Estructura de aminocidos y precipitacin de casena. Erika Patricia Caicedo Yela1, Tatiana Patricia Valencia Murcia2

1Departamento de Ciencias, Facultad de Ingeniera y Administracin. Programa de Ingeniera Ambiental, 2Departamento de Ciencias, Facultad de Ingeniera y Administracin. Programa de Ingeniera Ambiental. Laboratorio de Bioqumica, Departamento de Ciencias Bsicas, Facultad de Ingeniera y Administracin, Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira.

Marzo 14 de 2015

Resumen

Las soluciones que contengan protenas, en el caso de la prctica elaborada la leche y su protena la casena, se someten a procedimientos en los que mediante ciertos reactivos podemos evidenciar los conceptos de pH Isoelctrico, desnaturalizacin, presencia de calcio, presencia de carbohidratos, presencia de protenas o presencia de rivoflavina, entre muchas otras que manifiestan las propiedades con las que cuenta la solucin y la protena en cuestin.

Introduccin

Bien es sabido que las protenas son polmeros de aminocidos entrelazados por enlaces peptdicos entre el grupo carboxilo de un aminocido y el grupo amino de otro. Dichos enlaces son covalentes, por lo que poseen la caracterstica de ser muy fuertes.Las sustancias en las cuales estn inmersas las protenas son muchas veces complejas; sin embargo, a pesar de esto es posible separarlas mediante desnaturalizacin de la protena. Para desnaturalizar una protena simplemente vasta con adicionar cualquier factor que modifique la interaccin entre sta y el solvente, haciendo que disminuya la estabilidad de la solucin y por tanto induciendo la precipitacin de la protena ya desnaturalizada.Una forma de desnaturalizar una protena para precipitarla es alcanzar el denominado pH Isoelctrico de la misma, el cual se logra cuando se llega a una carga neta de cero que se evidencia mediante la precipitacin de la protena que posteriormente se separa de los lquidos sobrantes que contienen las dems sustancias.Las protenas de la leche, por ejemplo, pueden separase mediante este mtodo; as pues, una de ellas, la Casena cuenta con un pH Isoelctrico de 4,7, as que al cambiar el pH de la solucin hasta 4,7, para lo cual se adiciona una sustancia cida, se consigue que la casena se precipite.

Materiales y mtodos

Parte 1: Extraccin de la Casena:

MaterialesMtodos

ReactivosMateriales

50mL de LecheVaso de precipitados

cido Actico 2MAgitador

Medidor de pH

En el vaso de precipitados agregar la leche, calentar a aproximadamente 40C y dejar reposar. Adicionar gota a gota cido actico hasta que el pH sea 4,7, filtrar el precipitado y secar.

Parte 2: Verificacin de la presencia de protenas:

MaterialesMtodos

ReactivosMateriales

3mL Suero de leche2 tubos de ensayo

Casena

2mL Agua

Reactivo de Biuret

Disponer el suero de leche en un tubo de ensayo y la casena en el otro, a esta ltima agregarle el agua.Calentar al bao de mara. Adicionar el reactivo y observar la coloracin.

Parte 3: Determinacin de la presencia del carbohidrato lactosa:

MaterialesMtodos

ReactivosMateriales

Reactivo de Fehling A1 Tubo de ensayo

Reactivo de Fehling B

1mL de Suero de leche

Colocar 0.5mL de reactivo Fehling A y 0.5mL de reactivo Fehling B y calentar al bao de mara por 2 minutos. Agregar el suero de leche.Calentar nuevamente y observar la formacin de un precipitado rojizo.

Parte 4: Determinacin de la presencia de Calcio:

MaterialesMtodos

ReactivosMateriales

1mL Suero de leche1 Tubo de ensayo

Oxalato de disolucin de amonio al 4%

Disponer el suero de leche en el tubo de ensayo y aadir 3 gotas de oxalato de disolucin de amonio al 4%.Observar la formacin de un precipitado blanco

Parte 5: Determinacin de la presencia de riboflavina en la leche:

MaterialesMtodos

ReactivosMateriales

2mL de Suero de leche1 Tubo de ensayo

Luz Ultravioleta

Colocar 2 mL de suero de leche en un tubo de ensayo, luego, con cuidado acercar el tubo a una fuente de luz ultravioleta y observar.

Resultados y Anlisis.

Parte 1: Extraccin de Casena

Tabla 1: cambio de pH de la leche a 40 C al aadir cido actico.

Gotas de cido Actico 2MpH

106

205.8

305.3

404.7

Peso del papel sobre el que se deposita la casena = 1,4grPeso total del papel y la casena = 7,6gr

Peso Casena = 6,2gr

Despus de que se llega al pH 4.7 en el cual la protena casena se desnaturaliza y se precipita, se procedi a la filtracin del producto por medio de separacin del suero de leche y posteriormente se realiz secado de la casena. El paso en el cual se lavaba el precipitado con 20mL de Etanol y ter etlico en mezcla 1:1 fue omitido del procedimiento. Se puede observar que aunque quien realiza el experimento trate de recoger totalmente la Casena y separarla correcta y totalmente del suero de leche, pequeos restos de esta an permanecen en el suero de leche.

Adems del anterior hecho se observ que pequeas cantidades de la protena se perdan o separaban de la masa compacta de casena, muchas se lograban recuperar, pero otras quedaban unidas a las toallas y pasaban desapercibidas para quien realizaba el experimento.

Los hechos anteriores provocan que cambie el peso de la casena y por lo cual no se sepa con exactitud la masa total de casena presente en el volumen de leche usado para el experimento; el resultado de masa que se logra obtener es aproximado a la cantidad de protena que se logra recolectar.

Tambin es importante destacar que el proceso de secado de la protena mediante toallas no permite expulsar en su totalidad el suero de leche, aunque se seque lo ms posible esta antes de su pesaje, aun despus de finalizado el experimento an segua la protena eliminando suero.

Tambin hay que tener en cuenta otra anomala o error que podra presentarse al momento de obtener la masa correspondiente a la presencia de Casena en el volumen dado de leche, y es el margen de error que presenta la balanza utilizada para medicin, a fallas de calibracin del instrumento y en general a fallidas mediciones del realizador del experimento.

En resumen, cuando se alcanza el punto isoelctrico de la casena se neutralizan sus cargas, lo cual impide que esta protenainteractuecon las dems molculas presentes en la solucin. Al no interactuar con alguna otra molcula, la protena termina precipitndose, lo que hace fcil su aislamiento del resto de la solucin. Pero en este punto es importante considerar que la casena es la nica protena de la leche que alcanza su punto isoelctrico a un pH de 4.8, lo que garantiza que es la nica protena que se est aislando.

Parte 2: Verificacin de la presencia de protenas.

Tabla 2: Cambios fsicos y observaciones durante el experimento.

Tubo de ensayo con suero de leche y R. de Biuret.Tubo de ensayo con casena + 2mL de agua y R. de Biuret.

Se observa la formacin del precipitado

La mezcla se torna de un leve tono violeta/morado muy tenue.

Se observa la formacin de precipitado pero en este tubo fue en menor cantidad.

La mezcla se torna de un leve tono violeta/morado an ms tenue que el del otro tubo.

Para esta prueba se usa reactivo de Biuret, el cual contiene CuSO4 en solucin acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reaccin se basa en la formacin de un compuesto de color violeta, debido a la formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos. As pues la prueba da positiva puesto que ambas cuentan con presencia de protenas.

REACCION CON BIURET

Parte 3: Determinacin de la presencia del carbohidrato lactosa.

El resultado de la prueba fue fsicamente la formacin de un precipitado rojizo y visiblemente la mezcla se torn amarillo anaranjado tendiendo a rojo, siendo una prueba positiva para el carbohidrato en cuestin.

Para explicar esto se debe tener en cuenta que los reactivos de Fehling son usados para identificar la presencia de azucares reductores mediante un mecanismo en el que el catin cprico Cu++ reacciona con el azcar pasando a xido cuproso que se refleja mediante un precipitado rojizo. De esta manera, nuestra prueba da positivo debido a que la lactosa, protena que se quiere identificar, es un disacrido formado por glucosa y galactosa. La galactosa no tiene carcter reductor pero la glucosa si, por lo cual la lactosa tiene caracterstica de azcar reductor.

Parte 4: Determinacin de la presencia de calcio.

El tubo de ensayo dispuesto en su interior con 1mL de suero de leche al cual se agregaron 3 gotas de Oxalato de amonio al 4% se torn blancuzco al instante, su coloracin blanca da como resultado una prueba positiva, lo cual significa la presencia de calcio en la mezcla en cuestin.

El Oxalato de Amonio ((NH4)22C2O4) en contacto con un compuesto que contenga calcio reacciona dando lugar a Oxalato de Calcio (CaC2O4), de ah que se obtenga un precipitado blanco ms otros productos de la reaccin, que determina una prueba positiva para Calcio.

OXALATO DE AMONIOOXALATO DE CALCIO

Parte 5: Determinacin de riboflavina en la leche.

Estructura de la riboflavinaFuente: Es.wikipedia.org

En la presente prueba se dispuso en un tubo de ensayo 2mL aproximadamente de suero de leche, posterior a esto se apagaron las luces del laboratorio y se acerc a la muestra una lmpara fluorescente de luz negra que emite luz ultravioleta (la longitud de onda lo determina el equipo que haya sido usado), al acercar dicho artefacto al tubo el contenido del mismo se torn de un color reflexivo verdoso fluorescente con el cual se concluye fue una prueba positiva a la presencia de riboflavina en el suero de leche extrado.

La fluorescencia se puede explicar desde varios ngulos.

Inicialmente hay que mencionar ciertas caractersticas de la riboflavina, esta es una vitamina hidrosoluble conformada bsicamente por un grupo de 3 anillos, dos de los cuales son heterocclicos, y estos a su vez estn unidos a una cadena lineal ribosa, la fluorescencia se asocia en este caso y en general en las flavinas (grupo de bases nitrogenadas que poseen pigmentos amarillos fluorescentes cuando se encuentran oxidadas) se debe a la gran cantidad de dobles enlaces presentes en la riboflavina y adems a las diferentes estructuras que se producen debido al movimiento de los electrones dentro de las estructuras cclicas, los cuales actan en resonancia con los dobles enlaces externos con el oxgeno.

Cuestionario

1. Cmo pueden clasificarse los aminocidos? Examine las caractersticas comunes de cada grupo, compare los diferentes radicales de cada aminocido y familiarcese con su estructura.

Segn Bohinski (1991) la clasificacin a la que podemos llegar segn las caractersticas del grupo R de los aminocidos esta inicialmente constituida por aquellos que son neutros (no presenta carga, es decir, no puede ionizarse), los que son cidos (se puede cargar negativamente-cido de Brnsted) y los que son bsicos (se pueden cargar positivamente-base de Brnsted)

Tabla 3. Carcter de ionizacin de los grupos R de los aminocidos.

Otra clasificacin que nos aporta este autor es la que toma en cuenta la polaridad de los grupos R, que determina, entre otras caractersticas, la afinidad con el agua, para la que se tiene la siguiente tabla:

Tabla 4. Carcter polar de los grupos R de los aminocidos.

Sin embargo, hay una clasificacin ms especfica para los aminocidos, basada en la composicin qumica de los grupos R, la cual arroja siete grupos, as:

Tabla 5. Clasificacin determinada por composicin qumica de los grupos -R

Alifticos

Glicina Alanina Valina Leucina Isoleucina (tambin podra incluirse la Prolina)

Hidroxilados

Serina Treonina (podra incluirse la Tirosina)

Sulfurados

Cistena Metionina

Aromticos

Fenilalanina Tirosina Triptfano (podra incluirse la Histidina)

cidos (y su amida correspondiente)

Acido asprtico Asparagina Acido Glutmico Glutamina

Bsicos

Arginina Histidina Lisina

Imnicos

Prolina

A continuacin se presentan las estructuras de los 20 aminocidos para familiarizarnos con sus grupos R y comprender el porqu de sus clasificaciones:

2. Qu se entiende por pH o punto isoelctrico de un aminocido o una protena? Por qu, en dicho punto, las especies precipitan? Qu es lo que permite que los aminocidos acten como reguladores de pH de los fluidos biolgicos?

Por pH Isoelctrico o punto Isoelctrico se entiende como el pH al cual la carga neta del aminocido o de la protena es cero, es decir donde la concentracin del Zwitterin es mxima por lo que la concentracin de especies protonadas y desprotonadas se iguala.En el punto isoelctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la protena presenta su mxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad, esto se justifica debido a que las molculas que estn cargadas igual se repelen entre s, y as forman una dispersin estable en el agua. La eliminacin de la carga elimina la fuerza repulsiva y permita interactuar a las molculas entre si y precipitar en la mayora de los casos.Los aminocidos tienen carcter anftero, es decir, pueden ceder protones y tambin captarlos, gracias a que cuentan con el grupo amino y el grupo carboxilo. A pH fisiolgico, el cido carboxlico existe como in carboxilato (COO-) con una carga negativa y el grupo amino existe como in NH3 +. Cuando el pH es cido, el grupo carboxilo ocupa el exceso de iones de hidrgeno para volver de nuevo a la forma de cido carboxlico. Si el pH se vuelve alcalino, se produce una liberacin de un protn desde el in NH3 +, que toma la forma de NH2. As vemos como esa capacidad de captar o ceder protones le confiere a los aminocidos la caracterstica de ser amortiguadores del pH.

3. Experimentalmente, Cmo diferenciara usted entre un aminocido aromtico y otro que no lo es? Indague al respecto y disee un breve protocolo de laboratorio para la respectiva experimentacin.

Reaccin Xantoproteica

La reaccin se basa en la nitracin del anillo bencnico con acido ntrico, produciendo derivados del nitrobenceno de color amarillo. Estos derivados amarillos se tornan anaranjados a la alcalinidad de la solucin con o NaOH. En las condiciones de la reaccin la fenilalanina es difcil de nitrar por cuanto se requiere la presencia de un catalizador.

Materiales: 4 tubos de ensayo Pipeta Triptfano 0.1% Metionina 0.1% Albumina de huevo al 1% Solucin problema

Procedimiento

1. Tomar cuatro tubos de ensayo

2. Colocar 1mL de cada aminocido en tubos de ensayo diferentes

3. Agregar a cada tubo de ensayo 0.5mL de concentrado en cada tubo

4. Calentar al bao de mara los tubos por 10 minutos usando la campana de extraccin

5. Retire los tubos de ensayo y djelos enfriar a temperatura ambiente

6. Observe la coloracin, la prueba es positiva para aromticos si se presenta una coloracin de color amarillo.

NOTA: si se desea comprobar la veracidad del experimento se puede continuar desde el punto 6 con esto.

7. Agregue lentamente 1mL de o de NaOH concentrado en la campana de extraccin.

8. Observe el cambio de coloracin de amarillo a anaranjado en la interfase.

Conclusiones

Los Aminocidos los compuestos orgnicos que debido a la presencia de dos grupos funcionales presentan caractersticas anfipaticas, esto les atribuye caractersticas qumicas muy diversas en las cuales influye, el pH de sus dos grupos funcionales, el tamao del R, la complejidad de la estructura. Adems, tiene gran importancia el medio en el que se encuentre el aminocido, ya que dependiendo de este el aminocido puede tender a generar estructuras inicas.

Conociendo el punto isoelctrico de una determinada molcula antiptica, es posible aislarla. Por lo que alcanzando elpunto isoelctrico de la casena, esta se precipita, lo que hace posible su aislamiento del resto de la leche.

Es posible el aislamiento de la casena de la leche utilizando la poca solubilidad que esta protena tiene cuando se lleva hasta su punto isoelctrico y la rapidez de sedimentacin de la misma.

La leche es una mezcla de protenas, lpidos y glcidos en un medio acuoso (coloide en el que la grasa es la partcula dispersa y el agua es el medio dispersante), dichas molculas pueden ser aisladas teniendo en cuenta su punto isoelctrico y sus caractersticas qumicas.

Referencias Bibliogrficas

1. Annimo. Quimitube. El Comportamiento Acido-Base de los Aminocidos. Recuperado de: http://www.quimitube.com/el-comportamiento-acido-base-de-los-aminoacidos. Consultado el 14 de febrero de 2015

2. Bohinski, R., Bioqumica, Quinta Edicin, editorial Pearson Educacin, Mxico, 1991, Pg. 63-75

3. Calvo, Miguel. Bioqumica de los alimentos. Riboflavina. Recuperado de: http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/vitamins/riboflavina.html Consultado: 14 de marzo de 2015

4. Hicks, Juan. Bioqumica, segunda edicin, editorial Mc Graw Hill, Mxico, 2007. Pg. 54-59

5. Vaclavik V., Fundamentos de ciencia de los alimentos, Editorial ACRIBIA, Espaa (Zaragoza), 1998, Pg. 141-142.