UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA

Estudio de la evolución de las poblaciones microbianas en el proceso de eliminación biológica de materia orgánica y nitrógeno

amoniacal en un SBR

Trabajo final de máster

María Miralles Doménech

Directores

Dra. Aurora Seco Torrecillas

Javier Claros Bedoya

Valencia, Septiembre de 2012

ÍNDICE

Índice

INTRODUCCIÓN

1.1 Generalidades ambientales y legislación ________________________________1

1.2 Contaminación de las aguas _________________________________________5

1.2.1 Características de las aguas residuales _______________________________5

1.2.2 Presencia de nutrientes en aguas residuales. Fósforo y Nitrógeno __________7

1.2.3 Efectos del nitrógeno en el medio natural y la salud humana _______________8

1.2.3.1 Eutrofización________________________________________________________8

1.2.3.2 Toxicidad en la fauna por presencia de amonio, nitrito y nitratos____________9

1.2.3.3 Efectos perjudiciales sobre la salud humana____________________________12

1.3 Sistemas de tratamiento de materia orgánica y nitrógeno __________________12

1.3.1 Procesos físico-químicos__________________________________________12

1.3.2 Procesos biológicos______________________________________________13

1.3.2.1 Nitrificación ________________________________________________________14

1.3.2.2 Desnitrificación_____________________________________________________15

1.3.2.3 Factores que afectan los procesos de nitrificación-desnitrificación _________16

1.3.2.4 Esquemas de tratamiento____________________________________________23

1.3.2.4.1 Esquemas convencionales _________________________________________23

1.3.2.4.2 Esquemas no convencionales ______________________________________26

1.3.2.5 Reactor Discontinuo Secuencial o SBR (Sequencing Batch Reactor) ______31

1.3.2.5.1 Etapas de funcionamiento de un reactor SBR _________________________31

1.3.2.5.2 Parámetros de funcionamiento de un reactor SBR _____________________34

1.3.2.5.3 Ventajas e inconvenientes del sistema SBR __________________________36

1.3.2.6 Microorganismos implicados en los sistemas de eliminación_____________37

1.3.2.6.1 Clasificación y características de las bacterias ______________________39

1.3.2.6.2 Técnicas de caracterización y cuantificación________________________42

1.3.2.6.3 Técnica de hibridación in situ (FISH)______________________________45

OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

2 Objetivos y plan de trabajo ___________________________________________47

MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Descripción del montaje experimental _________________________________49

3.2 Procedimiento experimental _________________________________________51

3.2.1 Parámetros de operación _________________________________________51

3.2.1.1 Selección del inóculo y características del agua residual________________51

I

Índice

3.2.1.2 Etapas de operación del reactor___________________________________52

3.2.1.3 Parámetros de funcionamiento____________________________________54

3.2.2 Puesta en marcha del reactor ______________________________________55

3.2.3 Operación y seguimiento del proceso ________________________________55

3.2.3.1 Analíticas físico-químicas ________________________________________56

3.2.3.1.1 Sólidos suspendidos totales y sólidos suspendidos volátiles_____________56

3.2.3.1.2 Ácido acético y alcalinidad _________________________________________57

3.2.3.1.3 Amonio, nitrito, nitrato y fósforo _____________________________________58

3.2.3.2 Analíticas microbianas __________________________________________58

3.2.3.2.1 Técnica de Hibridación In Situ FISH _________________________________59

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Puesta en marcha_________________________________________________69

4.2 Seguimiento del proceso ___________________________________________71

4.2.1 Evolución de los parámetros físico-químicos __________________________72

4.2.2 Evolución de las poblaciones microbianas ____________________________76

4.2.2.1 Análisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias amonioxidantes _________76

4.2.2.2 Influencia del pH y la concentración de oxígeno disuelto en la población de AOB __________________________________________________________________84

4.2.2.3 Análisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias nitritoxidantes ___________86

4.2.2.4 Influencia del pH y la concentración de oxígeno disuelto en la población de NOB _____________________________________________________________________90

4.2.2.5 Análisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias desnitrificantes __________93

4.2.2.6 Influencia del pH y la concentración de oxígeno disuelto en la población de desnitrificantes.____________________________________________________________97

CONCLUSIONES

Conclusiones _______________________________________________________100

BIBLIOGRAFÍA

Bibliografía_________________________________________________________102

II

Índice

III

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 Esquemas de eliminación biológica de nitrógeno: A) Wuhrmann, B) Ludzack-

Ettinger, C) Ludzack-Ettinger modificado, D) Bardenpho, E) Canales de oxidación _____________________________________________________ 25

Figura 2 Esquema del proceso de nitrificación-desnitrificación vía nitrito____________ 27

Figura 3 Esquema de una EDAR con un reactor SHARON de nitritación parcial _____ 28

Figura 4 Proceso combinado nitrificación parcial-ANNAMOX ____________________ 29

Figura 5 Esquema del sistema SBR. Adaptado de Wilderer et al., (2001) __________ 33

Figura 6 Árbol filogenético hasta ahora conocido de los organismos amonioxidantes basado en la secuencia 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). Las líneas filogenéticos asociadas a sistemas de aguas residuales están indicadas mediante flechas _______________________________________________ 38

Figura 7 Árbol filogenético hasta ahora conocido de los organismos nitritoxidantes basado en la secuencia 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). Las líneas filogenéticos asociadas a sistemas de aguas residuales están indicadas mediante flechas _______________________________________________ 39

Figura 8 Fotografía del montaje experimental ________________________________ 49

Figura 9 Esquema del montaje experimental _________________________________ 50

Figura 10 Esquema del procedimiento experimental ____________________________ 51

Figura 11 Secuencia y duración de las 5 etapas de trabajo del reactor SBR__________ 53

Figura 12 Árbol filogenético basado en el 16S rARN de los principales linajes de bacterias amonioxidantes. Se ha destacado en azul las sondas empleadas en el presente trabajo de investigación. Los paréntesis indican la cobertura de las sondas. (Nielsen et al., 2009) ____________________________________________ 59

Figura 13 Árbol filogenético basado en el 16S-rARN de los principales linajes de bacterias nitritoxidantes. Los paréntesis indican la cobertura de las sondas. (Nielsen et al., 2009) ____________________________________________ 60

Figura 14 Árbol filogenético basado en el 16S-rARN de los principales linajes de bacterias desnitrificantes. Los paréntesis indican la cobertura de las sondas. (Nielsen et al., 2009) ____________________________________________ 61

Figura 15 Evolución de la concentración de sólidos suspendidos durante la primera semana del período experimental __________________________________ 69

Figura 16 Evolución de la concentración de amonio, nitrito y nitrato durante la primera semana del período experimental en la fase final de la etapa de reacción ___ 70

Figura 17 Evolución de la concentración de ácido acético durante la primera semana del período experimental en la fase final de la etapa de reacción _____________ 70

Figura 18 Evolución de la concentración de sólidos suspendidos en el licor mezcla a lo largo del período experimental _____________________________________ 72

Índice

IV

Figura 19 Evolución de la concentración de ácido acético en el licor mezcla en la fase final

de la etapa de reacción __________________________________________ 73

Figura 20 Evolución de la concentración de los compuestos nitrogenados (amonio, nitrito y nitrato) en el licor mezcla en la fase final de la etapa de reacción __________ 74

Figura 21 Evolución de la concentración de los compuestos nitrogenados (amonio, nitrito y nitrato) en el licor mezcla en la fase final de la etapa anóxica _____________ 75

Figura 22 Porcentaje de AOB en el licor mezcla detectado con la sonda NSO1225 en relación con la sonda EUBmix. Concentración de nitrógeno amoniacal en la fase final de la etapa de reacción_______________________________________ 76

Figura 23 Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias de dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las β-proteobacterias AOB identificadas por la sonda NSO 1225. Imágenes tomadas a 63x ____________________________________ 78

Figura 24 Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias totales del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las β-proteobacterias AOB identificadas por la sonda NEU. Imágenes tomadas a 63x ____________________________________ 82

Figura 25 Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las β-proteobacterias AOB identificadas por la sonda Nmo218. Imágenes tomadas a 63x _________________________________ 83

Figura 26 Porcentaje de bacterias amonioxidantes en el licor mezcla detectadas con las sondas NSO1225, Nmo218 y NEu en relación con la sonda EUBmix _______ 84

Figura 27 Porcentaje de bacterias nitritoxidantes en el licor mezcla detectadas con las sondas NIT3 y Ntspa712 en relación con la sonda EUBmix. Concentración de nitrito y nitrato en la fase final de la etapa de reacción___________________ 87

Figura 28 Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las β-proteobacterias NOB identificadas por la sonda Ntspa712. Imágenes tomadas a 63x ________________________________ 89

Figura 29 Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las bacterias desnitrificantes identificadas por la sonda AT1458. Imágenes tomadas a 63x__________________________________ 95

Figura 30

Porcentaje de bacterias desnitrificantes (DES) en el licor mezcla detectadas con las sondas AT1458 y PAR651 en relación con la sonda EUBmix. Concentración de nitrito y nitrato en el licor mezcla al final de la fase anóxica de la etapa de reacción ______________________________________________________ 97

Índice

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Legislación española para el tratamiento de aguas residuales _____________ 3

Tabla 2 Requisitos de los vertidos procedentes de instalaciones de tratamiento de aguas residuales urbanas sujetos a lo dispuesto en el Anexo I (cuadro 1) de la Directiva Europea 91/271/CEE y modificación de la Directiva Europea 98/15/CEE _____________________________________________________ 4

Tabla 3 Listado de parámetros analizados en aguas residuales urbanas____________ 6

Tabla 4 Influencia del pH en el procesos de nitrificación________________________ 18

Tabla 5 Procesos influenciados por la presencia de nitrito ______________________ 19

Tabla 6 Relación de la temperatura con el proceso de nitrificación _______________ 21

Tabla 7 Clasificación de bacterias amonioxidantes y nitritoxidantes_______________ 40

Tabla 8 Características de las bacterias nitrificantes __________________________ 41

Tabla 9 Componentes principales en el agua residual _________________________ 52

Tabla 10 Temperatura y TRC sugerido para la nitrificación ______________________ 54

Tabla 11 Frecuencia de muestreo y análisis de los parámetros físico-químicos_______ 56

Tabla 12 Sondas de hibridación empleadas en la identificación micriobiológica ______ 62

Tabla 13 Volúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para la preparación de la solución de hibridación ____________________________ 67

Tabla 14 Volúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para la preparación de la solución de lavado ________________________________ 67

Tabla 15 Porcentajes de bacterias amonioxidantes, nitritoxidantes y desnitrificantes en relación con la sonda EUBmix (dominio Eubacteria) en el inóculo empleado para sembrar el reactor SBR __________________________________________ 71

Tabla 16 Porcentajes de AOB en el licor mezcla en relación con la sonda EUBmix____ 79

Tabla 17 Porcentajes de NOB en el reactor licor mezcla en relación con la sonda EUBmix (dominio Eubacteria) ____________________________________________ 88

Tabla 18 Porcentajes de desnitrificantes en el reactor licor mezcla en relación con sonda EUBmix (dominio Eubacteria)______________________________________ 93

V

INTRODUCCIÓN

Introducción

1.1 Generalidades ambientales y legislación

Los recursos naturales que emplean numerosos sectores en sus sistemas

productivos se han incrementado de manera considerable en las últimas décadas,

tanto por el aumento poblacional como por los cambios en los hábitos de consumo, lo

cual ha aumentado el total de residuos generados.

Las políticas de conservación del medio ambiente surgidas en los últimos 30

años han impulsado el desarrollo de técnicas que permiten optimizar el

aprovechamiento de los materiales, reduciendo las necesidades de materias primas y

por tanto, minimizando la generación de productos de desecho. La implantación de

sistemas que faciliten la reutilización posterior de la materia prima, así como el uso de

materiales que al finalizar su vida útil puedan ser gestionados desde una perspectiva

más respetuosa con el medio ambiente son algunas de las técnicas empleadas para

reducir los recursos necesarios.

Existen un gran número de residuos de naturaleza y características muy

diversas cuya gestión varía en función de aspectos tales como la tecnología

disponible, los posibles usos posteriores (reutilización, reciclaje), etc. En función del

sistema de producción al que nos estemos refiriendo, los materiales y las fuentes de

energía empleados variarán. No obstante, existe un recurso que se emplea

prácticamente en la totalidad de los sistemas productivos, el agua.

Se trata de un bien imprescindible para la vida que está sometido a una

explotación continua, lo cual disminuye su disponibilidad al tiempo que su calidad se

ve seriamente afectada.

Las fuentes de agua (manantiales, ríos, lagos, mares, etc.) sufren procesos de

contaminación tanto naturales (precipitaciones que incorporan impurezas contenidas

en el aire y el suelo a los medios receptores), como artificiales (incorporación de

sustancias contaminantes orgánicas e inorgánicas de origen industrial y urbano). Sin

embargo, mientras que la contaminación natural puede ser contrarrestada por los

procesos de autodepuración de que constan los sistemas naturales, la degradación de

los cursos y masas de agua por parte de actividades humanas superan en muchos

casos los niveles de contaminación que permiten la regeneración de las fuentes

receptoras.

Este hecho se debe al aumento demográfico y urbanístico, al desarrollo

industrial y a la intensificación de las actividades agrícolas y ganaderas que han

provocado el deterioro paulatino de la calidad del agua, entendiendo como calidad el

conjunto de características físicas, químicas y biológicas que hacen que el agua sea

apropiada para determinado uso.

1

Introducción

En los entornos naturales, tanto el estado del agua como su cantidad deben

mantenerse en unos estándares ambientales óptimos, para lo cual se han desarrollado

políticas de gestión, control y protección. Estos métodos de protección adquieren

especial relevancia con la disminución progresiva de las reservas hídricas, tal y como

ocurre con los países enclavados en la cuenta mediterránea.

El problema de la escasez de agua se ha visto agravado por los efectos del

cambio climático mundial, y aunque en las regiones pertenecientes a climas

mediterráneos los desequilibrios entre el agua demandada por la población y los

recursos hídricos son un hecho histórico, la dinámica de poblaciones y las

modificaciones climáticas han hecho que esta situación se agrave de manera

considerable. Por este motivo la depuración de aguas y su posterior reutilización se

han convertido en actividades necesarias para el mantenimiento tanto de los entornos

naturales como de determinadas actividades de producción.

El interés del presente trabajo se centra en el punto a partir del cual el agua ha

finalizado su fase productiva y pasa a ser un residuo que debe regenerado para que

sea posible su reintroducción en el medio natural sin que ello suponga ningún tipo de

riesgo para el medio ambiente y/o la salud pública.

Las aguas residuales son aquellas que proceden de la utilización de un agua

natural o de la red, y que por lo general son recogidas mediante un sistema de

alcantarillado para su envío a una estación depuradora de aguas residuales (EDAR).

Puesto que constituyen un importante foco de contaminación, deben ser sometidas a

tratamiento antes de su vertido.

Deben cumplirse los criterios de calidad establecidos, de forma que los niveles

de contaminación que queden en el efluente tratado puedan ser asimilados de manera

natural por el medio receptor.

Las técnicas empleadas así como los requisitos de vertido (expresados como

rangos cuantitativos de una serie de características fisicoquímicas y biológicas) vienen

definidos en la legislación correspondiente.

Legislación

A nivel europeo, la Directiva 91/271/CEE del Consejo, de 21 de mayo de 1991

sobre el tratamiento de las aguas residuales urbanas controla la gestión de las aguas

residuales. Esta directiva recoge las medidas necesarias para garantizar que todas las

aguas residuales urbanas y de determinados sectores industriales reciban el

tratamiento adecuado antes de su vertido. Se complementa con la Directiva 98/15/CE

de la Comisión de 27 de febrero de 1998 que modificó el cuadro 2 del Anexo I de la

Directiva 91/271/CEE, concerniente al vertido a zonas sensibles propensas a la

2

Introducción

eutrofización de aguas residuales urbanas procedentes de instalaciones de

tratamiento.

Además de la Directiva europea, en España existe una amplia legislación

referida al control de las aguas residuales. Algunas de las principales normativas se

indican en la Tabla 1.

Tabla 1. Legislación española para el tratamiento de aguas residuales

Título Contenido

Real Decreto Ley 11/1995, de 28 de diciembre.

Establece las normas aplicables al tratamiento de las aguas residuales urbanas y que constituye la transposición de la Directiva 91/271/CEE y una complementación a las leyes 29/1985, de 2 de agosto, de Aguas y 22/1988, de 28 de julio, de Costas.

Real Decreto 509/1996, de 15 de marzo, de desarrollo

del Real Decreto-ley 11/1995 de 28 de

diciembre.

Establece las normas aplicables al tratamiento de las aguas residuales urbanas.

Real Decreto 2116/1998, de 2 de octubre, por el que se modifica el Real Decreto 509/1996, de 15 de marzo,

de desarrollo del Real Decreto Ley 11/1995, de

28 de diciembre.

Establece las normas aplicables al tratamiento de las aguas residuales urbanas.

Real Decreto 995/2000, de 2 de junio.

Fija objetivos de calidad para determinadas sustancias contaminantes y se modifica el Reglamento de Dominio Público Hidráulico, aprobado por el Real Decreto 849/1986, de 11 de abril.

Real Decreto 1620/2007, de 7 de diciembre.

Establece el régimen jurídico de la reutilización de las aguas depuradas.

El objetivo de estas normativas es el de asegurar una correcta gestión de las

aguas residuales así como unos niveles de carga contaminante en las aguas tratadas

admisibles por el medio natural, tanto si se trata de aguas residuales urbanas como de

aguas residuales industriales.

En la Tabla 2 se indican los valores máximos permitidos de algunos de los

parámetros principales según la Directiva Europea 91/271/CEE y la modificación

llevada a cabo por la Directiva Europea 98/15/CEE.

3

Introducción

Tabla 2. Requisitos de los vertidos procedentes de instalaciones de tratamiento de aguas residuales urbanas sujetos a lo dispuesto en el Anexo I (cuadro 1) de la Directiva Europea 91/271/CEE y modificación de la Directiva Europea 98/15/CEE.

Parámetro Concentración Porcentaje mínimo de reducción

Demanda química de oxígeno (DQO) 125 mg/L 75

Demanda bioquímica de oxígeno sin nitrificación (DBO5 a 20 °C) 25 mg/L 70-90

Total de sólidos en suspensión 35 mg/L 90

Fósforo Total 2 mgP/L (10.000-100.000 h-e*) 1 mgP/L (>100.000 h-e) 80

Nitrógeno Total 15 mgN/L (10.000-100.000 h-e) 10 mgN/L (>100.000 h-e) 70 - 80

*h-e: habitantes equivalentes: Carga orgánica biodegradable con una demanda bioquímica de oxígeno de cinco días de 60 gramos de oxígeno por día.

En el caso de las concentraciones de nitrógeno y fósforo, los valores de vertido

indicados son obligatorios si el medio receptor está considerado como zona sensible a

la eutrofización o con tendencia a estarlo en un futuro próximo (Directiva 98/15/CEE).

Bajo esta consideración se encuentran embalses, ríos, lagos, parques nacionales,

parques naturales, lagunas, marjales, estuarios, bahías, rías y calas de toda España.

Sin embargo, para los núcleos de población de menos de 10.000 habitantes la

Directiva no establece una concentración límite de vertido o un porcentaje específico

de reducción. No obstante afirma que se debe hacer un tratamiento adecuado, que es

aquel que después del vertido permite respetar los estándares de calidad del medio

receptor. A falta de objetivos de calidad, en la práctica las estaciones depuradoras

localizadas en esos puntos adoptan como requisitos de vertido los valores de la Tabla

1.

4

Introducción

1.2 Contaminación de las aguas

1.2.1 Características de las aguas residuales

Las aguas residuales pueden ser de tres tipos:

- Aguas residuales domésticas: aquellas procedentes de zonas de

vivienda y de servicios, generadas principalmente por el metabolismo

humano y las actividades domésticas.

- Aguas residuales industriales: todas las aguas residuales vertidas

desde locales utilizados para efectuar cualquier actividad comercial o

industrial, que no sean aguas residuales domésticas ni aguas de

escorrentía pluvial.

- Aguas residuales urbanas (ARU): las aguas residuales domésticas o la

mezcla de las mismas con aguas residuales industriales y/o aguas de

escorrentía pluvial.

Las aguas residuales domésticas están compuestas principalmente por materia

orgánica, en su mayor parte biodegradable, así como cantidades importantes de

nitrógeno, fósforo y sales minerales. En cambio, la composición de las aguas

residuales industriales varía en función de la actividad, conteniendo en muchos casos

sustancias que por su alta carga contaminante y/o su peligrosidad están sujetas a una

legislación específica que prohíbe su vertido a colectores, por lo que deben ser

tratadas previamente.

Las aguas residuales urbanas unifican estos dos tipos de vertidos, sin

embargo, las características de cada vertido urbano van a depender del núcleo de

población en el que se genere, influyendo parámetros tales como el número de

habitantes, la existencia de industrias dentro del núcleo, tipo de industria, etc.

La contaminación generada en el agua puede ser de tres tipos:

- Física: provoca modificaciones en parámetros tales como turbidez,

color, olor, sabor, temperatura, radiactividad, espumas, conductividad,

etc.

- Química: tanto por la alteración de los componentes químicos naturales

del agua (incrementando o reduciendo su concentración) como por la

adición de sustancias que modifican ciertos parámetros como salinidad,

pH, oxígeno disuelto, aniones (cloruros, nitratos, nitritos, fosfatos,

sulfuros, cianuros), cationes (sodio, calcio y magnesio, amonio, metales

5

Introducción

pesados) y compuestos orgánicos como grasas y aceites, que

modifican tanto las características físicas como químicas.

- Biológica: debida a la introducción de microorganismos patógenos tales

como bacterias, virus, protozoos y otros organismos transmisores de

enfermedades que son un riesgo a nivel medioambiental y de salud.

En la Tabla 3 se presentan algunos de los parámetros que se determinan para

la caracterización de las aguas residuales urbanas.

Tabla 3. Listado de parámetros analizados en aguas residuales urbanas.

Parámetro Parámetro

Color Compuestos inorgánicos: Olor pH Sólidos (suspendidos y disueltos) Alcalinidad Temperatura Cloruros Materia orgánica: Metales pesados

Carbohidratos Nitrógeno Grasas y aceites Fósforo Pesticidas Contaminantes prioritarios Fenoles Azufre Proteínas Gases: Contaminantes prioritarios Sulfuro de hidrógeno Tensoactivos Metano Compuesto orgánicos volátiles (COV) Oxígeno

Constituyentes biológicos: Animales Plantas Virus y bacterias

Fuente: METCALF y EDDY, INC (1995)

En cuanto a los principales parámetros que se determinan a nivel de laboratorio

y que permiten controlar el buen funcionamiento del sistema de depuración de aguas

se pueden destacar los siguiente: sólidos suspendidos totales (SST) y sólidos

suspendidos volátiles (SSV), pH, conductividad, DQO, DBO5, nitrógeno amoniacal,

nitratos, nitritos, nitrógeno total y fósforo total. Sus valores de concentración aportan

información importante acerca del estado de las aguas.

La modificación de las características físico-químicas y biológicas del agua da

lugar a procesos de diversa gravedad en función de la naturaleza de los

contaminantes.

6

Introducción

Dentro de la gran variedad de sustancias de origen industrial y doméstico que

pueden pasar a formar parte de las aguas naturales y que resultan perjudiciales para

el medio ambiente, las más comunes son los compuestos de nitrógeno (N) y fósforo

(P).

1.2.2 Presencia de nutrientes en aguas residuales. Fósforo y Nitrógeno

En los últimos 20 ó 30 años las concentraciones de nitrógeno y fósforo en

muchos mares y masas de agua continentales casi se han duplicado debido a los

vertidos de origen industrial, doméstico y agrícola, superando los niveles normales de

concentración naturales.

A continuación se indican las fuentes y las formas químicas de los compuestos

de fósforo y nitrógeno de mayor relevancia, haciendo especial hincapié en los

compuestos nitrogenados, ya que es la base de estudio del presente trabajo.

Fósforo

Puede presentarse en el suelo en forma orgánica o inorgánica, disuelto o en

suspensión. Generalmente procede del desgaste de ciertas rocas (ej. apatita), del

lavado de suelos y principalmente de los detergentes polifosfatados (regularizados por

el Reglamento 648/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo, sobre detergentes).

Este nutriente es absorbido con facilidad por las partículas del suelo y aunque

se trata de un elemento de escasa movilidad, en determinadas condiciones puede

alcanzar las aguas subterráneas y/o aguas superficiales.

En aguas residuales las formas predominantes generalmente son los

ortofosfatos (PO4-3 ,HPO4

-2 ,H2PO4¯, H3PO4) con un porcentaje del 85%, mientras que

los polifosfatos (P2O7) y el fósforo orgánico, alcanzan valores del 15% (Jiménez,

2010).

Nitrógeno

En cuanto al nitrógeno, una elevada proporción (alrededor del 30%) llega a

través de la contaminación atmosférica. Se trata de un compuesto más móvil que el

fósforo y puede ser lavado a través del suelo o transferirse al aire por desabsorción del

amoniaco o por desnitrificación.

Inicialmente está presente en el agua residual en forma de nitrógeno orgánico

(urea y proteínas), pero es transformado rápidamente a partir de reacciones

bioquímicas a amoniaco (NH3) o a amonio (NH4+). La forma predominante es el

7

Introducción

amonio como consecuencia del pH característico del agua residual, aunque a pH

básico el equilibrio se desplaza hacia la forma no ionizada (Russo, 1985). La Ecuación

1 muestra la relación entre estas dos formas.

La forma oxidada predominante es el nitrato (NO3¯), ya que el nitrito (NO2

¯) es

muy inestable, al ser fácilmente oxidable a nitrato. Si existe acumulación de nitrito en

el medio, éste mantiene un equilibrio químico con el ácido nitroso (HNO2) en función

del pH y la temperatura (Ecuación 2).

Ecuación 2

Ecuación 1OHNHOHNH 234 +↔+ −−

22 HNOHNO ↔+ +−

Las variaciones en la concentración de estos compuestos se deben a los

procesos biológicos que llevan a cabo una gran diversidad de microorganismos. En el

campo de la depuración de aguas, la actividad bacteriana de estos microorganismos

se emplea como sistema de tratamiento para la eliminación del nitrógeno a través de

dos procesos principales: nitrificación y desnitrificación.

1.2.3 Efectos del nitrógeno en el medio natural y la salud humana

Las actividades humanas han alterado de manera significativa el ciclo global

del nitrógeno, aumentando la presencia de iones de amonio, nitrito y nitrato en el

medio acuático en muchas regiones del planeta.

La acumulación de estos compuestos en las aguas superficiales y subterráneas

puede dar lugar a efectos adversos en la salud humana y el medio ambiente, algunos

de los cuales se describen en los siguientes apartados.

1.2.3.1 Eutrofización

Se produce por un exceso de nutrientes en el agua y consiste en un

crecimiento acelerado de biomasa (fitoplancton, algas asociadas y macrófitas), siendo

más elevada la velocidad de producción de los niveles tróficos inferiores que la

velocidad de consumo por parte de los niveles tróficos superiores (Paerl, 1988).

8

Introducción

Los problemas que tienen lugar en un medio eutrofizado son tanto físico-

químicos como biológicos: aparición de olores, incremento de la turbidez, reducción

del oxígeno disponible, incremento de compuestos perjudiciales procedentes de la

descomposición de materia orgánica, variaciones de pH, etc. Estas modificaciones

afectan a la biodiversidad del medio natural, perjudicando las especies con mayor

sensibilidad a los cambios (por ejemplo, menor tolerancia a bajos niveles de oxígeno

disuelto) ya que únicamente son capaces de sobrevivir aquellas que logran adaptarse

a las nuevas condiciones del entorno.

La problemática de los vertidos con elevadas cargas de nutrientes varía en

función de la masa de agua receptora. En el caso de aguas continentales, las aguas

lénticas (lagos, lagunas, pantanos, etc.) se ven más seriamente afectadas por su bajo

índice de renovación hídrica. En cambio, las aguas lóticas (ríos, manantiales,

barrancos, etc.) son masas de agua de carácter fluvial que permiten la salida de estos

nutrientes hacia estuarios, deltas, mares y océanos. Cuando los nutrientes alcanzan

las aguas marinas y oceánicas provocan los denominados “blooms” de algas por el

enriquecimiento en compuestos nitrogenados, que es un factor limitante del

crecimiento en los medios acuáticos marinos.

Los principales parámetros que controlan los fenómenos de eutrofización son:

la disponibilidad de una fuente de carbono asimilable, la intensidad lumínica para llevar

a cabo los procesos fotosintéticos y la presencia de oxígeno disuelto. También existen

factores que pueden inhibir los procesos de crecimiento de los microorganismos y las

algas, como metales pesados y compuestos inorgánicos (EPA,1993).

En el caso de que se alcancen niveles graves de eutrofización, las aguas

pueden dejar de ser aptas para la mayor parte de los seres vivos, convirtiendo

entornos naturales en ecosistemas degradados, cuya recuperación supone

importantes inversiones.

1.2.3.2 Toxicidad en la fauna por presencia de amonio, nitrito y nitratos

La presencia de estos compuestos en cantidades anormalmente elevadas

puede dar lugar a una serie de efectos perjudiciales que varían en función de la

concentración y la forma nitrogenada. A continuación se citan algunas de las posibles

consecuencias.

Amonio

El ión amonio (NH4+) y el amoniaco (NH3) se encuentran estrechamente

relacionados mediante un equilibrio químico.

9

Introducción

El amoniaco tiene carácter tóxico tanto en masas de agua dulce como salada a

concentraciones de entre 1 y 10 mg/L. Su acción tóxica puede ser debida a algunas de

las siguientes causas (EPA, 2007):

- Destrucción del epitelio branquial

- Estimulación de la glucólisis y supresión del ciclo de Krebs

- Inhibición de la producción de ATP y reducción de sus niveles

- Alteración de la actividad osmorreguladora

- Disrupción del sistema inmunológico

Todo ello provoca que a diferentes concentraciones puedan darse problemas

de elevada gravedad como daños branquiales a niveles en torno a 0.06 mg/L, muerte

de las especies más sensibles con valores de amoniaco de 0.2 mg/L y muerte de

especies tolerantes al NH3 a niveles cercanos a 2.0 mg/L. Además de pérdidas de

equilibrio, desorientación, hiperexcitabilidad, incremento del ritmo respiratorio,

reducción de la excreción de nitrógeno, reducción del porcentaje de eclosió y menores

tasas de crecimiento (EPA, 2007).

Por otro lado, niveles elevados de Na+ y Ca2+ en el medio acuático pueden

reducir la susceptibilidad de los animales a la toxicidad del amoniaco (Chambers, et

al., 2001). Esto explicaría el hecho de que, en general, los animales de agua dulce

muestren una menor tolerancia a la presencia de amoniaco respecto de los animales

de aguas marinas.

Nitrito

El nitrito (NO2¯) y el ácido nitroso (HNO2) están estrechamente relacionados a

través de un equilibrio químico. Las concentraciones relativas de NO2¯ y HNO2

dependen básicamente del valor de pH del agua, ya que elevadas concentraciones de

nitrito y bajo pH favorecen la formación de ácido nitroso. (Russo, 1985). Ambos

compuestos poseen una elevada toxicidad, sin embargo en rangos de pH entre 7.5 y

8.5, típicos de ecosistemas acuáticos, la concentración de nitrito es del orden de 4 a 5

veces superior que la concentración de ácido nitroso (Russo, 1985, Camargo y Alonso,

2006).

Algunos de los efectos perjudiciales del nitrito son:

- Reducción de los niveles de cloro, provocando un desequilibrio

electrolítico grave.

- Modificaciones en los niveles de potasio intracelular y extracelular que

afectan los potenciales de membrana y los neurotransmisores

10

Introducción

provocando contracciones musculares que afectan a la función

cardiaca.

- Formación de compuestos nitrosos de carácter mutagénico y

cancerígeno.

- Represión del sistema inmunitario, con la consiguiente la disminución

de la tolerancia a las enfermedades bacterianas y parasitarias.

En general, la concentración de nitrito en aguas superficiales es muy baja, pero

puede aparecer ocasionalmente en concentraciones inesperadamente altas debido a

la contaminación de aguas residuales industriales y domésticas (Prat et al., 1999).

En aguas superficiales bien oxigenadas, el nivel de nitrito no suele superar la

concentración de 0.1 mg/L (Stumm y Morgam, 1981). Los valores entre 0.1 y 0.9 mg/L

pueden presentar problemas de toxicidad dependiendo del pH (Erikson, 1985), y

valores por encima de 1 mg/L son totalmente tóxicos y representan un impedimento

para el desarrollo de la vida piscícola y el establecimiento de un ecosistema fluvial en

buenas condiciones (Prat et al., 1999).

Nitrato El ión nitrato en medios acuáticos no se encuentra formando especies

desionizadas por tanto, la toxicidad de este compuesto se debe únicamente al efecto

de la forma iónica (Camargo et al., 2005).

Puesto que el nitrato tiene una baja permeabilidad branquial, presenta un

menor índice de toxicidad respecto a otros compuestos nitrogenados, Sin embargo, la

fauna acuática más sensible puede verse afectada si es sometida a niveles en torno a

10 mg/L durante períodos prolongados de tiempo (Camargo y Alonso, 2006).

En general los animales marinos son más tolerantes que los animales de agua

dulce a la toxicidad del nitrato, aunque determinados invertebrados marinos en estado

larvario pueden mostrar sensibilidad a concentraciones relativamente bajas de nitrato

en el medio acuático (Muir et al., 1991).

Los niveles máximos de nitrato recomendados están entre 2.9 y 3.6 mg/L con

el fin de asegurar la protección de la fauna acuática tanto continental como marina y

un nivel máximo más restrictivo de 2 mg/L (Camargo et al., 2005) para proteger

aquellas especies más sensibles.

11

Introducción

1.2.3.3 Efectos perjudiciales sobre la salud humana

La ingesta de nitrito y nitrato procedentes de aguas contaminadas puede

inducir metahemoglobinemia, que consiste en la transformación de hemoglobina en

metahemoglobina, que no es capaz de realizar el intercambio de oxígeno. En el caso

de los infantes (principalmente menores de 4 meses) puede provocar cianosis,

taquicardia, convulsiones, asfixia y en último término la muerte (Fewtrell, 2004).

Evidencias científicas sugieren además que la ingestión prolongada de nitratos

y nitritos puede resultar en procesos de mutagénesis y teratogénesis, en el desarrollo

de linfomas y cánceres, enfermedades coronarias, infecciones del tracto respiratorio, y

malformaciones en los recién nacidos (Carmago y Alonso, 2006). Además, la

formación de nitrosaminas a partir de la presencia de elevadas concentraciones de

nitritos en el organismo tiene un alto poder cancerígeno y tóxico (Russo, 1985).

Por otra parte, el enriquecimiento en nutrientes de los ecosistemas acuáticos y

la proliferación de algas tóxicas pueden causar, de manera indirecta, efectos adversos

sobre la salud humana dando lugar a trastornos fisiológicos y diversos síndromes de

intoxicación (Busse et al., 2006).

Como se ha visto hasta ahora, la problemática derivada del incremento en la

concentración de compuestos nitrogenados en las masas de agua no afecta

únicamente el medio ambiente y a la viabilidad de los diferentes hábitats, sino también

al ser humano.

A nivel práctico, las actuaciones para reducir la presencia de estos compuestos

en las aguas pueden llevarse a cabo en la fuente de origen (cambios en el sistema de

producción, empleo de sustancias menos contaminantes, etc.) o mediante su

eliminación posterior en estaciones depuradoras empleando esquemas de tratamiento

basados en procesos físicos-químicos y biológicos.

1.3 Sistemas de tratamiento de materia orgánica y nitrógeno

1.3.1 Procesos físico-químicos

Los procesos físicos-químicos empleados para eliminar el nitrógeno de las

aguas residuales son tecnologías de tratamiento de uso limitado debido a su elevado

coste, su funcionamiento irregular, y los problemas de explotación y mantenimiento

(Metcalf y Eddy, 1995). Las técnicas de mayor relevancia son (Rodrigo et al., 1999):

12

Introducción

Arrastre con aire (stripping) Consiste en la basificación del agua hasta alcanzar un pH en el que el equilibrio

NH4+/NH3 esté desplazado hacia la formación de amoníaco, que se elimina por

arrastre con aire.

Intercambio iónico

Se basa en la utilización de un intercambiador iónico (ejemplo, zeolita

clinophlolita) que presenta gran afinidad por el amonio. Supone el inconveniente de la

saturación del intercambiador que obliga a regenerarlo periódicamente.

Cloración al breakpoint

Consiste en la oxidación del amonio a nitrógeno gaseoso con hipoclorito. Tiene

buenos rendimientos, pero hace necesario un tratamiento del agua con carbón

activado o con SO2 para eliminar el exceso de hipoclorito en el agua tratada.

Precipitación por estruvita (MAP, magnesium ammonium phosphate) Este sistema de eliminación de nitrógeno consiste en la coprecipitación del

nitrógeno amoniacal y el fósforo ortofosfórico mediante la adición de óxido de

magnesio, formando una sal llamada estruvita (MgNH4PO4, fosfato amónico

magnésico hexahidratado).

Se emplea como tratamiento previo al sistema biológica en aguas residuales

urbanas y permite la eliminación de fósforo y nitrógeno junto con la obtención de un

fertilizante de liberación lenta si se cumplen las restricciones en cuanto al contenido en

metales pesados (Lopetegui et al., 2005).

1.3.2 Procesos biológicos

La eliminación de materia orgánica y nitrógeno en las estaciones depuradoras

se aborda generalmente por la vía biológica, sometiendo a la biomasa a condiciones

aerobias, anóxicas o anaerobias en función de los requerimientos de cada tratamiento.

Como principales ventajas de los procesos biológicos cabe destacar el elevado

rendimiento de eliminación, la alta fiabilidad, la relativa facilidad de control y el

moderado coste (Metcalf y Eddy, 1995).

En las estaciones depuradoras urbanas, entre un 5% y un 10% del nitrógeno

total contenido en el agua residual afluente es eliminado en etapa de decantación

primaria en forma de nitrógeno orgánico particulado. Por otro lado, en los sistemas de

fangos activos convencionales se elimina entre un 10% y un 30 % del nitrógeno total

13

Introducción

14

para satisfacer las necesidades nutricionales de la biomasa, que se estiman entre un

12% y un 13 % en peso de la biomasa formada (Sedlak, 1991). En la mayoría de los

casos esta eliminación no es suficiente para conseguir cumplir requisitos de vertido por

lo que se requiere de la aplicación de tratamientos específicos de eliminación de

nitrógeno.

Las reacciones que permiten la eliminación de nitrógeno son la nitrificación y la

desnitrificación, que vienen detalladas a continuación.

1.3.2.1 Nitrificación

La nitrificación consiste en la transformación del nitrógeno amoniacal a nitrato

por acción de un conjunto de bacterias autótrofas denominadas nitrificantes. Las

bacterias encargadas de realizar este proceso utilizan el carbono inorgánico (CO2 o

HCO3¯) como fuente de carbono, y obtienen la energía necesaria para su crecimiento a

partir de la oxidación del nitrógeno amoniacal. Este proceso se realiza en dos etapas

llevadas a cabo por dos grupos diferentes de microorganismos.

Las bacterias amonioxidantes (AOB) oxidan el amonio a nitrito en un proceso

denominado nitritación (Ecuación 3), y posteriormente las bacterias nitritoxidantes

(NOB) oxidan el nitrito a nitrato en un proceso denominado nitratación (Ecuación 4). La

Ecuación 5 se representa la reacción de oxidación global de amonio a nitrato.

OHHNOONH AOB2224 24232 ++⎯⎯→⎯+ +−+

En la Ecuación 6 se considera la reacción de síntesis de los microorganismos

implicados, que asimilan una fracción del amonio del agua residual para el tejido

celular. En esta reacción de síntesis, se asume como fórmula química de la biomasa

C5H7NO2.

Ecuación 5

Ecuación 4

Ecuación 3

−− ⎯⎯→⎯+ 322 22 NOONO NOB

ETAPA 1

ETAPA 2

OHHNOONH 2324 22 ++⎯→⎯+ +−+ REACCIÓN

GLOBAL

Introducción

15

−

La reacción global representativa del proceso de nitrificación obtenida a partir de

las reacciones de oxidación y síntesis de biomasa corresponde con la

ecuación 7:

Teniendo en cuenta esta reacción, se observa que en el proceso de nitrificación

se produce un consumo considerable de alcalinidad que supone un importante

descenso del pH del medio. La compensación del pH tiene lugar durante el proceso de

desnitrificación, que viene descrito a continuación.

1.3.2.2 Desnitrificación

Las bacterias encargadas de llevar a cabo este proceso son heterótrofas

capaces de (en ausencia de oxígeno) emplear el nitrito o el nitrato como aceptor de

electrones para degradar la materia orgánica.

La reacción general de desnitrificación se representa en la Ecuación 8, con el

metanol (CH3OH) como fuente de carbono orgánico.

En la Ecuación 9 se considera la síntesis de biomasa (C5H7NO2), la

degradación de la materia orgánica del agua residual (C10H19O3N) y el consumo de

nitrógeno amoniacal. La reacción global de eliminación de nitrato se puede escribir

como (WEF y ASCE, 1998):

−

3

Ecuación 8

Ecuación 7

Ecuación 622752432 54 ONOHCOHNHHCOCO +→+++

⎯→⎯+++ −2432 37224 ONHHCOCO

+− +++⎯→⎯ HOHNONOHC 422021 23275

⎯→⎯++−3233 167.0833.0 COHOHCHNO

−+++⎯→⎯ 3222 33.155.0 HCOOHCON

Ecuación 9 ⎯→⎯++++ +−+4331910 267.0267.0345.0 NHHCOHNOHCNO

OHCONNOHC 222275 3.2655.05.0612.0 +++⎯→⎯

Introducción

La efectividad de este proceso de eliminación de nitrógeno es máxima cuando

en el sistema no existe oxígeno disuelto disponible (condiciones anóxicas). De lo

contrario, las bacterias emplean como aceptor de electrones el oxígeno, cuya

asimilación se ve favorecida frente al nitrato, por lo que si existen ambos compuestos,

no tiene lugar el proceso de desnitrificación. El motivo es que el crecimiento bacteriano

en presencia de nitrato resulta menos eficiente que el crecimiento en presencia de

oxígeno, ya que no se genera la misma cantidad de energía en forma de ATP por

unidad de DQO (Demanda Química de Oxígeno) degradada (Brock, 2003).

Como ya se ha indicado anteriormente, el consumo de protones y la producción

de CO2 asociados a esta reacción supone un aumento de la alcalinidad, que

compensa la disminución de alcalinidad del proceso previo de nitrificación. Por ello la

desnitrificación es una etapa de gran importancia, ya que permite estabilizar el sistema

además de que elimina de forma muy eficiente el nitrógeno del agua.

1.3.2.3 Factores que afectan los procesos de nitrificación-desnitrificación

En relación a los factores que intervienen en los sistemas de depuración de

aguas residuales, existen numerosos agentes físico-químicos que afectan los

procesos de nitrificación y desnitrificación llevados a cabo por los microorganismos.

Por tanto, un adecuado desarrollo de la población bacteriana es la clave para obtener

unos rendimientos de eliminación de materia orgánica y nutrientes que cumplan con

los objetivos establecidos.

La densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes en un reactor depende

de diversos factores, siendo algunos de los siguiente parámetros ambientales los de

mayor relevancia: oxígeno disuelto (OD), pH, alcalinidad, temperatura, concentración

de nutrientes, salinidad, luz, presencia de tóxicos (como por ejemplo, metales

pesados) (Henze et al., 2002). Además de factores relacionados con el diseño del

sistema, como el ratio DBO/Nitrógeno.

En este apartado se van a comentar los principales factores que influyen en el

desarrollo bacteriano, haciendo especial hincapié en el pH y los nitritos.

Alcalinidad y pH

El pH es un parámetro que influye en la velocidad de los procesos biológicos

por lo que valores fuera del intervalo fisiológico de funcionamiento provocan la

ralentización del crecimiento de los microorganismos.

16

Introducción

El rango de valores de pH adecuado para que se den los procesos de

nitrificación y desnitrificación se halla entre 7 y 9, con un rango óptimo entre 7.5 y 8.5

(Metcalf y Eddy, 1995; Van Haandel y Van der Lubbe, 2007).

En la nitrificación se reduce el nivel de HCO3¯ generando una disminución de la

alcalinidad del medio. La mayor proporción de esta alcalinidad se consume en la

neutralización de los protones liberados en la oxidación del ión amonio (7.14 mg de

alcalinidad como CaCO3) mientras que durante la desnitrificación se producen 3.57 mg

de alcalinidad como CaCO3.

Para evitar que un sistema de nitrificación-desnitrificación se acidifique

progresivamente es necesario que la alcalinidad residual sea superior a 50 mg

CaCO3/L (Villaseñor, 1997, Gerardi, 2002).

En cuanto a la influencia del pH en la velocidad de crecimiento bacteriano,

aunque afecta a todas las bacterias, su efecto es más significativo en determinadas

poblaciones, como por ejemplo las bacterias autótrofas y las bacterias acumuladoras

de polifosfato (PAO). Las bacterias autótrofas presentan su máxima velocidad de

crecimiento para valores de pH en torno a 8 y en el caso de las bacterias heterótrofas,

el pH adecuado para su desarrollo comprende un intervalo de entre 7 y 8.

Cuando el valor de pH excede los rangos mínimo o máximo puede darse la

limitación del crecimiento bacteriano. Los procesos pueden ser biológicos, afectando

directamente a la actividad enzimática por la inhibición de los sitios activos de las

enzimas debido a la unión de H+ y OH¯ (García y Fernández-Polanco, 1996), lo cual

provoca una pérdida de actividad en las células. O químicos, reduciendo la

concentración disponible de HCO3¯ (fuente de carbono) (Carretero, 2010).

Según Grunditz y Dalhammar (2001), el pH óptimo para bacterias

amonioxidantes y nitritoxidantes está próximo a 8 y se observa una disminución similar

en la actividad de ambas bacterias para valores de pH inferiores o superiores, aunque

las bacterias AOB se encuentran menos afectadas a valores de pH elevados. Por otra

parte, Ju y Nallagatla (2003) obtuvieron que para concentraciones elevadas de

amonio, la máxima velocidad de nitrificación tenía lugar a un valor de pH de 7.6,

mientras que con concentraciones bajas de amonio, el pH óptimo se desplazaba hacia

valores superiores ya que conforme aumenta el valor del pH también lo hace el

porcentaje de moléculas de nitrógeno amoniacal en forma de NH3 (verdadero sustrato

de las bacterias amonioxidantes).

En la Tabla 4 se presentan los rangos de pH y su influencia sobre la actividad

de las bacterias nitrificantes.

17

Introducción

Tabla 4. Influencia del pH en el procesos de nitrificación.

pH Efecto sobre la nitrificación

4.0 a 4.9 Presencia de bacterias nitrificantes (nitrificación organotrófica) 5.0 a 6.7 Velocidad de nitrificación lenta 6.7 a 7.2 Velocidad de nitrificación se incrementa 7.2 a 8.0 Velocidad de nitrificación constante 7.5 a 8.5 Nitrificación por bacterias nitrificantes

Fuente: Gerardi (2002)

Compuestos nitrogenados: Amonio, nitrito y nitrato Son las fuentes de energía o dadores de electrones de las bacterias

nitritoxidantes y desnitrificantes. Por esta razón son factores limitantes de gran

relevancia en el crecimiento bacteriano. No obstante, si se hallan presentes en una

elevada concentración puede llegar a inhibir el desarrollo de las bacterias (Anthonisen

et al., 1976; Glass y Silverstein, 1998; Surmacz-Gorzka et al.,1996).

Tanto el pH como la temperatura modifican el equilibrio en el que se hallan

presentes (Anthonisen et al., 1976; Claros et al., 2010). Un pH elevado provoca la

inhibición del proceso de nitrificación debido al propio efecto del pH (Claros et al.,

2010). Mientras que un pH bajo inhibe el proceso por efecto del propio pH y por la

generación de ácido nitroso a partir de iones nitrito.

Las bacterias nitritoxidantes son más sensibles que las amonioxidantes a los

efectos de inhibición provocados por amonio y nitrito (Vadivelu et al., 2007), aunque

hay una enorme disparidad en los valores recopilados en bibliografía. Las poblaciones

de Nitrosomonas y Nitrobacter pueden verse seriamente afectadas cuando la

concentración de amoniaco alcanza valores de 10 mg/L y 0.1 mg/L respectivamente

(Gerardi, 2002). Y en cuanto al ácido nitroso, ambos géneros se ven inhibidos a una

concentración de 1.0 mg/L.

El efecto inhibitorio que causa el nitrito sobre la actividad bacteriana es objeto

de interés en numerosos procesos, tal y como muestra la Tabla 5.

Zumft (1993) informó que muchas especies de bacterias son susceptibles a la

toxicidad del nitrito a causa de la formación del complejo metal-nitrosyl que ocurre

cuando los iones NO o los radicales NO interactúan con enzimas bacterianas. Otra

posible causa de la inhibición por nitrito es la presencia de ácido nitroso y su influencia

en el crecimiento celular (Almeida, 1995).

18

Introducción

Tabla 5. Procesos influenciados por la presencia de nitrito.

Proceso Inhibición (%)

Nitrito (mg/L) Referencia

Oxidación de amonio 60 280 Stein and Arp (1998) Oxidación de amonio 0-80 80-3000 Groenewg et al., (1994) Oxidación de amonio 50 42-70 Muller et al., (1995) Anammox 100 >280 Jetten et al., (1999) Remoción anóxica de fósforo n.s. 5-10 Kuba et al., (1996) Remoción anóxica de fósforo 100 >8 Meinhold et al., (1999) Síntesis de ATP n.s. 380 Almeida et al., (1995a) Desnitrificación 100 308 Almeida et al., (1995a) Desnitrificación a pH 6 100 250 Glass et al., (1997) Crecimiento de Clostridium spotogenes 50 140 Cui et al., (1992) Crecimiento de Pseudomonas denitrificans 27 100 Komaros and Lyberatos (1997) Crecimiento de Pseudomonas fluorescens 60 98 Almeida et al., (1995a) Crecimiento de Pseudomonas fluorescens 100 308 Almeida et al., (1995a) Metanogénesis 100 70 Klüber and Conrad (1998a) Nitrificación 40 100 Dahl et al., (1997) Nitrificación 20 100 Philips and Verstraete (2000)

Fuente: Romero (2010)

También es importante destacar las implicaciones económicas que puede tener

un incremento en la concentración de nitrito en plantas de tratamiento biológico

- Una concentración elevada de nitrito en el proceso de cloración de la

etapa terciaria de desinfección reduce la capacidad desinfectante del

cloro ya que parte de su función oxidante es empleada para oxidar

estos compuestos (Gerardi, 2002).

- Provoca el incremento en el consumo de oxígeno debido a la formación

de tetróxido de dinitrógeno (N2O4) que se genera abióticamente a partir

de nitrito y compite por el oxígeno en el proceso de oxidación de amonio

llevado a cabo por la encima amoniomonooxigenasa (AMO), que oxida

el amoniaco a hidroxilamina. Por tanto, un incremento en la

concentración inicial de nitrito provoca el incremento de la

concentración de N2O4provocando un aumento de la constante de

semisaturación para el oxígeno.

- Una elevada concentración de nitrito en el medio tiene un efecto

estimulante sobre el desarrollo de microorganismos filamentosos

(Musvoto et al., 1999). Casey (1999) halló que bajo condiciones de

elevada concentración de nitrito, cuando el fango activo era sometido a

alternancia de condiciones aeróbicas/anóxicas, se producía una

acumulación intracelular de NO durante el periodo de anoxia en

19

Introducción

bacterias formadoras de flóculos, aunque no en filamentosas,

provocando su inhibición en la etapa de consumo de oxígeno. De esta

manera las bacterias filamentosas experimentaban una ventaja

competitiva sobre las formadoras de flóculos y proliferan.

Oxígeno disuelto

El consumo de oxígeno en el proceso de nitrificación supone que por cada mg

de N-NH4 (nitrógeno en forma de amonio) oxidado a N-NO3 (nitrógeno en forma de

nitrato) se necesitan 4.57 mg de oxígeno, de los cuales 3.44 mg son consumidos por

las bacterias amonioxidantes y 1.13 mg por las bacterias nitritoxidantes. Mientras que

en la desnitrificación, una concentración que supere valores entre 0.3 mg O2/L y 1.5

mg O2/L inhibe el proceso de desnitrificación (Ciudad et al., 2005; Zafarzadeh et al.,

2011).

Las bacterias autótrofas nitrificantes son más sensibles que las bacterias

heterótrofas a la falta de oxígeno, habiéndose observado que concentraciones de

oxígeno disuelto inferiores a 1 mg/L conducen a una reducción significativa de su

velocidad de crecimiento (Grady et al., 1999). En sistemas con bajas edades de fango

y alta carga, el consumo de oxígeno es elevado y pueden crearse deficiencias en el

interior de los flóculos, ante las cuales las bacterias nitrificantes son muchos más

sensibles que las heterótrofas (Villaseñor, 1997)

Las bacterias amonioxidantes (AOB) tienen una constante de saturación

diferente a la de las bacterias nitritoxidantes (NOB). Existen estudios que indican que

las bacterias AOB tienen menor afinidad por el oxígeno que las bacterias NOB

(Hellinga et al., 1998; Pérez, 2001) y otros que por el contrario, proponen una

constante de afinidad mayor para las NOB (Wiesmann, 1994; Guisasola et al., 2005;

Ciudad et al., 2005).

En cuanto al efecto del oxígeno sobre las bacterias desnitrificantes, es

importante tener en cuenta que muchas bacterias nitrificantes son facultativas y por

tanto pueden llevar a cabo la desnitrificación en ausencia de oxígeno y presencia de

compuestos oxidados de nitrógeno (Seviour y Nielsen, 2010), por tanto su crecimiento

no se verá tan afectado como en el caso de las bacterias no facultativas.

Temperatura

La temperatura afecta a varios factores, como por ejemplo los valores de las

constantes de equilibrio ácido/base, la solubilidad de las sustancias, los coeficientes

de difusión y la actividad enzimática.

20

Introducción

Una mayor temperatura, dentro del rango considerado como óptimo, supone un

aumento de la velocidad de crecimiento debido a que se incrementa la rapidez de las

reacciones enzimáticas. Sin embargo, si se exceden los límites máximos se produce la

desnaturalización de las proteínas y la alteración de las membranas lipídicas, lo que

provoca la muerte celular.

Por otro lado, temperaturas inferiores a los valores óptimos provocan una

disminución de la velocidad de crecimiento al impedir el adecuado funcionamiento de

la membrana celular por el cambio de estado de los lípidos de la membrana, que

pasan de ser fluidos a cristalinos. En la Tabla 6 se presentan los rangos de

temperatura y su efecto sobre el proceso de nitrificación.

Tabla 6. Relación de la temperatura con el proceso de nitrificación.

Temperatura Efecto sobre la nitrificación

> 45 ºC Se detiene el proceso 28 ºC a 32 ºC Rango de temperatura óptimo

16 ºC Aproximadamente el 50% de la velocidad óptima

10 ºC Reducción significativa de la velocidad de nitrificación. 20% de la velocidad óptima

< 5 ºC Se detiene el proceso Fuente: Gerardi (2002)

El proceso de nitrificación puede desarrollarse en un intervalo de temperatura

comprendido entre 8ºC y 30ºC (Gerardi, 2002), aunque a temperaturas bajas es

necesario incrementar los tiempos de retención celular para lograr mantener los

niveles de eliminación de nutrientes y materia orgánica.

La temperatura óptima para las bacterias amonioxidantes es aproximadamente

de 35ºC y para las bacterias nitritoxidantes el intervalo óptimo de temperatura se

encuentra entre 35ºC y 42ºC (González et al., 2010). Mientras que para las bacterias

desnitrificantes el rango de temperatura va de 0ºC a 50ºC, con un valor máximo de

desnitrificación a 40ºC (Lolmede et al., 2000).

Luz

La inhibición por luz es significativa en la superficie del agua, donde se observa

una reducción del 50% de la actividad de las bacterias nitrificantes a intensidades de

luz de un orden de magnitud tres veces menor que la intensidad a plena luz del día

(Prosser, 1989).

21

Introducción

Nutrientes En todo proceso biológico es necesaria la existencia tanto de nutrientes como

de micronutrientes, por lo que se debe verificar que la carencia de alguno de ellos no

inhiba el proceso: N, S, P, K, Mg, Ca, Fe Na y Cl (Pérez, 2001; González et al., 2010).

Sustancias inhibidoras

En sistemas de tratamiento de aguas residuales industriales es frecuente que

las poblaciones bacterianas se vean afectadas ante vertidos que provoquen una

modificación en las condiciones del afluente, inhibiendo la actividad bacteriana durante

largos períodos de tiempo o incluso provocando su muerte.

El efecto de las sustancias tóxicas sobre las bacterias depende de la

concentración de dicha sustancia y del tiempo de exposición. Las sustancias tóxicas

más referenciadas en el campo de las aguas residuales son algunos metales y ciertos

compuestos inorgánicos: Z, Cu, Ni, Ci, Cd, As, Cr, fluoruros, yoduros, cloroformo,

fenol, tiourea, hidracina, etanol, etilendiamina, anilina y acetona (Blum y Speece, 1991;

Pérez, 2001, González et al., 2010).

Ratio Demanda Biológica de Oxígeno (DBO)/NKT Se ha observado experimentalmente que existe una correlación entre la

capacidad de eliminación de nitrógeno de los procesos de fangos activos y el cociente

DBO/NKT, donde DBO es la demanda biológica de oxígeno y NKT es el Nitrógeno

Kjeldahl, fracción que contiene el nitrógeno orgánico reducido y el amoniacal.

La fracción de organismos nitrificantes disminuye al aumentar la proporción

DBO5/NKT y por tanto se produce una pérdida de eficacia. En sistemas combinados

de eliminación de materia orgánica y nitrógeno esta proporción es superior a 5,

mientras que en los sistemas en los que se separan ambos procesos, en la etapa de

nitrificación la proporción es superior a 3 (Bitton, 2011).

Por otro lado, en el proceso de desnitrificación a medida que aumenta la

relación DBO/NKT, hay mayor disponibilidad de materia orgánica fácilmente

biodegradable lo cual permite un desarrollo eficaz del proceso (Carretero, 2010).

Dióxido de carbono

La limitación en el crecimiento autótrofo se produce por falta de fuente de

carbono (CO2), aunque es difícil encontrar este tipo de limitación debido a su elevada

solubilidad. No obstante, en el caso de que el caudal de aireación no contenga CO2,

es importante asegurar cierto nivel de carbono en el medio para que no se produzca la

limitación.

22

Introducción

Transferencia de materia En el caso de cultivos en suspensión, la transferencia de materia entre fases

puede limitar el crecimiento de las bacterias. En el caso de biomasa inmovilizada hay

que tener en cuenta, además, la transferencia entre la fase líquida y la sólida y la

posterior difusión en el sólido (Garrido et al., 1997).

Salinidad

Las bacterias son capaces de sobrevivir en ambientes con altos niveles de

salinidad, manteniendo su citoplasma en el mismo nivel osmótico que el del medio

ambiente circundante (Oren, 1999). Sin embargo, recientes estudios han determinado

que se da una reducción de la actividad de las bacterias o una inhibición total cuando

se somete la biomasa a elevadas concentraciones de salinidad (Claros et al., 2010;

Moussa et al., 2006).

Estudios como los llevados a cabo por Vredenbergt et al., (1997) y Dincer et al.,

(1999) determinaron que la salinidad tiene un efecto más negativo sobre las bacterias

nitritoxidantes que sobre las amonioxidantes.

A continuación se describen los principales esquemas de tratamiento

existentes.

1.3.2.4 Esquemas de tratamiento

Aunque se ha hecho especial hincapié en el proceso empleado en este trabajo,

Reactor Secuencial Discontinuo, más conocido por sus siglas en inglés como sistema

SBR (Sequencing Batch Reactor), en el siguiente apartado se describen algunos de

los procesos más empleados, así como aquellos que se han desarrollado en los

últimos años y que están en proceso de investigación e implementación.

1.3.2.4.1 Esquemas convencionales

Los esquemas de tratamiento más ampliamente difundidos para la eliminación

biológica de nitrógeno consisten básicamente en la disposición de etapas aerobias y

anóxicas en las que se realizan los procesos de nitrificación y desnitrificación. En

función de la posición relativa de las zonas, estos sistemas se clasifican en sistemas

de predesnitrificación y sistemas de postdesnitrificación (Rodrigo et al., 1999).

En la predesnitrificación el agua residual es tratada primero en una etapa

anóxica y posteriormente en una etapa aerobia. Los nitratos llegan al reactor anóxico

23

Introducción

por medio de una corriente de recirculación interna, utilizándose para la desnitrificación

la materia orgánica contenida en el agua residual. La postdesnitrificación consiste en una etapa previa aeróbica en la cual la

materia orgánica contenida en el agua residual ha sido consumida y es necesaria la

adición de una fuente de carbono externa (generalmente, en forma de metanol) o bien

la alimentación de parte del agua residual bruta directamente al reactor anóxico. La

materia orgánica procedente de la degradación de la biomasa endógena puede

complementar las anteriores fuentes de carbono.

Estos sistemas pueden operarse en cultivos de lecho fijo o en suspensión. El

método en suspensión está ampliamente extendido, siendo el más sencillo el que

corresponde a una configuración de etapas anóxica/aerobia. Esta configuración ha

dado origen a varios esquemas de proceso, entre los que podemos destacar los

siguientes y cuyo esquema de tratamiento viene representado en la Figura 1.

Wuhrman Es un proceso de postdesnitrificación. Esto implica la necesidad de emplear

una fuente de carbono orgánico para la desnitrificación, obteniéndose por norma

general bajos rendimientos en cuanto a eliminación de nitrógeno.

Configuración Ludzack-Ettinger y Ludzack-Ettinger modificado Ambos procesos son de predesnitrificación, diferenciándose en que, en el

proceso modificado, la corriente de recirculación interna es independiente de la de

recirculación de fangos, mientras que en el Ludzack-Ettinger la recirculación de fangos

realiza también la recirculación de nitratos.

Esquema Bardenpho En este sistema se adicionan dos etapas al proceso base, una anóxica o de

postdesnitrificación y una aerobia o de postaireación. En la etapa de

postdesnitrificación la materia orgánica utilizada es la procedente de la degradación de

la biomasa endógena. De esta manera, se consigue un aumento en el rendimiento de

eliminación de nitrógeno oxidado. La etapa de postaireación elimina por arrastre el N2

formado durante la desnitrificación, mejorando de esta forma la sedimentabilidad del

fango

24

Introducción

25

Figura 1. Esquemas de eliminación biológica de nitrógeno: A) Wuhrmann, B) Ludzack-Ettinger, C) Ludzack-Ettinger modificado, D) Bardenpho, E) Canales de oxidación

A. Proceso Wurhmann

Purga Recirculación de fangos

Decantador Reactor aerobio

Reactor anóxico

B. Proceso Ludzack-Ettinger

Purga Recirculación de fangos

Decantador Reactor aerobio

Reactor anóxico

C. Proceso Ludzack-Ettinger modificado

Purga Recirculación de fangos

Decantador Reactor aerobio

Reactor anóxico

Recirculación interna

Recirculación de fangos

Recirculación interna

Purga

Decantador Reactor aerobio

Reactor anóxico

Reactor aerobio

Reactor anóxico

D. Proceso Bardenpho

Aireadores

Aireadores

Recirculación de fangos

Decantador

Purga

E. Canal de oxidación

Introducción

Canales de oxidación continuos y de fases Las operaciones de mezcla y aireación son fundamentales en estos reactores.

En uno o en varios puntos del canal se suministra oxígeno, originándose dos zonas

entre cada dos puntos de aireación: una aerobia (en la que conforme aumenta la

distancia al punto de aireación disminuye la concentración de oxígeno) y una anóxica

(que comienza cuando la concentración de oxígeno es cero y se prolonga hasta

alcanzar el siguiente punto de aireación). El tamaño de ambas zonas variará a lo largo

del tiempo dependiendo del caudal y características del agua residual, pudiendo ser

ajustado mediante el control de la aireación. Es fundamental un control de la operación

de mezcla para que no se produzca, como consecuencia de la agitación, una aireación

del fango en las zonas anóxicas. Por lo general, estos procesos se operan con

elevadas edades de fango para favorecer el proceso de nitrificación.

1.3.2.4.2 Esquemas no convencionales

Muchos estudios se centran en las limitaciones técnicas y económicas de los

procesos de nitrificación-desnitrificación en sistemas que tratan aguas residuales con

elevadas cargas de nitrógeno y bajas cargas de carbono orgánico (Paredes et al.,

2007).

Por este motivo, se han desarrollado diferentes esquemas de tratamiento que

han puesto de manifiesto la posibilidad de optimizar el rendimiento de eliminación de

nitrógeno (en su mayor parte en forma de amonio) que suele provenir de corrientes de

recirculación interna de la planta (sobrenadante de la digestión anaerobia) o de

vertidos de determinados procesos industriales.

Potenciación de organismos nitrificantes en un sistema BABE®

Se trata de un proceso biológico de crecimiento y acumulación de organismos

nitrificantes (Bio-Augmentation Batch Enhanced) (Zilverentant, 1999) que contribuye a

optimizar la eliminación biológica del nitrógeno de la línea de aguas de una EDAR. El

objetivo de este esquema de tratamiento es potenciar el proceso de nitrificación en

sistemas de fangos activados que trabajan a bajas temperaturas (<15ºC) y por tanto

tienen limitada la velocidad de crecimiento de los organismos nitrificantes (Salem,

2003).

El proceso consiste en un reactor independiente que emplea como afluente la

corriente procedente de la deshidratación de fangos y una pequeña fracción del fango

de recirculación proveniente del sistema biológico. Mediante la alta concentración de

26

Introducción

27

bacterias autótrofas nitrificantes presentes en la corriente de recirculación y la elevada

concentración de nitrógeno del agua de deshidratación, se potencia el crecimiento de

los microorganismos, incrementando la eficiencia del sistema y reduciendo el TRC

necesario para conseguir la nitrificación. La corriente generada en el reactor BABE® es

introducida en la línea principal de la EDAR, mejorando el porcentaje de eliminación

global de nitrógeno de la planta.

Nitrificación-desnitrificación vía nitrito

La Figura 2 muestra el esquema de nitrificación-desnitrificación vía nitrito.

Consiste en la oxidación del amonio a nitrito, evitando que el proceso de oxidación

continúe. En el sistema global, el consumo de oxígeno necesario empleando este

proceso se reduce un 25% en la etapa aerobia, y supone un ahorro de materia

orgánica de entre un 40% y un 60% en la etapa anóxica, además de que se produce

un 300% menos de biomasa (Ciudad, 2007).

222324 NONNONONONONH NOBAOB ⎯→⎯⎯→⎯⎯→⎯⎯→⎯⎯⎯ →⎯⎯⎯→⎯ −−−+

Figura 2. Esquema del proceso de nitrificación-desnitrificación vía nitrito

Para llevar a cabo este proceso se requiere reducir la actividad de las bacterias

que realizan el paso de nitrito a nitrato, y los principales parámetros sobre los que se

puede actuar son: oxígeno disuelto (OD), pH, temperatura y tiempo de retención

celular. La concentración de OD es un adecuado parámetro de control de la oxidación

de amonio a nitrito debido a que las bacterias amonioxidantes (AOB) y las

nitritoxidantes (NOB) poseen distinta afinidad por el oxígeno, con una mayor

sensibilidad de las NOB a bajas concentraciones de OD (Wiesmann, 1994; Garrido et

al., 1997).

Por otra parte, el pH es un parámetro que permite controlar el equilibrio de las

formas iónicas y no iónicas del medio. Alcanzar un pH alcalino tiene dos efectos en las

bacterias NOB: la inhibición por amoníaco y la limitación por sustrato (Ciudad, 2007).

Sin embargo, se ha observado que puede darse la aclimatación a concentraciones

crecientes de amoniaco (entre 0.1 y 10 mg N-NH3/L) entre la población de NOB

(Villaverde et al., 2000), por lo que se han desarrollado sistemas de trabajo que

Paso 2

O2 Nitrificación Materia orgánica

DesnitrificaciónPaso 1

Introducción

28

emplean la temperatura como parámetro de control. Trabajando en un rango de entre

28ºC y 34 ºC y una baja retención de sólidos es posible reducir la concentración de

bacterias nitritoxidantes en el reactor (Hellinga et al., 1998).

Dada la dificultad para mantener estable en el tiempo una eficiente oxidación de

amonio junto con la inhibición de la oxidación de nitrito a nitrato se han desarrollo

diversos esquemas de tratamiento. Éstos involucran además de la nitrificación parcial,

la desnitrificación, empleando para ello los principales sistemas existentes, como son

los cultivos en suspensión o en soporte sólidos, los reactores secuenciales (SBR) o de

flujo continuo (RCTA) y la combinación de procesos en reactores independientes o en

un único reactor.

Algunos de los principales esquemas de tratamiento se describen a continuación.

Nitrificación parcial: SHARON

El sistema SHARON (Single reactor High activity Ammonia Removal Over Nitrite)

permite tanto la eliminación de nitrógeno por la vía del nitrito como la desnitrificación,

que puede realizarse con el objetivo de controlar el descenso del pH y/o lograr una

completa eliminación del nitrógeno siguiendo la ruta del nitrito.

Se fundamenta en la selección de bacterias AOB frente a bacterias NOB al

trabajar en rangos de temperatura elevados, que favorecen el crecimiento de las

bacterias amonioxidantes de modo que con tiempos de retención celular adecuados,

es posible reducir la concentración de bacterias nitritoxidantes en el reactor (Hellinga,

1998). El proceso se realiza alternando etapas aerobias y anóxicas, en un único

reactor o en un sistema de reactores independientes, operando a altas temperaturas

(30ºC – 40ºC), con un rango de pH entre 7 y 8.

En la Figura 3 se representa un esquema de una EDAR que incluye el reactor de

nitritación parcial para el tratamiento independiente de la corriente del sobrenadante

procedente de la desnitrificación del fango digerido anaeróbicamente.

Figura 3. Esquema de una EDAR con un reactor SHARON de nitritación parcial

Recirculación de fangos

Reactor biológico

Purga

Decantador

Reactor nitritación

Efluente deshidratación

Digestor anaerobio

Deshidratación

Introducción

29

Oxidación anaerobia de amonio: ANAMMOX Se trata de un proceso en el que bajo condiciones anóxicas el amonio es

convertido a nitrógeno gaseoso empleando nitrito como aceptor de electrones (Van

Dongen, 2003). Este tratamiento necesita de una nitrificación parcial previa que

permita obtener una relación entre amonio y nitrito próxima al 50%.

Los organismos involucrados en el proceso son bacterias autótrofas conocidas

como ANAMMOX, (ANaerobic AMMonia OXidation). Al ser autótrofas no requieren de

una fuente externa de carbono orgánico, siendo el dióxido de carbono su principal

fuente de carbono para el crecimiento (Van de Graaf, 1997). Estos organismos

emplean únicamente el nitrito como aceptor de electrones (Van Loosdrecht, 2005).

Los parámetros óptimos de trabajo deben mantener un pH en un rango de

valores entre 8 y 8.5 y una temperatura superior a 25ºC. Es importante tener en cuenta

que si la concentración de nitrito alcanza valores de entre 20 y 40 mg/L durante un

periodo de exposición superior a 24 horas, el proceso puede verse interrumpido de

forma irreversible (Fux, 2003).

Combinación de nitrificación parcial y ANAMMOX

En el proceso ANAMMOX, el amonio y el nitrito son consumidos de forma casi

equimolar, por lo que podría ser combinado con un proceso de nitritación parcial. Una

de las posibles opciones es el proceso SHARON, de forma que únicamente la mitad

del amonio sea oxidado a nitrito. Parte del amonio del agua residual es oxidado a

nitrito y el efluente de este proceso, que contiene amonio y nitrito a partes iguales, se

emplea como afluente del proceso Anammox, convirtiendo amonio a nitrógeno gas.

La complementación de ambos procesos autótrofos supone la eliminación de la

necesidad de una fuente de carbono externa y la reducción del consumo de oxígeno

entre un 50 % y un 60% (Van Hulle, 2005). Sin embargo, es importante mantener bajo

control dos parámetros principales: el oxígeno residual en el efluente del proceso de

nitrificación parcial, ya que podría inhibir a la actividad de las bacterias Anammox, y la

relación NH4+/NO2

¯, manteniéndola en un ratio 1.0:1.3.

Figura 4. Proceso combinado nitrificación parcial-ANNAMOX

0.1 NO3¯ NH4

+ NO2¯

NITRITACIÓN

ANAMMOX NH4

+

O2

0.9 N2

Introducción

Eliminación de nitrógeno con oxígeno limitado: CANON y OLAND

Se trata de un método de tratamiento que emplea un reactor de soporte sólido

que permite generar una biopelícula en la que se combinan simultáneamente los

procesos de nitrificación parcial y de oxidación anaerobia de amonio. En la zona

superficial de la biopelícula en contacto con el licor mezcla, la concentración de OD es

mayor y permite los procesos aerobios de nitrificación parcial, mientras que en las

capas inferiores se dan las condiciones que permiten el proceso de oxidación

anaerobia de amonio.

Los sistemas más conocidos son el sistema CANON (Completely Autotrophic

Nitrogen removal Over Nitrite) y el sistema OLAND (Oxygen Limited Aerobic

Nitrification-Denitrification) que difieren en la configuración del reactor.

Ambos procesos emplean la misma ruta de eliminación. Por lo tanto, pueden

ser denominados de forma colectiva como procesos de eliminación de nitrógeno con

limitación de oxígeno. Es una alternativa eficiente a la eliminación convencional de

nitrógeno que supone un ahorro de costes, especialmente para el tratamiento de

aguas residuales que contienen altas concentraciones de amonio pero carecen de

carbono orgánico.

Proceso CANON

Se trata de un sistema que consiste en la integración de la nitrificación

parcial y el proceso ANAMMOX y que transcurre en un único reactor de lecho

fijo. Bajo condiciones de oxígeno limitado, los dos grupos de bacterias

involucrados en los procesos de nitritación y ANAMMOX convierten

secuencialmente el amonio a nitrito y después a nitrógeno gas.

Este proceso es económicamente favorable ya que puede llevarse a cabo

en condiciones de oxígeno limitado además de no requerir una fuente externa

de carbono orgánico, ya que se trata de un proceso completamente autótrofo

(Third et al., 2001).

Proceso OLAND El proceso OLAND puede ser considerado como una variación del

proceso CANON. La reacción del amonio y el nitrito en la segunda fase del

sistema (ANAMMOX) es estequiométrica produciendo únicamente nitrógeno

gas, mientras que en el proceso CANON, se genera cerca del 11% de nitrato

respecto del total de nitrógeno en forma de N-NH4+ (Third et al., 2001) ya que la

relación nitrito:amonio es 1:3.

30

Introducción

1.3.2.5 Reactor Discontinuo Secuencial o SBR (Sequencing Batch Reactor)

Este tipo de reactores, más ampliamente conocidos por sus siglas en inglés,

SBR (Sequencing Batch Reactor), se han desarrollado como una variación del proceso

de fango activado. Es un sistema relativamente simple y compacto, ya que el

tratamiento completo tiene lugar en un mismo reactor.

El proceso consta de varias etapas que se reproducen de manera secuencial y

periódica, empleando tiempos que han sido previamente establecidos. Por tratarse de

un sistema por fases que ocurren en un mismo reactor, es posible combinar diferentes

etapas en función de los objetivos de calidad exigidos en el agua efluente.

1.3.2.5.1 Etapas de funcionamiento de un reactor SBR

Las etapas de funcionamiento de que consta este sistema son (Metcalf Eddy,

1995; Wilderer et al., 2001):

Etapa 1: Llenado Se lleva a cabo la adición de sustrato (agua residual) al reactor. Esta fase puede

constar de 3 sub-fases, que son:

- Llenado estático: el sistema completo está en modo no operativo

mientras que el agua es admitida en el reactor. Se produce la

acumulación de materia orgánica y nutrientes.

- Llenado con mezcla: el sistema de homogeneización del tanque está

operativo durante el proceso de admisión de sustrato. Tiene lugar una

mínima actividad aeróbica y generalmente se producen reacciones

anaeróbicas o anóxicas.

- Llenado con aireación: los sistemas de homogeneización y aireación

forzada están operativos, de modo que tienen lugar reacciones

aeróbicas y en muchas ocasiones permiten la simultaneidad de

condiciones anóxicas y aerobias en el interior de los flóculos.

Las reacciones que tienen lugar durante la etapa de llenado se completan

durante la etapa de reacción.

31

Introducción

Etapa 2: Reacción Tienen lugar los procesos de degradación de la materia orgánica y de

nitrificación-desnitrificación. Existen dos sub-fases posibles:

- Reacción con mezcla: se lleva a cabo la homogeneización sin emplear

el sistema de aireación forzada, lo que da lugar a un mínimo porcentaje

de reacciones aerobias y permite que se produzcan las reacciones

anóxicas y anaerobias.

- Reacción con aireación: permite la completa aireación del sistema y los

procesos de eliminación de nitrógeno.

El grado de interacción entre las aguas residuales que entran con un nuevo ciclo

y la biomasa que permanece en el tanque al finalizar el ciclo previo depende del grado

de aireación y mezcla del sistema. La duración de este período puede ser previamente

establecida para caudales de características físico-químicas y biológicas estables en el

tiempo, o se puede modificar en caso de caudales variables. Para ello se establece

como parámetro el consumo de oxígeno disuelto, que es un buen indicador del estado

de las reacciones biológicas de degradación y eliminación de materia orgánica y

nutrientes.

Etapa 3: Sedimentación Permite la separación de la biomasa y el agua tratada clarificada (sobrenadante).

El tiempo está definido, aunque la flexibilidad de este sistema permite variaciones en

la duración de esta etapa en función del estado de los flóculos y de la velocidad de

sedimentación. Uno de los parámetros empleados para determinar la finalización de

esta etapa es el volumen alcanzado por los fangos sedimentados.

Etapa 4: Vaciado El sobrenadante clarificado es extraído del sistema. La importancia del control

de esta etapa radica en evitar que junto con el clarificado sea arrastrado el fango

sedimentado. Para ello se emplean sensores que detienen la extracción en función del

nivel del manto.

Etapa 5: Purga

La eliminación del exceso de fangos permite mantener el tiempo de retención

celular, asegurando que los tiempo de funcionamiento escogidos sean efectivos.

Generalmente se lleva a cabo tras el vaciado, eliminando el porcentaje de fangos que

puede variar en función de las necesidades de la planta.

32

Introducción

En lo que respecta al diseño de este tipo de reactores, los parámetros más

importantes a tener en cuenta son: el número de ciclos, la duración y el orden de cada

fase, el tiempo de llenado así como la cantidad de agua residual introducida al reactor

y el tiempo de retención celular.

Los elementos principales de que consta un sistema de tratamiento de reactor

continuo secuencial son los siguientes y vienen esquematizados en la Figura 5:

- Pretratamiento: se emplea para la eliminación de gruesos, arenas y

grasas.

- Tanque de retención: asegura un caudal homogéneo de entrada a los

reactores.

- Reactor biológico: tiene lugar las reacciones de degradación y

eliminación de materia orgánica y nutrientes. El número de reactores

varía en función de las necesidades de la planta y determina tanto los

tiempos de llenado como la duración de los ciclos.

- Cámara de cloración: elimina elementos patógenos del agua tratada.

- Tanque de retención: permite homogeneizar el flujo de caudal efluente.

Purga

Purga

Purga

Reactores biológicos

Tratamiento primario

Tanque de retención

Cámara de cloración

Tanque de retención

(…)

Purga

Figura 5. Esquema del sistema SBR. Adaptado de Wilderer et al., (2001)

El número de reactores depende de los objetivos de calidad a alcanzar en el

agua efluente, ya que al incrementar la cantidad de reactores, se mejora la capacidad

de respuesta para tratar caudales variables mediante la modificación en los tiempos de

funcionamiento. De este modo se asegura un caudal efluente estable que facilite la

operación de los tratamiento secundarios, así como un volumen de vertido al medio

receptor que no sobrepase la capacidad del mismo.

33

Introducción

En cuanto a los posibles sistemas de funcionamiento existen 4 grupos en función

de la periodicidad del caudal y de las etapas empleadas que engloban los principales

métodos de operación de los reactores SBR:

- Caudal afluente periódico, una fase de reacción y una fase de

inactividad.

- Caudal afluente variable, fase de reacción y sin fase de inactividad

(necesidad de tanque de retención).

- Caudal afluente periódico, un selector y fases no reactiva y de

inactividad.

- Caudal afluente continuo.

Estos sistemas pueden orientarse para la eliminación de materia orgánica,

compuestos orgánicos y nutrientes (nitrógeno y/o fósforo). En cuanto a la eliminación

biológica de nitrógeno, la literatura propone diferentes esquemas de proceso,

principalmente a través de variaciones en el orden y la duración de las etapas,

coincidiendo en la necesidad de asegurar la disponibilidad de sustrato durante la fase

de desnitrificación mediante la adición de fuentes de carbono externas o modificando

los parámetros de funcionamiento, como con la sucesión de fases aeróbicas/anóxicas

breves o dividiendo la carga afluente.

1.3.2.5.2 Parámetros de funcionamiento de un reactor SBR

A continuación se indican los principales parámetros a considerar cuando se

trabaja con un reactor SBR (Balaguer, 2012): Variables relacionadas con el volumen (Vi)

Se define VT como el volumen total de reacción, es decir, el volumen del

reactor después de la fase de llenado. VS es el volumen que ocupa el fango

sedimentado tras la fase de sedimentación. V0 es el volumen del licor mezcla en el

reactor tras la fase de vaciado y previamente a la fase de llenado del siguiente ciclo,

compuesto por el volumen que ocupan los fangos decantados más el volumen

ocupado por el clarificado no extraído en la fase de vaciado. VF es el volumen de agua

residual que se añade en la fase de llenado de cada ciclo.

Variables relacionadas con la duración de cada ciclo (ti)

Se denomina Tc al tiempo de duración de cada ciclo y ti al tiempo de duración

de la fase i. Se distinguen las fases de llenado (tF), de reacción (tR), de sedimentación

34

Introducción

35

(tS), de vaciado (tD) y de reposo (tI), de forma que el tiempo de duración del ciclo es la

suma de los tiempos de duración de cada fase.

Tc = Σ ti = tF + tR + tS + tD + tI

Frecuencia del ciclo (n)

Es el número de ciclos por día. Define además del tiempo de duración del ciclo,

Tc, y el volumen de llenado de cada ciclo, VF. Donde Q es el caudal de agua residual a

tratar en m3/día.

Ratio de tiempo de llenado (RTLL)

Se expresa como el cociente entre el tiempo de llenado (tF) y el tiempo que dura

el ciclo (TC).

Ratio de intercambio de volumen (RIV)

Se calcula como el cociente entre el volumen de agua residual añadida en la fase

de llenado (VF) y el volumen total (VT).

Tiempo de retención hidráulico (TRH) Se define como el cociente entre volumen total de reacción y el caudal a tratar.

Ecuación 14

Ecuación 13

Ecuación 11

Ecuación 10

nTc

1= n

QVF = //

Ecuación 12C

F

TtRTLL =

T

F

VVRIV =

QVTRH T=

Introducción

Además también puede expresarse en función de TC:

C

F

O

F

FOT TVV

VmVV

QV

TRH ⋅⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+=

⋅+

== 1)(

Ecuación 15

Tiempo de retención celular Se trata del tiempo necesario para que los microorganismos puedan

desarrollarse y determina el tiempo en el que el fango es extraído del reactor. Se

calcula como la masa de fango contenida en el reactor, MX, dividido por el caudal

purga de los mismos, PXT.

reacciónXT

X tPM

TRC ×= Ecuación 16

Donde:

reactorSSTreactorX CVM ×=

purgaSSTpurgaXT CQP ×=

Carga másica Representa la relación entre la demanda bioquímica de oxígeno que llega al

tratamiento biológico con la masa de fangos del reactor dando idea de la relación entre

el alimento y los microorganismos presentes en el reactor.

1.3.2.5.3 Ventajas e inconvenientes del sistema SBR

En cuanto a los inconvenientes y las ventajas podemos destacar los siguientes

(EPA, 1999):

Inconvenientes - En comparación con los sistemas convencionales, se requiere un nivel

mayor de sofisticación de las unidades de programación temporal y

controles, especialmente en sistemas de mayor tamaño. Esto requiere

un nivel de conocimientos elevado para su mantenimiento.

- Existe el riesgo potencial de arrastre de lodos flotantes o sedimentados

durante la fase de descarga del reactor en algunas configuraciones de

SBR.

36

Introducción

- La sedimentación en el propio tanque puede provocar el taponamiento

de los dispositivos de aireación durante ciclos operativos específicos,

dependiendo del sistema de aireación utilizado por el fabricante.

- Es necesaria la homogenización de caudales en función de los

procesos utilizados aguas abajo.

Ventajas

- Las etapas tiene lugar en un único reactor.

- Elevada capacidad para la retención de biomasa, que mejora los

procesos en los que intervienen organismos autótrofos.

- Tiene una gran flexibilidad de operación y de control. Versatilidad para

trabajar con fluctuaciones de caudal y de concentración de materia

orgánica.

- Ahorro potencial de inversión de capital por la eliminación de

sedimentadores y otros equipos y por las menores necesidades de

espacio.

- Mejor control del crecimiento de organismos filamentosos y de

problemas de decantación.

- Menor tiempo de control requerido.

- Fácil reconocimiento y corrección de los problemas de decantación.

Este sistema se emplea habitualmente para tratar caudales de pequeño volumen

y de carácter intermitente, y se emplean tanto para vertidos industriales como

municipales gracias a sus ventajas en la flexibilidad operacional (EPA, 1999).

Sin embargo, a pesar de sus importantes ventajas, por tratarse de un método

biológico de tratamiento está sometido a una serie de factores que pueden afectar la

evolución del proceso de depuración.

Una vez repasados algunos de los principales sistemas de tratamiento de aguas

residuales, a continuación se describen los microorganismos que intervienen en los

procesos biológicos de eliminación de materia orgánica y nutrientes así como las

diversas técnicas empleadas para su detección y cuantificación.

1.3.2.6 Microorganismos implicados en los sistemas de eliminación

Existen numerosos estudios que profundizan en la microbiología de los

procesos de nitrificación-desnitrificación (Wagner et al., 1996) y de eliminación de

fósforo (Mino et al., 1998) ya que se trata de los dos contaminantes principales en las

37

Introducción

aguas residuales. Sin embargo, el siguiente apartado se centrará en aquellos

microorganismos encargados de los procesos de eliminación de nitrógeno.

Como se ha comentado anteriormente, hay dos grupos de bacterias

filogenéticamente distintos que en conjunto realizan el proceso de nitrificación. Las

bacterias amonioxidantes (AOB) y las bacterias nitritoxidantes (NOB). El proceso final

de eliminación de nitrógeno es llevado a cabo por bacterias desnitrificantes, acerca de

las cuales los conocimientos existentes no son tan profundos como en el caso de las

AOB y NOB.

En las Figuras 6 y 7 se presentan los árboles filogenéticos de los

microorganismos amonioxidantes y nitritoxidantes hasta ahora conocidos.

Figura 6. Árbol filogenético hasta ahora conocido de los organismos amonioxidantes basado en la secuencia 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). Las líneas filogenéticos

asociadas a sistemas de aguas residuales están indicadas mediante flechas.

38

Introducción

Figura 7. Árbol filogenético hasta ahora conocido de los organismos nitritoxidantes basado en la secuencia 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). Las líneas filogenéticos

asociadas a sistemas de aguas residuales están indicadas mediante flechas.

El desconocimiento acerca de las bacterias desnitrificantes se debe a que

pertenecen a muy distintos géneros (Metcalf y Eddy, 1995) y a que los estudios de

identificación que se han llevado a cabo mediante métodos de aislamiento y cultivo no

representan el total de bacterias desnitrificantes que intervienen en los procesos

biológicos de una estación depuradora (Thomsen et al., 2007).

A continuación se describen los grupos de microorganismos que intervienen de

manera más relevante en la depuración de las aguas residuales y las técnicas

empleadas para su identificación.

1.3.2.6.1 Clasificación y características de las bacterias

Los microorganismos responsables de la nitrificación biológica se pueden

dividir en dos grupos, los nitrificantes autótrofos y los nitrificantes heterótrofos. Esta

clasificación se basa en el modo de obtener energía para el crecimiento.

39

Introducción

Tabla 7. Clasificación de bacterias amonioxidantes y nitritoxidantes CLASE ORDEN FAMILIA GÉNERO ESPECIE

Nitrosomonas

N. aestuarii N. communis N. europaea N. eutropha N. halophila N. marina N. nitrosa N. oligotropha N. ureae

Nitrosospira N. briensis N. multiformis N. tenuis

Nitrosolobus N. multiformis

βproteobacteria Nitrosomonadales Nitrosomonadaceae

Nitrosovibrio

Chromatiaceae Nitrosococcus

N. oceani N. halophilus N. nitrous N. mobilis

AM

ON

IOXI

DA

NTE

S

γproteobacteria Chromatiales

Ctothiorhodospiraceae Nitrococcus

αproteobacteria Rhizobiales Bradyrhizobiaceae Nitrobacter

N. alkalicus N. hamburgensis N. vulgaris N. winogradskyi

PHYL

UM

: Pro

teob

acte

ria

δproteobacteria Desulfobacterales Noctuoidea Nitrospina N. gracilis

DO

MIN

IO: E

ubac

teria

PHYL

UM

: N

itros

pira

e

Nitrospira Nitrospirales Nitrospiraceae Nitrospira N. marina N. moscoviensis

NIT

RIT

OXI

DA

NTE

S

Fuente: Jiménez (2010)

Los géneros que dominan los diferentes sistemas de tratamientos de aguas

residuales (Tabla 7) pertenecen al phylum Proteobacteria, y entre ellos destacan:

Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosovibrio y Nitrosolobus, que participan

en la primera etapa de la nitrificación. La segunda fase la llevan a cabo las bacterias

del género Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrospira y Nitrospina (Wagner et al., 1995;

Brock, 2003; Rodríguez y Peñuela, 2009, Avendaño et al., 2010). Todos los miembros

de estos dos grupos son bacterias gram-negativas quimioautótrofas, es decir, utilizan

compuestos químicos inorgánicos como fuente de electrones para la inmovilización de

carbono inorgánico. Los microorganismos quimioautótrofos, por lo general, son

aerobios (emplean oxígeno como aceptor final de electrones).

La Tabla 8 presenta las características de los principales géneros de bacterias

amonioxidantes y nitritoxidantes.

40

Introducción

Tabla 8. Características de las bacterias nitrificantes

Características Género Grupo Hábitats

Oxidan amonio Gram-negativas, bacilos cortos o

largos, móviles por flagelo polar o inmóviles, sistemas de membrana periféricos

Nitrosomonas Beta Aguas residuales, agua dulce, agua marina y suelos

Cocos grandes móviles, sistemas de membrana vesicular o periférico

Nitrosococcus Gamma Agua dulce, agua marina y suelos

Espirales móviles por flagelos peritricos, ningún sistema de membrana aparentes

Nitrosospira Beta Suelo

Pleomórficas lobuladas, células compartimentadas, móviles por flagelo peritricos

Nitrosolobus Beta Suelo

Bacilos incurvados Nitrosovibrio --- Suelo

Oxidan nitrito Bacilos cortos, se reproducen por

gemación, a veces móviles por flagelo terminal único o no móviles, sistema de membrana organizada como un casquete polar

Nitrobacter Alpha Suelo, agua dulce y agua marina

Bacilos largos inmóviles y sin sistema de membrana aparente

Nitrospina Delta Agua marina

Cocos grandes, móviles por uno o dos flagelos terminales y sistemas de membrana distribuidos aleatoriamente en tubos

Nitrococcus Gamma Agua marina

Células en forma de helicoidal a vibrioide, inmóviles, sin membranas internas

Nitrospira Grupo Nitrospirae

Agua marina y suelo

Fuente: Brock (2003)

Respecto a las bacterias desnitrificantes, existe una gran variedad taxonómica

(Metcalf y Eddy, 1995; Parés y Juárez, 1997). Pueden ser aerobias autótrofas o

heterótrofas y pertenecer a distintos géneros, entre los que se pueden destacar:

- Autótrofas: Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus, Agrobacterium

- Quimiolitrótofos: Thiobacillus, Thiomicrospira, Nitrosomas

- Diazótrofos: Rhizobium, Azospirillum

- Fotótrofos: Rhodopseudomonas

- Arqueobacterias: Halobacterium

41

Introducción

- Heterótrofas: Achromobacter, Aerobacter, Alcalibacter, Alcaligenes,

Bacillus, Brevibacterium, Flavobacterium, Lactobacillus, Micrococcus,

Proteus, Pseudomonas y Spirillum.

La variedad de tipos de bacterias capaces de llevar a cabo el proceso de

desnitrificación permite que bajo diferentes circunstancias (modificaciones de OD, pH,

temperatura, fuente de carbono, etc.) pueda tener lugar este proceso. Sin embargo,

los conocimientos acerca de las bacterias que tienen un papel más relevante en el

proceso de desnitrificación son escasos.

De entre los géneros de bacterias desnitrificantes que se consideran de mayor

interés en estaciones depuradoras destacan Azoarcus y Aquaspirillum (Thomsen et

al., 2007), Thauera y Zoogloea (Juretschko et al., 2002; Thomsen et al., 2007) y

Rhodocyclus (Thomsen et al., 2007), pertenecientes al phylum Betaproteobacteria. Los

resultados de estos estudios se obtuvieron a partir de muestras procedentes de

plantas de tratamiento de aguas residuales de diferentes orígenes, con diseños y

sistemas de operación diversos. Este hecho sugiere la posibilidad de que las bacterias

desnitrificantes, gracias a su capacidad para desarrollarse ocupando nichos ecológicos

diferentes en función de la fuente de carbono, sean capaces de colonizar ambientes

muy diversos pudiendo llevar a cabo su función desnitrificante (Thomsen et al., 2007).

1.3.2.6.2 Técnicas de caracterización y cuantificación

Actualmente las técnicas utilizadas para la detección y cuantificación de la

diversidad microbiana se dividen en técnicas convencionales de cultivo, técnicas

inmunológicas y técnicas moleculares basadas en el ADN.

A continuación se citan algunas de las más empleadas en la identificación y

cuantificación de poblaciones de microorganismos en sistemas de depuración de

aguas (Seviour y Nielsen, 2010).

Métodos convencionales

Corresponden a técnicas de cultivo convencional y no convencional, análisis

microscópico y Número Más Probable (NMP).

- Microscopía óptica: que puede ser de contraste de fases, de

interferencia, de campo oscuro, de fluorescencia y de luz ultravioleta.

Se emplea a nivel de laboratorio en las estaciones depuradoras y

42

Introducción

aunque en su mayoría no permite realizar la identificación de bacterias,

aporta información valiosa acerca del estado del fango.

- Tinción bacteriana: que permite la diferenciación celular y la

identificación a grandes rasgos. Son muchas las clases de tinciones

disponibles, sin embargo únicamente se emplean determinados tipos en

los sistemas de fangos activados (Jenkins et al., 2004), siendo la tinción

GRAM unas de las más extendidas. También es posible llevar a cabo la

determinación de la viabilidad bacteriana in situ mediante kits, cuya

metodología se basa en las diferencias en la permeabilidad de la

membrana celular bacteriana (Seviour y Nielsen, 2010).

- Técnica del número más probable (NMP) y sembrado selectivo de

placas (Matulewich et al., 1975): es uno de los métodos más extendidos

para la detección y cuantificación de bacterias en sistemas complejos.

Sin embargo, estas técnicas requieren mucho tiempo y a menudo

subestiman el número de bacterias ya que aíslan los microorganismos

de acuerdo a sus necesidades nutricionales, lo que da lugar a sesgos al

favorecer el crecimiento de determinadas especies frente a otras.

Estos procedimientos son lentos y laboriosos puesto que se tiene que aislar el

microorganismo (lo cual no en todos los casos es posible) y permitir su desarrollo en

un medio de cultivo hasta que alcance un tamaño o una etapa de crecimiento

adecuados para su identificación. Además de que en muchos casos no es posible

llevar a cabo la determinación de los tipos de bacterias presentes en una muestra de

manera precisa.

Por este motivo se han desarrollado otros métodos que permiten la identificación

in situ y la cuantificación. Se basan en la especificidad de los anticuerpos y en las

secuencias de ácidos nucleicos, son las llamadas técnicas inmunológicas y técnicas

moleculares.

Métodos inmunológicos

Se han desarrollado técnicas inmunológicas de identificación y cuantificación que

consisten en el uso de anticuerpos marcados con fluorescencia.

Este método es de alta sensibilidad e incluso puede identificar serotipos

específicos. Las células objetivo tienen que ser aisladas primero como cultivos puros y

43

Introducción

los anticuerpos producidos a menudo sólo reconocen unas pocas cepas de una

especie determinada. Posteriormente se desarrollaron los anticuerpos para la

detección de enzimas de amonioxidantes y nitritoxidantes que solucionan los

problemas de los anticuerpos que únicamente reconocen epítopos de la pared celular

(Aamand et al., 1996). Estos nuevos anticuerpos se usaron con éxito en la detección

de bacterias AOB y NOB en muestras ambientales (Bartosch et al., 1999; Fiencke y

Bock, 2004), así como en estudios fisiológicos de enzima clave (Pinck et al., 2001).

Sin embargo, se trata de un método de elevado coste, destructivo, no permite la

visualización de la célula y únicamente permite detectar células individuales en

suspensión.

Otras metodologías que permiten tanto la identificación como la cuantificación de

bacterias son los métodos moleculares basados en ADN y ARN.

Métodos moleculares basados en ADN y ARN

Los métodos moleculares de identificación de microorganismos se basan en el

estudio de las moléculas de ADN y ARN mediante técnicas basadas en la Reacción en

Cadena de la Polimerasa (RCP o PCR, por sus siglas en inglés) y en la hibridación de

ADN.

La PCR permite obtener un elevado número de copias del fragmento a amplificar

a partir de una pequeña concentración de ADN, prescindiendo del cultivo de los

microorganismos. Mediante esta técnica, es posible realizar el análisis de ciertas

regiones de los genes 16S, 23S y 5S del ADN recombinante, usando cebadores que

reconocen la secuencia nucleotídica de las regiones específicas. Generalmente se

emplea el nucleótido 16S rARN (Degrange y Bardin, 1995; McCaig et al., 1999), ya

que contiene zonas que son comunes para microorganismos filogenéticamente

semejantes y se trata de un gen relativamente corto, de aproximadamente 1500pb

(Holzer, 2007; Fukushima y Bond, 2010).

Dentro de las técnicas de hibridación mas utilizadas podemos destacar la técnica

de los Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica (RFLP’s) (Rodríguez-

Herrera et al., 2009). Consiste en extraer ADN de un cultivo puro de un

microorganismo o bien de una muestra y digerir el ADN con enzimas de restricción

(enzimas que cortan el ADN en sitios específicos). Posteriormente estos fragmentos

de ADN son separados en un gel de agarosa utilizando electroforesis. Esta

metodología es muy específica, sin embargo, no es muy rápida ni muy sensible (se

requiere 103 a 106 copias de la molécula o secuencia de interés para dar un resultado

44

Introducción

fiable) y se considera como un método semi-cuantitativo para el análisis de la

diversidad y la dinámica de ecosistemas microbianos.

Otra técnica que se emplea en el campo de la cuantificación e identificación es la

Citometría de Flujo. Consiste en medir las características de dispersión de la luz y la

fluorescencia que poseen las células conforme se las hace pasar a través de un rayo

de luz. Al atravesar el rayo, las células interaccionan con éste causando la dispersión

de la luz.

Basándose en la difracción se puede evaluar el tamaño de las células que pasan

(parámetro Forward Scatter) y al medir la reflexión de la luz de manera lateral se

evalúa la granularidad o complejidad de éstas (parámetro Side Scatter). Además de la

dispersión de la luz, si previamente a su análisis las células se sitúan en presencia de

anticuerpos monoclonales marcados con moléculas fluorescentes, se puede evaluar

que células poseen los antígenos complementarios a los anticuerpos monoclonales

usados, permitiendo el análisis multiparamétrico. Por tanto, esta técnica permite

combinar las medidas de distintos parámetros determinados sobre la misma célula y

relacionarlos. Sin embargo, una de sus más importantes desventajas es que las

células deben encontrarse individualmente en suspensión en un fluido.

Junto con las técnicas citadas hasta ahora, existen otras metodologías como el

estudio de comunidades y su funcionalidad mediante Chips de ADN (del inglés DNA

microarray), que consiste en una superficie sólida a la cual se une una colección de

fragmentos de ADN. Su funcionamiento se basa en la medición del nivel de hibridación

entre la sonda específica y la molécula diana, indicándose generalmente mediante

fluorescencia y analizándose por análisis de imagen.

La Microautoradiografía (MAR) es una técnica que se emplea para ensayos de

viabilidad, cuantificación de bacterias capaces de consumir un sustrato específico,

estudios de actividad autótrofa, toma de ortofosfatos y el uso potencial de diversos

aceptores de electrones por PAO, GAO (Organismos Acumuladores de Glicógeno) y

bacterias filamentosas. Consiste en la visualización mediante una emulsión sensible a

la radiación de un sustrato radiomarcado que es consumido por células individuales

(Seviour y Nielsen, 2010). Esta técnica suele emplearse en combinación con el

método FISH (Fluorescente in situ hybridization), que se desarrolla a continuación en

el siguiente apartado.

1.3.2.6.3 Técnica de hibridación in situ (FISH)

La técnica FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) es una metodología

citogenética utilizada para detectar y localizar la presencia o ausencia de

45

Introducción

determinadas secuencias de ADN o ARN. Mediante el análisis FISH podemos

identificar in situ bacterias que pertenecen a un grupo taxonómico específico (clase,

género, especie, etc.).

Esta técnica utiliza sondas de ADN marcadas con un agente de color

fluorescente (fluorocromo), que se unen a la fracción 16S del rARN de la bacteria,

generando una fluorescencia en las bacterias con la fracción de rARN coincidente

(Amann et al., 1990).

Se basa en la aplicación de los procesos de hibridación que se producen entre

secuencias complementarias de material genético. La doble hélice de ADN se

desnaturaliza mediante la aplicación de una elevada temperatura y al disminuir la

temperatura, las hebras se vuelven a unir por sus bases complementarias. Una

secuencia de ADN se puede unir a otra de ADN o también a una secuencia de ARN

complementaria, produciéndose un híbrido ADN-ADN, o ADN–ARN. De este modo,

una secuencia de ADN o de ARN de cadena simple que es complementaria de la

secuencia de interés (también llamadas sondas), puede utilizarse para identificar con

gran exactitud la presencia de la secuencia en preparaciones de ADN, ARN.

La sonda debe ser lo suficientemente grande como para hibridar específicamente

con su objetivo, pero no tan grande como para impedir el proceso de hibridación.

Para que una sonda sea específica, debe hibridar con su diana, pero no con las

otras cadenas de ácidos nucleicos presentes en la muestra. La especificidad varía con

la extensión de la cadena y las condiciones de hibridación, por lo que es posible

ajustarla a diferentes niveles filogenéticos.

La técnica FISH permite verificar la existencia de una especie determinada de

bacteria en una muestra compleja. Si disponemos de la sonda específica, es posible

identificar la presencia de una bacteria determinada, conocida como bacteria “diana”.

La diana es la cadena de ARN o ADN que se puede detectar utilizando la sonda. Estas

secuencias pueden localizarse en cromosomas, en plásmidos, en mitocondrias y en

ribosomas. Ciertas regiones de los ribosomas se encuentran en todos los seres vivos,

otras son comunes a todas las bacterias, y unas pocas se hallan en los miembros del

mismo género o especie, lo que permite utilizar la estructura ribosómica para

determinar la taxonomía bacteriana.

En las técnicas de hibridación in situ, el ADN de la célula puede ser teñido de

forma independiente del marcaje de la sonda específica. Esto se conoce como

contratinción y tiñe la cantidad total de bacterias presentes en la muestra. De esta

forma, podemos saber la cantidad de bacterias hibridadas respecto a la cantidad total

de bacterias. El compuesto más utilizado es el DAPI (diclorhidrato de 4',6-diamidino-2-

fenilindol), que emite fluorescencia en azul cuando es excitado por luz ultravioleta.

46

Introducción

En cuanto a las sondas, se suelen emplear secuencias de ADN y no de ARN ya

que las primeras son más resistentes a la degradación por nucleasas. Las sondas son

marcadas con fluorocromos como el FITC, rodamina, CY-3, CY-5, que emiten

fluorescencia bajo las condiciones apropiadas de excitación, haciendo posible su

visualización mediante un microscopio de fluorescencia.

47

OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

Objetivos y Plan de Trabajo

El objetivo principal de este trabajo de investigación es el estudio de la

evolución de las poblaciones microbianas en los procesos de eliminación biológica de

materia orgánica y nitrógeno amoniacal presentes en el agua residual bajo condiciones

ambientales estables y variables.

Para alcanzar este objetivo principal se plantean los siguientes objetivos

específicos:

Montaje, puesta en marcha, mantenimiento y monitorización de un

reactor discontinuo (SBR) operado para la eliminación biológica de

materia orgánica y nitrógeno amoniacal de una corriente de agua

residual con concentración típica urbana.

Estudio de la influencia del oxígeno y el pH sobre la actividad y el

desarrollo de los microorganismos involucrados en los procesos de

nitrificación-desnitrificación.

Seguimiento de la evolución de los microorganismos implicados en los

procesos de eliminación de materia orgánica y nitrógeno amoniacal

mediante la aplicación de la técnica molecular de hibridación in situ

FISH.

Para alcanzar los objetivos planteados en este trabajo de investigación se ha

llevado acabo el plan de trabajo que se describe a continuación:

1. Diseño, montaje y puesta en marcha del reactor. Operación y

seguimiento mediante los dispositivos de control y medición, para unas

condiciones de pH y OD fijadas.

2. Mantenimiento del sistema: preparación de alimento artificial,

calibración de sondas y tareas de limpieza.

3. Realización de analíticas físico-químicas de los parámetros necesarios

para el seguimiento de los procesos biológicos.

4. Aplicación de la técnica FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) para el

seguimiento de la evolución de las poblaciones microbianas.

48

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y Métodos

3.1 Descripción del montaje experimental

Los datos experimentales para el estudio del proceso se obtuvieron mediante el

montaje de un reactor secuencial discontinuo (SBR, Sequencing Batch Reactor) a

escala de laboratorio. Para ello se empleó un reactor cilíndrico de metacrilato de

diámetro 30 cm y altura 35 cm con un volumen útil de 7 L. En la Figura 8 se muestra el

montaje experimental.

Figura 8. Fotografía del montaje experimental

En la Figura 9 puede observarse el esquema del montaje experimental. La

línea azul corresponde a los dispositivos que realizaban la toma de datos y la línea

negra indica los elementos que intervenían en el funcionamiento del sistema y que

estaban dirigidos por el software de control implementado en el ordenador.

La monitorización del sistema se realizó en tiempo real mediante sondas de

pH, conductividad, potencial redox, temperatura y oxígeno disuelto (OD). La

información de todas las sondas, excepto la sonda de OD, era transmitida al

ordenador a través de un analizador multiparamétrico (marca Consort C832). El

oxígeno era medido y transmitido por un oxímetro (marca Oxi 340 WTW) y

supervisado desde el ordenador mediante un sistema de control on-off que mantenía

la concentración de OD en niveles previamente establecidos.

49

Materiales y Métodos

50

Figura 9. Esquema del montaje experimental

Los registros de las variables monitorizadas eran almacenados cada 30

segundos para su análisis posterior.

Por otro lado, el llenado y vaciado estaban controlados por el software del

ordenador mediante electroválvulas, bomba peristáltica y sensores de nivel. Una

electroválvula permitía la entrada del agua residual en el reactor mediante la acción de

una bomba peristáltica. La salida del agua clarificada estaba controlada por la acción

de la electroválvula ubicada en la conducción de la corriente efluente. Con el objetivo

de evitar el desbordamiento en caso de fallo del sensor de nivel se instaló una

conducción de salida en el extremo superior del reactor.

El control del tiempo de retención celular estaba automatizado mediante la

programación de los tiempos de apertura y cierre de la electroválvula.

En cuanto a la aireación, se llevaba a cabo mediante una soplante que

suministraba el aire por una conducción central a 4 difusores de piedra porosa

situados en la parte inferior del reactor. Un sistema de control on-off regido por el

ordenador se encargaba de mantener el oxígeno en la etapa de reacción aerobia en

un intervalo de concentración determinado.

La fuente de materia orgánica escogida fue ácido acético (CH3-COOH) ya que

se trata del ácido graso volátil dominante en los sistemas de aguas residuales (Henze

Dosificadores

Amonio Acético

Rebose

Agua residual afluente

Aireación

Baño termostático

Sensor de nivel Sondas: Amarilla: pH Roja: Redox Negra: Conductividad Gris: temperatura

Oxímetro

Registro de datos

Control del proceso

Agitador mecánico

Agua residual efluente.

Purga

Electroválvula

Electroválvula

Materiales y Métodos

et al., 1994; Raunkjær et al., 1995; Buchauer, 1997, Constantine y Fick, 1997; Bernat y

Wojnowska-Baryła, 2007; Khanitchaidecha, et al., 2010) y como fuente de nitrógeno

amoniacal se empleaba cloruro amónico (NH4Cl). La dosificación se llevaba a cabo

tras la etapa de llenado mediante dos dosificadores de alta precisión (marca Liquino

711 Metrohm).

La homogeneización del licor mezcla se realizaba con un agitador mecánico

(marca Heidolph de 50 Hz y 35-2800 rpm). La velocidad de giro estaba controlada por

un regulador de potencia con el objetivo de minimizar la reaireación del reactor.

La temperatura en el reactor se mantuvo a 20ºC y estuvo controlada mediante

la recirculación de agua procedente de un baño termostático (marca Haake).

3.2 Procedimiento experimental

El procedimiento experimental está esquematizado en la Figura 10.

Selección de los parámetros de

operación

Puesta en marcha del reactor

Operación y seguimiento del

proceso

Figura 10. Esquema del procedimiento experimental

En primer lugar se llevó a cabo la selección de los parámetros de operación,

estableciéndose los criterios de funcionamiento. En segundo lugar se procedió a la

puesta en marcha del reactor. Y por último durante la fase de operación y seguimiento

se controló el funcionamiento del sistema mediante la revisión diaria de los valores

aportados por las sondas de monitorización.

Las tareas de mantenimiento y limpieza del reactor y los aireadores así como la

calibración de las sondas y los dosificadores se realizaron una vez por semana.

3.2.1 Parámetros de operación

3.2.1.1 Selección del inóculo y características del agua residual

El inóculo se obtuvo de la EDAR “Conca del Carraixet”, localizada en Alboraia

(Valencia). El esquema de tratamiento de esta planta se basa en la eliminación de

51

Materiales y Métodos

materia orgánica y nutrientes mediante un sistema de fangos activados con

decantación primaria y secundaria.

El agua residual empleada, cuya composición se presenta en la Tabla 9, se

formuló para que simulase las principales características de una corriente de agua

residual urbana (Metcalf and Eddy Inc, 1995).

La fuente de carbono se obtuvo a partir de una disolución concentrada (70000

mg DQO/L) de ácido acético (CH3COOH) y el nitrógeno amoniacal se obtuvo a partir

de una disolución concentrada (21000 mg N/L) de cloruro de amonio (NH4Cl). El

volumen adicionado de ácido acético y nitrógeno amoniacal al inicio de cada etapa de

reacción permitió alcanzar en el licor mezcla una concentración de 210 mg DQO/L y

30 mg N/L, respectivamente.

Tabla 9. Componentes principales en el agua residual.

Compuestos Concentración (mg/L)

CaCl2 2.50 K2HPO4 14.00

MgSO4·7H2O 50.70 NaHCO3 671.56

FeCl3.6H2O 0.029 CuSO4.5H2O 0.060

Na2MoO4.2H2O 0.120 ZnSO4.H2O 0.240 MnCl2.4H2O 0.240

H3BO3 0.300 CoCl2.6H2O 0.300

KI 1.274

Con el objetivo de evitar reacciones bioquímicas en el bidón de

almacenamiento del agua residual, tanto la materia orgánica como el nitrógeno

amoniacal se almacenaban y dosificaban de forma independiente.

3.2.1.2 Etapas de operación del reactor

Las etapas de operación del reactor se establecieron para un total de 4 ciclos

diarios con una duración de 6 horas/ciclo completo. La representación esquemática

puede observarse en la Figura 11.

52

Materiales y Métodos

Afluente

Etapa Vaciado 6 minutos

Etapa Anóxica 105 minutos

Etapa Llenado

6 minutos Efluente

Ciclo 6 horas

Etapa Aerobia

210 minutos Etapa Decantación

33 minutos

Figura 11. Secuencia y duración de las 5 etapas de trabajo del reactor SBR

El inicio del ciclo tenía lugar durante la etapa de llenado. Se trabajó mediante

un sistema de llenado con mezcla según el cual el reactor se llenaba con el agua

residual a tratar mediante un bombeo uniforme mientras que el sistema de agitación

aseguraba una buena homogeneización con el fin de establecer un óptimo contacto

entre los microorganismos y el sustrato existente. El tiempo establecido para realizar

esta etapa fue de 6 minutos, asegurando que se alcanzase el volumen útil del reactor

(7 litros).

A continuación tenía lugar la etapa de reacción con una duración total de 315

minutos. Esta etapa estaba compuesta por dos fases: la fase anóxica que tenía una

duración total de 105 minutos y en la que el sistema de aireación estaba desactivado y

se mantenía la homogenización del licor mezcla, y la fase aerobia en la que la

aireación entraba en funcionamiento. Del tiempo total de reacción, un 35%

correspondió a la etapa anóxica y un 65% a la etapa aerobia.

53

Materiales y Métodos

A continuación comenzaba la etapa de decantación, cuya duración se

estableció en 33 minutos, y finalmente la etapa de vaciado del agua clarificada

durante 6 minutos.

3.2.1.3 Parámetros de funcionamiento

Para la realización de los cálculos de los parámetros de funcionamiento se

fijaron el tiempo de retención hidráulico (TRH) y el tiempo de retención celular (TRC):

- Tiempo de retención hidráulico: se estableció en 18 horas.

- Tiempo de retención celular: se estableció en 14 días para asegurar el

proceso de nitrificación teniendo en cuenta que la temperatura de

trabajo fue de 20ºC (Gerardi, 2002).

Tabla 10. Temperatura y TRC sugerido para la nitrificación

Temperatura Tiempo de retención celular

10 ºC 30 días 15 ºC 20 días 20 ºC 15 días 25 ºC 10 días 30 ºC 7 días

Fuente: Gerardi (2002)

Los cálculos realizados fueron los siguientes:

Caudal purga A partir del tiempo de retención celular se determinó el caudal purga:

reacciónpurga

reactorreacción

SSTpurgapurga

reactorSSTreactor tQV

tCQCV

TRC ×=×××

= Ecuación 17

Donde:

CSST reactor= Concentración de sólidos suspendidos totales en el reactor SBR

Qpurga= Caudal de purga

CSST purga= Concentración de sólidos suspendidos totales en la purga

Y puesto que la concentración de sólidos suspendidos en el reactor y en el

caudal de purga son iguales ya que la purga se realiza cuando el sistema está

54

Materiales y Métodos

homogeneizado minutos antes de la finalización de la etapa de reacción, la

aplicación de la ecuación resulta en:

( )

horasdíacicloshorashoras

QLdías aerobioanóxico tt

purga 24/45.375.1714

×+×=

Qpurga = 0.4375 L/día = 0.1094 L/ciclo

Determinación del caudal afluente

A partir del valor del tiempo de retención hidráulico se determinó el caudal

afluente diario, teniendo en cuenta el tiempo real de reacción en el que los

microorganismos realizan el proceso nitrificación-desnitrificación (etapa aerobia y

etapa anóxica). En base a esta premisa y a partir de la ecuación 18, el caudal afluente

obtenido fue el siguiente.

reacciónAfluente

reactor tQV

TRH ×= Ecuación 18

( )dL

horasdcicloshorashoras

horasdhoras

LQ aerobioanóxico ttAfluente /8

24/45.375.1

24118

7=

×+×=

3.2.2 Puesta en marcha del reactor

Una vez establecidos los parámetros de operación y realizado el montaje se

puso en funcionamiento el reactor.

En los días posteriores a la puesta en marcha se controló el proceso para

asegurar que funcionase correctamente. Para ello se llevaron a cabo analíticas de

amonio, nitrito y nitrato que permitieron confirmar el desarrollo de los procesos de

nitrificación y desnitrificación y la idoneidad del agua residual formulada así como de la

materia orgánica empleada.

3.2.3 Operación y seguimiento del proceso

A continuación se describen los procedimientos empleados para las

determinaciones físico-químicas y microbianas llevadas a cabo para el seguimiento del

funcionamiento reactor y de la evolución de las poblaciones bacterianas.

55

Materiales y Métodos

3.2.3.1 Analíticas físico-químicas

Los parámetros estudiados y la frecuencia en la toma de muestras y análisis se

presentan en la Tabla 11.

Tabla 11. Frecuencia de muestreo y análisis de los parámetros físico-químicos.

Parámetro Frecuencia

Sólidos suspendidos totales (SST)

Sólidos suspendidos volátiles (SSV) 1 vez por semana

DQO (ácido acético) Alcalinidad

Fósforo Amonio Nitrito Nitrato

2 ó 3 veces por semana

Las determinaciones analíticas se llevaron a cabo empleando las técnicas que

se describen a continuación.

3.2.3.1.1 Sólidos suspendidos totales y sólidos suspendidos volátiles

Las concentraciones de sólidos suspendidos totales y volátiles se obtuvieron

siguiendo la metodología del Standard Methods for the examination of water &

wastewater (APHA, AWWA & WEF, 2005):

1. Se toma una cápsula de porcelana a temperatura ambiente del

desecador y se pesa en la balanza analítica junto con un filtro de

tamaño de poro 0.45μm. (P1)

2. Se obtiene un volumen del licor mezcla que se pasa a través del filtro.

Para agilizar el proceso de filtración se emplea una bomba de vacío.

3. El filtro con los sólidos retenidos se coloca en la cápsula de porcelana y

se introduce en estufa a una temperatura de 105ºC hasta alcanzar peso

constante (eliminación total de la humedad).

4. Tras enfriarse en el desecador, se pesa el conjunto filtro más sólidos

retenidos. (P2)

5. A continuación, se coloca en la mufla a 550ºC durante 1 hora.

6. Una vez transcurrida 1 hora, se extrae la cápsula y se añade carbonato

amónico (CH5NO3) hasta cubrir totalmente el filtro.

56

Materiales y Métodos

57

7. Se introduce de nuevo en la estufa a 105 ºC durante 1 hora.

8. Finalmente, la cápsula con la muestra calcinada se pasa a un

desecador y una vez a temperatura ambiente, se obtiene un nuevo

peso. (P3)

El valor de los sólidos suspendidos totales se obtiene mediante la siguiente

fórmula:

SST muestraVolumenPP 12 −= Ecuación 19

Los sólidos restantes tras el proceso de calcinación corresponden a los sólidos

suspendidos no volátiles (ecuación 20) y la diferencia entre estos y los sólidos totales

da como resultado los sólidos suspendidos volátiles.

3.2.3.1.2 Ácido acético y alcalinidad

El equipo empleado para llevar a cabo este análisis fue un titrador marca 716

DMS Titrino de la firma comercial Metrohm. Este dispositivo emplea el método de

valoración ácido-base propuesto por Moosbrugger et al., (1992, 1993) para la

determinación de los siguientes parámetros:

- Sa: ácidos grasos volátiles considerados como ácido acético (mg/L)

- CT: concentración total de carbonato: [H2CO3] + [HCO3¯] + [CO3

2¯]

(mol/L)

El método consiste en la realización de una valoración mediante un ácido, en

este caso ácido clorhídrico (HCl) 0.1N, hasta alcanzar los puntos de pH seleccionados,

que son: 6.7, 5.9, 5.2 y 4.3.

Una vez se dispone de los volúmenes de ácido que han sido necesarios para

alcanzar los valores de pH, es posible examinar la influencia de concentraciones

conocidas de otros ácidos y bases (además del carbonato y los ácidos volátiles).

Para ello, se introducen los siguientes parámetros en un software desarrollado

por el grupo de trabajo denominado VALORA:

Ecuación 20SSNV muestraVolumenPP 13 −=

Materiales y Métodos

- Temperatura, (ºC)

- Conductividad, (mS/m)

- pH inicial

- Volúmenes empleados de ácido, (mL)

- Concentración de amonio, (mg/L)

- Concentración de fosfato inorgánico, (mg/L)

- Concentración de sulfuro, (mg/L)

Además del análisis de los ácidos grasos volátiles, este procedimiento permite

la determinación de la alcalinidad asociada al carbonato, que viene expresada como

carbonato de calcio (CaCO3).

3.2.3.1.3 Amonio, nitrito, nitrato y fósforo

Las concentraciones de amonio (NH4+), nitrito (NO2

-), nitrato (NO3-) y ortofosfato

(PO43-) fueron determinadas mediante la utilización de un analizador multiparámetro

selectivo espectrofotométrico, SmartchemTM200 de la casa Metrohm.

Este analizador se basa en métodos colorimétricos siguiendo los

procedimientos establecidos en el Standard Methods for the Examination of Water &

Wastewater (2005).

Las muestras son previamente filtradas y colocadas en las cubetas de análisis.

Una vez introducidos los protocolos de análisis de cada muestra, el brazo robótico

succiona un volumen del orden de microlitros de muestra y de reactivos, mezclándolos

en una cubeta individual para obtener los resultados del análisis colorimétrico.

Finalmente toma una lectura directa en la cubeta a la longitud de onda

correspondiente. A continuación, realiza una prueba de calidad midiendo una

concentración conocida con el objetivo de asegurar la fiabilidad del análisis.

3.2.3.2 Analíticas microbianas

La toma de muestras para las determinaciones microbianas se llevó a cabo una

vez por semana en función de las condiciones del reactor.

Las muestras eran preparadas mediante un proceso de fijación para determinar

posteriormente la población bacteriana existente mediante la técnica de Hibridación

Fluorescente In Situ o FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) por sus siglas en inglés

Este procedimiento permitió llevar a cabo un seguimiento del estado de las

poblaciones de las bacterias amonioxidantes (AOB), nitritoxidantes (NOB) y

58

Materiales y Métodos

59

desnitrificantes y su evolución a lo largo de las diferentes fases del periodo

experimental.

3.2.3.2.1 Técnica de Hibridación In Situ FISH

La técnica FISH (Fluorescent In Situ Hybridisation) consiste en la hibridación de

una sonda con una parte específica del 16S RNA bacteriano (Wagner et al., 1995). La

sonda se elabora mediante la síntesis química de nucleótidos y se marca con un

agente de color fluorescente (fluorocromo). Las bacterias de un grupo taxonómico

específico (especie, género o clase entre otros), al ser hibridadas con una sonda

específica, pueden ser identificadas empleando un microscopio de fluorescencia.

et al., 1995). La

sonda se elabora mediante la síntesis química de nucleótidos y se marca con un

agente de color fluorescente (fluorocromo). Las bacterias de un grupo taxonómico

específico (especie, género o clase entre otros), al ser hibridadas con una sonda

específica, pueden ser identificadas empleando un microscopio de fluorescencia.

En las Figuras 12, 13 y 14 se pueden ver las principales sondas disponibles para

la detección de bacterias amonioxidantes, nitritoxidantes y desnitrificantes

respectivamente, así como los rangos de cobertura. En azul se han destacado las

sondas empleadas en el presente trabajo de investigación.

En las Figuras 12, 13 y 14 se pueden ver las principales sondas disponibles para

la detección de bacterias amonioxidantes, nitritoxidantes y desnitrificantes

respectivamente, así como los rangos de cobertura. En azul se han destacado las

sondas empleadas en el presente trabajo de investigación.

Figura 12. Árbol filogenético basado en el 16S rARN de los principales linajes de bacterias amonioxidantes. Se ha destacado en azul las sondas empleadas en el presente

trabajo de investigación. Los paréntesis indican la cobertura de las sondas. (Nielsen et al., 2009)

Figura 12. Árbol filogenético basado en el 16S rARN de los principales linajes de bacterias amonioxidantes. Se ha destacado en azul las sondas empleadas en el presente

trabajo de investigación. Los paréntesis indican la cobertura de las sondas. (Nielsen et al., 2009)

Nse

1472

Materiales y Métodos

Figura 13. Árbol filogenético basado en el 16S-rARN de los principales linajes de bacterias nitritoxidantes. Los paréntesis indican la cobertura de las sondas.

(Nielsen et al., 2009)

60

Materiales y Métodos

Figura 14. Árbol filogenético basado en el 16S-rARN de los principales linajes de bacterias desnitrificantes. Los paréntesis indican la cobertura de las sondas.

(Nielsen et al., 2009)

61

Materiales y Métodos

En la Tabla 12 se detallan las sondas empleadas en este estudio, así como

algunos datos de interés (secuencia de nucleótidos, bacterial señal y referencia donde

ha sido descrita la sonda).

Tabla 12. Sondas de hibridación empleadas en la identificación micriobiológica.

Sonda Secuencia (5’-3’) Organismo Referencia

Bacterias totales (Dominio Eubacteria)

EUB338 I * GCT GCC TCC CGT AGG AGT Amman et al., (1990)

EUB338 II GCA GCC ACC CGT AGG TGT Planctomycetales Daims et al., (1999)

EUB338 III GCT GCC ACC CGT AGG TGT Verrucomicrobiales Daims et al., (1999)

Bacterias Amonioxidantes

NSO1225 LNA CGC CAT TGT ATT ACG TGT GA Betaproteobacterial AOB Mobarry et al.,

(1996)

NEU CCC CTC TGC TGC ACT CTA Nitrosomonas spp. Wagner et al., (1995)

Competidora

NEU : CTE TTC CAT CCC CCT CTG CCG

Comamonas spp., Acidovorax spp.,

Hydrogenophaga spp., Aquaspirillum spp.

Brachymonas denitrificans, Rhodocyclus purpureus y

Leptothrix discophora

Schleifer et aI., (1992)

Nsv443 CCG TGA CCG TTT CGT TCC G Nitrosospira spp. Mobarry et al., (1996)

Nmo218 CGG CCG CTC CAA AAG CAT Nitrosomonas oligotropha-lineage

Gieseke et al., (2001)

Nse1472 ACC CCA GTC ATG ACC CCC Nitrosomonas europea,

N. halophila, N. eutropha, Kraftisried-Isolat

Juretschko et al., (1998)

Nmv TCC TCA GAG ACT ACG CGG Nitrosococcus mobilis (“Nitrosomonas”) lineage

Juretschko et al., (1998)

Bacterias Nitritoxidantes

Ntspa712 CGT CTT CGC CAC CGG CCT TCC Mayoría phylum Nitrospirae Daims et al., (2001)

Competidora Ntspa712 CGT CTT CGC CAC CGG TCT TCC Desulfovibrio.desulfuricans Daims et al.,

(2001)

NIT3 CCT GTG CTC CAT GCT CCG Nitrobacter spp. Wagner et al., (1996)

Competidora NIT3 : CNIT3 CCT GTG CTC CAG GCT CCG Competidora Wagner et al.,

(1996)

Bacterias Desnitrificantes

DEN67 CAA GCA CCC GCG CTG CCG Grupo desnitrificantes a partir de methanol

Ginige et al., (2005)

AT1458 GAA TCT CAC CGT GGT AAG CGC Grupo Azoarcus-Thauera-Castellaniella

Rabus et al., (1999)

PAR651 ACC TCT CTC GAA CTC CAG Género Paracoccus Neef et al., (1996)

* A partir de las las tres sondas EUB338 (I, II y III) se obtuvo una sonda denominada EUBmix.

62

Materiales y Métodos

A continuación se describen los procedimientos para la identificación

microbiana mediante la técnica FISH (Alonso, 2003):

I. Preparación de los portaobjetos: 1. Se preparan los portaobjetos, que en este caso son de 10 celdas, 8

mm de diámetro y están impresos con una capa de teflón.

2. Se lavan en una solución jabonosa de agua desionizada.

3. Se enjuagan con agua desionizada.

4. El secado se lleva a cabo a temperatura ambiente y con medidas de

protección para evitar que se depositen impurezas en la superficie de

los portaobjetos (24 horas).

5. Se prepara una solución de inmersión, compuesta por 100 mL de

agua destilada a una temperatura de 60ºC en los que se disuelven 0.1

gramos de gelatina y 0.01 gramos de KCr(SO4)2·12H2O. Una vez

obtenida la solución, se enfría a 50ºC y los portas se sumergen

durante 5 segundos.

6. Se dejan secar al aire, nuevamente protegidos.

7. Una vez secos están ya preparados para su almacenaje y posterior

utilización.

II. Procedimiento de fijación de muestras: Bacterias GRAM negativas 1. Se extrae 1 mL de biomasa de la muestra, se vierte a un tubo de

microcentrífuga y se centrifuga a 5000 rpm durante 3 minutos.

2. Se retiran 750 μL de sobrenadante.

3. Se añaden 3 volúmenes de paraformaldehído (PFA) (750 μL) por 1

volumen de muestra (250 μL) y se mantienen a 4ºC durante 1 hora.

4. Se centrifuga a 5000 rpm durante 3 minutos y se retira el

sobrenadante.

5. Se añaden 900 μL de tampón fosfatos salino (PBS) 1X, se

resuspende y se centrifuga a 5000 rpm durante 3 minutos. Se repite

este paso 3 veces.

6. Se retira todo el PBS 1X y se añaden dos soluciones: 700 μL de

etanol frío (4ºC) y 300 μL de PBS 1X y se homogeneiza.

7. Se almacena a 4ºC.

8. La concentración final de biomasa es de entre 108 y 109 células/mL.

9. Las muestras se guardan a -20 ºC.

63

Materiales y Métodos

Protocolo para la obtención de las soluciones de paraformaldehído (PFA) y

tampón fosfatos salino (PBS):

PFA:

- Se calientan 65 mL de agua mili-Q a 60ºC. - Se añaden 4 g de paraformaldehido. - Se añade una gota de solución NaOH y se agita con rapidez hasta que

la solución se ha clarificado (entre 1 y 2 minutos). - Se quita de la fuente de calor y se añaden 33 mL de PBS 3X. - Se ajusta el pH a 7.2 con ácido clorhídrico (HCl). - En caso de que se produzcan cristales, es importante eliminarlos

mediante un procedimiento de filtración estéril a través un filtro de 0.2

μm. - Se enfría rápidamente y se almacena a 4ºC.

PBS 1X:

- Se disuelven 257.9 gramos de Na2HPO4·12H2O y 43.7 gramos de

NaH2PO4·2H2O en 1000 mL de agua destilada. Después se disuelven

en esta solución 754 gramos de NaCl. Se ajusta a pH 7.2.

- Para obtener PBS 3X, se prepara una dilución 1 en 30 a partir del PBS

1X y agua destilada (1 PBS 3X+ 29 agua destilada).

- Se esteriliza mediante autoclave.

Previamente a la hibridación de las muestras es importante su identificación en

función de la numeración y del porcentaje de formamida para asegurar la correcta

hibridación posterior, ya que cada sonda requiere una concentración de formamida

determinada para el proceso de hibridación.

A continuación se hace la selección de las sondas para posteriormente pasar a

la fijación de las muestras y posterior hibridación.

III. Aplicación de las muestras en los portaobjetos: 1. Se pone un volumen de 6 μL de muestra en los pocillos del

portaobjetos.

2. Se seca en estufa a 55 ºC.

3. Se realiza la deshidratación de las muestras de los portaobjetos

mediante la inmersión progresiva en tres tubos Falcon que contienen

64

Materiales y Métodos

soluciones de etanol (CH3CH2OH) de concentración creciente: 50% -

80% - 98%, dejando transcurrir un tiempo de 3 minutos para cada

inmersión.

4. Tras la deshidratación y el secado al aire, las muestras están listas

para ser hibridadas.

Protocolo para la obtención de las soluciones de alcohol:

Etanol 50%:

- Se disuelven 100 mL de etanol en 100 mL de agua destilada

- Se conserva en tubos Falcon a temperatura ambiente.

Etanol 80%:

- Se disuelven 160 mL de etanol en 40 mL de agua destilada

- Se conserva en tubos Falcon a temperatura ambiente.

Etanol 98%:

- Reactivo etanol absoluto grado PRS.

- Se conserva en tubos Falcon a temperatura ambiente.

IV. Procedimiento de hibridación: 1. Se ponen 8 μL de la solución de hibridación (ver Tabla 13) en cada

pocillo con muestra.

2. Las sondas han sido previamente atemperadas y mantenidas en

oscuridad. Se vierte 1μL de sonda general EUBmix y 1 μL de la sonda

específica sobre la muestra en cada pocillo.

3. Se introduce un papel de celulosa en un tubo Falcon de 50 mL de

forma que cubra el 50% de las paredes del tubo.

4. La solución de hibridación restante se vierte en el tubo Falcon para

humedecer el papel de celulosa y crear una cámara de hibridación.

5. El portaobjetos con las muestras hibridadas se introduce dentro del

tubo Falcon, manteniendo siempre la posición horizontal.

6. Se mantiene en estufa a 46ºC entre 1 y 2 horas.

7. Se prepara 50 ml de la solución de lavado (ver Tabla 14) en un tubo

Falcon, se recubre con un film protector para evitar que la luz

ambiente pueda dañar las sondas y se calienta en un baño térmico a

48ºC durante el tiempo necesario para la hibridación.

65

Materiales y Métodos

8. Se saca el tubo Falcon que contiene el portaobjetos de la estufa. Se

extrae el portaobjetos y se introduce en el tubo que contiene la

solución de lavado y se mantiene en el baño durante 15 minutos.

9. Se extrae el portaobjetos y se lava con agua mili-Q enfriada.

10. Se seca al aire en oscuridad.

11. Se almacena a −20ºC en oscuridad.

En este punto la muestra ya está preparada para ser observada al microscopio

de epifluorescencia

Protocolo para la preparación de los reactivos necesarios para la obtención de

las soluciones de hibridación y de lavado. En las Tablas 13 y 14 se indican los

volúmenes correspondientes en función del porcentaje de formamida:

Solución de hibridación:

- 360 μL de Cloruro Sódico 5M (NaCl)

• Disolución patrón: 292.2 g de cloruro sódico en 1000 mL de agua

destilada.

• Disolución 5M: 800 mL de NaCl y ajustar hasta 1000 mL.

• Se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 minutos y

posteriormente filtrar.

- 40 μL de HCl-Tris

• Se pesan 121.1 gramos de Tris y se disuelven en 800 mL de agua

destilada. Se añaden 42 mL de HCl concentrado y ajusta hasta

1000 mL con agua destilada.

• Se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 minutos y

posteriormente filtrar.

- x μL de formamida

- y μL de agua Mili-Q

• Se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 minutos y

posteriormente se filtran 200 mL de agua Mili-Q.

- 2 μL de SDS 10%

• Se pesan 121.1 gramos de SDS y se disuelven en 100 mL de

agua destilada.

• Se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 minutos y

posteriormente filtrar.

66

Materiales y Métodos

Solución de lavado:

- x μL de Cloruro Sódico 5M (NaCl)

- 1 mL de HCl-Tris

- y μL de EDTA 0.5M

- 50 μL de SDS 10%

- Agua Mili-Q hasta ajustar a 50 mL

Tabla 13. Volúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para la preparación de la solución de hibridación

Formamida (%) Reactivos

(μL) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Formamida 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Agua Mili-Q 1498 1398 1298 1198 1098 998 898 798 698 598

NaCl 5M 360 360 360 360 360 360 360 360 360 360

HCl-Tris 1M 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40

SDS 10% 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Tabla 14. Volúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para la preparación de la solución de lavado.

Formamida (%) Reactivos

(μL) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

NaCl 5M 6300 4500 3180 2150 1490 1020 700 460 300 180

HCl-Tris 1M 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000

EDTA --- --- --- 500 500 500 500 500 500 500

SDS 10% 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

Agua Mili-Q 42650 44450 45770 46300 46960 47430 47750 47990 48150 48270

V. Observación al microscopio: 1. Se sacan los portaobjetos almacenados a -20ºC para que alcancen la

temperatura ambiente manteniéndolos en oscuridad.

2. Se añade una pequeña cantidad de aceite de montaje en la esquina

de cada pocillo y se recubre con un cubreobjetos eliminado el exceso

de aceite.

67

Materiales y Métodos

3. Se observa al microscopio de epifluorescencia empleando los filtros

adecuados según los fluorocromos utilizados.

4. Una vez enfocada la muestra, se toman 20 parejas de fotografías (40

en total). 20 con el filtro de la sonda general EUBmix y 20 con el filtro

de la sonda de la bacteria diana, manteniendo el mismo campo en

ambas fotografías.

La técnica de análisis microbiológico empleada permite tanto la identificación

de los grupos de bacterias, como la obtención de datos cuantitativos.

Se ha utilizado un microscopio de fluorescencia DM2500 dotado de una

cámara digital Leica DFC420c para la identificación y captura de imágenes. La

visualización de las muestras se realizó con un objetivo de 63x (Leica63x/0.80 N

PLAN).

La cuantificación bacteriana se ha realizado siguiendo la metodología

desarrollada por Borrás (2008).

La técnica establece la captura de imágenes de entre 20 y 40 campos que

sean representativos de la muestra hibridada. Posteriormente, las imágenes son

introducidas en un software de cuantificación, que devuelve un informe detallado de

los porcentajes de área ocupados por las bacterias presentes en la muestra hibridada.

Este programa trabaja con las imágenes tomadas bajo el microscopio de

epifluorescencia en términos de áreas, comparando la superficie ocupada por el total

de bacterias presentes en el campo (sonda EUBmix) y el área ocupada por las

bacterias que han sido hibridadas con la sonda específica.

El resultado final es un número que representa el porcentaje en área de una

especie bacteriana en la muestra, acompañado de su error estándar, calculado como

la desviación estándar dividida por la raíz cuadrada del número de campos analizados.

68

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Resultados y Discusión

69

4.1 Puesta en marcha

Al inicio de la puesta en marcha se llevaron a cabo analíticas físico-químicas

para confirmar la adaptación de la biomasa a las nuevas condiciones de operación. En

la Figura 15 se puede observar como durante la primera semana la concentración de

sólidos suspendidos totales se fue reduciendo de forma progresiva pasando de un

valor medio en torno a 2750 mg SST/L a aproximadamente 2000 mg SST/L.

El ratio SST/SSV se mantuvo estable y los sólidos suspendidos no volátiles se

mantuvieron en un valor en torno a 500 mg SSNV/L.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Con

cent

raci

ón d

e só

lidos

sus

pend

idos

(mg/

L)

SST SSV SSNV

T (días)

Figura 15. Evolución de la concentración de sólidos suspendidos en el licor mezcla al final de la etapa de reacción durante la primera semana del periodo experimental

En las Figuras 16 y 17 vienen representadas la evolución de los compuestos

nitrogenados y la materia orgánica respectivamente, medidos al final de la fase de

reacción durante la primera semana.

Tal y como se puede observar en la Figura 16 los organismos presentes fueron

capaces de llevar a cabo el proceso de nitrificación adecuadamente.

Asimismo, en la Figura 17 se puede observar que la materia orgánica

adicionada fue consumida prácticamente en su totalidad, por lo que el proceso de

desnitrificación se estaba produciendo correctamente.

Resultados y Discusión

70

0

4

8

12

16

20

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Con

cent

raci

ón d

e co

mpu

esto

s ni

troge

nado

s (m

g N

/L)

Título del gráfico

1

AMONIO EFLUENTE NITRITO EFLUENTE NITRATO EFLUENTE

T (días)

Figura 16. Evolución de la concentración de amonio, nitrito y nitrato en el licor mezcla al final de la etapa de reacción durante la primera semana del periodo experimental

0

2

4

6

8

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Con

cent

raci

ón d

e ac

étic

o en

el e

fluen

te (m

g D

QO

/L)

1

MATERIA ORGÁNICA EFLUENTE (ÁCIDO ACÉTICO)

T (días)

Figura 17. Evolución de la concentración de ácido acético durante la primera semana del período experimental al final de la etapa de reacción

En la Tabla 15 se muestran los resultados obtenidos en el estudio

microbiológico llevado a cabo sobre el inóculo. Como se observa, la práctica totalidad

de bacterias amonioxidantes estaba formada por organismos de la especie

Nitrosomonas oligotropha-lineage. En cuanto a las bacterias nitritoxidantes no se

detectaron microorganismos del género Nitrobacter pero si del género Nitrospira,

acerca del cual numerosos autores citan en investigaciones de los últimos años como

Resultados y Discusión

el de mayor abundancia en estaciones de depuración de aguas residuales (Wagner et

al., 1996; Princic et al., 1998; Juretschko et al., 1998; Schramm et al., 1998; Okabe et

al., 1999; Daims et al., 2000; Nogueira et al., 2002; Konrad et al., 2003, Carvalho et al.,

2006). Respecto a las bacterias desnitrificantes, con las sondas disponibles se han

identificado en el inóculo microorganismos de los géneros Azoarcus, Thauera,

Castellaniella, y Paracoccus en menor proporción.

Tabla 15. Porcentajes de bacterias amonioxidantes, nitritoxidantes y desnitrificantes en relación con la sonda EUBmix (dominio Eubacteria) en el inóculo empleado para sembrar el reactor SBR

AMONIOXIDANTES NITRITOXIDANTES DESNITRIFICANTES

Am

onio

xida

ntes

Nitr

osom

onas

eu

ropa

ea,

N. e

utro

pha,

N

. hal

ophi

la

Nitr

osoc

occu

s M

obili

s

Nitr

osoc

occu

s M

obili

s

Nitr

osom

onas

eu

ropa

ea,

N. e

utro

pha,

N

. hal

ophi

la

Nitr

osom

onas

ol

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roph

a-lin

eage

Nitr

osos

pira

spp

.

Nitr

obac

ter s

pp.

May

oría

phy

lum

N

itros

pira

e

Des

nitri

fican

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que

empl

ean

met

anol

A

zoar

cus-

Thau

era-

Cas

tella

niel

la

Gén

ero

Par

acoc

cus

Nso

1225

NEU

Nm

v

Nse

1472

Nm

o 21

8

Nsv

443

NIT

3

Nts

pa71

2

DEN

67

AT14

58

PAR

651

(%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)

8 ± 2 0.2 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 7 ± 2 0 ± 0 0 ± 0 10 ± 3 0 ± 0 11 ± 2 3 ± 1

4.2 Seguimiento del proceso

Una vez transcurrido el periodo de puesta en marcha del reactor se pasó a

estudiar la evolución del sistema a lo largo 176 días de experimentación. Durante ese

tiempo el reactor SBR se mantuvo en funcionamiento alternando condiciones anóxicas

y aerobias con el objetivo de que los procesos de desnitrificación y nitrificación

ocurrieran de forma completa.

Para clarificar la evolución del sistema, el periodo de experimentación fue

dividido en 4 fases en base a modificaciones llevadas a cabo en dos parámetros, el pH

y la concentración de oxígeno disuelto (OD).

- Fase I: Incluye la puesta en marcha del sistema. Durante esta fase el sistema

fue operado con un pH de inicio de ciclo de 6.5 y una concentración de OD

de 2.5 mg O2/L.

71

Resultados y Discusión

- Fase II: Inicio de fase con una limitación puntual de oxígeno que tuvo una

duración de 12 horas. Se mantuvieron constantes tanto la concentración de

pH como el OD.

- Fase III: Inóculo de 2 L compuesto principalmente por bacterias heterótrofas

facultativas y una fracción de bacterias autótrofas amonioxidantes y

nitritoxidantes. Al inicio de esta fase se incrementó el oxígeno disuelto de 2.5

mg O2/L a 3.5 mg O2/L, y se mantuvo el pH al inicio de ciclo en 6.5.

- Fase IV: La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo en 3.5 mg O2/L y

se incrementó el pH de 6.5 a 7.5.

4.2.1 Evolución de los parámetros físico-químicos

En la Figura 18 se presentan las concentraciones de sólidos suspendidos

totales (SST), sólidos suspendidos volátiles (SSV) y sólidos suspendidos no volátiles

(SSNV) a lo largo del periodo experimental. Se puede observar como la concentración

de sólidos suspendidos totales experimentó un descenso cercano al 70% durante los

25 primeros días de experimentación, pasando de un valor en torno a 2700 mg SST/L

de sólidos suspendidos en el fango activo original, a oscilar en torno a valores de 700

a 1000 mg SST/L. Esta concentración se mantuvo a lo largo de todo el periodo

experimental.

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

2250

2500

2750

3000

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170

Con

cent

raci

ón d

e só

lidos

sus

pend

idos

(mg/

L)

SST SSV SSNV

T (días)

FASE I FASE II FASE III FASE IV

OD

Resiembra

OD 2.5 mg O2/L OD 3.5 mg O2/L

pHinicio ciclo 6.5 pHinicio ciclo 7.5

Figura 18. Evolución de la concentración de sólidos suspendidos en el licor mezcla al final de la etapa de reacción

72

Resultados y Discusión

Este hecho se debió al lavado de parte de la biomasa al reducir la carga de

carbono orgánico respecto a la concentración en el fango activado original y a que el

agua residual empleada como afluente no contenía sólidos suspendidos. No obstante,

aunque la concentración de SST en el reactor fue inferior a los valores de un reactor

SBR a escala industrial, que oscilan entre 2000 mg/L y 4000 mg/L, la biomasa

presente fue capaz de llevar a cabo la nitrificación desde los primeros días de

experimentación.

En cuanto a la concentración de sólidos suspendidos volátiles, a medida que la

biomasa se fue adaptando a las nuevas condiciones de operación, el porcentaje de

SSV respecto a los SST fue en aumento, alcanzando un valor cercano al 90% que se

mantuvo estable a lo largo de todo el periodo experimental. El incremento observado

en la concentración de SSV indica la capacidad de las poblaciones microbianas para

adaptarse a las nuevas condiciones de operación.

En la Figura 19 se presenta la evolución de la concentración de materia

orgánica (ácido acético) en el licor mezcla medida en la fase final de la etapa de

reacción a lo largo del periodo experimental. Se observa como la concentración de

ácido acético permaneció en la corriente efluente en valores inferiores a 10 mg DQO/L,

lo cual supone un porcentaje de eliminación de materia orgánica del orden del 95.2%.

Este hecho indica que no se produjo limitación por sustrato.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170

Con

cent

raci

ón d

e ác

ido

acét

ico

(mg

DQ

O/L

)

MATERIA ORGÁNICA (ÁCIDO ACÉTICO)

T (días)

FASE II FASE III FASE IVFASE I

OD 2.5 mg O2/L OD 3.5 mg O2/L

pHinicio ciclo 7.5 pHinicio ciclo 6.5

Figura 19. Evolución de la concentración de materia orgánica (ácido acético) en el licor mezcla al final de la etapa de reacción

73

Resultados y Discusión

Sin embargo, aunque el porcentaje de eliminación de materia orgánica como

ácido acético fue elevado, a partir del día 110 se observó una ligera acumulación que

se mantuvo hasta el final del periodo experimental.

En la Figura 20 se presenta la evolución de los compuestos nitrogenados

(amonio, nitrito y nitrato) en el licor mezcla en la fase final de la etapa de reacción a lo

largo del periodo experimental. Durante los 25 primeros días de operación se alcanzó

la nitrificación completa ya que la concentración de nitrato al final de la etapa de

reacción se mantuvo en torno a 8 mg N-NO3/L mientras que la concentración de nitrito

fue prácticamente despreciable durante este periodo de operación. Este hecho indica

que en el licor mezcla se desarrolló una población de bacterias amonioxidantes y

nitritoxidantes adecuada.

Figura 20. Evolución de la concentración de los compuestos nitrogenados (amonio, nitrito y nitrato) en el licor mezcla en el licor mezcla al final de la fase aerobia de la etapa

de reacción

Sin embargo a partir del día 43 comenzó a incrementarse la concentración de

nitrito en el licor mezcla hasta alcanzar el día 77 un valor de 5 mg N-NO2/L. Este hecho

fue indicativo de que la población de bacterias NOB estaba viéndose afectada,

posiblemente debido a la limitación previa de oxígeno disuelto en el licor mezcla

74

Resultados y Discusión

durante 12 horas. Con el objetivo de recuperar la actividad de las bacterias

nitritoxidantes se llevó a cabo una resiembra de 2 L de fango activo el día 83, lo cual

dio lugar a que el proceso de nitrificación se recuperase. Sin embargo 14 días después

de la resiembra se produjo de nuevo la acumulación de nitrito, que se mantuvo hasta

el final del periodo experimental alcanzando un valor máximo de en torno a 7 mg N-

NO2/L.

El incremento de la concentración de nitrito a partir del día 110 coincide con la

ligera acumulación de ácido acético observada (Figura 19) y puesto que en el proceso

de desnitrificación a partir de nitrito la toma de carbono orgánico es menor que en el

proceso de desnitrificación a partir de nitrato (Ciudad, 2007), este hecho podría ser

una de las causas de la menor toma de carbono orgánico por parte de la población

microbiana.

Por otro lado, en la Figura 21 se presenta la concentración de amonio, nitrito y

nitrato medidos en el licor mezcla al final de la fase anóxica. Como puede observarse

el proceso de desnitrificación se produjo de manera estable durante todo el periodo

experimental, tanto a partir de nitrato como de nitrito.

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170

Conc

entra

ción

de

com

pues

tos

nitro

gena

dos

(mg

N/L)

AMONIO NITRITO NITRATO

T(días)

FASE II FASE III FASE IVFASE I

OD Resiembra

ç

OD 2.5 mg O2/L OD 3.5 mg O2/L

pHinicio ciclo 6.5 pHinicio ciclo 7.5

Figura 21. Evolución de la concentración de los compuestos nitrogenados (amonio, nitrito y nitrato) en el licor mezcla al final de la fase anóxica de la etapa de reacción

75

Resultados y Discusión

4.2.2 Evolución de las poblaciones microbianas

A lo largo del periodo experimental se realizaron 18 muestreos del licor mezcla

en la fase aerobia de la etapa de reacción. A partir de las muestras obtenidas se

realizaron los procesos de hibridación con las sondas escogidas para el estudio de la

población microbiana, realizando réplicas para confirmar los resultados obtenidos.

A continuación se presentan los resultados de la evolución de las poblaciones

de bacterias amonioxidantes (AOB), nitritoxidantes (NOB) y desnitrificantes.

4.2.2.1 Análisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias amonioxidantes

La Figura 22 muestra la evolución de los organismos AOB en relación con la

concentración de nitrógeno amoniacal determinada al final de la fase aerobia de la

etapa de reacción.

Durante los 25 primeros días (Fase I) se observa que el porcentaje de

microorganismos amonioxidantes se mantuvo constante en torno a un valor del 7%.

Figura 22. Porcentaje de AOB en el licor mezcla detectado con la sonda NSO1225 en relación con la sonda EUBmix. Concentración de nitrógeno amoniacal en el licor mezcla

al final de la fase aerobia de la etapa de reacción

76

Resultados y Discusión

La población de bacterias amonioxidantes llevó a cabo la oxidación del amonio

mientras la concentración de oxígeno disuelo fue estable (valor medio de 2.5 mg O2/L).

Sin embargo, la limitación puntual de oxígeno el día 25 (2 ciclos sin suministro de

oxígeno durante la etapa aerobia, en total 12 horas bajo condiciones anóxicas

alcanzando la anerobiosis) produjo el cese de su actividad, así como una reducción

drástica de su población, que pasó de un 7% a un 1%. La concentración de amonio en

el licor mezcla se incrementó hasta alcanzar un valor máximo de 25 mg N-NH4/L al

final de la etapa aerobia, ya que continuó la adición de amonio en la corriente afluente.

Transcurridos 8 días de la limitación de oxígeno la población de AOB se había

recuperado alcanzado un valor del 4% y era capaz de oxidar todo el amonio del

sistema. El día 42 la concentración de bacterias amonioxidantes se había restablecido

hasta alcanzar los niveles iniciales (8%) aunque durante la segunda mitad de la fase II

el porcentaje de bacterias se situó en torno al 6% para el día 79.

Tal y como se ha comentado anteriormente, debido a la necesidad de

reestablecer la población de organismos NOB, el día 83 se realizó una resiembra de 2

L de fango activo procedente de la EDAR utilizada para inocular el reactor biológico

SBR inicialmente. El inóculo potenció el desarrollo de la población de bacterias AOB

que alcanzó un valor en torno al 14% el día 124 y cercano al 17% el último día del

periodo experimental.

La Figura 23 muestra ocho imágenes obtenidas con la técnica FISH

correspondientes a la sonda Nso1225 (β-proteobacterias amonioxidantes). Se puede

observar como las bacterias forman agregados compactos y ligeramente esféricos,

con células claramente visibles.

77

Resultados y Discusión

FASE I

FASE II

FASE III

FASE IV

Figura 23. Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias de dominio Eubacteria (sonda EUBmix)

y en rojo las β-proteobacterias AOB identificadas por la sonda NSO 1225. Imágenes tomadas a 63x.

La sonda Nso1225 hibrida para una elevada variedad taxonómica de bacterias

AOB y por tanto aporta información relevante acerca del potencial nitrificante de la

población microbiana presente en el licor mezcla.

Sin embargo, puesto que se trata de una sonda general, se realizó un estudio

más en profundidad de las especies que conformaban la población de bacterias

amonioxidantes. Para ello se llevó a cabo un análisis cualitativo y cuantitativo de las

78

Resultados y Discusión

principales especies de bacterias amonioxidantes, cuyos resultados se presentan en la

Tabla 16.

Tabla 16. Porcentajes de AOB en el licor mezcla en relación con la sonda EUBmix

A

OB

N

itros

omon

as

euro

paea

, N

. eut

roph

a,

N. h

alop

hila

N

itros

ococ

cus

mob

ilis

Nitr

osom

onas

eu

ropa

ea,

N. e

utro

pha,

N

. hal

ophi

la

Nitr

osoc

occu

s

mob

ilis

Nitr

osom

onas

ol

igot

roph

a-lin

eage

Nitr

osos

pira

spp

.

Nso1225 NEU Nse1472 Nmv Nmo218 Nsv443

Fase Día

(%) (%) (%) (%) (%) (%) 1 6 ± 1 <1 0 0 5 ± 1 0

12 7 ± 1 <1 0 0 5 ± 1 0 I

20 7 ± 1 <1 5 ± 1

29 <1 <1 0 0 <1 0

33 3 ± 1 <1 0 0 1 ± 1 0

42 6 ± 1 3 ± 1 1 ± 1

56 9 ± 1 4 ± 1 6 ± 2

61 8 ± 1 5 ± 1 4 ± 1

70 8 ± 1 5 ± 1 0 0 4 ± 1 0

II

79 6 ± 1 5 ± 1 5 ± 1

91 7 ± 1 3 ± 1 0 0 3 ± 1 0

104 8 ± 1 4 ± 1 0 0 <1 0

111 12 ± 1 6 ± 1 3 ± 1 III

124 14 ± 2 8 ± 1 5 ± 1

139 15 ± 2 7 ± 1 0 0 5 ± 1 0

154 15 ± 1 8 ± 1 0 0 4 ± 1 0

168 16 ± 1 12 ± 1 3 ± 1 IV

174 16 ± 1 12 ± 1 3 ± 1

Estos resultados (media ± error estándar) indican que prácticamente la

totalidad de bacterias amonioxidantes identificadas mediante la sonda general

Nso1225 correspondieron a las sondas específicas NEU y Nmo218, que hibridan

bacterias de las especies Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas eutropha,

Nitrosomonas halophila, Nitrosococcus mobilis y Nitrosomonas oligotropha-lineage,

respectivamente.

Las hibridaciones de las sondas que inicialmente dieron resultados negativos,

fueron hibridadas posteriormente para confirmar los resultados obtenidos.

79

Resultados y Discusión

Las sondas Nse1472 y Nmv dieron señal negativa a lo largo de todo el periodo

experimental. Sin embargo la sonda NEU, que engloba las sondas Nse1472 y Nmv,

dio resultados positivos con un valor que se fue incrementando progresivamente. Este

hecho podría deberse a varias causas:

En primer lugar es posible suponer una incorrecta hibridación de las sondas

Nse1472 y Nmv debido a fallos en el proceso o a la degradación de sus fluorocromos.

Sin embargo, para asegurar la fiabilidad de los resultados se introdujeron controles

positivos durante las hibridaciones que permitieron constatar que el procedimiento se

realizaba adecuadamente y que las sondas estaban en buen estado, por lo que se

descartó esta posibilidad.

También se pudo producir la hibridación de bacterias con la sonda NEU que

tienen coincidencias en su cadena de ácidos nucleicos con la sección de la cadena

para la que hibrida esta sonda específica, pero que sin embargo no son bacterias

amonioxidantes. Por este motivo, el protocolo establece el uso de una sonda

competidora (CTE) sin fluorescencia para descartar hibridaciones erróneas (Wagner et

al., 1995; Schleifer et al., 1992). Este tipo de sonda hibrida con bacterias que actúan

en el proceso de hibridación como competidoras del grupo de bacterias identificadas

con la sonda NEU, como Comamonas testosteroni, Brachymonas denitrificans,

Rhodocyclus purpureus y Leptothrix discophora (Schleifer et aI., 1992). De modo que

la sonda CTE sin fluorocromos hibrida sobre la secuencia de nucleótidos objetivo de

las bacterias competidoras, impidiendo que lo haga la sonda NEU.

Otra opción es la existencia de bacterias que hibridan para la sonda NEU pero

no para Nse1472 y Nmv. En relación a este tercer supuesto, Wagner et al., (1995)

identificaron una serie de bacterias que daban positivo para la sonda NEU pero no

para Nse1472 y Nmv: Nitrosomonas marina, Nitrosomonas aestuarii y Nitrosovibrio

tenuis. No obstante, estas bacterias suelen presentarse por lo general en ambientes

marinos (Nielsen et al., 2009) aunque se ha llegado a identificar Nitrosomonas marina

en un biofiltro asociado a un sistema de producción acuícola.

Existe constancia de otros autores (Gieseke et al., 2001; Persson et al., 2002)

que obtuvieron resultados positivos para la sonda de hibridación NEU mientras que

Nmv y Nse1472 aportaron resultados negativos en muestras de sistemas de

depuración de aguas residuales urbanas.

Teniendo en cuenta estos resultados, sería interesante llevar a cabo una

investigación más en profundidad en relación con las secuencias para las que hibrida

la sonda NEU y las especies de bacterias identificadas ya que se trata de una sonda

que al hibridar para bacterias halotolerantes o moderadamente halofílicas con afinidad

por medios con elevadas concentraciones de nutrientes, suele dar resultados positivos

80

Resultados y Discusión

en sistemas de tratamiento de aguas residuales (Seviour y Nielsen, 2010). Además de

que como numerosos estudios indican, el género Nitrosomonas tiene una presencia

mayoritaria en plantas de tratamiento de aguas residuales (Prosser, 1989; Dionisi et

al., 2002; Egli et al., 2003; Dong-Jin et al., 2006; Rodríguez et al., 2011).

Por otro lado, las bacterias pertenecientes a la especie N. mobilis (sonda Nmv)

suelen desarrollarse en medios que tienen elevadas concentraciones de amonio y

sales (Juretschko et al., 1998) que no es el caso del presente trabajo.

En cuanto a la sonda Nmo218, que hibirida para Nitrosomonas oligotropha-

lineage, durante los primeros días del periodo experimental supuso prácticamente la

totallidad de la población de bacterias AOB. Mientras que las bacterias identificadas

mediante la sonda NEU fueron detectadas en el fango pero con una concentración

inferior al 1%. Tras 25 días en los que el sistema permaneció estable se mantuvo esta

dinámica de población. Sin embargo, progresivamente las bacterias identificadas

mediante la sonda NEU fueron incrementando su concentración en el licor mezcla,

pasaron a situarse como la población microbiana amonioxidante mayoritaria.

En cuanto a la sonda restante, Nsv443, que hibrida para Nitrosospira spp., dio

resultados negativos y aunque ocasionalmente se han podido identificar en sistemas

de fangos activados, es un tipo de bacteria que generalmente va asociado a hábitats

terrestres (Nielsen et al., 2009; Seviour y Nielsen, 2010).

A continuación, en las Figuras 24 y 25 se presentan imágenes obtenidas

mediante la técnica FISH sobre muestreos realizados a lo largo del periodo

experimental empleando las dos sondas que dieron resultados positivos, NEU (Figura

24) y Nmo218 (Figura 25).

Se puede observar como las agrupaciones de bacterias identificadas mediante

la sonda NEU dieron lugar a formaciones globosas y con poca distancia entre ellas.

Mientras que las poblaciones microbianas correspondientes a la especie Nitrosomonas

oligotropha-lineage (Figura 25) dio lugar a formaciones de menor tamaño, más

dispersas y con células más claramente visibles.

81

Resultados y Discusión

FASE I

FASE II

FASE III

FASE IV

Figura 24. Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias totales del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las β-proteobacterias AOB identificadas por la sonda NEU. Imágenes

tomadas a 63x.

82

Resultados y Discusión

FASE I

FASE II

FASE III

FASE IV

Figura 25. Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las β-proteobacterias AOB identificadas por la sonda Nmo218.

Imágenes tomadas a 63x.

83

Resultados y Discusión

4.2.2.2 Influencia del pH y la concentración de oxígeno disuelto en la población de AOB

Desde el día 1 del periodo experimental y hasta el día 135, el pH al inicio de

ciclo se mantuvo en torno a un valor de 6.5. Existen estudios que indican que al pasar

de pH 7.0 (valor típico de una depuradora) a pH 6.6, el ratio de oxidación de amonio

puede verse afectado (Konrad et al., 2003). Sin embargo, desde el inicio del ensayo la

población de AOB fue capaz de adaptarse y llevar a cabo la oxidación de amonio tal y

como se observa en la Figura 26, en la que se muestran los porcentajes de bacterias

amonioxidantes identificadas en el licor mezcla respecto al dominio Eubacteria en

relación con la concentración de amonio al final de la fase aerobia de la etapa de

reacción.

Figura 26. Porcentaje de bacterias amonioxidantes en el licor mezcla detectadas con las sondas NSO1225, Nmo218 y NEu en relación con la sonda EUBmix. Concentración de

nitrógeno amoniacal en el licor mezcla al final de la fase aerobia de la etapa de reacción

El día 26, debido a la limitación de oxígeno en el reactor, todas las especies de

AOB detectadas se vieron seriamente afectadas. Sin embargo, existen estudios que

indican la capacidad de determinadas especies de bacterias nitrificantes para

mantener su actividad en condiciones de limitación de oxígeno. A este respecto, en la

Figura 26 puede observarse como las bacterias detectadas con las sondas específicas

NEU y Nmo218 fueron capaces de recuperar paulatinamente los porcentajes previos a

84

Resultados y Discusión

la reducción en la concentración de oxígeno, especialmente las especies detectadas

con la sonda NEU, que incrementaron su presencia hasta alcanzar un 5%.

Sin embargo, estos niveles no se mantuvieron y a partir del día 60 del periodo

experimental, la población de bacterias amonioxidantes fue reduciéndose

progresivamente, aunque este hecho no afectó el índice de oxidación de amonio.

Al tiempo que se realizó la resiembra de 2 L el día 83, se incrementó la

concentración de oxígeno disuelto en el reactor de 2.5 mg O2/L a 3.5 mg O2/L.

Probablemten debido tanto al inóculo como a la mayor concentración de oxígeno

disuelto en el licor mezcla, tuvo lugar un incremento progresivo en la población de

AOB identificadas con la sonda Nso125, que alcanzó un porcentaje en torno al 16%.

También se produjo un cambio en la población microbiana, ya que las bacterias

identificadas por la sonda NEU se duplicaron a partir del día 83, pasando de un 3% a

un 7%, superando los niveles de Nitrosomonas oligotropha-lineage y haciendo más

patente el cambio observado entre los día 25 y 83, en los que ambas poblaciones se

habían igualado. A este respecto, Park y Noguera (2004) hallaron que en un reactor

alimentado con agua residual artificial las bacterias predominantes inicialmente fueron

Nitrosomonas oligotropha. Sin embargo, progresivamente la población predominante

pasó a ser la especie Nitrosomonas europaea. Estos resultados coinciden con los

observados en cuanto al cambio de población en el presente trabajo, en el que se

observa que aunque inicialmente la población predominante fue claramente

Nitrosomonas oligotropha-lineage, progresivamente las bacterias identificadas por la

sonda NEU pasaron a ser mayoritarias.

Tras el incremento de pH el día 134, el porcentaje de Nitrosomonas

oligotropha-lineage se redujo pasando de un 5% a un 3%, mientras que las bacterias

identificadas por la sonda NEU alcanzaron un valor cercano al 13%, pasando a

suponer el 75% del total de bacterias AOB detectadas en el fango activo.

Bae et al., (2002) hallaron que con el incremento de pH de 6.5 a 7.5 el ratio de

oxidación de amonio por parte de las bacterias AOB se incrementó en un 67%. Y

Konrad et al., (2003) observaron que a pH 7.5 la población microbiana dominante fue

la detectada mediante la sonda NEU, aunque a pH inferior a 7, la población de

bacterias NEU decreció a favor de otras poblaciones detectadas mediante la sonda

Nso190 (sonda general para AOB). Por ello concluyeron que las variaciones de pH

tenían una mayor influencia en las poblaciones de Nitrosomonas eutropha y

Nitrosomonas europaea, siendo el pH 7.5 óptimo para el desarrollo de estas especies

en medio artificial, lo cual coincide con los resultados obtenidos en el presente trabajo.

En lo referente al efecto del incremento en la concentración de nitrito, Bock et

al., (1995) y Kuai et al., (1998) hallaron que N. europaea/eutropha podían emplear el

85

Resultados y Discusión

nitrito como aceptor de electrones en caso de limitación de oxígeno. Por tanto, es

posible que bacterias detectadas mediante la sonda NEU se viesen favorecidas ya que

se produjo acumulación de nitrito desde el día 97, pasando de una concentración en el

efluente de 1.5 mg N-NO2/L a alcanzar los 7 mg N-NO2/L como valor promedio a partir

del día 134 y hasta el final del periodo experimental.

Respecto a la reducción de la población de N. oligotropha en relación con la

concentración de nitrito, Bollmann et al., (2002) hallaron que la población de bacterias

amonioxidantes G5-7 (muy relacionada con Nitrosomonas oligotropha) se vio afectada

cuando en el reactor se incrementó la concentración de nitrito, de lo que dedujeron

una posible sensibilidad de estas bacterias a la presencia de este compuesto en el

medio, lo cual coincide con los resultados obtenidos en este trabajo.

La predominancia de bacterias detectadas por la sonda NEU viene

referenciada por otros estudios (Logemann et al., 1998; Egli et al., 2003). Fux et al.,

(2003) obtuvieron una modificación poblacional en un sistema SBR operado con

influente artificial, con un incremento de bacterias identificas con la sonda NEU

respecto al total de bacterias detectadas con la sonda Nso1225, lo cual coincide con

los resultados presentados en relación al cambio poblacional observado en este

trabajo.

4.2.2.3 Análisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias nitritoxidantes

Las sondas empleadas fueron Ntspa712 (hibrida para la mayor parte de

miembros del género Nitrospira) y NIT3 (género Nitrobacter spp.), aunque el total de

bacterias que dieron resultado positivo en la hibridación correspondieron a la sonda

Ntspa712 y por tanto al phylum Nitrospira. Para confirmar estos resultados se llevaron

a cabo 8 hibridaciones, 2 al inicio de cada fase mediante la sonda NIT3 y su

competidora sin obtenerse resultados positivos en ninguna fase.

Estudios llevados a cabo en plantas de tratamiento de aguas residuales

coinciden en que las bacterias pertenecientes al género Nitrospira son dominantes en

estos ambientes frente a las bacterias del género Nitrobacter (Wagner et al., 1996;

Juretschko et al., 1998; Schramm et al., 1998; Okabe et al., 1999; Daims et al., 2000;

Nogueira et al., 2002; Konrad et al., 2003, Carvalho et al., 2006).

La Figura 27 presenta la evolución de la población de bacterias nitritoxidantes y

de las concentraciones de nitrito y nitrato en la fase final de la etapa de reacción.

86

Resultados y Discusión

Figura 27. Porcentaje de bacterias nitritoxidantes en el licor mezcla detectadas con la sonda Ntspa712 en relación con la sonda EUBmix. Concentración de nitrito en el licor

mezcla al final de la fase aerobia de la etapa de reacción

Al inicio del ensayo el proceso fue estable con una población de NOB cercana

al 3% respecto al dominio Eubacteria. A pesar de que ésta se redujo durante los 25

primeros días de experimentación hasta un 1%, la concentración de nitrito no se

incrementó y la concentración de nitrato en el medio varió en un intervalo de entre 5 y

3 mg N-NO3/L.

Desde el día 25 (Fase II) la población de nitritoxidantes fue en aumento y

alcanzó un valor cercano al 8% hasta el día 56. Sin embargo, posteriormente la

población de NOB se fue reduciendo de forma progresiva hasta un valor cercano al

1% el día 79. Al mismo tiempo se observó un incremento progresivo de la

concentración de nitrito en el licor mezcla, hasta alcanzar un valor de 5.5 mg N-NO2/L.

Por tanto, es posible que las bacterias detectadas mediante el procedimiento de

hibridación fueran bacterias viables en torno al día 25 y no viables en torno al día 79,

lo cual explicaría la acumulación de nitrito con una misma concentración de NOB en el

licor mezcla.

El día 83 (inicio de la Fase III) se realizó la resiembra de 2 L, tras la cual el

sistema dio muestras de recuperación del proceso de oxidación de nitrito. Se observó

una rápida respuesta de la actividad de las bacterias nitritoxidantes, ya que su

población pasó de un 1% a un 10% tras un periodo de aproximadamente 10 días y se

87

Resultados y Discusión

logró la nitrificación completa. Sin embargo, hacia el día 97 del proceso experimental

se produjo de nuevo la acumulación de nitrito en el licor mezcla. Este hecho mostró

que la bioaumentación no es un método efectivo para la recuperación de determinadas

poblaciones bacterianas, como indican otros estudios (Bouchez et al., 2000; Seviour y

Nielsen, 2010)

En la Tabla 17 pueden observarse los resultados obtenidos para las dos

sondas estudiadas.

Tabla 17. Porcentajes de NOB en el reactor licor mezcla en relación con la sonda EUBmix (dominio Eubacteria)

Nitr

obac

ter s

pp.

Phy

lum

Nitr

ospi

rae

NIT3 Ntspa712

Fase Día

(%) (%) 1 0 2 ± 1

12 0 1 ± 1 I

20 1 ± 1

29 0 2 ± 1

33 0 3 ± 1

42 5 ± 1

56 8 ± 2

61 7 ± 2

70 5 ± 2

II

79 1 ± 1

91 0 10 ± 2

104 0 3 ± 1

111 2 ± 1 III

124 2 ± 1

139 0 1 ± 1

154 0 1 ± 1

168 1 ± 1 IV

174 1 ± 1

En sistemas que trabajan bajo condiciones variables se puede dar el caso de

que una restricción en determinada fase de la actividad de las bacterias pueda permitir

el desarrollo de poblaciones de NOB diversas (Gieseke et al., 2001). Sin embargo, en

este caso la población dominante ha sido la perteneciente al género Nitrospira.

88

Resultados y Discusión

A continuación, en la Figura 28 se presentan imágenes obtenidas mediante la

técnica FISH sobre muestreos realizados a lo largo del periodo experimental

empleando la sonda Ntspa712. Se puede observar como las agrupaciones de

bacterias Nitrospira dan lugar a formaciones irregulares de pequeño tamaño y por lo

general dispersas.

FASE I

FASE II

FASE III

FASE IV

Figura 28. Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda

EUBmix) y en rojo las β-proteobacterias NOB identificadas por la sonda Ntspa712. Imágenes tomadas a 63x.

89

Resultados y Discusión

4.2.2.4 Influencia del pH y la concentración de oxígeno disuelto en la población de NOB

La ausencia de oxígeno disuelto en el medio durante 12 horas el día 25

provocó una reducción importante en la actividad de las bacterias. A este respecto,

Daims et al., (2001a) hallaron que bajo condiciones anaerobias, bacterias del género

Nitrospira spp. no llevaron a cabo la toma de carbono, lo que indica que en ausencia

total de OD su actividad se reduce de forma significativa.

A partir del día 25 (Fase II), tras la limitación de oxígeno, la población de

bacterias NOB se recuperó con una concentración de OD en el medio de 2.5 mg O2/L,

aunque se produjo una acumulación progresiva de nitrito. Otros autores (Nogueira et

al., 2002) obtuvieron resultados semejantes, con valores crecientes en la población de

bacterias nitritoxidantes y acumulación simultánea de nitrito.

El día 83 (Fase III), tras incrementar el OD a 3.5 mg O2/L y realizar el inóculo

de 2 L, durante los 14 primeros días se produjo la nitrificación completa. Sin embargo,

como ya se ha comentado, posteriormente la población de bacterias NOB se redujo de

manera progresiva y comenzó a observarse de nuevo la acumulación de nitrito en el

licor mezcla.

Como posible solución para la recuperación del proceso de nitrificación, el día

134 (inicio de la Fase IV) se incrementó el pH pasando de un valor de inicio de ciclo de

6.5 a un valor de 7.5 ya que existen estudios que indican que el crecimiento y la

actividad de las bacterias NOB se ve incrementado a valores de pH en torno a 7.5 -

8.0 (Prosser, 1989; Gieseke et al., 2006; Gu et al., 2007) mientras que a valores

inferiores a 6.5 la velocidad de nitrificación se reduce de forma brusca (González et al.,

2010). Sin embargo, la modificación del pH no influyó en la recuperación de la

población de NOB y la acumulación de nitrito se mantuvo hasta el final del periodo

experimental.

En cuanto al efecto inhibitorio del nitrito, el auténtico inhibidor es el ácido

nitroso (HNO2) cuya concentración va en función del pH del medio. Varios autores

(Vadivelu et al., 2006; Sinha y Annachhatre, 2007) han observado que a un valor de

pH inferior a 6 se incrementa la concentración de ácido nitroso, afectando los procesos

de nitrificación. A este respecto existen trabajos (Anthonisen, 1976; Almeida, 1995)

que indican que el ácido nitroso tiene un impacto considerable sobre las bacterias

NOB. Estos trabajos indican que una concentración de HNO2 superior a 2.8 mg/L no

permite la nitrificación completa ya que inhiben la actividad de las bacterias

nitritoxidantes.

No obstante, Vadivelu et al., (2006) hallaron que una concentración de 0.02 mg

N-HNO2/L provocó un descenso del 15% en el ratio de toma de oxígeno en una

90

Resultados y Discusión

población de Nitrobacter. Y aunque las poblaciones pertenecientes al género

Nitrospira son predominantes en estaciones depuradoras de aguas residuales, podría

resultar interesante el estudio del efecto de la concentración de ácido nitroso en su

actividad nitrificante.

A partir de los cálculos de equilibrio químico (Ecuación 21 y 22) entre el nitrito y

el ácido nitroso se calculó la concentración de ácido nitroso correspondiente a 10 mg/L

de nitrito con un pH de 6.5 (menor pH a lo largo del periodo experimental) y una

temperatura de 20ºC.

pH

NOKeTNOHNO 2

2

101 +

= Ecuación 21

Siendo TNO2 = NO2 + HNO2

4273

2300

109.3 −+−

⋅== eTNOKe Ecuación 22

Donde KeNO (mol L-1) es la constante de equilibrio químico a 20ºC de

NO2¯/HNO2.

La concentración de ácido nitroso obtenida fue de 0.008 mg N-HNO2/L, valor

muy por debajo del umbral de inhibición propuesto por Anthonisen (1976). Por esta

razón se puede desestimar la hipótesis de que la inhibición de las NOB se produjo a

causa de la presencia de ácido nitroso en el sistema.

Kim et al., (2008) estudiaron la acumulación de nitrito a diferentes

temperaturas, y observaron que a 20ºC no se produjo acumulación de nitrito en el

reactor. Mientras que los resultados obtenidos por Gerardi (2002) indican que a pesar

de obtener la nitrificación completa a 20ºC, a menor temperatura (16 ºC) el porcentaje

de nitrificación obtenido fue un 50% inferior respecto al proceso a 30ºC. Por tanto,

ligeras variaciones en el rango de temperatura son de gran importancia cuando se

trabaja en valores de temperatura en torno a 20ºC.

Otro parámetro importante a tener en cuenta en el desarrollo de las

poblaciones bacterianas es la fuente de carbono (orgánico o inorgánico). Por lo

general, el contenido en materia orgánica de las aguas residuales suple las

necesidades de la población microbiana, sin embargo, en determinados sistemas de

tratamiento se emplean fuentes alternativas de carbono (principalmente en sistema

con desnitrificación).

91

Resultados y Discusión

En el presente trabajo se empleó ácido acético como fuente de carbono, que es

el ácido graso volátil dominante en los sistemas de aguas residuales, aunque también

se pueden emplear glucosa ometanol.

La relación del ácido acético con la acumulación de nitrito en sistemas de

nitrificación viene referenciada por diversos autores. Ge et al., (2012) no hallaron

diferencias notables en cuanto a la acumulación de nitrito al comparar como fuente de

carbono el acético con la glucosa y el metanol. Por otro lado, Carley y Mavinic (1991)

hallaron una acumulación de nitrito del orden del 21% al emplear acético como fuente

de carbono y del 23 y el 17% al emplear glucosa y metanol respectivamente. Mientras

que Sun et al., (2009) obtuvieron un incremento del 10% en la acumulación de nitrito al

emplear ácido acético con respecto al uso de metanol y Eilersen et al., (1994) hallaron

que diversos ácidos (fórmico, propiónico y acético) inhibieron por igual el proceso de

nitrificación.

A este posible efecto inhibitorio del ácido acético sobre la población de NOB,

Nogueira et al., (2002) hallaron que Nitrospira tenía cierta resistencia a desarrollarse

bajo esta fuente de carbono orgánico, recuperándose tras la interrupción de la adición

de ácido acético en el reactor. Y estudios llevados a cabo por Daims et al., (2001)

hallaron que bacterias relacionadas con el género Nitrospira no empleaban acetato

como fuente de carbono orgánico, sino piruvato.

Además de los factores indicados hasta ahora, la intensidad lumínica es

también un parámetro importante a tener en cuenta en la evolución de poblaciones

microbianas. En ensayos de laboratorio en los que se emplean reactores piloto de

materiales translúcidos se ha detectado que puede tener un cierto efecto negativo en

los procesos de nitrificación/desnitrificación que en el caso de reactores industriales

pasa desapercibido por tratarse de materiales opacos. Kaplan et al., (2000) y Vanzella

et al., (1989) hallaron que las bacterias NOB eran más sensibles a la luz solar que las

bacterias AOB. Por otro lado, Olson (1981) en un estudio llevado a cabo en un

depósito de aguas residuales observó cierto grado de inhibición de la actividad de

bacterias nitritoxidantes al incrementar la intensidad lumínica durante las épocas de

finales de primavera y verano, que dependió de la dosis de luz. Al comparar con un

estado de oscuridad total, un incremento en la luminosidad del 5% provocó una

inhibición del 15% y de un 67% al recibir plena intensidad lumínica.

Tal y como se observa en la Figura 8 correspiente al apartado de 3.1 de

Materiales y Métodos, el montaje experimental se realizó en un reactor

semitransparente sometido a luz directa. Por tanto, el incremento de la intensidad

lumínica durante las últimas fases del ensayo (correspondientes a los meses de abril y

mayo) podría haber afectado la capacidad de las bacterias NOB para desarrollarse.

92

Resultados y Discusión

Por tanto, sería interesante realizar un estudio más en profundidad a este respecto,

enfocado a la influencia de la intensidad lumínica en la realización de ensayos a

escala de laboratorio.

4.2.2.5 Análisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias desnitrificantes

La Tabla 18 presenta los porcentajes obtenidos para las tres sondas

empleadas.

Tabla 18. Porcentajes de desnitrificantes en el reactor licor mezcla en relación con sonda EUBmix (dominio Eubacteria)

Gén

eros

A

zoar

cus-

Thau

era-

Cas

tani

ella

Gén

eros

P

arac

cocu

s

Des

nitri

fican

tes

a p

artir

de

met

anol

AT1458 PAR651 DEN67

Fase Día

(%) (%) (%) 1 11 ± 2 2 ± 1 0

12 11 ± 2 2 ± 1 0 I

20 11 ± 2 2 ± 1

29 12 ± 2 2 ± 1 0

33 14 ± 2 2 ± 1 0

42 15 ± 2 2 ± 1

56 20 ± 6 2 ± 1

61 25 ± 6 2 ± 1

70 29 ± 7 2 ± 1

II

79 33 ± 8 1 ± 1

91 45 ± 5 1 ± 1 0

104 50 ± 6 4 ± 1 0

111 58 ± 7 7 ± 1 III

124 61 ± 7 10 ± 3

139 63 ± 8 8 ± 2 0

154 67 ± 8 7 ± 3 0

168 70 ± 9 7 ± 3 IV

174 72 ± 9 7 ± 3

Desde el primer día del ensayo y hasta el día 25 el porcentaje de ambas

poblaciones de bacterias se mantuvo estable. A partir del día 25, la población de

bacterias detectadas por sonda AT1458, que hibrida los géneros de bacterias

Azoarcus, Thauera y Castellaniella aumentó de forma progresiva hasta alcanzar un

93

Resultados y Discusión

valor en torno a un 70% en la fase final del periodo experimental. A este respecto,

diversos autores (Juretschko et al., 2002; Wagner et.al, 2002; Ginige et al., 2005;

Thomsen et al., 2007; Nielsen y Seviour, 2010) coinciden en situar los géneros

Thauera y Azoarcus como mayoritarios en estaciones depuradoras con etapa de

desnitrificación, coincidiendo con los resultados obtenidos en el presente trabajo.

En el caso del género Azoarcus los valores que suelen presentarse en

estaciones depuradoras de aguas residuales varían entre un 3% y un 16% pudiendo

alcanzar valores superiores a un 30% cuando se emplean fuentes de carbono

orgánico externas (Thomsen et al., 2007). Y en el caso de Thaurea los valores

hallados más comúnmente se encuentran entre un 2% y un 11%, por lo que en

conjunto pueden llegar a suponer un porcentaje relevante de la población de

desnitrificantes en una estación depuradora con suplemento de carbono orgánico.

Por otro lado, las bacterias del género Paracoccus, hibridadas mediante la

sonda PAR651, redujeron su concentranción en el licor mezcla de forma progresiva.

Sin embargo, 5 días después de la resiembra llevada a cabo para recuperar la

población de NOB, su concentración se incrementó hasta alcanzar una concentración

del 10%, que posteriormente se estabilizó en torno a un valor del 7% en la fase final

del periodo experimental.

Respecto a la sonda DEN67, que hibrida para bacterias que emplean metanol

como fuente principal de carbono orgánico, no dio resultados positivos.

A continuación se presentan imágenes tomadas a lo largo del periodo

experimental para las sondas AT1458 y PAR651. Se puede observar como las

agrupaciones de bacterias Azoarcus/Thaurea (Figura 29) dan lugar a colonias

agrupadas e irregulares y Paracoccus (Figura 30) dan lugar a colonias irregulares o

circulares en función del número de bacterias que la conforman, aunque por lo general

forman grupos dispersos.

94

Resultados y Discusión

FASE I

FASE II

FASE III

FASE IV

Figura 29. Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda

EUBmix) y en rojo las bacterias desnitrificantes identificadas por la sonda AT1458. Imágenes tomadas a 63x.

95

Resultados y Discusión

FASE I

FASE II

FASE III

FASE IV

Figura 30. Imágenes obtenidas mediante la técnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda

EUBmix) y en rojo las bacterias desnitrificantes identificadas por la sonda PAR651. Imágenes tomadas a 63x.

96

Resultados y Discusión

4.2.2.6 Influencia del pH y la concentración de oxígeno disuelto en la población de desnitrificantes.

En la Figura 31 puede observarse la evolución de las poblaciones de bacterias

desnitrificantes hibridadas mediante las sondas AT1458 y PAR651 en relación con la

concentración de nitrito y nitrato en el licor mezcla al final de la fase anóxica de la

etapa de reacción.

Figura 31. Porcentaje de bacterias desnitrificantes (DES) en el licor mezcla detectadas con las sondas AT1458 y PAR651 en relación con la sonda EUBmix. Concentración de

nitrito y nitrato en el licor mezcla al final de la fase anóxica de la etapa de reacción

La reducción de los compuestos nitrogenados durante la fase de

desnitrificación no se vio afectada por la concentración de oxígeno ya que ésta se

mantuvo en valores en torno a 0 mg O2/L.

En cuanto al efecto del pH, los resultados obtenidos indicaron que tras

incrementar el pH de inicio de ciclo de 6.5 a 7.5, las bacterias hibridadas mediante la

sonda AT1458 (géneros Azoarcus, Thauera y Castellaniella) no se vieron afectadas,

manteniendo el ritmo de crecimiento a lo largo de todo el periodo experimental.

El porcentaje de bacterias detectadas por la sonda PAR651 se mantuvo en

torno a valores del 2% respecto al dominio Eubacteria hasta el día 91. Transcurridos 8

97

Resultados y Discusión

días de la resiembra, su concentración se incremento hasta alcanzar un porcentaje del

10% que tras el incremento de pH a 7.5 se estabilizó en valores en torno al 7%.

Esta reducción pudo deberse tanto al efecto del pH como a la competencia

generada por las bacterias de los géneros Azoarcus y Thauera.

Ginige et al., (2005) observaron en un reactor que tenía una elevada

concentración de los géneros Azoarcus y Thaurea, una reducción en la concentración

de nitrito de 107 mg N-NO2/L a 0.02 mg N-NO2/L durante la etapa anóxica con un pH

de 7.5 y ácido acético como fuente de carbono externa. De lo cual dedujeron que

estos géneros son capaces de llevar a cabo el proceso de desnitrificación de forma

óptima en presencia de nitrito y ácido acético, lo cual coincide con los resultados

obtenidos en el presente trabajo. A este respecto, Morgan-Sagatsume et al., (2008)

hallaron que bacterias del género Azoarcus se desarrollaron más en un medio rico en

nitrito y con ácido acético como fuente de carbono.

En cuanto al efecto de la concentración de nitrito en el licor mezcla, tras la

resiembra (día 83), la concentración de nitrito se redujo pasando de 10 mg N-NO2/L a

una concentración de prácticamente 0 mg N-NO2/L. No obstante, la población de

bacterias desnitrificantes no se vio afectada y durante los días posteriores incrementó

su concentración de un 45% (día 91) a un 60% (día 124) alcanzando un porcentaje en

torno al 70% en la etapa final de la Fase IV (día 174).

Existen numerosos estudios que relacionan el desarrollo de una determinada

población de bacterias heterótrofas desnitrificantes con el sustrato empleado como

fuente de carbono. Ginige et al., (2007) observaron que al emplear acético como

fuente de carbono se potenció una población determinada de bacterias en un sistema

de fangos activados. Otros autores (Hallin et al., 1995; Isaacs y Henze, 1995; Lee y

Weelander, 1996) indican que en sistemas de fangos activados en los que se añaden

fuentes de carbono externas se pueden provocar modificaciones en la población de

bacterias heterótrofas. Sin embargo, en este estudio se observó que durante lo

primeros días de experimentación las poblaciones de bacterias no se vieron

modificadas respecto a los valores del fango activo.

Según Ginige et al., (2005) y Osaka et al., (2006) el uso de ácido acético

promueve el desarrollo de miembros de Comamonadaceae y Rhodocyclaceae como

Comamonas, Acidovorax y Thaurea. Thomsen et al., (2007) hallaron que empleando

como fuente de carbono orgánico el ácido acético se obtuvo la mayor toma de carbono

por parte de los géneros Thaurea y Azoarcus, con un 50% y un 45% respectivamente

identificando Azoarcus como desnitrificantes a partir de nitrato y Thaurea y

Aquaspirillium a partir de nitrito.

98

Resultados y Discusión

Gu et al., (2007) trabajaron bajo condiciones similares a las empleadas en el

presente trabajo (23ºC y pH 6.5 - 8.3) y la desnitrificación en presencia de ácido

acético fue más favorable a partir de nitrito. Además, observaron una menor demanda

de materia orgánica, lo cual coincide con los resultados obtenidos, ya que en la etapa

final del periodo experimental se observó una ligera acumulación de acético en el

efluente.

99

CONCLUSIONES

Conclusiones

En este trabajo se ha estudiado el efecto de ciertos factores ambientales y de

operación sobre la evolución y el comportamiento de diversas especies de

microorganismos amonioxidantes, nitritoxidantes y desnitrificantes, presentes en un

proceso biológico de eliminación de materia orgánica y nitrógeno de una corriente de

agua residual típicamente urbana. A continuación se describen las conclusiones

obtenidas más importantes:

1. Mediante la aplicación de la técnica FISH se ha identificado que en el inóculo

los microorganismos amonioxidantes (AOB) dominantes correspondieron

mayoritariamente a la especie Nitrosomonas oligotropha-lineage. Asimismo, se

ha determinado que el género de bacterias nitritoxidantes presentes en el

inóculo ha correspondido prácticamente en su totalidad a microorganismos

pertenecientes al genero Nitrospira. Por otro lado, las sondas de hibridación

disponibles para identificar organismos desnitrificantes han mostrado en este

inóculo microorganismos pertenecientes principalmente a los géneros

Azoarcus, Thauera y Castellaniella, y en menor proporción organismos del

género Paracoccus.

2. Hibridaciones realizadas durante la evolución del proceso a lo largo del periodo

experimental, en las que se ha empleado la sonda general NSO1225

(organismos amonioxidantes β-proteobateria) y diversas sondas específicas

(NEU, Nse1472, Nmv, Nmo218 y Nsv443) para microorganismos

amonioxidantes, han indicado un cambio poblacional. El porcentaje de

microorganismos AOB identificados como más abundantes en el inóculo de

puesta en marcha (Nitrosomonas oligotropha-lineage) descendió ligeramente a

lo largo del periodo experimental, mientras que los microorganismos

identificados con la sonda NEU se incrementaron de forma considerable, ya

que fueron detectados en el inóculo de puesta en marcha en un porcentaje

inferior al 1% y alcanzaron unvalor del13%.

3. Dentro del grupo de microorganismos AOB identificados con la sonda NEU no

se ha logrado determinar las especies de AOB presentes en el licor mezcla.

Los resultados obtenidos empleando las sondas Nse1472 y Nsv443 han sido

negativos.

4. La concentración de oxígeno disuelto en un reactor biológico es un parámetro

fundamental para llevar a cabo el proceso de nitrificación. De los

100

Conclusiones

microorganismos involucrados en este proceso: microorganismos

amonioxidantes y nitritoxidantes, los microorganismos AOB han mostrado una

mayor capacidad de superar situaciones puntuales de baja concentración de

oxígeno disuelto en el licor mezcla. Los microorganismos NOB, pertenecientes

mayoritariamente al género Nitrospira, no lograron recuperarse de manera

satisfactoria y su población no alcanzó valores estables a lo largo del periodo

experimental, por lo que estos microorganismos son más sensibles a bajas

concentraciones de oxígeno disuelto en el medio.

5. El pH es un parámetro que influye de diversas formas en los procesos de

eliminación biológica de nitrógeno de las aguas residuales, tanto por su acción

intrínseca como inhibidor del proceso, como por su efecto en el equilibrio

químico entre sustrato e inhibidor (amoniaco - NH3 y ácido nitroso - HNO2) de

los organismos involucrados en el proceso de nitrificación. Valores puntuales

de pH 6.5 durante la operación del proceso (inicio de cada ciclo) pudieron

afectar la actividad de los organismos NOB, ocasionando que la nitrificación se

realizara sólo hasta nitrito. Debido a que la concentración de ácido nitroso en el

licor mezcla no ha sido suficientemente elevada, es importante destacar que

esta reducción de la actividad de NOB puede ser debida al propio efecto del pH

bajo. Por otro lado, a pesar de incrementar el pH a 7.5 al inicio del ciclo, no se

observó actividad de NOB y el nitrito continuó acumulándose en el licor mezcla.

6. Las bacterias desnitrificantes de los géneros Azoarcus y Thaurea no se han

visto afectadas por la modificación del pH (periodos a pH 6.5 y 7.5) al inicio de

cada ciclo de operación. Asimismo, se ha observado que el incremento en la

concentración de nitrito potencia su desarrollo, por tanto estos

microorganismos pueden emplear tanto el nitrato como el nitrito como aceptor

de electrones durante el proceso de desnitrificación.

7. Las bacterias desnitrificantes del género Paracoccus se han visto afectadas al

pasar el pH al inicio de cada ciclo de 6.5 a 7.5.

8. La técnica FISH puede ser empleada de manera satisfactoria en combinación

con otras técnicas microbiológicas y analíticas, para llevar a cabo el

seguimiento de poblaciones microbianas y diagnosticar el estado del proceso

biológico en una estación de depuración de agua residual.

101

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