Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT- FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACIA UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA INFORME FINAL ESTUDIO QUÍMICO DE LOS ACEITES ESENCIALES Y METABOLITOS SECUNDARIOS DE TRES PLANTAS DEL GÉNERO Lantana (VERBENACEAE). PROYECTO FODECYT No. 011-2007 JUAN FRANCISCO PÉREZ SABINO Investigador Principal GUATEMALA, AGOSTO DE 2011.

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Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT-

SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACIA

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

INFORME FINAL

ESTUDIO QUÍMICO DE LOS ACEITES ESENCIALES Y METABOLITOS

SECUNDARIOS DE TRES PLANTAS DEL GÉNERO Lantana

(VERBENACEAE).

PROYECTO FODECYT No. 011-2007

JUAN FRANCISCO PÉREZ SABINO

Investigador Principal

GUATEMALA, AGOSTO DE 2011.

Page 2: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del

Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría

Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología -CONCYT-.

Page 3: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

Biografía académica de los autores:

Dr. Juan Francisco Pérez Sabino.

Químico graduado de la Universidad de San Carlos, MBA por ESEADE, Universidad

Francisco Marroquín y M.Sc. en Estudios Ambientales por la Universidad del Valle de

Guatemala. Es Doctor en Química de Productos Naturales, por el Núcleo de Pesquisas de

Productos Naturales de la Universidad Federal de Río de Janeiro, Brasil. Ha hecho estudios

de especialización en Química Analítica Nuclear en la Universidad de Lund, Suecia, y en

la Universidad de Viena, Austria, y de microcontaminantes orgánicos en medio ambiente

en los Laboratorios del OIEA en Seibersdorff, Austria, y en el Instituto Biológico, Sao

Paulo, Brasil. Profesor Titular de la Escuela de Química de la USAC desde 1998, actual

Director de la misma, ha impartido cursos de Química Orgánica, Análisis Instrumental y

Fisicoquímica desde 1993. Anteriormente se desempeñó como Jefe del Laboratorio de

Radiactividad Ambiental de la Dirección General de Energía Nuclear (1990-1997). Ha

participado en más de 25 proyectos de investigación relacionados con la Química

Ambiental, Radiactividad Ambiental, Química Analítica y Química de Productos

Naturales. Es Autor y Co-autor de 12 publicaciones nacionales y más de 30

internacionales.

M.A. Sully Margot Cruz Velásquez

Química Farmacéutica, Maestría Multidisciplinaria en la Producción y Uso de Plantas

Medicinales (MUPLAM) graduada de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la

Universidad de San Carlos. Profesora a nivel Licenciatura de los cursos Farmacognosia y

Fitoquímica, profesora a nivel de posgrado de los cursos Farmacología y Toxicología,

Técnicas Instrumentales de Análisis. Se ha capacitado en técnicas instrumentales,

caracterización fitoquímica y evaluación de bioactividad de extractos vegetales,

formulación de productos cosméticos y medicinales en INETI Portugal, Universidad

Federal de Rio Grande do Sul, Universidad de Niteroi en Brasil y Centro de Investigación

de la Flora Panameña de la Universidad de Panamá. Ha participado como Coordinadora

e Investigadora en proyectos nacionales e internacionales sobre química de productos

naturales, fitocosmética, farmacología, agrotecnología, biotecnología. Autora y coautora

en doce publicaciones nacionales e internacionales.

M.Sc. Pedro Guillermo Jayes Reyes

Químico graduado de la Escuela de Química de la USAC, habiendo sido acreedor al

Premio a la mejor tesis del año por la USAC en 1996. M.Sc. en Formulación y Evaluación

de Proyectos, Faculta de Economía, USAC. Ha hecho estudios de especialización en

Ciencia y Tecnología Ambiental por la Universidad de Cádiz, y Nanotecnología en la

USAC. Es Profesional Analista e Investigador de la Unidad de Análisis Instrumental de la

Escuela de Química. Ha impartido cursos de Fisicoquímica, Gerencia y Garantía de la

Calidad y Formulación y Evaluación de Proyectos de la Escuela de Química. Ha

participado como coordinador e investigador en proyectos de investigación en el área de la

Química de Productos Naturales. Cuenta con tres publicaciones nacionales y una

internacional.

Lic. Fabiola Prado de Micheo

Química Farmacéutica, graduada de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la

Universidad de San Carlos. Investigadora y Analista Profesional del Departamento de

Page 4: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

Toxicología de la USAC desde 1997. Laboró de 1972 a 1996 como Investigadora y

analista en el ICAITI. Tiene especialización en Cultivo de Tejidos efectuada en el Centro

Agronómico Tropical de investigación y Enseñanza), Turrialba, Costa Rica y en Técnicas

Cromatográficas de Análisis en los Laboratorios de la Armada de los EE.UU. en Natick,

Massachussets, Estados Unidos. Ha asesorado siete tesis de graduación en la Facultad de

Ciencias Químicas y Farmacia de la USAC y tiene trece publicaciones internacionales en el

área de la Química Agrícola.

M.Sc. Bessie Oliva Hernández de Sandoval

Química graduada de la Universidad de San Carlos. Obtuvo su M.Sc. en Estudios

Ambientales en la Universidad del Valle de Guatemala. Profesora de la Escuela de

Química de la USAC desde 1998, ha impartido cursos de Química Orgánica, Análisis

Instrumental y Fisicoquímica des 1993. Realizó estudios de especialización en Análisis de

Metales Traza en el Centro de Energía Nuclear en la Agricultura (CENA), Piracicaba,

Brasil, y en la Universidad Católica del Norte, Antofagasta, Chile, y de Garantía de la

Calidad, en la Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia. Anteriormente se

desempeñó como Jefe del Laboratorio de Fluorescencia de Rayos X de la Dirección

General de Energía Nuclear (1992-1996). Ha participado en más de 25 proyectos de

investigación relacionados con la Química Ambiental, Química Analítica y Química de

Productos Naturales. Es Co-autora de 10 publicaciones nacionales y más de 20

internacionales.

M.A. Christian Daniel Farfán.

Químico graduado de la Escuela de Química de la USAC. Maestro en Uso y Producción de

Plantas Medicinales por la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la USAC. Se ha

capacitado en Nanotecnología en la USAC y en Cristalografía Matemática en Universidad

de La Habana, Cuba. Cuenta con cinco años de experiencia en proyectos relacionados a la

Química de Productos Naturales en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. Se ha

desempeñado también en la docencia relacionada con Química Orgánica y Análisis

Instrumental. Es Autor de 2 publicaciones nacionales y Co-Autor de 5 publicaciones

nacionales e internacionales.

También participaron en este proyecto:

Lic. Armando Cáceres

Lic. Marco Vinicio García Sarán

Licda. Odra Babette Lara

Max Samuel Mérida Reyes

Page 5: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

I

INDICE

ABREVIATURAS _________________________________________________ i

RESUMEN iii

SUMMARY (ABSTRACT) iv

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN 1

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3

I.2.1 Antecedentes 3

I.2.1.1 Plantas a estudiar 3

I.2.1.2 Lantana camara 3

I.2.1.3 Lantana hispida HBK 4

I.2.1.4 Lantana trifolia L. 4

I.2.1.5 Estudios de polimorfismo de aceites esenciales de diferentes plantas 4

I.2.1.6 Estudios de actividad antimicrobiana de aceites esenciales de plantas

en América Latina 5

I.2.2 Justificación del trabajo de investigación 7

I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS 8

I.3.1 Objetivos 8

I.3.1.1 General 8

I.3.1.2 Específicos 8

I.3.2 Hipótesis 9

I.4 METODOLOGÍA 9

I.4.1 Localización 9

I.4.2 Las variables 10

I.4.2.1 Variables dependientes 10

I.4.2.2 Variables independientes 10

I.4.3 Indicadores 10

I.4.3.1 Aceites esenciales 10

I.4.3.2 Metabolitos secundarios 10

I.4.4 Estrategia Metodológica 11

I.4.4.1 Población y Muestra 11

I.4.5 El Método 11

I.4.5.1 Muestreo 11

I.4.5.2 Preparación de la muestra 11

I.4.5.3 Determinación de humedad 11

I.4.5.4 Determinación de contenido de cenizas 12

I.4.5.5 Extracción de aceites esenciales por hidrodestilación con

aparato tipo Clevenger 12

I.4.5.6 Extracción de metabolitos secundarios por maceración con diclorometano

y metanol 12

I.4.5.7 Análisis cromatográfico de los aceites esenciales 12

I.4.5.8 Tamizaje fitoquímico 13

Page 6: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

II

I.4.5.8.1 Investigación de alcaloides 13

I.4.5.8.2 Investigación de flavonoides y antocianinas 14

I.4.5.8.3 Investigación de antraquinonas 15

I.4.5.8.4 Investigación de cumarinas 15

I.4.5.8.5 Investigación de saponinas 16

I.4.5.8.6 Investigación de principios amargos 17

I.4.5.8.7 Investigación de taninos 17

I.4.5.9 Actividad biocida de metabolitos secundarios aislados

y aceites esenciales 17

I.4.5.10 Indice de refracción de aceites esenciales 17

I.4.6 La técnica estadística 17

I.4.7 Los instrumentos utilizados 18

PARTE II MARCO TEÓRICO (CONCEPTUAL)

II.1 ACEITES ESENCIALES 19

II.1.1 Biosíntesis 21

II.1.1.2 Terpenos 21

II.1.1.3 Fenilpropanoides 22

II.1.1.4 Extracción de los aceites esenciales 22

II.1.2 Polimorfismo químico 23

II.1.3 Actividad antioxidante 24

II.1.4 Actividad antioxidante de aceites esenciales 24

II.1.5 Actividad biológica de aceites esenciales 25

II.1.6. Métodos de análisis de actividad antimicrobiana 26

II.1.6.1 Métodos de difusión en agar 26

II.1.6.2 Métodos bioautográficos 26

II.1.6.3 Métodos de dilución 27

II.1.7 Bioautografía directa 27

II.1.8 Análisis de los aceites esenciales 27

II.1.8.1 Cromatografía de gases (CG) 28

II.1.8.2 Espectrometría de masas (EM) 29

II.1.8.3 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM) 29

II.2 FLAVONOIDES 29

II.2.1 Funciones de los flavonoides 31

II.2.2 Actividad antioxidante de los Flavonoides 31

II.2.3 Anti-carcinogénesis 32

II.2.4 Evolución de la producción de flavonoides por plantas 33

PARTE III

III.1 RESULTADOS 35

III.1.1 Colecta de plantas 35

III.1.2 Determinación del porcentaje de humedad 37

III.1.3 Aceites esenciales 37

III.1.3.1 Rendimiento 37

III.1.3.2 Composición del aceite esencial de Lantana hispida 38

Page 7: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

III

III.1.3.3 Composición del aceite esencial de Lantana camara 39

III.1.3.4 Composición del aceite esencial de Lantana trifolia 40

III.1.3.5 Evaluación de la actividad biológica, antioxidante e índice

de refracción de los aceites esenciales de las plantas de estudio 41

III.1.3.6 Actividad biocida y antioxidante de extractos con solvente de

las plantas de estudio _________________________________________ 42

III.1.4 Tamizaje fitoquímico 43

III.1.4.1 Alcaloides 43

III.1.4.2 Flavonoides y antocianinas 44

III.1.4.3 Saponinas 44

III.1.4.4 Antraquinonas, cumarinas, principios amargos y taninos 45

III.1.5 Extracción de metabolitos secundarios por maceración con

diclorometano y metanol 47

III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 48

III.2.1 Rendimiento de extracción de aceites esenciales 48

III.2.2 Composición de los aceites esenciales de las plantas de estudio 48

III.2.3 Tamizaje Fitoquímico y extractos diclorometánicos y metanólicos 49

III.2.4 Actividad biológica, antioxidante e índice de refracción de los aceites

esenciales de las plantas de estudio ______51

III.2.5 Actividad biológica y antioxidante de los extractos de las plantas de

Estudio obtenidos con solventes _________________________________51

PARTE IV

IV.1 CONCLUSIONES 53

IV.2 RECOMENDACIONES 55

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 56

IV.4 ANEXOS 63

IV.4.1 ANEXO 1 CROMATOGRAMAS_______________________________ 64

IV.4.2 ANEXO 2. APARIENCIAS DE LOS EXTRACTOS________________ 68

IV.4.3 ANEXO 3. Determinación de actividad antioxidante de los

extractos de las plantas de estudio.________________________________71

PARTE V

V.1 INFORME FINANCIERO 73

Page 8: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

IV

Lista de Ilustraciones

Figura 1. Ruta del ácido mevalónico en la biosíntesis de terpenos 21

Figura 2. Ruta de la 1-desoxi-Dixilulosa-5-fosfato en la biosíntesis de terpenos 23

Figura 3. Estructura de las principales clases de flavonoides 30

Figura 4. Actividad antioxidante de extractos de plantas del género Lantana____52

Figura 5. Cromatograma del aceite esencia de Lantana camara, muestra 1 64

Figura 6. Cromatograma del aceite esencial de Lantana camara, muestra 2 64

Figura 7. Cromatograma del aceite esencial de Lantana camara, muestra 3 65

Figura 8. Cromatograma del aceite esencial de Lantana hispida, muestra 1 65

Figura 9. Cromatograma del aceite esencial de Lantana hispida, muestra 2 66

Figura 10. Cromatograma del aceite esencial de Lantana trifolia, muestra 1 66

Figura 11. Cromatograma del aceite esencial de Lantana trifolia, muestra 2 67

Figura 12. Apariencia del extracto metanólico de Lantana camara 68

Figura 13. Apariencia del extracto metanólico de Lantana hispida 68

Figura 14. Apariencia del extracto metanólico de Lantana trifolia 69

Figura 15. Apariencia del extracto diclorometánico de Lantana camara 69

Figura 16. Apariencia del extracto diclorometánico de Lantana hispida 70

Figura 17. Apariencia del extracto diclorometánico de Lantana trifolia 70

Figura 18. Fotografía de la determinación de la actividad antioxidante del

extracto etanólico del residuo de la extracción con diclorometano de

Lantana hispida.______________________________________________71

Figura 19. Fotografía de la determinación de la actividad antioxidante del

extracto diclorometánico de Lantana hispida._______________________71

Figura 20. Fotografía de la determinación de la actividad antioxidante de la

solución etanólica de BHT______________________________________72

Lista de Tablas

Tabla 1. Ubicación geográfica de los sitios de colecta de muestras 9

Tabla 2. Códigos, localización geográfica y datos de rendimiento de aceite

esencial de las muestras de las plantas de estudio colectadas 35

Tabla 3. Porcentaje de humedad 37

Tabla 4. Rendimiento de extracción de aceite esencial por especie 38

Tabla 5. Resultados del análisis de muestras de Lantana hispida por

cromatografía de gases 38

Tabla 6. Resultados del análisis de muestras de Lantana camara por

cromatografía de gases 39

Tabla 7. Resultados del análisis de muestras de Lantana trifolia por

cromatografía de gases 40

Tabla 8. Actividad biológica, antioxidante e índice refracción

de los aceites esenciales 41

Tabla 9. Actividad biocida de extractos etanólicos de las especies de

Lantana a una concentración de 1 mg de extracto/mL ________________42

Tabla 10. Actividad antioxidante de extractos de las especies de Lantana

estudiadas y del antioxidante artificial BHT, expresada como IC50_______42

Tabla 11. Presencia de alcaloides en las plantas Lantana camara L.,

Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. 43

Page 9: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

V

Tabla 12. Detección de alcaloides por CCF 43

Tabla 13. Detección de flavonoides y antocianinas por CCF 44

Tabla 14. Detección de saponinas mediante la prueba de espuma 44

Tabla 15. Detección de saponinas por CCF 44

Tabla 16. Presencia de antraquinonas 45

Tabla 17. Presencia de cumarinas 45

Tabla 18. Cromatografía en capa fina cumarinas 45

Tabla 19. Presencia de principios amargos en cromatografía en capa fina 46

Tabla 20. Presencia de taninos 46

Tabla 21. Extractos metanólicos 47

Tabla 22. Extractos diclorometánicos 47

Page 10: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

i

ABREVIATURAS

% por ciento

µL microlitro

ATP adenosin trifosfato

BHA butil-hidroxianisol

BHT butilhidroxitolueno

C carbono

CCF cromatografía de capa fina

CE50 concentración eficiente

CG cromatografía de gases

CG-EM cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas

CG-IRTF cromatografia de gases acoplada a espectroscopía de infrarrojo com

transformada de Fourier

CI50 concentración inhibitoria

CIM concentración inhibitoria mínima

d.i. diámetro interno

DMAPP γ,γ-dimetilalilpirofosfato

DMSO dimetilsulfóxido

DPPH difenil picrilhidrazina

EM espectrometría de masas

ERN especies reactivas del nitrógeno

ERO especies reactivas del oxígeno

FAB bombardeo con átomos rápidos

FPP farnesil difosfato

g gramo

GGPP geranilgeranilo difosfato

GP galato de propilo

GPP geranil difosfato

h hora

IE impacto electrónico

IPP isopentenilpirofosfato

IQ ionización química

m/z masa/carga

Mg miligramo

mg/mL miligramos por mililitro

min minuto

mL mililitro

mm milímetro

msnm metros sobre el nivel del mar

N normal

nm nanómetro

ºC grado celsius

p/v peso volumen

Rf factor de retención

Page 11: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

ii

RMN Resonancia Magnética Nuclear

TBHQ terc-butil-hidroxiquinona

THBP trihidroxibutilfenona

UV ultravioleta

VIS visible

w/d.w. peso sobre peso seco

Page 12: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

iii

RESUMEN:

Las plantas estudiadas pertenecen al género Lantana, de la (Verbenaceae). Esta familia se

caracteriza por contar con varios géneros que presentan rendimientos interesantes de

aceite esencial, como el caso del género Lippia, que ha sido estudiado en Guatemala. Se

evaluaron los metabolitos secundarios y el rendimiento y composición de aceite esencial

de tres especies del género Lantana, Lantana camara L., Lantana hispida HBK y

Lantana trifolia L., las cuales se colectaron en siete localidades de Guatemala de forma

bimensual entre mayo 2008 y mayo 2009. Las localidades fueron: Escuintla, Retalhuleu,

Quetzaltenango, El Progreso, Zacapa, Alta Verapaz e Izabal. Estas plantas son nativas y

son utilizadas en la medicina popular. Actualmente existe información obtenida en otros

países, sobre la composición química de una de las plantas propuestas (L. camara), sin

embargo, dicha información no puede considerarse válida para Guatemala, en vista que las

variaciones en el clima generan diferenciación en los metabolitos secundarios producidos.

Los aceites esenciales fueron extraídos a partir de material vegetal seco por medio de

hidrodestilación, utilizando un aparato tipo Clevenger, obteniéndose rendimientos entre

0.03 y 0.65% (w/d.w.). La especie que presentó el mayor rendimiento de aceite esencial

fue L. hispida (0.38%). Los rendimientos para las otras dos plantas fueron 0.18% para L.

camara y 0.17% para L. trifolia. La composición de los aceites fue analizada por

cromatografía de gases, encontrándose compuestos comunes a los aceites esenciales de

plantas de la Familia Verbenaceae, como -cariofileno y germacreno D. El aceite esencial

de L. trifolia presentó entres los componentes principales metileugenol, lo cual sugiere

una mayor factibilidad de aplicación económica. La finalidad de la investigación consistía

en evaluar la actividad biocida y antioxidante de los aceites esenciales aislados de los

especímenes colectados. Ninguno de los aceites presentó actividad biológica frente a las

bacterias Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhi ATCC 14028 y Staphylococcus

aureus ATCC 25923, mientras que los aceites de L. camara y L. hispida no presentaron

actividad antioxidante significativa por el método del DPPH. Se realizó el tamizaje

fitoquímico por medio de pruebas a nivel macro y en cromatografía en capa fina, de siete

familias de metabolitos secundarios confirmándose la presencia de flavonoides, saponinas

y alcaloides en todas las muestras pero no de cumarinas, principios amargos,

antraquinonas y taninos. La recomendación más importante al considerar los resultados de

la investigación es la de realizar experimentos de domesticación de L. hispida y L.

trifolia., para evaluar rendimientos y composición de los aceites esenciales en condiciones

controladas. También se considera de utilidad caracterizar los alcaloides presentes en las

tres plantas al igual que hacer pruebas biológicas con Bacillus subtilis, Pseudomona

aeruginosa, Sarcina lutea, Candida albicans y los hongos Aspergillus Níger y A.

fumigatus.

Page 13: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

iv

SUMMARY (ABSTRACT)

The plants that were studied are found in the Lantana genus (Verbenaceae). This family is

characteristic for having various genus with interesting yields of essential oils, such as in

the case of the Lippia genus, which has been studied in Guatemala. The yield and

composition of the essential oils as well as the presence of secondary metabolites were

analyzed in three species of the Lantana genus: Lantana camara L, Lantana hispida HBK

and Lantana trifolia L. The samples were collected every two months in seven different

locations between May 2008 and May 2009. The locations were: Escuintla, Retalhuleu,

Quetzaltenango, El Progreso, Zacapa, Alta Verapaz and Izabal. These are native plants

and are used in traditional medicine. There is some information regarding the chemical

composition of one of these plants (L. camara). Nevertheless, such information cannot be

generalized to include those found in Guatemala since different environments cause

different productions of secondary metabolites. Hydrodistillation was used to extract the

essential oils with a Clevenger type apparatus. The yields obtained ranged between 0.03

and 0.65% (w/d.w.). The species with the highest yields was L. hispida (0.38%). The

yields of the other two plants were 0.18% for L. camara and 0.17% for L. trifolia. The

composition of the oils was determined using gas chromatography. The compounds found

are common to the Verbenaceae family such as -caryophellene and germacrene D. The

essential oil of L. trifolia showed a significant presence of methyleugenol, which suggest

the plausibility of economical significance. Ultimately, the investigation sought to

establish the biological and antioxidant activity of the essential oils isolated from the

plants. None of the essential oils showed any biological activity on the microorganisms

used for the bioassays: Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhi ATCC 14028 and

Staphylococcus aureus ATCC 25923. The essential oils of L. camara and L. hispida did

not show any significant antioxidant activity (DPPH method). Phytochemical screening

was performed in order to establish the presence or absence of 7 families of secondary

metabolites; TLC assays were also used. Flavonoids, saponines and alkaloids were found

in all three species, but no presence of coumarins, bitter principles, antraquinones or

tannins was detected. The most important recommendation that should be considered

according to the results obtained is to perform domestication experiments of L. hispida

and L. trifolia. That would allow to measure yields and chemical compositions of the

essential oils of plants raised in a controlled environment. It would also be

recommendable to characterize the alkaloids detected in the three plants and to perform

bioassays with Bacillus subtilis, Pseudomona aeruginosa, Sarcina lutea, Candida

albicans and the fungi Aspergillus Níger and A. fumigatus.

Page 14: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

1

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN

Las especies del género Lantana estudiadas, Lantana camara L., Lantana hispida

HBK y Lantana trifolia L., son plantas nativas de importancia apícola y ornamental, que

se utilizan en medicina popular en afecciones gastrointestinales, dérmicas y reumáticas

(Stevens, W. 2001; Márquez, et al., 1999). L. camara se encuentra desde el nivel del mar

hasta los 2200 msnm, en los departamentos de Alta Verapaz, Baja Verapaz,

Chimaltenango, Escuintla, Guatemala, Huehuetenango, Izabal, Jalapa, Petén,

Quetzaltenango, Retalhuleu, Sacatepéquez, San Marcos, Santa Rosa, Sololá y Zacapa.

L. hispida presenta dos formas más diversas, una con hojas oblongas-lanceoladas,

escabrosas a hispidulosas, que se encuentra entre 1300 y 2700 msnm y otra que presenta

hojas ovales anchas, siempre velutinosas-tomentulosas y que crece entre 600 y 1900

msnm. L. trifolia se encuentra normalmente en matorrales húmedos y en bosques de pino,

desde el nivel del mar hasta los 1200 msnm, en Alta Verapaz, Guatemala, Izabal (tipo Los

Amates), Petén, El Quiché (Standley, P. Steyermark, 1970).

Previamente se había obtenido información sobre la composición química de una

de las plantas estudiadas, L. camara (Ross, 1999), sin embargo, dicha información no

puede considerarse válida para Guatemala, en vista que las variaciones climáticas,

edáficas, latitudinales y ontológicas generan diferenciación en los metabolitos secundarios

producidos. En Guatemala se ha determinado únicamente la actividad biocida de L.

camara y L. hispida, a nivel de extractos (Cáceres et al., 1990), en cambio de L. trifolia,

no se encontró información en la revisión de literatura efectuada. En cuanto al contenido

de aceites esenciales, en estudios previos se ha encontrado que las diferencias climáticas y

edáficas, pueden causar polimorfismo químico intraespecífico (Pereira et al, 2000; Pereira

et al., 2003), por lo que en este estudio se colectaron individuos de la misma especies en

diferentes localidades. Anteriormente no se había realizado ningún estudio a nivel

químico de estas tres especies en Guatemala, y es debido a ello que se realizó esta

investigación de los aceites esenciales y metabolitos secundarios más importantes

presentes en estas plantas con el objetivo de generar información que permita validar el

conocimiento popular de la flora nativa. Esta información servirá para el desarrollo de

investigaciones futuras con un grado de especificidad mayor acerca de otros componentes

de las plantas; y a la vez se espera que contribuya a propiciar el desarrollo económico de

diferentes regiones en Guatemala, a partir del aprovechamiento de las plantas de estudio,

que podría generar mayores oportunidades de trabajo y a su vez llegar a mejorar la

calidad de vida de sus habitantes.

Sin lugar a dudas, L. camara es la especie que se encuentra presente sobre una

mayor extensión del territorio nacional. Sin embargo, las poblaciones ubicadas en el

occidente del país, sobre todo en el área de Quetzaltenango, cuentan con los especímenes

de mayor tamaño y por lo tanto mayor biomasa. Esto las provee de especial interés y

utilidad industrial en el caso de determinarse alguna utilidad para esta especie. Por su

parte, L. hispida y L. trifolia se encuentran distribuidos sobre una extensión mucho menor

de terreno y han presentado menor capacidad de adaptabilidad al estrés de origen

antropogénico por lo que varias de las poblaciones reportadas por Standley y Steyermark

Page 15: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

2

(1970) ya no existen. La determinación de utilidades específicas para ambas especies

puede contribuir a su conservación al existir un valor económico por su supervivencia.

La composición de los aceites esenciales para las tres especies estudiadas indicó

presencia de compuestos químicos característicos de la Familia Verbenaceae. Un aspecto

importante en cuanto al contenido de aceite esencial de las plantas de estudio, es que se

encontró que los rendimientos de extracción a partir de las muestras de L. camara y L.

trifolia fueron menores a los de L. hispida. Aún así, es L. trifolia la que presenta mayor

potencial para su aprovechamiento, ya que cuenta con una alta concentración de

metileugenol.

Otros datos obtenidos de los análisis químicos de las plantas estudiadas indican

que las tres contienen alcaloides, flavonoides y saponinas. Los flavonoides son de

particular interés debido a su aplicabilidad como antioxidantes en la industria cosmética y

de alimentos. Por su parte, las saponinas presentes en las plantas podrían ocasionar

dificultades para la extracción del aceite esencial utilizando la técnica de hidrodestilación.

Este problema no se observó en las diferentes extracciones realizadas a las muestras por lo

que su concentración podría ser lo suficientemente baja para no ocasionar dicha dificultad,

al menos a escala de laboratorio. No se encontró presencia de cumarinas, principios

amargos, antraquinonas y taninos en las hojas de las tres especies.

No se encontró actividad biocida a partir de los extractos analizados. Estos

resultados deben ser interpretados de acuerdo a las metodologías utilizadas. La ausencia

de actividad biocida es específica para Escherichia coli, Salmonella typhi y

Staphylococcus aureus (todas ATCC), por lo que cabe la posibilidad que los extractos

presenten actividad ante otros microorganismos patógenos. De igual manera, la actividad

antioxidante determinada por el método del DPPH, resultó negativa. La misma prueba de

actividad pero con otras metodologías podría arrojar resultados diferentes.

Page 16: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

3

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 Antecedentes en Guatemala

I.2.1.1 Plantas a estudiar:

Las plantas estudiadas pertenecen al género Lantana, de la Familia Verbenaceae. La

Familia Verbenaceae se caracteriza por contar con varios géneros que presentan

rendimientos interesantes de aceite esencial, como el caso del género Lippia, que ha sido

estudiado en Guatemala. A continuación, se describen las plantas estudiadas en el

presente trabajo, de las cuales no se contaba con información fitoquímica básica en

Guatemala.

I.2.1.2 Lantana camara

Conocida también como cinco negritos. Arbusto de 1 a 3 m de altura, de tallo

espinoso, flores amarillas, anaranjadas o rojas en forma de pequeños manojos. Los frutos

son bayas de color azul verdoso o negro, de sabor dulce. Sus hojas pueden ser

redondeadas o alargadas, ásperas o rugosas por el haz y con pelillos por el envés. La

planta es originaria de América tropical, habita en los climas cálidos, semicálido,

semiseco, desde el nivel del mar hasta los 1000 m y de los 2300 a los 3000 msnm.

Presenta diferentes usos etnomédicos, siendo usado en El Salvador como antipirético, a

partir de la cocción de flores y hojas con agua. Los frutos son tóxicos por contener

lantadeno, un sesquiterpenoide. En Colombia, se usa la planta entera en forma de cocción

para facilitar el parto y como emenagogo. En Guatemala se le atribuyen propiedades

curativas de heridas, úlceras y contusiones e infecciones de la piel. Se reporta también su

uso en afecciones respiratorias como catarro y tos ferina, se usan solo las ramas en

cocimiento. En Guatemala se encuentra desde nivel del mar hasta los 2,200 metros sobre

el nivel del mar. Se reporta en Alta Verapaz, BajaVerapaz, Chimaltenango, Escuintla,

Guatemala, Huehuetenango, Izabal, Jalapa, Petén, Quetzaltenango, Retalhuleu,

Sacatepéquez, San Marcos, Santa Rosa, Sololá, Zacapa (Standley, P. Steyermark, 1970)

En cuanto a su composición química, se ha reportado el triterpenoide lantadeno A

como principio tóxico, asimismo se ha reportado la presencia de a-amarina, lantamarona,

lantadeno B, C, y D; ácidos lantanílico, lantanólico y lantoico, oleanólico, verbascósido,

ácidos botulínicos y butulónico, -sitosterol, furanonaftaquinonas. Presenta aceite esencial, especialmente en las flores.

Se ha encontrado actividad antibiótica por las hojas y el aceite esencial sobre

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomona aeruginosa, Sarcina lutea,

Salmonella typhi y los hongos Aspergillus Níger y A. fumigatus. El extracto etanólico de

las ramas de la planta presentó efecto antibióticos contra Staphylococcus aureus, Bacillus

subtilis, y Streptococcus faecalis, habiendo resistencia en cuanto a Eschericchia coli y

Candida albicans.

Es planta tóxica para el ganado. Se ha reportado actividad antimicrobiana de los

extractos brutos de sus hojas (Cáceres et al., 1990). Se ha reportado también hojas

Page 17: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

4

presentan usos etnobotánicos para enfermedades gastrointestinales, del tracto respiratorio

y enfermedades de piel y mucosas (Cáceres et al., 1990 a)

I.2.1.3 Lantana hispida HBK

Arbustos erectos, de 1-2 m de altura con ramas puberulentas a hispidas, hojas

usualmente opuestas, raramente verticiladas, raramente subsésiles ovales u oblongas

lanceoladas, de 1-9 cm de longitud (principalmente de 2-5 cm) brácteas lanceovaladas,

corola blanca, crema, púrpura, o levemente rosadas. Frutos púrpura-negros, jugosos.

La planta crece en bosques de roble, pino-roble, o de pino, ocasionalmente en

colinas secas y rocosas, entre los 300 y los 2700 msnm. Las dos formas más diversas de

esta especie compleja son las plantas con hojas, oblongas-lanceoladas, escabrosas a

hispidulosas (1300-2700 msnm) y las que presentan hojas ovales anchas, siempre

velutinosas-tormentulosas (600-1900msnm). (Standley, P. Steyermark, 1970). Cáceres

reporta que los extractos brutos presentan actividad contra levaduras (Cáceres et al., 1990)

y que sus hojas presentan usos etnobotánicos para enfermedades gastrointestinales, y

enfermedades de piel y mucosas (Cáceres et al., 1990 a)

I.2.1.4 Lantana trifolia L.

Se le encuentra normalmente en matorrales húmedos, en bosques de pino, raramente

en terrenos claros. Crece desde el nivel del mar hasta los 1200 msnm, en Alta Verapaz,

Guatemala, Izabal (tipo Los Amates), Petén, El Quiché. Son arbustos erectos de hasta tres

metros de altura, trocos pilosos, hojas usualmente con pecíolo corto, lanceoladas u

oblongo-lanceoladas, agudas o atenuadas en la base. Las inflorescencias de 5 cm de largo,

densamente floreadas, pedunculadas, brácteas verdes, corola usualmente rosa, lila o

púrpura, raramente blanca. Es una planta común en muchos lugares de América Central,

a menudo en bosques secundarios (Standley, P. Steyermark, 1970). No se encontró

información en la literatura sobre estudios realizados acerca de esta planta.

I.2.1.5 Estudios de polimormismo de aceites esenciales de diferentes plantas

El polimorfismo químico ha sido estudiado en especies de diferentes regiones

geográficas. La composición química de los aceites esenciales de Lippia alba de 15

diferentes regiones de Colombia fue analizada por CG-EM y por Análisis de

Componentes Principales (ACP). Se encontraron tres quimiotipos, siendo estos: a)

carvona (41 %), b) citral (55 %); c) híbrido (carvona: 25 %; limoneno: 22 % y citral: 21

%). Más del 60 % de la variación fue representada en los dos primeros componentes

principales (Durán et al., 2007).

Poli et al. (1997) realizaron un estudio comparativo de los aceites esenciales de

Santolina insularis y Santolina corsica. Las dos especies se encuentran en Sardeña, Italia,

siendo utilizadas indistintamente por la medicina tradicional en la isla. El análisis de los

aceites esenciales por CG-EM mostró diferencias cualitativas y cuantitativas siendo

algunos componentes identificados en ambas especies, mientras que otros fueron

característicos de una sola especie, como felandreno, -3-careno y -terpineno para S.

Page 18: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

5

insularis.

La composición del aceite esencial de 11 poblaciones de Thymus carnosus y su

variabilidad fue estudiada por CG, CG-EM y RMN-13

C, y análisis multivariado de

conglomerados. Tres muestras de Extremadura (España) fueron caracterizadas por su alto

contenido de linalol (9.5-25.5 %). Los primeros tres componentes principales explicaron

83.8 % de la variancia total. Se obtuvo tres conglomerados. I: alto contenido de borneol,

hidrato de cis-sabineno y terpinen-4-ol (54.2 % de las muestras); II: linalol, borneol e

hidrato de trans-sabineno (9.6 %); III: borneol y canfeno (36.2 %) (Salgueiro et al., 1995).

En un estudio del polimorfismo químico en aceites esenciales de Thymus

caespetitius de las Islas Corvo, Flores, São Miguel y Terceira (Açores), en Portugal, se

analizó la composición de los aceites esenciales de 24 poblaciones analizada por CG y

CG-EM. Se encontraron tres conglomerados principales: carvacrol (41-65%), timol (35-

51 %) y -terpineol (33-37 %). Según los autores, el polimorfismo químico puede deberse

a la variabilidad genética o a la influencia de factores edáficos (Santos et al., 2005).

Pereira et al. (2000) investigaron el polimorfismo químico de los aceites esenciales

de Thymus caespetitius en la isla San Jorge (Açores). En el estudio, los autores extrajeron

el aceite esencial por hidrodestilación utilizando un aparato Clevenger para determinar el

rendimiento del aceite y por extracción-destilación con aparato Likens-Nickerson, para

determinar la composición del aceite esencial por CG-EM. Así, se analizaron los aceites

esenciales de diez poblaciones de Thymus caespetitius habiéndose encontrado que la

relación enantiomérica de sabineno y -terpineol varía con la localidad de colecta (Pereira et al., 2000).

En otro estudio se investigó la influencia de los factores ambientales sobre el

polimorfismo químico de los aceites esenciales de Lychnophora ericoides en dos

poblaciones de la planta en el Cerrado brasileño. Se colectaron hojas de la planta en

intervalos de 2 meses durante un año y estas fueron analizadas por CG-EM y ACP. Dos

grupos de aceites esenciales fueron distinguidos en relación con el local de colecta y

composición, siendo estos: Conglomerado I: correspondientes a la localalidad Vianópolis,

con alto porcentaje de -bisabolol (45-76 %) y -cadinol (11-24 %). Conglomerado II:

correspondiente a la localidad Cristalina, con alto contenido de (E)-nerolidol (31-47 %) y

ar-dihidro-turmerona (5-15 %). La quimiovariación encontrada parece deberse a factores

ambientales y a características del suelo (Curado et al., 2006).

I.2.1.6 Estudios de atividad antimicrobiana de aceites esenciales de plantas en

América Latina

Diferentes estudios de actividad antimicrobiana han sido realizados en aceites

esenciales de plantas de América Latina, especialmente del género Lippia, Familia

Verbenaceae. En un estudio en Brasil, el aceite de L. origanoides tipo carvacrol presentó

mayor actividad que el antibiótico Amphotericina B contra los hongos Candida albicans

Serotipo B ATCC 36802, Candida albicans, Candida guilliermondii, Candida

parapsilosis, y mayor actividad que el antibiótico Vancomicina contra las bacterias

Page 19: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

6

Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus MRSA (BMB9393),

Lactobacillus casei ATTC 4646 y Streptococcus mutans ATCC 25175 (Oliveira et al.,

2007).

El aceite esencial de L. graveolens de dos poblaciones de Guatemala fue evaluado

contra diferentes microorganismos. Los aceites, tipo carvacrol y timol, presentaron

actividad contra varios microorganismos, entre ellos Escherichia coli, Staphylococcus

aureus, Staphylococcus epidermis, Streptococcus faecalis, Proteus vulgaris, Candida

albicans, Clodosporium cladosporioides, Apergillus niger, encontrándose que el tipo

carvacrol presentó la mayor actividad (Salgueiro et al., 2003).

En otro estudio, L. alba f. Intermedia y L. alba presentaron actividad antimicrobiana

contra diferentes bacterias y hongos por el método de difusión en agar (Oliveira et al.,

2006). El aceite de L. alba f. Intermedia presentó mayor actividad que la anfotericina

contra los hongos Candida albicans Serotipo B ATCC 36802, Candida guilliermondii,

Trichophytum rubrum T544, y que vancomicina contra las bacterias Staphylococcus

aureus MRSA (BMB9393), Lactobacillus casei ATTC 4646 y Streptococcus mutans

ATCC 25175. El aceite de L. alba presentó mayor actividad que los antibióticos contra

los hongos Candida albicans Serotipo B ATCC 36802, Candida albicans, Candida

guilliermondii, Trichophytum rubrum T544, y que vancomicina contra las bacterias

Staphylococcus aureus ATCC 25923, Lactobacillus casei ATTC 4646 y Streptococcus

mutans ATCC 25175. Otro quimiotipo de L. alba había presentado previamente,

actividad contra C. albicans, con una CIM de 0.6 mg/mL, siendo un aceite que presentó

un rendimiento de 0.1 % y linalol como componente principal (76.3 %) seguido por cineol

(2.34 %) (Duarte et al., 2005).

En un estudio reciente, el aceite esencial de Lippia sidoides presentó timol (56.67 %)

y carvacrol (16.73 %) como componentes principales, seguidos por p-cimeno (7.13 %),

timol metil éter (5.06 %) y aromadendreno (2.79 %). El método de difusión del disco fue

utilizado para evaluar la actividad antimicrobiana, mostrando 10 L de una solución de

217.5 mg/L, inhibición del crecimiento para Streptococus mutans (d.i. 18.7 mm contra

20.0 mm de vancomicina), Streptococcus mitis (d.i. 10.0 mm contra 17.0 mm de

vancomicina), Streptococcus salivarius (d.i. 8.5 mm contra 22.7 mm de vancomicina),

Streptococcus sanguis (d.i. 12 mm contra 16 mm de vancomicina) y Candida albicans (34

mm contra 27.2 mm de cetoconazol) (Botelho et al., 2007a). La actividad contra estos

microorganismos orales fue confirmada por la prevención del gel de L. sidoides (0.5%

volumen/masa) contra la absorción del hueso alveolar en periodontitis experimental en

ratones (Botelho et al., 2007b). Es interesante mencionar que una muestra del aceite

esencial de L. sidoides con timol (59.65 %) y (E)-cariofileno (10.60 %) como

componentes principales también presentó actividad antihelmíntica contra el nematoide

Haemochus contortus en ensayos con ratones (Camurça-Vasconcelos et al., 2007). El

aceite esencial de L. sidoides de Ceará también ha presentado actividad larvicida contra

Aedes aegypti (Carvalho et al., 2003).

Page 20: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

7

I.2.2 Justificación del trabajo de investigación

Las plantas estudiadas en la presente investigación pertenecen a la familia

Verbenaceae, género Lantana, siendo las especies Lantana camara L., Lantana hispida

HBK y Lantana trifolia L. Estas plantas son nativas de Guatemala y son utilizadas en la

medicina popular. Actualmente existe información obtenida en otros países, sobre la

composición química de una de las plantas propuestas (L. camara), sin embargo, dicha

información no puede considerarse válida para Guatemala, en vista que las variaciones en

el clima generan diferenciación en los metabolitos secundarios producidos. En Guatemala

se ha determinado únicamente la actividad biocida de dos de las plantas a estudiar (L.

camara y L. hispida), a nivel de extractos, por lo cual no se tiene conocimiento sobre que

metabolito o grupo de metabolitos son los responsables de esa actividad, lo cual no

permite la generación de valor agregado para estas plantas. De la tercera planta, L.

trifolia, no se encontró información en la literatura sobre estudios sobre su composición

química.

Es debido a ello que se justificó la realización de esta investigación; el contar con

información química respecto a los aceites esenciales y los grupos de metabolitos

secundarios más importantes presentes en estas plantas, servirá para el desarrollo de

investigaciones futuras con un grado de especificidad mayor acerca de otros componentes

de las plantas. Así mismo, se espera que contribuya al desarrollo económico de diferentes

regiones en Guatemala, a partir del aprovechamiento económico de las plantas de estudio,

que podría generar mayores oportunidades de mejoramiento del ingreso económico y a su

vez contribuir al mejoramiento de la calidad de vida de sus habitantes. Por otra parte,

también se contribuye a los objetivos de la Escuela de Química y del Laboratorio de

Investigación de Productos Naturales –LIPRONAT- en la obtención de información útil

en relación con L.camara L., L.hispida HBK y L.trifolia L., siendo esta última investigada

por primera vez en Guatemala a nivel químico.

Page 21: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

8

I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS

I.3.1 Objetivos

I.3.1.1 General

Evaluar la actividad biocida y antioxidante de los aceites esenciales y metabolitos

secundarios aislados de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L.,

de la Familia Verbenaceae, de diferentes regiones de Guatemala.

I.3.1.2 Específicos

I.3.1.2.1 Determinar la composición química de los aceites esenciales de Lantana camara

L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L.

I.3.1.2.2 Determinar las variaciones estacionales en el rendimiento de extracción de

aceites esenciales de las plantas nativas estudiadas.

I.3.1.2.3 Determinar las diferencias en el rendimiento y la composición química de los

aceites esenciales obtenidos por los métodos de hidrodestilación con aparato tipo

Clevenger y por extracción-destilación con aparato Likens-Nickerson.

I.3.1.2.4 Establecer los posibles usos del aceite esencial de las plantas nativas estudiadas,

con base en su composición química.

I.3.1.2.5 Determinar la actividad biocida de los aceites esenciales y metabolitos

secundarios aislados de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L.,

usando la metodología de bioautografía.

I.3.1.2.6 Determinar la actividad antioxidante de los aceites esenciales y metabolitos

secundarios aislados de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L.

I.3.1.2.7 Establecer las procedencias de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y

Lantana trifolia L. con mejores rendimientos cualitativos.

I.3.1.2.8 Desarrollar metodología de aislamiento y análisis que permita la determinación

rápida y confiable de los componentes de aceites esenciales y metabolitos secundarios.

I.3.1.2.9 Evaluar los métodos de extracción de metabolitos secundarios por maceración en

etanol y por extracción por ultrasonido.

1.3.1.2.10 Caracterizar los aceites esenciales de Lantana camara L., Lantana hispida

HBK y Lantana trifolia L. por su índice de refracción.

Page 22: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

9

I.3.2 Hipótesis

Las tres plantas sujetas a estudio, Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana

trifolia L., presentan aceites esenciales y metabolitos secundarios con actividad biocida y

antioxidante.

I.4 METODOLOGIA (Descripción detallada de la Metodología)

I.4.1 Localización

El área de colecta de las plantas se localiza en los departamentos de Escuintla,

Retalhuleu, Quetzaltenango, El Progreso, Zacapa, Alta Verapaz e Izabal (Tabla 1), en los

cuales se realizó una búsqueda de acuerdo con la información provista por la Flora de

Guatemala y de acuerdo al cuadro siguiente, en cuanto a la localización de las plantas en

el país.

Tabla 1. Ubicación geográfica de los sitios de colecta de muestras.

Nombre Científico Lugar Coordenadas

Geográficas

Altitud

(msnm)

Lantana hispida L. San Vicente Pacaya,

Escuintla

N 14º 23. 452´

WO 90º 35. 897´

2,290

Lantana hispida L.

San Cristóbal

Acasuaguastlán, El Progreso

N 14º 55.305´

WO 89º 56.413´

278

Lantana hispida L. San Cristóbal

Acasuaguastlán, El Progreso

N 14º 55.341´

WO 89º 56. 480´

296

Lantana hispida L. San José, Teculután, Zacapa N 14º 59.043´

WO 89º 41.677´

248

Lantana hispida L. San José, Teculután, Zacapa N 14º 59.002´

WO 89º 41. 704´

232

Lantana hispida L. El Chico, Usumatlán, Zacapa

N 15º 01.141´

WO 89º 50. 528´

999

Lantana hispida L.

Chorjalé, Cabricán,

Quetzaltenango

N 15º 05.646´

WO 91º 40.838´

2,472

Lantana hispida L.

La Grandeza, Cabricán,

Quetzaltenango

N 15º 06.184´

WO 91º 41.296´

2,462

Lantana camara L. Zunil, Quetzaltenango N 14º 46.748´

WO 91º 29.791´

2,085

Lantana camara L. Zunil, Quetzaltenango N 14º 46.393´

WO 91º 30.098´

1,989

Lantana camara L.

La Calera, Zunil,

Quetzaltenango

N 14º 46.472´

WO 91º 30.096´

2,010

Lantana camara L.

La Calera, Zunil,

Quetzaltenango

N 14º 46.480´

WO 91º 30.091´

2,010

Page 23: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

10

Lantana camara L. San Felipe, Retalhuleu

N 14º 37.373´

WO 91º 35.771´

620

Lantana trifolia L. Santa Inés, Los Amates,

Izabal

N 15º 13.788´

WO 89º 07.575´

103

Lantana trifolia L. Santa Inés, Los Amates,

Izabal

N 15º 13.759´

WO 89º 07.623´

103

Lantana trifolia L. Santa Inés, Los Amates,

Izabal

N 15º 13.018´

WO 89º 09.253´

93

Lantana trifolia L. Santa Inés, Los Amates,

Izabal

N 15º 13.144´

WO 89º 08.941´

100

Lantana trifolia L. Santa Inés, Los Amates,

Izabal

N 15º 13.323´

WO 89º 08.570´

105

Lantana trifolia L. Santa Inés, Los Amates,

Izabal

N 15º 13.144´

WO 89º 08.941´

100

Lantana trifolia L. Lachuá, Alta Verapaz N 15º 56.038´

WO 89º 30.601´

165

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007

I.4.2 Las Variables

I.4.2.1 Variables dependientes

Rendimiento de los aceites esenciales (% p/p) y porcentaje de los componentes de los

aceites esenciales de las plantas de estudio (% área cromatográfica).

Metabolitos secundarios de las plantas de estudio (cualitativo).

I.4.2.2 Variables independientes

Especies de estudio (Lantana camara, Lantana hispida y Lantana trifolia)

Localidades de colecta de las plantas de estudio.

I.4.3 Indicadores

Los indicadores fisicoquímicos que permiten evaluar los objetivos de la presente

investigación son los siguientes:

1.4.3.1 Aceites esenciales

Porcentajes de rendimiento de extracción de aceites esenciales.

Porcentajes de componentes de aceites esenciales analizados por cromatografía de gases.

1.4.3.2 Metabolitos secundarios

Presencia de metabolitos secundarios analizados por tamizaje fitioquímico:

flavonoides, cumarinas, alcaloides, saponinas, antocianinas, antraquinonas, princípios

amargos y taninos.

Page 24: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

11

I.4.4 Estrategia Metodológica

I.4.4.1 Población y Muestra

La población está constituida por las poblaciones de las plantas L. camara, L.

hispida y L. trifolia en los departamentos de Escuintla, Retalhuleu, Quetzaltenango, El

Progreso, Zacapa, Alta Verapaz e Izabal. La muestra corresponde a los especimenes

colectados en las poblaciones localizadas, de acuerdo con la información que se presenta

en la Tabla 1 en la sección de Resultados.

I.4.5 El Método

I.4.5.1 Muestreo

Con base en la información de la Flora Guatemalteca, se realizaron viajes de campo

para la localización de las especies a estudiar. En la Tabla 1 se presentan los lugares en

que se localizó y colectó material vegetal correspondiente a las tres especies de estudio.

Se colectaron dos ejemplares de cada especie para herborizar, depositándose una en el

herbario de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. A cada muestra le fue asignado

un código, con ocho letras abreviando el nombre científico de la especies, seguido de

punto y cuatro letras abreviando el lugar de colecta, seguido del número asignado a la

población de colecta en el lugar seguido de punto y dos cifras correspondientes al

ejemplar. Las coordenadas geográficas de los lugares de colecta se registraron utilizando

un sistema de posicionamiento geográfico (GPS) para referenciar el lugar.

En vista que en varias localidades el material era muy escaso, el tamaño de la

muestra varió entre 100 g y 1000 g de material húmedo. El material vegetal colectado fue

transportado a la ciudad de Guatemala para su procesamiento, en el Laboratorio de

Investigación de Productos Naturales (LIPRONAT) de la Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacia.

I.4.5.2 Preparación de la muestra

Las hojas y los troncos suaves del material vegetal fueron separados, descartándose

el material sobrante. El material vegetal fue mezclado y secado a temperatura ambiente,

dejando una fracción de 25.0 g para determinaciones de humedad. Dos ejemplares de

cada especie fueron herborizados para depositar en herbario. Cada muestra fue dividida en

tres submuestras de masa aproximadamente igual masa. A partir de cada submuestra se

realizaron las determinaciones que se describen en las siguientes secciones.

I.4.5.3. Determinación de humedad

10.0 g de material vegetal recién cortado (submuestra 1) fueron pesados, colocados

en una cápsula de porcelana e introducidos en el horno de convección y a 95ºC por 20 h.

Luego de transcurridas las 20 h, la muestra fue pesada en balanza analítica, determinando

el contenido de humedad por diferencia con el peso original.

Page 25: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

12

I.4.5.4 Determinación de contenido de cenizas

4.0 g de material vegetal húmedo fueron pesados con exactitud en un crisol de

porcelana. Luego, la muestra fue calcinada en una mufla a 550 oC por 14 h, o hasta

obtener cenizas blancas. El crisol conteniendo las cenizas fue pesado en balanza analítica

luego de la calcinación El contenido de cenizas fue calculado por la diferencia de peso del

crisol con material vegetal y con las cenizas.

I.4.5.5. Extracción de aceites esenciales por hidrodestilación con aparato tipo Clevenger

Se pesaron entre 10.0 y 25.0 g de material vegetal en un balón de 250 mL, 24/40,

agregándose agua hasta sobrepasar levemente el nivel de la mitad del balón.

Luego el balón fue acoplado con el aparato de extracción, y fue encendida la estufa y

la circulación del agua a través del refrigerante del aparato de destilación. El aceite

esencial fue destilado por 3 horas, contadas a partir de la hora en que se inició la

destilación.

Luego de apagar el aparato de destilación, el aceite fue colectado en n-pentano y

concentrado en rotavapor. Luego se midió la masa del aceite destilado y se almacenó en

vial de 2 mL en refrigeración, para su posterior análisis cromatográfico.

I.4.5.6. Extracción de metabolitos secundarios por maceración con diclorometano y metanol

Se colocaron 50.0 g de material seco, en un percolador de 1 L. Se agregó

diclorometano al percolador, hasta cubrir completamente la muestra. Luego se dejó

reposar la muestra por 48 horas. La muestra fue filtrada y se colectó la solución

diclorometánica en un recipiente de vidrio. A continuación se agregó una nueva cantidad

de diclorometano al material vegetal restante en el percolador, dejándose reposar la

muestra por 24 horas.

La muestra fue nuevamente filtrada y se colectó la solución diclorometánica. En los

casos en que la solución aún presentaba coloración, se repitieron los dos pasos anteriores,

hasta obtener soluciones sin coloración o con coloración muy débil. El mismo

procedimiento se llevó a cabo con metanol utilizando el mismo material, obteniendo así

dos extractos de la misma muestra: diclorometánico (con una mayor concentración de

compuestos apolares) y metanólico (con una mayor concentración de compuestos polares).

I.4.5.7. Análisis cromatográfico de los aceites esenciales

Se realizaron de acuerdo con la metodología de Adams (2002), inyectando 0.1 µL de

una solución con aproximadamente 5 µL de aceite esencial en 0.2 mL de cloroformo, en

un cromatógrafo de gases equipado con una columna capilar HP5 de 60 m y programa de

temperatura con rampa de 60 ºC a 220 ºC, a 3 ºC/min.

Page 26: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

13

La identificación de los componentes de los aceites esenciales se realizó por medio

de los índices de retención de los componentes presentes, calculados a partir de la

inyección de una mezcla de hidrocarburos de cadena lineal de serie homóloga desde el

octano al eicosano y por la comparación de tiempos de retención de los picos

cromatográficos con los de estándares puros. El análisis cuantitativo se realizó por medio

del cálculo del porcentaje de área total de los picos cromatográficos.

I.4.5.8. Tamizaje fitoquímico

Se realizaron pruebas de tamizaje fitoquímico para determinar la presencia de los

siguientes compuestos en el material vegetal seco que son considerados como principios

activos: alcaloides, taninos, flavonoides, principios amargos, antraquinonas, cumarinas y

saponinas. Las pruebas se realizaron siguiendo los procedimientos del Laboratorio de

Investigación de Productos Naturales y del Departamento de Farmacognosia de la

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos (Medinilla,

1996), que se describen a continuación:

I.4.5.8.1 Investigación de alcaloides

Ensayos macro y semimicro: Pesar 1 g de material vegetal. Agregar 2 gotas de

solución de hidróxido de amonio al 10 por ciento (p/v), luego añadir 25 mL de metanol a

60C. Filtrar con papel filtro Whatman 1 y acidificar el filtrado con ácido clorhídrico 2 N. La solución resultante dividirla en 4 tubos y evaluar de la siguiente manera:

Tubo 1: agregar 5 gotas del reactivo de Mayer’s. (Color blanco a crema).

Tubo 2: agregar 5 gotas del reactivo de Dragendorff. (Color rojo a naranja).

Tubo 3: agregar 5 gotas del reactivo de Wagner. (Color marrón).

Tubo 4: testigo.

Usar como estándar soluciones al 1 por ciento de atropina y papaverina. Observar

durante 2 horas la existencia de precipitados, turbidez o precipitación de complejos en los

tubos.

Preparación de Reactivos:

Mayer’s (yoduro de mercurio y potasio)

a. 1.36 g de HgCl2 /60 mL H2O

b. 5 g KI / 10 mL H2O

c. Mezclar y diluir a 100 mL.

Dragendorff (yoduro de bismuto y potasio)

a. 8 g Bi(NO3)3 5 H2O / 20 mL HNO3

7. 27.2 g KI / 50 mL H2O

8. Mezclar, reposar, decantar supernadante. Diluir a 100 mL.

Wagner (yodo-yoduro de potasio)

a. 1.27 g I2 + 2 g KI / 5 mL H2O

b. Diluir a 100 mL.

Page 27: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

14

Cromatografía en capa fina: Pesar 1 g de material vegetal seco y molido, agregar 1 mL de

hidróxido de amonio al 10 por ciento (p/v) y extraer con 5 mL de metanol. Colocar en

baño maría a 60 C durante 5 minutos. Filtrar y concentrar. Aplicar en una placa de silica

gel 60 F254, utilizando como estándar una solución de atropina y papaverina al 1 por

ciento en metanol (10 μL).

Fase móvil: tolueno-acetato de etilo-dietilamina (70:20:10); acetato de etilo-metanol-agua

(100:13.5:10), cloroformo- dietilamina (90:10); acetona-agua-amonio concentrado

(90:7:3)

Detección:

Sin tratamiento químico: UV 254nm fluorescencia, UV 365 nm algunos fluorescen azul o

amarillo.

Reactivo de Dragendorff: zonas cafés o naranjas en región visible, los colores no son

estables.

I.4.5.8.2 Investigación de flavonoides y antocianinas

Ensayos macro y semimicro: Extraer 3 g de material vegetal pulverizado con 10 mL

de etanol o metanol al 80 por ciento, filtrar y concentrar. Enfriar a temperatura ambiente y

triturar el residuo con 15 mL de éter de petróleo hasta que la extracción sea incolora.

Disolver el residuo en 30 mL de metanol al 80 por ciento, filtrar y dividir en 5 tubos:

Tubo 1: agregar 0.5 mL de ácido sulfúrico concentrado.

Tubo 2: agregar 3 a 5 gotas de cloruro férrico al 10 por ciento (p/v).

Tubo 3: agregar 0.5 mL de ácido clorhídrico concentrado y calentar en baño de maría por

5 minutos (prueba para leucoantocianinas).

Tubo 4: agregar magnesio metálico y 0.5 mL de ácido clorhídrico concentrado.

Tubo 5: agregar un álcali a un extracto acuoso.

Tubo 6: agregar solución de ácido bórico en anhídrido acético.

Tubo 7: testigo.

Evaluar las reacciones, cambios de color y/o formación de precipitado comparados con el

testigo.

Desarrollo inmediato de color flavonas y flavonoles (amarillo a rojo), flavanonoles

(rojo a magenta), flavanonas (rojo, magenta, violeta, azul), isoflavonas (amarillo);

isoflavononas, chalconas y auronas no dan coloración.

Cromatografía en capa fina: Extraer 1 g de material vegetal seco pulverizado con 10 mL

de metanol por 5 minutos en baño de maría a 60C. Filtrar la solución y aplicar sobre las cromatoplacas de silicagel 60 F254. Como estándar emplear solución de flavonoides al

0.05 por ciento en metanol (10 μL). (Quercetina, rutina, ácido clorogénico, hiperósido).

Fase móvil: acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético glacial-agua (100:11:11:27), n-

butanol-ácido acético-agua (40:10:50); acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético

glacial-etilmetilcetona-agua (50:7:3:30:10)

Page 28: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

15

Detección:

Sin tratamiento químico: UV 254 nm fluorescencia, zonas azules o amarillas. UV 365 nm,

dependiendo la estructura fluorescen de color amarillo, azul o verde.

Reactivo de Productos Naturales (NP/PEG). Fluorescencia intensa en UV-365 nm.

Solución 1: solución metanólica al 1 por ciento de difenilboriloxietilamina (NP).

Solución 2: solución etanólica al 5 por ciento de polietilenglicol 4000 (PEG).

Aplicar a la placa vapores de amoniaco para intensificar el color de las manchas.

I.4.5.8.3 Investigación de antraquinonas

Prueba de Bornträger: Extraer 3.0 g de material vegetal pulverizado con 10 mL de

etanol al 80 %, filtrar y concentrar en baño de maría (60C). Disolver el residuo con 30

mL de agua destilada y filtrar. Extraer con 10 mL de benceno. A la fase bencénica añadir

5 mL de solución de test de amonio y agitar. Observar cambios de color en la fase

alcalina (color rojo, rosado: positivo).

Prueba de Bortränger modificada: Calentar 0.3 g de material vegetal pulverizado con

10 mL de hidróxido de potasio alcohólico 0.5 N y 1 mL de peróxido de hidrógeno al 3 por

ciento y calentar 10 min en baño de maría a 60C. Añadir 10 gotas de ácido acético glacial para acidificar. Extraer con 10 mL de benceno. A la capa bencénica adicionar 5

mL de solución de prueba de amonio y agitar. Observar cambios de color en fase alcalina

(color rojo, rosado: positivo).

Cromatografía en capa fina: Extraer 0.5 g de material vegetal seco pulverizado con

5 mL de metanol en baño maría (60C) por 5 minutos. Filtrar y aplicar 10 μL en la

cromatoplaca de silicagel 60 F254.

Estándar: solución al 0.1 % en metanol de antraquinonas (10 μL). (Aloína,

flangulina A/B, glucofrangulina A/B y sus agliconas, reina, aloe-emodina, extracto de sen)

Fase móvil: acetato de etilo-metanol-agua (100:17:13), acetato de etilo-metanol-agua

(100:13.5:10).

Detección:

Sin tratamiento químico: UV 254 nm fluorescencia, UV 365 nm fluorescencia amarilla o

rojo-café.

Solución etanólica de hidróxido de potasio al 5 o 10 %.

Antraquinonas: zonas rojas en visible y fluorescencia roja en UV-365 nm.

Antronas y antranolas: zona amarillas en visible y fluorescencia amarilla en UV-365 nm.

I.4.5.8.4 Investigación de cumarinas

Ensayos macro y semimicro: Medir 5 mL de extracto vegetal metanólico. Agregar 1 mL

de agua destilada hirviendo. Con un capilar aplicar 2 manchas en papel filtro. A una

Page 29: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

16

mancha agregar 1 gota de hidróxido de potasio 0.5N. Observar bajo luz ultravioleta de

365 nm (fluorescencia azul o verde: positivo).

Cromatografía en capa fina: A 1.0 g de material vegetal adicionar 10 mL de metanol y

calentar 30 minutos en baño de maría. Filtrar y evaporar hasta 1 mL. Aplicar 20 μL en

una cromatoplaca de sílica gel 60 F254. Utilizar como estándar canela en metanol al 1 por

ciento, umbeliferona, ácido p-cumárico, cumarina.).

Fase móvil: tolueno-acetato de etilo (93:7); tolueno-éter (1:1 saturado con 10 % de ácido

acético, 50 mL de tolueno y 50 mL de éter son mezclados durante 5 min con 50 mL de

ácido acético al 10 %, se filtra y se descarta la fase de abajo, y la mezcla de tolueno-éter

es usada).

Detección:

Sin tratamiento químico UV 254nm fluorescencia. UV 365 nm todas las cumarinas

muestras una intensa fluorescencia azul o verde- azul.

Solución etanólica de KOH al 5 o 10 por ciento. UV-365 nm fluorescencia azul o verde.

I.4.5.8.5 Investigación de saponinas

Prueba de espuma:

Tubo 1: 100 mg de material vegetal pulverizado y seco.

Tubo 2: 2 mL de control de saponinas (0.5 %).

Tubo 3: 2 mL de agua.

A cada tubo se le adiciona 10 mL de agua destilada. Calentar en baño de maría

(60C) durante 30 minutos. Enfriar, tapar los tubos, agitar vigorosamente 30 a 40

segundos. Dejar reposar los tubos durante 30 minutos, observar la formación de capa de

espuma. Si una capa de espuma mayor de 3 cm persiste en la superficie líquida después de

30 minutos se presume la presencia de saponinas.

Cromatografía en capa fina: 2 g de material vegetal seco, se extraen con 10 mL de

etanol al 70 por ciento con reflujo por 10 minutos. Evaporar a 5 mL y proceder a aplicar

25-40 μL en una cromatoplaca de silicagel 60 F254. Estándar de saponinas al 0.1 por

ciento en metanol (10 μL).

Fase móvil: cloroformo-metanol-agua (64:50:10), n-butanol-ácido acético-agua (50:10:40).

Detección:

Reactivo de sangre, zonas hemolíticas blancas en fondo rojo.

Reactivo de Liebermann-Burchard: UV-365 o VIS zonas azules y verdes de saponinas

esteroidales, rojas y violetas de triterpenoides. Reactivo de Komarowsky: zonas azules,

Page 30: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

17

amarillas y rojas. Vainillina-ácido sulfúrico y anisaldehído-ácido sulfúrico: zonas azules,

violetas, amarillentas.

I.4.5.8.6 Investigación de principios amargos

Cromatografía en capa fina: Calentar 1 g de material vegetal con 10 mL de metanol

en baño de maría a 60C por 10 minutos. Evaporar y filtrar a 2 mL. Aplicar en la

cromatoplaca. Estándar: artemisina al 1 por ciento en metanol (20 μL).

Fase móvil: acetato de etilo-metanol-agua (77:15:8) y cloroformo-metanol (95:5).

Detección: vainillina-ácido sulfúrico, anisaldehído-ácido sulfúrico. Zonas rojas-violetas,

cafés-rojas, azules-verdes.

(Reactivo de Liebermann-Buchard: UV-365 nm: gris, café; VIS: café oscuro, gris).

I.4.5.8.7 Investigación de taninos

Ensayos macro y semimicro: Extraer 10.0 g de material vegetal pulverizado con 30

mL de etanol o metanol al 80 %, filtrar y evaporar a sequedad. Añadir 25 mL de agua

caliente al residuo y agitar con varilla y dejar enfriar. Agregar 1 mL de solución de

cloruro de sodio al 10 por ciento y filtrar. Adicionar 3 mL del filtrado a 4 tubos de

ensayo:

Tubo 1: testigo.

Tubo 2: agregar 4 a 5 gotas de solución de gelatina al 1 % (p/v).

Tubo 3: agregar 4 a 5 gotas de gelatina-sal (1 por ciento de gelatina y cloruro de sodio al

10 por ciento).

Tubo 4: agregar 3 a 4 gotas de solución de cloruro férrico al 10 % (p/v).

Observar la formación de precipitado y/o cambio de coloración.

Con cloruro férrico: grisáceo-negro: catecol; negro-azulado: pirogalol)

I.4.5.9 Actividad biocida de metabolitos secundarios aislados y aceites esenciales

Los aceites esenciales de dos especimenes de cada especie, fueron utilizados para

realizar ensayos de actividad biocida por inoculado en caja de Petri y por bioautografía

colocando los cromatogramas de capa fina obtenidos cromatoplacas de sílica gel sobre

medio inoculado. Los ensayos realizados correspondieron a la bacteria grampositiva,

Staphylococcus aureus, y a las bacterias gramnegativas Salmonella typhi y Escherichia

coli.

I.4.5.10 Indice de refracción de aceites esenciales

El índice de refracción de los aceites esenciales fue obtenido utilizando un

Refractómetro tipo Abbe. Este parámetro es de utilidad para la evaluación de de

diferencias entre los aceites esenciales.

I.4.6 La técnica estadística

Para la interpretación de los resultados se utilizó estadística descriptiva. Se obtuvo la

Page 31: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

18

media del rendimiento de la extracción de aceites esenciales de tres o más repeticiones, así

como de la integración de las áreas de los picos cromatográficos correspondientes a los

componentes de los aceites esenciales analizados en las plantas de estudio.

Para su identificación, las muestras colectadas en cada muestreo fueron codificadas,

consignándose en una hoja de registro las características principales del lugar de muestreo,

ubicación y de la planta, además de registrarse la información en cuaderno de campo.

Se considera que una planta presenta potencial económico para su extracción de

aceite esencial si su contenido de aceite es mayor que 0.5 % y presenta componentes

mayoritarios de valor económico (Aragao, 1981).

I.4.7 Los instrumentos utilizados

Los principales instrumentos utilizados en esta investigación fueron:

Cromatógrafo de gases con detector de llama

Cromatógrafo de gases con detector de masas

Espectrofotómetro UV-VIS

Aparato de hidrodestilación tipo Clevenger

Refractómetro tipo Abbe

Rotavapor

Page 32: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

19

PARTE II

MARCO TEÓRICO (CONCEPTUAL)

II.1 Aceites esenciales

Los aceites esenciales son productos volátiles de origen vegetal obtenidos por

proceso físico y puede presentarse aisladamento en mezclados entre sí, rectificados,

desterpenados o concentrados (Yunes y Cechinel, 2009). Los aceites esenciales son usados

en muchas industrias para proporcionar aromas y olores especiales a productos como

perfumes, cosméticos, jabones, condimentos, dulces, etc. Otros usos consisten en

enmascarar olores desagradables en ambientes de trabajo e instalaciones sanitarias, así

como su uso como solventes y como insumos en productos de las industrias de plásticos,

tintas, caucho, insecticidas y otras.

Algunas especies vegetales que contienen aceites volátiles, como canela, clavo de

la India, nuez moscada y jenjibre, fueron extensamente consumidas en Europa a partir de

la época de las cruzadas, debido a que poseían aroma y/o sabor acentuados. Especies

elaboradas con flores, frutos, semillas, cáscaras y raices de una gran variedad de plantas

provenientes de regiones tropicales, alcanzaron un elevado valor comercial. Esto motivó la

creación de nuevas rutas comerciales entre occidente y oriente. Las esepcies fueron

utilizadas tanto en la culinaria, con con fines de condimentación y conservación de los

alimentos, enla preparación de aceites, ungüentos, cosméticos y medicamentos (Yunes y

Cechinel, 2009).

La utilización de los aceites esenciales requiere de una cuidadosa caracterización

química y evaluación de posibles modificaciones de su composición quíica, deibdas a los

diferentes orígenes geográficos y condiciones climáticas y a variaciones genéticas

poblacioneas que pueden provocar la formación de diferentes quimiotipos. Además, la

comosiciòn química de una misma especie fegetal puede variar de acuerdo con la parte de

la planta utilizada.

En la actualidad, muchos aceites esenciales constituyen compuestos de partida para

síntesis de otras sustancias útiles en las industrias química y farmacéutica. Otros

componentes tienen propiedades farmacológicas y son usados como antibacterianos,

analgésicos, sedantes, expectorantes, estimulantes y estomáquicos en la composición de

medicamentos.

La introducción de un aceite esencial nuevo en el mercado internacional, presenta

diferentes niveles de dificultad, según la industria para la que se destine, así por ejemplo,

para su aceptación en la industria de aromas debe cumplir con patrones complejos y

rígidos, exigiendo una calidad uniforme. Por esta razón, generalmente existe un gran

interés en esta industria por la investigación de nuevas fuentes de aceites esenciales. En

el caso de la industria química, en la cual los aceites esenciales son utilizados como

solventes, o bien, como insumos, las restricciones son menores.

Page 33: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

20

Aragão et al. (1981), seleccionaron varias plantas con posibilidades económicas en

cuanto a su cultivo, basándose en los siguientes criterios:

a) abundancia de la planta en la región

b) rendimiento de aceite esencial elevado, igual o mayor que 0.5%

c) un componente principal económicamente importante en concentración superior a

30%

d) un componente secundario de alto valor económico

En dicho estudio, Aragão obtuvo resultados de análisis químico de 82 Aceites

esenciales de plantas del Noreste de Brasil, de 14 familias botánicas diferentes. Los

resultados más importantes de dicho estudio fueron los cromatogramas correspondientes a

cada aceite y la relación de los constituyentes químicos identificados, así como sus fuentes

alternativas. Previo a su análisis, los aceites estudiados fueron obtenidos extracción por

arrastre con vapor de agua, a partir de materiales colectados en el campo y transportados

al laboratorio en vehículo, manteniéndolas a baja temperatura. Existen otras técnicas de

extracción antiguas, como la extracción con grasa fría o grasa caliente, que no serán

utilizadas en el proyecto, al ser de bajo rendimiento (Guenther, 1948). Como aporte final,

el autor presentó once monografías de los aceites esenciales seleccionados por la

importancia de sus posibilidades económicas, en las cuales se hicieron sugerencias sobre

la necesidad de investigación agronómica para su aprovechamiento agroindustrial en el

noreste de Brasil.

En cuanto a las técnicas de extracción, los aceites esenciales son obtenidos por

diferentes procesos, dependiendo de su localización en el vegetal, de la cantidad y de las

características requeridas para el producto final. Las técnicas más conocidas son el arrastre

con vapor de agua, la hidrodestilación y la extracción con solventes. Para propósitos

analíticos la hidrodestilación con aparato tipo clevenger es la más utilizada (Pereira, et al.,

2000), sin embargo, esta técnica provoca reacciones de oxidación en varios componentes

del aceite, debido a la presencia de agua y la alta temperatura, por lo que la composición

del aceite se altera antes del análisis. Por esto, se ha utilizado recientemente la destilación

extracción por tres horas, utilizando el aparato de Likens-Nickerson, para la extracción del

aceite con fines puramente analíticos (Pereira et al., 2003), que es la técnica que se

propone en el presente estudio. Además, recientemente se ha utilizado la técnica de

Microextracción en Fase Sólida, que permite la extracción del aceite esencial a partir de

material fresco y su inyección inmediata en el cromatógrafo de gases, lo cual evita el uso

de solventes y permite un análisis más inmediato de la composición del aceite esencial

estudiado.

Otras técnicas de extracción utilizadas son la expreción, la enfloración la extracción

con solventes orgánicos o grasas, y con fluidos supercríticos. Los solventes de baja

polaridad o el dióxido de carbono supercrítico, permiten obtener aceites esenciales en

mezcla con compuestos lipofílicos no volátiles. Por otro lado, la ausencia de

calentamiento evita la producción de artefactos, como los de la serie de derivados del

sabineno (terpinen-4-ol, -terpineno, -terpineno y terpinoleno). En algunos casos el

calentamiento es necesario para formarción de compuestos de interés, como el

camazuleno en la camomila (Yunes y Cechinel, 2009).

Page 34: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

21

II.1.1 Biosíntesis

Los terpenos y terpenoides son producidos en la naturaleza por dos rutas

biosintéticas, siendo estas la del mevalonato a través del ácido mevalónico y la ruta no

mevalónica, descubierta más recientemente, a través del intermediario de cinco átomos de

carbono 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato (Dubey et al., 2003). Los fenilpropanoides son

sintetizados a partir de la fenilalanina producida vía el ácido shiquímico.

II.1.1.2 Terpenos

El ácido mevalónico, formado a partir de dos moléculas de acetilcoenzima A, es el

precursor de las dos unidades básicas de los terpenos, el isopentenilpirofosfato (IPP) y el

,-dimetilalilpirofosfato (DMAPP). La ruta del ácido mevalónico se presenta en la

Figura 1. El ácido mevalónico es pirofosfatado por dos unidades de ATP originando el

mevalonil-pirofosfato, el cual se descarboxila con la participación de otra molécula de

ATP, originando al isopentenilpirofosfato (IPP). El DMAPP es formado por isomerización

del enlace doble del IPP. La condensación de moléculas de IPP y DMAPP origina a los

precursores inmediatos de los diferentes terpenoides como el geranil difosfato (GPP),

farnesil difosfato (FPP) y geranilgeranilo difosfato (GGPP) (Yang y Orihara, 2002;

Dewick, 2001).

Figura 1. Ruta del ácido mevalónico en la biosíntesis de terpenos.

Fuente: Dewick, 2001.

Page 35: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

22

En la ruta del 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato (Figura 2) la descarboxilación del

piruvato mediada por tiamina difosfato produce un acetaldehído enlazado en la forma de

una enamina la cual reacciona como nucleófilo en una reación de adición con el

gliceraldehido-3-fosfato (Dubey et al., 2003; Rochdich et al., 2001; Fellermeier et al.,

2001). La liberación de la tiamina difosfato genera aL 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato que

sufre un rearreglo tipo pinacol y una reducción siendo transformado en 2-C-metil-D-

eritrol-4-fosfato (Duvold et al., 1997; Sagner et al., 1998). La reacción de esta molécula

con citidina trifosfato produce un derivado difosforado de citidina el cual es fosforilado

vía ATP, resultando en un derivado 2-fosfato que es convertido en un fosfoanhidrido

cíclico con pérdida de citidina fosfato. El ciclofosfato es transformado por reacciones

todavía no esclarecidas en IPP que relaciona la síntesis de la desoxixilulosa con la del

mevalonato. El DMAPP podría ser derivado del IPP o producido independientemente, lo

cual no ha sido elucidado (Dewick, 2001).

La gran variedad diversidad estructural de los monoterpenos se deriva de las

reacciones de cilización enzimáticamente catalizadas, en especial por las monoterpeno

ciclasas y las isomerasas. De forma general, estas enzimas presentan propiedades

semejantes y la mayoría es capaz de sintetizar no solo uno, sino una serie de productos,

normalmente con la misma configuración espacial (Lu et al., 2002).

II.1.1.3 Fenilpropanoides

Los fenilpropanoides no son constituyentes muy comunes de los aceites esenciales,

aunque existen especies que producen estas sustancias en cantidades importantes. Los

fenilpropanoides son sintetizados a partir de la ruta del ácido shikímico (Dewick, 2001).

Los fenilpropanoides de aceites esenciales son derivados de la fenilalanina y en menor

grado de la tirosina (Sangwan et al., 2001). En la ruta biosintética, la fenilalanina es

convertida en ácido trans-cinámico; el ácido trans-cinámico es convertido en p-cumarato

(Schmid y Amrhein, 1995). Entre los fenilpropanoides comunes en aceites esenciales, se

encuentran el eugenol, el metileugenol, la miristicina, el chavicol, el metilchavicol, el

estragol y el anetol, entre otros.

II.1.1.4 Extracción de los aceites esenciales

En el laboratorio los aceites esenciales son extraídos generalmente por

hidrodestilación con aparato tipo Clevenger (Pereira, et al, 2000), siendo esta la técnica

más utilizada para la determinación del contenido del aceite esencial y para la extracción

del aceite esencial utilizado para el análisis cromatográfico. Esta técnica provoca

reacciones de oxidación en varios componentes del aceite esencial por la presencia de

agua y la temperatura elevada de operación, por lo cual la composición del aceite puede

ser alterada antes del análisis cromatográfico (Richter y Schellenberg, 2007). Por esa

razón recientemente se ha utilizado la técnica de extracción-destilación simultáneas con

aparato Likens-Nickerson para extraer el aceite con fines puramente analíticos (Pereira et

al., 2003). Existen otras técnicas de extracción antiguas, como el arraste con vapor de

agua, la extracción con disolventes y la extracción con cera fría o caliente (Guenther,

1948).

Page 36: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

23

Figura 2. Ruta de la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato en la biosíntesis de terpenos.

Fuente: Dewick, 2001.

II.1.2 Polimorfismo químico

Diferentes estudios de plantas ricas en aceite esencial han demostrado en los últimos

años, la existencia de polimorfismo químico entre plantas de la misma especie, es decir,

existen plantas de una misma especia que producen aceites esenciales con composiciones

diferentes, debido principalmente a la diferencia en condiciones climáticas donde crecen.

Estas plantas pueden agruparse de acuerdo a orígenes comunes de acuerdo a quimiotipos

(Pereira et al., 2003), de manera que puede seleccionarse la procedencia que producirá los

mejores resultados en cuanto a composición y a rendimiento.

Page 37: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

24

Algunas poblaciones de plantas poseen principalmente un quimiotipo simple, pero se

ha observado que muchas poblaciones presentan dos o tres, o más quimiotipos, como

ocurre en el caso de Thymus vulgaris, planta que posee seis quimiotipos (Thompson et al.,

2003). Em el caso de polimorfismo en plantas de Guatemala del género Lippia, se ha

encontrado que L. graveolens presenta tres quimiotipos (Fischer et al, 1997) y L. alba dos

quimiotipos (Fischer et al., 2004). II.1.3 Actividad antioxidante

Las especies reactivas de oxígeno son reconocidas como responsables por un gran

número de enfermedades, así como por el proceso de envejecimiento. Los radicales libres

constituyen un blanco interesante para el desarrollo de nuevos medicamentos, en este

contexto los antioxidantes de origen natural merecen atención especial, pues las plantas

sintetizan un gran número de metabolitos capaces de captar los radicales libres (Potterat,

1997). Los mecanismos de acción de estos compuestos son diversos, incluyéndose la captura

de oxígeno, la desactivación de radicales por reacción de adición covalente, la reducción de

radicales peróxidos y la complejación de metales de transición (Larson, 1995).

La reducción del radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) permite determinar la

actividad antioxidante. La prueba es bastante simple: los extractos, fracciones o productos

puros a evaluar son depositados en una placa de cromatografía de capa fina (sílica gel) y se

realiza la separación adecuada con un sistema de solventes apropiado, que es optimizado por

medio de pruebas de separación de los aceites esenciales. Después de secarse, la placa es

vaporizada con una solución metabólica de 2 mg/mL de DPPH. Las actividades anti-

radicalares aparecen en la forma de manchas amarillas sobre fondo violeta. La

determinación de actividad antioxidante en solución también es posible (Hostettmann et al.,

2003).

II.1.4 Actividad antioxidante de aceites esenciales

Algunos aceites esenciales son conocidos por sus propiedades antioxidantes, las

cuales presentan amplia paliación den la industria farmacéutica, de cosméticos y

pricipalmente en la industria alimenticia (Sacchetti et al., 2005). La actividad antioxidante

es de utilidad enla conservación de alimentos y también en cualquier tipo de producto que

contenga en su composición un sustrato lipídico (Hirasa y Takemasa, 1998).

Los antioxidantes son sustancias que, presentes en bajas concentraciones,

comparadas con el sustrato oxidable, retardan significativamente o inhiben la oxidación

del sustrato. Los radicales formados a partir de antioxidantes no son reactivos para

propagar la reacción en cadena, siendo neutralizados por la reacción con otro radical,

formando productos estables o pueden ser reciclados por otro antioxidante (Sousa et al.,

2007). Los principales mecanismos de acción de las sustancias antioxidantes incluyen

captadores de radicales y supresores de estados excitados, sistemas catalíticos que neutralizan o eliminan las especies reactivas de oxígeno (ERO) y especies reactivas de

nitrógeno (ERN), y el enlace de iones metálicos a proteínas, haciéndolos indisponibles

para producir especies oxidantes.

Page 38: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

25

En la industria alimenticia la oxidación lipídica es inhibida por secuestradores de

radicales libres. Las sustancias más utilizadas para esa función son: butil-hidroxianisol

(BHA), butilhidroxitolueno (BHT), terc-butil-hidroxiquinona (TBHQ),

trihidroxibutilfenona (THBP) y galato de propilo (GP). Estudios recientes han sugerido la

posibilidad de que estas sustancias presenten efectos tóxicos (Soares, 2002).

Varios métodos son utilizados para determinar la actividad antioxidante de extractos

y sustancias aisladas, encontrándose entre ellos el método de oxidación térmica (Almeida-

Doria y D’Arce, 2000), el del -caroteno y el del DPPH, que permiten la evaluaciòn de las

etapas primarias y secundarias de la oxidación en sistemas liposolubles (Sacchetti et al.,

2005); uno de los métodos más utilizados es la evaluación de la actividad secuestradora

del radical libre 2,2-difenil-picril-hidrazil (DPPH) de color púrpura que absorbe radiación

electromagnética a 515 nm (Sousa, 2005). Por acción de un antioxidante (AH) o de una

especie radical (R.), el DPPH

. es reducido generando difenil-picril-hidrazina, de color

amarillo con disminución proporcional de la absorbancia. A partir de las medidas de

absorbancia obtenidas puede determinarse la actividad antioxidante o secuestradora de

radicales libres como porcentaje de DPPH. remanente en el medio reactivo (Sánchez-

Moreno, 1998). El porcentaje de actividad antioxidante (% AA) corresponde a la cantidad

de DPPH consumida por el antioxidante, mientras que la cantidad de antioxidante

necesaria para disminuir la concentración inicial de DPPH en 50 % es denominada

concentración eficiente (CE50) también llamada como concentración inhibitoria (CI50).

Cuanto mayor el consumo de DPPH por una muestra, menor será la CE50 de la sustancia y

mayor su actividad antioxidante.

Sacchetti et al (2005), evaluaron la actividad antioxidante, antiradical y biocida de

once aceites esenciales, usando los métodos del -caroteno, DPPH y luminol-quimioluminiscencia para determinar la actividad antioxidante obteniendo resultados

consistentes entre los métodos usados. El método del DPPH fue usado también en la

evaluación de la actividad antioxidante del aceite esencial Lippia berlandieri (Rocha-

Guzmán et al., 2007) y de Ocotea quixos (Lam.) (Laureaceae) del Ecuador (Bruni et al.,

2004). Besco et al. (2007), determinaron la capacidad antioxidante integral (IAC) de

productos de baobab por fotoquimioluminiscencia.

II.1.5 Actividad biológica de aceites esenciales

La actividad biológica puede ser definida como la capacidad de una sustancia o

mezcla de sustancias para alterar una o más funciones químicas o fisiológicas de una

célula. Esa capacidad está relacionada con la naturaleza física de la sustancia, la

composición química y concentración, y con la duración de la exposición de la célula a la

sustancia. Existen varios ensayos para evaluar la actividad biológica dependiendo del

objetivo. Los organismos utilizados como blancos para ensayos de actividad biológica,

pueden clasificarse en 6 grupos principales (Hosttettman et al., 2003):

a) organismos inferiores: microorganismos (bacterias, hongos)

b) invertebrados: insectos, crustáceos, moluscos.

c) sistemas sub-celulares: enzimas, receptores.

Page 39: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

26

d) culturas de células de origen vegetal o animal

e) órganos aislados: humanos

f) animales vivos

En el caso de los aceites esenciales, las actividades antibacteriana y antifúngica son

estudiadas en la búsqueda de sustancias que puedan ser utilizadas como desinfectantes y

en la industria de alimentos. El esquema de trabajo es relativamente simple. El extracto o

sustancia es colocado en contacto con el agente patógeno y después de un período de

incubación se observa la inhibición del crecimiento o muerte de esporas en el caso de

hongos (Hosttettman et al., 2003). En las últimas décadas, se ha estudiado

exhaustivamente la actividad antimicrobiana de una gran variedad de aceites esenciales

(Oumzil et al., 2002; Burt et al., 2004; Cheng et al., 2006). La mayor parte de estos

estudios se realizó con lso aceites esenciales sin fraccionamiento, y en algunos casos, sin

la identificación de los componentes químicos. En lagunos casos la actividad fue atribuida

a alguno de los componentes del aceite, con base en estudios realizados con las sustancias

aisladas.

Es importante que los resultados de actividad antimicrobiana sean confrontados con

la sensibilidad variable de las diferentes cepas de microorganismos utilizadas en los

experimentos. Los métodos más empleados para la detección de actividad antimicrobiana

son ensayos in vitro realizados por difusión, dilución o bioautografía, siendo posible en

este último, relacionar los efectos bacteriostáticos o bactericidas y fungistáticos o

fungicidas con los componentes de la mezcla. En algunos casos, el aceite de una planta

puede presentar un constituyente mayoritario, como el de la canela que contiene más de 85

% de cinamaldehido, lo que evidencia la correlación entre la química y la actividad. Sin

embargo, las sustancias presentes en menor cantidad pueden contribuir, por lo menos en

parte, a la actividad, posiblemente por sinergismo entre sus componentes (Yunes y

Cechinel, 2009). .

II.1.6. Métodos de análisis de actividad antimicrobiana

Los métodos para análisis de actividad antimicrobiana son clasificados en tres tipos

(Valgas et al., 2007):

II.1.6.1 Métodos de difusión en agar

En estos métodos el inóculo bacteriano es colocado en agar y el aceite esencial es

colocado en el agar en pozos o en discos de papel filtro que son puestos en contacto con el

inóculo. Después de la incubación los resultados son obtenidos como diámetros de los

halos de inhibición.

II.1.6.2 Métodos bioautográficos

Existen dos métodos, el directo y el indirecto, en los cuales el aceite esencial es

corrido en una cromatografía en capa fina (CCF) y después la placa es colocada sobre el

inóculo. Con esta metodología se determina el halo de inhibición que corresponde a las

sustancias separadas en la CCF.

Page 40: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

27

II.1.6.3 Métodos de dilución

En este método se determina la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM), usando

diferentes diluciones del aceite esencial en DMSO que son distribuidas en placas de 96

pozos, siendo cada pozo utilizado, inoculado con la suspensión bacteriana a evaluar.

Después de la inoculación, se determina la menor concentración del aceite que inhibe el

crecimiento bacteriano, correspondiendo a la CIM, siendo esta expresada en mg/mL

(Valgas et al., 2007).

II.1.7 Bioautografía directa

Esquema bastante simple para actividades antifúngica y antibacteriana. En un primer

ensayo debe colocarse el extracto o sustancia en contacto con un agente patógeno, y puede

observarse con relativa facilidad la inhibición del crecimiento o muerte de esporas, en el

caso de los hongos. (Hostettmann et al., 2003).

Actualmente muchas investigaciones son realizadas para desarrollar nuevos agentes

antimicóticos, pues un número de casos ligados al SIDA, de micosis sistémicas, están en

plena expansión. La bioautografía directa, combina la cromatografía en capa fina y el ensayo

biológico in situ, es un excelente método porque puede conseguir la fácil localización de los

compuestos activos en una matriz compleja. Algunos métodos de cromatografía directa que

utilizan Aspergillum, Penicillium y Cladosporium sp. han sido publicados en la literatura

(Van der Sluis et al., 1981)

Las placas de capa fina son asperjadas con una suspensión de esporas y en seguida,

incubadas por dos o tres días en atmósfera húmeda. Las zonas de inhibición son directamente

visibles, pues durante el período de incubación, el hongo produce un pigmento colorido. La

técnica también puede ser usada para Candida albicans.

II.1.8 Análisis de los aceites esenciales

El desenvolvimiento de técnicas instrumentales de análisis y el acoplamiento con

sistemas computadorizados ha facilitado el análisis de los aceites esenciales.

Antiguamente el análisis era un proceso muy largo ya que se necesitaba aislar y purificar

cada componente de los aceites esenciales para determinar la estructura por métodos

químicos tradicionales (Bandoni, 2003). En la actualidad, las técnicas usadas en el

análisis de los aceites esenciales son los siguientes:

a) Técnicas cromatográficas de alta resolución, como cromatografia de gases con columna

capilar.

b) Técnicas espectroscópicas, como espectrometría de masas (EM), espectroscopía

infrarroja (IR) y espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN).

c) Sistemas cromatográficos acoplados a técnicas espectroscópicas, como cromatografía

de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM) y cromatografia de gases acoplada

a espectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier (CG-IRTF).

Page 41: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

28

Las principales técnicas analíticas utilizadas en el análisis de aceites esenciales se

basan en las caracteristicas fisicoquímicas de los aceites y sus componentes.

II.1.8.1 Cromatografía de gases (CG)

Por tratarse de una mezcla de constituyentes volátiles, los aceites esenciales brutos

pueden analizarse directamente por cromatografía de gases, sin tratamiento previo de la

muestra, además de una simple dilución, permitiendo no solamente el análisis cuantitativo

de sus constituyentes, sino también cualitativo, ya sea por el uso de tiempos o índices de

retención, o por el acoplamiento del cromatógrafo con un espectrómetro de masas. Sin

embargo, cuando los aceites se encuentran como componentes en formas farmacéuticas,

alimentos u otros tipos de formulaciones, su análisis es posible solamente mediante una o

varias etapas de extracción.

La técnica más usada en los laboratorios para el análisis cualitativo y cuantitativo de

aceites esenciales es la cromatografía de gases con detector de ionización de llama

(Bandoni, 2003). El análisis de aceites esenciales se basa en la identificación de las

sustancias presentes en el aceite por el tiempo de retención de estas comparado con los

tiempos de retención de sustancias puras o por medio de índices de retención obtenidos a

partir de la inyección de hidrocarburos de serie homóloga y su comparación con los

índices de estándares de sustancias comunes en los aceites esenciales (Marriot et al.,

2001). Existen bases de datos de los índices de retención para un número grande de

sustancias encontradas en aceites esenciales (Adams, 2001). El análisis cuantitativo es

realizado por medio de la integración de las áreas de los picos pertenecientes al aceite

esencial y el cálculo del porcentaje del área de cada pico dentro del área total de los picos

correspondientes al aceite (Bandoni, 2003). En la actualidad son utilizadas columnas

capilares de 25 a 60 m de largo por 0.25 mm de diámetro, que proporcionan alta

resolución cromatográfica. Columnas de polidimetilsiloxano y polietilenglicol son

utilizadas normalmente en el análisis de aceites esenciales (Bandoni, 2003).

Desde 1952, cuando fue desarrollada la cromatografía de gases, existe interés en

mejorar la velocidad de separación. Recientemente se han desarrollado alternativas para

disminuir el tiempo de análisis en casos en que el número de platos teóricos de una

columna capilar es demasiado alto para un problema de separación específico presentando

solutos muy bien separados (R>>2) pero tiempos de retención muy largos. Estos métodos

incluyen el uso de columnas multicanales y cromatografía de gases “Flash” (David et al.,

1999). El incremento de la velocidad de separación sin disminuir la resolución obtenida

para una mezcla compleja sobre una determinada fase estacionaria, puede realizarse por la

reducción del diámetro interno de la columna capilar. Así, una columna de 10m x 0,1 mm

D.I., proporciona la misma resolución que una columna de 25 m x 0.25 mm D.I.. Como la

columna es 2,5 veces más corta, el tiempo de análisis es reducido drásticamente, pudiendo

ser usadas también mayores velocidades de flujo para el gas portador ya que la velocidad

óptima del gas es mayor y las gráficas de H versus u (curvas de Van Deemter) son más

planas para columnas finas (Cramers y Leclercq, 1999). Con el uso de programas de

computadora de conversión de métodos, un procedimiento de operación existente para una

columna capilar normal puede ser convertido en un procedimiento de operación para una

columna fina, resultando en un análisis más rápido con la misma resolución. Ambos datos

Page 42: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

29

cualitativos y cuantitativos permanecen sin alteraciones. La técnica de cromatografía de

gases ultra rápida (CG-UR) ha sido probada en el análisis de aceites esenciales de

diferente complejidad, mostrando buena reproducibilidad en la separación e identificación

de sustancias confiable (Bicchi et al., 2004).

II.1.8.2 Espectrometría de masas (EM)

El objetivo de la EM es determinar la masa molecular del analito y generar

información sobre su estructura. La masa molecular es determinada por medio de la

ionización de la molécula utilizando diferentes técnicas como Impacto Electrónico (IE),

Ionización Química (IQ), Bombardeo con Átomos Rápidos (conocida por FAB en inglés),

entre otras. Los iones generados en la cámara de ionización son acelerados

eletrostáticamente y separados en el analizador en función de su relación masa/carga

(m/z), y son colectados en el detector donde es registrada la señal producida. Las señales

son digitalizadas y procesadas en un sistema computarizado donde son comparadas con

espectros de bibliotecas de sustancias patrón. Esta técnica se utiliza pocas veces en forma

aislada en el análisis de aceites esenciales, para el cual su utilidad principal es en forma

acoplada como sistema de detección con CG.

II.1.8.3 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM)

La cromatografía de gases con detector de masas (CG-EM) presenta una gran

utilidad para el análisis de sustancias volátiles y estables a temperaturas altas. En la

literatura existen bases de datos y bibliotecas de espectros (Adams, 2001) que son usadas

para identificar los componentes de los aceites esenciales por medio de la comparación de

los espectros. La espectrometría de masas no presenta espectros únicos para componentes

de aceites esenciales en muchos casos, en vista del gran número de isómeros con la misma

fórmula molecular y diferente estructura que presentan espectros muy similares. El

acoplamiento con CG permite la separación de las sustancias de los aceites esenciales en

la columna cromatográfica y la obtención de los espectros de masas de cada una de las

sustancias eluidas. Así, el uso combinado de la información proporcionada por los tiempos

de retención en la cromatografía y los espectros de masas es de gran utilidad para la

identificación de los componentes de los aceites (Marriot et al., 2001). En la actualidad

casi todas las publicaciones sobre identificación de los componentes de aceites esenciales

son basadas en estas dos técnicas acopladas.

II.2 Flavonoides

Entre los grupos de metabolitos secundarios que se encontraron en las plantas de

estudio que presentan mayor potencial para la investigación de posibles aplicaciones en

las industrias de alimentos y farmacéutica, se encuentran los flavonoides. Los flavonoides

constituyen una clase de compuestos polifenólicos de amplia distribución en el reino

vegetal. Se encuentran principalmente en plantas en la forma de glucósidos, siendo los

pigmentos amarillos, naranja, azules y rojos de las flores, responsables también por el

color amarillo de las horas en el otoño. Son importantes para el crecimiento normal,

desarrollo y defensa de las plantas, Actúan como atractivos visuales favoreciendo la

polinización, como mecanismo de defensa contra el ataque de insectos y microorganismos

Page 43: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

30

y como protectores contra la radiación ultatvioleta, por sus propiedades antioxidantes

(Yunes y Cechinel, 2009).

Los flavonoides son importantes constituyentes de la dieta humana, a pesar de no ser

considerados nutrientes. Se encuentran en una gran variedad de vegetales, bebidas como té

o vino tinto, y en frutas, especialmente las cítricas. Se ha calculado que la ingestión diaria

de flavonoides aportados por la dieta se encuentra entre 50-800 mg/día (Yunes y Cechinel,

2009), existiendo estimaciones de que la ingestión podría ser de hasta 1 g (Kandaswami et

al., 2005). Una taza de té verde o de un vaso de vino tinto pueden proporcinar hasta 200

mg de flavonoides totales; una cebolla, 40 mg/100 g; una manzana, 6-10 mg, un durazno,

1-2 mg y una naranja, 10 mg (Yunes y Cechinel, 2005). El hecho de que los flavonoides

estén presentes en la dieta y de que se les atribuya una gran variedad de actividades

biológicas, hace suponer que estos polifenoles podrían cumplir una función protectoa

contra enfermedades cardiovasculares y contra ciertas forams de cáncer.

Las plantas sintetizan centenas de compuestos fenólicos y polifenólicos, que poseen

variadas estructuras y funciones (Figura 3). Entre estos compuestos, los más estudiados

como antioxidantes son los flavonoides que tienen en común las estructura C6-C3-C6,

consistiendo de dos anillos aromáticos enlazados por un heterociclo oxigenado. Dentro de

los aproximadamente 4000 flavonoides descritos, las mayores clases son los flavonoles,

catequinas o flavonas, antocianidinas e isoflavonas. En estas clases hay grandes

variaciones estructurales, dependiendo del nivel de hidrogenación, hidroxilación,

metilación y sulfonación de las moléculas.

Figura 3. Estructuras de las principales clases de flavonoides.

Fuente: Bruneton, 1993.

Los flavonoides constituyen los ingredientes nutracéuticos más activos en las

plantas. Corresponden a un grupo de moléculas orgánicas distribuidas en las plantas

Page 44: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

31

vasculares. Como compuestos fenólicos típicos, pueden actuar como potente antioxidantes

y quelantes metálicos.

II.2.1 Funciones de los flavonoides

Los flavonoides cumplen una amplia variedad de funciones ecológicas y fisiológicas

en las plantas. Es bien conocido el rol de los pigmentos de antocianina como señales

visuales en angiospermas para atraer polinizadores y agentes de dispersión de frutas, pero

estas funciones se adquirieron tarde en la diversificación evolutiva de los flavonoides.

Funciones menos conocidas y probablemente más antiguas de los flavonoides incluyen la

protección contra los efectos nocivos de la radiación UV, la mediación de las

interacciones entre el polen y el estigma, defensa contra bacterias, hongos patógenos y

herbívoros, mediación de interacciones entre plantas y hongos micorrízicos mutualistas, y

como reguladores de la actividad hormonal (Shirley, 1996).

La ruta biosintética de los flavonoides ha sido útil como sistema modelo para el

entendimiento de la regulación de los genes en las plantas. En forma similar, los genes de

la ruta de los flavonoides, estructurales y reguladores, han sido útiles como sistema

modelo para el entendimiento de una gran variedad de procesos evolutivos, incluyendo el

rol de la duplicación de genes en la facilitación de la evolución de caracteres nuevos y la

importancia relativa de los genes estructurales y reguladores en la evolución de caracteres

ecológicamente importantes.

La ruta de los flavonoides es un ejemplo clásico de las rutas que se han ido

extendiendo gradualmente, conforme nuevos productos y nuevas funciones van surgiendo.

A pesar que muchos detalles de su construcción evolutiva aún son desconocidos, es

posible reconstruir los principales eventos evolutivos con confianza. La duplicación de

genes ha proveído la materia prima para la construcción de la ruta. Hay una simetría

satisfactoria en esto, ya que una vez que la ruta de los flavonoides se completó, la

duplicación y la divergencia de los genes de la ruta han permitido la aparición de nuevas

clases de compuestos. A través de la duplicación de los genes, las rutas no solo nacen, sino

también se expanden en rutas sintéticas adicionales (Lin y Weng, 2008).

II.2.2 Actividad antioxidante de los flavonoides

Las dietas ricas en flavonoides, frutas y vegetales, son protectoras contra una

variedad de enfermedades, particularmente enfermedades cardiovasculares y algunos tipos

de cáncer (Ness y Powles, 1997). Los antioxidantes y la fibra dietética son los nutrientes

responsables por estos efectos protectores. Las Especies Reactivas de Oxígeno (ERO) son

formadas in vivo durante el metabolismo aeróbico normal y pueden causar daño al ADN,

proteínas y lípidos, no obstante el sistema de defensa antioxidante natural de todos los

organismos (Lin y Weng, 2008). Las ERO contribuyen al envejecimiento celular

(Kawanishi et al., 2001) y enfermedades coronarias (Khan y Baseer, 2000), posiblemente

a través de la desestabilización de membranas (Takabe et al, 2001), daño del ADN, y

oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) (Meyer et al., 1998).

Page 45: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

32

Los efectos protectores de los flavonoides en los sistemas biológicos se deben a su

capacidad para transferir electrones de radicales libres, la quelación de catalizadores

metálicos (Ferrari et al., 1997), la activación de enzimas antioxidantes, la reducción de

radicales de -tocoferol (Hirano et al., 2001) y la inhibición de oxidasas (Cos et al.,

1998). Velioglu et al. (1998), analizaron la actividad antioxidante y fenoles totales en

frutas, vegetales y granos. Ellos encontraron correlación estadísticamente significativa

entre la actividad antioxidante y el contenido de fenoles totales.

Algunos flavonoides como la quercetina, presentan mayor velocidad de reacción con

radicales libres in vitro que el -tocoferol. Se ha sugerido que esto es debido a la conjugación más extendida de sus estructuras, que lleva a radicales libres más

estabilizados. La presencia de dos o más grupos OH reactivos y menor impedimento

estérico en el sitio de abstracción también deben influir.

Los polifenoles son capaces de captar radicales alcoxilo (RO.), alquilperoxilo

(ROO.), superóxido (O2

.-) radical hidroxilo (HP

.), óxido nítrico (NO

.), además del oxidante

peroxinitrito (ONOO./ONOOH). La eficacia antioxidante de polifenoles in vivo todavía

necesita de ser evaluada, pues se conoce poco sobre su biodisponibilidad.

II.2.3 Anti-carcinogénesis:

Numerosos estudios in vitro indican que los flavonoides encontrados en plantas

pueden participar efectivamente en procesos que pueden tener efectos anticarcinogénicos

y anti-anterogénicos. Estos estudios han demostrado que los flavonoides inhiben la

carcinogénesis in vitro y evidencia sustancial indica que también lo hacen así in vivo

(Caltagirone et al., 2000; Miyagi et al., 2000). Los flavonoides pueden inhibir la

carcinogénesis afectando los eventos moleculares en las etapas de iniciación, promoción y

progresión. Los estudios en animales usando diferentes modelos celulares sugieren que

ciertos flavonoides podrían inhibir la iniciación de tumores así como el crecimiento de los

mismos (Makita et al., 1996; Tanaka et al., 1997, 1999).

Entre los procesos que previenen estas enfermedades, el más evidente es la

capacidad antioxidante de estos compuestos atribuida al poder reductor del grupo

hidroxilo aromático, que reduce radicales libres reactivos, produce el radical libre

fenoxilo estabilizado por resonancia. La capacidad antioxidante de los polifenoles es

influida por el número y posición de los grupos OH, así como por las posiciones de

glicosilación. Al contrario del ácido ascórbico y el -tocoferol, que actúan en medio

acuoso y en la cámara fosfolipídica celular, respectivamente, los flavonoides pueden

localizare en las dos fases.

En cuanto a la actividad anticancerígena de los flavonoides, Soleas et al. (2006)

compararon las actividades antitumorales de un fenol de cada uno de cuatro diferentes

clases: flavanoles [(+)-catequina], estilbenos (trans-resveratrol), flavonoles (quercetina) y

ácidos hidroxibenzoicos (ácido gálico). Para eso, fue utilizado un modelo de cáncer de

piel de ratón CD-1 en dos etapas, con el 9,10-dimetil-1,2-benzantraceno (DMBA) como

iniciador. Los ratones fueron tratados con polifenoles específicos en dosis entre 0 y 25

Page 46: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

33

moles (disueltos en 200 L de acetona), dos veces por semana hasta dieciocho semanas.

La solución fue aplicada tópicamente en la región dorsal afeitada de cada animal Los

autores comparan las potencias relativas de los polifenoles, por la evaluación de la

inhibición de la formación de tumores en individuos y por el número de ratones que

desarrollaron uno o más tumores con los diferentes programas de dosis. La quercetina fue

la más efectiva (ED50< 1 mol) y el ácido gálico el menos efectivo (ED50 5-10 moles),

(+)-catequina y trans-resveratrol fueron intermedios, con ED50 entre 5 y 6 mol,

respectivamente. Los autores concluyeron que el trans-resveratrol podría ser el polifenol

anticancerígeno más efectivo de los presentes en el vino tinto en la forma como es

consumido por humanos saludables, ya que el trans-resveratrol es absorbido mucho más

eficientemente que la (+)-catequina y la quercetina en humanos después de la ingestión.

II.2.4 Evolución de la producción de flavonoides por las plantas.

Los flavonoides juegan un papel muy importante para la quimiosistemática, como

marcadores de la evolución de las plantas. Es aceptada la teoría de que las plantas

terrestres se derivaron de organismos como las algas verdes, sin embargo, no se han

encontrado flavonoides en las algas. Además, a pesar que los genomas de algunas algas se

han secuenciado, ninguno contiene marcos de lectura abiertos que muestren homología

con las secuencias de codificación de las enzimas conocidas en la biosíntesis de los

flavonoides. Así, la evolución inicial de la ruta de los flavonoides probablemente se

desarrolló después de la colonización del suelo. El grupo parafilético (briofitas),

representa las primeras plantas que colonizaron la tierra. Corresponde también a las

plantas que produjeron los primeros flavonoides, estando entre los tipos producidos por

estas plantas, las charconas, los flavonoles y las flaconas, que son derivadas de las

primeras tres enzimas de la ruta de los flavonoides (Lin y Weng, 2008).

Dos hipótesis han sido planteadas en relación a las funciones que pudieron dar

origen a la biosíntesis de flavonoides por las primeras plantas que colonizaron la tierra. La

primera hipótesis sugiere que los flavonoides se originaron como pantalla efectiva contra

la radiación UV cuando las plantas iniciaron la colonización de la tierra (Shirley, 1996).

Entre los hechos que dan soporte a esta hipótesis se encuentran las observaciones de que

aún los flavonoides simples, como chalconas, auronas y flavanonas, absorben fuertemente

longitudes de radiación UV, y que mutantes que no presentan estos compuestos son

extremamente susceptibles a daños por la radiación UV. En contraste, Stafford planteó en

1991 la hipótesis de que la primera función de los flavonoides fue regular las hormonas de

las plantas. Según Stafford, esta hipótesis es más probable, en vista que la de la

protección contra radiación UV ya que presumiblemente las primeras enzimas de los

flavonoides no eran tan eficientes como las enzimas actuales, y de esta forma los

flavonoides no podían acumularse en cantidades suficientes para proteger a las plantas.

Además de esto, ha sido demostrado que los flavonoides contribuyen a la regulación del

transporte de auxina en las angiospermas (Peer et al., 2004).

La última etapa evolutiva de los flavonoides corresponde a las gimnospermas y

angiospermas. En estos dos grupos fue donde hicieron su aparición las antocianinas. La

adición clave a la ruta de los flavonoides involucrada en esta etapa fue la enzima

Page 47: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

34

antocianidina sintasa (ANS), posiblemente como resultado de la duplicación de genes de

la familia de las oxigenasas de pendientes del 2-oxo-glutarato. Esta enzima cataliza la

producción de las antocianinas coloreadas a partir de las leucoantocianidinas incoloras.

No esta claro, sin embargo, si fue la producción de color per se la que constituyó la

función original de las antocianinas. A pesar de la función señalizadota del color,

especialmente para los polinizadores y los agentes dispersores de frutas, es claramente la

función primaria de las antocianinas en las angiospermas, dicha señalización es rara sino

ausente en las gimnospermas de las cuales se desarrollaron las angiospermas (Lin y Weng,

2008). Se ha estimado que existe más de un millón de polifenoles naturales, en frutas y

vegetales, ya que los polifenoles se encuentran generalmente como glucósidos, existiendo

una gran variedad de especies de azúcares y las formas de enlace con la aglicona

(Herrmann, 1976; Wollenweber et al., 1981).

Page 48: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

35

PARTE III

III.1 RESULTADOS

III.1.1 Colecta de plantas.

La Tabla 2 presenta los códigos y los sitios de colecta de los especimenes de las

plantas de estudio, en los departamentos de Escuintla, El Progreso, Zacapa,

Quetzaltenango, Retalhuleu, Izabal y Alta Verapaz.

Tabla 2. Códigos, localización geográfica y datos de rendimiento de aceite esencial

de las muestras de las plantas de estudio colectadas.

Código Nombre

científico Fecha Lugar

Altitud

(msnm)

Masa

(g)

Rend

(%)

LH.PACA.01.01 L. hispida L. 01-may-08 Volcán Pacaya, Escuintla 2.290 9.8 0.09

LH.PACA.02.01 L. hispida L. 08-nov-08 Volcán Pacaya, Escuintla 2.290

LH.KM93.01.01 L. hispida L. 30-jun-08 San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso

278

LH.KM93.01.02A L. hispida L. 30-jun-08 San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso

296 30 0.60

LH.KM93.01.02B L. hispida L. 30-jun-08 San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso

296 27.3 0.65

LH.KM93.01.02C L. hispida L. 30-jun-08 San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso

296 30 0.46

LH.KM93.01.POOL L. hispida L. 30-jun-08 San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso

0.57

LH.SNJO.01.01A L. hispida L. 30-jun-08 Aldea San José, Teculután, Zacapa

248 29.2 0.33

LH.SNJO.01.01B L. hispida L. 30-jun-08 Aldea San José, Teculután, Zacapa

249 30.2 0.35

LH.SNJO.01.01C L. hispida L. 30-jun-08 Aldea San José, Teculután, Zacapa

250 31.4 0.24

LH.SNJO.01.01D L. hispida L. 30-jun-08 Aldea San José, Teculután,

Zacapa 251 30 0.29

LH.SNJO.01.03 L. hispida L. 30-jun-08 San Cristóbal Acasuaguastlán,

El Progreso 0.33

LH.CHOR.02.01A L. hispida L. 11-ene-09 Aldea Chorjalé, Cabricán,

Quetzaltenango 2.472 0.11

LH.CHOR.02.01B L. hispida L. 11-ene-09 Aldea Chorjalé, Cabricán,

Quetzaltenango 2.472 0.23

LH.CHOR.02.01C L. hispida L. 11-ene-09 Aldea Chorjalé, Cabricán,

Quetzaltenango 2.472 0.17

LH.LGRA.02.01 L. hispida L. 11-ene-09 Aldea La Grandeza, Cabricán,

Quetzaltenango 2.462

LH.KM93.02.01 L. hispida L. 11-ene-09 San Cristóbal Acasuaguastlán,

El Progreso 278 0.72

LH.SNJO.02.01A L. hispida L. 11-ene-09 Aldea San José, Teculután,

Zacapa 248 0.30

LH.SNJO.02.01B L. hispida L. 11-ene-09 Aldea San José, Teculután,

Zacapa 249 0.35

LH.KM93.03.01 L. hispida L. 10-may-09 San Cristóbal Acasuaguastlán,

El Progreso 278

LH.SNJO.03.01 L. hispida L. 10-may-09 Aldea San José, Teculután,

Zacapa 232

LH.CHIC.03.01 L. hispida L. 10-may-09 Aldea El Chico, Usumatlán,

Zacapa 999

LC.ZUNI.01.01A L. camara L. 06-jul-08 Carretera a Zunil, 2.085 25 0.09

Page 49: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

36

Quetzaltenango

LC.ZUNI.01.01B L. camara L. 06-jul-08 Carretera a Zunil,

Quetzaltenango 2.086 20 0.09

LC.ZUNI.01.02 L. camara L. 06-jul-08 Aldea La Calera, Zunil,

Quetzaltenango 2.010

LC.ZUNI.01.03 L. camara L. 06-jul-08 Carretera a Zunil,

Quetzaltenango 1.989

LC.ZUNI.01.04 L. camara L. 06-jul-08 Aldea La Calera, Zunil,

Quetzaltenango 2.010

LC.SNFE.01.01 L. camara L. 06-jul-08 San Felipe, Retalhuleu 620 30 0.09

LC.ZUNI.02.01 L. camara L. 11-ene-09 Carretera a Zunil,

Quetzaltenango 2.085 14.1 0.22

LC.ZUNI.02.02A L. camara L. 11-ene-09 Aldea La Calera, Zunil,

Quetzaltenango 2.010 23.4 0.34

LC.ZUNI.02.02B L. camara L. 11-ene-09 Aldea La Calera, Zunil,

Quetzaltenango 2.010 20 0.11

LC.ZUNI.02.03A L. camara L. 11-ene-09 Carretera a Zunil,

Quetzaltenango 1.989 25 0.12

LC.ZUNI.02.03B L. camara L. 11-ene-09 Carretera a Zunil,

Quetzaltenango 1.989 20 0.17

LC.ZUNI.02.03C L. camara L. 11-ene-09 Carretera a Zunil,

Quetzaltenango 1.989 25 0.46

LC.ZUNI.02.04 L. camara L. 11-ene-09 Aldea La Calera, Zunil,

Quetzaltenango 2.010 20 0.39

LC.SNFE.02.01 L. camara L. 11-ene-09 San Felipe, Retalhuleu 620

LC.ZUNI.03.01A L. camara L. 26-abr-09 Carretera a Zunil, Quetzaltenango

2.085 26.3 0.07

LC.ZUNI.03.02 L. camara L. 26-abr-09 Aldea La Calera, Zunil, Quetzaltenango

2.010 20 0.17

LC.ZUNI.03.01B L. camara L. 26-abr-09 Carretera a Zunil, Quetzaltenango

2.085 25 0.13

LC.ZUNI.03.03A L. camara L. 26-abr-09 Carretera a Zunil, Quetzaltenango

1.989 19 0.10

LC.ZUNI.03.03B L. camara L. 26-abr-09 Carretera a Zunil, Quetzaltenango

1.989 19 0.16

LC.ZUNI.03.04 L. camara L. 26-abr-09 Aldea La Calera, Zunil, Quetzaltenango

2.010 25 0.13

LT.LAMA.01.01A L. trifolia L. 31-ago-08 Carretera a Aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal

103 25 0.03

LT.LAMA.01.01B L. trifolia L. 31-ago-08 Carretera a Aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal

103 25 0.51

LT.LAMA.01.02A L. trifolia L. 31-ago-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal

103 25 0.09

LT.LAMA.01.02B L. trifolia L. 31-ago-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal

103 19.5 0.13

LT.LAMA.01.02C L. trifolia L. 31-ago-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal

103 25 0.01

LT.LAMA.01.03 L. trifolia L. 31-ago-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal

93 0.13

LT.LAMA.02.01A L. trifolia L. 07-dic-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal

103 25 0.25

LT.LAMA.02.01B L. trifolia L. 07-dic-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal

103 25 0.32

LT.LAMA.02.01C L. trifolia L. 07-dic-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal

103 25 0.36

LT.LAMA.02.03A L. trifolia L. 07-dic-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal

93 28 0.18

LT.LAMA.02.03B L. trifolia L. 07-dic-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal

93 27 0.27

LT.LAMA.02.03C L. trifolia L. 07-dic-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal

93 20 0.17

Page 50: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

37

LT.LAMA.02.03D L. trifolia L. 07-dic-08 Carretera a aldea Santa Inés,

Los Amates, Izabal 93 25 0.10

LT.LAMA.02.03E L. trifolia L. 07-dic-08 Carretera a aldea Santa Inés,

Los Amates, Izabal 93 30 0.05

LT.LAMA.02.04 L. trifolia L. 07-dic-08

Carretera de aldea Santa Inés a

aldea Gayuser, Los Amates,

Izabal

100

LT.LAMA.02.05 L. trifolia L. 07-dic-08

Carretera de aldea Santa Inés a

aldea Gayuser Los Amates,

Izabal

105

LT.LAMA.03.06ª L. trifolia L. 07-abr-09 Carretera a aldea Santa Inés,

Los Amates, Izabal 100 30 0.03

LT.LAMA.03.06ª L. trifolia L. 07-abr-09 Carretera a aldea Santa Inés,

Los Amates, Izabal 100 30 0.02

LT.LAMA.03.07 L. trifolia L. 02-may-09

Carretera de terracería de

Rubelsanto a Parque Nacional Laguna Lachúa, Alta Verepaz

165

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

III.1.2 Determinación del porcentaje de humedad

En la tabla 3 se observan los porcentajes de humedad obtenidos de las muestras en

que se determinó humedad, obteniéndose como resultados porcentajes desde 13.08 %

hasta 14.80 %.

Tabla 3. Porcentaje de humedad

No. muestra Muestra Peso (g) Porcentaje de Humedad

1 LC.ZUNI.01.01 0.5 14.55

2 LC.ZUNI.01.04 0.5 13.80

3 LT.LAMA.01.01 0.5 14.75

4 LH.SNFE.01.01 0.5 14.01

5 LT.LAMA.01.03 0.5 13.08

6 LH.KM93.01.01 0.5 14.80

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007. Balanza de humedad utilizada: HB35 Halogen.

III.1.3 Aceites esenciales

La tabla 4 presenta los resultados de rendimiento de extracción de los aceites

esenciales de las plantas de estudio, mientras que las tablas 5, 6 y 7 presentan los

resultados de los análisis cromatográficos de los aceites.

III.1.3.1 Rendimiento

La Tabla 4 presenta los resultados del rendimiento de extracción por hidrodestilación

del aceite esencial de las plantas de estudio, utilizando un aparato tipo Clevenger. La

planta que presentó el rendimiento más elevado fue L. hispida con 0.38 %, mientras que L.

camara y L. trifolia presentaron un rendimiento bajo (0.18 y 0.17 %, respectivamente). No

fue posible obtener los rendimientos por la técnica de destilación-extracción, ya que los

bajos contenidos de aceite esencial de las especies de estudio no permiten la evaluación de

los mismos por esta técnica.

Page 51: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

38

Tabla 4. Rendimiento de Extracción de aceite esencial por especie.

Especie n % de rendimiento

Lantana hispida 16 0.38

Lantana camara 17 0.18

Lantana trifolia 17 0.17

n = número de especimenes extraídos.

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

III.1.3.2 Composición del aceite esencial de Lantana hispida

El aceite esencial de L. hispida presentó como componentes mayoritarios, sabineno

(6.59-13.91 %; no se encontró sabineno en especimenes colectados en San José, Zacapa, y

Cabricán, Quetzaltenango), limoneno (2.9-24.34 %), -cariofileno (16.44-30.61 %) y germacreno D (9.05-18.5 %) (Tabla 5).

Tabla 5. Resultados del análisis de muestras de Lantana hispida por Cromatografía de

gases, expresados en porcentajes de área. En los códigos de muestras se han omitido las

siglas LH, correspondientes a las iniciales de la especie. IK teórico Sustancia KM93.01.01 KM93.01.02 KM93.01.04 SNJO.01.01D CHOR.02.01B

ND NI 0.81

930 -thujeno 0.74 0.91 16.43

939 -pineno 2.4 2.62 4.68 4.42 2.54

975 Sabineno 13.91 13.17 6.59

979 -pineno 1.02 11.51

ND NI 0.7

991 -mirceno 1.55 1.51 4.35

1003 -felandreno 4.73 4.16

1017 -terpineno 2.49 3.55

1025 p-cimeno 3.05 2.74 1.72

1029 Limoneno 10.97 10.42 2.9 24.34

1031 1,8-cineol 7.35 6.43 4.97

1037 Ocimeno 0.74

1060 -terpineno 1.07 1.48

1097 -linalol 1.06 1.17

1177 1-terpinen-4-ol 1.06 1.48

ND NI 0.57

1189 -terpineol 0.62

1290 Timol 1.48 1.15 3.77

1375 -copaeno 5.85 1.57 4.71

1388 -bourboneno 0.67

1391 -elemeno 0.64 1.07 2.88 0.65

1404 Metileugenol 2.51

1419 -cariofileno 16.44 21.75 30.61 23 15.62

1455 -cariofileno 1.32 1.58 1.76

1460 Aloaromadendreno 1.05

1485 germacreno D 9.05 10.62 18.5 17.66 14.33

1498 -selineno 3.42 3.78 5.15

ND NI 1.08

ND NI 0.58

1506 (E,E)--farneseno 0.68 0.88

1514 -cadineno 0.63 10.92

1523 -cadineno 3.81

Page 52: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

39

1561 Germacreno B 1.28 1.33

1578 Espatulenol 3.32 2.61 2.86 3.76

ND NI 0.83

1583 óxido de cariofileno 3.41 2.25 3.53 5.76

1640 Epi--cadinol 0.57

1654 -Cadinol 1.27

ND NI 5.99 7.96

ND NI 1.54 3.45

ND NI 0.37

ND NI 1.27

ND NI 0.66

1658 -oxido de bisabolol B 3.23

1672 Epi--Bisabolol 4.87

1686 -bisabolol 3.75 3.35

ND NI 0.34

SUMA 99.42 100.0 100.0 100.0 99.98

NI = No identificado.

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

III.1.3.3 Composición del aceite esencial de Lantana camara

El aceite esencial de L. camara presentó como componentes mayoritarios, -

cariofileno (4.45-32.97 %) y germacreno D (29.5-50.36 %), presentes en todas las

muestras, las cuales presentaron más del 70 % de compuestos correspondientes a

sesquiterpenoides (Tabla 6).

Tabla 6. Resultados del análisis de muestras de Lantana camara por Cromatografía de

gases, expresados en porcentajes de área. En los códigos de muestras se han omitido las

siglas LC, correspondientes a las iniciales de la especie.

IK teórico Sustancia ZUNI.01.01 ZUNI.02.02 ZUNI.03.03 ZUNI.02.04 ZUNI.02.01 LACH.04.01

930 -thujeno 1.59 2.55 4.71

939 -pineno

975 Sabineno 1.09 0.32 7.67

979 -pineno 2.09

1025 p-cimeno

1029 Limoneno 2.61 5.78 16.26 3.11

1031 1,8-cineol 0.87 2.51 2.99

1037 Ocimeno 1.32

1060 -terpineno

1097 -linalol 2.02 7.34 0.59 10.12

1238 Neral 0.53 0.93 7.77

1267 Geranial 0.66

1290 Timol 3.62

ND NI

1338 -elemeno 0.46

1351 -Cubeneno

1369 NI

1375 -copaeno 0.45

1388 -bourboneno 0.62 0.58 0.96 1.95

1391 -elemeno 5.83 3.46 2.13 1.72 3.09

1419 -cariofileno 32.97 29.83 21.74 22.13 28.73 4.45

1432 -copaeno

Page 53: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

40

1455 -cariofileno 1.88 1.57 2.37

1460 Aloaromadendreno 1.37 1.17 1.06 1.55 5.56 2.15

1480 -muuroleno 0.57 0.58 2.00 1.30

1485 germacreno D 29.54 29.6 29.5 50.36

1493 -selineno 39.26 18.47 2.12

1498 -selineno 10.85 15.28 5.69 1.92

ND NI 9.97 16.91

ND NI 4.56

1506 (E,E)--farneseno 3.24 1.37 2.12 0.54 2.34

1514 -cadineno 0.65 1.20 12.89

1523 -cadineno 0.75 0.57

1550 Elemol

1561 Germacreno B 0.99

1563 E-nerolidol 4.18

1568 NI

1578 Espatulenol 0.93 1.7 1.04 4.44

1583 óxido de cariofileno 1.02 2.52 1.08

ND NI 2.68

ND NI 2.72

ND NI 1.14

1604 NI 1.30

1608

Epóxido de humuleno

II

ND NI 0.76

1640 Epi--cadinol 0.79

ND NI

1646 -muurolol

1654 -cadinol 2.71 1.81

1658 -oxido de bisabolol B 1.25

1672 Epi--Bisabolol

1686 -bisabolol

1691 NI 1.06

SUMA 99.99 98.91 100.0 99.98 100.0 98.17

NI: No identificado. Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

III.1.3.4 Composición del aceite esencial de Lantana trifolia

El aceite esencial de L. trifolia presentó como componentes mayoritarios, α-copaeno

(3.67-12.48 %, presente en tres de las cuatro muestras analizadas), metileugenol (21.06-

40.01 %, presente en todas las muestras analizadas), y muuroleno (17.8-22.09 %) por lo

que su composición es diferente del aceite de las otras dos plantas estudiadas (tabla 7).

Tabla 7. Resultados del análisis de muestras de Lantana trifolia por Cromatografía de

gases, expresados en porcentajes de área. En los códigos de muestras se han omitido las

siglas LT, correspondientes a las iniciales de la especie. IK teórico Sustancia LAMA.01.01 LAMA.02.03 LAMA.01.03 LACH.04.02

975 Sabineno 2.16 0.69 3.51

1025 p-cimeno 1.26

1029 Limoneno 0.68

1031 1,8-cineol 2.05

ND NI 1.57

1097 -linalol 2.83 0.84

ND NI 0.88

ND NI 0.98

1238 Neral 4.09

Page 54: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

41

1257 Acetato de Linalilo 0.73

1290 Timol 5.36 0.99 1.29 3.51

1338 -elemeno

1351 -Cubeneno 1.27 0.91

1369 NI 3.99

1375 -copaeno 10.39 12.48 3.67

1391 -elemeno 3.55 3.48 1.44 1.69

1404 Metileugenol 40.01 3.3.32 21.63 21.06

1432 -copaeno 5.19

1435 trans-bergamoteno 7.3 3.45 4.7 8.35

1455 -cariofileno 1.82 7.48

1460 Aloaromadendreno 1.72 1.21 1.39

1480 -muuroleno 22.09 17.8 18.79

1485 germacreno D 0.73 7.31

ND NI 0.68

1493 -selineno 1.4 1.56

1498 -selineno 2.41 2.68 3.78 1.54

ND NI 1.89

ND NI 4.77

ND NI 0.33

1506 (E,E)--farneseno 1.91

1507 Z--bisaboleno 1.1 2.01

1514 -cadineno 3.8 4.15 1.9 2.79

1550 Elemol 3.03

1561 Germacreno B 2.84 9.01

1568 NI 0.69 2.58

1578 Espatulenol 5.06 2.6 2.2 6.09

1583 óxido de cariofileno 1.33 1.32

1608

Epóxido de humuleno

II 1.55

1632 -eudesmol 1.81

1654 -Cadinol 1.38 6.89 1.38

ND NI 1.72

ND NI 2.65

SUMA 99.97 98.93 98.93 96.64

NI: No identificado

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

III.1.3.5 Evaluación de la actividad biológica, antioxidante e índice de refracción de

los aceites esenciales de las plantas de estudio

Como puede apreciarse en la Tabla 8, ninguno de los aceites esenciales de las plantas

estudiadas presentó actividad antioxidante por el método del DPPH, ni contra los

microorganismos S. aureus, S. typhi y E. coli, lo cual puede deberse a que los aceites no

presentan compuestos fenólicos o con funciones alcohólicas en porcentajes elevados.

Tabla 8. Actividad biológica, antioxidante e índice de refracción de los aceites

esenciales

Especie S. aureus S. typhi E. coli Antioxidante IR

Lantana camara Negativo Negativo negativo negativo ND

Lantana hispida Negativo Negativo negativo negativo 1.4960

Lantana trifolia Negativo Negativo negativo ND ND

NM: no determinado. Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Page 55: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

42

III.1.3.6 Actividad biocida y antioxidante de extractos con solvente de las plantas de

estudio.

La Tabla 9 presenta los resultados de actividad biocida de los extractos metanólicos de las

tres plantas del género Lantana estudiadas. Ningúno de los extractos presentó actividad

contra los microrganismos evaluados.

Tabla 9. Actividad biocida de extractos etanólicos de las especies de Lantana a una

concentración de 1 mg de extracto/mL

Procedencia Parte Escherichia coli

ATCC 25922

Salmonella typhi

ATCC 14028

Staphylococcus aureus

ATCC25923 L. hispida Hoja Negativo negativo negativo L. cámara Rizoma Negativo negativo negativo L. trifolia Hoja Negativo negativo negativo

Fuente: FODECYT 011-2007

La Tabla 10 presenta los resultados de actividad antioxidante de los extractos de las tres

plantas del género Lantana estudiadas, determinada por el método de la extinción del

radical libre DPPH. Para las plantas L. hispida y L. trifolia se evaluaron los extractos

etanólicos obtenidos directamente del material vegetal y del material vegetal previamente

extraído con diclorometano. En el caso de L. camara, se evaluó la actividad antioxidante

del extracto metanólico correspondiente. Los extractos diclorometánicos de las tres plantas

de estudio, no presentaron actividad antioxidante.

Tabla 10. Actividad antioxidante de extractos de las especies de Lantana estudiadas y

del antioxidante artificial BHT, expresada como IC50 (concentración de extracto que

inhibe la concentración del DPPH al 50 %).

No. Muestra IC50 (g/mL)

1 L. hispida CH2Cl2/etanol 95% 50.24

2 L. trifolia CH2Cl2/etanol 95% 28.29

3 L. hispida etanol 95% 74.34

4 L. trifolia etanol 95% 29.15

5 L. hispida CH2Cl2 ND

6 L. trifolia CH2Cl2 ND

7 L. camara CH2Cl2 ND

8 L. camara metanólico 29.32

9 BHT etanol 95% 34.22

ND: No detectado.

Fuente: FODECYT 011-2007

Page 56: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

43

III.1.4 Tamizaje fitoquímico

En las tablas 11 a 15 se presentan los resultados obtenidos mediante pruebas macro y

semimicro y cromatografía en capa fina (CCF) de los metabolitos evaluados, habiéndose

detectado la presencia de alcaloides, flavonoides y saponinas en CCF.

III.1.4.1 Alcaloides

Tabla 11. Presencia de alcaloides en las plantas Lantana camara L., Lantana hispida

HBK y Lantana Trifolia L.

No.

Muestra

Muestra Reactivo

Mayer’s

Reactivo

Dragendorff

Reactivo

Wagner

1 LC.ZUNI.01.01 - - + Marrón

2 LC.ZUNI.01.04 - - -

3 LT.LAMA.01.01 - - + Marrón

4 LH.SNFE.01.01 - - + Marrón

5 LT.LAMA.01.03 - + (naranja) + Marrón

6 LH.KM93.01.01 - + (naranja) + Marrón

Reactivo Mayer’s cambio de color blanco a crema (+)

Reactivo Dragendorff cambio de color rojo a naranja (+)

Reactivo Wagner cambio de color marrón (+).

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Tabla 12. Detección de Alcaloides por CCF

No. Mx Muestra No.

Bandas

Rf Color de la banda

1 LC.ZUNI.01.01

2 0.50

0.68

Naranja, naranja

2 LC.ZUNI.01.04

2 0.38

0.55

Naranja, naranja

3 LT.LAMA.01.01

2 0.33

0.38

Naranja, naranja

4

LH.SNFE.01.01

3 0.23

0.30

0.37

Naranja, naranja,

naranja

5

LT.LAMA.01.03

3 0.23

0.32

0.42

Naranja, naranja,

naranja

6 LH.KM93.01.01

2 0.28

0.42

Naranja, naranja

Estándar

Papaverina

1 0.28 Naranja

Atropina 1 0.08 Naranja

Reserpina 1 0.22 Naranja

Fase móvil: tolueno, acetato de etilo, dietilamina (70:20:10).

Revelador utilizado: Reactivo de Dragendorff.

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Page 57: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

44

III.1.4.2 Flavonoides y antocianinas

Tabla 13. Detección de flavonoides y antocianinas por CCF

No. Mx Muestra No.

Bandas

Rf Color de la banda

1 LC.ZUNI.01.01 2 0.50, 0.68 Naranja, naranja

2 LC.ZUNI.01.04 2 0.38, 0.55 Naranja, naranja

3 LT.LAMA.01.01 2 0.33, 0.38 Naranja, naranja

4 LH.SNFE.01.01

3 0.23, 0.30, 0.37 Naranja, naranja,

naranja

5 LT.LAMA.01.03

3 0.23, 0.32, 0.42 Naranja, naranja,

naranja

6 LH.KM93.01.01 2 0.28, 0.42 Naranja, naranja

Estándar de Flavonoides 3 0.09, 0.22, 0.28 Naranja

Fase móvil: n-butanol-ácido acético-agua (40:10:50)

Reactivo Revelador: Productos naturales (NP/PEG).

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

III.1.4.3 Saponinas

Tabla 14. Detección de saponinas mediante la prueba de espuma

No. Mx Muestra Reactivo

(KOH)

Observación

1 LC.ZUNI.01.01 + Se observó

formación de espuma. Si

una capa de espuma mayor

de 3 cm persiste en la

superficie líquida pués de 30

minutos se presume la

presencia de saponinas.

2 LC.ZUNI.01.04 +

3 LT.LAMA.01.01 +

4 LH.SNFE.01.01 +

5 LT.LAMA.01.03 +

6 LH.KM93.01.01 +

Estándar de saponinas +++

+ poca formación de espuma

+++ abundante formación de espuma

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Tabla 15. Detección de Saponinas por CCF

No. Muestra No. Bandas Rf Color de la banda

1 LC.ZUNI.01.01 1 0.97 Violeta

2 LC.ZUNI.01.04 1 0.94 Violeta

3 LT.LAMA.01.01 1 0.94 Violeta

4 LH.SNFE.01.01 1 0.96 Violeta

5 LT.LAMA.01.03 1 0.96 Amarillenta

6 LH.KM93.01.01 1 0.96 Amarillenta

Estándar de Saponinas 1 0.69 Violeta

Fase móvil: n-butanol-ácido acético-agua (50:10:40)

Revelador: vainillina-ácido sulfúrico.

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Page 58: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

45

III.1.4.4 Antraquinonas, cumarinas, principios amargos y taninos:

Las tablas 16, 17, 18, 19 y 20 presentan los resultados de tamizaje fotoquímico

correspondiente a los metabolitos secundarios antraquinonas, cumarinas, principios

amargos y taninos. No fue detectada la presencia de compuestos correspondientes a estas

familias en ninguna de las seis muestras de las plantas de estudio.

Tabla 16. Presencia de Antraquinonas

No.

Muestra

Muestra Bornträger Bornträger

modificado

1 LC.ZUNI.01.01 - -

2 LC.ZUNI.01.04 - -

3 LT.LAMA.01.01 - -

4 LH.SNFE.01.01 - -

5 LT.LAMA.01.03 - -

6 LH.KM93.01.01 - -

Prueba de Bornträger cambios de color en la fase alcalina (color rojo, rosado: +).

Prueba de Bornträger modificado cambios de color en fase alcalina (color rojo, rosado: +).

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Tabla 17. Presencia de Cumarinas

No.

Muestra

Muestra Reactivo

(KOH)

Observación

1 LC.ZUNI.01.01 - No se observó

fluorescencia

azul o verde,

bajo luz UV de

365 nm

2 LC.ZUNI.01.04 -

3 LT.LAMA.01.01 - 4 LH.SNFE.01.01 -

5 LT.LAMA.01.03 - 6 LH.KM93.01.01 -

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Tabla 18. Cromatografía en capa fina Cumarinas

No. Muestra Muestra No. De

bandas

Rf Color de la

banda

1 LC.ZUNI.01.01 0 0

2 LC.ZUNI.01.04 0 0

3 LT.LAMA.01.01 0 0

4 LH.SNFE.01.01 0 0

5 LT.LAMA.01.03 0 0

6 LH.KM93.01.01 0 0

Ácido p-cumarico 1 0.07 Verde

Umbelliferona 1 0.07 Verde

Cumarinas 1 0.34 Verde

Fase móvil: tolueno-acetato de etilo (93:7)

Revelador: solución etanólica de hidróxido de potasio al 5%.

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Page 59: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

46

Tabla 19. Presencia de Principios Amargos en Cromatografía en Capa Fina

No.

Muestra

Muestra No. de

bandas

Rf Color de la

banda

1 LC.ZUNI.01.01 0 0

2 LC.ZUNI.01.04 0 0

3 LT.LAMA.01.01 0 0

4 LH.SNFE.01.01 0 0

5 LT.LAMA.01.03 0 0

6 LH.KM93.01.01 0 0

Neuroloena

lobata

1 0.17 Amarillenta

Fase móvil: acetato de etilo-metanol-agua (97:15:8)

Revelador: vainillina-ácido sulfúrico. Las seis muestras dieron resultados negativos.

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Tabla 20. Presencia de Taninos

No.

Muestra

Muestra Gelatina

al 1%

Gelatina-

sal

Cloruro férrico

al 10%

1 LC.ZUNI.01.01 - - -

2 LC.ZUNI.01.04 - - -

3 LT.LAMA.01.01 - - -

4 LH.SNFE.01.01 - - -

5 LT.LAMA.01.03 - - -

6 LH.KM93.01.01 - - -

Observación de formación de precipitados y/o cambio de coloración es positivo (+). Las

seis muestras dieron resultados negativos (-).

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Page 60: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

47

III.1.5 Extracción de metabolitos secundarios por maceración con diclorometano y metanol

En las tablas 21 y 22 se presentan los resultados de rendimento de los extractos

metabólicos y diclorometánicos, respectivamente, observándose mayores rendimientos en

los extractos metanólicos que en los extractos diclorometánicos para las tres plantas. Esto

puede estar relacionado a un alto contenido de compuestos fenólicos como los flavonoides

y bajo contenido de compuestos poco polares como los presentes en los aceites esenciales.

Tabla 21. Extractos metanólicos

Muestra

Material

Vegetal (g)

Extracto

(g)

Rendimiento

% Propiedades Organolépticas

LT.LACH.04.01 50.03 21.5566 43.09

Consistencia muy dura, color

pardo a negro, olor muy débil e

indescriptible

LC.GUA.04.01 50.05 6.2761 12.54

Consistencia muy dura, color

pardo a negro, olor muy débil e

indescriptible

LH.CHIC.03.01 51.86 9.9636 19.21

Consistencia muy dura, color

pardo a negro, olor muy débil e

indescriptible

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Tabla 22. Extractos diclorometánicos

Especie

Material

Vegetal (g)

Extracto

(g)

Rendimiento

% Propiedades Organolépticas

LT.LACH.04.01 50.03 1.5987 3.20

Consistencia suave, color pardo

a negro, olor ligeramente dulce

LC.GUA.04.01 50.05 3.3591 6.71

Consistencia dura, color pardo a

negro y olor muy dulce

LH.CHIC.03.01 51.86 3.1305 6.04

Consistencia suave, color pardo

a negro, olor muy débil e

indescriptible

Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.

Page 61: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

48

III.2 Discusión de Resultados

III.2.1 Rendimiento de extracción de aceites esenciales

El aceite esencial de una planta es una fracción líquida volátil, para la cual existen

diversas técnicas de extracción. En la presente investigación se utilizó la técnica de

hidrodestilación con aparato tipo Clevenger, la cual es una técnica reproducible y que

presenta alto rendimiento de extracción.

En el presente trabajo, fueron utilizados entre 10.0 y 30.0 g de material vegetal seco

para realizar la extracción del aceite esencial por hidrodestilación. En los casos en que se

usaron menos de 20.0 g para la extracción, se debió a que la planta era escasa en algunos

sitios de muestreo. Los sitios de muestreo se presentan en la Tabla 1 en Resultados, donde

se presentan los códigos de las muestras, el lugar de colecta, la altitud y el rendimiento de

extracción. En la revisión de literatura, no se encontró información sobre el rendimiento

de aceite esencial en este género; pero por estudios previos se tiene conocimiento que

distintos géneros de la Familia Verbenaceae tienen buenos rendimientos de aceites

esenciales (Pérez, 2008).

Casi todas las muestras y submuestras presentaron porcentajes de rendimiento bajos

por debajo del 0.5 %, el cual se sugiere como aceptable para la producción de aceites

esenciales (Aragão et al., 1981; Pérez, 2008); la excepción fueron las muestras:

LH.KM93.01.02 A y B, y LT.LAMA.01.03 C que presentaron porcentajes de

rendimientos de aceites esenciales superiores a 0.5%. También se puede observar en la

Tabla 4 que el rendimiento promedio de extracción del aceite esencial de L. hispida fue el

más alto (0.38 %), mientras que para L. camara y L. trifolia, fue de 0.18 y 0.17 %,

respectivamente. Estos últimos dos rendimientos son bajos, pero considerando que las

tres especies estudiadas, por lo que en vista de los resutados de composición obtenidos, en

que L. hispida presenta alto porcentaje de metileugenol, esta planta presentaría el mayor

potencial para la extracción del aceite esencial.

Por otra parte, no se observaron diferencias en las colectas realizadas en meses

diferentes, por ejemplo en el caso de L. hispida, que fue colectada en San Cristóbal

Acasaguastlán, El Progreso y en San José, Zacapa, en los meses de junio de 2008 y enero

de 2009, los rendimientos fueron similares en ambos meses. En el caso de L. hispida, si se

observaron diferencias en el rendimiento de extracción entre los dos municipios

mencionados, con mayores rendimientos en las muestras colectadas en San Cristóbal

Acasaguastlán (0.46-0.72 %) que en las colectadas en San José (0.24-0.35 %), por lo que

en el caso de esta especie si influye la situación geográfica. En el caso de L. camara y L.

trifolia, no se observaron diferencias marcadas en los rendimientos entre diferentes sitios

de colecta ni entre diferentes meses.

III.2.2 Composición de los aceites esenciales de las plantas de estudio:

Las tablas 5, 6 y 7 presentan los resultados de los análisis cromatográficos de los

aceites esenciales de L. hispida, L. camara y L. trifolia, obtenidos por hidrodestilación con

aparato tipo Clevenger. El aceite esencial de L. hispida presentó principalmente sabineno,

Page 62: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

49

-cariofileno y germacreno D, todos en porcentajes promedio superiores a 10 % (tabla 5),

siendo el primero de ellos un monoterpeno y los segundos, sesquiterpenos, que resultaron

ser los compuestos dominantes en la composición del aceite esencial. No se observaron

diferencias marcadas en la composición de los aceites esencial de L. hispida de diferentes

localidades, con excepción del aceite esencial de San José, Zacapa, que presentó mayor

diversidad (29 compuestos), entre ellos 9 compuestos menores no identificados. El -cariofileno y el germacreno D son compuestos que pueden ser utilizados como base para

la síntesis de otros compuestos que podrían presentar actividad biológica, por lo que la

producción de aceite esencial de esta planta podría ser orientada para la obtención de estos

compuestos como materia prima. El aceite esencial de L. hispida no presentó actividad

biológica contra los microorganismos investigados. Al ser L. hispida la planta que

presentó mayor rendimiento de aceite esencial (0.46-0.72 %), se considera que de las

plantas estudiadas es la que presentaría mayor potencial económico para producción del

aceite esencial.

El aceite esencial de L. camara presentó -cariofileno (4.45-32.97 %) y germacreno

D (29.5-50.36 %) como componentes mayoritarios, presentando los aceites de esta planta

más del 70 % correspondiente a compuestos sesquiterpenoides (Tabla 6). En vista del

bajo rendimiento de extracción (0.18 %), la falta de actividad biológica del aceite y la

presencia de los mismos compuestos mayoritarios que el aceite de L. hispida, el aceite

esencial de L. camara presenta menor potencial económico que el de L. hispida. No se

observaron diferencias marcadas en la composición del aceite esencial correspondiente a

diferentes localidades de colecta.

El aceite esencial de L. trifolia presentó -copaeno (3.67-12.48 %), metileugenol

(21.06-40.01 %), y muuroleno (17.8-22.09 %), como principales componentes (tabla 7).

Estos compuestos no presentan porcentajes elevados en las otras dos especies estudiadas,

por lo que sería un factor de diferenciación para la producción del aceite esencial. El

metileugenol puede ser un precursor en la síntesis de compuestos con actividad biológica.,

por lo que la producción del aceite esencial de L. trifolia, a pesar del bajo rendimiento de

extracción (0.17 %) podría orientarse a la obtención de este compuesto. No se observaron

diferencias marcadas en la composición del aceite esencial en las dos localidades ni en

meses diferentes.

III.2.3 Tamizaje fitoquímico y extractos diclorometánicos y metanólicos

El tamizaje fitoquímico se realizó en seis muestras; dos de cada especie de la familia

Lantana: L. camara, L. hispida y L. trifolia provenientes de distintos lugares. El tamizaje

fitoquímico se realizó con el fin de determinar cualitativamente los siete grupos

principales de constituyentes químicos presentes en planta, ya que en Guatemala no se le

ha realizado ningún estudio previo; tales como alcaloides, taninos, flavonoides (fenoles),

principios amargos, antraquinonas, cumarinas y saponinas. Se realizaron extracciones con

metanol a partir de material vegetal seco, tanto con maceración como con ultrasonido, no

habiéndose observado diferencias en los grupos de metabolitos secundarios extraidos con

los dos métodos, analizados por pruebas colorimétricas (ensayo macro) cualitativas y un

análisis por cromatografía en capa fina.

Page 63: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

50

Se puede observar en la Tabla 3, que el porcentaje de humedad en todos los casos

fue superior al 10 %, Esto no es relevante ya que la finalidad de reducir el porcentaje de

humedad del material vegetal al 10 % es de poder almacenarlo sin que pierda su integridad

por un período de dos años aproximadamente, y esa no fue la finalidad de este estudio.

Un grupo de metabolitos secundarios de gran importancia es el conformado por los

alcaloides. Esto se debe a que presentan actividad contra una gran cantidad de herbívoros

provenientes de diferentes familias. Los resultados de las pruebas realizadas a las seis

muestras se presentan en la Tabla 11; se puede observar que se realizaron tres pruebas

colorimétricas (ensayo macro) para indicar la presencia de alcaloides. Para que se pueda

tomar como significativa la presencia de alcaloides, tienen que ser positivas por lo menos

dos de las tres pruebas realizadas, de lo contrario no son significativas. Las muestras No.

5 (L. trifolia) y 6 (L. hispida), (LT.LAMA.01.03 y LH.KM93.01.01 respectivamente)

dieron positivas en las pruebas con el reactivo de Dragendorff y Wagner (Trease y Evans,

1991). La desventaja de este tipo de pruebas es que en muchas ocasiones se pueden

obtener resultados ambiguos, es decir, falsos positivos; es por eso que se realizó la

cromatografía en capa fina, solamente para saber de una forma muy general si hay

presencia o no de alcaloides. Se puede observar en la Tabla 12, que en la cromatografía de

capa fina, las seis muestras presentaron cualquier tipo de alcaloide. Se utilizaron tres

estándares de alcaloides específicos (Papaverina, Atropina y Reserpina), estos se

utilizaron con el fin de tener una referencia de comparación en el color de las bandas

siempre dependiendo del reactivo revelador (bandas naranjas o cafés), y también a su vez

se pudo realizar una comparación entre los factores de retención (Rf) teóricos versus los

obtenidos experimentalmente de las seis muestras. Con la realización de este experimento

se determinó que en la muestra No. 6, de L. hispida, LH.KM93.01.01, hay presencia del

alcaloide papaverina ya que el Rf teórico es igual a uno de los obtenidos

experimentalmente en esa muestra; lo cual se puede decir de una forma general que hay

presencia de alcaloides.

Los flavonoides y antocianinas son de suma importancia ya que poseen la propiedad

de actuar como agentes antioxidantes, aunque frecuentemente presentan más actividades

(Bruneton, 1993). Se clasifican en isoflavonas, antocianidinas, flavanos, flavonoles,

flavonas y flavanonas. Se realizaron las pruebas a nivel macro pero en ninguna de las seis

muestras hubo presencia de alguna de ellas; pero en cambio en la cromatografía en capa

fina se puede observar en la Tabla 13 que en las seis muestras hay presencia de

flavonoides y antocianinas, debido a que se obtuvieron varias bandas de color naranja

similar al de los obtenidos en el estándar; específicamente en la muestra No. 6, de L.

hispida, LH.KM93.01.01.

Las saponinas son compuestos que presentan propiedades tensoactivas. Estas

mismas propiedades tensoactivas no son deseables durante la hidrodestilación de aceites

esenciales al hacer uso del aparato tipo Clevenger o cualquier sistema similar debido a que

provocan proyecciones del material vegetal. En la Tabla 14, se observa en que las seis

muestras hay presencia de saponinas ya que al realizar la prueba macro se observó la

formación de una capa de espuma de aproximadamente 3 cm la cual persistió por más de

30 min. Esto se corroboró con la cromatografía en capa fina, ya que según la Tabla 15, se

obtuvieron resultados positivos para la presencia de saponinas, ya que al utilizar el

Page 64: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

51

revelador de vainillina-ácido sulfúrico se presentaron bandas de color azul, violetas o

amarillas. No se detectó presencia de antraquinonas, cumarinas, principios amargos y

taninos en ninguna de las seis muestras a las que se realizó el tamizaje fotoquímico

(Tablas 16, 17, 18, 19 y 20).

Las Tablas 21 y 22 presentan respectivamente los rendimientos de los extractos

metanólicos y diclorometánicos. Se observa un mayor rendimiento en el extracto

metanólico que en el diclorometánico para las tres especies estudiadas. En el caso de L.

trifolia, el rendimiento del extracto metanólico es superior al 40 %, trece veces mayor que

el rendimiento del extracto diclorometánico. La reducida presencia de aceite esencial en

las tres especies y presencia de compuestos fenólicos tales como los flavonoides se

correlacionan perfectamente con este tipo de resultados.

III.2.4 Actividad biológica, antioxidante e índice de refracción de los aceites

esenciales de las plantas de estudio

Los ensayos de actividad biológica se realizaron con dos muestras de aceite esencial

de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. No se encontró que los

aceites presenten actividad biológica frente a los microorganismos Escherichia coli,

Salmonella typhi y Staphylococcus aureus (Tabla 8). Esto puede deberse a que los aceites

esenciales estudiados no presentan grupos funcionales con alta reactividad (grupos

hidroxilo o fenólicos), que puedan atacar a los microorganismos utilizados.

Los mismos aceites esenciales, con excepción del aceite esencial de L. trifolia

(debido a la escasez con que se obtuvo este aceite, se priorizaron los análisis

cromatográficos y de actividad biológica), fueron utilizados para evaluar la actividad

antioxidante por el método del DPPH (Tabla 8). Ninguna de las cuatro muestras de aceite

esencial evaluadas (dos correspondientes a L. camara y dos a L. hispida), presentaron

actividad antioxidante, considerándose, al igual que con los resultados negativos de

actividad biológica, que la ausencia de actividad antioxidante, en este caso, secuestro del

radical libre DPPH, se debió a que estos aceites no presentaron componentes con grupos

reactivos, por ejemplo fenólicos. De igual manera, únicamente fue posible determinar el

índice de refracción de L. hispida, que fue de 1.4960.

III.2.5 Actividad biológica y antioxidante de extractos de las plantas de estudio

obtenidos con solventes.

En las tablas 9 y 10 se presentan los resultados de la evaluación de la actividad

antimicrobiana y actividad antioxidante de extractos de las plantas de estudio, obtenidos

por maceración con solvente.

Los ensayos de actividad biológica se realizaron con muestras de extractos

etanólicos de hojas Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. y de rizomas de Lantana

camara L. Ninguno de los extractos de las plantas de estudio presentó actividad biológica

frente a los microorganismos Escherichia coli, Salmonella typhi y Staphylococcus aureus

(Tabla 9). Es posible que el grado de dilución de los extractos etanólicos de la

Page 65: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

52

metodología estándar utilizada no sea el adecuado para que la concentración de los

metabolitos secundarios encontrados, entre ellos, flavonoides, muestre actividad biológica.

La actividad antioxidante de los extractos de las plantas de estudio fue evaluada

utilizando el método del radical libre DPPH (Tabla 10). Extractos etanólicos obtenidos

directamente del material vegetal de L. hispida y L. trifolia, y de material de estas plantas

previamente extraido por diclorometano fueron utilizados para esta determinación. En el

caso de L. camara fueron utilizados extractos metanólicos. Los extractos diclorometánicos

de las tres plantas de estudio, no presentaron actividad antioxidante detectable. El extracto

etanólico de L. hispida presentó la mayor actividad antioxidante (IC50 de 74.34 g/mL)

superior inclusive a la actividad presentada por BHT (IC50 de 34.22 g/mL). La menor actividad antioxidante fue observada para el extracto diclorometánico de L. trifolia (IC50

de 28.29 g/mL), mientras que el extracto metanólico de L. camara presentó una actividad

antioxidante ligeramente menor a la del BHT (IC50 de 29.32 g/mL). Las diferencias pueden observarse en la Figura 4, que presenta la gráfia del IC50 de los extractos

analizados. La actividad antioxidante observada en las especies del género Lantana

estudiadas, podría ser causada por la presencia de flavonoides encontrada en las mismas, y

que podría presentar potencial para su evaluación para la obtención de antioxidantes

naturales para su uso en la industria alimenticia.

Figura 4. Actividad antioxidante de extractos de plantas del género Lantana.

Actividad antioxidante de extractos

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Lanta

na hisp

ida C

H2Cl2/e

tanol 9

5%

Lanta

na trifo

lia C

H2Cl2/e

tanol 9

5%

Lanta

na hisp

ida e

tanol 9

5%

Lanta

na trifo

lia e

tanol 9

5%

Lanta

na cam

ara m

etanólic

o

BHT eta

nol 95%

muestra

I C5

0 [

µg/

ml]

Fuente: FODECYT 011-2007.

Page 66: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

53

PARTE IV.

IV.1 CONCLUSIONES

IV.1.1 El aceite esencial de las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y

Lantana trifolia L., presenta una composición química característica de la Familia

Verbenaceae, siendo el aceite de L. trifolia el que presenta mayor potencial para su

aprovechamiento en procesos agroindustriales al presentar metileugenol entre sus

componentes mayoritarios.

IV.1.2 La planta Lantana hispida presentó el mayor rendimiento de extracción (0.38 %)

en comparación con Lantana camara (0.18 %) y Lantana trifolia (0.17 %), no habiéndose

encontrado que exista relación entre el rendimiento de extracción de los aceites esenciales

de las plantas de estudio con la estación del año en que se realiza la colecta.

IV.1.3 No fue posible determinar las diferencias en los rendimientos de extracción de los

aceites esenciales por las técnicas de hidrodestilación y extracción-destilación, ya que por

el bajo contenido de aceite esencial de las plantas de estudio, la técnica de extracción-

destilación no resultó útil para la extracción de los aceites esenciales para las especies del

género Lantana evaluadas.

IV.1.4 Con base en su composición química, los aceites esenciales de las plantas de

estudio presenta potencial para su uso como materia prima para la síntesis de moléculas

modificadas para la investigación de actividad biológica, por el elevado porcentaje de

sesquiterpenos, para la obtención de metileugenol en el caso de L. trifolia, y en la industria

cosmética para el caso de las tres plantas de estudio.

IV.1.5 Los aceites esenciales y metabolitos secundarios presentes en los extractos de

Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L., no presentaron actividad

biológica frente a los microorganismos Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhi

ATCC 14028 y Staphylococcus aureus ATCC25923.

.

IV.1.6 Los aceites esenciales de Lantana camara L., Lantana hispida HBK no presentaron

actividad antioxidante por el método del DPPH. La actividad antioxidante del aceite

esencial de Lantana trifolia L. no pudo determinarse por la escasez con que se obtuvo

dicho aceite. En el caso de los extractos con solvente de las plantas de estudio, todos

presentaron actividad antioxidante similar o mayor a la del antioxidante artificial BHT

(IC50 de 34.33 g/mL), destacando la actividad antioxidante (IC50 de 74.34 g/mL) del

extracto etanólico de Lantana hispida. Esta actividad antioxidante de lo extractos puede

estar relacionada a la presencia de flavonoides encontrada en los mismos extractos.

IV.1.7 El aceite esencial de Lantana hispida proveniente de San Cristóbal Acasaguastlán

presenta mejor rendimiento de extracción que el procedente de la Aldea San José,

Teculután, Zacapa, por lo que puede considerarse como con mayor potencial para la

selección de plantas con el propósito de producción del aceite esencial. Para las otras dos

plantas estudiadas, Lantana camara y Lantana trifolia, no se encontraron diferencias en el

Page 67: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

54

rendimiento ni en la composición del aceite esencial que le otorguen mayor potencial a las

plantas procedentes de las diferentes localidades de colecta.

IV.1.8 Se optimizó el método de extracción y análisis por cromatografía de gases, que

permite la determinación rápida y confiable de los componentes de aceites esenciales y

metabolitos secundarios de las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y

Lantana trifolia L.

IV.1.9 No hubo diferencia en la extracción de los grupos de metabolitos secundarios

identificados en las plantas de estudio, al utilizar las técnicas de maceración en etanol y de

extracción en etanol por ultrasonido, al obtenerse los mismos metabolitos secundarios.

IV.1.10 No fue posible realizar la clasificación de los aceites esenciales de las plantas de

estudio con base en su índice de refracción, debido a que los rendimientos de extracción

fueron muy bajos, siendo todos menores a 0.4 %, por lo que no se contó con material

suficiente para la determinación de este parámetro.

IV.1.11 Las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L.

presentaron Alcaloides, Flavonoides y Saponinas, que deben investigarse, ya que podrían

presentar potencial en las industrias cosmética, de alimentos y como posibles moléculas

con actividad biológica.

IV.1.12 Las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. no

presentaron Cumarinas, Principios Amargos, Antraquinonas y Taninos.

IV.1.13 Los extractos metanólicos de las plantas Lantana camara L., Lantana hispida

HBK y Lantana trifolia L. presentan un rendimiento de 12.54, 19.21 y 43.09 %

respectivamente; los cuales son superiores a los rendimientos de los extractos

diclorometánicos para estas mismas plantas; 6.71, 6.04 y 3.20 % respectivamente.

Page 68: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

55

IV.2 RECOMENDACIONES

IV.2.1 Realizar experimentos de domesticación de Lantana hispida HBK y Lantana

trifolia L., para evaluar rendimientos y composición de los aceites esenciales en

condiciones controladas, para evaluar el potencial de producción.

IV.2.2 Realizar estudios de aislamiento, identificación y cuantificación de alcaloides y

flavonoides en las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L.,

para determinar las moléculas que puedan ser investigadas por su actividad biológica y

antioxidante, para posibles usos en las industrias de alimentos y farmacéutica.

IV.2.3 Realizar ensayos de actividad biocida con los aceites esenciales y extractos de las

plantas del género Lantana, frente a los microorganismos: Bacillus subtilis, Pseudomona

aeruginosa, Sarcina lutea, Candida albicans y los hongos Aspergillus Níger y A.

fumigatus. Así mismo, se recomienda evaluar la actividad biocida frente a Escherichia

coli, Salmonella typhi y Staphylococcus aureus modificando el método, para utilizar una

mayor concentración de extractos.

Page 69: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

56

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Almeida-Doria, R.F., Regitano-Dárcey, A.B. (2000) Antioxidant of Rosemary and

oregano ethanol extracts in soybean oil under thermal oxidation. Cienc. Tecnol.

Aliment., Campinas 20: 197-203.

Aragão, A. (1981) Oleos Essenciais de Plantas do Nordeste. Ediçoes UFC. Fortaleza,

Brasil, 1981.

Bandoni, A. (2003) Los Recursos Vegetales Aromáticos en Latinoamérica. Su

aprovechamiento industrial para la producción de aromas y sabores. Buenos Aires,

CYTED. pp31.

Besco, E., Baccioli, E., Vertuani, S., Ziosi, P., Brazzo, F., Bruni, R., Sacchetti, G.,

Manfredini, S. (2007) The use of photochemiluminescence for the measurement of

the integral antioxidant capacity of baobab products. Food Chem. 102: 1352-1356.

Bicchi, C., Cordero, Ch., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. (2004) Automated

headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food

matrices. J. Chromatogr. A, 1024: 217-226.

Botelho, M.A., Nogueira, N.A.P., Bastos, G.M., Fonseca, S.G.C., Lemos, T.L.G.,

Matos, F.J.A., Montenegro, D., Heukelbach, J., Rao, V.S., Brito, G.A.C. (2007a)

Antimicrobial activity of the essential oil from Lippia sidoides, carvacrol and thymol

against oral pathogens. Braz. J. of Med. Biol. Res. 40: 349-356.

Botelho, M.A., Rao, V.S., Carvalho, C.B.M., Bezerra-Filho, J.G., Fonseca, S.G.C.,

Vale, M.L., Montenegro, D., Cunha, F., Ribeiro, R.A., Brito, G.A. (2007b)

Lippia sidoides and Myracrodruon urundeuva gel prevents alveolar bone resorption

in experimental periodontitis in rats. J. Ethnopharmacol. 113: 471-478

Bruneton, J. (1993) Farmacognosia. Fotoquímica. Plantas Medicinales. Segunda edición.

Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, España. Pp 123-124, 183-184, 261-263, 305-306,

366-367, 405-407, 467 y 775.

Bruni, R., Medici, A., Andreotti, E., Fantin, C., Muzzoli, M., Dehesa, M., Romagnoli,

C., Sacchetti, G. (2004) Chemical composition and biological activities of Ishpingo

essential oil, a traditional Ecuadorian spice from Ocotea quixos (Lam.) Diosterm.

(lauraceae) flower calices. Food Chem. 85:415-421.

Burt, S. (2004) Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in

foods –a review. Int. J. Food Microbiol. 94:223.

Cáceres A. (1998) Plantas de Uso Medicinal en Guatemala. Colección Monografías, Vol.

1 Editorial Universitaria, Guatemala.

Page 70: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

57

Cáceres A.; Samayoa, B, Logemann, H. (1990) Plantas de Uso Medicinal en

Guatemala: Tamizaje de la actividad antimicrobiana (2ª parte) Revista de la

Universidad de San Carlos, No. 10, marzo, 1990.

Cáceres A, Girón L, Freire V. (1990) Plantas de uso medicinal en Guatemala.

Detección etnobotánica y bibliográfica. Revista de la Universidad de San Carlos,

No. 10, junio, 1990.

Caltagirone, S., Rossi, C., Poggi, A., Ranelletti, F.O., Natali, P.G., Brunetti, M.,

Aiello, F.B., Piantelli, M. (2000) Flavonoids apigenin and quercetin inhibit

melanoma growth and metastatic potencial, Int J. Cancer, 87: 595-600.

Camurça-Vasconcelos, A.L.F., Bevilaqua, C.M.L., Morais, S.M., Maciel, M.V.,

Costa, C.T.C., Macedo, I.T.F., Oliveira, L.M.B., Braga, R.R., Silva, R.A.,

Vieira, L.S. (2007) Antihelmintic activity of Croton zehntneri and Lippia sidoides

essential oils. Vet. Parasitol. 148: 288-294

Carvalho, A.F.U., Melo, V.M.M., Craveiro, A.A., Machado, M.I.L., Bantim, M.B.,

Rabelo, E.F. (2003) Larvicidal activity of the essential oil from Lippia sidoides

Cham. Against Aedes Aegypti Linn. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 98: 569-571.

Cheng, S.S., Liu, J., Hsui, Y.R., Chang, S.T. (2006) Chemical polymorphism and

antifungal activity of essential oils from leaves from different provenances of

indigenous cinnamon (Cinnamomum osmophloeum). Bioresource Technology. 97:

306.

Cos, P., Ying, L., Calomme, M., Hu, J.P., Cimanga, K., Van Poel, V., Pieters, L.,

Vlietinck, A.J., Vanden Berghe, D. (1998) Structure-activity relationship and

classification of flavonoids as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide

scavengers. J. Nat. Prod. 61: 71-76.

Cramers, C.A., Leclercq, P.A. (1999). Strategies for speed optimization in gas

chromatography: an overview. J. of Chromat. A 842:3-13.

Curado, M.A., Oliveira, C.B.A., Jesus, J.G., Santos, S.C., Seraphin, J.C., Ferri, P.H. (2006) Environmental factors influence on chemical polymorphism of the essential

oils of Lychnophora ericoides. Phytochemistry 67:2363-2369.

Dewick, P.M. (2001) Medicinal Natural Products. A Biosynthetic Approach. West

Soussex, John Wiley and Sons. 2nd

Ed. 507 pp.

Duarte, M.C.T., Figueira, G.M., Sartoratto, A., Rehder, V.L.G., Delarmelina, C. (2005) Anti-Candida activity of Brazilian medicinal plants. J. Ethnopharmacol.

97:305-311.

Dubey, V.S., Bhalla, R., Luthra, R. (2003) An overview of the non-mevalonate pathway

for terpenoid biosynthesis in plants. J. Biosci. 28: 637-646.

Page 71: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

58

Durán, D.C., Monsalve, L.A., Martínez, J.R., Stashenko, E.E. (2007) Estudio

comparativo de las composición química de aceites esenciales de diferentes regiones

de Colombia, y efecto del tiempo de destilación sobre la composición del aceite.

Scient. Et Tech. 33:435-438.

Duvold, T., Bravo, J., Pale-Grosdemange, C., Rohmer, M. (1997) Biosynthesis of 2-C-

Methyl-D-erytrhiotol, a putative C5 intermediate in the mevalonate independent

pathway for isoprenoid biosynthesis. Thetraed. Lett. 38: 4769-4772.

Fellermeier, M., Raschke, M., Sagner, S., Wungsintaweekul, J., Schuhr, Ch., Hecht,

S., Kis, K., Radykewicz, T., Adam, P., Rohdich, F., Eisenreich, W., Bacher, A.,

Arigoni, D., Zenk, M. (2001) Studies on the nonmevalonate pathway of terpene

biosuynthesis. Eur. J. Biochem. 268: 6302-6310.

Ferrari, M., Signorini, C., Caciotti, B., Sugherini, L., Ciccoli, L., Giachetti, D.,

Comproti, M. (1997) Protection against oxidative damage of erythrocyte membrane

by the flavonoid quercetine and its relation to iron chelating activity, FEBS Lett,

416:123-129.

Fischer, U., Franz, Ch., López, R., Pöll, E. (1997) Variability of the Essential Oils of

Lippia graveolens HBK from Guatemala. Proceedings of 27th International

Symposium on Essential Oils. Edits., Ch. Franz, A. Mathé and G. Buchbauer, pp.

266-269. Allured Publ. Corp., Carol Stream, IL.

Fischer, U., López, R., Pöll, E., Vetter, S., Novak, J., Franz, Ch. (2004) Two

chemotypes within Lippia alba populations in Guatemala. Flav. Frag. J., 19, 333-

335.

Guenther, E. (1948) The Essential Oils. Van Nostrand Company, New York. Vol. 1.

P.189-200.

Hermann, K. (1976) Flavonols and flavones in food plants: a review. J. Food Technol.

11: 433-448.

Hirano, R., Sasamoto, W., Matsumoto, A., Itakura, H., Igarashi, O., Kondo, K. (2001) Antioxidant ability of various flavonoids against DPPH radicals and LDL

oxidation, J. Nutr. Sci. Vitaminol (Tokyo), 47:357-362.

Hirasa, K., Takemasa, M. (1998) Spice Science and Technology. CRS Press: Nueva

York. 232 pp.

Hostettmann, K; Queiroz, E.; Vieira, P. (2003) Princípios Ativos de Plantas

Superiores. Edufscar, San Carlos, Brasil.

Kanadaswami, C., Lee, L.T., Lee, P.P., Hwang, J.J., Ke, F.C., Huang, Y.T., Lee, M.T.

(2005) The antitumor activities of flavonoides. In vivo, 19: 895.

Page 72: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

59

Kaneda, J. P. (1992) J. Nat. Prods. 55 (8): 1136-1141

Kawanishi, S., Hiraku, Y., Oikawa, S. (2001) Mechanism of guanine-specific DNA

damage by oxidative stress and its role in carcinogenesis and aging. Mutat. Res. 488:

65-76.

Khan, M.A., Baseer, A. (2000) Increased malondialdehyde levels in coronary heart

disease, J. Pak. Med. Assoc. 50:261-264.

Larson, R A (1995) Antioxidant mechanisms of secondary natural products. In: Oxidative

stress and antioxidant defense in biology. Ed. Ahmad, London.

Lin, L., Mukhopadhyay, S., Robbins, R.J., Harnly, J.M. (2007) Identification and

quantification of flavonoids of Mexican oregano (Lippia graveolens) by LC-DAD-

ESI/MS analysis. J. Food Comp. Anal. 20: 361-369.

Lu, S., Xu, R., Jia, J.W., Pang, J., Matsuda, S.T.P., Chen, X.Y. (2002) Cloning and

functional characterization of a -pinene synthase from Artemisia annua L. that

shows a circadian pattern of expression. Plant Physiol. 130: 477.

Marriot, P.J., Shellie, R., Cornwell, Ch. (2001) Gas chromatographic technologies for

the analysis of essential oils. J. Chromatogr. A. 936:1-22.

Medinilla, B. (1996) Manual de Laboratorio de Farmacognosia. USAC, Guatemala.

Meyer, A.S., Heinonen, M., Frankel, E.N. (1998) Antioxidant interactons of catechin,

cyanidin, caffeic acid, quercetin, and ellagic acid on human LDL oxidation. Food

Chem. 61: 71-75.

Ness, A.R., Powles, J.W. (1997) Fruit and vegetables, and cardiovascular disease: a

review, Int. J. Epidemiol, 26: 335-341.

Oliveira, D.R., Leitão, G.G., Santos, S.S., Bizzo, H.R., Lopes, D., Alviano, C.S.,

Alviano, D.S., Leitão, S.G. (2006) Ethnopharmacological study of two Lippia

species from Oriximiná, Brazil. J. Ethnopharmacol. 108: 103-108.

Oumzil, H., Ghoulami, S., Thajaoui, M., Hidrissi, A., Fkih-Tetouani, S., Faid, M.,

Bejouad, A. (2002) Antibacterial and antifungal activity of essential oils of Mentha

suaveolens. Phytother. Res. 16: 727

Peer, W.A., Bandyopadhyay, A., Blakeslee, J.J.U., Makam, S.N., Chen, R.J., Masson,

P.H., Murphy, A.S. (2004) Variation in expression and protein localization of the

PIN family of auxin efflux facilitator proteins in flavonoid mutants with altered

auxin transport in Arabidopsis thaliana, Plant Cell, 16: 1898-1911.

Page 73: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

60

Pereira, S.I., Santos, P.A.G., Barroso, J.G., Figueiredo, A.C., Pedro, L.G., Salguero,

L.R., Deans, S.G., Scheffer, J.J.C. (2003) Chemical Polymorphism of the Essential

Oils from Populations of Thymus caespiitius Grown on the Islands Pico, Faial and

Graciosa (Azores). Pthytochemical Analysis, 14, 228-231.

Pereira, S.I., Santos, P.A.G., Barroso, J.G., Figueiredo, A.C., Pedro, L.G., Salgueiro,

L.R., Deans, S.G., Scheffer, J.J.C. (2000) Chemical Polymorphism of the Esencial

Oils from Populations of Thymus caespititius Grown on the island S. Jorge (Azores).

Phytochemistry, 55, 241-246.

Pérez, J.F. (2008) Investigação Química de Óleos Essencials de Plantas da Guatemala.

Tesis doctoral. Río de Janeiro. UFRJ. BR. 281 p.

Poli, F., Bonsignore, L., Loy, G., Sacchetti, G., Ballero, M. (1997) Comparison between

the essential oils of Santolina insularis (Genn. Ex Fiori) Arrigoni and Santolina

corsica Jord. Et Fourr. From the island of Sardinia (Italy) J. Of Ethnopharma.

56:201-208.

Potterat, O. (1997) Antioxidants and free radical scavengers of natural origin. Current

Organic Chemistry, 1, 415.

Richter, J. e Schellenberg, I. (2007) Comparison of different extraction methods for the

determination of essential oils and related compounds from aromatic plants and

optimization of solid-phase microextraction/gas chromatography. Anal. Bional.

Chem. 387: 2207-2217.

Rocha-Guzmán, N.E., Gallegos-Infante, J.A., González-Laredo, R.F., Ramos-Gómez,

M., Rodríguez-Muñoz, M.E., Reynosos-Camacho, Rocha-Uribe, A., Roque-

Rosales, M.R. (2007) Antioxidant effect of orégano (Lippia berliandieri v. Shauer)

essential oil and mother liquors. Food Chem. 102: 330-335.

Rochdich, F., Kis, K., Bacher, A., Eisenreich, W. (2001) The non-mevalonate pathway

of isoprenoids: genes, enzymes and intermediates. Curr. Opin. Chem. Biol. 5: 535-

540.

Ross, I.A. (1999) Medicinal Plants of the World. Totowa: Humana Press. Vol. 1. pp 179-

187.

Sacchetti, G., Maietti, S., Muzzoli, M., Scaglianti, M., Manfredini, S., Radice, M.,

Bruni, R. (2005) Comparative evaluation of 11 essential oils of different origin as

functional antioxidants, antiradicals and antimicrobials in foods. Food chemistry,

91:621-632.

Sagner, S., Eisenreich, W., Fellermeier, M., Latzel, Ch., Bacher, A., Zenk, M. (1998)

Biosynthesis of 2-C-methyl-D-erytrhiol in plants by rearrangement of the terpenoid

precursor, 1-Deoxy-D-xylulose 5 –phosphate. Tetrahed. Lett. 39: 2091-2094.

Page 74: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

61

Salgueiro, L.R., Cavaleiro, C., Goncalves, M.J., Proença da Cunha, A. (2003)

Antimicrobial Activity and Chemical Composition of the Essential Oil of Lippia

graveolens from Guatemala. Planta Medica, 69, 80-83.

Salgueiro, L., Vila, R., Tommas, X., Tomi, F., Cañigueral, S., Casanova, J., Proença,

A., Adzet, T. (1995) Chemical Polymorphism of the essential oil of Thymus

carnosus from Portugal. Phytochemistry. 38:391-396.

Sánchez-Moreno, C. Larrauri, J.A. Saura-Calixto, F. (1998) A procedure to measure

the antiradical efficiency of polyphenols. J. Sci. Food Agric. 76: 270.

Sangwan, N.S.; Farooqi, A.H.A.; Shabih, F.; Sangwan, R.S. (2001) Regulation of

essential oil productin in plants. Plant Growth Regulation 34: 3-21.

Santos, P.A.G., Barroso, J.G., Figueiredo, A.C., Pedro, L.G., Salgueiro, L.R.,

Fontinha, S.S., Deans, S.G., Scheffer, J.C. (2005) Chemical polymorphism of

populations of Thymus caespititius grown on the islands Corvo, Flores, Sao Miguel

and Terceira (Azores) ande on Madeira, assessed by analysis of their essential oils.

Plant Science. 169:1112-1117.

Schmid, J. y Amrhein, N. (1995) Molecular organization of the shikimate pathway in

higher plants. 39: 737-749.

Senatore, L., Rigano, F. (2001) Essential oil of two Lippia spp. (verbenaceae) growing

wild in Guatemala. Flav. Fragr. J. 16: 169-171

Shirley, B.W. (1996) Flavonoid biosynthesis: “new” functions for an “old” pathway,

Trend Plant Sci. 1:377-382

Soares, S. E. (2002) Ácidos fenólicos como antioxidantes. Rev. Nutr. 15:71

Soleas, G.J., Grass, L., Josephy, P.D., Goldberg, D.M., Diamandis, E. (2006) A

comparison of the anticarcinogenic properties of four red wine polyphenols.

Clinical Biochem (39) 492-497.

Sousa, C.M.M., Silva, H.S., Vieira-Jr, G.M., Ayres, M.C.C., Costa,C.L.S., Araújo,

D.S., Cavalcante, L.C.D., Barros, E.D.S., Araújo, P.B.M., Brandão, M.S.,

Chaves, M.H. (2007) Fenóis totais e atividade antioxidante de cinco plantas

medicinais. Quím. Nova 30:2

Souto-Bachiller, F.A., De Jesús Echeverría, M., Cárdenas González, O.E., Acuña-

Rodríguez, M.F., Meléndez, P.A., Romero-Ramsey, L. (1997) Terpenoid

composition of Lippia dulcis. Phytochemistry. 44 (6): 1077-1086

Standley, P. Steyermark, (1970) Flora de Guatemala, part IX. Fieldiana: Botany, USA.

1970, vol. 24. 209-211.

Page 75: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

62

Stevens, W. D., C. Ulloa U., A. Pool y O. M. Montiel (eds.), (2001) Flora de Nicaragua.

Vol. 85, tomos I, II y III. Missouri Botanical Garden Press. St. Louis Missouri.

Tanaka, T., Kawabata, K., Kakumoto, M., Makita, H., Ushida, J., Honjo, S., Hara,

A., Tsuda, H., Mori, H. (1999) Modifying effects of a flavonoid morin on

azoxymethane-induced large bowel tomorigenesis in rats. Carcinogenesis, 20:1477-

1484.

Thompson, J.D., Chalchat, J., Michet, A., Linhart, Y., Ehlers, B. (2003) Qualitative

and Quantitative variation in monoterpene co-occurrence and composition in the

essential oils of Thymus vulgaris chemotypes. J. Chem. Ecol. 29: 859-880.

Valgas, C., Souza, S.M., Smânia, E.F.A., Smânia Jr., A. (2007) Screening methods to

determine antibacterial activity of Natural Products. Braz. J. Microbiol. 38: 369-

380.

Yunes, R.A., Cechinel Filho, V. (2009) Química de Produtos Naturais, Novos Fármacos

e a Moderna Farmacognosia. 2 Ed. UNIVALI, Itajaí, Brasil. 319 pp.

Van der Sluis, WT; Van Arkel J, Fischer FC, Labadie R, (1981) Thin Layer

chromatography assay of photoactive compounds (furanocoumarins) using the

fungus Penicillium-expansum as test organism. J. of Chrom., 214, 349.

Velioglu, Y.S., Mazza, G., Gao, L., Oomah, B.D. (1998) Antioxidant Activity and Total

Phenolics in Selected Fruits, Vegetables, and Grain Products. J. Agric. Food Chem.

46: 4113-4117.

Vila, R., Iglesias, J., Cañigueral, S., Ciccio, J.F. (2004) J. Ess. Oil Res. 16: 177-179

Windholz, M. (1983) The Index Merck. Merck & Co. 10 ed. New Jersey, USA.

Wollenweber, E., Dietz, V.H. (1981) Occurrence and distribution of free flavonoid

aglycones in plants. Phytochemistry 20: 869-932.

Yang, J.W., Orihara, Y. (2002) biosynthesis of abietane diterpenoids in cultured cells of

Torreya nucifera var. radicans: bioisynthetic inequality of the FPP part and the

terminal IPP. Tetrahedron 58: 1265-1270.

Page 76: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

63

IV.4 ANEXOS

Page 77: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

64

IV.4.1 ANEXO 1 CROMATOGRAMAS

Figura 5. Cromatograma del aceite esencial de Lantana camara, muestra 1. Colectada en Zunil,

Quetzaltenango el 6 de julio de 2008; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de ionización de

llama.

Fuente: FODECYT 011-2007.

Figura 6. Cromatograma del aceite esencial de Lantana camara, muestra 2. Colectada en Zunil,

Quetzaltenango el 11 de enero de 2009; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de ionización de

llama.

Fuente: FODECYT 011-2007.

-Cariofileno

Germacreno-D

-Selineno

-Elemeno

-Cariofileno Germacreno-D

-Elemeno

-Selineno

Page 78: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

65

Figura 7. Cromatograma del aceite esencial de Lantana camara, muestra 3. Colectada en Zunil,

Quetzaltenango el 26 de abril de 2009; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de ionización de

llama.

Fuente: FODECYT 011-2007.

Figura 8. Cromatograma del aceite esencial de Lantana hispida, muestra 1. Colectada en San Cristóbal

Acasaguastlán, El Progreso, el 30 de junio de 2008; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de

ionización de llama.

Fuente: FODECYT 011-2007.

-Cariofileno

Germacreno-D

-Selineno

Limoneno

Limoneno

1,8-cineol

-Cariofileno

Germacreno-D

Page 79: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

66

Figura 9. Cromatograma del aceite esencial de Lantana hispida, muestra 2. Colectada en San Cristóbal

Acasaguastlán, El Progreso, el 30 de junio de 2008; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de

ionización de llama.

Fuente: FODECYT 011-2007.

Figura 10. Cromatograma del aceite esencial de Lantana trifolia, muestra 1. Colectada en Los Amates,

Izabal, el 31 de agosto de 2008; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama.

Fuente: FODECYT 011-2007.

Limoneno

1,8-cineol

-Cariofileno

Germacreno-D

Metileugenol

-Muuroleno

-Copaeno

Timol

trans-Bergamoteno

Page 80: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

67

Figura 11. Cromatograma del aceite esencial de Lantana trifolia, muestra 2. Colectada en Los Amates,

Izabal, el 7 de diciembre de 2008; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama.

Fuente: FODECYT 011-2007.

-Copaeno

-Muuroleno

Metileugenol

Page 81: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

68

IV.4.2 ANEXO 2. APARIENCIAS DE LOS EXTRACTOS

Figura 12. Apariencia del extracto metanólico de Lantana camara, colectada en la ciudad

de Guatemala, Guatemala el 22/12/09 (extracto seco).

Fuente: FODECYT 011-2007.

Figura 13. Apariencia del extracto metanólico de Lantana hispida, colectada en El Chico,

Zacapa (extracto seco), el 10/05/09.

Fuente: FODECYT 011-2007.

Page 82: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

69

Figura 14. Apariencia del extracto metanólico de Lantana trifolia, colectada en Lachuá,

Alta Verapaz (extracto seco), el 29/11/09.

Fuente: FODECYT 011-2007.

Figura 15. Apariencia del extracto diclorometánico de Lantana camara, colectada en la

ciudad de Guatemala, Guatemala (extracto seco), el 22/12/09.

Fuente: FODECYT 011-2007.

Page 83: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

70

Figura 16. Apariencia del extracto diclorometánico de Lantana hispida, colectada en El

Chico, Zacapa (extracto seco), el 10/05/09.

Fuente: FODECYT 011-2007.

Figura 17. Apariencia del extracto diclorometánico de Lantana trifolia, colectada en

Lachuá, Alta Verapaz (extracto seco), el 29/11/09.

Fuente: FODECYT 011-2007.

Page 84: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

71

IV.4.3 ANEXO 3. Determinación de actividad antioxidante de los extractos de las

plantas de estudio.

Figura 18. Fotografía de la determinación de la actividad antioxidante del extracto

etanólico del residuo de la extracción con diclorometano de Lantana hispida.

Fuente: FODECYT 011-2007.

Figura 19. Fotografía de la determinación de la actividad antioxidante del extracto

diclorometánico de Lantana hispida.

Fuente: FODECYT 011-2007.

Page 85: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

72

Figura 20. Fotografía de la determinación de la actividad antioxidante de la solución

etanólica de BHT.

Page 86: Estudio de aceites esenciales y metabolitos secundarios

73

PARTE V

V.1 INFORME FINANCIERO