1

Estudio de asociación mediante marcadores genéticos de la Queratitis Superficial Crónica en

perros de raza Ovejero Alemán

Laura Soledad Barrientos

Trabajo de tesis para ser presentado como requisito parcial para optar al Título de DOCTORA en CIENCIAS VETERINARIAS

Área Genética de Animales Domésticos PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS VETERINARIAS

Director: Guillermo Giovambattista Codirectora: Pilar Peral Garcia Miembros del jurado: -Marcela Juliarena -Gastón More -Sebastian Picco

Marzo de 2017, Ciudad de La Plata, Argentina

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA

2

Dedicado especialmente a mi hermana, Mariel.

3

Agradecimientos

En este apartado, quisiera agradecer a quienes hicieron posible este trabajo de tesis.

A todos los miembros de mi querida Facultad de Ciencias Veterinarias de la UNLP, en

donde obtuve mi título de grado y viví las mejores etapas de mi vida, por brindarme el lugar

de trabajo.

A mi director, Guillermo Giovambattista, por su constante ayuda, preocupación y buen

humor en el desarrollo de mi trabajo.

A mi codirectora y directora del IGEVET, Pilar Peral García, por tener siempre tan buena

predisposición para atender mis necesidades, tanto laborales como personales.

A todos y cada uno de los miembros del IGEVET.

A Diego Posik por su gran ayuda en la secuenciación de los genes DLA y por estar

siempre dispuesto a evacuar cualquier duda.

A Hernan Olivera por el desarrollo del software para asignación de genotipos, por los mates

y la buena onda, siempre.

A Juan Pedro Lirón por la ayuda con los análisis de asociación y por las miles de charlas.

A Julian Crespi por ser tan buen compañero y ayudarme siempre (Gracias Man).

A Egle Villegas Castagnasso por las risas y por las buenas conversaciones.

A Andres Rogberg Muñoz por siempre tener la buena predisposición para ayudar y

aconsejar.

A todos los que en este trayecto se convirtieron en amigos a los que quiero mucho: Agustin

Falomir, Claudia Corbi Botto, Daniel Goszczynski, Elisa Cordoba, Hernan Morales, Maria

Elena Fernandez, María Eugenia Zappa, Nadia Castillo y Suani Pacheco Marino.

A Veronica It por haberme iniciado en la actividad del laboratorio y en la genética de

caninos.

A Gustavo Zapata y Agustina Iaquinandi, por la colaboración en la obtención de muestras y

en la realización de la inspección oftalmológica de los pacientes incluidos en el trabajo.

A mi hermana de la vida, Marina Li Rosi por estar siempre y haberme dado una ahijada

hermosa.

A mis grandes amigas, Natalia Eguren, Sabrina Micale, Mariana Villalba y Natalia

Gonzalez.

A toda mi familia, en especial a mi hermanita, por quererme tanto.

4

Al Estado Argentino por la educación pública y por el Consejo Nacional de Investigaciones

Científicas y Técnicas (CONICET).

5

Publicación parcial del trabajo de tesis

Barrientos, L; Zapata, G; Crespi, J; Posik, D; Díaz, S; It, V; Peral-García, P; Giovambattista , G. 2013. A study of the association between chronic superficial keratitis and polymorphisms in the upstream regulatory regions of DLA-DRB1, DLA-DQB1 and DLA-DQA1. Veterinary Immunology and Immunopathology. Vol 156. Issues 3-4. p 205–210

INDICE

Sección Página

Agradecimientos 3

Resumen 14

Abstract 15

Glosario 16

Abreviaturas 18

Introducción 21

1. Enfermedades de origen genético en perros 21

1.1. Tipo y origen de enfermedades genéticas en perros 21

1.2. Perros como modelo de enfermedades humanas 24

1.2.1. Origen del perro domestico 24

1.2.2. El perro como modelo de enfermedad autoinmune 28

1.3. Enfermedades inmunomediadas 30

1.3.1. Mecanismos inmunopatológicos 31

1.4. Genes involucrados en la respuesta inmune 33

1.4.1. Respuesta inmune 33

1.4.2. Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) 34

1.5. Mapeo de Genes Asociados a Características Fenotípicas 42

1.5.1 Definición de marcador genético 42

6

1.5.2. Diseños experimentales utilizados para mapeo de genes asociados a

caracteres fenotípicos. 42

1.6. Queratitis superficial crónica en ovejero alemán 43

1.6.1. Incidencia y prevalencia de la enfermedad en la región y en el

mundo. 44

1.6.2. Estado del arte sobre la herencia de la QSC 45

Hipótesis 47

Objetivo General y específicos 47

2.Materiales y Métodos 49

2.1. Material animal 49

2.1.1. Datos fenotípicos 49

2.1.2. Población estudiada 46

2.2. Obtención de la muestra y extracción de ADN 51 2.3. Genotipificación 51

2.3.1. Microsatélites 52

2.3.2. Secuenciación 54

2.3.3. Genes de clase II del Complejo Principal de Histocompatibilidad canino (DLA)

55

2.3.3.a. Regiones reguladoras de los genes de clase II DLA-DRB1,-DQA1 y-DQB 56

2.3.2.b. Regiones presentadoras de antígenos (exón 2) de los genes de clase II DLA-DRB1, -DQA1 y –DQB1. 58

2.4. Análisis Bioinformáticos 59

2.5. Análisis poblacional 60

2.6. Análisis de asociación 60

3. Resultados 62

3.1. Análisis de las características de la muestra utilizadas 62

7

3.2. Análisis poblacional 62

3.2.1. Microsatélites ligados al DLA 62

3.2.2. Región Reguladora Proximal de las Genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1

66

3.2.3. Región Presentadora de Antígenos (exón 2) de las Genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1

75

3.2.4. Análisis de los haplotipos de la región presentadora de antígenos

82

3.3. Análisis de asociación 82 3.3.1. Microsatélites 82

3.3.2. Región Promotora Proximal de los genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1

84

3.3.3. Segundo exón de los genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1

87

4. Discusión 94

5. Conclusiones 103

6. Bibliografía 106

7. Anexos 118

8

Índice de tablas

Tabla 1.1. Número de Enfermedades genéticas en caninos basado en las categorías

detalladas en la base de datos de OMIA …………………………………………….…….24

Tabla 1.2. Grupos raciales de perros según la clasificación propuesta por la Federación

Cinológica Internacional (FCI)……………………………………………………………27

Tabla 1. 3. Comparación de los principales mecanismos inmunopatológicos……...…..32

Tabla 1.4. Organización molecular del Complejo Mayor de Histocompatibilidad

canino……………………………………………………………………………………..39

Tabla 2.1. Características de los microsatélites FH2054, FH2975 y FH2202 utilizados en

el presente estudio………………………………………………………………………..53

Tabla 2.2. Primers utilizado para amplificar las regiones promotoras de los genes de DLA-

DRB1, -DQA1 y –DQB1………………………………………………………………...57

Tabla 2.3. Primers utilizados en la secuenciación del exón 2 de los genes DLA- DRB1,

DLA-DQA1 y DLA-DQB1………………………………………………………….......58

Tabla 3.1. Frecuencias alélicas del microsatélite FH2054 (tetranucleótido) estimadas en los

grupos caso y control………………………………………………………………….…63

Tabla 3.2. Valores estimados de heterocigosidad esperada (he) y observada (ho) para el

microsatélite FH2054 detectados en los grupos caso y control y la población total……63

Tabla 3.3. Frecuencias alélicas del microsatélite FH2975 (tetranucleótido) estimadas en los

grupos caso y control…………………………………………………………………....64

Tabla 3.4. Valores estimados de heterocigosidad esperada (he) y observada (ho) para el

microsatélite FH2975 detectados en los grupos caso y control y la población total……64

Tabla 3.5. Frecuencias alélicas del microsatélite FH2202 (tetranucleótido) estimadas en los

grupos caso y control……………………………………………………………………65

9

Tabla 3.6. Valores estimados de heterocigosidad esperada (he) y observada (ho) para el

microsatélite FH2202 detectados en los grupos caso y control y la población total….......66

Tabla 3.7. Características de los polimorfismos detectados en la región promotora/exon 1

de los genes de clase II DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1……………….……….67

Tabla 3.8. Frecuencias alélicas, heterocigosidad obsevada (ho) y esperada (he), equilibrio

de Hardy-Weinberg (HWE) calculada para cada polimorfismo detectado en los promotores

de los genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1 en el total de la muestra………...71

Tabla 3.9. Heterocigosidad obsevada (ho) y esperada (he), equilibrio de Hardy-Weinberg

(HWE) calculada para cada polimorfismo detectado en los promotores de los genes DLA-

DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1en los grupos caso y control………………………..72

Tabla 3.10. Frecuencias haplotípicas de las regiones reguladoras proximales de los genes

DLA-DRB1 y DLA-DQB1 en los grupos caso y control……………………………….75

Tabla 3.11. Código de ambigüedad nucleotídica (IUPAC, International Union of Pure and

Applied Chemistry)...……………………………………………………………………77

Tabla 3.12. Frecuencias alélicas del exón 2 del gen DLA-DRB1 estimadas en los grupos

caso, control y en la población total…………………………………………………….79

Tabla 3.13. Valores estimados de heterocigosidad esperada (he) y observada (ho) para el

exón 2 del gen DLA-DRB1 detectados en los grupos caso y control y la población

total…………………………..…………………………………………………………..79

Tabla 3.14. Frecuencias alélicas del exón 2 del gen DLA-DQA1 estimadas en los grupos

caso, control y en la población total…….………………………………………………80

Tabla 3.15. Valores estimados de heterocigosidad esperada (he) y observada (ho) para el

exón 2 del gen DLA-DQA1 detectados en los grupos caso y control y la población

total…..............................................................................................................................80

10

Tabla 3.16. Frecuencias alélicas del exón 2 del gen DLA-DQB1 estimadas en los grupos

caso, control y en la población total…………………………………………………….81

Tabla 3.17. Valores estimados de heterocigosidad esperada (he) y observada (ho) para el

exón 2 del gen DLA-DQB 1 detectados en los grupos caso y control y la población

total……………………………………………………………………………………...81

Tabla 3.18. Haplotipos DRB1/DQA1/DQB1. Frecuencias haplotípicas en el grupo caso,

control y población total………………………………………………….……….......82

Tabla 3.19. Análisis de asociación entre el desarrollo de QSC y los alelos de los

microsatélites FH2054, FH2975 y FH2202. ……………………………..…………...83

Tabla 3.20. Análisis de asociación entre el desarrollo de QSC y la heterocigocidad

observada (ho) para los alelos de los microsatélites FH2054, FH2975 y FH 2202..….84

Tabla 3.21. Frecuencias alélicas estimadas en los grupos caso y control para los

promotores de los genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 and DLA-DQB1. La frecuencia de cada

alelo dentro de cada grupo se comparó utilizando el Test exacto de Fisher y Odds ratio

(OR)……………………………………………….………………………………….....85

Tabla 3.22. Frecuencia haplotípica estimada en el grupo caso y control para los promotores

de los genes DLA-DRB1 y DLA-DQB1. La frecuencia de cada haplotipo dentro de cada

grupo fue comparada usando el test exacto de Fisher y Odds ratio (OR)………………85

Tabla 3.23. Análisis del equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) para cada polimorfismo de

los promotores de los genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1 dentro de los grupos

caso y control utilizando el índice FIS .Las proporciones de homocigotas/heterocigotas entre

ambos grupos fueron comparadas mediante el test exacto de Fisher y Odds ratio (OR)….87

Tabla 3.24. Análisis de asociación entre el desarrollo de QSC y los alelos de los exones 2

de los genes DLA-DRB1, -DQA1 y DQB1……………………………………………...88

11

Tabla 3.25. Análisis de asociación entre el desarrollo de QSC y la heterocigocidad

observada (ho) para los alelos de los exones 2 del gen DLA-DRB1, -DQA1, -DQB1……89

Tabla 3.26. Desequilibrio de ligamiento medido en D´ entre todos los loci analizados

(Pypop software)………………………………………………………………………......90

Tabla 3.27. Análisis de asociación entre el desarrollo de QSC y los haplotipos

conformados por las regiones presentadoras de antígenos de los genes de clase II DLA-

DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1……………………………………………………….90

Tabla 3.28. Frecuencias haplotípicas de las regiónes promotoras y presentadoras de

antígenos del gen DLA-DQB1 (URR-DQB/exón 2 DQB1) y análisis de asociación…….92

Índice de figuras

Figura 1.1. Representación esquemática del fenómeno de cuello de botella y efecto

fundador. …………………………………………………………………………………..22

Figura 1.2. Árbol filogenético basado en datos de secuenciación masiva. ……….……...25

Figura 1.3. Centros de domesticación e historia de la migración y evolución del perro

doméstico……………………………………………………………………………..........25

Figura 1.4. Factores asociados e interrelacionados al desarrollo de la

autoinmunidad…………………………………………………………………….…….….28

Figura 1.5. Relación entre la inmunidad innata y adaptativa en las tres líneas de defensa del

organismo frente a los patógenos…………………………………………………….........34

Figura 1.6. Estructura de las moléculas de clase I y II……………………………...…....36

Figura 1.7. . Esquema del procesamiento y presentación de antígenos……………...…...37

Figura1.8. Función de las moléculas de clase II en la presentación de antígenos…..……38

12

Figura 1.9. Estructura del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de mamíferos......40

Figura 1.10 Región donde se ubican los genes DLA de clase II en el Cromosoma 12 canino

utilizados en este estudio………………………………………………………………...41

Figura 2.1. Perros de la raza Ovejero Alemán…………………………………….........50

Figura 2.2. Signos característicos a la inspección oftalmológica………………..........50

Figura 2.3. Descripción esquemática de la metodología utilizada para la genotipificación

de las muestras……………………………………………………………………........52

Figura 2.4. Localización en la región del DLA de clase II de los microsatélites utilizados

en este estudio………………………………………………………………….……….54

Figura 2.5. Cromatograma de un fragmento de ADN……………………….…..….....56

Figura 3.1. Alineamiento de la secuencias de las variantes alélicas de las regiones

reguladoras proximales de los genes DLA de clase II…………………………..….….68

Figura 3.2. Haplotipos y desequilibrio de ligamiento (LD) en las regiones reguladoras

proximales de los genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1….………..….…..74

Figura 3.3. Flujo de trabajo del software diseñado para asignar los genotipos de los exones

2 de los genes de clase II……………………………………………………..……….78

Figura 3.4. Distribución de los haplotipos detectados en los grupos caso y control. Se

marcó con una flecha el haplotipo 3, el cual evidenció diferencias significativas (haplotipo

protector)……………………………………………………………………..………91

Índice de anexos

ANEXO 1. Planilla de examen ocular……………………………………….…..….118

ANEXO 2. Modelo de consentimiento informado presentado a los propietarios de los

animales muestreados………………………………………………………….……119

13

ANEXO 3. Kit de purificación de ADN genómico Wizard® (Promega, Madison, WI,

USA)…………………………………………………………………………..………120

ANEXO 4. Protocolo de extracción orgánica de ADN total de sangre periférica…..121

ANEXO 5.Cuantificación del ADN extraído y productos de PCR purificados…..122

ANEXO 6. Chequeo de productos de PCR en geles de poliacrilamida 6%.............123

ANEXO 7.Purificación de las reacciones de PCR por precipitación con polietilenglicol

(PEG) ………………………………………………………..….…………………..124

ANEXO 8. Secuenciación…………………………………….….…………….......125

ANEXO 9. Esquema de un proceso de secuenciación………….………………....127

ANEXO 10. Protocolos de amplificación……………………….………...…........128

ANEXO 11. a) Geles de poliacrilamida 6%. Chequeo de productos de PCR

(Microsatélites)……………………………………………………………….……128

b) Cromatogramas de los microsatélites…..………………….....…129

ANEXO 12. Alineamiento de las secuencias reportadas para el exón 2 de los genes DLA

de clase II. Base de datos IPD-MHC ………………………..……………………132

14

Resumen

La Queratitis Superficial Crónica (QSC) es una enfermedad inflamatoria corneal que puede

conducir a la ceguera del animal si no es tratada. La QSC se presenta con mayor frecuencia

en el perro Ovejero Alemán (OA). Mientras que la córnea normal tiene una baja expresión

de MHC de clase II, en la QSC se produce la sobreexpresión de estas moléculas, asociado

con la secreción de interferón gamma por los linfocitos T CD4+ del infiltrado inflamatorio.

Numerosas evidencias apoyan la hipótesis de que QSC es una enfermedad inmuno-

mediada. Debido a esto, para investigar los factores genéticos moleculares que pueden estar

asociados con el desarrollo de QSC se tipificaron 73 perros (43 animales enfermos y 30

animales control) para los siguiente marcadores genéticos: 3 microsatélites (FH2202,

FH2054 y FH2975) ligados a la región de clase II del DLA (Dog Leukocyte Antigen o

Antígeno Leucocitario Canino), las regiones reguladores proximales (URR) y las regiones

presentadoras de antígenos (exón 2) de los genes DLA de clase II DLA-DRB1, DLA-

DQA1 y DLA-DQB1. Se observó asociación significativa en los tres tipos de marcadores.

En cuanto a los microsatélites, los alelos FH2054*172 (valor de p = 0,02) y FH2975*320

(valor de p = 0,005) se asociaron a un mayor riesgo al desarrollo de QSC. En cuanto a las

regiones reguladoras, el haplotipo URR-DQB*TATC se asoció significativamente con la

QSC (p = 0,006), evidenciando una aumento de 3 veces el riesgo de desarrollar esta

enfermedad (OR = 2,87, 95 %, IC = 1,43- 81). El haplotipo de exones 2

DRB1*00101/DQA1*00101/ DQB1*00201 se asoció con un menor riesgo a desarrollar

QSC (p = 0,02) (OR = 0,2, 95%, IC = 0.07- 0,81). Aunque, el haplotipo conformado por el

promotor y el exón 2 de DLA-DQB1/URR-DQB*TATC/*01302 se asoció

significativamente con la QSC (p = 0,003), aumentando casi 5 veces el riesgo a desarrollar

la enfermedad (OR = 4,56, 95% IC = 1,74- 16,53). Este trabajo confirma el rol de MHC de

clase II en el desarrollo de la QSC y proporciona nuevos datos sobre la población local de

OA. Esta asociación genética también es compatible con los estudios clínicos, histológicos

y farmacológicos reportados, que indican que la QSC es una enfermedad inmunomediada.

Potencialmente estos marcadores podrían ser utilizados para identificar animales

susceptibles y para dirigir los cruzamientos en los criaderos.

Palabras claves: Perros, Marcadores genéticos, Enfermedades autoinmunes, Queratitis Superficial Crónica, MHC, Estudio de asociación

15

Abstract

Canine chronic superficial keratitis (CSK) is an inflammatory corneal disease that leads to

blindness if not treated. CSK occurs most frequently in the German Shepherd dog (GSDs).

While the normal central cornea has little MHC class II expression, aberrant expression

occurs in CSK, associated with secretion of gamma interferon by infiltrating CD4

expressing lymphocytes. Several evidences lend support to the hypothesis that CSK is an

immune-mediated disease. Accordingly, to investigate the molecular genetic factors that

may be associated to CSK development: 3 STRs (short tandem repeats) linked to DLA

(Dog Leukocyte Antigen) class II region (FH2202, FH2054 y FH2975, upstream regulatory

regions (URR) and ARS (exon 2) of DLA class II DLA-DRB1, DLA-DQA1 and DLA-

DQB1 genes were genotyped in 73 dogs, including 43 CSK animals. Association was

observed in all types of markers, allele FH2054*172 (p value =0.02) and FH2975*320 (p

value = 0.005) were associated with a higher risk to develop CKS. The URR-DQB*TATC

haplotype was significantly associated with CSK (p = 0.006), increasing almost three folds

the risk to develop this disease (OR= 2.87, 95%, CI = 1.43- 81). Furthermore, the haplotype

DRB1*00101/DQA1*00101/DQB1*00201 was associated with a low risk to develop CSK

(p=0.02, OR= 0.2, 95%, CI = 0.07- 0.81). Although, the haplotype conformed by promoter

and exon 2 of DLA-DQB1 URR-DQB*TATC/*01302 was significant associated with CSK

(p=0.003, OR= 4.56, 95%, CI = 1.74- 16.53) increasing five folds the risk to develop the

disease. This study confirms the role of MHC class II in the development of CSK and

provides new data about the local population of GSD. This genetic association also

supports the previous clinical, histological and pharmacological studies of CSK as an

immune-mediated disease and could potentially be used to identify susceptibly animals that

require monitoring for early pathological changes to reduce blindness and to ameliorate

reproductive management.

Key words: Dogs, Genetic markers, Autoimmmune diseases, Chronic Superficial Keratitis,

MHC, Association study.

16

GLOSARIO

ALELO DE RIESGO: Variante alélica que presenta una frecuencia significativamente

mayor en el grupo de animales afectados que en el grupo de animales sanos.

CITOQUINAS: Proteínas que regulan las interacciones de las células del sistema inmune. Su

función fundamental en la respuesta inmune, la inflamación y la hematopoyesis de distintos

tipos celulares.

ENFERMEDAD AUTOINMUNE: Enfermedad caracterizada por una respuesta inmune

patológica (enfermedad inmunomediada) en contra de los tejidos propios. Se clasifican en

primarias, cuando no tienen causa subyacente identificada, y secundarias, cuando tienen

una causa subyacente (ej. Infecciones, neoplasias).

ENFERMEDAD DE ORIGEN GENÉTICO: Afecciones causada por alteraciones en el

genoma. La gran mayoría de ellas son hereditarias.

ENFERMEDAD INMUNOMEDIADA: Enfermedad caracterizada por el daño tisular

causado por la activación inapropiada de los efectores del sistema inmune. Esta respuesta

inmune patológica puede estar dirigida a agentes infecciosos, a sustancias aparentemente

inocuas o a los llamados autoantígenos.

ESTUDIO CASO-CONTROL: Estudio epidemiológico, observacional y analítico, en el

cual los individuos se seleccionan en función de que tengan (casos) o no tengan (control)

una determinada enfermedad. Una vez seleccionados los individuos en cada grupo, se

investiga si estuvieron expuestos o no a una característica de interés y se los compara.

GENOMA: Totalidad de la información genética de un organismo.

GRUPO FUNDADOR: Individuos que dan origen a una población nueva con

características propias.

LINFOCITO B: Leucocitos mononucleares (agranulocitos) responsables de la respuesta

humoral, transformándose en plasmocitos productores de anticuerpos o inmunoglobulinas

(Ig), las cuales se adhieren a un antígeno específico. Interactúan con los linfocitos T con lo

que proliferan y cambian el isotipo de inmunoglobulina (IgM, IgE, IgG, IgD, IgA ) que

secretan, manteniendo la especificidad del antígeno. Pueden actuar como células

presentadoras de antígenos.

17

LINFOCITOS T: Leucocitos mononucleares (agranulocitos) que detectan antígenos

proteicos asociados a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).

-Linfocitos T colaboradores (en inglés "helper") o linfocitos CD4+. Reconocen antígenos

presentados por el MHC de clase II en células dendríticas, linfocitos B, macrófagos y otras

células presentadoras de antígenos. Se les denomina colaboradores porque están

involucrados en la activación y dirección de otras células del sistema inmune.

-Linfocitos T citotóxicos o linfocitos CD8+. Reconocen péptidos presentados por MHC de

clase I y tienen capacidad la capacidad de lisis célular.

MICROSATÉLITE: Marcador genético que consiste en secuencias básicas de 2-4

nucleótidos, cuya repetición en tándem origina frecuentemente secuencias de menos de 150

nucleótidos. Son polimorfismos multialélicos en los que la variación está dada por la

diferencia en el número de repeticiones.

MONOGÉNICO: Carácter o afección atribuida a la variación de un solo gen.

POLIGÉNICO: Carácter o afección atribuida a la variación de varios genes.

QUERATITIS: Inflamación de la córnea (primer medio transparente del ojo)

RESPUESTA INMUNE ADAPTATIVA: Reacción del sistema inmune específica, la

cual mejora con cada exposición al antígeno, deja memoria y es filogenéticamente más

reciente

RESPUESTA INMUNE INNATA: Reacción del sistema inmune inespecífica que se

desarrolla cada vez que el organismo se enfrenta al patógeno, no deja memoria y es

filogenéticamente más antigua. Está presente desde el nacimiento y actúa en la primera y

segunda línea de defensa.

SISTEMA INMUNE: Conjunto de moléculas, células y tejidos especializados en la

función de defender al organismo contra la agresión producida por una gran variedad de

agentes patógenos y controlar el desarrollo tumoral.

18

ABREVIATURAS

ADN: Ácido desoxirribonucleico.

AKC: American Kennel Club.

CFA: Canine (Canis lupus familiaris) chromosome.

CNK: Células Natural Killer.

CPA: Célula Presentadora de Antígenos.

ddNTPs: didesoxi-dinucleótidos trifosfato.

DLA: Dog Leukocyte Antigen (Antígeno Leucocitario Canino).

dNTPs: dinucleótidos trifosfato.

EDTA: Etilendiaminotetraacético (anticoagulante).

FCI: Federación Cinológica Internacional.

he : Heterocigocidad esperada

ho: Heterocigocidad observada.

HWE: Hardy-Weinberg Equilibrium (Equilibrio de Hardy-Weinberg).

IC: Intervalo de confianza.

INDEL: Inserción-Deleción (Tipo de polimorfismo genético).

kb: kilobases (1000 pb).

LD: Linkage Desequilibrium (Desequilibrio de ligamiento).

MHC: Major Histocompatiblity Complex (Complejo Mayor de Histocompatibilidad).

mM: milimolar.

ng: nanogramo.

pb: pares de bases (distancia genética).

PCR: Polymerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la polimerasa).

QSC: Queratitis Superficial Crónica (Pannus).

SBT: Tipificación basada en secuenciación.

SNP: Single Nucleotide Polymorphism (Polimorfismo de nucleótido simple)

STR: Short tandem repeat (microsatélites)

TNF: Tumor Necrosis Factor (Factor de necrosis tumoral).

μM: micromolar.

19

20

1-INTRODUCCIÓN

21

1-INTRODUCCIÓN

1. Enfermedades de origen genético en perros

1.1. Tipo y origen de enfermedades genéticas en perros

Se define como enfermedades de origen genético a las afecciones causadas por

alteraciones en el genoma. La gran mayoría de ellas son hereditarias y pueden ser

descriptas como monogénicas (atribuidas a la variación en un solo gen), poligénicas

(atribuidas a la variación en varios genes) o multifactoriales (con base genética y

ambiental).

La especie Canis lupus familiaris (perro doméstico), debido a la selección y a la

formación de las razas, muestra gran variabilidad fenotípica entre razas. Por ejemplo en la

característica del tamaño la diferencia entre la raza más pequeña (Chihuahua) y la más

grande (Gran Danes) es de 40 veces (Wayne y Ostrander, 2007). Debido al origen de un

reducido grupo fundador y a las restricciones generadas por el modo de cría de las

diferentes razas, se observa una estructura poblacional particular en donde cada raza se

encuentra aislada genéticamente (Parker y col., 2004). A su vez, cada raza presenta una

variabilidad genética reducida y un tamaño efectivo de la población pequeño debido,

básicamente, a dos efectos de cuello de botella: el primero ocurrido durante la

domesticación del perro y el segundo en la creación de las diferentes razas, por la selección

a favor de ciertas características fenotípicas específicas (estándar racial) y por el uso

repetido de los mismos reproductores (“popular sire”) (Mellanby y col., 2013). A este

fenómeno se le llama efecto fundador (Figura 1.1). Por lo tanto, se pierde variabilidad

genética cuando se establece una nueva población a partir de un número pequeño de

individuos perteneciente a una población más grande, obteniéndose como resultado

individuos genética y fenotípicamente diferentes a la población original (menor

heterocigosidad) (Hedrick, 2005).

22

Figura 1.1. Representación esquemática del fenómeno de cuello de botella (a) y efecto

fundador (b).

a)

b)

23

La sobrerrepresentación del genoma del pequeño grupo de reproductores fundadores

genera un aumento de la frecuencia de alelos recesivos deletéreos e incrementa la

probabilidad de alelos indeseables idénticos por descendencia en la próxima generación

(Calboli y col., 2008).

Se han clasificado a las enfermedades genéticas en relacionadas y no relacionadas

directamente con el estándar racial, llegando estas últimas a un 75% del total siendo

atribuidas a un pequeño tamaño efectivo de la población, uso repetido de reproductores

populares y consanguinidad (Asher y col., 2009; Summers y col., 2010). Por lo tanto, la

formación de las razas caninas ha sido asociada con el incremento de la prevalencia de un

gran número de enfermedades genéticas (Björnerfeldt y col., 2008), el ejemplo clásico es el

síndrome braquiocefálico consecuencia de la selección fenotípica en la raza Boxer y

Bulldog (Packer y col., 2015). La alta susceptibilidad a enfermedades específicas en

determinadas razas, así como su incidencia mucho menor o ausencia completa en otras

razas, sugiere fuertemente la presencia de alelos de riesgo, es decir, variantes alélicas que

presentan una frecuencia significativamente mayor en el grupo de animales afectados que

en el grupo de animales sanos. Los alelos de riesgo, si tomamos la población general,

poseen una baja frecuencia, ya que si éstos fuesen variantes comunes todas las razas

presentarían incidencias similares para cada enfermedad y esto no ocurre. De hecho, el

46% de las enfermedades genéticas reportadas en los perros se cree que se produce

predominantemente o exclusivamente en una o unas pocas razas relacionadas en su origen

(Patterson, 2000).

En la actualidad, se han reportado un total de 683 enfermedades de origen genético en

caninos, de las cuales solo en 208 se conoce la mutación causal y en muchas aún no está

claro o es controversial su modo de herencia (Tabla 1.1.). Es de destacar que por su

similitud con enfermedades humanas, 365 de ellas son potenciales modelos para estudios

de investigación (OMIA, 2016). Entre las enfermedades genéticas caninas es posible

encontrar diferentes modos de herencia mendeliana o poligénica, así por ejemplo:

Autosómicas recesivas: CEA o Anomalía del ojo de Collie (Pedersen y col., 2004).

Autosómicas dominantes: PRA o Atrofia progresiva de retina en el Mastiff inglés (Marsili

y col., 2015).

24

Ligados al X o ligadas al sexo: GRMD o Distrofia muscular del Golden Retriever

(Brinkmeyer-Langford y Komegay, 2013).

Poligénicas y multifactoriales: CHD o Displasia de cadera en Ovejero Alemán y Labrador

Retriever (Fels y col., 2014).

Tabla 1.1. Número de Enfermedades genéticas en caninos basado en las categorías

detalladas en la base de datos de OMIA (septiembre, 2016).

Categoría Cantidad

Total de características/enfermedades 683

Condición de herencia mendeliana 283

Condición con mutación causal reconocida 208

Potenciales modelos de enfermedades humanas 385

1.2 Perros como modelo de enfermedades humanas

1.2.1 Origen del perro domestico

El origen del perro doméstico es aún materia de discusión en la comunidad científica,

tanto el lugar geográfico como el momento son controversiales. Hay estudios que sugieren

que la domesticación comenzó entre 10 mil y 33 mil años atrás (Davis y Valla, 1978; Pang

y col., 2009; Skoglund y col., 2011; Larson y Bradley, 2014; Wang y col., 2015). Un

estudio reciente (Wang y col., 2015), utilizando secuencias del genoma completo de

diferentes cánidos (Figura 1.2), reveló que existe una mayor diversidad genética en las

poblaciones de Asia del Este comparada con las otras, lo que sugiere que allí se localizó el

grupo que originó el perro doméstico 33 mil años atrás. Luego, hace 15 mil años, un

subgrupo migró a Oriente Medio, África y Europa. Uno de los linajes de Asia también

emigraron hacia el este, creando una serie de poblaciones mezcladas con los linajes

asiáticos endémicos (Figura 1.3).

25

Figura 1.2. Árbol filogenético basado en datos de secuenciación masiva (Tomado de Wang

y col., 2015)

Figura 1.3. Centros de domesticación e historia de la migración y evolución del perro

doméstico (tomado de Wang y col., 2015).

26

La población de perros puros está compuesta por más de 350 (FCI, 2016) islas

genéticas llamadas razas (Tabla 1.2.), todos derivados de un ancestro común, el lobo. A

pesar de haber sido la primer especie domesticada, la mayoría de las razas son

relativamente nuevas, producto de la intensa selección artificial impuesta por el ser

humano en los últimos 300 años (Wilcox y Walkowicz 1995; Wayne y Ostrander, 1999;

Rimbault y Ostrander, 2012) y, como ya se dijo en la sección anterior, derivan de un

pequeño número de individuos fundadores que poseían las características físicas y de

comportamiento deseadas para un determinado fin. Por esta razón, muchas de las razas

actuales tienen una variabilidad genética limitada con predisposición a ciertas

enfermedades derivada de uno o unos pocos antecesores. Esta gran cantidad de razas

caninas fue dividida por la Federación Cinológica Internacional en 10 grupos con

características fenotípicas y usos similares (Tabla 1.2.). Dentro de cada grupo se pueden

encontrar numerosos ejemplos de enfermedades compartidas por las razas que lo

componen, por ejemplo la osteocondrosis en las razas gigantes pertenecientes al grupo 2

(Nemanic y col., 2016)

27

Tabla 1.2. Grupos raciales de perros según la clasificación propuesta por la Federación Cinológica Internacional (FCI).

28

1.2.2. El perro como modelo de enfermedad autoinmune

Las características únicas de la estructura genético poblacional de las razas caninas,

hacen de esta especie un excelente modelo para el estudio de enfermedades de origen

genético, debido principalmente al elevado desequilibrio de ligamiento dentro de cada raza

y al elevado nivel de estructuración poblacional. Es por esta razón que empleando un

menor número de marcadores genéticos y un menor tamaño de muestra con respecto a

estudios humanos, ha sido posible mapear loci asociados a diferentes enfermedades (Parker

y col., 2010).

Se define como autoinmunidad a una respuesta inmunológica anómala frente a uno o

varios antígenos propios. Se caracteriza por la pérdida de tolerancia inmune. Si esta

respuesta persiste, provocará una lesión tisular que dará lugar a la enfermedad

autoinmune, caracterizada por la activación de los linfocitos B, linfocitos T, o ambos. Para

el desarrollo de este tipo de enfermedades hay varios factores asociados: inmunológicos,

hormonales, genéticos y ambientales (Figura 1.4). Cualquier mamífero puede ser afectado

por una enfermedad autoinmune, ya sea órgano-específica (la gran mayoría) o

multisistémica (Lopez García, 2013).

Figura 1.4. Factores asociados e interrelacionados al desarrollo de la autoinmunidad.

29

En humanos, son las afecciones de mayor importancia médica y económica, entre

ellas se encuentran la Diabetes mellitus, la Artritis Reumatoidea, la Tiroiditis de Hashimoto

y el Lupus eritematoso sistémico. En medicina veterinaria, el perro es la especie doméstica

que tiene mayor prevalencia de estas enfermedades y son muy similares a sus equivalentes

humanas en cuanto a la base inmunológica, fisiopatología y presentación clínica. (Day y

Shultz, 2014).

En humanos, la mayoría de las enfermedades genéticas autoinmunes muestran modos

de herencia complejos lo que dificulta el análisis genético. Los modelos en roedores son los

más manejables genéticamente pero los resultados tienen una importancia limitada debido

a las profundas diferencias fisiológicas existentes. En comparación, la patogenia y la

respuesta clínica de los perros son similares a las enfermedades humanas. Las razas caninas

ofrecen todas las ventajas de las poblaciones humanas aisladas geográficamente, pero con

un mayor grado de aislamiento, cuellos de botella más estrechos, y mucho mejores registros

genealógicos (Ostrander, 2000). Otra de las ventajas que ofrece el perro como modelo para

el análisis de enfermedades humanas es que de las casi 700 enfermedades de origen

genético caninas reportadas más de la mitad son similares a los trastornos humanos (OMIA,

2016).

Diferentes estrategias han sido utilizadas para mapear los genes y mutaciones

involucradas en el desarrollo de una enfermedad genética. Entre ellas se encuentran los

estudios de mapeo por asociación genómica que se basan en la asociación entre alelos de un

gen y una enfermedad, y estos con marcadores vecinos. Por lo tanto, dependen del nivel de

desequilibrio de ligamiento (LD) debido a que la cantidad de marcadores tipificados es

limitada. Estas asociaciones surgen cuando la mayoría de los alelos asociados a enfermedad

en una población comparten el mismo origen ancestral. En una población, cuanto mayor es

el LD menor cantidad de marcadores deben ser tipificados. Por lo tanto, la estructura de las

razas caninas reduce los problemas del estudio de las enfermedades hereditarias asociados a

la heterogeneidad, complejidad genética y registro genealógico. Por el contrario, un mayor

LD tiene como consecuencia negativa que la región cromosómica asociada es de mayor

tamaño, y por lo tanto, incluye un mayor número de posibles genes candidatos causales de

la enfermedad. Sin embargo, la disponibilidad en la actualidad de genomas con buenos

niveles de anotación facilita la selección de los posibles genes a ser secuenciados con el fin

30

de detectar la mutación causal. Esto hace que el mapeo por LD sea una buena estrategia

para detectar a los genes responsables de enfermedad (Sutter y col., 2004).

1.3 Enfermedades inmunomediadas

Las enfermedades inmunomediadas se caracterizan por el daño tisular causado por

la activación inapropiada de los efectores del sistema inmune. Esta respuesta inmune

patológica puede estar dirigida a agentes infecciosos contribuyendo a la presentación

clínica de la enfermedad (ej. Babesiosis canina), a sustancias aparentemente inocuas (ej.

Alergia alimentaria o dermatitis atópica) o a los llamados autoantígenos, es decir contra el

propio tejido del que genera la respuesta (enfermedad autoinmune primaria). Se considera

enfermedad autoinmune primaria a la que no tiene una causa subyacente bien definida y

se cree que está causada por un desbalance o una disfunción del sistema inmune. El término

enfermedad autoinmune secundaria se utiliza para describir desordenes inmunomediados

en los que la causa subyacente puede ser identificada, por ejemplo: infecciones, toxinas,

vacunas o neoplasias (Nelson y Couto, 2014).

1.3.1 Mecanismos inmunopatológicos

Las lesiones inmunopatológicas se dan por cuatro mecanismos básicos (Tabla 1.3.).

Estos forman parte, tanto de la respuesta inmune normal como de la patogenia de las

enfermedades inmunomediadas. Los mecanismos son:

Mecanismos de tipo I: Mediada por Ig E y la degranulación de mastocitos. La

exposición del antígeno activa las células T CD4+ (helper) y la diferenciación de los

linfocitos B a célula plasmática (productora de Ig). Los mastocitos tienen receptores para Ig

E. En una segunda exposición al antígeno, los anticuerpos específicos activan la

degranulación de los mastocitos. Ejemplo: Reacción anafiláctica aguda.

31

Mecanismos de tipo II: Mediada por anticuerpos. Se producen IgG e IgM que se

unen a la célula diana, lo cual desencadena fagocitosis o lisis de las mismas. Ejemplo,

Anemia hemolítica autoinmune.

Mecanismos de tipo III: Mediada por inmunocomplejos. Se depositan complejos

Antígeno-Anticuerpo en los tejidos, se activa el complemento y se atrae a los leucocitos a la

zona. Ejemplo, Lupus eritematoso sistémico.

Mecanismos de tipo IV: Mediada por células. Los linfocitos T activados, se liberan

citoquinas, se produce inflamación y activación de macrófagos. Ejemplo, Diabetes tipo I.

32

Tabla 1.3. Comparación de los principales mecanismos inmunopatológicos (Modificado de

Nelson y Couto, 2014)

Como se mencionó anteriormente las enfermedades autoinmunes se definen como el

daño tisular, localizado o sistémico, provocado por una respuesta autoinmune frente a uno o

varios antígenos propios. Estas enfermedades se pueden dar por tres tipos de mecanismos

inmunopatológicos de tipo II, III y IV (Day y Shultz, 2014, Tabla 1.3).

Así como hay mayor prevalencia de ciertas enfermedades autoinmunes en ciertas

etnias o familias humanas o líneas de ratones, en las razas caninas sucede lo mismo (Day y

Shultz, 2014). La elevada incidencia de enfermedades específicas en determinadas razas,

33

indicarían que unos pocos factores de riesgo podrían haberse acumulado dentro de cada

raza como consecuencia de la deriva génica y selección. Estas particularidades hacen de los

perros un muy buen modelo para la identificación de rutas involucradas en enfermedades

humanas complejas (Wilbe y col.,2010).

1.4 Genes involucrados en la respuesta inmune

1.4.1 Respuesta inmune

Se ha definido tradicionalmente al sistema inmune como un conjunto de moléculas,

células y tejidos especializados en la función de defensa del organismo contra la agresión

producida por una gran variedad de agentes patógenos y control del desarrollo tumoral. El

sistema inmune puede dividirse en dos partes principales para facilitar su estudio: innato y

adaptativo. La respuesta inmune innata se desarrolla cada vez que el organismo se enfrenta

al patógeno, no deja memoria y es filogenéticamente más antigua. La respuesta inmune

adaptativa mejora con cada exposición al antígeno, deja memoria y es filogenéticamente

más reciente (Rugeles López, 2009). La acción integrada de ambas respuestas hace que el

organismo, aun viviendo en un ambiente poblado de agentes patógenos, solo en ocasiones

tenga una enfermedad infecciosa (Figura 1.5).

Dentro de los componentes de la respuesta innata se encuentran:

- Las barreras físicas: piel y mucosas.

- Componentes celulares: Neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, células NK, mastocitos,

células dendríticas, células endoteliales.

- Componentes humorales: Sistema del complemento, proteínas de fase aguda, interferón α

y β.

Dentro de los componentes de la respuesta adaptativa se encuentran:

- Componentes celulares: Linfocitos T y B.

- Componentes humorales: Inmunoglobulinas, interleuquinas e interferón gama.

34

Figura 1.5. Relación entre la inmunidad innata y adaptativa en las tres líneas de defensa del

organismo frente a los patógenos.

La respuesta inmune innata resuelve o al menos controla el proceso infeccioso

naciente hasta el desarrollo de la respuesta inmune adaptativa. Esta respuesta se inicia

cuando las células presentadoras de antígenos (CPA; por ejemplo: célula dendrítica)

migran del foco infeccioso a los órganos linfáticos secundarios (ejemplo, ganglio linfático

regional) en donde los linfocitos T y B reconocerán el antígeno y sus clones se expandirán

y se diferenciaran a las células efectoras de la inmunidad adaptativa (Fainboim, 2008).

1.4.2. Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC)

Dentro de los genes que participan en la respuesta inmune, los pertenecientes al

Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) cumplen un rol central, tanto en la

respuesta celular como humoral. Codifican para las glicoproteínas (superfamilia de las

35

Inmunoglobulinas) de membrana responsables del fenómeno de restricción del sistema

inmune. Hay dos clases principales de moléculas que difieren tanto en estructura (figura

1.6) como en distribución. Las moléculas de clase I, se encuentran en todas las células

nucleadas, mientras que las moléculas de clase II se encuentran principalmente en las

células presentadoras de antígenos (linfocitos B, macrófagos y células dendríticas) y en

otras células (Ej., epiteliales) dentro de lesiones inflamatorias. A diferencia de otras

especies, los linfocitos T caninos (también los felinos) expresan constitutivamente

moléculas de clase II en las primeras semanas de vida (Day, 2012).

Como se observa en la Figura 1.6, las moléculas de clase I están formadas por una

cadena α compuesta por una cadena citoplasmática, una transmembrana y tres dominios

externos y en una molecula de microglobulina β2. La secuencia del dominio α3 se encuentra

conservada en toda la superfamilia de Ig, mientras que los dominios α1 y α2 son variables.

Las moléculas de clase II consisten en dos cadenas transmembrana (α y β), cada una

con cuatro dominios externos, dos de secuencia conservada (α2 y β2) y dos de secuencia

muy variable (α1 y β1; Figura 1.6). El sitio de reconocimiento de antígenos (ARS) consiste

en un surco con un piso formado por una hoja plegada β y dos paredes, cada una formada

por una hélice α. La selectividad de los alelos del MHC para unir péptidos es mediada por

las propiedades bioquímicas de esos bolsillos (motivos aminoacídicos) ya que tienen un

rol crítico en la unión del péptido. La afinidad de la unión del péptido a esos bolsillos

estaría determinando la cantidad y calidad de la respuesta inmune. Trabajos previos

analizaron la asociación entre la estructura proteica del MHC y el reconocimiento y la

presentación de antígenos, esto puso en evidencia la importancia de estas moléculas en la

respuesta inmune y la resistencia a las enfermedades infecciosas. Estos trabajos mostraron

que la intensidad de la respuesta inmune es regulada por los motivos aminoacídicos de los

sitios de unión a antígenos presentes en los bolsillos de las moléculas presentadoras del

MHC (Konnai y col., 2003; Yoshida y col., 2009).

36

Figura 1.6. Estructura de las moléculas de clase I y II. Clase I: moléculas de clase I .

α1 , α2 y α3: tres dominios externos de la cadena α . β2m: molécula de microglobulina.

Clase II: moléculas de clase II. α1 y β1: dominios variables. α2 y β2: dominios conservados.

El fenómeno por el cual los linfocitos T reconocen y responden a proteínas extrañas o

propias y que son presentadas por las CPA se denomina restricción del MHC. A la

conversión de proteínas a péptidos asociados al MHC se lo denominada procesamiento de

antígenos. Las moléculas de clase I y II utilizan vías de procesamiento antigénico y de

secreción diferentes (Figura 1.7).

Los linfocitos T CD4+ (helper o colaboradores), reconocen péptidos que se unen a

moléculas de MHC de clase II en la superficie de las CPA (18-25 aminoácidos de tamaño).

Los péptidos asociados a moléculas de clase II derivan usualmente de agentes patógenos

extracelulares y de antígenos solubles. Los linfocitos T CD8+ (citotóxicos) reconocen

fragmentos peptídicos unidos a moléculas de MHC de clase I (8-11 aminoácidos de

tamaño). Los péptidos derivan fundamentalmente de proteínas endógenas sintetizadas (ej.

Antígenos virales, tumorales) (Figura 1.8).

37

Figura 1.7. Esquema del procesamiento y presentación de antígenos. 1) Antígeno

intracelular (ej. Virus). 2) Antígeno Extracelular (ej. Bacterias). 3) Proteasoma (se procesa

el antígeno y se reduce a péptidos que luego ingresaran en el retículo endoplasmático RE).

4) Vesícula endocítica. 5) Fagolisosoma (se procesa antígeno y se reduce a péptidos). 6)

Molécula de MHC de clase II se une al péptido correspondiente. 7) Vesícula con receptor

MHC de clase II. 8) MHC de clase II presenta el péptido antigénico en la superficie

celular. 9) Molécula de MHC de clase I. 10) Unión del péptido a la molécula de MHC de

clase I. 11) Molécula de clase I presenta el péptido antigénico en la superficie celular.

38

Figura 1.8. Función de las moléculas de clase II en la presentación de antígenos. TCR

(Receptor en el linfocito T). APC (Célula presentadora de Antígenos, CPA)

Al igual que el MHC de todos los mamíferos estudiados hasta la actualidad, el DLA

está constituido por genes de clase I, II y III (Figura 1.9 y Tabla 1.4). El MHC canino,

denominado Dog Leucocyte Antigen (DLA), ha sido mapeado en el cromosoma 12, entre

las posiciones 892.380 y 2.383.828 pb (http://www.ensembl.org/Canis_familiaris) (Figura

1.10).

39

Tabla 1.4. Organización molecular del Complejo Mayor de Histocompatibilidad canino

(Basado en el artículo: Molecular Organization of the Canine Major Histocompatibility.

Complex. J. L. WAGNER, 2003.Journal of Heredity 2003:94(1):23–26)

a) Genes de clase I

Nombre del Locus Tipo de gen Localización

DLA-88 Completo CFA12 DLA-79 Completo CFA18

DLA-12 Completo CFA12 DLA-64 Completo CFA12

DLA-12a Pseudogén1 CFA12 DLA-53 Pseudogén CFA12 DLA-A - CFA12

C1pg-26 - -

b) Genes de clase II

Nombre del Locus Tipo de gen Localización DLA-DRA1 Completo CFA12 DLA-DRB1 Completo CFA18 DLA-DRB2 Pseudogén CFA12 DLA-DQA1 Completo CFA12 DLA-DQB1 Completo CFA12 DLA-DQB2 Pseudogén CFA12 DLA-DPA1 - - DLA-DPB1 - - DLA-DPB2 - - DLA-DOB - - LMP-2 2 - -

c) Genes de clase III

Nombre del Locus Tipo de Gen Localización C4 3 Completo CFA12

TNF-α 4 Completo CFA12 HSP-70 5 Completo CFA12

1) Secuencia nucleotídica similar a un gen funcional normal que no da como resultado un producto, es decir, que no se expresa. 2) Low molecular weight polypeptide. 3) Componente 4 del complemento. 4) Factor de necrosis tumoral alfa. 5) Heat shock proteins.

40

Los genes que codifican para las moléculas del MHC se encuentran juntos en un

cluster en el cromosoma 12 canino. En el humano se han mapeado y consisten en genes de

clase I (A, B y C) y de clase II que codifican a las cadenas α y β (D). Entre estos loci hay

una serie de genes (clase III) que codifican para algunas proteínas del complemento (c2, c4

y factor B), la enzima 21-hidroxilasa, proteínas de shock térmico y el factor de necrosis

tumoral (TNF), entre otros. El MHC canino, al igual que todos los mamíferos estudiados

hasta la actualidad, tiene una estructura similar (Day, 2012; Figura 1.9).

Figura 1.9. Estructura del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de mamíferos

(modificado de Day, 2012).

Las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de clase II (MHC clase

II) son las más efectivas en la presentación de antígenos propios, los cuales activan a los

linfocitos T autoreactivos. Por lo tanto, son los principales genes candidatos para estudiar

las enfermedades autoinmunes (Day y Shultz, 2014). Estos genes desempeñan un

importante rol en la resistencia/susceptibilidad tanto a enfermedades autoinmunes como a

infecciosas y parasitarias: tales como diabetes tipo 1, poliartritis, tiroiditis linfocítica,

anemia hemolítica inmuno-mediada, lupus eritematoso sistémico, demodicosis,

41

leishmaniasis y streptococosis (Ollier y col., 2001; Kennedy y col., 2006; Kennedy y col.,

2007; Wilbe y col., 2010; It y col., 2010; Quinnell y col., 2003; Kasper y col., 2014).

Figura 1.10 Región donde se ubican los genes DLA de clase II en el Cromosoma 12 canino

utilizados en este estudio.(http://www.ensembl.org/Canis_familiaris)

42

1.5. Mapeo de Genes Asociados a Características Fenotípicas

1.5.1 Definición de marcador genético

Los marcadores genéticos son variaciones (mutaciones) en la secuencia de ADN que

presentan un modo de herencia conocido y son relativamente fáciles de identificar.

Generalmente presentan una posición conocida dentro del genoma y son analizados

mediante técnicas moleculares. Estas mutaciones pueden estar ubicadas dentro de la

secuencia de un gen responsable de cierto fenotipo o ligadas a loci cuantitativos o

cualitativos de interés. Estos locus deben ser polimórficos para ser informativos. Según

Lucotte (1977), en una población se puede considerar un determinado locus como

polimórfico cuando la frecuencia del alelo más común es igual o inferior a 0,99. Según el

tipo de cambio ocurrido los polimorfismos pueden clasificarse en: polimorfismo de

nucleótido simple (SNP), inserciones o deleciones de una o varias bases nucleotídicas

(INDELs), variaciones en el número de repeticiones de secuencias en tándem

(microsatélites), etc.

1.5.2. Diseños experimentales utilizados para mapeo de genes asociados a caracteres

fenotípicos

Estudio de asociación Caso-Control: Consiste en detectar los marcadores genéticos

relacionados al mayor o menor riesgo a desarrollar una enfermedad, determinando si se

observan diferencias significativas entre los animales enfermos y los sanos. Se pueden

hacer basados en genes candidatos funcionales, es decir, cuando el mismo se encuentra

involucrado en la patogenia de la enfermedad (por ejemplo la asociación entre las variantes

del gen del factor de von Willebrand y la enfermedad de von Willlebrand (Kramer y col.,

2004) o sin tener en cuenta esa información a través de estrategias de rastreo genómico del

tipo de:

Microsatélites: Fueron los primeros en utilizarse como marcadores posicionales

debido al elevado desequilibrio de ligamiento con los genes responsables de la enfermedad

43

(por ejemplo la asociación con un panel de microsatélites y la toxicosis por cobre en perros

Bedlington Terriers permitió localizar el gen responsable de la enfermedad (Yuzbasiyan-

Gurkan y col., 1997)

SNP array: Es un tipo de DNA microarray utilizado para detectar SNPs dentro de

una población. Luego de haberse reportado el genoma completo canino en 2004 se

utilizaron como herramientas para los estudios de asociación los SNPs distribuidos en el

genoma a través de los SNPs array y los estudios de asociación llamados GWAS (Genome

wide association). Los primeros estaban conformados para tipificar 1500 SNP y luego

fueron aumentando la resolución (50k Affymetrix, 22k Illumina, 173 K Illumina HD array).

NGS (next generation sequencing): Las plataformas NGS realizan secuenciación de

millones de pequeños fragmentos de ADN en paralelo. Las miles de millones de bases del

genoma se secuencian varias veces. Esta tecnología puede utilizarse para secuenciar

genomas enteros o restringidos a áreas específicas de interés incluyendo todos los genes

codificantes (exoma completo) o un pequeño número de genes individuales.

Estudio de Asociación por desequilibrio de ligamiento

El mapeo de genes por desequilibrio de ligamiento (LD) se basa en asociaciones a nivel

poblacional entre los alelos en los loci de la enfermedad y los marcadores cercanos. Estas

asociaciones se producen generalmente cuando todos o la mayoría de los alelos de la

enfermedad poseen un origen ancestral común (de la Chapelle, 1998).

1.6. Queratitis superficial crónica en ovejero alemán

La Queratitis Superficial Crónica (QSC) canina es una enfermedad inflamatoria no

ulcerativa del estroma corneal superficial, que potencialmente puede producir ceguera.

También es conocida como Pannus del Ovejero Alemán, Síndrome de Uberreitier y Pannus

degenerativo (Whitley y Gilger, 1999). El Ovejero Alemán es la raza más comúnmente

afectada. La edad de inicio y la raza de los animales afectados son de valor pronóstico en

esta enfermedad (Whitley y Gilger, 1999). La QSC se describe como una queratitis

linfocítica-plasmocítica, con una lesión similar a la del lupus discoide que se produce en la

piel (Gelatt, 1999). Estudios previos han intentado sin éxito atribuirle una causa infecciosa.

44

La lesión se desarrolla como una infiltración progresiva bilateral de células mononucleares

en la región temporal del limbo del estroma corneal superficial (Bedford y Longstaffe,

1981). La fibroplasia progresiva y la vascularización que se produce, a menudo conduce a

la participación de toda la extensión de la córnea. Los casos clínicos parecen ser más graves

a medida que aumenta la altitud y en climas más cálidos, lo que sugiere una modulación

actínica de la enfermedad (Chandler y col., 2008).

El patrón difuso de las manchas y la ausencia de éstas en estructuras específicas del

epitelio indicaría que la QSC no es una enfermedad autoinmune clásica similar a cualquier

enfermedad del grupo pénfigo o el lupus eritematoso sistémico. Aunque las evidencias

disponibles indicarían que la QSC sería una enfermedad inmuno-mediada (Chavkin y col.,

1994).

La predisposición racial y los signos clínicos suelen ser suficientes para diagnosticar

la QSC. Esta enfermedad generalmente es tratada por una variedad de métodos médicos y

quirúrgicos, pero no es curada. Los propietarios deberían ser advertidos de la necesidad de

una terapia de por vida para controlar la enfermedad y que tanto la severidad y como el

pronóstico dependen de muchos factores, incluidos edad de inicio, altitud y localización

geográfica (Williams, 1999).

1.6.1. Incidencia y prevalencia de la enfermedad en la región y en el mundo

La QSC ocurre con mayor frecuencia, pero no exclusivamente, en el perro Ovejero

Alemán. La prevalencia de la QSC se correlacionó significativamente (r = 0,90) con la

altitud de residencia, pero no con otros factores tales como la latitud y longitud geográfica,

media anual de radiación solar y media anual de humedad relativa (Farmer ,1983). Los

perros que viven en altitudes > 2.000 metros sobre el nivel del mar fueron 7,75 veces más

propensos a desarrollar lesiones que los que viven a alturas entre 900 y 1500 metros. Un

estudio basado en los registros médicos de perros con (n = 595) y sin (n = 72.877) QSC

pertenecientes al Hospital Escuela de Veterinaria de la Universidad de Colorado (USA)

determinó que las razas con mayor incidencia de QSC eran el Pastor Belga Tervuren, el

Ovejero Alemán, el Border Collie, el Galgo, el Siberian Husky y el Pastor Australiano.

Además, se evidenció que los perros de entre 4 y 7 años de edad tuvieron 2,36 veces más

45

probabilidades de desarrollar lesiones que los perros menores a 4 años de edad (Chavkin y

col., 1994).

1.6.2. Estado del arte sobre la herencia de la QSC

Se ha sugerido que QSC tendría una herencia recesiva con expresión variable (Gough y

Thomas, 2004). Otro autor propuso para la raza galgo el modo autosómico dominante

(Cheng y col, 2016).

Sin embargo, aún no se han reportado mutaciones causales de dicha enfermedad en

las bases de datos públicas sobre enfermedades de origen genético en animales domésticos

(Online Medelian Inheritance in Animals, http://www.ncbinlm.nih.gov/omia; List of

Inherited Diseases in Animals, http://sydney.edu.au/vetscience/lida/). Trabajos previos han

descripto las características histopatológicas inflamatorias de la QSC (Gelatt, 1999;

Chavkin y col., 1994), y puesto en evidencia el predominio de linfocitos CD4+ que se

expresan en las lesiones (Williams, 1999). Además, la respuesta a los corticoides tópicos y

a la ciclosporina apoya la hipótesis de que la QSC es una enfermedad inmuno-mediada. El

centro normal de la córnea tiene bajos niveles de expresión de genes del Complejo

Principal de Histocompatibilidad (MHC) de clase II. Por el contrario, en los animales con

QSC presentan un considerable aumento en la expresión de estos genes, asociada a la

secreción de interferón gamma por el infiltrado de linfocitos CD4+. Aunque este cambio es

probablemente una característica secundaria de las lesiones producidas por la QSC, el

aumento de la expresión de los genes del MHC de clase II puede jugar el papel fundamental

para perpetuar la queratitis característica esta enfermedad (Williams, 2005).

Dadas las asociaciones previas reportadas entre citoquinas, tales como el interferón

gamma, y la regulación positiva de la expresión de antígenos del MHC de clase II,

Williams (2005) comparó la expresión de los antígenos de clase II en la córnea canina

normal y afectada. Además, estudió el efecto in vitro del interferón gamma sobre la

regulación positiva de la expresión de los antígenos del MHC de clase II en la córnea

canina. Estos estudios demostraron que en la córnea normal los genes del MHC de clase II

se expresan a altos niveles dentro del estroma y del epitelio del limbo de la córnea y el

epitelio conjuntival, mientras presentan bajos nivel de expresión en la región central. Las

46

células del limbo y del epitelio conjuntival que expresaron estos genes mostraron actividad

ATPasa, lo que sugiere que son células de Langerhans. Por el contrario, las corneas de los

perros con QSC mostraron una expresión de genes del MHC de clase II asociada a células

del estroma y, aunque algunas eran dendríticas, la mayoría eran linfocitos. Las células

corneales epiteliales dentro de la lesión también expresaron en forma aberrante los genes

del MHC de clase II. Explantes corneales expresaron genes del MHC de clase II en

diversos niveles luego de diferentes períodos de incubación con interferón gamma.

Mientras la córnea central normal presentaba bajos niveles de expresión, en la QSC se

observaron elevados niveles de expresión aberrante asociados a la secreción de interferón

gamma por el infiltrado de linfocitos CD4+.

Los genes del MHC clase II desempeñan un importante rol en la

resistencia/susceptibilidad a enfermedades inmuno-mediadas, tales como diabetes tipo 1,

poliartritis, tiroiditis linfocítica, anemia hemolítica inmuno-mediada, demodicosis y lupus

eritematoso sistémico (Ollier y col.,2001; Kennedy y col.,2006; Kennedy, 2007; It y col.,

2010; Wilbe y col.,2010). Dadas las características inmunológicas de la QSC, los genes del

MHC de clase II u otros genes involucrados en la respuesta inmune son buenos candidatos

para el estudio de las bases genéticas de esta enfermedad. Debido a la sobreexpresión de las

moléculas de clase II que ha sido reportada, tanto las regiones reguladoras (promotores)

como las presentadoras de antígenos (exón 2) pueden ser buenos marcadores para esta

enfermedad. Berggren y Seddon (2005) han despcripto la variabilidad genética a nivel de lo

promotores de los genes DLA de clase II. Por otro lado, Jokinen y colaboradores (2011)

analizaron la asociación entre los genes de clase II DLA-DRB1, -DQA1 y -DQB1 y la

susceptibilidad a la progresión de QSC en Ovejeros Alemanes, demostrando que ciertos

haplotipos estaban asociados a un mayor riesgo de presentar la enfermedad. Estos

resultados apoyarían la hipótesis que QSC tendría un origen autoinmune.

47

HIPÓTESIS

La Queratitis Superficial Crónica canina es una enfermedad autoinmune que está

asociada a los polimorfismos en los loci del MHC canino involucrados en la respuesta

inmune.

OBJETIVOS

Objetivo General: El objetivo general del presente estudio consistió en identificar la

asociación entre los polimorfismos de los genes de clase II y la predisposición a desarrollar

Queratitis Superficial Crónica en perros de la raza Ovejero Alemán. Dicho objetivo general

incluyó los siguientes objetivos específicos:

a) Estudiar la prevalencia de la QSC en la región.

b) Evaluar la influencia del sexo y edad sobre la prevalencia de QSC.

c) Asociar marcadores de tipo microsatélites ligados al cluster DLA con la

susceptibilidad a desarrollar QSC.

d) Caracterizar los polimorfismos presentes en las regiones promotoras y en la región

presentadora de antígenos (exón 2) de los genes de clase II DLA-DRB1, DLA-

DQB1 y DLA-DQA1.

e) Desarrollar un software para determinar los haplotipos que definen los alelos de los

DLA-DRB1, DLA-DQB1 y DLA-DQA1 tipificados mediante secuenciación

directa.

f) Asociar los alelos de los genes DLA-DRB1, DLA-DQB1 y DLA-DQA1 con la

predisposición a desarrollar QSC.

48

2-MATERIALES Y MÉTODOS

49

2-MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Material animal. 2.1.1. Datos fenotípicos.

Unidad de análisis: Perros de la raza Ovejero Alemán de provincia de Buenos Aires

(Figura 2.1).

Diseño experimental: En el presente estudio se utilizó una estrategia de caso-

control. Este diseño retrospectivo y transversal consiste en dividir a la muestra en animales

sanos y enfermos para luego evaluar las diferencias entre ambos grupos. Es por esta razón

que la inclusión de los animales en cada grupo se llevó adelante según los siguientes

criterios:

Grupo Caso: compuesto por perros Ovejeros Alemanes con QSC, clasificados por sexo y

edad. Estos animales presentaban pérdida de transparencia corneal, reacción inflamatoria

corneal bilateral originada en el ángulo ventro-temporal que progresa al centro corneal.

Además, los perros enfermos presentaban las siguientes características en la región

afectada: variación de color, dependiendo del progreso de la enfermedad (gris, rojo y/o

marrón), vascularización subepitelial y pigmentación del área vascular (Figura 2.2). Los

pacientes no presentaron signos de dolor ni inflamación palpebral. La inspección

oftalmológica se realizó mediante biomicroscopía con lámpara de hendidura (Kowa SL-14,

Japón). Para descartar la presencia de la queratoconjuntivitis seca se midió la producción de

lágrimas mediante el test de Schirmer (Showa Yakuhin Kako, Tokio, Japón). Además, se

completó la inspección con oftalmoscopio indirecto (oftalmoscopio indirecto, All Pupil,

Keeler, Inglaterra y lupa Volk 20) para evaluar el segmento posterior en aquellos pacientes

en los que la opacidad corneal no permitía la evaluación directa (ANEXO 1).

50

Figura 2.1. Perros de la raza Ovejero Alemán.

Figura 2.2. Signos característicos a la inspección oftalmológica. La lesión característica de

la enfermedad es la reacción inflamatoria corneal bilateral originada en el ángulo ventro-

temporal que progresa al centro corneal.

51

Grupo Control: compuesto por perros Ovejeros Alemanes sanos, clasificados por sexo y

una edad mayor a 8 años. Estos animales no presentaron alteraciones corneales durante el

estudio oftalmológico a pesar de su avanzada edad.

2.1.2. Población estudiada.

Se evaluaron un total de 73 animales, los que se clasificaron en grupo caso (N = 43) y

grupo control (N = 30) según los criterios antes mencionados. La proporción entre

enfermos y sanos fue de 1,43:1 y la relación entre hembras y machos de 1,21:1. El grupo

CASO (enfermos) tuvo un relación hembra:macho de 1,15:1 y el promedio de edad fue de

5,5 años. El grupo CONTROL (sanos) tuvo una relación hembra: macho de 1,3:1 y un

promedio de edad de 10,5 años. Como se mencionó anteriormente, la mayor edad promedio

de este último grupo se debió a que sólo se incluyeron animales mayores de 8 años.

2.2. Obtención de la muestra y extracción de ADN.

Se tomaron muestras de sangre entera de la vena cefálica antebraquial o safena en un

tubo con ácido etilediaminotetraacético (EDTA) al 6% como anticoagulante, previa firma

del consentimiento informado a los propietarios (ANEXO 2). El ADN genómico se extrajo

a partir de las muestras de sangre con el kit de purificación de ADN genómico Wizard

(Promega, Madison, WI, USA), de acuerdo a las instrucciones del proveedor (ANEXO 3).

Luego de la extracción se midió cantidad y calidad del ADN genómico obtenido utilizando

espectrofotometría (ANEXO 5).

2.3. Genotipificación.

En el presente estudio se utilizaron tres tipos de marcadores genéticos: microsatélites,

SNPs e INDELs. A continuación se describen las metodologías utilizadas para su

genotipificación (Figura 2.3).

52

Figura 2.3. Descripción esquemática de la metodología utilizada para la genotipificación

de las muestras.

2.3.1. Microsatélites

Los animales se tipificaron para tres microsatélites ligados a los genes DLA mediante

la técnica de análisis de fragmentos, la que contempla una primera etapa de amplificación

del microsatélite por PCR utilizando primers fluorescentes, seguido de una electroforésis

capilar en un secuenciador de ADN. Finalmente, los genotipos son identificados mediante

los picos de fluorescencia (Figura 2.3). Como se observa en la Figura 2.4, dichos

53

marcadores se encuentran localizados en diferentes regiones del DLA. Las características

de los tres marcadores utilizados se describen en la Tabla 2.1.

Tabla 2.1. Características de los microsatélites FH2054, FH2975 y FH2202 utilizados en

el presente estudio.

. Locus Unidades de

repetición Posición

(unidades TSP)

Rango de tamaño

(pb)

Primers Secuencia 5´-3´

FH2054 Tetranucleótido (GATA)n

4747 140–184 Forward GCCTTATTCATTGCAGTTAGGG Reverse ATGCTGAGTTTTGAACTTTCCC

FH2202 Tetranucleótido (AAGA)n

600 377–477 Forward GTTGAGTGGTTGCCTTTAGC Reverse CAGGATCTTCATATGTCACC

FH2975 Tetranucleótido (CTTT)n

13159 274–388 Forward TGAACCAATTGAGGAACACA Reverse TGGGGTCTTGAGTTTGAGTC

Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen total de 25 μl de una solución de

reacción que contenía 20 mM de Tris-HCl (pH=8,4), 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2,

200 μM de dNTPs, 0,5 U de Taq polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0,4 μM de cada

primer y entre 25-50 ng de ADN. Las condiciones de reacción fueron: 1 ciclo de 3 minutos

a 95ºC, 35 ciclos de 40 segundos a 95ºC, 1 minuto a 61°C y 1 minuto a 72ºC y una

elongación final de 10 minutos a 72ºC.

Los productos de amplificación se verificaron en geles de poliacrilamida 6% 1 X

TBE durante 30 min a 170 voltios, se revelaron mediante la tinción con bromuro de etidio y

se visualizaron en un transiluminador UV (Figura 2.3, ver ANEXO 6).

Con el fin de discriminar los alelos de los STRs, los productos de amplificación se

corrieron en una electroforésis capilar utilizando un secuenciador automático de ADN

MegaBACE 1000 (GE Healthcare, USA) usando como marcador de peso molecular el AQ4

ET550-R (GE Healthcare). (Figura 2.3). Los picos de fluorescencia y la asignación de los

genotipos se llevó a cabo utilizando el software MEGABACE GENETIC PROFILER

SOFTWARE SUITE version 2.2 (GE Healthcare).

54

Figura 2.4. Localización en la región del DLA de clase II de los microsatélites utilizados

en este estudio.

2.3.2 Secuenciación

Para el análisis de las regiones reguladoras y presentadoras de antígenos de genes de

clase II del DLA se utilizó la metodología de secuenciación directa (SBT) mediante la

técnica de Sanger (dideoxy chain termination method, Sanger y col., 1977). Este método se

basa en un proceso de síntesis de ADN controlado por la adición de terminadores dideoxi

marcados, ddNTPs, en una PCR. La ADN polimerasa copia el molde de ADN de cadena

simple mediante la incorporación de nucleótidos en el extremo 3 'de un cebador hibridado

al ADN molde. Se sintetiza una nueva cadena de ADN mediante la adición de un

nucleótido al extremo 3'-hidroxilo. El método de Sanger explota la capacidad de las ADN

polimerasas de incorporar análogos de nucleótidos, tales como didesoxinucleótidos

(ddNTPs), y terminadores marcados con fluorescencia. Estos son nucleótidos que carecen

del grupo 3'-hidroxilo libre (bloqueado por la marca fluorescente). Mediante la adición de

terminadores, junto con dNTPs ordinarios, a la reacción, el proceso de alargamiento se

55

termina una vez que un terminador se incorpora. Debido a que cada terminador lleva una

marca fluorescente de color diferente, es posible detectar qué nucleótido dio por terminada

la polimerización. Varias rondas de elongación generarán fragmentos de todos los tamaños.

Estos fragmentos son posteriormente discriminados por electroforésis capilar, y la

secuencia de nucleótidos se puede leer mediante la detección de fluorescencia después de

que las marcas son excitadas por un rayo láser. Este análisis se realiza de forma rutinaria en

secuenciadores automáticos, que suelen utilizar electroforésis capilar.

2.3.3. Genes de clase II del Complejo Principal de Histocompatibilidad canino (DLA)

Para realizar la caracterización genética de los genes de clase II DLA-DRB1, DLA-

DQA y DLA-DQB se tipificaron por la técnica de PCR-secuenciación directa (SBT) los

SNPs e INDELs presentes en dos regiones de estos loci: la región promotora proximal y el

segundo exón o región presentadora de antígenos (ARS). La técnica utilizada consiste en la

amplificación por PCR de la región a caracterizar, los amplicones (productos de PCR) se

secuenciaron mediante la técnica de Sanger en un secuenciador capilar de ADN, finalmente

los cromatogramas se procesaron y los polimorfismos se identificaron mediante software

específicos (Figura 2.5).

56

Figura 2.5. Cromatograma de un fragmento de ADN. La altura de los picos está

relacionada con el número de fragmentos que tienen el mismo largo y mismo nucleótido en

el extremo 3’. El eje de las X es el tiempo en el cual ese grupo de fragmentos migra desde

el sitio de siembra a la ventana del capilar del secuenciador donde es detectado por el láser

y el sistema óptico.

2.3.3.a. Regiones reguladoras de los genes de clase II DLA-DRB1,-DQA1 y-DQB.

Para caracterizar los polimorfismo de la región promotora proximal de los genes de

clase II del DLA se amplificaron tres fragmentos de 219, 255 y 294 pb correspondientes a

los genes DLA-DRB1, -DQA1 y –DQB1, respectivamente, utilizando los primers

publicados por Berggren y Seddon (2005). Se utilizó la nomenclatura propuesta por estos

autores para denominar los alelos de las regiones promotoras de estos genes de clase II. Las

características de los tres marcadores tipificados se describen en la Tabla 2.2.

57

Tabla 2.2. Primers utilizados para amplificar las regiones promotoras de los genes de

DLA-DRB1, -DQA1 y –DQB1.

Gen Primers (5´-3´) Tamaño del

amplificado Región

DRB1 Forward CAATCCTTTCAATGAACAAAATCAAAG

Reverse GTGTGCACTTACGTGGGGTGT

219pb

Promotor

DQA1 Forward ATTGATTGAGTGAGCCTCCTCCT Reverse TGTGCACTCACCCACAATCTC

255pb

Promotor

DQB1 Forward TTGTTCAGTTTCTTAAACCCCTAAGG Reverse AGGTGTCCTGCACTTACGTGG

294pb

Promotor

Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen total de 25 μl de una solución de

reacción que contenía 20 mM de Tris-HCl (pH=8,4), 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2,

200 μM de dNTPs, 0,5 U de Taq polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0,4 μM de cada

primer y entre 25-50 ng de ADN. Las condiciones de reacción fueron: 1 ciclo de 3 minutos

a 94ºC, 35 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 40 segundos a la temperatura de annealing

correspondiente, 40 segundos a 72ºC y una elongación final de 10 minutos a 72ºC.

Los productos de amplificación se verificaron en geles de poliacrilamida 6% 1X TBE

durante 30 min a 170 voltios, se revelaron mediante la tinción con bromuro de etidio y se

visualizaron en un transiluminador UV (ANEXO 6). Posteriormente, los productos de PCR

se purificaron mediante la técnica de precipitación diferencial con polietilenglicol 8000

(ANEXO 7) y se secuenciaron mediante el método de Sanger en un secuenciador

automático de ADN MegaBACE 1000 (GE Healthcare, USA) usando el kit DYEnamic ET

Terminator (GE Healthcare) (ANEXO 8 y 9). Las secuencias crudas fueron editadas

mediante el software Sequence Analyzer (GE Healthcare).

58

2.3.3. b. Regiones presentadoras de antígenos (exón 2) de los genes de clase II DLA-

DRB1, -DQA1 y –DQB1.

Para caracterizar los polimorfismos de la región presentadora de antígenos (ARS) de

los tres genes de clase II DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1 se amplificaron tres

fragmentos de 270, 260 y 285 pb, respectivamente. Las características de los tres

marcadores utilizados se describen en la Tabla 2.3. Vale la pena aclarar que el agregado a

los primers específicos las secuencias de los primers universales (T7 promoter y M13

forward) permitió obtener secuencias de mejor calidad en los extremos y, por lo tanto, una

lectura más eficiente de las mismas.

Tabla 2.3. Primers utilizados en la secuenciación del exón 2 de los genes DLA- DRB1,

DLA-DQA1 y DLA-DQB1. Tm (Temperatura de Melting). M13 (M13(-21) forward). T7

(T7 promoter).

Gen Secuencia 5´-3´ forward Secuencia 5´-3´reverse Tm (C°)

Región

DRB1

M13-CTC AGC TGA CCA TGT TGC

T7-GGG GAC AGA TTC AGT GAA GAG A

67-63°C

Exón 2

DQA1

M13-CCG TCC CCA CAG CAC ATT TC

T7-GGT GTG TCA CAC ACC TCA GCA CCA

69-66°C

Exón 2

DQB1

M13-CTC ACT GGC CCG GCT GTC TC

T7- GGC ACC TCG CCG CTG CAA CGT G

68-71°C

Exón 2

Secuencia 5’-3’ M13 (-21) forward TGT AAA ACG ACG GCC AGT

T7 promoter TAA TAC GAC TCA CTA TAG

Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen total de 25 μl de una solución de

reacción que contenía 20 mM de Tris-HCl (pH=8,4), 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2,

200 μM de dNTPs, 0,5 U de Taq polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0,4 μM de cada

primer y entre 25-50 ng de ADN. Las condiciones de reacción fueron: 1 ciclo de 3 minutos

59

a 94ºC, 35 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 40 segundos a la temperatura de annealing

correspondiente, 40 segundos a 72ºC y una elongación final de 10 minutos a 72ºC.

Los productos de amplificación se verificaron en geles de poliacrilamida 6% 1X TBE

corridos durante 30 min a 170 voltios, se revelaron mediante la tinción con bromuro de

etidio y se visualizaron en un transiluminador UV (ANEXO 6). Posteriormente, los

productos de PCR se purificaron mediante la técnica de precipitación diferencial con

polietilenglicol 8000 (ANEXO 7) y se secuenciaron mediante el método de Sanger en un

secuenciador automático de ADN MegaBACE 1000 (GE Healthcare, USA) usando el kit

DYEnamic ET Terminator (GE Healthcare) (ANEXO 8 y 9). Las secuencias crudas se

editaron mediante el software Sequence Analyzer (GE Healthcare).

2.4. Análisis Bioinformáticos

Para el análisis y detección de los genotipos de los marcadores microsatélites, se

utilizó el software MEGABACE GENETIC PROFILER SOFTWARE SUITE version 2.2

(GE Healthcare). Las secuencias de ADN obtenidas de los promotores y de los exones 2 se

alinearon utilizando el software DNAMAN. En el primer caso las variaciones se definieron

por comparación directa con las secuencias reportadas en el Genbank. En el caso de los

sitios heterocigotas se realizó el control individual de las secuencias de ADN con el

software Chromas Lite v2.1.1 (Technelysium, http://technelysium.com.au/?page_id=13) y

UGENE (Okonechnikov y col., 2012). Para el análisis de los exones 2, debido al mayor

grado de polimorfismo, se desarrolló un software en colaboración con el equipo de

bioinformática del IGEVET (Instituto de Genética Veterinaria, FCV, UNLP), el que se basa

en los lenguajes Python y R. En principio se desarrolló un script en Python, utilizando la

biblioteca BioPython, que lee las secuencias a partir del cromatograma en formato FASTA,

permitiendo la notación [A/C] para los SNP polimórficos y los alineamientos extraídos de

la base de datos IPD-MHC (ANEXO 12, https://www.ebi.ac.uk/ipd/mhc/)

Para el análisis de desequilibrio de ligamiento entre los diferentes loci se utilizó el software

PyPop (Python for Population Genomics) 0.7.0 (www.pypop.org). Este análisis permitió

analizar los haplotipos conformados por los exones 2 de los genes DLA-DRB1, -DQA1 y

DQB1.

60

2.5. Análisis poblacional.

Las frecuencias alélicas y genotípicas para cada una de los marcadores genéticos

utilizados (microsatélites, SNPs e INDELs) dentro de los grupos caso y control se

calcularon con el software GENEPOP 4.0 (Rousset y col., 1997, Rousset, 2007). La

diversidad genética se estimó mediante el número de alelos (na), la heterocigosidad

observada (ho) y esperada (he) para cada locus y la heterocigosidad promedio esperada

sobre todos los locus. El número de alelos se determinó por conteo directo, mientras que la

he y ho se estimaron de acuerdo a la fórmula propuesta por Nei (1978) usando el software

de análisis genéticos poblacionales ARLEQUIN 3.5 (Schneider y col., 2000). Las posibles

desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) se estimaron para cada locus y para

cada grupo mediante el índice FIS y el test exacto de Fisher incluido en el programa

GENEPOP 4. El desequilibrio de ligamiento (fase de ligamiento) entre los marcadores

genéticos se reconstruyó por el método bayesiano implementado en el software Phase

v2.1.1 (Li y Stephens, 2003; Crawford y col., 2004) utilizando las opciones

predeterminadas. Las fases y el desequilibrio de ligamiento entre los loci se visualizaron

por medio del programa Haploview v3.31 (Barrett y col., 2005).

2.6. Análisis de asociación.

La asociación entre los alelos/haplotipos y la predisposición a desarrollar QSC se

evaluó utilizando el modelo clásico de estudio caso-control. Utilizando el mismo modelo,

también se evaluó la hipótesis de la asociación entre la elevada homocigosis y la QSC. El

test exacto de Fisher, Odds Ratio y sus intervalos de confianza (IC) se calcularon por

comparación de las frecuencias alélicas entre ambos grupos. Se incluyeron en el estudio los

alelos más representados en la población, considerando como límite de corte una frecuencia

alélica de 0,05. Los valores de p menores a 0,05 se consideraron significativos. El análisis

estadístico se llevó a cabo utilizando el paquete de R epitools (http://www.r-project.org/).

61

3- RESULTADOS

62

3-RESULTADOS

3.1. Análisis de las características de la muestra utilizadas.

En un estudio retrospectivo realizado en colaboración con Servicio de Clínica de

Pequeños Animales, Hospital Escuela de la Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad

Nacional de La Plata se recolectó información de pacientes caninos sobre edad, sexo, raza y

motivos de consulta (n=752 ), en un período comprendido entre el año 2009 y 2011.

Donde se observó una incidencia de la QSC de 5,46% (n=41), dentro de este grupo de

animales el 78 % (n=32) eran de la raza ovejero alemán. La edad de presentación promedio

fue 5,5 años. Dentro los caninos afectados, la relación hembra: macho fue de 1,15:1. No se

observaron diferencias en la predisposición a desarrollar QSC entre hembras y machos (chi

cuadrado=0,2, con un valor de p=0,05 y un valor crítico de 3,84).

En la muestra de perros ovejeros alemanes analizada en el presente estudio, se observó

una relación entre enfermos y sanos de 1,43:1 y una relación entre hembras y machos de

1,21:1. El grupo CASO (animales enfermos) tuvo un relación hembra: macho de 1,15:1 y

un promedio de edad de 5,5 años. El grupo CONTROL (animales sanos) tuvo una relación

hembra: macho de 1,3:1 y un promedio de edad de 10,5 años. Cabe recordar que, como se

mencionó anteriormente, la mayor edad promedio de este último grupo se debe a los

criterios de inclusión empleados en el estudio.

3.2. Análisis poblacional

3.2.1. Microsatélites ligados al DLA

Para el análisis de los microsatélites FH2054, FH2975 y FH2202, se tipificaron un

total de 61 animales (55 ovejeros alemanes, 3 mestizos, 1 galgo, 1 ovejero belga y 1 pastor

suizo). Esta muestra se dividió en grupo caso (n = 35, 16 hembras y 18 machos) y control

(n = 26, 15 hembras y 7 machos), según los criterios descriptos en la sección “Material

animal”.

Para el microsatélite FH2054 se detectaron siete alelos en el total de la muestra,

cuatro en el grupo control y siete en el grupo caso (Tabla 3.1). Las frecuencias alélicas de

63

este marcador variaron entre 0,02 y 0,4. Esto resultó en valores de he de 0,732 y 0,722 y de

ho de 0,56 y 0,661 en el grupo caso y en el grupo control, respectivamente (Tabla 3.2). El

equilibrio HWE mostró que el grupo caso (estimado a partir del índice FIS) y en la

población total (estimado mediante el método exacto de Fisher) no se ajustaban a las

proporciones teóricas esperadas bajo el HWE (Tabla 3.2). Estos desvíos se debieron en los

dos casos a un aumento significativo de individuos homocigotas. Por otra parte, no se

observaron diferencias significativas en la proporción de individuos homocigotas entre los

grupos caso y control (p < 0,05).

Tabla 3.1. Frecuencias alélicas del microsatélite FH2054 (tetranucleótido) estimadas en los

grupos caso y control.

FH2054 (alelos) CASO CONTROL

148 0,06 0 152 0,4 0,39 156 0,06 0,12 160 0,02 0 164 0,15 0,14 168 0,2 0,35 172 0,11 0

Tabla 3.2. Valores estimados de heterocigosidad esperada (he) y observada (ho) para el microsatélite FH2054 detectados en los grupos caso y control y la población total.

Grupo he ho FIS (valor de p) CASO 0,732 0,556 0,245 (0,004)

CONTROL 0,722 0,611 0,158 (0,107) Total 0,746 0,578 0,003

En cuanto al microsatélite FH2975 se detectaron 17 alelos en el total de la muestra,

once en el grupo control y trece en el grupo caso (Tabla 3.3). Diez de estas variantes se

detectaron sólo en uno de los grupos. Las frecuencias alélicas de este marcador variaron

entre 0,01 y 0,35. Esto resultó en valores de he de 0,861 y 0,914 y de ho de 0,750 y 0,722

en el grupo caso y en el grupo control, respectivamente (Tablas 3.4). El equilibrio HWE

64

mostró que en los dos grupos y en la población total no se ajustaba a las proporciones

teóricas esperadas bajo el HWE (Tabla 3.4). En los tres casos los desvíos se debieron a un

aumento significativo de individuos homocigotas. Además, no se observó un aumento

significativo de homocigosis en el grupo caso con respecto al grupo control (p < 0,05), que

podría llevar a la fijación de un alelo asociado al desarrollo de la enfermedad.

Tabla 3.3. Frecuencias alélicas del microsatélite FH2975 (tetranucleótido) estimadas en los

grupos caso y control.

FH2975 (alelos) CASO CONTROL

248 0,03 0 284 0 0,03 288 0,02 0 300 0,02 0,11 304 0,02 0 308 0,03 0 312 0,02 0,11 316 0 0,03 320 0,47 0,18 324 0,02 0,11 328 0 0,03 332 0 0,08 340 0,07 0 344 0,07 0,13 348 0,17 0,05 352 0,05 0,16 356 0,02 0

Tabla 3.4. Valores estimados de heterocigosidad esperada (he) y observada (ho) para el microsatélite FH2975 detectados en los grupos caso y control y la población total.

Grupo he ho FIS (valor de p) CASO 0,861 0,750 0,131 (0,008)

CONTROL 0,914 0,722 0,215 (0,000) Total 0,926 0,690 < 0.001

Con respecto al microsatélite FH2202 se detectaron 22 alelos en el total de la

muestra, diecisiete en el grupo control y dieciséis en el grupo caso (Tabla 3.5). Como en el

65

caso anterior muchos de los alelos solo se detectaron en uno de los grupos con baja

frecuencia. Las frecuencias alélicas de este marcador variaron entre 0,02 y 0,24. Esto

resultó en valores de he de 0,904 y 0,922 y de ho de 0,680 y 0,700 en el grupo caso y en el

grupo control, respectivamente (Tablas 3.6). Como en el caso anterior, el equilibrio HWE

evidenció desviaciones significativas tanto en los dos grupos como en la población total

(Tabla 3.6). En los tres casos los desvíos se debieron a un aumento significativo de

individuos homocigotas. Además, no se observó un aumento significativo de homocigosis

en el grupo caso con respecto al grupo control (p < 0,05).

Tabla 3.5. Frecuencias alélicas del microsatélite FH2202 (tetranucleótido) estimadas en los

grupos caso y control.

FH2202 (alelos) CASO CONTROL

377 0,02 0 381 0 0,02 385 0 0,02 393 0,02 0,04 397 0,05 0,04 401 0,13 0,14 405 0,02 0,08 409 0,02 0 413 0,13 0,08 417 0,02 0 421 0,05 0 425 0,04 0,02 429 0,24 0,24 433 0,17 0,1 437 0,04 0 441 0,02 0,04 445 0,02 0,02 449 0,02 0,02 453 0 0,02 457 0 0,06 469 0 0,02 477 0 0,04

66

Tabla 3.6. Valores estimados de heterocigosidad esperada (he) y observada (ho) para el microsatélite FH2202 detectados en los grupos caso y control y la población total.

Grupo he ho FIS (valor de p) CASO 0,904 0,680 0,252 (0,000)

CONTROL 0,922 0,700 0,240 (0,000) Total 0,899 0,738 0,001

En conclusión, los tres microsatélites tipificados mostraron niveles de diversidad

genética suficiente (en los grupos caso y control) para llevar a cabo los subsiguientes

estudios de asociación.

3.2.2. Región Reguladora Proximal de las Genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-

DQB1.

El análisis por secuenciación directa del ADN de la región reguladora proximal de los

tres genes DLA de clase II puso en evidencia: dos SNPs del gen DLA-DRB1 (uno en el

promotor y otro en el exón 1), dos SNPs en el gen DLA-DQA1 (uno en el promotor y otro

en el exón 1) y seis SNPs en el gen DLA-DQB1 (cinco en el promotor y uno en el exón 1).

Además, se detectó un INDEL en el promotor del gen DLA-DQB1 (Tabla 3.7, Figura 3.1a-

c). La mutación A/G (no sinónima) en la posición 46 del exón 1 del gen DLA-DQB1

específica del lobo no se detectó en la muestra analizada.

67

Tabla 3.7. Características de los polimorfismos detectados en la región promotora/exon 1 de los genes de clase II DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1. Gen Polimorfismo Variación Promotor/ Exon 1

(posición) Ubicación en el

genoma DLA-DRB1

DRB1*-128 [C/T] C / T -128 CFA12 : 2151317

DRB1*69 [C/T] C / T 69 CFA12 : 2151514 DLA-DQA1

DQA1*-85 [A/T] A / T -85 CFA12 : 2221102

DQA1* 38 [C/T] C / T 38 CFA12 : 2221225

DLA-DQB1

DQB1*-272 [indel] TAAC/- -272 CFA12 : 2244333

DQB1*-256 [G/T] G / T -256 CFA12 : 2244346

DQB1*-170 [G/A] G / A -170 CFA12 : 2244432

DQB1*-154 [C/T] C / T -154 CFA12 : 2244448

DQB1*-105 [A/T] A / T -105 CFA12 : 2244497

DQB1-87 [C/T] C / T -87 CFA12 : 2244515

DQB1*-71[C/T] C / T -71 CFA12 : 2244531

DQB1*46 [G/A] G / A 46 CFA12 : 2244646

DQB1*71 [indel]1 INDEL 71 CFA12 : 2244671 1 no analizado

68

Figura 3.1. Alineamiento de la secuencias de las variantes alélicas de las regiones reguladoras proximales de los genes DLA de clase II. Se marcaron sus correspondientes sitios polimórficos y cajas reguladoras (S, X1, X2, Y y T). a) Gen DLA-DRB1

b) Gen DLA-DQA1

69

c) GenDLA-DQB1

70

Como se mencionó anteriormente, para el gen DLA-DRB1 se detectaron dos

polimorfismos (SNPs), el primero está ubicado en el promotor, denominado DRB1*-128

[C/T] y otro está ubicado en el exón 1 y se denomina DRB1*69 [C/T]. Para cada uno de

ellos se calculó la frecuencia génica, la heterocigocidad obsevada y esperada y el equilibrio

de Hardy-Weinberg en la población total y en los grupos caso y control. Estos análisis

mostraron que ambos polimorfismos presentaban frecuencias alélicas apreciables para sus

dos alelos, resultando en hE y h0 cercanas al 0,5 (Tabla 3.8 y 3.9). Cabe destacar que ambos

SNPs presentaban las mismas frecuencias alélicas, lo que estaría indicando un ligamiento

completo entre ambos. Este punto se discute en más detalle en la sección de análisis de

ligamiento. El equilibrio HWE mostró que los dos polimorfismos se ajustaban a las

proporciones teóricas esperadas (Tabla 3.8 y 3.9).

En el caso del gen DLA-DQA1, se analizaron dos polimorfismos, uno ubicado dentro

del promotor, denominado DQA1*-85 [A/T], y el otro ubicado en el exón 1, denominado

DQA1*38 [C/T]. Ambos SNPs mostraron una variabilidad muy baja, siendo la frecuencia

alélica de la variante T del SNP DQA1*-85 [A/T], resultó ser de 0,98 en la población total,

mientras que la variante C del SNP DQA1*38 [C/T] se encontró fijada en la población de

ovejeros alemanes estudiada. Esto resultó en valores de variabilidad genética cercana a

cero, presentando el primer polimorfismo una ho y una he, en los grupos caso y control de

71

0,055 y 0,066, respectivamente. Para el segundo polimorfismo, tanto la ho como la he,

presentaron valores de 0 (ver Tabla 3.8 y 3.9).

Se analizaron siete sitios polimórficos en el gen DLA-DQB1, seis dentro del

promotor y uno dentro del exón 1. Tres de ellos se encontraron fijados: la variante G del

SNP DQB1*-256 [G/T], la variante A del SNP DQB1*-105 [A/T] y la variante G del SNP

DQB1*46 [G/A]. En el caso del INDEL DQB1*-272 [TAAC/-], la variante delecionada

tuvo una frecuencia de 0,93. En el resto de los casos se obtuvieron frecuencias más

apreciables. Se evaluaron las ho y he , tanto en la población total como en los grupos caso y

control, en todos los casos no se observaron diferencias significativas con las proporciones

teóricas esperadas. (Tabla 3.8 y 3.9).

Tabla 3.8. Frecuencias alélicas, heterocigosidad obsevada (ho) y esperada (he), equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) calculada para cada polimorfismo detectado en los promotores de los genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1 en el total de la muestra. ND (no determinado).

Polimorfismo Frecuencias alélicas

ho he HWE FIS – p

DRB1*-128 [C/T] 0,63 0,37 0,542 0,474 0,16 – 0,65 DRB1*69 [C/T] 0,63 0,37 0,542 0,474 0,16 – 0,65 DQA1*-85 [A/T] 0,02 0,98 0,033 0,033 -0.02 – 1,00 DQA1* 38 [C/T] 1 0 0 0 ND

DQB1*-272 [TAAC/-] 0,07 0,93 0 0,135 1,00 – 0,003 DQB1*-256 [G/T] 1 0 0 0 ND DQB1*-170 [G/A] 0,43 0,57 0,61 0,495 -0,23 – 0,39 DQB1*-154 [C/T] 0,59 0,41 0,535 0,488 -0,08 – 1,00 DQB1*-105 [A/T] 1 0 0 0 ND

DQB1-87 [C/T] 0,36 0,64 0,535 0,466 -0,10 – 1 DQB1*-71[C/T] 0,72 0,28 0,302 0,396 0,07 – 1 DQB1*46 [G/A] 1 0 0 0 ND

72

Tabla 3.9. Heterocigosidad obsevada (ho) y esperada (he), equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) calculada para cada polimorfismo detectado en los promotores de los genes DLADRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1en los grupos caso y control. ND (no determinado). Polimorfismo Grupo Frecuencias

alélicas ho he HWE (FIS – p)

DRB1*-128 [C/T] CASO 0,73 0, 27 0,4 0,4 0,04 (1) CONTROL 0.6 0,4 0,64 0,49 -0,29 (0,2) DRB1*69 [C/T] CASO 0,69 0,31 0,36 0,43 0,16 (0,63) CONTROL 0,56 0,44 0,66 0,5 -0,33 (0,33) DQA1*-85 [A/T] CASO 0 1 0,055 0,055 ND CONTROL 0,06 0,94 0,066 0,066 ND DQA1* 38 [C/T] CASO 1 0 0 0 ND CONTROL 1 0 0 0 ND DQB1*-272 [TAAC/-] CASO 0,1 0,9 0 0,13 1 (0,03) CONTROL 0,18 0,82 0 0,3 1 (0,007) DQB1*-256 [G/T] CASO 1 0 0,055 0,055 ND CONTROL 1 0 0 0 ND DQB1*-170 [G/A] CASO 0,38 0,66 0,58 0,47 -0,23 (0,39) CONTROL 0,52 0,48 0,6 0,51 -0,2 (0,42) DQB1*-154 [C/T] CASO 0,45 0,55 0,62 0,5 -0,23 (0,43) CONTROL 0,72 0,28 0,39 0,42 0,06 (1) DQB1*-105 [A/T] CASO 0,98 0,02 0,04 0,04 ND CONTROL 1 0 0 0 ND DQB1-87 [C/T] CASO 0,28 0,72 0,5 0,42 -0,19 (0,63) CONTROL 0,44 0,56 0,52 0,5 -0,04 (1) DQB1*-71[C/T] CASO 0,8 0,2 0,3 0,36 0,15 (0,58) CONTROL 0,68 0,32 0,3 0,44 0,33 (0,16) DQB1*46 [G/A] CASO 1 0 0 0 ND CONTROL 1 0 0 0 ND

Debido a que los polimorfismos tipificados para los tres genes de clase II se

encuentran cercanos en el genoma, se llevó a cabo el análisis del desequilibrio de

ligamiento (LD) utilizando los algoritmos “Four Gamete Rule” y “Solid spine pf LD”

implementados en el software Haploview. Este análisis permitió identificar dos bloques de

ligamiento con un r2 ≤ 45 (Figura 3.2). El primer bloque incluye dos haplotipos del gen

DLA-DRB1 (CC y TT), presentando ambas combinaciones frecuencias apreciables en la

73

población total (Figura 3.2b). Como se mencionó anteriormente estos SNPs evidenciaron

un valor de r2 de 1 por presentar un ligamiento completo. Por lo que desde el punto de vista

práctico, solo haría falta tipificar uno solo de estos polimorfismos para estudios de

asociación o de variabilidad genética. El segundo bloque incluye 5 haplotipos del gen

DLA-DQB1, tres de ellos presentaron frecuencias superiores al 10%, mientras que los dos

restantes resultaron ser combinaciones raras en la población estudiada (Figura 3.2). Las

frecuencias haplotípicas de los dos bloques de ligamiento en los grupos caso y control se

resumen en la tabla 3.10, evidenciando que los 7 haplotipos identificados se detectaron en

ambos grupos pero con frecuencias diferentes en alguno de ellos. Cabe mencionar que el

gen DLA-DQA1 no se incluyó en el análisis de desequilibrio de ligamiento debido a su

bajo nivel de variabilidad genética en la raza de ovejeros alemanes. La construcción de los

haplotipos permitió la realización de los estudios de asociación con la QSC tanto a nivel

alélico como haplotípico.

74

Figura 3.2. Haplotipos y desequilibrio de ligamiento (LD) en las regiones reguladoras proximales de los genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1. a) Bloques haplotípicos 1 y 2. b) Se obtuvo el LD (r2) utilizando el software HAPLOVIEW 3.31 (Barrett y col., 2005). Las líneas gruesas marcan los dos bloques identificados. a)

b)

75

Tabla 3.10. Frecuencias haplotípicas de las regiones reguladoras proximales de los genes

DLA-DRB1 y DLA-DQB1 en los grupos caso y control.

Haplotipo Frecuencias haplotípicas

Caso

Control URR-DRB1*CC 0,36 0,26 URR-DRB1*TT 0,2 0,18

URR-DQB*TATC 0,54 0,28 URR-DQB*CACC 0,23 0,47 URR-DQB*CATT 0,17 0,24 URR-DQB*CACT 0,039 0 URR-DQB*CTCT 0,02 0

En conclusión, las regiones promotoras de dos de los tres genes de clase II tipificados

mostraron niveles suficientes de diversidad genética en los grupos caso y control para poder

llevar a cabo los subsiguientes estudios de asociación tanto a nivel alélico como

haplotípico, siendo la excepción el gen DLA-DQA1 el cual no presentó variabilidad

genética.

3.2.3. Región Presentadora de Antígenos (exón 2) de las Genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1

Debido a su rol central en el reconocimiento y presentación de antígenos, el segundo

exón o ARS (Antigen recognition site) de los genes de clase II DRB1, DQA1 y DQB1

presenta niveles excepcionales de variabilidad genética, siendo polimórficas gran parte de

las posiciones nucleotídicas. Es por esta razón que la mayor dificultad para la identificación

de los alelos en los individuos heterocigotas es la determinación de las fases de ligamiento

entre los numerosos sitios polimórficos. Con el fin de solucionar este problema, en el

presente estudio el análisis de las secuencias del exón 2 de los tres genes de DLA de clase

II obtenidas se realizó mediante un software desarrollado en colaboración con el equipo de

bioinformática del IGEVET. Este software se programó en los lenguajes Python

(https://www.python.org/) y R (https://www.r-project.org/). En una primera etapa se

desarrolló un script en Python, utilizando la biblioteca BioPython

76

(http://biopython.org/wiki/Biopython). Este script lee las secuencias a partir del

cromatograma en formato FASTA, permitiendo la notación [A/C] para las posiciones

polimórficas y las de todos los alelos reportados extraídos de la base de datos IPD-MHC

(https://www.ebi.ac.uk/ipd/mhc/; ANEXO 12) en el formato de texto original. A partir de

las secuencias de referencia que figuran en dicha base de datos, se generan todas las

combinaciones posibles tomadas de a dos. Ese resultado se convierte a la nomenclatura

IUPAC (Tabla 3.12), al igual que la secuencia problema leída a partir del cromatograma

problema. Luego se alinea con cada una de las combinaciones de haplotipos, calculando

coincidencias y diferencias, reportando en un archivo las secuencias, el alineamiento y las

diferencias, finalmente ordenado de mayor a menor por cantidad de coincidencias. Además,

se utilizó también una librería de R/Bioconductor llamada sangerseqR, que permite la

lectura automática de los cromatogramas en formato .abd, generando un archivo con las

secuencias primaria y secundaria, y el cromatograma correspondiente con las secuencias

interpretadas. El uso de este paquete de R permitió detectar algunos errores en el algoritmo

original de sangerseqR, que producen algunas lecturas erróneas en ciertas situaciones. Por

lo tanto, se reportaron los errores encontrados y se resolvió el problema hallado en la

librería. Por otra parte, se desarrolló en R una función para calcular la reversa

complementaria del cromatograma, necesario para comparar las lecturas forward y reverse.

Esta función no estaba disponible en el paquete de original de Bioconductor mencionado,

pero sí en otros software, como por ejemplo el UGENE. La función será enviada al

proyecto sangerseqR una vez que sea adaptada a los estándares de estilo de dicha

biblioteca. Cabe destacar que para validar y corroborar los resultados del algoritmo

desarrollado para este trabajo, la edición de las secuencias se realizó paralelamente en

forma manual. Si bien en esta instancia el desarrollo es una prueba de concepto, se han

logrado reunir todos los módulos necesarios para resolver el problema propuesto y falta aún

desarrollar el script como una aplicación con interfase gráfica, que facilite la edición de

errores de lectura y recalcule los alineamientos y comparaciones de forma amigable. En la

figura 3.3 se describe el flujo de trabajo implementado en el software desarrollado para el

análisis de las secuencias del exón 2 de los genes de clase II.

77

Tabla 3.11. Código de ambigüedad nucleotídica (IUPAC, International Union of Pure and Applied Chemistry).

78

Figura 3.3. Flujo de trabajo del software diseñado para asignar los genotipos de los exones

2 de los genes de clase II. 1) Base de datos IPD-MHC donde se encuentran reportados los

alelo/haplotipos del exón 2. 2) Conversión a nomenclatura IUPAC. 3) Secuencia teórica. 4)

Secuencia problema en formato .abd. 5) Cromatograma de la secuencia problema. 6)

Secuencia problema en formato FASTA con nomenclatura original. 7) Secuencia problema

en formato FASTA con nomenclatura IUPAC. 8) Ranking de comparaciones tomadas de a

pares ordenado los posibles genotipos de mayor a menor número de coincidencias.9)

Identificación del genotipo del individuo problema.

Para el análisis de los exones 2 (región presentadora de antígenos) de los genes DLA-

DRB1, y -DQA1 se tipificaron los 73 perros clasificados en grupo caso (N = 43) y grupo

control (N = 30) según los criterios antes mencionados.

79

Para el exón 2 del gen DLA-DRB1 se detectaron 15 alelos/haplotipos en el total de la

muestra de los 52 variantes reportadas actualmente para este marcador genético (ANEXO

12), 9 en el grupo control y 10 en el grupo caso (Tabla 3.12). Las frecuencias alélicas de

este marcador variaron entre 0,01 y 0,45 en la población total. Esto resultó en valores de he

de 0,86 y ho de 0,69 en la población total. La diversidad genética dentro de los grupos caso

y control fue de 0,848 y 0,88 para la he y de 0,667 y 0,733 para la ho, respectivamente

(Tabla 3.13). El equilibrio HWE mostró que en ambos grupos (estimado a partir del índice

FIS) y en la población total (estimado mediante el método exacto de Fisher) las frecuencias

alélicas no se ajustaban a las proporciones teóricas esperadas (Tabla 3.13). Estos desvíos se

debieron principalmente a un aumento significativo de individuos homocigotas.

Tabla 3.12. Frecuencias alélicas del exón 2 del gen DLA-DRB1 estimadas en los grupos caso, control y en la población total.

ALELO CASO CONTROL TOTAL *00101 0,11 0,03 0,08 *00202 0 0,03 0,01 *01101 0,48 0,4 0,45 *01201 0 0,03 0,01 *01501 0,23 0,18 0,22 *01502 0 0,18 0,08 *01503 0 0,03 0,01 *01601 0,02 0 0,01 *01701 0 0,06 0,04 *02001 0,08 0 0,04 *02101 0,02 0 0,01 *03001 0 0,03 0,01 *03501 0 0,03 0,01 *03701 0,02 0 0,01 *03901 0,02 0 0,01

Tabla 3.13. Valores estimados de heterocigosidad esperada (he) y observada (ho) para el exón 2 del gen DLA-DRB1 detectados en los grupos caso y control y la población total.

Grupo he ho FIS (valor de p) CASO 0,848 0,667 0,218 (0,015)

CONTROL 0,88 0,733 0,172 (<0,00001) Total 0,86 0,69 High sign

80

En cuanto al exón 2 del gen DLA-DQA1 se detectaron 7 alelos en el total de la

muestra de las 16 variantes reportadas para este marcador genético en la base de datos

pública IPD-MHC (ANEXO 12). En los grupos caso y control se identificaron 7 y 4 alelos,

respectivamente (Tabla 3.14). Las frecuencias alélicas de este marcador variaron entre 0,01

y 0,41 en la población total. Esto resultó en valores de he de 0,886 y 0,824 y de ho de 0,572

y 0,588 en el grupo caso y en el grupo control, respectivamente (Tablas 3.15). El equilibrio

HWE mostró que en los dos grupos y en la población total las frecuencias alélicas no se

ajustaban a las proporciones teóricas esperadas bajo el HWE (Tabla 3.15). En los tres casos

los desvíos se debieron a un aumento significativo de individuos homocigotas.

Tabla 3.14. Frecuencias alélicas del exón 2 del gen DLA-DQA1 estimadas en los grupos caso, control y en la población total.

ALELO CASO CONTROL TOTAL *00101 0,05 0,28 0,17 *00201 0,46 0,36 0,41 *00401 0,11 0,08 0,09 *00601 0,25 0,28 0,26 *01401 0,05 0 0,03 *01501 0,05 0 0,03 *05011 0,03 0 0,01

Tabla 3.15. Valores estimados de heterocigosidad esperada (he) y observada (ho) para el exón 2 del gen DLA-DQA1 detectados en los grupos caso y control y la población total.

Grupo he ho FIS (valor de p) CASO 0,886 0,572 0,363 (0,00328)

CONTROL 0,824 0,588 0,29 (0,0041) Total 0,85 0,58 0,00013

Con respecto al exón 2 del gen DLA-DQB1, se detectaron 13 alelos en el total de la

muestra de los 36 variantes reportadas en las bases de datos ( ANEXO 12), 9 en el grupo

caso y 11 en el grupo control (Tabla 3.16). Algunos alelos solo se detectaron en uno de los

grupos o presentaron baja frecuencia. Las frecuencias alélicas de este marcador variaron

entre 0,011y 0,371. Esto resultó en valores de he de 0,75 y 0,844 y de ho de 0,667 y 0,6 en

el grupo caso y en el grupo control, respectivamente, mientras que la muestra total presentó

81

valores de he de 0,81 y de ho de 0,64 (Tablas 3.17). Como en los dos casos anteriores, el

equilibrio HWE evidenció desviaciones significativas tanto en los dos grupos como en la

población total (Tabla 3.17). En los tres casos los desvíos se debieron a un aumento

significativo de individuos homocigotas, hecho que coincidió en los exones 2 de los tres

genes de clase II evaluados.

Tabla 3.16. Frecuencias alélicas del exón 2 del gen DLA-DQB1 estimadas en los grupos caso, control y en la población total.

ALELO CASO CONTROL TOTAL *00201 0,12 0,28 0,2 *00301 0,12 0,1 0,1 *008011 0,09 0 0,05 *00802 0,07 0,125 0,1 *01301 0,02 0,025 0,02 *01302 0,45 0,25 0,36 *01303 0,02 0,025 0,02 *01701 0 0,025 0,01 *02101 0 0,025 0,01 *02201 0 0,025 0,01 *02301 0,09 0,1 0,1 *02401 0 0,025 0,01 *03201 0,02 0 0,01

Tabla 3.17. Valores estimados de heterocigosidad esperada (he) y observada (ho) para el exón 2 del gen DLA-DQB 1 detectados en los grupos caso y control y la población total.

Grupo he ho FIS (valor de p) CASO 0,75 0,667 0,11 (0,0284)

CONTROL 0,844 0,6 0,29 (<0,00001) Total 0,81 0,64 High sign

En los tres exones 2 analizados no se observó un aumento significativo de

homocigosis en el grupo caso con respecto al grupo control (p < 0,05). En los tres exones 2

tipificados se observaron niveles elevados de diversidad genética, en los grupos caso y

control, suficientes para poder llevar a cabo los subsiguientes estudios de asociación.

82

3.2.4. Análisis de los haplotipos de la región presentadora de antígenos Para determinar los haplotipos compuestos por las tres regiones presentadoras de

antígenos de utilizó el análisis multilocus del software Pypop. Se encontraron en la

muestra un total de 11 haplotipos, 9 en el grupo caso y 6 en el grupo control (Tabla 3.18)

con una frecuencia haplotípica entre 0,1 y 0,43 en la población total.

Tabla 3.18. Haplotipos DRB1/DQA1/DQB1. Frecuencias haplotípicas en el grupo caso, control y población total. Haplotipo DRB1/DQA1/DQB1 CASO CONTROL TOTAL

1 01101/00201/01302 0,53 0,32 0,43 2 01501/00601/00301 0,13 0,12 0,125 3 00101/00101/00201 0,11 0,32 0,2 4 01501/00601/02301 0,11 0,12 0,11 5 01501/00201/01302 0,03 0 0,01 6 02001/01501/08011 0,03 0 0,01 7 02001/00401/08011 0,03 0 0,01 8 00101/01501/00802 0,03 0 0,01 9 01601/00401/00802 0,03 0 0,01 10 01501/00101/00201 0 0,03 0,01 11 01501/00601/00802 0 0,09 0,04

3.3. Análisis de asociación. 3.3.1. Microsatélites.

Debido a que los microsatélites genotipados presentaron un alto número de alelos,

muchos de los cuales se detectaron a muy baja frecuencia génica se utilizaron para hacer la

asociación los alelos que estaban más representados en la población. Los resultados

obtenidos mostraron una asociación significativa entre los alelos FH2054*172 (valor de p

=0,02) y el FH2975*320 (valor de p = 0,005) y el desarrollo de la QSC. En el caso del alelo

FH2054*172, solo se presentó en los animales enfermos en una frecuencia de 0,12 y

presentó un OR=6,55, con IC 95%=0,8-251. El microsatélite FH2975*320 se presentó en

una frecuencia significativamente mayor en el grupo caso (0,47) que en grupo caso, con un

valor de OR=3,27 con IC 95%=1,42-9,44. El microsatélite FH2202 no evidenció

83

asociaciones significativas con QSC en la población de ovejeros animales en estudio (Tabla

3.19).

Tabla 3.19. Análisis de asociación entre el desarrollo de QSC y los alelos de los microsatélites FH2054, FH2975 y FH2202.OR (Odds ratio). IC (Intervalo de confianza). En negrita se marcaron los valores significativos.

Alelo

Frecuencia alélica Test

exacto de

Fisher

(valor de

p)

OR 95% IC

Caso

Control

FH2054*148 0,06 0 0,14 3 0,37-133

FH2054*152 0,4 0,38 1 0,99 0,5-2,24

FH2054*156 0,06 0,12 0,3 0,38 0,14-1,68

FH2054*164 0,15 0,14 1 1 0,33-3,56

FH2054*168 0,2 0,36 0,09 0,42 0,2-1,05

FH2054*172

0,12

0 0,02 6,55 0,8-251

FH2975*300 0,02 0,11 0,09 0,12 0,03-1,33

FH2975*312 0,02 0,11 0,09 0,12 0,03-1,33

FH2975*320 0,47 0,18 0,005 3,27 1,42-9,44

FH2975*324 0,02 0,11 0,09 0,12 0,03-1,33

FH2975*348 0,17 0,05 0,09 2,45 0,75-13,4

FH2975*352 0,05 0,16 0,01 0,24 0,08-1,24

FH2202*397 0,05 0,04 1 0,82 0,22-6,22

FH2202*401 0,14 0,125 1 0,94 0,36-3,3

FH2202*405 0,017 0,08 0,17 0,15 0,04-1,7

FH2202*413 0,14 0,083 0,54 1,38 0,5-5,6

FH2202*429 0,24 0,23 1 0,95 0,43-2,58

FH2202*433 0,17 0,1 0,4 1,48 0,56-5,2

FH2202*457 0 0,06 0,08 0 0,005-2,2

84

Evaluando la hipótesis de que la homocigosis aumenta el riesgo a desarrollar QSC,

se realizó el análisis de asociación entre la homocigosis de los tres microsatélites y la

enfermedad. En ninguno de los casos de observaron diferencias significativas (Tabla 3.20).

Tabla 3.20. Análisis de asociación entre el desarrollo de QSC y la heterocigocidad observada (ho) para los alelos de los microsatélites FH2054, FH2975 y FH 2202. OR (Odds Ratio). IC (Intervalo de confianza).

Microsatélite Ho Test exacto de Fisher (valor de p)

OR 95% IC

Caso Control FH2054 0,56 0,64 0,59 0,7 0,4-2,32 FH2975 0,78 0,65 0,37 1,93 0,59-6,51 FH2202 0,79 0,7 1,55 0,43 0,43-5,8 3.3.2. Región Reguladora Proximal de los genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1 La asociación entre la QSC y los alelos/haplotipos de las regiones promotoras de los

genes los tres genes de clase II del DLA se evaluó utilizando un clásico estudio de caso-

control. La frecuencia de cada alelo dentro de cada grupo, caso y control, se comparó

utilizando el Test exacto de Fisher y Odds ratio (OR),

Para el gen DLA-DRB 1 se estimó la frecuencia de cada alelo dentro de cada grupo y se

las comparó utilizando el Test exacto de Fisher y Odds ratio (OR), con un intervalo de

confianza de 95% (ver tabla 3.21). En ninguno de los dos se apreciaron diferencias

significativas entre los grupos.

En el caso del gen DLA-DQA1, los alelos se encontraron casi fijados en el SNP DQA1*-

85 [A/T] y fijado en el DQA1* 38 [C/T], el alelo T y el alelo C respectivamente. Debido a

esto no se pudo asociar este gen al desarrollo de QSC (Tabla 3.21)

En el gen DLA-DQB1 se observaron diferencias significativas en las frecuencias del

SNP DQB1*-154 [C/T], con un valor de p de 0,016 y un OR de 3, donde la variante T

aumentaría el riesgo a desarrollar QSC (Tabla 3.21). Este resultado se confirmó cuando se

realizó la asociación entre los haplotipos de la región promotora y QSC. El haplotipo URR-

DQB*TATC, el único que contiene la variante T del SNP DQB1*-154 [C/T], estuvo

85

significativamente asociado con la QSC (p = 0,006), incrementando tres veces el riego de

desarrollar la enfermedad (OR= 3, 08%, IC = 1,43- 8) (Tabla 3.22)

Tabla 3.21. Frecuencias alélicas estimadas en los grupos caso y control para los promotores de los genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 and DLA-DQB1. La frecuencia de cada alelo dentro de cada grupo se comparó utilizando el Test exacto de Fisher y Odds ratio (OR). IC (Intervalo de confianza). ND (no determinado).

Polimorfismo Frecuencia génica Test exacto de Fisher

(valor de p)

OR 95% IC Caso Control

DRB1*-128 [C/T] 0.73/0.27 0.6/0.4 0.19 0.54 0.22-1.3 DRB1*69 [C/T] 0.69/0.31 0.56/O.44 0.33 0.58 0.22-1.53 DQA1*-85 [A/T] 0/1 0.06/0.94 0.38 Inf 0.04-inf DQA1* 38 [C/T] 1/0 1/0 1 ND ND

DQB1*-272 [TAAC/ - ] 0.1/0.9 0.18/0.82 0.66 0.47 0.05-2.89 DQB1*-256 [G/T] 1/0 1/0 1 ND ND DQB1*-170 [G/A] 0.38/0.66 0.52/0.48 0.2 1.8 0.76-4.4 DQB1*-154 [C/T] 0.45/0.55 0.72/0.28 0.016 3 1.25-7.68 DQB1*-105 [A/T] 0.98/0.02 1/0 0.47 ND ND

DQB1-87 [C/T] 0.28/0.72 0.44/0.56 0.17 2 0.81-5.1 DQB1*-71[C/T] 0.8/0.2 0.68/0.32 0.22 0.53 0.19-1.4 DQB1*46 [G/A] 1/0 1/0 1 ND ND

Tabla 3.22. Frecuencia haplotípica estimada en el grupo caso y control para los promotores de los genes DLA-DRB1 y DLA-DQB1. La frecuencia de cada haplotipo dentro de cada grupo fue comparada usando el test exacto de Fisher y Odds ratio (OR). IC (Intervalo de confianza). ND ( no determinado). Haplotipo Frecuencia haplotípica Test exacto de

Fisher (valor de p)

OR 95% IC

Caso Control URR-DRB1*CC 0,36 0,26 0,67 0,79 0,34-1,83 URR-DRB1*TT 0,2 0,18 0,67 0,79 0,34-1,83 URR-DQB*TATC 0,54 0,25 0,006 3,08 1,43- 8 URR-DQB*CACC 0,23 0,40 0,07 0,4 0,18- 1,05 URR-DQB*CATT 0,17 0,29 0,22 0,45 0,19-1,31 URR-DQB*CACT 0,04 0,045 1 0,53 0,13-4,97 URR-DQB*CTCT 0,02 0 1 0,85 0,1-65,25

86

Se evaluó la hipótesis de que la homocigosis de los genes del MHC incrementa el

riesgo de susceptibilidad a las enfermedades autoinmunes independientemente de la

combinación de alelos presentes. Para confirmarlo se estimaron las ho, he y el HWE en toda

la muestra y dentro de cada grupo (caso y control). Además, se calculó el OR para

comparar los rangos de genotipos homocigotas/heterocigotas en ambos grupos. Los

resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3.23. Aunque todos los SNPs de las regiones

reguladoras se encontraban en HWE tanto en los grupos caso como en el de animales

controles, los resultados mostraron que los perros homocigotas para DRB1*69 [C/T]

poseían más riesgo para desarrollar QSC que los perros heterocigotas (p = 0.048; OR = 4.2,

95% CI = 1.07-18.21, Tabla 3.23). Estos resultados se encuentran en concordancia con los

resultados reportados previamente por Jokinen y colaboradores (2011). Para el resto de los

polimorfismos no se observaron diferencias significativas.

87

Tabla 3.23. Análisis del equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) para cada polimorfismo de los promotores de los genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1 dentro de los grupos caso y control utilizando el índice FIS .Las proporciones de homocigotas/heterocigotas entre ambos grupos fueron comparadas mediante el test exacto de Fisher y Odds ratio (OR). IC (Intervalo de confianza). ND (no determinado).

Polimorfismo HWE FIS – p Caso

HWE FIS – p

Control

Test exacto de Fisher (valor de p)

OR 95% IC

DRB1*-128 [C/T] 0.16-0.65 -0.39-0.09

0.14 2.83 0.86 – 9.96

DRB1*69 [C/T] 0.16-0.65 -0.39- 0.09

0.048 4.2 1.07 - 18.21

DQA1*-85 [A/T] -0.02-1 ND 1.00 1.21 0.01 - 100.77

DQA1* 38 [C/T] ND ND ND ND ND DQB1*-272 [TAAC/ - ] 1-0.033 ND

ND ND ND

DQB1*-256 [G/T] ND ND 1 0 0 – inf DQB1*-170 [G/A] -0.23-0.4 -0.27 -0.36

0.76 1.26 0.36 - 4.42

DQB1*-154 [C/T] -0.07-1 0.1 -1

0.07 3.48 0.99 - 13.47

DQB1*-105 [A/T] ND ND 0.47 0 0 - 35.6

DQB1-87 [C/T] -0.1- 1 -0.18-0,63

0.76 1.32 0.4 – 4.57

DQB1*-71[C/T] 0.07- 1 0.47-0.06

0.5 0.58 0.12 – 2.4

DQB1*46 [G/A] ND ND ND ND ND

3.3.3. Segundo exón de los genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1

La asociación entre la QSC y los alelos/haplotipos de las regiones presentadoras de

antígenos de los tres genes de clase II del DLA se evaluó utilizando un clásico estudio de

caso-control. Con este propósito, se estimaron las frecuencias alélicas y la heterocigocidad

observada y esperada dentro de los grupos caso y control de los tres genes DLA-DRB1,

DLA-DQA1 y DLA-DQB1 (Tabla 3.24). Los resultados obtenidos mostraron una

asociación significativa entre el desarrollo de QSC y el alelo DLA-DQA1*00101 (p =

88

0,013, OR= 0,12, IC 95%=0,04-0,75), lo que sugiere un menor riesgo a presentar la

enfermedad en los animales portadores de esta variante (alelo protector). El resto de los

polimorfismos no mostraron asociaciones significativas. Como en el caso de las regiones

reguladoras de estos loci, también se evaluó la hipótesis de que la homocigosis de los genes

del MHC incrementa el riesgo de susceptibilidad a la QSC. Para confirmarlo se estimaron

las heterocigocidades dentro de cada grupo (caso y control). Sin embargo, no se observó

asociación significativa entre la heterocigocidad y la QSC en ninguno de los tres genes

(Tabla 3.25).

Tabla 3.24. Análisis de asociación entre el desarrollo de QSC y los alelos de los exones 2 de los genes DLA-DRB1, -DQA1 y DQB1. OR (Odds ratio). IC (Intervalo de confianza). En negrita se marcan los valores significativos.

Alelo

Frecuencia alélica Test exacto

de Fisher

(valor de p)

OR 95% IC

Caso

Control

DLA-DRB1*01101 0,48 0,4 0,65 1,17 0,53-3,15

DLA-DRB1*01501 0,23 0,18 0,78 1,14 0,45-3,99

DLA-DRB1*00101 0,11 0,03 0,22 2 0,48-20

DLA-DQA1*00101 0,05 0,28 0,013 0,12 0,04-0,75

DLA-DQA1*00201 0,41 0,46 0,48 1,35 0,6-3,72

DLA-DQA1*00401 0,09 0,11 0,7 1,05 0,32-6,11

DLA-DQA1*00601 0,26 0,25 0,79 0,72 0,3-2,25

DLA-DQB1*00201 0,2 0,12 0,09 0,03 0,11-1,09

DLA-DQB1*00301 0,1 0,12 1 0,9 0,3-4,25

DLA-DQB1*01302 0,36 0,45 0,06 2,18 0,97-6

DLA-DQB1*02301 0,1 0,09 1 0,7 0,22-3,6

DLA-DQB1*00802 0,1 0,07 0,46 0,42 0,14-2,36

89

Tabla 3.25. Análisis de asociación entre el desarrollo de QSC y la heterocigocidad observada (ho) para los alelos de los exones 2 del gen DLA-DRB1, DLA-DQA1, DLA-DQB1. OR (Odds Ratio). IC (Intervalo de Confianza).

Exón 2 ho Test exacto de Fisher

(valor de p)

OR 95% IC Caso Control

DLA-DRB1 0,667 0,733 0,72 0,72 0,16-3,13

DLA-DQA1 0,57 0,591 1 0,93 0,22-3,9

DLA-DQB1 0,667 0,6 0,75 1,33 0,37-4,76

En conclusión, en los tres grupos de marcadores utilizados (microsatélites, regiones

reguladoras proximales y exones 2) para el estudio de asociación se observaron alelos

asociados significativamente con el desarrollo de la QSC, evaluados por separado. Luego se

determinó el desequilibrio de ligamiento (LD, en valores de D´) entre todos los loci

utilizando el software Pypop (Tabla 3.26). Del análisis multilocus de los tres microsatélites

se obtuvieron 141 haplotipos diferentes, con frecuencias haplotipicas entre 0,014 y 0,06 por

lo que no fueron muy útiles para realizar un estudio de asociación. Es por esta razón que se

procedió a realizar los estudios de asociación entre los haplotipos conformados por los

alelos de las regiones presentadoras de antígenos de los tres genes de clase II y el desarrollo

de QSC. Este análisis puso en evidencia diferencias significativas entre los grupos caso y

control en la distribución del haplotipo 3 (p=0,02, OR=0,2, IC 95%=0,07-0,81; Tabla 3.27),

debido a que esta combinación resultó ser significativamente más frecuente en los

individuos sanos que en los enfermos, los resultados obtenidos sugerirían un rol protector

para el desarrollo de QSC. Este resultado coincide con los resultados de la asociación con

los exones 2 en forma individual, ya que este haplotipo contiene el alelo protector DLA-

DQA*00101 (Tabla 3.27, Figura 3.4).

90

Tabla 3.26. Desequilibrio de ligamiento medido en D´ entre todos los loci analizados

(Pypop software).

Pares de loci Desequilibrio de Ligamiento [D´] Población

total Caso Control

URR-DRB1/DRB1 exón2 0,87 0,85 1 DRB1 exón2/DQA1 exón2 0,8 0,91 0,86 DQA1 exón2/URR-DQB1 0,6 0,77 0,63 URR-DQB1/DQB1 exón2 0,8 0,92 0,67

DQB1 exón2/FH2202 0,73 0,84 0,8 FH2202/FH2975 0,82 0,8 0,87 FH2975/FH2054 0,56 0,6 0,7

Tabla 3.27. Análisis de asociación entre el desarrollo de QSC y los haplotipos conformados por las regiones presentadoras de antígenos de los genes de clase II DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1. OR (Odds ratio). IC ( Intervalo de confianza). En negrita se marca el valor significativo.

Haplotipo Frecuencias haplotípicas

Caso Control

Test exacto de Fisher

(valor de p)

OR 95% IC

1 01101/00201/01302 0,53 0,32 0,6 2,32 1,002-6,59 2 01501/00601/00301 0,13 0,12 1 1,04 0,2-5,74 3 00101/00101/00201 0,11 0,32 0,02 0,2 0,07-0,81

4 01501/00601/02301 0,11 0,12 1 0,63 0,2-3,27

91

Figura 3.4. Distribución de los haplotipos detectados en los grupos caso y control. Se marcó con una flecha el haplotipo 3, el cual evidenció diferencias significativas (haplotipo protector).

Para finalizar se evaluó la asociación entre los haplotipos conformados por la región

reguladora proximal y su correspondiente región presentadora de antígenos (exón 2) del

gen DLA-DQB1y el riesgo a desarrollar QSC. La determinación de estos haplotipos y de

sus frecuencias alélicas se llevó a cabo usando el software Pypop. Cabe mencionar que solo

se tuvieron en cuenta las combinaciones más representadas, y que en este caso los loci

analizados presentaban un LD = 0,92 (D´). Los resultados de asociación obtenidos

mostraron diferencias significativas entre el haplotipo URR-DQB*TATC/*01302 y el

desarrollo de QSC (p=0,003, OR=4,56, 95% IC=1,74-16,53) (Tabla 3.28), lo que sugiere

que los animales portadores de esta combinación poseen cinco veces más riesgo a

desarrollar QSC.

92

Tabla 3.28. Frecuencias haplotípicas de las regiónes promotoras y presentadoras de antígenos del gen DLA-DQB1 (URR-DQB/exón 2 DQB1) y análisis de asociación. OR (Odds Ratio). IC (Intervalo de Confianza).

Haplotipo Frecuencia haplotípica

Test exacto de Fisher (valor de

p)

OR 95% IC

Caso Control URR-DQB*TATC/*01302 0,5 0,15 0,003 4,56 1,74-16,53 URR-DQB*CACC/*00301 0,15 0,12 0,25 0,24 0,072-1,58 URR-DQB*CATT/*00201 0,06 0,16 1 1 0,33-4,85 URR-DQB*CACC/*02301 0,09 0,06 1 1 0,26-7,87

93

4- DISCUSIÓN

94

4- DISCUSIÓN

En cuanto al estudio retrospectivo realizado colaboración con Servicio de Clínica de

Pequeños Animales, Hospital de Clínicas (Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad

Nacional de La Plata) se recolectó información de pacientes caninos sobre edad, sexo, raza

y motivos de consulta (n = 752), en un período comprendido entre el año 2009 y 2011.

Como resultado de este relevamiento se observó una incidencia de la QSC de 5,46%.

Dentro de este grupo de animales el 78% eran de la raza ovejero alemán. La edad de

presentación promedio fue 5,5 años. Dentro los caninos afectados, la relación hembra:

macho fue de 1,15:1. Este estudio confirma que el Ovejero Alemán, una de las principales

razas que se crían en nuestro país, es la raza más afectada por QSC. Además, cabe destacar

que la QSC es una de las enfermedades de origen genético más importante en esta raza. En

cuanto a la predisposición sexual, se muestran diferencias con los autores Gelatt (1999),

Bedford (1981) y Maggs (2009) quienes reportan que las hembras están más afectadas que

los machos. Por el contrario, en este estudio no se observó diferencias en la predisposición

a desarrollar QSC entre hembras y machos. La edad promedio de presentación fue de 5,5

años, coincidente con reportes anteriores donde se informó un rango etario de entre 1 y 6

años de edad en Ovejeros Alemanes (Jokinen y col., 2011).

Estudios previos han propuesto que la QSC es una enfermedad autoinmune. Entre las

evidencias que apoyan esta hipótesis se encuentra el hecho que se ha reportado la

sobreexpresión de los genes de clase II en las corneas afectadas (Williams, 2005). Además,

la importancia de la respuesta inmune anómala en el desarrollo de la enfermedad queda en

evidencia por su respuesta al tratamiento con fármacos inmunosupresores como los

corticoides y ciclosporina (Pérez, 2004). Es por esta razón que para el estudio de asociación

entre polimorfismos genéticos y el desarrollo de la QSC se seleccionó la región del DLA de

clase II ubicada en el cromosoma 12 canino, debido a que estos genes codifican a los

receptores más efectivos en la presentación de antígenos propios, los cuales activan a los

linfocitos T autoreactivos. Por lo tanto, los loci de clase II presentadores de antígenos, tales

como los genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1, son los principales genes

candidatos para estudiar las enfermedades autoinmunes (Day y Shultz, 2014). Por otra

parte, numerosos trabajos han reportado asociaciones significativas entre loci de clase II y

enfermedades autoinmune en humanos, animales de experimentación y animales

95

domésticos (Ollier y col., 2001; Kennedy, 2006; Kennedy, 2007; Wilbe y col. , 2010; It y

col., 2010; Quinnell y col., 2003, Kasper y col., 2014 ). Entre ellas pueden mencionarse el

Lupus eritematoso sistémico, la enfermedad de Addison y Diabetes Mellitus, de gran

importancia debido a las similitudes fisiopatológicas con la especie humana. Basado en

estas evidencias, en el presente trabajo de Tesis Doctoral se eligieron tanto las regiones

promotoras proximales como las regiones presentadoras de antígenos de los genes de clase

II DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1. Estos genes son los tres genes funcionales de

clase II canino que presentan mayor nivel de polimorfismo. Además, el estudio se

complementó con la tipificación de tres microsatélites cercanos a estas regiones (Figura

2.4).

En una primera etapa se tipificaron tres microsatélites ubicados próximos a la región

de clase II del DLA. Los resultados obtenidos en este análisis mostraron que, si bien los tres

marcadores genéticos elegidos presentaron variabilidad alélica, la mayoría de los alelos

detectados evidenciaron una baja frecuencia en la población estudiada. Por esta razón se

realizaron los estudios de asociación para las variantes que al menos estaban en una

frecuencia mayor a 0,1, dos de los tres microsatélites elegidos mostraron una asociación

significativa con el desarrollo de la QSC. En este sentido, alelos de los STRs FH2054

(FH2054*172) y FH2975 (FH2975*320) presentaron asociaciones significativas con un

mayor riesgo a desarrollar QSC. Por el contrario, no se observaron asociaciones

significativas con el microsatélite FH2202, a pesar de ser el marcador genético más

cercano a la región de clase II del DLA. Los resultados obtenidos a partir de la

genotipificación de los microsatélites constituyen una primera aproximación para apoyar la

hipótesis que genes de la región cromosómica de clase II del DLA estarían asociados al

desarrollo de QSC. Esto afirmación sería confirmada posteriormente con la tipificación de

los genes de clase II (regiones reguladora proximal y presentadora de antígenos), lo cual se

discutirá más adelante.

En una segunda etapa se evaluaron los polimorfismos (SNPs e INDELs) dentro de

dos regiones de importancia funcional para los genes de clase II, las que están involucradas

en la regulación de la expresión génica y en el reconocimiento y presentación de los

antígenos. En la población de ovejeros alemanes estudiada se detectaron con frecuencias

apreciables los dos alelos reportados para el promotor del gen DLA-DRB1. Trabajos

96

previos mostraron que el alelo DRBp*1 (variante C del DRB1*-128 [C/T]) es el más

común en perros y está fijada en algunas razas (por ej., Rottweiler, Airedale Terrier, Irish

Setter, Cocker Spaniel y Boston Terrier). De todas maneras, los resultados obtenidos están

en concordancia con los datos reportados en la raza ovejero alemán (C = 0,58 y T = 0,42;

Berggren y Seddon, 2005). En cuanto a los SNPs que fueron reportados en perros y lobos

en el gen DLA-DQA1, el primero corresponde a una transversión A/T localizada en una

TATA Box en posición−85 dentro del promotor y el segundo a una sustitución sinónima en

la posición 69 del exón 1 del gen. Los alelos T del SNP DQA1*-85 [A/T] y C del SNP

DQA1* 38 [C/T] fueron las variantes más comunes en perros, mientras que los alelos A del

SNP DQA1*-85 [A/T] y T del DQA1* 38 [C/T] solo fueron identificados en las razas

Doberman Pinscher, English Springer Spaniel y Saluki. Por lo tanto, estas variantes no

estaban reportadas en el ovejero alemán (Berggren y Seddon, 2005). En concordancia con

los estudios previos, el análisis de la población de ovejeros alemanes de nuestra región

mostró que el alelo C del DQA1* 38 [C/T] estaba fijado, mientras que la variante T del

SNP DQA1*-85 [A/T] se encontraba cercano a la fijación. La variante A del DQA1*-85

[A/T] solo se observó en dos animales heterocigotas (frecuencia alélica = 0,02). La

ausencia de esta variante en ovejeros alemanes en los reportes previos podría deberse a

efectos de muestreo. Por otra parte, la baja variabilidad del promotor de este gen con

respecto a otras razas caninas puede explicarse por los altos niveles de diferenciación

interracial y por lo bajos niveles de diversidad intraracial producto de la alta

consanguinidad, reducido número de individuos fundadores, al tamaño efectivo de la

población y a la presencia de barreras raciales. Esto ha llevado a que muchos SNPs solo

presenten polimorfismos en algunas razas o grupos raciales. Esto se ve reflejado en la

distribución de las enfermedades de origen genético en esta especie. Aunque este patrón es

común en las especies domésticas, es mucho más marcado en la especie canina (van

Steenbeek y col., 2016).

Berggren y Seddon (2005) reportaron siete SNPs y dos INDELs en el gen DLA-

DQB1 en diferentes razas de perros y el lobo, siendo el SNP DQB1*46 [G/A] especifico

del lobo. Esto último explicaría porque en el presente estudio no se detectó la mutación

A/G (no sinónima) en la posición 46 del exón 1 del gen DLA-DQB1. Además, tampoco, se

observaron nuevos polimorfismos para este locus. Los resultados obtenidos coinciden con

97

los reportados previamente, ya que se detectaron los mismo polimorfismos con frecuencias

similares, con excepción del INDEL DQB1*-272 [TAAC/-] (Berggren y Seddon, 2005).

Esta inserción se encontró en muy baja frecuencia en la población de ovejeros alemanes

estudiada, en contraste con lo reportado en Escandinavia donde ambas variantes

presentaban frecuencias alélicas similares (Berggren y Seddon, 2005).

Los resultados obtenidos del análisis de LD permitieron identificar dos bloques

haplotípicos. Este hecho es esperable debido a que a pesar de que los genes de clase II del

DLA encuentran próximos en el cromosoma 12 canino, se ha reportado que en los genomas

de mamíferos solo se alcanza un alto LD a distancias genéticas muy pequeñas (< 100 kb;

Goddard y Hayes, 2012; Axelsson, 2012). En este sentido, los genes DLA-DRB1 y DLA-

DQA1 se encuentran a una distancia genética de aproximadamente 70 kb, mientras que

entre el DLA-DQA1 y el DLA-DQB1 hay una distancia de aproximadamente 30 kb, por lo

que la distancia total entre los genes más alejados (100 kb) es lo suficientemente grande

para que se pierda el LD por efecto de la recombinación. Como consecuencia de ello, los

dos bloques detectados estaban conformados por polimorfismos de un mismo gen (DLA-

DRB1 y DLA-DQB1). En el caso del gen DLA-DRB1, los haplotipos detectados

corresponden a los alelos reportados previamente: DLA-DRB1*1 y DLA-DRB1*2. En

cuanto al gen DLA-DQB1, se detectaron los haplotipos DLA-DQBp*2, DLA-DQBp*3,

DLA-DQBp*6 y DLA-DQBp*7, que fueron reportados previamente por Berggren y

Seddon (2005). Además, se detectó el haplotipo DLA-DQBp*4 (denominado en el presente

estudio DLA-URR-DQB*CATT) con una frecuencia génica de 0,2, siendo identificado por

primera vez en la raza Ovejero alemán. Como se discutió anteriormente, estas diferencias

entre poblaciones de ovejeros alemanes de distintas regiones geográficas pueden ser

consecuencia de la estructura y dinámica poblacional característica de las razas caninas.

Finalmente, cabe mencionar que la fase de ligamiento del gen DLA-DQA no pudo ser

analizada debido a que casi todos los animales presentaron genotipos homocigotas para el

mismo genotipo para ambos SNPs. En este caso, también los resultados obtenidos

concuerdan con lo observado en otras poblaciones de ovejeros animales.

Las variaciones en los niveles de la respuesta inmune entre individuos/poblaciones

han sido explicadas mediante diferentes mecanismos, tales como diferencias en el

reconocimiento y presentación de antígenos, en los niveles de expresión génica y en el

98

grado de homocigosis (Fernando y col., 2008). La expresión de las moléculas del MHC de

clase II está principalmente regulada a nivel transcripcional por un proceso complejo que

involucra secuencias altamente conservadas localizadas en las regiones reguladoras de los

genes de clase II. Estas unidades reguladoras comprenden a seis secuencias (S, X, X2, Y,

CCAAT y TATA boxes), que están altamente conservadas en los vertebrados

(Handunnetthi y col., 2010). Estas secuencias representan sitios de interacción con factores

de transcripción nucleares como NF-YB, NF-YC, RFX5, RFXANK y CREB-1, los cuales

forman un “transcriptosoma” con el transactivador de clase II (CIITA) y median el control

transcripcional (Ting y col., 2002). Además, estas secuencias regulatorias son necesarias

para la correcta expresión constitutiva e inducidas por citoquinas. Por lo tanto, los

polimorfismos a ese nivel podrían tener consecuencias funcionales en su actividad

transcripcional (Louis y col., 1994; Singal y col., 1994, 1996; Janitz y col., 1997).

La sobreexpresión de las moléculas del MHC de clase II que ocurre en la QSC, la

cual está regulada por el IFN-gamma secretado por el infiltrado celular de linfocitos T

CD4+, que reconoce las regiones reguladoras a través de un complejo de factores de

transcripción haciendo que células como fibroblastos o epiteliales expresen moléculas de

clase II como si fueran “celulas presentadoras de antígenos temporarias” (Andersen y col.,

1991; Williams, 2005). Considerando tanto esto como el rol de las regiones reguladoras en

el control transcripcional, se puede suponer que los polimorfismos dentro de las cajas

regulatorias podrían modificar los niveles de expresión génica y por lo tanto la respuesta

inmune. De todos los polimorfismos detectados en el presente estudio solo dos se localizan

dentro de secuencias de reconocimiento de factores de transcripción: SNP DQB1*-154

[C/T] y SNP DLA-DQA1*-85[A/T]. El SNP DQB1*-154 [C/T] está localizado en el

extremo 3’ de la caja reguladora X2, y además, evidenció una asociación significativa con

un mayor riesgo a desarrollar QSC. Por lo que se podría hipotetizar que el cambio en la caja

regulatoria X2 podría afectar el nivel y/o patrón de expresión del gene clase II DLA-DQB1

en la QSC, y de esta forma explicar la asociación observada. De todas maneras, el rol

funcional de este sitio polimórfico necesita ser confirmado por estudios de expresión

génica. Cabe recordar que el SNP DLA-DQA1*-85[A/T] se encuentra en la caja regulatoria

Y del promotor, pero que en este caso el polimorfismo no fue informativo debido a que se

su variante T se encuentra prácticamente fijada en la raza estudiada.

99

Varios estudios muestran que la heterocigosidad confiere una ventaja contra

enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes en diferentes especies de

mamíferos, como por ejemplo humanos y bovinos (Thursz y col., 1997; Hraber y col.,

2007; Takeshima y col., 2008), En caninos, se asoció la homocigosis de los genes DLA

case II a la mayor predisposición a desarrollar enfermedades autoinmunes, como en SLE,

Enfermedad de Addison (Hughes y col., 2010; Wilbe y col., 2010). En este sentido, Jokinen

(2011) asoció los niveles de homocigosis con un mayor riesgo o predisposición a

desarrollar QSC (OR: 4,37; p = 0,02). Sin embargo, en este estudio no se observaron

asociaciones significativamente entre la homocigocidad y la mayoría de los marcadores

utilizados, que un mayor riesgo al desarrollo de la enfermedad. La excepción a esto fue el

SNP DRB1*69 [C/T] localizado al inicio del exón 1 del gen DLA-DRB1. En este caso los

perros homocigotas para este polimorfismo poseían más riesgo para desarrollar QSC que

los perros heterocigotas (p = 0.048; OR = 4.2, 95% CI = 1.07-18.21).

El análisis de los polimorfismos del exón 2 (región presentadora de antígenos, ARS)

de los genes DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA–DQB1 presentó suficiente variabilidad

genética, tanto en el grupo caso como control, como para realizar el estudio de asociación.

Sin embargo, solo se detectaron 15 de los 52 haplotipos reportados para el gen DLA-

DRB1, 7 de los 16 alelos reportados para el gen DLA-DQA1 y 13 de los 36 alelos

reportados para el gen DLA-DQB1. Además, en los tres genes se observaron diferencias

significativas con las proporciones esperadas del HWE atribuidas a la elevada homocigosis.

Esto es esperable debido a diferentes factores genéticos poblacionales. El reducido número

de animales fundadores y la presencia de barreras raciales han tenido como consecuencias

que la excepcional variabilidad genética de estos genes de clase II esté fraccionada entre las

diferentes razas o grupos raciales. Es por esta razón, que por ejemplo en el caso de los

genes analizados se detectaron aproximadamente un tercio de los alelos reportados

(Hedrick, 2005). Este efecto no se ve tan marcado en el caso de los SNPs bialélicos, como

por ejemplo el promotor del gen DLA-DRB1. Por otra parte, dentro de cada raza la

población usualmente está dividida en criaderos de pocos reproductores, por lo que el

aumento significativo de la homocigosis observado en el presente estudio podría deberse al

efecto Wahlund. El uso de uno o unos pocos reproductores machos portadores de una pocas

variantes en particular produce su aumento en esta subpoblación con respecto al resto,

100

produciendo variaciones entre las frecuencias alélicas de los diferentes criaderos. Esta

explicación puede ser aplicada a la muestra analizada ya que los animales incluidos

provienen de diferentes criaderos y explicaría que la mayoría de los marcadores se

encuentren en desequilibrio de HWE. Además, este efecto podría enmascarar la mayor

predisposición de los homocigotas a desarrollar QSC.

En cuanto a la distribución haplotípica dentro de la población de estudio se hallaron

11 haplotipos de los exones 2 DLA-DRB1/DLA-DQA1/DLA-DQB1 en el total de la

población, pero solo cuatro con una frecuencia apreciable para hacer los estudios de

asociación. Las variantes más comunes halladas en otros países coinciden con las

encontradas en este estudio. La frecuencia del haplotipo más común en ovejeros alemanes,

DLA-DRB1*01101/DQA1*00201/DQB1*01302 fue de 0,43, mientras que en otras

poblaciones como las de Estados Unidos, Reino Unido y Finlandia, fue en promedio del 0,4

(Tsai y col., 2013; Wilbe y col., 2010; Jokinen, 2011).

Una vez genotipados los animales para los exones 2 de los tres genes, se realizó el

análisis de asociación entre los polimorfismos de esta región y el desarrollo de QSC con el

clásico diseño de caso-control. Se observaron diferencias significativas solo entre el

haplotipo DRB1*00101/DQA1*00101/DQB1*00201 y el desarrollo de QSC, indicándolo

con haplotipo protector. Sin embargo, el haplotipo de riesgo

DRB1*01501/DQA1*00601/DQB1*00301 reportado por Jokinen (2011), presentó en este

estudio una frecuencia génica de 0,125 en la población total y no evidenció diferencias

significativas entre los grupos caso y control. Mientras que en otras poblaciones de ovejeros

alemanes presentaron una frecuencia alélica de 0,27 (Tsai y col., 2013, Jokinen y col.,

2011). Estas diferencias dentro de la misma raza pero en poblaciones diferentes pueden

deberse a las diferentes presiones de selección que hayan recibido (Clatworthy y col., 2007).

Finalmente, se evaluó el haplotipo conformado por las regiones reguladoras y el exón

2 del gen DLA-DQB1. Este tipo de análisis no se ha hecho en otros trabajos de asociación

entre enfermedades inmunomediadas y el MHC clase II. Se encontró una asociación

significativa entre el haplotipo URR-DQB*TATC/*01302 (p=0,003) y la enfermedad,

aumentando el riesgo a desarrollar QSC en 5 veces. Cabe recordar el promotor URR-

DQB*TATC también evidenció una asociación significativa cuando fue analizado en

forma independiente y que el alelo *01302, el más frecuente en la raza OA, mostró un valor

101

de p cercano al límite de significancia (p = 0,06). Además, estos dos loci mostraron valores

de LD cercanos al ligamiento completo (D’ = 0,92) en el grupo caso. Es por estas razones

que la asociación del haplotipo URR-exon 2 podría explicarse teóricamente como una

sinergia entre el promotor y el exón 2, relacionado al número de transcriptos expresados del

gen conjuntamente a una mayor eficiencia en el reconocimiento del antígeno. En este este

sentido, Cowell (1998) y Mitchison y Roes (2002) sugirieron que la co-evolución entre

estas dos regiones del gen pueden haber sido consecuencia de una selección favorable hacia

alguna otra característica. El análisis de los polimorfismos en las regiones presentadoras de

antígenos (exón 2) son críticas en el estudio de las enfermedades inmunomediadas ya que

determinan los motivos aminoacídicos de los sitios de unión a antígenos presentes en los

bolsillos de las moléculas presentadoras del MHC. La importancia de las variaciones a

nivel aminoacídico fue confirmada en trabajos que analizaron las asociaciones entre la

estructura proteica de las moléculas del MHC y el reconocimiento y la presentación de

antígenos, por lo tanto con la respuesta inmune (Konnai y col., 2003; Yoshida y col., 2009)

102

5-CONCLUSIONES

103

5- CONCLUSIONES

El presente trabajo de Tesis Doctoral se centró en el estudio de asociación entre los

polimorfismos localizados en genes de DLA de clase II y microsatélites ligados al DLA

con la patogénesis de la QSC en perros ovejeros alemanes. Las principales conclusiones

obtenidas se detallan a continuación:

Se obtuvieron por primera vez datos epidemiológicos locales sobre la prevalencia de

QSC en ovejeros alemanes, no observándose diferencias significativas entre sexos.

Los resultados obtenidos validan la asociación reportada en ovejeros alemanes (Jokinen,

2011) en una muestra independiente, perteneciente a la provincia de Buenos Aires y

proveen una fuerte evidencia que avala la asociación entre los genes del MHC de clase II

y el desarrollo de la QSC en perros.

Como respuesta a la necesidad de asignar los alelos de los exones 2 se desarrolló un

software que calcula las combinaciones más probables a partir de las secuencias crudas y

utilizando las secuencias de alelos reportados en la base de datos IPD-MHC.

Se han detectado por primera vez haplotipos protectores, los cuales podrían contribuir

una vez validados a la selección positiva en los criaderos.

También se evaluó la sinergia que se puede dar entre las regiones reguladoras

proximales y las regiones presentadoras de antígenos en los genes del DLA de clase II,

observándose la asociación entre ciertas combinaciones y el desarrollo de QSC.

Estas asociaciones genéticas apoyan los estudios clínicos, histológicos y farmacológicos

previos que indican que la QSC es una enfermedad inmunomediada (Bedford y

Longstaffe, 1981; Williams, 1999, 2005).

104

Si bien la base genética de la enfermedad puede ser principalmente explicada por esta

asociación con los genes del MHC, otros genes pueden contribuir en la patogénesis y

deberían ser identificados.

Los hallazgos del presente trabajo podrían ser utilizados para identificar animales

susceptibles previo a la aparición de los cambios patológicos.

105

6-BIBLIOGRAFÍA

106

6- BIBLIOGRAFÍA:

1. Andersen LC, Beaty JS, Nettles JW, Seyfried CE, Nepom GT, Nepom BS.

Allelic Polymorphism in Transcriptional Regulatory Regions of HLADQB

.1991Genes. J Exp Med. 173(1), 181–192.

2. Asher L, Diesel G, Summers JF, McGreevy PD, Collins LM. Inherited defects

in pedigree dogs. Part 1: disorders related to breed standards. Vet J. 2009;

182(3):402–11.

3. Axelsson E, Webster MT, Abhirami R, The LUPA Consortium, Ponting CP,

Kerstin LT. Death of PRDM9 coincides with stabilization of the recombination

landscape in the dog genome. Genome Research. 2012; 22, 51–63

4. Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of

LD and haplotype maps. Bioinformatics. . 2005; 21, 263–265.

5. Bedford PGC, Longstaffe JA. Corneal pannus (chronic superficial keratitis) in

the German shepherd dog. Journal of Small Animal Practice .1981; 20: 41–56.

6. Berggren K, Seddon J. MHC promoter polymorphism in grey wolves and

domestic dogs. Immunogenetics. 2005; 57, 267–272.

7. Björnerfeldt S, Hailer F, Nord M, Vilà C. Assortative mating and

fragmentation within dog breeds. BMC Evol Biol. 2008; 8:28.doi:

10.1186/1471-2148-8-28.

8. Brinkmeyer-Langford C, Komegay JN. Comparative Genomics of X-linked

Muscular Distrophies: The Golden Retriever Model. Curr Genomics. 2013;

144:330-342.

107

9. Calboli FC, Sampson J, Fretwell N, Balding DJ. Population structure and

inbreeding from pedigree analysis of purebred dogs. Genetics. 2008;

179(1):593–601.

10. Chandler HL, Kusewitt DF, Colitz CM. Modulation of matrix metallo-

proeinases by ultraviolet radiation in the canine cornea. Vet Ophthalmol. 2008;

11:135–144.

11. Chavkin MJ, Roberts SM, Salman MD, Severin GA, Scholten NJ. Risk factors

for development of chronic superficial keratitis in dogs. J Am Vet Med Assoc.

1994 204(10):1630-4.

12. Cheng S, Wigney D, Haase B, Wade CM. Inheritance of chronic superficial

keratitis in Australian Greyhounds. Animal Genetics. 2016. 47:629.

13. Clatworthy MR, Willcocks L, Urban B. Systemic lupus erythematosus-

associated defects in the inhibitory receptor FcγRIIb reduce susceptibility to

malaria. Proc Natl Acad Sci U SA. 2007: 104: 7169–74.

14. Cowell LG, Kepler TB, Janitz M, Lauster R, Mitchison NA. The distribution of

variation in regulatory gene segments, as present in MHC class II promoters.

1998. Genome Res 8:124–134

15. Davis SJM, Valla FR. Evidence for domestication of the dog 12,000 years ago

in the Natufian of Israel. Nature. 1978. 276:608–10.

16. Day M. Clínical Immunology of the dog and cat, Second Edition. Manson

Publishing. 2012.

108

17. Day MJ, Shultz RD. Veterinary Immunology: Principles and practice. Second

Edition. Taylor and Francis Group. 2014. Cap 16, pag.188.

18. de la Chapelle A, Wright FA. Linkage disequilibrium mapping in isolated

populations: The example of Finland revisited. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci.

95:12416–12423.

19. Fainboim L, Geffner J. Introducción a la Inmunología humana. 5ta Edición.

Buenos Aires. Médica Panamericana. 2008.

20. Farmer A-MT. Corneal pannus in the dog. PhD Thesis, University of

Cambridge, 1983.

21. Federación Cinológica Internacional. FCI, 2016. http://www.fci.be/en/.

22. Fels L, Marschall Y, Philipp U, Distl O. Multiple loci associated with canine

hip dysplasia (CHD) in German sherperd dogs. 2014. Mamm Genome. 25:262-

269.

23. Gelatt KN. Veterinary Ophthalmology Ed. 3ª. Lippincott, Williams & Willkins.

Cap 9-355-425. 1999.

24. Goddard ME, Hayes BJ. Genome-Wide Association Studies of Linkage

Disequilibrium in Cattle. 2012. Bovine Genomics.192-211.

25. Gough A, Thomas A. Breed predispositions to disease in Dogs and Cats.

Blackwell. 2004. 72-79.

109

26. Handunnetthi L, Ramagopalan SV, Ebers GC, Knight JC. Regulation of MHC

class II gene expression, genetic variation and disease. Genes Immun. 2010.

11(2), 99–112.

27. Hedrick PW. Genetics of populations. Third Edition. Jones and Barlett

Publishers. Cap 6. Pag 342. 2005.

28. http://omia.angis.org.au/home/

29. Hughes AM, Jokinen P, Bannasch DL, Lohi H, Oberbauer AM.Association of

a dog leukocyte antigen class II haplotype with hypoadrenocorticism in Nova

Scotia Duck Tolling Retrievers. 2010. Tissue Antigens75, 684–690

30. Hraber P, Kuiken C, Yusim K. Evidence for human leukocyte antigen

heterozygote advantage against hepatitis C virus infection. 2007. Hepatology

46, 1713-1721.

31. It V., L. Barrientos, J. López Gappa, D. Posik, S. Diaz, C. Golijow, G.

Giovambattista. Association of canine juvenile generalized demodicosis with

the Dog Leukocyte Antigen System (DLA). 2010. Tissue Antigens, 76 (1): 67-70.

32. Janitz M, Mitchison A, Reiners-Schramm L, Lauster R. Polymorphic MHC

class II promoters exhibit distinct expression pattern in various antigen-

presenting cell lines. 1997. Tissue Antigens. 49, 99– 106.

33. Kasper KJ, Zeppa JJ, Wakabayashi AT, Xu SX, Mazzuca DM. Bacterial

Superantigens Promote Acute Nasopharyngeal Infection by Streptococcus

pyogenes in a Human MHC Class II-Dependent Manner. 2014. PLoS Pathog

10(5): e1004155.

110

34. Kennedy LJ, Quarmby S, Happ GM .Association of canine hypothyroidism

with a common major histocompatibility complex DLA class II allele. 2006.

Tissue Antigens 68: 82–6.

35. Kennedy LJ. 14th International HLA and Immunogenetics Workshop: report

on joint study on canine DLA diversity. 2007. Tissue Antigens, 269–271.

36. Konnai S, Nagaoka Y,Takeshima S, Onuma M, Aida Y. Sequences and

diversity of 17 new Ovar-DRB1 alleles from three breeds of sheep. 2003.

Immunogenetics. 30:275-282.

37. Kramer JW, Venta PJ, Klein SR, Cao Y, Schall WD, Yuzbasiyan-Gurkan V. A

von Willebrand's Factor Genomic Nucleotide Variant and Polymerase Chain

Reaction Diagnostic Test Associated with Inheritable Type-2 von Willebrand's

Disease in a Line of German Shorthaired Pointer Dogs. 2004. Vet Pathol.

41(3):221-8.

38. Larson G, Bradley DG. How much is that in dog years? The advent of canine

population genomics. PLoS Genet. 2014.10(1): e1004093.

39. Li N, Stephens M. Modeling Linkage Disequilibrium and Identifying

Recombination Hotspots Using Single-Nucleotide Polymorphism Data.

2003.Genetics. 165( 4) 2213-2233

40. Lopez García MJ, Osuna Molina A, Osuna Molina R. Manual de laboratorio

de las enfermedades autoinmunes digestivas. Omnia Science Publisher. 2013.

41. Lucotte G, Perramon A, Kaminski M. Molecular basis for heterosis in the

chicken-quail hybrid. 1977.Comp Biochem Physiol B.56(2):119-22.

111

42. Maggs D. Capítulo Córnea y esclera. En Slatter, Fundamentos de oftalmología

veterinaria. 4° ed. Elsevier. Barcelona (España) 2009. p. 179-206.

43. Marsili S, Genini S, Sudharsan R, Gingrich J, Aguiire GD, Beltran WA.

Exclusion of the unfolded protein response in light-induced retinal

degeneration in the canine T4R RHO model of autosomal dominant retinitis

pigmentosa. 2015. PloS One 10.

44. Mellanby RJ, Ogden R, Clements DN, French AT, Gow AG, Powell R.

Population structure and genetic heterogeneity in popular dog breeds in the

UK. 2013. Vet J. 2013;196(1):92–7.

45. Mitchison NA, Roes J. Patterned variation in murine MHC promoters. 2002.

Proc Natl Acad Sci USA. 99:10561–10566

46. Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small

number of individuals.1978. Genetics.89(3):583-90.

47. Nelson RW, Couto G. Small Animal Internal Medicine. 5ta Edición. Elseiver.

2014

48. Nemanic S, Nixon B.K, Baltzer W. Analysis of risk factors for elbow dysplasia

in giant breed dogs. 2016. Vet Comp Orthop Traumatol. 29(5):369-77.

49. Okonechnikov, Golosova, Fursov. Unipro UGENE: a unified bioinformáticas

toolkit. 2012. Bioinformatics. 28:1166-1167

50. Ollier WER, Kennedy LJ, Thomson W. Dog MHC alleles containing the

112

‘‘human RA shared epitope’’ confer susceptibility to canine rheumatoid

arthritis. 2001. Immunogenetics. 53: 669–73.

51. Ostrander E A, Kruglyak L. Unleashing the Canine Genome. 2000. Genome

Res. 10: 1271-1274.

52. Pang JF, Kluetsch C, Zou XJ, Zhang AB, Luo LY, Angleby H. mtDNA data

indicate a single origin for dogs south of Yangtze River, less than 16,300 years

ago, from numerous wolves. 2009. Mol Biol Evol.26(12):2849–64.

53. Parker HG, Kim LV, Sutter NB, Carlson S, Lorentzen TD, Malek TB. Genetic

structure of the purebred domestic dog. 2004. Science. 304(5674).

54. Parker HG, Shearin AL, Ostrander EA. Man’s best friend becomes biology´s

best in show: Genome analyses in the domestic dog. 2010. Annu Rev Genet.

44:309-336.

55. Packer RM, Hendricks A, Tivers MS, Burn CC. Impact of facial conformation

on canine health: brachycephalic obstructive airway syndrome. 2015. PLoS

One 10, e0137496.

56. Patterson, D. Companion animal medicine in the age of medical genetics. 2000.

J. Vet. Internal. Med. 14: 1-9.

57. Pedersen, P.B., Nielsen, C.B., Heegaard, S. Collie eye anomaly in blind Collie

pups. 2004. Dansk Veterinaertidsskrift 87:27-29.

58. Pérez AA. La asociación lógica: corticoterapia y Ciclosporina A, una

alternativa eficaz en el tratamiento de la queratitis superficial crónica

113

inmunomediada .Tesis Doctoral. Facultad de Veterinaria . Universidad

Complutense de Madrid. 2004.

59. Quinnell RJ, Kennedy LJ, Barnes A, Courtenay O, Dye C, Garcez LM, Shaw

MA, Carter SD, Thomson W, Ollier WE. Susceptibility to visceral

leishmaniasis in the domestic dog is associated with MHC class II

polymorphism. 2003. Immunogenetics.55(1):23-28.

60. Rimbault M, Ostrander EA. So many doggone traits: mapping genetics of

multiple phenotypes in the dog. 2012.Hum Mol Genet. 15;21(R1):R52-7.

61. Rugeles López MT, Montoya Guarin CJ. Inmunología. Una ciencia activa. 2da

Edición. Universidad de Antioquia, 2009.

62. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating

inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America. 1977;74(12):5463-5467.

63. Schneider S, Roessli D, Excoffier L. Arlequin: a software for population

genetics data analysis. 2000. Schneider S, Roessli D, Excoffier L. Arlequin: a

software for population genetics data analysis User manual ver 2.000. Genetics

and Biometry Lab, Dept. of Anthropology, University of Geneva; Geneva:

2000.

64. Singal D P, Qiu X. Polymorphism in the upstream regulatory regions and level

of expression of HLA-DRB genes. 1994. Mol. Immunol. 31, 1117–1120.

65. Singal DP, Qiu X. Polymorphism in both X and Y motifs controls level of

expression of HLA-DRB1 genes. 1996. Immunogenetics. 43, 50– 56.

114

66. Skoglund P, Gotherstrom A, Jakobsson M. Estimation of population

divergence times from non-overlapping genomic sequences: examples from

dogs and wolves. 2011. Mol Biol Evol. 28(4):1505–17.

67. Summers JF, Diesel G, Asher L, McGreevy PD, Collins LM. Inherited defects

in pedigree dogs. Part 2: disorders that are not related to breed standards.

2010. Vet J. 183(1):39–45.

68. Sutter NB, Eberle MA, Parker H, Pullar BJ, Kirkness EF, Kruglyak L,

Ostrander E.A. Extensive and breed-specific linkage disequilibrium in Canis

familiaris. 2004. Genome Research.14:2388–2396.

69. Takeshima SN, Matsumoto Y, Chen J, Yoshida T, Mukoyama H, Aida Y.

Evidence for cattle major histocompatibility complex (BoLA) class II DQA1

gene heterozygote advantage against clinical mastitis caused by Streptococci

and Escherichia species. 2008. Tissue Antigens. 72: 525-531.

70. Thursz MR, Thomas HC, Greenwood BM, Hill AV. Heterozygote advantage

for HLA class-II type in hepatitis B virus infection. 1997. Nature Genetics. 17

(1): 11-12.

71. Ting JPY, Trowsdale J. Genetic control of MHC class II expression. 2002. Cell

109, 121: S21-33.

72. van Steenbeek FG, Hyt€onen† MK, Leegwater PAJ, Lohi† H. The canine era:

the rise of a biomedical model. 2016. Animal Genetics 47: 519-527.

73. Wang G-D, Zhai W, Yang H-C. Out of southern East Asia: the natural history

of domestic dogs across the world. 2016. Cell Research. 26(1):21-33.

115

74. Wayne RK, Ostrander EA. Origin, genetic diversity, and genome structure of

the domestic dog. 1999. Bioessays, 21: 247–257.

75. Wayne RK, Ostrander EA. Lessons learned from the dog genome. 2007.Trends

in Genetics. 23, 557–67.

76. Whitley RD, Gilger BC. Cap: Diseases of the canine cornea and sclera. En

Gelatt KN (Ed.) Veterinary Ophthalmology Ed. 3ª. Lippincott, Williams &

Willkins, 1999. 635-673.

77. Wilbe M, Jokinen P, Truvé K, Seppala EH, Karlsson EK, Biagi T, Hughes A,

Bannasch D, Andersson G, Hansson-Hamlin H, Lohi H, Lindblad-Toh K.

Genome-wide association mapping identifies multiple loci for a canine SLE-

related disease complex. 2010. Nat Genet. 42(3): 250-4.

78. Wilcox B, Walkowicz C. The Atlas of Dog Breeds of the World Hardcover,

1995.

79. Williams DL. Major histocompatibility class II expression in the normal canine

cornea and in canine chronic superficial keratitis. 2005.Veterinary

Ophthalmology. 8, 6, 395–400.

80. Williams DL. Histological and immunohistochemical evaluation of canine

chronic superficial keratitis. 1999. Res Vet Sci. 67(2):191-5.

81. Yoshida T, Furuta H, Kondo Y, Takeshima S, Aida Y, Kosugiyama

M,Tomogane H. Association of the amino acid motifs of BoLA-DRB3 alleles

with mastitis pathogens in Japanese Holstein cows. 2009. Animal Science

Journal. 5: 510–519.

116

82. Yuzbasiyan-Gurkan V, Blanton SH, Cao Y, Ferguson P, Li J, Venta PJ,

Brewer GJ. Linkage of a microsatellite marker to the canine copper toxicosis

locus in Bedlington Terriers. 1997. American Journal of Veterinary Research.

58: 23 –7.

117

7- ANEXOS

118

ANEXO 1. Planilla de examen ocular

119

ANEXO 2. Modelo de consentimiento informado presentado a los propietarios de los animales muestreados.

CONSENTIMIENTO INFORMADO En el día de la fecha:…………/………………/…………………. Yo,……………………………………………………con DNI

nro………………………………………………………………………… Con domicilio en: Calle:…………………..Nro:……………………………Localidad:………………………. Pcia:……………………………………. CP………………Teléfono…………………………………. Tras haber recibido información verbal clara y sencilla sobre el procedimiento. Autorizo voluntariamente a la extracción de muestra de sangre entera con EDTA/Hisopado bucal (tache lo que no corresponda) del paciente: Nombre…………………………………………………Especie………………………….. Sexo……………………………. Raza………………………………Edad………………………Pelaje………………………

……………………………………………… Nro. de Historia Clínica………………………………………. Para su utilización en (marcar con una x): …… Estudio de asociación genómica de la Queratitis Superficial Crónica en la raza

Ovejero Alemán. A realizarse en el IGEVET (Instituto de Genética Veterinaria), Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata. Firma: Firma: Aclaración: Aclaración: VETERINARIO PROPIETARIO

120

ANEXO 3. Kit de purificación de ADN gUSA)

Protocolo de extracción de ADN genómico a partir de sangre entera con EDTA, heparina o citrato.

1- Cargar 900 µl de solución de lisis celular en tubos de 1,5 ml y agregar 300 µl de sangre. Mezclar por inversión.

2- Incubar por 10 minutos a temperatura ambiente.

3- Centrifugar las muestras a 13000-16000 x g (velocidad máxima en micro-centrífuga), 20 segundos.

4- Descartar sobrenadante y vortexear el pellet por 15 segundos.

5- Agregar 300 µl de solución de lisis nuclear y se mezclar por inversión.

6- Agregar 100 µl de solución de precipitación proteica y vortexear por 20 segundos.

7- Centrifugar las muestras según su volumen13000-16000 x g (velocidad máxima en micro-centrífuga), 3 minutos

8- Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5ml con 300 µl isopropanol y mezclar suavemente hasta que aparezcan los ” hilos” de ADN

9- Centrifugar las muestras según su volumen 13000-16000 x g (velocidad máxima en micro-centrífuga), 1 minuto.

10 - Descartar el sobrenadante y agregar 300 µl etanol 70% .

121

11-Quitar el etanol y secar el pellet al aire por 10-15 minutos (no deben quedar restos de alcohol.

12- Rehidratar el ADN en 100 µl de solución de rehidratación de ADN por 1 hora a 65ºC u overnight a 37ºC. 13- Luego almacenar al ADN purificado a -20°C.

ANEXO 4. Protocolo de extracción orgánica de ADN total de sangre periférica

1- Alicuotar 500 ul de la muestra de sangre en tubos de 1,5 ml.

2- Lavar con 1000 ul de agua pura y centrifugar a 10000 g por 1 minuto.

3- Descartar el sobrenadante volcando suavemente el tubo y secar sobre papel la última gota. Repetir el lavado una vez mas o hasta que el pellet quede blanco.

4- Resuspender el pellet en 400 ul de Buffer de Extracción S (50mM de HCl-Tris, 25 mM de DTT, 2 % de N-Laurylsarcosine)

5- Agregar 10 ul de proteinasa K (10 mg/ml) e incubar durante 3 horas a 55 °C o toda la noche a 37 °C.

6- Llevar la muestra a temperatura ambiente y agregar 400 ul de cloroformo. Mezclar por inversión. Centrifugar a 10000 g por 1 minuto.

7- Transferir la fase acuosa, que contiene el ADN (superior), a un nuevo tubo y descartar la fase orgánica.

8- Repetir la extracción orgánica una vez más.

9- Transferir la fase acuosa a otro tubo y agregar 80 ul de Acetato de Amonio 10M. Centrifugar a 10000 g por 1 minuto. Transferir la fase acuosa a otro tubo y agregar 800 ul de etanol 100 % (preenfriado). Mezclar suavemente, precipitar durante 1 hora en hielo o en el freezer (se puede dejar toda la noche).

10- Centrifugar a 14000 g por 15 minutos. Luego descartar el sobrenadante volcando suavemente y secar la boca del tubo sobre papel.

11- Lavar el tubo con 250 ul de etanol 70 % frio, centrifugar a 14000 g por 15 minutos y volver a descartar el sobrenadante.

12- Secar el pellet a T° ambiente.

13- Agregar 100 – 200 ul de agua pura e incubar toda la noche en un baño a 37 °C para hidratar el ADN.

122

ANEXO 5.Cuantificación del ADN extraído y productos de PCR purificados. Protocolo del uso de NanoVue : Medición de concentración de ADN Espectrofotómetro NanoVue GE HealthCare

Panel de control

1) Encender el equipo utilizando la tecla color negra del panel de control (on/off).

2) En la pantalla se muestran los íconos de cinco carpetas con distintas funciones, utilizando la botonera alfanumérica, seleccionar la carpeta nro 1 con la leyenda “Life

Science”. 3) Seleccionar de las seis funciones que aparecen en la pantalla, la opción nro 1 con la leyenda DNA. 4) Confirmar la operación utilizando el botón “Confirm selection”ubicado debajo del teclado alfanumérico.

123

5) Levantar la tapa que protege la placa de medición de muestra. 6) Para calibrar el espectrofotómetro con un blanco, colocar una gota de 3 µl de agua destilada en el centro de la placa de medición, utilizando una micropipeta de 0-10µl, 7) Bajar la tapa que protege la placa de medición. 8) Seleccionar del panel de control el botón “Set reference”, para llevar el equipo a 0

absorbancia. 9) Aparecerá en la pantalla un cartel con la leyenda: “A second reference is required

for comparison-Replace the reference and repeat”. 10) Levantar la tapa, secar cuidadosamente con un papel absorbente estéril la zona donde estaba la gota y reemplazar con una nueva gota de agua destilada estéril. 11) Bajar la tapa y nuevamente pulsar nuevamente el botón “Set reference.” 12) A continuación en la pantalla, todos los parámetros de medición se colocaran en cero. 13) Levantar la tapa, limpiar la placa de medición el agua utilizada anteriormente. 14) Colocar una gota de 3 µl de la muestra problema en el centro de la placa de medición. 15) Pulsar el botón de tomar medida “Take measurement”. 16) La concentración [ng/ µl] aparecerá en el recuadro “Concentration” y la relación de

absorbancias (A260/A280) en el recuadro correspondiente (Indicador de calidad de ADN, el valor debe estar entre 1,7 y 2). 17) Una vez finalizada la utilización del equipo, apagar utilizando la misma tecla de encendido (on/off) y luego desconectarlo de la red eléctrica.

ANEXO 6 . Chequeo de productos de PCR en geles de poliacrilamida 6%.

Preparación de geles de poliacrilamida 6 % Agua destilada………………………. 9 ml TBE 5X…………………………….. 3 ml Poliacrilamida 30 %............................ 3 ml APS……………………………… 150 µl TEMED…………………………… 15 µl 1. Limpiar los vidrios con alcohol 70%para desengrasarlos. 2. Colocar los separadores (0,375 mm) sobre el vidrio entero y apoyar encima, con mucho cuidado, el vidrio calado. Sujetar con ganchos o clips. 3. Agregar el APS y luego el TEMED a la mezcla de poliacrilamida, mezclar bien y proceder (desde el extremo calado) a cargar el gel con una pipeta de vidrio, evitando que se formen burbujas de aire. 4. Una vez lleno el molde con el gel, colocar el peine con cuidado. 5. Esperar que polimerice y montar en la cuba electroforética con TBE 1X. No dejar el gel polimerizado mucho tiempo sin montar para evitar la deshidratación. 6. Sembrar las muestras y correr a 170 voltios durante el tiempo necesario (30 minutos aproximadamente). TBE 5X: 54 g……………………………. de Tris base.

124

27,5 g………………………….. de Ácido Bórico. 20 ml…………………………... de EDTA 0.5M ( pH=8). Completar hasta 1000 ml con agua destilada. Preparación de las muestras para su siembra La muestra se siembra en el gel con colorante DYE, permitiendo así su visualización durante la corrida electroforética. Se toman 3µl del ADN genómico y se le agregan 1 µl de DYE, los 4 µl resultantes se colocan en los pocillos del gel. La corrida electroforética se realiza a 170 voltios durante 1 hora y cuarto. Colorante DYE: 0.025 g………………………….. de Bromophenol Blue. 4 g………………………………. de sacarosa. Completar hasta un volumen final de 100 ml con agua destilada. Revelado de los geles 1. Se colocan 50 µl de Bromuro de etidio en 500 ml de H20 destilada. 2. Sumergir el gel en la solución por 10 minutos. 3. Revelar bajo luz UV.

ANEXO 7.Purificación de las reacciones de PCR por precipitación con

polietilenglicol (PEG)

Este protocolo está ajustado para reacciones de PCR de 50 µl. Si el volumen de la PCR

es diferente, modificar la escala manteniendo las proporciones.

1. Correr 5 µl de la PCR en un gel de agarosa para verificar la amplificación.

2. Al resto de la reacción de PCR agregarle 50 µl de una solución de 20% PEG -2.5 M

NaCl y mezclar bien.

3. Incubar a 37°C por 15 minutos.

4. Centrifugar a alta velocidad (~15.000 x g) durante 15 minutos a temperatura

ambiente.

5. Retirar el sobrenadante con pipeta y descartarlo. El pellet es incoloro y queda

adherido a la pared del tubo.

6. Agregar 125 µl de etanol 70%. Si se agrega el etanol en el fondo del tubo, centrifugar

2 minutos. Si se agrega el etanol suavemente por la pared del tubo, dejar reposar un

125

minuto. Eliminar el sobrenadante y descartar. Eliminar la mayor cantidad posible del

etanol.

7. Secar el pellet a 37°C durante 10-15 minutos. Asegurarse de que no queden restos de

etanol y que el pellet esté seco. Un exceso en el secado del pellet dificulta la

resuspensión.

8. Disolver el producto de PCR en 20 µl de agua bidestilada estéril. Resuspender

completamente el pellet (con pipeta o vortex). Ayuda incubar por unos minutos a

temperatura ambiente o a 37°C.

9. Correr de 2 a 4 µl en un gel de agarosa durante 10 minutos para tener una idea

aproximada del porcentaje de recuperación. Simultáneamente sembrar 20 y 100 ng de

un standard de DNA.

Solución 20% PEG - 2,5 M NaCl

Para 50 ml mezclar:

1) 10.0 g polietilenglicol 8000 (funciona igualmente con el PEG 6000 u 8000)

7.3 g de NaCl

2) Agregar 45 ml de agua bidestilada.

3) Agitar y dejar disolver el PEG durante al menos 20 minutos. Se puede colocar la

solución en un agitador a 37°C.

3) Una vez disuelto el PEG (la solución se vuele incolora), completar el volumen hasta

50 ml con agua bidestilada.

4) Conservar a temperatura ambiente.

ANEXO 8. Secuenciación

Se utilizó un secuenciador automático MEGABACE 1000. Que utiliza una mezcla de

nucleótidos sin marcar y dideoxinucleótidos marcados fluorescentemente con distintos

colores. La secuenciación se lleva a cabo en una sola reacción. Los fragmentos

obtenidos en la reacción se separan por electroforésis en un capilar de poliacrilamida y

el color asociado a cada uno de ellos se detecta utilizando un rayo láser. La secuencia

de colores registrada por el detector a lo largo de la corrida es indicativa de la secuencia

126

de bases que componen al fragmento, y es informada al usuario a través de un

computador. (Ver figura en ANEXO 9)

Protocolo de realización de las reacciones de secuenciación

Para 10 µl de volumen final:

ADN (200 ng) + agua…………………………. 5 µl

primer (5 uM = 5 pmol/ul)……………………...1 µl

premix (DYEnamic ET Dye Terminator)…… 4 µl

volumen final…………………………………...10 µl

Programa de PCR poco riguroso: 40 ciclos de 20 segundos a 95ºC, 15 segundos a 50ºC

y 1 minuto a 60ºC.

Purificar las reacciones para eliminar los cebadores y los nucleótidos fluorescentes no

incorporados, para ello se realiza una precipitación con acetato de amonio y etanol de

acuerdo al siguiente protocolo.

Reacción de secuencia……………….. 10 µl

Acetato de amonio 7.5 M………….…... 1 µl

Etanol absoluto…………………………30 µl

1. Centrifugar a 15.000 rpm durante 15 minutos.

2. Descartar el sobrenadante.

3. Lavar con 100 µl de etanol 70%, agregando el alcohol con suavidad para no despegar

el pellet.

4. Centrifugar a 15.000 rpm durante 2 minutos y eliminar tanto etanol como sea posible

(si quedaran gotas en las paredes, centrifugar brevemente y eliminarlas con la pipeta).

Esto es importante ya que los restos de etanol producen artefactos en la corrida del

secuenciador (dye blobs).

5. Secar el etanol a 37°C durante aproximadamente 10 minutos. No secar

excesivamente (dificulta la resuspensión).

6. Disolver el pellet en 10 µl de MegaBACE Loading Solution vortexeando

vigorosamente durante 20-30 segundos para asegurar una resuspensión completa.

127

ANEXO 9. Esquema de un proceso de secuenciación.

128

ANEXO 10. Protocolos de amplificación:

Secuenciación (volumen final: 25 µl)

Agua Destilada csp

Buffer 20 mM

dNTP´s 200 µM

MgCl2 1,5 mM

Primer – F (5 µM) 0,4 µM

Primer – R (5 µM) 0,4 µM

Taq. Polimerasa 0,5 UI

ADN 25-50 ng

ANEXO 11.

a) Geles de poliacrilamida 6%. Chequeo de productos de PCR (Microsatélites). 1)2)3)4) Muestras problema. (+) Positivo. (-) Negativo.

129

ANEXO 11 b) Cromatogramas de los microsatélites. 1)FH2054

130

2) FH2202

131

3) FH2975

132

ANEXO 12. Alineamiento de las secuencias reportadas para el exón 2 de los genes DLA de clase II. Base de datos IPD-MHC

a) DLA-DRB1

133

134

135

b) DLA-DQA1.

136

c) DLA-DQB1.

137

138

139