Estudio de la respuesta de las variedades de · Taulé-Barlocco et.al., en preparación ....
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Estudio de la respuesta de las variedades de
Sorgo bicolor (L) Monech cultivadas en Uruguay
a la inoculación con bacterias promotoras del
crecimiento vegetal
Dr Federico Battistoni, [email protected] Departamento de Bioquímica y Genómica Microbianas División de Microbiología Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable
Rizosféricas
Epifíticas
Endófito facultativo
Endófito obligatorio
Simbióticas
G. diazotrophicus – caña de azúcar
Azospiriullum sp. – sorgo
S. meliloti – alfalfa
A. chroococcum - arroz
Interacción planta-bacteria
P. fluorescens - alfalfa • Coevolución planta – bacteria • Grado de interacción
Endófitos bacterianos
•Bacterias que colonizan activamente los tejidos internos de las plantas y establecen asociaciones (endosimbiosis), beneficiando a las mismas (PCV) •Endófito verdadero: cuando se demuestra mediante técnicas microscópicas su localización e identidad dentro de los tejidos vegetales •Cumplir con el postulado de Koch: ser capaz de infectar nuevos hospederos
Zona de raíces laterales
Zona de pelos radiculares
Zona de elongación celular
Pelo radicular
Córtex
Endodermis
Xilema
Interacción planta-endófito
I-
I- Colonización del rizoplano
II-
II- Infección de los tejidos
III-
III- Colonización del cortex
nifH::gusA
Mecanismos de promoción del crecimiento vegetal
a. Competencia por los nutrientes del nicho
b. Producción de metabolitos secundarios tóxicos
c. Parasitismo
d. Inducción de la resistencia sistémica
1. Control Biológico
• Indirectos: actúan sobre otros componentes del ecosistema provocando un efecto benéfico en la planta
• Directos: actúan sobre la planta
1. Fijación biológica del nitrógeno (FBN)
3. Incremento en la capacidad de absorción de minerales (Fe,P)
2. Producción de sustancias estimulantes del crecimiento
Objetivo de la línea de investigación
Aportar a la sustentabilidad de cultivos de interés agronómico mediante el empleo de bacterias endófitas promotoras del crecimiento vegetal, en sustitución a la fertilización química
Modelos exitosos Gluconacetobacer diazotrophicus PAL5- caña de azúcar (Saccharum officinarum) Herbaspirillum seropedicae SmR1 – arroz (Oryza sativa)
Klebsiella pneumoniae 342-trigo (Triticum spp.)
Modelos de estudio en el laboratorio
Festuca SFRO var. Don Tomás
Caña de azúcar (Saccharum officinarum)
Sorgo dulce var. M81E (Sorghum bicolor)
Canola (Brassica napus)
• Sorghum bicolor (sorgo dulce) pertenecen a la familia de las Poaceae • Es el quinto cultivo en importancia en el mundo • A este cultivo se lo define como multipropósito (biocombustible, alimento, energía) • Variedad utilizada en ALUR M81E, introducida de la Universidad de Kentucky USA
Sorghum bicolor (L) Monech
General
Determinar mediante estudios de interacción planta-bacteria si los probables endófitos bacterianos asociados al sorgo dulce tienen un papel significativo en promover el crecimiento vegetal de la variedad M81E
Objetivos
1. Construir una amplia colección de probables endófitos bacterianos nativos asociados a plantas adultas de la variedad M81E de interés para ALUR S.A.
2. Caracterizar bioquímica y molecularmente la colección construida e identificar aislamientos de interés.
Específicos
3. Estudiar la respuesta en ensayos de invernáculo y de campo de plantas de sorgo dulce inoculadas con bacterias promotoras del crecimiento vegetal.
4. Determinar si los aislamientos promotores del crecimiento vegetal son endófitos verdaderos.
5. Determinar el efecto de la fertilización química sobre el microbioma
Estrategia
Ensayos de campo
Caracterización (PCV y PMI)
Ensayos de PCV
Identificación y filogenia
PF1
EU672801.1| Enterobacter arachidis Ah...
AJ853891.1| Enterobacter ludwigii EN-...
PC3
DQ504305.1|Pantoea dispersa LMG2603
PL2
JT26
U80196.1|Pantoea ananatis
AJ233423.1| Pantoea agglomerans DSM 3493
EF688009.1| Pantoea eucalypti LMG 24197
AJ233426.1| Rahnella aquatica (strain...
LT5
LT8
AF143245.1| Pseudomonas stutzeri
X06684.1| Pseudomonas aeruginosa ATCC...
JA5
EU184082.1| Pseudomonas lutea PSB2
D84020.1| Pseudomonas putida ATCC 12633
LF13
DQ095904.1| Pseudomonas fluorescens S16
JF5
JF1
D84013.1|Pseudomonas fluorescens ATCC...
X81665.1|Acinetobacter lwoffii(DSM2403)
JT25
X81660.1|Acinetobacter baumannii(DSM3...
AB166885.1| Stenotrophomonas koreensis
AM403589.2|Stenotrophomonas terrae st...
JF6
EU573216.1| Stenotrophomonas chelatip...
FJ404810.1| Stenotrophomonas sp. DNPA8
FJ748683.2| Stenotrophomonas pavanii ...
JL9
PL12
JC2
X95923.1|Stenotrophomonas maltophilia...
JT9
JA15
LA2
HQ536002.1| Bacillus subtilis DP14
91
100
97
100
100
100
54
43
51
97
47
57
94
100
100
71
72
87
71
37
89
78
100
40
91
71
100
61
78
93
89
87
97
0.02
Construcción de una colección Semillas, raíces y tallos
Mareque et.al., 2014; Heijo 2015
Productores de proteasas
Formadores de biopelículas
Productores de celulasas y hemicelulasas
29
5/3
41
PM
I Caracterización de la colección Colección: 369 aislamientos
Solubilizadores de fosfatos (P)
Productores sideróforos (Fe)
Diazótrofos (N) (nifH+/película de crecimiento)
Productores AIA (ácido indol acético) 66
146
22
25
PC
V
Alto potencial biotecnológico
Identificación y filogenia
Árbol filogenético basado en las secuencias de gen 16S ARNr de los aislamientos asociados a sorgo dulce
• Gran diversidad bacteriana
• Géneros nuevos reportados como asociados a sorgo dulce
Mareque et.al., 2014; Heijo 2015
Ensayos de promoción del crecimiento vegetal en invernáculo
Aislamiento Altura Tallo
(cm)
Diámetro Tallo
(mm)
Peso seco (g planta-1)
Raíz Aéreo
Control Negativoa 13,50 a 4,84 a 0,74 a 0,86 a
Rhizobium sp. UYSB12 14,44 ab 4,90 a 1,05 c 0,95 abc
Rhizobium sp. UYSB13 16,00 b 4,44 a 1,09 c 1,07 cd
Enterobacter sp. UYSB34 14,95 ab 4,73 a 0,93 abc 1,02 bcd
Pantoea sp. UYSB45 16,25 b 4,79 a 1,01 bc 1,15 d
Azospirillum brasilense Sp7 14,30 ab 4,90 a 0,77 ab 0,94 ab
Variedad de sorgo dulce M81E
Rhizobium sp. UYSB13 y Pantoea sp. UYSB45 son endófitos verdaderos
Pantoea sp. UYSB45::gfp
A: raíces (630X) y B: cofa de la raíz principal.
Rhizobium sp. UYSB13
Efecto de la fertilización química nitrogenada sobre la comunidad endofítica y diazotrófica
Mareque et.al., enviado
+N#(200#KgN/há)#
Raíz%Tallo%
inferior%Tallo%
superior%
-N#(0#KgN/há)##
Raíz%Tallo%
inferior%Tallo%
superior%
+N
-N
200 kgN/ha
0 kgN/ha
Campo Extracción
de ADN endofítico
Análisis por DGGE de la estructura y diversidad de la comunidad endofítica y diazotrófica
80.9
81.0
76.4
75.7
71.5
87.8
88.4
78.5
71.6
61.3
88.9
76.1
85.7
66.4
50.7
DGGE 16S
100
80
60
DGGE 16S
Tallo Inferior 3 +N
Tallo Superior 1 +N
Tallo Inferior 1 +N
Tallo Inferior 2 +N
Tallo Superior 3 +N
Tallo Superior 2 +N
Tallo Inferior 1 -N
Tallo Inferior 3 -N
Tallo Superior 1 -N
Tallo Superior 2 -N
Tallo Superior 3 -N
Raíz 1 -N
Raíz 2 -N
Raíz 3 -N
Raíz 1 +N
Raíz 2 +N
Raíz 3 +N
0.0% 16.7% 33.3% 50.0% 66.7% 83.3% 100%
Las comunidades se agrupan según los órganos
Tallo
R
aíz
Dentro de cada órgano: las comunidades se agrupan según el tratamiento +/-N
+N
+N
-N
-N
Tallo
R
aíz
Estructura de la comunidad endofítica (16S ADNr)
94.1
64.1
83.3
80.9
47.5
37.8
95.2
73.5
71.0
66.6
94.1
90.8
51.2
34.7
nifH
10
0
80
60
40
nifH
Tallo Inferior 1 -N
Tallo Inferior 2 -N
Tallo Inferior 3 -N
Tallo Superior 1 -N
Tallo Superior 2 -N
Tallo Superior 3 -N
Raíz 1 -N
Raíz 3 -N
Tallo Superior 1 +N
Tallo Superior 2 +N
Tallo Inferior 3 +N
Tallo Superior 3 +N
Tallo Inferior 1 +N
Raíz 1 +N
Raíz 2 +N
Raíz 3 +N
0.0% 16.7% 33.3% 50.0% 66.7% 83.3% 100%
Estructura de la comunidad endofítica-diazotrófica (nifH)
+N
Tallo
Tallo
Raíz
Raíz
En cada tratamiento (+/-N): las comunidades se agrupan según los órganos (51,2 y 37,8%)
-N
Tallo
inferio
r Tallo
su
perio
r
Parcela –N: las comunidades se agrupan de acuerdo al tallo inferior/superior
-N
Las comunidades se agrupan según el tratamiento +/-N
+N
-N
Se debe considerar la fertilización química a la hora de modular el microbioma asociado con el fin de
obtener el efecto benéfico a través de la inoculación bacteriana
Perspectivas
• Profundizar en los ensayos de promoción del crecimiento vegetal:
• en diferentes sistemas (invernáculo, campo) • evaluar un amplio número de bacterias (diazótrofas) • estudiar la estabiliadad del inóculo a lo largo del tiempo • determinar cual es el mecanismo PCV
• Evaluar el efecto de la fertilización química nitrogenada:
• en la promoción del crecimiento vegetal • en microbioma asociado a sorgo dulce • en la expresión de genes específicos (funcionalidad)
Taulé-Barlocco et.al., en preparación
Formación de recursos humanos
Producción científica
• Mareque, C., C. Taulé, M. Beracochea and F. Battistoni. 2014. Isolation, characterization and plant growth promotion effects of putative bacterial endophytes associated with sweet sorghum (Sorghum bicolor (L) Moench). Annals of Microbiology. DOI 10.1007/s13213-014-0951-7.
• Mareque,C. Freitas,T., Estebanez Vollú,R., Seldin,L., Beracochea, M. and F. Battistoni. The chemical N-fertilization affects the structure and the composition of the endophytic-bacterial community associated with sweet sorghum (Sorghum bicolor), under field conditions. En evaluación.
• Congresos nacionales (7) • Congresos internacionales (3)
• 2011-2014: Cintia Mareque. Tesis de Maestría en Ciencias Biológicas, PEDECIBA. Apoyo ANII. “Producción sustentable en el cultivo de sorgo dulce: búsqueda de bacterias promotoras del crecimiento vegetal asociadas a Sorghum bicolor (L) Monech para su futura aplicación biotecnológica”.
• 2013-2014: Gabriela Heijo. Tesina de Grado. Facultad de Ciencias-UdelaR. Apoyo ANII. “Construcción y caracterización de una colección de probables endófitos diazótrofos nativos asociada a la variedad M81E de sorgo dulce (Sorghum bicolor)”
Cecilia Taulé: Estudiante de Doctorado Cintia Mareque: Estudiante de Doctorado Martín Beracochea: Estudiante de Maestría Gabriela Heijo: Estudiante de Maestria María Cecilia de los Santos: Estudiante de Grado Enzo Ferrari: Estudiante de Grado Margarita Sicardi (Facultad de Ciencias) Fernando Hackembruch (ALUR) Darío Rodriguez (ALUR) Alicia Castillo (INIA) Claudia Barlocco (INIA) Verónica Reis (EMBRAPA-Agrobiología, BR) Fabio Olivares (UENF-LBCT, BR) Euan James (The James Hutton Institute. UK) Lucy Seldin (Instituto de Microbiología, UFRJ, BR)