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ESTUDIO DE ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGENA Y ENTEROAGREGATIVA EN MENORES DE CINCO AÑOS DE EDAD CON DIARREA PERSISTENTE MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA [2000] ISABEL ARIAS BUSTAMANTE OMAR CACERES REY EDUARDO SALAZAR LINDO MARIA LUZ ZAMUDIO ROJAS JOSE CARLOS HUGUET TAPIA SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº34

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ESTUDIO DE ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGENA Y

ENTEROAGREGATIVA EN MENORES DE CINCO AÑOS DE EDAD CON

DIARREA PERSISTENTE

MINISTERIO DE SALUDINSTITUTO NACIONAL DE SALUDCENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA

[2000]

ISABEL ARIAS BUSTAMANTEOMAR CACERES REY

EDUARDO SALAZAR LINDOMARIA LUZ ZAMUDIO

ROJAS JOSE CARLOS HUGUET TAPIA

SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº34

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CON DIARREA PERSISTENTE

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TITULO DE LA INVESTIGACION

CODIGO OGITT: 2-01-05-03-053

ESTUDIO DE ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGENA Y ENTEROAGREGATIVA EN

MENORES DE CINCO AÑOS DE EDAD CON DIARREA PERSISTENTE

NOMBRES Y APELLIDOS COMPLETOS DE LOS INVESTIGADORES

ISABEL ARIAS BUSTAMANTE

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD - LABORATORIO DE ENTEROPATOGENOS

4719920 – 117, Capac Yupanqui 1400, Jesús María, [email protected]

OMAR CACERES REYINSTITUTO NACIONAL DE SALUD - LABORATORIO DE ENTEROPATOGENOS

4719920 – 129, Capac Yupanqui 1400, Jesús María.

EDUARDO SALAZAR LINDOHOSPITAL NACIONAL CAYETANO HEREDIA855 2049, Honorio Delgado . San Martín de Porres

MARIA LUZ ZAMUDIO ROJAS INSTITUTO NACIONAL DE SALUD - LABORATORIO DE ENTEROPATOGENOS

4719920 – 117, Capac Yupanqui 1400, Jesús María.

JOSE CARLOS HUGUET TAPIA INSTITUTO NACIONAL DE SALUD - LABORATORIO DE ENTEROPATOGENOS

4719920 – 129, Capac Yupanqui 1400, Jesús María.

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RESUMEN

La presencia y el rol de Escherichia coli Enteropatógena y Enteroagregativa, en

diarrea persistente es desconocido en el Perú. A pesar que en el ámbito mundial

se ha detectado alguna relación de esta bacteria con cuadros de diarrea, sobre

todo persistente; en el Perú, éste patógeno no es considerado por muchos

laboratorios como agente infeccioso importante, desconociéndose de ésta

manera la prevalencia de éste agente en la población infantil.

El presente estudio tiene como objetivo describir la frecuencia de E. coli

Enteropatógena (EPEC) y Enteroagregativa (EAEC), en pacientes menores de

cinco años con diarrea persistente, tipificando los aislamientos de EPEC y EAEC

aislados de los diversos grupos de diarreas y establecer una correlación con la

clínica.

Se establecieron dos grupos de estudio, uno en el cual presentaron

características de diarrea persistente y el otro grupo con diarrea aguda, con la

finalidad de comparar frecuencias de E.coli. La metodología empleada en el

estudio fue el cultivo microbiológico, serotipificación y análisis molecular mediante

Reacción en Cadena de la Polimerasa ( PCR ).

Los resultados obtenidos en el presente estudio nos indica la presencia de

factores de virulencia ( Eagg ) en un 10.67 % para la categoría de E. coli

diarreogénica Enteroagregativa, en una población con diarrea persistente. Se

obtuvo el 13.40 % para los factores ( Eagg ) de E. coli Enteroagregativa en

diarrea aguda. También se encontraron los factores de virulencia ( eae, bfp ) de la

categoría de E. coli Enteropatógena en el 6.79 % y 4.12 %, dentro de la población

con diarrea persistente y aguda respectivamente.

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INTRODUCCION

La diarrea persistente es considerada en la actualidad como un problema en salud

publica, afectando niños menores de cinco años y principalmente lactantes(1). Se

estima que anualmente, alrededor de unos 2,2 millones de niños mueren por

deshidratación debido a la diarrea persistente que con frecuencia se agrava

debido a la desnutrición (1y 2). En el Perú, se considera a la diarrea en todas sus

formas como un problema grave, siendo los cuadros persistentes muy comunes

asociados a diferentes factores, tales como fisiológicos y nutricionales del

paciente, antecedentes de diarreas continuas y el factor infeccioso (1).

La presencia específica de organismos patógenos en diarrea persistente ha sido

demostrada en varias oportunidades, postulándose de esta manera al factor

infeccioso como un importante condicionante dentro del cuadro de diarrea

persistente en población infantil (9, 11, 12).

En la actualidad se reconoce que E. coli Enteropatógena y E. coli

Enteroagregativa, pueden estar involucradas y ser un importante factor en diarrea

persistente en población infantil (9,11,12). Numerosos estudios de casos y

controles han demostrado una mayor frecuencia tanto de E. coli Enteropatógena

como Enteroagregativa en pacientes con diarrea persistente que otros cuadros de

diarrea (1, 9, 10). Sin embargo, en el Perú la presencia de E. coli en coprocultivos

es mal interpretada ya que se piensa que es una bacteria de flora normal y se

ignora el verdadero potencial patogénico. De esta manera, queda un vacío de

información acerca de la frecuencia con que E. coli Enteropatógena es asociada a

cuadros de diarrea persistente, produciéndose además que la etiología real de una

diarrea puede ser sesgada.

En la actualidad las técnicas rutinarias realizadas en el Perú para identificación de

E. coli no pueden distinguir con facilidad una bacteria patógena o no patógena.

Adicionalmente, se ha observado que en los Centros de Salud existe una

confusión en la definición de categoría patogénica de E. coli. A pesar que en las

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últimas convenciones internacionales en microbiología se reconoce y se define a

E. coli enteropatógena como aquella bacteria que posee dos genes específicos: el

de la intimina (AE) y el de la fimbria (bfp), dejando a la serotipificación como un

análisis referencial y no concluyente (13); en muchos centros de Salud se cree

aun que el serotipo justifica la patogenicidad de esta bacteria. En consecuencia se

reportan en muchos casos E. coli enteropatogena sólo teniendo en cuenta el

serotipo y sin haber analizado la real patogenicidad de esta bacteria.

Como resultado final de esta confusión, el tratamiento de la diarrea se basa con

frecuencia sólo en la experiencia clínica, sin detectar al agente etiológico

responsable del cuadro diarreico, teniéndose una información sesgada del

problema. Se encuentran además escasos registros detallados acerca del estudio

de E. coli enteropatógena, quedando un vacío de información acerca de la

epidemiología de esta bacteria en el Perú.

La E. coli enteroagregativa (EAEC) fue descrita por Cravioto y col, mediante el

análisis de biopsias en microscopía electrónica (14). En estos análisis se observó

un fenómeno de adhesión de las bacterias al epitelio intestinal con un patrón

característico de agregación, formando además una película o Biofilm sobre el

epitelio. Este mecanismo de adherencia más la presencia de una citotoxina

característica de la bacteria produce un cuadro de diarrea (15).

La identificación de esta bacteria se realiza principalmente por el cultivo celular del

aislamiento, tratando de repetir el fenómeno producido in vivo (16). Sin embargo la

metodología resulta un poco complicada de realizar por todos los laboratorios así

que en la actualidad se emplean técnicas de amplificación molecular dirigidas a

los genes característicos de esta bacteria, principalmente el gene de la adherencia

y de la citotoxina (17).

A pesar de las nuevas metodologías, el problema de identificación de EAEC

persiste y no esta resuelto, ya que laboratorios locales no tienen capacidad para

desarrollar técnicas moleculares o de cultivo celular. Una alternativa para el

diagnostico primario de esta bacteria es la correlación clínica, epidemiológica y la

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confirmación con el test de formación de Biofilm en tubo. Este método fue descrito

por Albert (18).

Objetivo General.-

Describir la frecuencia de Escherichia coli enteropatógena (EPEC ) y E. coli

enteroagregativa (EAEC), en diarrea persistente, de las cepas aisladas de

muestras de niños menores de 5 años.

Objetivos específicos.-

- Encontrar frecuencias de EPEC y EAEC en pacientes con diarrea persistente

mediante PCR y PCR Multiplex.

-Tipificar los aislamientos de EPEC y EAEC aislados de los diversos grupos de

diarreas por serologia.

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MATERIAL Y METODOS

Debido a que no se tiene mayor información sobre frecuencias de EPEC o EAEC

en el Perú, se realizó un estudio de tipo descriptivo.

El universo considerado en la población fueron niños menores de 5 años que

asistieron al Hospital Cayetano Heredia de la DISA Lima Norte y Hospital Sergio

Bernales - Collique. Se establecieron dos grupos de estudio, el primero que estuvo

conformado por pacientes (niños igual o menores de cinco años) que presentaron

diarrea persistente, teniendo en cuenta los criterios de Inclusión (Ver Anexo)

Adicionalmente se captaron pacientes con diarrea aguda, tomando en cuenta

también algunos criterios de inclusión (Ver Anexo).

De esta manera se formaron dos grupos: el grupo de estudio (con diarrea

persistente) y el grupo de comparación o contraste (con diarrea aguda ).

Se evaluaron 103 muestras de pacientes que cumplieron la definición de diarrea

persistente. El grupo de comparación conformado por 97 muestras de pacientes

que cumplieron la definición de diarrea aguda.

Obtención de muestra

La toma de muestra se realizó mediante hisopado rectal, el hisopo fue colocado en

medio de transporte Cary blair. La muestra fue tomada por el encargado del

servicio y remitida al Laboratorio de Enteropatógenos – INS, para ser procesada

de inmediato.

Envío de muestras al INS

Las muestras en Cary Blair, fueron enviadas al INS acompañadas de la ficha

clínico epidemiológica del paciente a excepción del Hospital Sergio Bernales que

remitió el agente aislado de la muestra, el mismo que fue remitido en medio de

mantenimiento de Tripticase soy agar, con la ficha respectiva.

Procesamiento de Muestras:

Se procedió al aislamiento e identificación del agente, orientándose a buscar

principalmente E. coli enteropatogena clásica (EPEC) y E. coli enteroagregativa

(EAEC); utilizando medios selectivos y diferenciales.

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Para E. coli enteropatógena clásica se realizó serología con antisueros

polivalentes y monovalentes para serotipos asociados a EPEC; mientras que para

EAEC se realizó la prueba de formación de biofilm, utilizando caldo Muller Hinton.

Detección de factores de virulencia de EPEC o EAEC

Los aislamiento de E. coli encontrados en cada grupo fueron procesados mediante

Reacción en Cadena de la Polimerasa ( PCR ), para lo cual se procedió a realizar

los siguientes pasos:

Aislamiento de ADN.- La extracción de ADN, se realizó mediante CHELEX 100 al

5 %, tomando una colonia de un cultivo de 24 horas, se suspendió en 200 uL.,de

solución CHELEX , se agitó en vortex (10 segundos) y luego se incubó en baño

maría a 60 ºC por 30 minutos, se agitó en vortex (10 segundos ) y se hirvió en

baño maría por 10 minutos, agitamos nuevamente en vortex (10 seg) y

centrifugamos a 12,000 rpm por 3 minutos, el sobrenadante fue sacado a otro tubo

para realizar el PCR. El sobrenadante fue cuantificado espectrofotometría a 0.6 ug

de ADN en un promedio aproximado de 0.3 ng/mL por cada muestra.

Reacción en Cadena de la Polimerasa ( PCR ).-

- Preparación del Master Mix.- Para ello utilizamos los siguientes reactivos,

cuya concentración final de la reacción fue de 1x para el Buffer de Reacción,

1mM de Cloruro de Magnesio, 0.8 uM para cada uno de los Primer EAgg

EC F, Primer EAgg EC R, Primer Euer P1, Primer Euer P2, Primer bfp F,

Primer bfp R, 100 uM para la mezcla de nucleótidos, 2 uL de ADN y 1 U de

Taq Gold ADN polimerasa, para 25 uL de volumen final de reacción.

- El PCR fue realizado en un termociclador AMPLITRON II, donde los ciclos

de amplificación fueron: 1 ciclo de denaturación inicial a 95 ºC x 10 minutos;

30 ciclos de 95 ºC x 40 segundos; 53 ºC x 1 minuto y 72 ºC x 1 minuto y

una extensión final de 72 ºC x 10 minutos.

Ocho microlitros fueron colocados en un gel de agarosa al 2 % en buffer TAE 1X,

junto con 5 microlitros de un marcador de peso molecular. El gel fue sometido a

electroforesis horizontal a 170 V por una hora, posteriormente fue teñido con una

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solución de 0,5 ug/mL de bromuro de etidio por 15 minutos, los productos fueron

visualizados en un transiluminador de luz UV (UVP) y luego fueron fotografiados

usando un documentador de geles de la marca UVP. (Ver Foto)

PCR-MULTIPLEX PARA E. coli ENTEROPATOGENA (EPEC)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

RESULTADOS

M : marcador de Peso Molecular 100pb1 : E.coli no EPEC2 : EPEC eae +, bfp +3 : E.coli no EPEC4 : E.coli no EPEC5 : E.coli no EPEC6 : E.coli no EPEC7 : E.coli no EPEC8 : E.coli no EPEC9 : E.coli no EPEC10 : EPEC eae +11 : E.coli no EPEC12 : E.coli no EPEC13 : E.coli no EPEC14 : E.coli no EPEC15 : E.coli no EPEC16 : Control Positivo EPEC eae +, bfp +17 : Control Positivo EPEC bfp +18 : Control Negativo Klebsiella sp19 : Control de sistema

320pbgen bfp

920pbgen eae

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PCR PARA E. coli ENTEROAGREGATIVA (EAEC)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

A

B

RESULTADOSAM : marcador de Peso Molecular 100pb1 : E.coli no EAEC2 : E.coli no EAEC3 : EAEC eagg +4 : E.coli no EAEC5 : E.coli no EAEC6 : EAEC eagg +7 : EAEC eagg +8 : E.coli no EAEC9 : E.coli no EAEC10 : E. coli no EAEC11 : EAEC eagg +12 : EAEC eagg +13 : E. coli no EAEC14 : E. coli no EAECBM : marcador de Peso Molecular 100pb1 : E.coli no EAEC2 : EAEC eagg +3 : EAEC eagg +4 : E. coli no EAEC5 : E. coli no EAEC6 : E. coli no EAEC7 : EAEC eagg +8 : E. coli no EAEC9 : E. coli no EAEC10 : E. coli no EAEC11 : E. coli no EAEC12 : E. coli no EAEC13 : E. coli no EAEC14 : E. coli no EAEC15 : E. coli no EAEC16 : E. coli no EAEC17 : E. coli no EAEC18 : Control Positivo EAEC eagg +19 : Control de sistema

630pbgen eagg

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en el presente estudio nos indica la presencia de

factores de virulencia ( Eagg ) en un 10.67 % para la categoría de E. coli

Enteroagregativa, de una población de 103 muestras procedentes de diarrea

persistente. De 97 muestras con diarrea aguda se obtuvo el 13.40 % para los

factores ( Eagg ) de E. coli Enteroagregativa. También se encontraron los factores

de virulencia (eae, bfp) correspondiente a la categoría de E. coli Enteropatógena

en el 6.79 % y 4.12 %, para ambas poblaciones respectivamente.

Dentro de la población con diarrea persistente encontramos otros agentes

patógenos como Campylobacter (2.91 %), Aeromonas (1.94 %), Salmonella (0.97

%) y en un 7.76 % no se encontraron E. coli. En la población con diarrea aguda

también se encontraron agentes patógenos como Campylobacter (5.15 %),

Shigella (2.061 %) de igual modo hubieron muestras en las que no se aisló E. coli

(10.30 %).

Con respecto a los serotipos encontrados en la población con diarrea persistente

obtuvimos el 9.70 % y 12.37 % para la población con diarrea aguda.

Lo obtenido en el estudio muestran valores relativamente bajos para las

categorías de E. coli, motivo del estudio. Si comparamos ambos grupos

encontramos que los resultados obtenidos son similares.

Estudios realizados a nivel internacional revelan una frecuencia mayor de

aislamientos de E. coli Enteropatogena y E. coli Enteroagregativa en diarrea

persistente en comparación con otros cuadros clínicos de diarrea (9, 11, 12, 13)

Los datos obtenidos servirán de base para establecer estudios que puedan

identificar otras Categorías de E. coli, dentro de una población infantil a mediano y

largo plazo y que puedan realizarse en el ámbito nacional y conocer la situación

epidemiología de E. coli enteropatógena en el Perú.

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ESTUDIO DE ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGENA Y ENTEROAGREGATIVA EN MENORES DE CINCO AÑOS DE EDAD CON DIARREA PERSISTENTE

ESTUDIO DE ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGENA Y ENTEROAGREGATIVA EN MENORES DE CINSO AÑOS

CON DIARREA PERSISTENTE

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ANEXOS

Criterios de Inclusión

Pacientes con diarrea persistente

Diarrea persistente de 14 días o más al tiempo de la primera evaluación, sin

sangre visible en las deposiciones, durante las 24 horas posteriores a la admisión

del Hospital).

Pacientes con diarrea aguda

Diarrea aguda que dura entre 3 y 7 días del tiempo de la primera evaluación

No presentar sangre visible en cualquiera de las deposiciones pasadas dentro

durante las 24 horas posteriores a la admisión al Hospital u observada por la

persona que cuida al paciente, dentro de la 72 horas previas a la admisión

No presentar sepsis clínica o cualquier otra condición clínica severa presente a la

admisión o desarrollada dentro de las primeras 24 horas posteriores a la admisión,

Ausente episodio de diarrea la semana previa al episodio actual

Criterios de exclusión

Pacientes con diarrea persistente

Episodio actual que dura más de seis semanas al momento de la primera

evaluación.

Antibióticos usados a dosis terapéuticas las últimas 72 horas

Pacientes con diarrea aguda

Antibióticos usados a dosis terapéuticas las últimas 72 horas

Paciente con diarrea disentérica o sanguinolenta.