos

frente a un segmentado siempre y cuando se observe un núcleo polisegmentado y se observe al menos un puente de cromatina

Neutrófilos Vs No Segmentados

Neutrófilos Células en Banda

Criterios para la diferenciación entre neutrófilos Vs no segmentados

Si seguimos con la mirada la continuidad nuclearY en algún momento esta se entrecruza con otraLínea del mismo núcleo , entonces lo llamamosSegmentado. Del mismo modo si al termino de laObservación de la continuidad de la membranaNuclear sobra núcleo lo llamamos segmentado.( Fig. 1 )

Si al observar la continuidad nuclear no notamosCruce de líneas, entonces lo estamos frente a unAbastonado. ( fig. 2 )

Fig. 2

• Son células redondeadas, de tamaño entre 12 y 14 um.

• Su núcleo está segmentado en 2 a 5 lóbulos, unidos por unos finos puentes cromatínicos.

• El citoplasma es rosa pálido y contiene numerosos gránulos neutrófilos que se tiñen de color marrón con las coloraciones panópticas habituales, así como cierto número de gránulos primarios ( 10 – 20 % ) o azurófilos dificilmente visibles al quedar enmascarados por los neutrófilos.

• Su núcleo es de color violeta oscuro y presenta cromatina densa

• Algunas veces su núcleo presenta un pequeño ápéndice en “palillo de tambor” ( cromatina sexual )

NEUTRÓFILOSPOLISEGMENTADOS

Granulaciones Tóxicas Pelger - Huet

Vacuolas Citoplasmáticas Vacuolas Degenerativas

BASÓFILO

• Poseen un núcleo bilobulado y grandes gránulos esféricos basofílicos y metacromáticos dados por heparina e histamina. Liberan además aminas vasoactivas y sustancia de reacción lenta de la anafilaxia.

• Célula redondeada• 12 – 17 µ• Núcleo violeta,

generalmente bilobulado simétrico unido por un puente de cromatina o en forma de anteojos

• Presenta gránulos, grandes y acidófilos que no cubren el núcleo

• Estos gránulos se tiñen con la eosina y contienen diversas sustancias como la peroxidasa, fosfatasa ácida, hidrolasas, etc

Eosinófilos

Serie Linfoide:

Linfoblasto

Linfocitos

Prolinfocitos

• Diámetro variable de 7 – 18 µ• Pueden diferir en su relación

N / C• El citoplasma es variable

( escaso o abundante )• Su coloración es azul pálida,

pero aumenta en los linfos reactivos ( estimulados )

• Pueden presentar una granulación azurófila escasa en el ciptoplasma

• Núcleo redondeado y cromatina compacta

• La densidad de la cromatina puede variar entre los diferentes estadíos. Es generalmente elevada pero pueden presentar zonas mas laxas

Linfocitos

LINFOCITOS ATÍPICOS

MAS LINFOCITOS ATÍPICOS

Serie Linfocítica : Criterios

Plasmocitos • 8 – 20 µ de diámetro• Relación N/C 2:1 o 1:1• Núcleo redondo u oval• Cromatina densa azul –

purpura con grandes muescas cerca al margen nuclear

• No presenta nucleolos• Citoplasma moderado,

basófilo, con zona clara perinuclear adjacente al núcleo

• Puede contener una o mas vacuolas

• No presenta granulaciones citoplasmáticas

MONOCITOS• Son las células circulantes de

mayor tamaño. Poseen un núcleo excéntrico en forma de U ó en forma “arriñonada”

• El núcleo suele presentar una ubicación central

• 14 – 20 µ de diametro • Citoplasma abundante y de color

lila pálido• Presenta fina granulación azurófila• Presenta cromatina laxa o

filamentosa• En ocasiones se halla vacualizado

• Son los precursores del sistema mononuclear fagocítico, que incluye macrófagos (histiocitos), osteoclastos, macrófagos alveolares, células de Kupfer en el hígado y la microglia en el sistema nervioso central.

Monoblasto

Promonocito

Monocito

Serie Monocítica

Serie Trombocítica

• Debemos reportar la cantidad de plaquetas en lámina ( trombocitopenias o trombosis )

• Debemos dar un informe detallado sobre la citomorfología de las plaquetas

• Reportar si hay plaquetas normales, degranuladas, pequeñas o macroplaquetas

• Se debe informar si existe la presencia de agregados plaquetarios

• Es muy importante una impecable técnica en el momento de realizar el frotis, es decisivo.

Promegacariocito

Megacariocito Granular

Megacariocito en Brotación

Megacariocito Productor de Plaquetas

Serie Trombocítica• Las plaquetas son las

células sanguíneas mas pequeñas del organismo

• Se producen por fragmentación simple del citoplasma de los megacariocitos.

• Son células anucleadas de forma discoide de 2 – 4 micras de diámetro y 8 micras de volumen.

• poseen una vida media de 7 - 10 días y su rango va de 150,000 a 450,000 pmmc

Trombocitopenia :

Leve : 150,000 - 100,000Moderada : 100,000 - 50,000Severa : < 50,000

Macroplaqueta Plaquetas Normales

≥ 450, 000 pmmc se denomina trombocitosis

≥ 1’000,000 pmmc se denomina trombocitemia

Recuento en Lámina Periférica

Damacheck :

• ( Rcto 1000 GR + F ) x 100

• Factor = ?

• Hto ≤ 35 ( + 5 )• Hto : 35 - 39 ( + 3 )• Hto : ≥ 40 ( + 1 )