Estructura y Topología de Los Ácidos Nucleicos
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7/26/2019 Estructura y Topologa de Los cidos Nucleicos
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2 - Estructura y topologa de los cidos nucleicos 25 de marzo de 2015
Gentica Molecular Universidad de Morn
ESTRUCTURA Y TOPOLOGIA DE
LOS ACIDOS NUCLEICOS
Gentica Molecular
Ctedra 2016
Universidad de Morn
1
Estructura de los
cidos nucleicos:
elementos que los
componen.
Topologa de los cidos
nucleicos: forma
tridimensional que adquieren
estas molculas en el
espacio
2
Composicin qumica de los cidos nucleicos
El
descubrimiento de
los
cidos
nucleicosse debe a Meischer (
1869
), quientrabajando con
leucoci tos y espermatozoides de
salmn obtuvo unasustancia rica en
carbono, hidrgeno,oxgeno,
nitrgeno
y
un
porcentaje
elevadode
fsforo
.
A
esta
sustancia
se
la
llam
enun
principio
nuclena,
por
encontrarse
en
elncleo
.
Aos ms tarde, se fragment esta
nuclena, y se separ un componente
proteico y un grupo prosttico
. A steltimo,
por
ser
cido,
se lo llam cidonucleico
.
3
Cuando
se
realiza
la
hidrlisis
completa
de
los
cidos
nucleicos,
se
obtienen
tres
tiposde
componentes
principales
:
Azcar
:
una
pentosa
.
Bases
nitrogenadas
:
pricas
y
pirimidnicas
.
cido
fosfrico
.
El
azcar,
en
el
caso
de
los
cidos
desoxirribonucleicos
(ADN)
es
la
2
-
desoxi
-
D
-
ribosay
en
el
caso
de
los
cidos
ribonucleicos
(ARN)
es
la
D
-
ribosa
.
Video recomendado:
http://www.youtube.com/watch?v=
-
Q_Lvzdkexo
4
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Las bases nitrogenadas que forman parte de los cidos nucleicos son de dos tipos:
pricas y pirimidnicas.
5
BASES PIRIMIDNICAS
6
Bases nitrogenadas que normalmente
forman parte del ADN:
A
G
C
T
Bases nitrogenadas que normalmente
forman parte del ARN:
A
G
C
U
Por lo tanto:
la timina es especfica del ADN y el uracilo es especfico del ARN
BASES PURNICAS O PRICAS
Adems
de
las
anteriormente
descritas,
se
han
encontrado
otras
bases
nitrogenadas
enalgunos
virus
o
formando
parte
de
algunos
tipos
especiales
de
ARN
:
Bases pricas poco corrientes
: Hipoxantina, Xantina, 2
-
metiladenina, 6
-
metil
-aminopurina
.
Bases
pirimidnicas
poco
corrientes
:
5
-
metilcitosina
(propia
del
ADN
de
vertebrados)y
5
-
hidroximetil
citosina
(HMC)
que
sustituye
a
la
citosina
en
los
fagos
T
-
pares
(propiade
ADN
bacteriano)
.
En
ARNt
:
Ribotimidina,
Dihidrouridina,
Seudouridina
e
Inosina
(I)
.
7
Nucletidos
y
nuclesidos
que
contienen
D
-
ribosa
:
ribonucletidos
y
ribonuclesidos
.Nucletidos
y
nuclesidos
que
contienen
2
-
desoxi
-
D
-
ribosa
:
desoxirribonucletidos
ydesoxirribonuclesidos
.
La
terminologa
empleada
para
referirse
a
los
nuclesidos
y
nucletidos
es
la
siguiente
:
Los
nucletidos
pueden
tener
1
,
2
3
grupos
fosfato
unidos
al
carbono 5
de
lapentosa,
existiendo
por
tanto,
nucletidos
5
monofosfato,
nucletidos
5
difosfato ynucletidos
5
trifosfato
.
8
-
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Los nucletidos se unen entre s para formar largas cadenas de polinucletidos:
esta unin entre monmeros nucletidos se realiza mediante enlaces fosfodister entre
los carbonos de las posiciones 3 de un nucletido con la 5 del siguiente.
9
Proporciones de las bases nitrogenadas
REGLAS DE CHARGAFF PARA ADN DE DOBLE HELICE
La proporcin de Adenina (A) es igual a la de
Timina (T). (A = T y A/T = 1)
La proporcin de Guanina (G) es igual a la de
Citosina (C). (G= C y G/C=1)
La proporcin de bases pricas (A+G) es igual a la
de las bases pirimidnicas (T+C). (A+G) = (T+C) y
(A+G)/(T+C)=1.
Sin embargo, la proporcin entre (A+T) y (G+C) era caracterstica de ca da organismo...
Esto indicaba que los cidos nucleicos no eran la repeticin montona de un tetranucletido:
exista variabilidad en la composicin de bases nitrogenadas
Edwin Chargaff
10
Procedencia del ADN A G C T 5-Me-C
Timo de Bovino 28,2 21,5 21,2 27,8 1,3
Esperma de bovino 28,7 22,2 20,7 27,3 1,3
Germen de trigo 27,3 22,7 16,8 27,1 6,0
Saccharomyces 31,3 18,7 17,1 32,9 -Escherichia coli 26,0 24,9 25,2 23,9 -
Mycobacterium tuberculosis 15,1 34,9 35,4 14,6 -
X174 24,3 24,5 18,2 32,3 -
T3 23,7 26,2 27,7 23,5 -T5 30,3 19,5 19,5 30,8 -
T7 32,4 18,3 32,4 17,0 HMC
Virus ARN A G C U
Mosaico del tabaco (TMV) 29,8 25,4 18,5 26,3
Mosaico amarillo nabo 22,6 17,2 38,0 22,2
Poliomielitis 28,6 24,0 22,0 25,4
E nc falo miocarditis del ratn 2 7,3 2 3,5 23 ,2 2 5,9
Reovirus Tipo 3 28,0 22,3 22,0 27,9
Tumor de las heridas 31,1 18,6 19,1 31,3
11
Todos
los
ADN
estudiados
cumplen
la
relacin
A=T
y
G=C,
excepto
el
ADN
delbacterifago
X
174
(el
ADN
de
este
virus
es
de
una
sola
hlice)
.
En
los
virus
ARN
no
se
cumple
la
equimolaridad
de
las
bases
excepto
en
el
casodel
virus
del
Tumor
de
las
heridas
y
de
los
Reovirus
que
tienen
ARN
de
doble
hlice
.En
estos
virus
se
cumple
que
A=U
y
G=C,
adems
se
cumple
que
A+G/U+C=
1
.
El
fago T
2 y los otros
fagos
T
-
pares
(T
4
y
T
6
) en
vez
de citosina
tienenhidroximetil
-
citosina
(HMC)
.
Algunos
organismos
tienen
en
su
ADN
una
pequea
proporcin
de 5
-
metil
-citosina
(
5
-
Me
-
C)
que
sustituye
a
la
citosina
.
12
-
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Organismo Tejido A+T/G+C
Escherichia coli - 1,00
Diplococcus pneumoniae - 1,59
Mycobacterium tuberculosis - 0,42
Levadura - 1,79
Paracentrolus lividus (erizo mar) E sperma 1,85
Arenque Esperma 1,23
Rata Mdula sea 1,33
Hombre Timo 1,52
Hombre Hgado 1,53
Hombre Esperma 1,52
Pero la proporcin A+T/G+C vara de un organismo a otro!
Por lo tanto, la proporcin A+T/G+C es especfica de cada organismo y est
relacionada con la densidad y la temperatura de fusin.
13
PROPIEDADES FISICO
-
QUIMICAS
DE LOS ACIDOS NUCLEICOS
14
DENSIDAD DE LOS CIDOS NUCLEICOS
Existe
una
relacin
lineal
entre
el
contenido
en
G+C
y
la
densidad
del
ADNdeterminada
en
un
gradiente
de
densidad
:
a mayor contenido en G+C >>> mayor densidad posee el ADN
15
Meselson y col. (1957) desarrollaron una tcnica de centrifugacin en
gradiente de densidad.
Centrifugacin en gradiente de CsCl
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DESNATURALIZACION
: TEMPERATURA DE FUSION
DEL ADN
La proporcin A+T/C+G
est relacionada en primer
lugar con laestabilidad
de
la
molcula
de
ADN
de
doble
hlice
.Cuanto
mayor
es
el
contenido
en
G+C
de
una
molcula,
mayor
cantidadde pares G
-
C presentar, como consecuencia tendr una mayor
cantidad
de triples enlaces y por consiguiente, ser necesario
suministrar
una
mayor
cantidad
de
energa
a
esa
doble
hlice
paraseparar
sus
dos
hebras
.
17
La
temperatura
de
fusin
(Tm)
necesaria
para
desnaturalizar
lamitad
de l
ADN
de
un a
mezcla
(punto
medio
de
la
reaccin
ADN
dob le hlice ADN hlice sencilla) est
directamenterelacionada
co n
el
contenido
en
G+C
:
a mayor contenido en G+C >>>mayor temperatura de
fusin (Tm)
DESNATURALIZACION: TEMPERATURA DE FUSION
DEL ADN
Relacin entre el contenido en (G+C) y Tm
18
ABSORBANCIA A 260 nanmetros (nm)
Absorbancia
a
2
.
600
:
el
estado
fsico
de
los
cidos
nucleicos
estrelacionado
con
su
capacidad
de
absorcin
de
la
luz
ultravioleta
(UV)
a2
.
600
.
El
menor
grado
de
absorcin
se
produce
en
estado
de
doblehlice
;
la
absorcin
aumenta
cuando
se
produce
la
desnaturalizacinpasando
a
estado
de
hlice
sencilla
(efecto
hipercrmico,
aumento
de
laabsorbancia)
y,
por
ltimo,
si
degradamos
este
ADN
de
hlice
sencilla
anivel
de
nucletidos
libres,
de
nuevo
aumenta
la
absorbancia
.
Esquema efecto hipercrmico
19
ABSORBANCIA A 260 nm
Por
tanto,
la
absorbancia
a
2
.
600
se
puede
utilizar
como
una
medidadel
estado
fsico
de
la
molcula
de
ADN
.
Las
curvas
de
fusin
tienenforma
de
S
observndose
un
aumento
brusco
de
la
absorbancia
al
llegar
auna
temperatura
determinada,
la
temperatura
de
fusin
.
Curvas de desnaturalizacin de diferentes ADNs
20
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CINTICA DE RENATURALIZACION: CURVAS Cot
(de C
ot
= producto de la concentracin inicial por el tiempo)
La velocidad de renaturalizacin del ADN de un organismo est
relacionada
con
su
complejidad,
que
se
define
como
la
suma
del
nmero
denucletidos
que
tiene
cada
tipo
de
secuencia
sin
tener
en
cuenta
el
nmerode
veces
que
est
repetida
.
#
El
ADN
de
los
virus
y
las
bacterias
en
su
mayora
slo
tiene
secuenciasque
estn
una
sola
vez
en
el
genoma
(secuencias
nicas)
.
#
Organismos
ms
complejos
-
como
los
eucariontes
-
presentan
distintostipos
de
secuencias
:
secuencias
nicas
(SU),
secuencias
de
bajo
nmero
decopias
(SBNC,
2
-
10
copias),
secuencias
repetidas
(SR,
alrededor
de
102copias)
y
altamente
repetidas
(SAR,
103
a
106
copias)
.
21
Tipo de
Secuencia
N de
repeticiones
N de
nucletidos
A (SU) 1 5.700
B (SU) 1 7.530
C (SBNC) 4 3.720
D (SBNC) 6 4.350
E (SR) 200 500
F (SAR) 10.000 300
G (SAR) 1.000.000 200
Complejidad 22.300
Si imaginamos
un organismo eucarionte
con
los
tipos
de
secuenciasindicados
en la tabla,
su
complejidad
sera
la
suma
del
nmero denucletidos
de
cada
tipo
de
secuencia
(
22
.
300
)
sin
tener
en
cuenta
elnmero
de
veces
que
est
repetida
cada
una
de
ellas
.
22
Las
curvas
de
renaturalizacin
(o
curvas
Cot)
de
organismos
que
carecende
secuencias
repetidas
como
virus
y
bacterias
tienen
forma
de
S
y
tienenun
slo
punto
de
inflexin
o
punto
medio
de
la
reaccin
.Todas las secuencias son nicas y tienen la
misma probabilidad
deencontrar a su complementaria para formar la
doblehlice
.
Curvas Cot de un eucarionteCurvas Cot de virus y bacterias
23
Las
curvas
Cot
de
organismos
eucariontes
con
diferentes
tipos
desecuencias,
poseen
varios puntos
de
inflexin
. Cada uno de elloscorrespondiente a un tipo
de
secuencias (nicas,
moderadamenterepetidas,
y
altamente
repetidas)
.
Como
en
el
caso
de
las
curvas
de
fusin,
tambin
se
utiliza
como
medida
el
punto
medio
de
la
reaccin
de
renaturalizacin,
es
decir,
elCot
o
tiempo
al
que
se
ha
reasociado
la
mitad
del
ADN
.
El
Cot
es
directamente
proporcional
a
la
complejidad
del
ADN
delorganismo
. Valores de Cot
bajos (
10
-
4 a
10
-
1
) corresponden
asecuencias
altamente
repetidas,
valores
de
Cot
comprendidos
entre10
y
102
corresponden
a
secuencias
moderadamente
repetidas
y
lassecuencias
nicas
o
de
bajo
nmero
de
copias
dan
lugar
a
valores
deCot
altos
(mayores
de
103
)
.
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HIBRIDACIN DE LOS CIDOS NUCLEICOS
Lastcnicasde desnaturalizacinyposteriorrenaturalizacinse utilizan
para conseguir la hibridacin de cidos nucleicos, es decir, una vezseparadaslasdoshebrasdelADNdoblehlice,esposiblevolveraformaruna doble hlice con una hebra de ADN que sea complementaria(hibridacindeADNconADN)ovolveraformarunadoblehliceconunsegmentodeARNquecontengalasecuenciacomplementaria(hibridacindeADNconARN).
Deestamanerase puedeidentificar porejemplo-el gen queha dadolugar a un determinado ARN mensajero. Si se asla un mensajerodeterminadoenunaclula,esposiblehibridaresteARNconelADNdelaclulapreviamente fragmentado mediante el uso de endonucleasas derestriccin.
25
EL MODELO DE LA DOBLEHELICE -1953(WATSON Y CRICK?)
26
Francis H. C. Crick James D. Watson Maurice H. F. Wilkins
Premio Nobel 1962
Pararealizarsutrabajoemplearondostiposdedatosyaexistentes:
*Porunlado,utilizaronlosdatosobtenidosvariosaosantesporChargaff(1950),relativosalacomposicindebasesnitrogenadasenelADNdediferentesorganismos.*ElotrotipodedatoseranlosprocedentesdeestudiosdedifraccinderayosXsobrefibrasdeADN.Paradeterminarla estructura tridimensionalo disposicinespacialde las molculasdeADN, sehaceincidirunhazderayosXsobrefibrasdeADNyserecogeladifraccindelosrayossobreuna pelculafotogrfica.Lapelculase impresionaen aquellospuntosdondeincidenlosrayosX,produciendoal revelarsemanchas.Elngulodedifraccinpresentadoporcadaunadelasmanchasenla pelculasuministrainformacinsobrelaposicinenla molculade ADNdecadatomoogrupodetomos.
27
MedianteestatcnicadedifraccinderayosXseobtuvieronlossiguientesresultados:Lasbasespricasypirimidnicasseencuentranunassobreotrasapiladasalolargodelejedelpolinucletido a una distancia de 3,4 , y son estructuras planas orientadas de formaperpendicularaleje(Astbury, 1947).Eldimetrodelpolinucletidoesde20yestenrolladohelicoidalmentealrededordesueje.Cada34seproduceunavueltacompletadelahlice(10bases).Existe ms de una cadena polinucleotdica enrollada helicoidalmente (Wilkins et al.1953,FranklinyGosling, 1953).
Foto 51: ADN-B (ver explicacin enhttp://www.pbs.org/wgbh/nova/body/DNA-
photograph.html) RosalindFranklin
28
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BasndoseenestosdostiposdedatosWatsonyCrickpropusieronsumodelodeestructuraparaelADNconocidoconelnombrede ModelodelaDoble Hlice:
ElADNes una doblehliceenrolladahelicoidalmente a derechas(sentidodextrorso).Algoparecidoadosmuellesentrelazados.
Enrollamientode tipoplectonmico:parasepararlasdos hlicesesnecesariogirarlascomosifueraunsacacorchos.
Modelo de la Doble hlice: ADN-B
29
Las dos hlices son antiparalelas yse mantienen unidas mediante puentes o enlaces dehidrgenoproducidosentrelasbasesnitrogenadasdecadahlice.Siguiendo los datosdeChargaff(1959),laadeninadeunahliceapareaconla timinadelahlicecomplementariamediantedospuentesdehidrgeno.Igualmente,laguaninadeunahliceapareaconlacitosinadelacomplementariamediantetrespuentesdehidrgeno.
Pares A-T y G-C
Par G-C
Par A-T
30
ADN-B:ADN en disolucin(92%de humedadrelativa).Se encuentraen solucionescon bajafuerzainicaysecorrespondeconel modelodeladoblehlice. TieneunmayorintersbiolgicoyaqueeslaquepresentaelADNeninteraccinconlasprotenasnucleares.
ALTERNATIVAS AL MODELO DE LA DOBLE HLICE
ADN-A:ADNcon75%dehumedad,requiereNa,KoCscomocontraiones,presenta11paresdebasesporgirocompletoy23dedimetro.Esinteresanteporpresentarunaestructuraparecidaala de los hbridosADN-ARNya las regionesde autoapareamientoARN-ARN,aunqueno seencuentrainvivosinoencondicionesnofisiolgicas(ADNdeshidratado).
ADN-C:ADNcon66%dehumedad,seobtieneenpresenciadeionesLi,muestra9+1/3paresdebasesporgirocompletoy19dedimetro.
31 32
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ADN-Z
Doblehlicesinistrosaolevgira(enrollamientoaizquierda)12paresdebasesporgirocompleto18dedimetroSloseobservaunsurco, semejantealsurcomenor.
La conformacin Z est favorecida (estabilizada) porun elevado contenido en G-C, por lametilacin de citosinas y por molculas que pueden encontrase presentes in vivo como laesperminayespermidina.LassecuenciasdeADNpuedenpasardelaformaBhacialaformaZyviceversa:elADN-Zesunaformatransitoriainvivo.LaformacindeADN-Zseproducedurantelatranscripcindegenes:elmovimientodelaARNpolimerasainduceunasuperhelicoidizacinnegativaenla parteanteriorocorrientearriba;unafuncinposibledelADN-Zpodraserabsorberestasuperhelicoidizacinnegativa.Alfinalde latranscripcin, latopoisomerasarelajalaestructuradelADNvolviendoalaconformacinB.Ciertas protenasse unenalADN-Zproduciendouna modificacinepigenticaporla cuallaprotenaposteriormentesintetizadaporestefragmentodeADNserdistinta.SehanencontradoanticuerposfrentealADN-Zenellupuseritematosoyenotrasenfermedadesautoinmunes.
33
ADN triple hlice o ADN-H
Invitroesposibleobtenertramosdetriplehlice intercalandooligonucletidoscortosconstituidossolamente por pirimidinas (timinas y citosinas) en el surco mayor de una doble hlice. Esteoligonucletidose uneaparesde basesA-TyG-Cmedianteenlacesde hidrgenotipoHoogsteenqueseestablecenentrelaTolaCdeloligonucletidoylosparesA-TyG-Cdeladoblehlice.Nosesabela funcinbiolgicadelADN-Haunquese ha detectadoen cromosomaseucariticos;puede
tenerunpapelfuncionalenlaregulacindelaexpresingnicaysobrelosARNs(porejemplo,enlarepresindelatranscripcin).
34
Cuartetos de Guanina
ADN cuadruplexo
In vitro se han obtenido cuartetos de guanina unidos mediante enlaces tipo Hoogsteen,empleandopolinucletidosquesolamentecontienenguanina.Losextremosde loscromosomaseucariticos(telmeros)tienenunaestructuraespecialconunextremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en elque se repite muchas veces entndemunasecuenciaricaenguaninas,queserviraparaprotegerlosextremoscromosmicosdeladegradacinenzimtica.Ejemplodesecuenciatelomricaricaenguaninas:
5PTTGGGTTGGGGTTGGGG...............TTGGGG3 'OH
35
Palndromos
Plegamientooapareamientodeunahliceconsigomisma.Elpalndromotambinesunafiguragramaticalqueseleeigualenlosdossentidos, porejemplo:
DABALE ARROZ A LA ZORRA EL ABADExiste ADNpalindrmicode hlicesencillayde hlicedoble.Enelpalndromodedoblecadenalasecuenciadebasesseleeigualendireccin5P3OHenambascadenas.
Palndromos en ADN de una y doble hliceSecuencias palindrmicas
36
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Ademsde las alternativasanteriormentecitadases necesarioteneren cuentaque no todoslosorganismos vivostienencomomaterialhereditarioADNdedoblehlice:
Algunos virus (como los fagos X174yM13) tienen ADNde hlice sencilla circular.Se hacomprobadoqueunapequeaparteresistelaaccindeenzimasquedigierenespecficamenteADNde hlice sencilla; por lo tanto, estas regiones presentan complementariedad interna oautoapareamiento, formandoADNdplexodoblehliceyteniendosecuenciaspalindrmicas.ARNde hlice sencilla:elgen de la protena de la cubierta delbacterifagoMS 2 presentasegmentosquetienen complementariedadinterna (autoapareamiento)ysepliegansobresmismosformandohorquillas(regionesdeARNdedoblehlice).
ARN Fago MS2: genque codifica para la
protena de la cpside
37
Esquema ARN-ribosmico deTetrahymena
Esquema ARN-transferente
El ARN transferente (ARN-t) que transporta los aminocidos y el ARN ribosmico (ARN-r) que interviene en el proceso de traduccin, son cidos ribonucleicos de una sola hlice
y tambin presentan autoapareamiento.
38
