SIMPLE 2A-Bdiff / STICK 2A-Bdiff Test inmunocromatográfico en un solo paso para la deteccióndiferencial de la toxina A y la toxina B de C.difficile en heces.

ESTAS INSTRUCCIONES DEBEN DE SER LEÍDAS CONATENCIÓN ANTES DE PROCEDER A UTILIZAR EL TEST.

INTRODUCCIÓNEl inmunoensayo cromatográfico 2A-Bdiff de OPERON esun procedimiento para la detección cualitativa, en bandasindependientes, de la toxina A (TcdA) y de la toxina B(TcdB) de Clostridium difficile en heces humanas. Unaseñal positiva en cualquiera de las dos bandas de lastoxinas proporciona un buen indicio de que podamosestar ante una infección por Clostridium difficile (CDI) quedebería ser tenida en consideración por el clínico.A diferencia de otros inmunoensayos del mercado (ELISA ytest rápidos) que sólo permiten la detección conjunta deTcdA y TcdB, sin diferenciarlas en ningún caso, el test 2A-Bdiff de OPERON permite, haciendo uso de un soloensayo, diferenciar la presencia de ambas toxinasutilizando dos bandas separadas, una banda roja debajode la banda azul de control que detecta la presencia deTcdA y otra banda de color rojo encima de la banda azulde control que detecta la presencia de TcdB en la muestra(ver Fig. 1).El test está basado en la captura inmunológica demicropartículas coloreadas durante su paso a través deuna membrana sobre la que se han inmovilizado, enposiciones separadas, anticuerpos monoclonalesespecíficos frente a TcdA y TcdB.

Diagnóstico de infección por Clostridium difficile (CDI)C.difficile produce dos toxinas diferentes que constituyenlos factores de virulencia esenciales para desarrollar unaCDI. Investigaciones recientes1,2 han demostrado que cadauna de las dos toxinas por sí solas pueden inducir laenfermedad en hamster.Se considera que C.difficile es el responsable deaproximadamente un 25% de las diarreas relacionadascon el consumo de antibióticos entre los que seencuentran la clindamicina, segunda y tercera generaciónde cefalosporinas, inhibidores de girasa, ampicilina,amoxicilina,... Además de los síntomas diarreicos, laenfermedad puede derivar en colitis pseudomembranosa(PMC) que necesita urgentemente un tratamiento conantibióticos eficaces frente a C.difficile (metronidazol /vancomicina) ya que puede llegar a comprometer la vidadel individuo. La mortalidad asociada a CDI puede irdesde el 6% hasta el 30%, sobre todo si el paciente sufrePMC. La CDI inducida por tratamiento previo conantibióticos puede suponer una estancia en el hospital de6-10 días con los consiguientes gastos adicionales quepueden alcanzar los 6000-8000 euros3.

Descripción de C.difficile

Clostridium difficile es una bacteria anaerobia gram-positiva, con capacidad de formar esporas, presentede manera asintomática hasta en un 5% de lapoblación sana. A causa de las hospitalizaciones, latasa de portadores puede elevarse hasta un 30%.Los niños suelen estar colonizados por C.difficile pocodespués de nacer pero no tienden a desarrollarcuadros clínicos. Las investigaciones más recientesapuntan a que esto puede ser debido a la falta dereceptores para las toxinas en los enterocitos o bien aque el pH fecal del niño es diferente al del adulto eimpide la acción de las toxinas.Como se ha comentado previamente, C.difficile puedeproducir dos toxinas diferentes4:La toxina A (TcdA) (308 kDa) denominada enterotoxinadebido a que esta toxina puede inducir todos lossíntomas en modelos de hamster. TcdA también llega amostrar una elevada citotoxicidad pero sólo en célulasespecíficas que son especialmente sensibles a ellacomo las HT-295.La toxina B (TcdB) (279 kDa) clasificada comocitotoxina. En la mayoría de células cultivadas enlaboratorio (como Vero, CHO, HeLa, etc.) esaproximadamente 1000 veces más potente que latoxina A . La secuencia de aminoácidos de TcdB varíaentre las distintas cepas6.

Patrones de detección TcdA / TcdBRespecto a la producción de estas dos toxinas, lascepas de C.difficile se pueden clasificar en lossiguientes grupos:Cepas no-toxigénicas: no son patógenas y carecen dela producción de TcdA y TcdB así como de la toxinabinaria.Cepas TcdA+ TcdB+: son las cepas patógenas máscomunes que inducen CDI de entre las cuales losribotipos 001, 014, 027 y 078 son los más frecuentesen Europa7.Cepas TcdA- TcdB+: fueron identificadas por primeravez por Depitre et al. en Bélgica8. Se las considerapatógenas a pesar de no producir la toxina A9. Entreestas cepas se encuentra el ribotipo 017, responsablede varios brotes endémicos en Norte América.Cepas TcdA+ TcdB-: estas cepas pueden seridentificadas directamente a partir de la muestra fecalcon el test 2A-Bdiff pues permite la detección rápida,sencilla y separada de las toxinas A y B haciendo usode un solo test. Tan sólo se han encontrado unos pocosejemplares de estas cepas hasta la fecha.Investigaciones recientes muestran que cepas deC.difficile mutantes en el gen TcdB son capaces deseguir induciendo CDI en hamster debido a laproducción de toxina A2. Estos resultados apuntan a laexistencia de estas cepas en muestras clínicas.

1

ES

PRINCIPIOS BÁSICOS DEL TESTEl test 2A-Bdiff utiliza una combinación de:1) unas partículas de látex rojas conjugadas a unanticuerpo específico frente a la toxina A que coopera conotro anticuerpo especifico para toxina A situado en lamembrana, debajo de la banda de control2) otras partículas de látex rojas conjugadas a unanticuerpo específico frente a la toxina B que coopera conotro anticuerpo especifico para toxina B situado en lamembrana, encima de la banda de control3) partículas de látex azules conjugadas a un antígenoreconocido por un anticuerpo especifico para dichoantígeno unido a la membrana conformando la llamadabanda de control del test.En primer lugar, la muestra se trata con el tampóndiluyente de la muestra (incluido en este kit) paraconseguir la extracción de las toxinas a partir de la matrizfecal. Tras la extracción, tan sólo se necesita añadir unvolumen determinado de sobrenadante en la tira reactiva yesperar 15 minutos.Cuando la muestra extraída fluye a través de la membranadel test, las partículas coloreadas migran. En el caso deuna muestra positiva, los anticuerpos específicos presentesen la membrana capturarán las partículas coloreadasrecubiertas por el antígeno.Diferentes líneas de color serán visibles, dependiendo delcontenido de toxinas en la muestra. Estas líneas se usanpara interpretar el resultado a los 15 minutos deincubación a temperatura ambiente (ver Fig.1)

FORMATOS DEL TESTEl test 2A-Bdiff está disponible en dos formatos diferentes:- Formato Stick: se trata de la tira reactiva envasada en unsobre de aluminio individual o en un tubo de plástico de25 unidades. Se necesita un tubo (incluido en el kit) o unpocillo de microplaca de 96 pocillos y fondo plano paradepositar la muestra extraída y correr el test.- Formato Simple: se trata de la tira reactiva en el interiorde un cassette de plástico. Las muestras extraídas seañaden directamente a la ventana de muestra de lacarcasa señalizada con una flecha.Ambos formatos tienen las mismas prestaciones, la únicadiferencia está relacionada con la forma de ejecutar el test(ver más abajo los apartados de “Procedimiento”correspondientes).

MATERIALES INCLUIDOS EN EL KIT• Dispositivos de reacción (formato Simple o Stick).• Tampón de dilución de la muestra. Este tampón es elmismo que se utiliza para el producto Simple/Stick GDH.• Pipetas de plástico desechables no graduadas(amarillas).

• BIOSIGMA S.r.l.• Via Valletta, 6 – Zona Ind. Cantarana

30010 - Cona (VE) - ITALY

• Pipetas de plástico desechables graduadas.• Aplicadores de madera para la toma de muestrassólidas.• Micro-tubos de plástico con cierre de 1,5 ml.• Tubos de ensayo.• Soportes para los tubos de ensayo anteriores quepermiten mantenerlos en posición vertical, estable.

MATERIALES NO INCLUIDOS EN EL KIT• Centrifuga adaptada a los micro-tubos de 1,5 ml.• Vórtex• CronómetroExisten controles a disposición del usuario para validarlos resultados obtenidos, que se pueden adquirir comouna referencia comercial independiente.

PRECAUCIONES1. Las muestras de los pacientes (heces) deben sermanipuladas con cuidado ya que pueden conteneragentes infecciosos. A lo largo de todo el proceso sedeben usar todos los medios de protección requeridos.

2. El tampón de dilución de la muestra contiene azidade sodio como agente anti-microbiano. Evitar elcontacto directo con la piel y las mucosas. Desecharde forma apropiada. No usar el tampón si manifiestaindicios de contaminación o precipitación.3. No comer, beber, fumar, almacenar o prepararalimentos en la zona donde se manejan los reactivos ylas muestras.

4. Cuando se finaliza el trabajo, desechar los guantesy, a continuación, en primer lugar, limpiar las manoscon desinfectantes alcohólicos. En segundo lugar, lavarlas manos con jabón. Finalmente, descontaminar elfregadero con desinfectantes esporocídicos ya que lasesporas de C.difficile no se eliminan con alcohol.

5. No intercambiar los componentes de kits condistinto numero de lote.

6. En el caso de almacenar el test refrigerado, dejarque todos los componentes del kit y las muestrasfecales alcancen la temperatura ambiente, puesreactivos y/o muestras fríos pueden reducir lafuncionalidad del test. Se recomiendan de 20 a 30minutos para alcanzar la temperatura ambiente.7. Utilizar todos los reactivos únicamente in vitro.

8. No usar los componentes del kit después de lasfechas de caducidad.

9. En caso de rotura del envase primario (sobre dealuminio o vial) el producto no debe ser utilizadoaunque ninguno de los componentes haya sidodañado.

10. En el caso del formato Simple, es muy importanteañadir el volumen correcto de muestra extraída aldispositivo de reacción. Si es inferior al indicado,

2

puede ser que no se realice la cromatografía porque nollegue suficiente muestra a la zona de reacción; si essuperior, pueden aparecer líneas marrones en vez de rojaso azules.11. El producto usado debe desecharse conforme a lalegislación vigente.

12. No usar el test si aparece alguna línea de color en lazona de resultados antes de empezar a usarlo.

13. Es muy importante tomar la cantidad adecuada demuestra: unos 75 mg si son muestras sólidas (una bolitapequeña de unos 3 mm de diámetro) ó 75 µl si sonmuestras líquidas o semi-líquidas; estas cantidades seextraen en 1 ml de diluyente de la muestra incluido en elkit. Si se toma una cantidad de muestra mayor, basta conmantener la proporción de 75 mg (ó 75 µl) de muestra en1 ml de diluyente de la muestra. Un exceso de muestra enrelación a la cantidad de tampón añadida impide que lacromatografía transcurra de forma correcta; esto esespecialmente crítico en el caso de muestras sólidas yaque no es tan sencillo tomar la cantidad adecuada demuestra. Hay que tener en cuenta que el test 2A-Bdiff seha diseñado para analizar muestras líquidas y semi-líquidas.

14. En el caso del producto envasado en tubo, es muyimportante que se vuelva a cerrar de manera inmediatauna vez sacada la tira reactiva dado que una humedadambiental elevada podría dañar al resto de tiras quepermanecen en el interior del tubo.15. No tirar la caja externa del kit hasta que se hayautilizado todo el contenido. La caja contiene informaciónesencial respecto al marcado CE del producto ylotificación.

ALMACENAMIENTOSe puede conservar a cualquier temperatura comprendidaentre 2 y 30ºC.Su fecha de caducidad está impresa en los tubos o en losenvoltorios de aluminio.

MUESTRAS▪ Este test está diseñado para analizar muestras fecaleslíquidas o semi-líquidas; pueden analizarse muestrassólidas aunque no es lo habitual teniendo en cuenta quela diarrea es un síntoma inherente a la infección porC.difficile.▪ No usar muestras que hayan sido recogidas en mediosde transporte o se les hayan añadido agentes deconservación (como formalina, SAF, PVA o similares) omedios de enriquecimiento ya que su presencia podríainterferir con la correcta ejecución del test.▪ Se recomienda analizar muestras frescas sin tratar. Si setienen que conservar durante un tiempo, puedenguardarse en el frigorífico (+2-8ºC) durante 1 ó 2 días.Para tiempos más largos, deben congelarse a -20ºCteniendo en cuenta que algunas muestras se vuelvennegativas tras haber sido congeladas.

▪ Prestar especial atención cuando se analicenmuestras hemorrágicas pues suelen dar problemas deinespecificidad cuando el contenido en sangre eselevado. Un indicio de esta inestabilización del testsuele ser la alteración del color azul de la banda decontrol (tiende a mostrar un color morado o azul muyoscuro).▪ En caso de congelación, descongelar totalmente lasmuestras a temperatura ambiente antes de proceder asu análisis.▪ Evitar ciclos de congelación y descongelación con lasmuestras fecales ya que las toxinas pueden perder suintegridad.

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS FECALESNota General: usar todos los medios de protecciónrequeridos a lo largo del desarrollo del test debido almanejo de muestras infecciosas. Una vez finalizado eltrabajo, proceder con la higiene de acuerdo al punto 4del apartado “Precauciones”.Este tampón es el mismo que se utiliza para elproducto Simple/Stick GDH.El protocolo de preparación de las muestras fecales esel común para formato Simple y Stick:

1. Para heces líquidas o semi-líquidas añadir 3 gotas(ó 75 µl) de muestra con la pipeta desechable singraduar (amarilla) a un micro-tubo de 1,5 ml.Si la muestra es sólida, tomar una porción deaproximadamente 75 mg (una bolita pequeña de unos3 mm de diámetro) con el aplicador de madera yañadirla a un micro-tubo de 1,5 ml etiquetado.Importante: Homogeneizar la muestra y tomar unaporción de al menos tres sitios diferentes de la muestracon el fin de obtener una muestra lo másrepresentativa posible.2. Añadir 1 ml de diluyente de la muestra al micro-tubo anterior de 1,5 ml (o el volumen apropiado paramantener una proporción de 75 µl (ó 75 mg) demuestra en 1 ml de tampón de dilución).

3. Agitar en el vórtex durante 30 segundos o el tiemponecesario para asegurar la total resuspensión de lamuestra en el tampón.

4. Centrifugar los micro-tubos de 1,5 ml durante 5minutos a 700xg (unas 3000 rpm) en una centrífugapequeña adaptada a estos micro-tubos parasedimentar las partículas sólidas. Si no se dispone deuna centrífuga adecuada, esperar unos 3-5 minutoshasta que las partículas sólidas se hayan depositado enel fondo del tubo. En cualquier caso, el mejorfuncionamiento del test se consigue usando unasolución clara de la muestra extraída tras lacentrifugación.

PROCEDIMIENTO SIMPLE 2A-BdiffUna vez que las muestras se han preparado como seindica en los apartados anteriores, se procede de la

3

siguiente manera:- Sacar el dispositivo de reacción de la bolsa de aluminio.Desechar la bolsita de desecante puesto que sólo sirvepara preservar el test de la humedad.- Tomar sobrenadante de la muestra, tras lacentrifugación, con una nueva pipeta desechable amarillay añadir 4 gotas (ó 100 µl) a la zona para la muestra deldispositivo de reacción (ventana circular señalada con unaflecha).- Esperar exactamente 15 minutos para leer e interpretar elresultado.

PROCEDIMIENTO STICK 2A-BdiffUna vez que las muestras se han preparado como seindica en los apartados anteriores, se procede de lasiguiente manera:- Sacar la tira reactiva de la bolsa de aluminio o delcorrespondiente tubo (volver a cerrarlo inmediatamentepara evitar daños debidos a la humedad ambiental).- Si se usa un tubo de ensayo incluido en el kit, introducirdicho tubo en el soporte incluido en el kit. Tomar unvolumen de unos 265 µl (cuarta marca de la pipetadesechable graduada) del sobrenadante de la muestra,tras la centrifugación, y depositarlo en el interior del tubode ensayo.- Si se usa una microplaca de 96 pocillos con fondoplano, tomar un volumen de unos 150 µl (tercera marcade la pipeta desechable graduada) por pocillo delsobrenadante de la muestra tras la centrifugación.- Introducir la tira reactiva en el tubo de ensayo (acopladoal soporte) o en el pocillo de la microplaca con las flechasdel adhesivo superior indicando hacia abajo.- Incubar y leer el resultado exactamente a los 15 minutosen la zona central blanca de la tira (ver Fig 1).

LECTURA DE RESULTADOSLas cinco tiras que se muestran en la Fig. 1 son unejemplo de los distintos resultados que se pueden obtenercon el test 2A-Bdiff.Se distinguen tres bandas coloreadas diferentes:Banda azul: constituye la banda de control que indica uncorrecto funcionamiento del testBanda roja superior: indica presencia de TcdB en lamuestra.Banda roja inferior: indica presencia de TcdA en lamuestra.La banda azul de control debe aparecer siempre. Lapresencia adicional de cualquiera de las dos bandas rojasindica la presencia de C.difficile productor de TcdA y/oTcdB en la muestra analizada.

Tira 1: resultado NEGATIVO: la muestra no contieneC.difficile o contiene una cepa no productora de TcdA /TcdB. Sólo aparece una línea transversal AZUL en la zonacentral del dispositivo de reacción (en formato Simplealineada con la letra “C” marcada en la carcasa). Esta

banda constituye la banda de control y debe aparecersiempre ya que indica que la cromatografía transcurrecon normalidad.

Fig. 1: Modelos de posibles resultados. La lectura se indicadebajo de las tiras.

Tiras 2-4: resultados POSITIVOSTira 2. Detección de TcdA: aparece una banda AZUL(control) y una banda ROJA justo por debajo de labanda de control (en formato Simple alineada con laletra “T1” marcada en la carcasa). La intensidaddepende de la concentración de toxina A en lamuestra.Tira 3. Detección de TcdB: aparece una banda AZUL(control) y una banda ROJA justo por encima de labanda de control (en formato Simple alineada con laletra “T2” marcada en la carcasa). La intensidaddepende de la concentración de toxina B en lamuestra.Tira 4. Detección de TcdA y TcdB aparece una bandaAZUL (control) junto a dos bandas ROJAS (una porencima (TcdB) y otra por debajo (TcdA) de la banda decontrol).

Tira 5: resultados INVÁLIDOS: no aparece la banda decontrol azul, el color azul de la banda de controlaparece claramente alterado (azul muy oscuro omorado) o aparecen colores inespecíficos en lasbandas positivas (diferentes al rojo). En general,cualquier combinación de colores diferente a lasindicadas en las tiras 1-4, indica un funcionamientoanómalo del test. Algunas de las causas que justificaneste hecho pueden ser:- algunos de los reactivos se han deteriorado o el testha caducado.- la muestra no se ha preparado de acuerdo a lasinstrucciones de uso.- la muestra tiene un alto contenido en sangre.

4

Ante un resultado inválido, se recomienda repetir el testcon una nueva tira siguiendo estrictamente lasinstrucciones de uso descritas en este manual. En el casode las muestras con sangre, se aconseja el uso de unatécnica alternativa pues el problema de la inestabilizaciónno suele depender de la tira empleada sino de la propiamatriz de la muestra. Otros tests rápidos comercialesdieron resultados similares con estas muestras.Toda línea que por la naturaleza de la muestra puedaaparecer pasados los 15 minutos de reacción no tendrávalor diagnóstico.NOTA: El diagnóstico final y definitivo sobre unaCDI/PMC lo establece el médico clínico. Este test sólodetecta TcdA / TcdB en una muestra, pero no constituye unargumento para afirmar que la persona padece una CDI.

ADVERTENCIA: Se recomienda la inclusión de nuestroscontroles de resultado conocido para asegurar que losdatos obtenidos son correctos.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO1. El test 2A-Bdiff analiza heces humanas de naturalezalíquida o semi-líquida; no se excluye la medida demuestras sólidas aunque el test no se ha optimizado paraello ya que, en ocasiones aisladas, se han observadofenómenos de secuestro de las toxinas con este tipo dematrices sólidas. 2. Este test es cualitativo, no cuantitativo aunque laintensidad de las bandas positivas está relacionada con lacantidad de toxinas detectable en la muestra fecal.

3. Mas de 200 muestras fecales fueron evaluadas paraasegurar el correcto funcionamiento del test. Lacorrelación de resultados con otras técnicas (ELISA yCitotoxicidad) fue buena. Sin embargo, este estudio noexcluye posibles interferencias en el funcionamiento deltest al analizar otras muestras fecales.

4. Con un defecto de muestra pueden aparecer resultadospositivos muy débiles. En este caso se debe repetir el testcon una cantidad mayor de muestra manteniendo laproporción recomendada con el volumen del diluyente dela muestra (ver apartado de “Preparación de lasmuestras”).

5. Un exceso de muestra puede causar un desarrollo deltest muy lento e incluso impedir el correcto desarrollo deltest (no se ve la línea control). En este caso se debe repetirel test con una cantidad menor de muestra. Prestarespecial atención a este punto cuando se analizanmuestras sólidas.6. Un resultado negativo no excluye la posibilidad de unainfección por parte de C.difficile (CDI). El resultado del testdebe ser interpretado en relación a los síntomas clínicosdel paciente. Además debemos tener en cuenta que lastoxinas son moléculas frágiles que pueden degradarse confacilidad debido, por ejemplo, a un almacenamientoinadecuado de la muestra o la presencia de inhibidoreshaciendo que la concentración de toxinas esté por debajo

del límite de detección del test (ver apartado“Sensibilidad Analítica”)7. Un resultado positivo obtenido con una muestrasólida debe ser interpretado con mucha precaución.En principio, la diarrea es un síntoma inherente a lainfección por C.difficile (CDI) y una muestra sólidaimplica ausencia de diarrea. El operador del test debeproporcionar información de la naturaleza de lamuestra al médico clínico para que, junto al historialclínico del paciente, se pueda establecer undiagnóstico lo más preciso posible.

8. Se ha observado una cierta reactividad cruzada conmuestras fecales fuertemente positivas paraEntamoeba histolytica. No ocurre así cuando seanaliza un extracto puro de este parásito, sin matrizfecal. Otros ELISA y test rápidos del mercado dieronresultados similares con estas muestras.9. Se ha observado que muestras fecales con un altocontenido en sangre interfieren negativamente con eltest, pudiendo aparecer problemas de inespecificidadcon muestras que son negativas para C.difficile. Estainestabilización del test suele ir acompañada de unaalteración en la coloración de la banda de control; enlugar de un color azul claro, aparece un color azul muyoscuro o incluso morado (ver las imágenes en elapartado “Lectura de Resultados”).

10. Se han descrito índices de colonización en niñospor parte de C.difficile de hasta el 50 %. También sedan elevados índices de colonización en pacientes confibrosis quística. Normalmente, estos dos grupos depacientes permanecen asintomáticos por lo que norequieren tratamiento específico. Prestar especialatención a estos resultados positivos sin relevanciaclínica ya que los pacientes afectados no requierentratamiento frente a C.difficile.

SENSIBILIDAD ANALÍTICAPara determinar la sensibilidad del test 2A-Bdiff seusaron toxinas A y B procedentes de tgc BIOMICsllegando a detectar unos niveles en torno a 0,75ng/ml para ambas toxinas.

SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DIAGNÓSTICALos valores medios de sensibilidad y especificidadestablecidos para el test 2A-Bdiff considerando todaslas evaluaciones llevadas a cabo son:

Sensibilidad: 97,4 %Especificidad: 96,1 %

El test 2A-Bdiff muestra un excelente comportamientocon valores de sensibilidad y especificidad superioresal 95%.A continuación se incluyen dos de las evaluacionesrealizadas con el test:

5

A.- Evaluación ExternaEl test 2A-Bdiff de Operon se evaluó en un hospitalespañol analizando un total de 150 muestras negativas y44 muestras positivas según la técnica de referencia, laCitotoxicidad. Todas las muestras del estudio fueronfrescas. Los resultados obtenidos fueron:

Sensibilidad: 92,5%Especificidad: 95,5%

B.- Evaluación InternaEl test 2A-Bdiff se evaluó internamente midiendo un totalde 242 muestras negativas y 105 muestras positivas,caracterizadas a nivel de Citotoxicidad en los hospitales deorigen. Todas las muestras analizadas fueron congeladas.Los resultados obtenidos se indican a continuación:

Sensibilidad: 99,0%Especificidad: 96,3%

REPETIBILIDADSe diseña una curva de sensibilidad haciendo uso de lastoxinas A y B puras de ListLabs que permite establecer lasensibilidad del test 2A-Bdiff en distintas condiciones.Cada una de las diluciones ½ que integran la curva semidió por triplicado, en una única sesión por la mismapersona. La variación máxima de los resultados utilizandoel test 2A-Bdiff fue de una dilución 1/2, lo que indica unaalta precisión intra-ensayo.

REPRODUCIBILIDAD

PRECISIÓN INTER-DÍACon un mismo lote del test 2A-Bdiff se midió la curva desensibilidad descrita anteriormente a lo largo de cuatrodías espaciados en el tiempo. Los resultados fueron muyreproducibles (obtenemos la misma sensibilidad tantopara TcdA como para TcdB los cuatro días de medida).

PRECISIÓN INTER-OPERADORCinco personas sin previo entrenamiento midieron porduplicado una curva de sensibilidad. Se observarondiferencias en las diluciones más fuertes de la curva(señales más débiles) que en ningún caso fueronsuperiores a una dilución ½.

PRECISIÓN INTER-LOTECon tres lotes distintos del test se midió una curva desensibilidad por duplicado. El análisis lo realizó una únicapersona el mismo día. Sólo se apreciaron diferencias deuna dilución ½ , asumibles y tolerables por el ensayorealizado.

Las diferencias encontradas en los distintos apartados de“Reproducibilidad” son asumibles en una técnica

inmunocromatográfica cualitativa con una variabilidadinherente a la misma.

EFECTO HOOK O PROZONADiversas publicaciones indican que, en el caso de lasinfecciones más severas por C.difficile, laconcentración máxima de toxinas halladas en hecesronda los 112 ng/ml10. Como se quiere ver el efectode una concentración muy elevada de toxinas, porencima de valores que se pueden encontrar entre lapoblación, se midieron concentraciones de toxina A yde toxina B de hasta 5000 ng/ml que supone estarunas 400 veces por encima del LPC del test paratoxina A (12,5 ng/ml), unas 1500 veces por encimadel LPC del test para toxina B (3 ng/ml) y unas 40veces por encima de la máxima concentración detoxinas observada en heces de pacientes. En ningúncaso se observó disminución en la intensidad de lasseñales positivas.

SUSTANCIAS INTERFERENTESLas siguientes sustancias no mostraron ningún efecto enlos resultados del test cuando fueron añadidas amuestras fecales (positivas y negativas) a lasconcentraciones indicadas en la siguiente tabla:

Racecadotrilo 5% (p/v) Ibuprofeno 20% (p/v)

Cimetidina 10% (p/v) Ac. Acetilsalicílico 30% (p/v)

Loperamida 5% (p/v) Edulcorante 5% (p/v)

Metronidazol 10% (p/v) Ac. palmítico 40% (p/v)

Omeprazol 3% (p/v) Sulfato de Bario 5% (p/v)

Ampicilina 15% (p/v) Mucina 5% (p/v)

REACTIVIDAD CRUZADA CON OTROSMICROORGANISMOS

Este estudio se desarrolló en dos centros diferentes:

▪ OPERON: el test 2A-Bdiff se testó frente a hecesfuertemente positivas para los siguientesmicroorganismos:Adenovirus - Rotavirus - Norovirus - Astrovirus -Helicobacter pylori - Entamoeba histolytica - Giardialamblia - Cryptosporidium parvum

Se observó una cierta reactividad cruzada conmuestras fecales fuertemente positivas paraEntamoeba histolytica (ver punto 8 en el apartado“Limitaciones del Procedimiento”).

▪ CENTRO HOSPITAL ARIO NACIONAL (España): eltest 2A-Bdiff se testó frente a distintos microorganismossusceptibles de estar presentes en el tracto intestinal enun momento dado a una concentración suficientementeelevada. Los exámenes fueron realizados consuspensiones de bacterias a una concentración de 108

cfu/ml. El test 2A-Bdiff no presentó reactividad cruzadacon ninguno de los microorganismos indicados acontinuación:Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila, Bacilluscereus, Bacillus spp, Bacteroides nordii, Campylobacter

6

jejuni, Candida albicans, Clostridium butyricum, Clostridiumcadaveris, Clostridium perfringens, Clostridium sordellii,Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae,Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichiacoli 1, Escherichia coli 2, Klebsiella pneumoniae,Lactobacillus gosseri, Listeria monocitogenes, Plesiomonasshigelloides, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa,Salmonella enteriditis, Salmonella typhi, Salmonellatyphimurium, Serratia marcescens, Shigella dysenterie,Shigella flexnerii, Shigella sonneii, Staphylococcus aureus,Staphylococcus epidermidis, Vibrio cholerae, Vibrioparahaemolyticus, Yersinia enterocolitica.

SIMPLE 2A-Bdiff / STICK 2A-Bdiff

One-step immunochromatographic test for the differentialdetection of toxin A and toxin B from C.difficile in faeces

THESE INSTRUCTIONS SHOULD BE READ CAREFULLYBEFORE PERFORMING THE TEST.

INTRODUCTIONOPERON's 2A-Bdiff chromatographic immunoassayprovides a procedure for a qualitative detection ofClostridium difficile toxin A (TcdA) and toxin B (TcdB) intwo separate bands. A positive band of either toxin is asign of an underlying Clostridium difficile infection(CDI), which should be taken into consideration by theclinician.Unlike other immunoassay systems (ELISA and rapidtests) that only allow detection of TcdA and TcdB incombination and without any differentiation betweenthe two, the OPERON 2A-Bdiff test allows you to run asingle assay with a single strip that differentiatesbetween both of the toxins using two separated bands- a red band below the blue control band when TcdA ispresent, and another red band above the control bandwhen TcdB is in the sample (see Fig. 1).The test is based on the immunological capture ofcoloured microparticles during their passage along amembrane on which specific monoclonal antibodiesagainst TcdA and TcdB have been immobilised at twoseparated locations.

Presumptive diagnosis of Clostridium difficile infection(CDI)C.difficile produces two different toxins that constitutethe essential virulence factors for CDI induction. Recentinvestigations1, 2 have proven that each of the twoalone will induce disease in hamsters.C.difficile infection is considered responsible forapproximately 25% of the diarrhoea incidents relatedto the consumption of antibiotics such as clindamycin,second and third generation cephalosporins, gyrase-Inhibitors, ampicillin or amoxicillin.In addition to the diarrhoea symptoms, the disease canlead to pseudo-membranous colitis (PMC), requiringurgent treatment with antibiotics effective againstC.difficile (metronidazole / vancomycin) and which,without treatment, may severely compromise the life ofthe patient. CDI mortality can be as high as 6% to 30%,particularly when the patient suffers from PMC. Patientssuffering from CDI induced by previous treatment canlead to an increased hospital stay of 6-10 days at anadditional cost of 6,000-8,000 Euro3.

7

EN

C.difficile descriptionClostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming bacteria that is carried by approximately 5% ofthe healthy population. Following hospitalisation, thecarrier rate climbs to approximately 30%. Children arecolonised by C.difficile early after birth, but they do notappear to suffer any clinical symptoms despite intensiveinvestigations. The current discussion suggests a lack ofenteric receptors for the toxins or differences in faecal pHin children that prevent toxin activity.As previously mentioned, C.difficile can produce differenttoxins4:Toxin A (TcdA) (308 kDa) is called an enterotoxin giventhat it can induce full symptoms in the hamster animalmodel. TcdA also displays high cytotoxicity but only onspecific TcdA sensitive cells such as HT-295. Toxin B (TcdB) (279 kDa) is classified as a cytotoxin. In themajority of cells cultured in laboratories (e.g. Vero, CHOor HeLa) it is about 1,000 times more potent than toxin A.The TcdB amino acid sequence varies between differentstrains6.

TcdA/TcdB detection patternsThe following C.difficile strains can be identified based onthe production of toxins:▪ Non-toxigenic strains are non-pathogenic and lack TcdAand TcdB production as well as production of the binarytoxin.▪ TcdA+ / TcdB+ strains are the most common CDIinducing strains of which ribotypes 001, 014 and 078 arethe most prevalent in Europe7.▪ TcdA- / TcdB+ strains were first identified by Depitre etal. in Belgium8. They are considered pathogenic despitenot producing toxin A9. Ribotype 017 strains belong to thisgroup and were responsible for various endemic outbreaksin North America.▪ TcdA+ / TcdB- strains can be identified directly in stoolsamples with the 2A-Bdiff test due to provides a simple,fast and separate detection of toxin A and toxin B in asingle test. Very few isolates of these strains have beenfound until now. Recent results show that TcdB mutantC.difficile strains still induce CDI in hamsters owing to theproduction of toxin A2. These results appear to indicate thepresence of these strains in clinical samples.

BASIC PRINCIPLES OF THE TESTThe 2A-Bdiff test employs a combination of:1) Red latex particles conjugated to a specific toxin Aantibody that cooperates with another antibody specificfor toxin A and that is located on the membrane, belowthe control band.2) Other red latex particles conjugated to a specific toxinB antibody that cooperates with another specific toxin Bantibody that is located on the membrane, above thecontrol band.3) Blue latex particles conjugated to an antigenrecognised by an antibody specific for that antigen and

bound to the membrane, serving as the control bandtest.To run the test, the sample is first treated with a samplediluent buffer (provided in the kit) that extracts thetoxins from the stool matrix. Following extraction, analiquot of the supernatant needs to be added to thetest strip followed by a 15 minute wait.When the extract flows through the test membrane, thecoloured particles begin to migrate. In the event of apositive sample, the specific antibodies on themembrane will capture antigen-covered colouredparticles.

The pattern of lines obtained after 15 minutes ofincubation at room temperature are used to interpretthe result (see Fig. 1).

TEST FORMATSThe 2A-Bdiff test is available in two formats:- Stick format: uses the reactive strip itself packagedindividually within an aluminium wrap or included in a25 units plastic tube. An additional test tube (includedin the kit) or a 96-well microplate with flat-bottom isrequired to deposit the extracted sample and run thetest.- Simple format: uses the reactive strip inside a plasticcassette. The extractions are added directly to thesample window that is marked with an arrow on thecasing.Both formats display the same features, however thereare some differences in the operations layout (see therelevant “Procedures” section below).

MATERIALS INCLUDED IN THE KIT• Reaction devices (Stick or Simple format)• Sample diluent buffer. The sample diluent buffer isthe same as for the Simple/Stick GDH product.• Disposable graduated plastic pipettes• Disposable non-graduated plastic pipettes (yellow)

BIOSIGMA S.r.l.Via Valletta, 6 – Zona Ind. Cantarana30010 - Cona (VE) - ITALY

• Wooden applicators for taking formed stool samples.• 1.5 ml capped microtubes.• Test tubes.• Stands to hold the previous test tubes in a stableupright position.

MATERIAL NOT INCLUDED IN THE KIT• Centrifuge adapted to 1.5 ml microtubes • Vortex apparatus• TimerThere are available controls for the user in order tovalidate the obtained results. These controls may beacquired as an independent commercial reference.

8

PRECAUTIONS1. Patient samples (faeces) should be handled with care asthey may contain infectious agents. All the necessaryprotections should be used throughout handling(disposable gloves, goggles, laboratory coat and others).

2. The sample diluent buffer contains Sodium Azide as anantimicrobial agent. Avoid direct contact with the skin andmucous membranes. Dispose of appropriately. The buffershould not be used if there are signs of contamination orprecipitation.

3. Do not eat, drink, smoke, store or prepare food inareas where the reagents and the samples are handled.

4. Once the work has been concluded, remove the glovesand first disinfect your hands with alcoholic disinfectant.Secondly, wash your hands with soap. Finally, the sink thathas been used needs to be decontaminated withsporocidic disinfectants, as the C.difficile spores are noteliminated with alcohol.5. Do not exchange components between kits withdifferent lot numbers.

6. If the test is stored refrigerated, allow kit componentsand stool samples to reach room temperature before use,as cold reagents and/or samples may reduce testperformances. About 20-30 minutes are usually sufficientfor reaching room temperature.

7. All reagents are for in vitro use only.

8. Do not use kit components beyond their expiry date.9. In case the primary packaging is damaged (aluminumpouch or diluent buffer vial) the product should not beused even though none of the components have beendamaged.

10. In the case of the Simple format, it is very important toadd the correct volume of extracted sample to the reactivedevice. If the volume is lower than indicated,chromatography may not occur because the sample maynot reach the reaction area. If higher volumes are used,brown lines may appear instead of red or blue ones.

11. All products are for single use only and should bediscarded according to current legislation.

12. Do not use the test if any coloured lines appear in theresult area prior to performing the test.13. It is critical to collect the correct sample quantity:approximately 75 mg of a solid sample (a small ball of 3mm in diameter) or 75 µl of a liquid or semi-liquidsample. These quantities are extracted in 1 ml of thesample diluent supplied with the kit. If a larger sample istaken, maintaining a ratio of approximately 75 mg (or 75µl) of sample in 1 ml of sample diluent is sufficient. An excess of sample in relation to the amount of bufferadded prevents the chromatography from runningcorrectly; this is especially critical in the case of solidsamples, since it is harder to obtain an appropriatequantity. Please bear in mind that the 2A-Bdiff test wasdesigned to analyse liquid and semi-liquid samples.

14. It is very important to recap product that is packaged

in tubes immediately once the reaction strip has beenremoved, since high levels of humidity may damagethe unused strips inside the tube.15. Do not discard the external box of the kit until itscontent has been totally used. The external boxcontains essential information regarding the ECmarking and lotificaction.

STORAGEThe product can be stored at any temperature between2 and 30ºC.Its expiry date is printed on the tube or on thealuminium wrap.

SAMPLES▪ This test is designed to analyse liquid or semi-liquidstool samples. Solid samples may be analysed, but it isunusual given that the leading symptom of C.difficileinfection is diarrhoea.▪ Do not use samples that have been collected inmeans of conveyance or to which enrichment media /preserving agents have been added (e.g. formalin, SAF,PVA or similar) as they may interfere with the test.▪ The analysis of untreated fresh samples isrecommended. If preservation is needed, they shouldnot be stored in the refrigerator (+2-8ºC) for longerthan 1 to 2 days. For longer storage, samples must befrozen at -20ºC, however please bear in mind thatsome samples turn negative when they have beenfrozen. ▪ Pay special attention when analyzing hemorrhagicsamples as they often give false positve results whenthe blood content is high. An indicator of thisdestabilization of the test is usually the alteration of thecolour in the control band (tends to show a purple ordark blue colour). ▪ Ensure that frozen samples have completely defrostedand reached room temperature prior to proceedingwith their analysis.▪ Avoid repeatedly freezing and thawing the stoolsamples as the integrity of the toxins may suffer.

STOOL SAMPLES PREPARATIONGeneral remark: all the necessary protections shouldbe used throughout the test procedure due thehandling of infectious samples. Once finished, do notforget to comply with the hygiene procedures detailedin point 4 of the “Precautions” section. The sample diluent buffer is the same as for theSimple/Stick GDH product.Whatever format of test is used (Simple or Stick), theprotocol for the preparation of stool samples is asfollows:1. For liquid or semi-liquid samples add 3 drops (or 75µl) of sample using the plastic non-graduated pipette(yellow) to a 1.5 ml microtube.

9

If the sample is solid, take a portion of approximately 75mg (a small ball of 3 mm in diameter) with the woodenapplicator and add it to a 1.5 ml labelled microtube.Important: ensure the sample is homogeneous by taking aportion from three different sample areas in order toobtain the most representative sample possible. 2. Add 1 ml of the sample diluent to the previous 1.5 mlmicrotube containing the sample (or the appropriatevolume to maintain a ratio of 75 µl -or approximately 75mg- of sample for 1 ml of diluent buffer).3. Vortex the microtube thoroughly for 30 seconds toensure the total resuspension of the sample within thebuffer. 4. Centrifuge the 1.5 ml microtubes for 5 minutes at700xg (approximately 3000 rpm) in a small benchtopcentrifuge to settle solid particles. If a centrifuge is notavailable, wait 3-5 minutes for the solid particles to settleat the bottom of the tube. In any case, optimum testperformance is achieved with a clear solution of a sampleextracted following centrifugation.

SIMPLE 2A-Bdiff PROCEDUREOnce the samples have been prepared as describedabove, proceed as follows:- Take the reaction device out of its aluminium pouch.Discard the desiccant as it only functions as to preservethe test from any excess of humidity.- Following centrifugation and using the yellow plasticpipette supplied with the kit, transfer 4 drops (or 100 µl)of the sample supernatant to the sample area of thereaction device (round window marked with an arrow) - Wait for exactly 15 minutes to read and interpret theresult.

STICK 2A-Bdiff PROCEDUREOnce the samples have been prepared as describedabove, proceed as follows:- Take the reaction strip out of its tube or aluminiumpouch (recap it immediately to avoid damages due to thehumidity getting access).- If a test tube included in the kit is used, insert this tubeinto the tube-stand also included in the kit. Take analiquot of the centrifuged sample supernatant: theappropriate volume is approximately 265 µl (fourth markof the plastic graduated pipette). Transfer this volume tothe test tube.- If a 96-well microplate with flat-bottom is used,approximately 150 µl of the centrifuged samplesupernatant is enough (third mark of the plastic graduatedpipette).- Dip the reaction strip with the arrow heads pointing tothe liquid sample into the test tube or into a well of themicroplate.- Incubate the test at room temperature for 15 minutesand read the test result in the white area (see Fig. 1)

RESULTS READINGThe five strips shown in Fig. 1 exemplify the variousresults that can be obtained using the 2A-Bdiff test. There are three different coloured bands:Blue band: the control band that indicates a correctperformance of the test.Upper red band: TcdB positive sampleLower red band: TcdA positive sample

The blue band (control) should always appear. Theadditional appearance of any red band in the stripindicates the presence of C.difficile that produces TcdAand/or TcdB in the analysed sample.

Fig. 1: Pattern of possible results. Result as indicated belowthe strips.

Strip 1. NEGATIVE result: the sample does not containC.difficile or it contains a strain that does not produceTcdA/TcdB. A single BLUE horizontal band appears withinthe central area of the reactive device (in the Simpleformat it is aligned with the letter “C” marked on thecassette). This is the control band and it should alwaysappear as an indication of the chromatography runningsmoothly.

Strips 2–4: POSITIVE results: Strip 2 . Detection of TcdA: a BLUE (control band) anda RED band appear just below the control band (in theSimple format is it aligned with the letter “T1” markedon the cassette). The intensity depends on theconcentration of toxin A in the sample.Strip 3. Detection of TcdB: a BLUE (control band) anda RED band appear just above the control band (in theSimple format it is aligned with the letter “T2” markedon the cassette). The intensity depends on theconcentration of toxin B in the sample.Strip 4. Detection of both TcdA and TcdB: a BLUE(control band) and two RED bands (one above [TcdB]and one below [TcdA] the control band).

10

Strip 5. INVALID result: the blue control band does notappear or the blue colour of this band is clearly altered(very dark blue or a purple colour), also nonspecificcolours in the positive bands (different from red) areinvalid results. In general, any colour combinationdifferent from those indicated in 1-4 strips indicates ananomalous test performance. Possible reasons are:* some reagents have got damaged or the test hasexpired. * the sample was not prepared according to theinstructions of use. * high blood content in the sample.In the event of an invalid result it is recommended thatanother test is run, strictly following the protocol describedin this manual. For blood samples, it is advisable the useof an alternative technique because the problem ofdestabilization does not usually depend on the strip but ofthe sample matrix. Other commercial rapid tests gavesimilar results with these bloody samples.Any line appearing after the standard 15 minutes reactiontime is of NO diagnostic value.NOTE: The final and definitive diagnosis CDI/PMC isestablished by the clinician. This test only detects TcdA/TcdBin a sample, but does not constitute a case to confirmwhether a person has CDI.

WARNING: Including our controls with an establishedresult is recommended to ensure that the data obtainedare correct.

LIMITATIONS OF THE PROCEDURE1. The 2A-Bdiff test analyses liquid or semi-liquid humanstool samples; solid samples may be used, however thetest has not been optimised for their use since, in rareoccasions, toxins sequestration phenomena have beenobserved with such solid matrices.

2. This test is qualitative and not quantitative, although theintensity of the positive bands is associated with thequantity of toxins that are detected in the stool sample.3. Over 200 stool samples were evaluated to ensure thecorrect performance of the test. The correlation of theresults with other techniques (ELISA and Cytotoxicity) wasgood. However, this study does not exclude interferences inthe performance of the tests with other stool samples.

4. Weak signals may be due to excessively low amounts ofsample. In the event of this occurring, the test should berepeated with a greater amount of sample whilstmaintaining the recommended sample diluent ratio (see“Sample preparation” section).

5. An excess of sample can significantly slow down thedevelopment of the test or even prevent the test fromrunning (control band remains invisible). In the event ofthis occurring, the test should be repeated with a reducedsample amount. This is particularly relevant in the analysisof solid samples.

6. A negative result does not fully exclude thepossibility of infection with a C.difficile (CDI). The testresult must be interpreted in relation to the clinicalsymptoms of the patient. In addition, it is important tokeep in mind that toxins are fragile molecules that canbe easily degraded, for example owing toinappropriate storage of the sample or the presence ofinhibitors. Under these conditions, toxin concentrationmay be below the test detection limit (see “AnalyticalSensitivity” section).7. A positive result obtained from solid samples mustbe interpreted with a great amount of caution. Inprinciple, diarrhoea is the leading symptom ofC.difficile (CDI) infection CDI, and a solid stool impliesan absence of diarrhoea. The person performing thetest must provide the clinician with information on thenature of the sample. This, in combination with thepatient’s medical history, will allow the clinician toestablish the most accurate diagnosis possible.

8. A certain degree of cross-reaction has been observedwith stool samples that are strongly positive forEntamoeba histolytica. The reaction was negative whenusing a preparation of the isolated parasite (withoutstool matrix). Other ELISA and rapid tests that areavailable on the market yielded similar results for thesesamples.9. It is observed that faecal samples with a high bloodcontent may interfere negatively with the test. In thiscases, specificity problems may appear with C.difficilenegative samples. This destabilization of the test isoften accompanied by an alteration in the colour ofthe control band; a purple or dark blue colourappears instead of the expected light blue (see imagesin “Results Reading” section).

10� C.difficile colonisation rates of up to 50% havebeen reported in infants. A high rate has also beenreported in cystic fibrosis patients. Normally, these twogroups of patients remain asymptomatic and do notrequire specific treatment. These positive results that areof no clinical significance should be treated with cautionas affected patients do not require treatment forC.difficile infection.

ANALYTICAL SENSITIVITYIn order to determine the sensitivity of the 2A-Bdiff test,toxins A and B from tgc BIOMICs were used diluted inthe sample diluent buffer of this test. Most manufacturedbatches detect a concentration of 0.75 ng/ml of bothtoxins.

DIAGNOSTIC SENSITIVITY AND SPECIFICITYThe average values of sensitivity and specificity for the2A-Bdiff test obtained from all the evaluations madewith the test are:

Sensitivity: 97,4 %Specificity: 96,1 %

11

The 2A-Bdiff test shows an excellent performance withsensitivity and specificity values above 95%. Two of the evaluations performed with the 2A-Bdiff test areshowed below:

A.- External Evaluation

The 2A-Bdiff test from Operon was evaluated at a Spanishhospital by measuring a total of 150 negative samples and44 positive samples according to the reference technique,the Cytotoxicity. All samples were fresh. The results obtained were:

Sensibilidad: 92,5%Especificidad: 95,5%

B.- Internal EvaluationThe 2A-Bdiff test was evaluated internally by measuring242 negative samples and 105 positive samples accordingto the Cytotoxicity developed at the place of origin of thesamples (different Spanish hospitals). All samples analysedwere frozen.The results obtained were the follows:

Sensitivity: 99.0%Specificity: 96.3%

REPEATABILITYPurified toxins A and B from ListLabs were used to design asensitivity curve to measure the sensitivity of the 2A-Bdifftest in different conditions. Dilutions were two-fold and thesamples were assayed by the same person in triplicateduring a single session. The results differed by less than afactor of 2 indicating a high accuracy of the test.

REPRODUCIBILITY

INTER-DAY PRECISIONA sensitivity curve was measured with the same lot of stripson four different days. The results were very reproducible(the same level of sensitivity is obtained for both TcdA andTcdB over the four measurement days).

INTER-OPERATOR PRECISIONFive people with no prior training measured a sensitivitycurve in duplicate. Differences were observed in thestronger curve dilutions (weaker signals), never exceeded afactor of 2.

INTER-LOT PRECISIONThree different lots of the 2A-Bdiff test were used tomeasure the sensitivity curve in duplicate. The analysis wasperformed by a single person on the same day. Differencesof a dilution factor of 2 were appreciated, which areacceptable and tolerable for the test that was carried out.

The differences found in the “Reproducibility” sections areacceptable for this qualitative immunochromatographic testdue to the inherent variability associated to this technique.

HOOK EFFECTSeveral publications indicate that in the case of severeC.difficile infections, the highest concentration of toxinsfound in feces is around 112 ng/ml10. To evaluate theeffect of a very high concentration of toxins, values wellabove those that can be found among the populationaffected by CDI, concentrations of toxin A and toxin Bup to 5000 ng/ml were measured with the 2A-Bdiff test.This concentration is about 400 times the LPC test fortoxin A (12.5 ng/ml), about 1500 times the LPC test fortoxin B (3 ng/ml) and about 40 times the highestconcentration of toxins found in faeces from patients.No decrease in the intensity of the positive signals wasobserved.

INTERFERING SUBSTANCESThe substances indicated in the below table, at thespecified concentration, did not interfere with the resultsof the test when they were added to stool samples(positive and negative ones):

Racecadotril 5% (p/v) Ibuprofen 20% (p/v)

Cimetidine 10% (p/v) Acetylsalicylic acid 30% (p/v)

Loperamide 5% (p/v) Edulcorant 5% (p/v)

Metronidazole 10% (p/v) Palmitic acid 40% (p/v)

Omeprazole 3% (p/v) Barium Sulfate 5% (p/v)

Ampicillin 15% (p/v) Mucin 5% (p/v)

CROSS-REACTIVITY WITH OTHER MICRO-ORGANISMSThis study was developed in two different places:

▪ OPERON: the 2A-Bdiff test was evaluated againststrongly positive samples for the following micro-organisms:Adenovirus, Rotavirus, Norovirus, Astrovirus,Helicobacter pylori, Entamoeba histolytica, Giardialamblia, Cryptosporidium parvum.

A certain degree of cross-reaction was observed withstrongly positive samples for Entamoeba histolytica (seepoint 8 in the “Limitations of the Procedure” section).

▪ NATIONAL HOSPITAL CENTER (Spain): the 2A-Bdifftest was evaluated against different micro-organismslikely to be present in the intestinal tract at any time in asufficiently high concentration. Tests were carried out onbacterial suspensions at a concentration of 108 cfu/ml.The 2A-Bdiff test showed no cross reactivity with any ofthe micro-organims listed below:Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila, Bacilluscereus, Bacillus spp, Bacteroides nordii, Campylobacterjejuni, Candida albicans, Clostridium butyricum,Clostridium cadaveris, Clostridium perfringens,Clostridium sordellii, Enterobacter aerogenes,Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis,

12

Enterococcus faecium, Escherichia coli 1, Escherichia coli 2,Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus gosseri, Listeriamonocitogenes, Plesiomonas shigelloides, Proteus mirabilis,Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteriditis,Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Serratiamarcescens, Shigella dysenterie, Shigella flexnerii, Shigellasonneii, Staphylococcus aureus, Staphylococcusepidermidis, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus,Yersinia enterocolitica.

SIMPLE 2A-Bdiff / STICK 2A-BdiffTest immunochromatographique en une seule étape pour

la détection séparée de la toxine A et de la toxine B de C.difficile dans les selles.

CES INSTRUCTIONS DOIVENT ÊTRE LUES AVECATTENTION AVANT L’UTILISATION DU TEST

INTRODUCTIONLe test immunochromatographique 2A-Bdiffd’OPERON est un test de détection qualitatif, basé surl’apparition de deux bandes distinctes, l’une pour latoxine A (TcdA) et l’autre pour la toxine B (TcdB) deClostridium difficile présentes dans les matières fécaleshumaines. Une réponse positive pour l’une des deuxbandes de toxines suggère une infection sous-jacenteà Clostridium difficile (CDI), et doit attirer la vigilancedu clinicien.A la différence d’autres immunoessais disponibles surle marché (ELISA et tests rapides) qui permettentuniquement de détecter les toxines TcdA et TcdB demanière conjointe, sans possibilité de les différencier,le test 2A-Bdiff d’OPERON permet, en une seuleétape, de distinguer la présence de chacune des deuxtoxines grâce à deux bandes séparées: une banderouge en dessous de la bande bleue de contrôle quidétecte la présence de TcdA et une autre bande rougeau dessus de la bande bleue de contrôle qui détecte laprésence de TcdB dans l’échantillon (voir Fig. 1).Le test se base sur la capture immunologique demicroparticules colorées lors de leur passage le long dela membrane sur laquelle des anticorps monoclonalspécifiques des toxines TcdA et TcdB ont été immobilisésà deux endroits distincts.

Diagnostic de l’infection à Clostridium difficile (CDI)C.difficile produit deux toxines distinctes qui constituentles facteurs de virulence essentiels lors d’une infectionCDI. Des études récentes1, 2 ont démontré quechacune des deux toxines à elle seule peut induire lamaladie chez le hamster.On considère que C.difficile est responsable d’environ25% des diarrhées associées à la consommationd’antibiotiques tels que la clindamycine, lescéphalosporines de deuxième et troisième génération,les inhibiteurs de la gyrase, l’ampicilline,l’amoxicilline,... En plus des symptômes de diarrhée, lamaladie peut évoluer en colite pseudomembraneuse(PMC) qui, vu son caractère potentiellement létal,nécessite un traitement d’urgence avec desantibiotiques efficaces contre C.difficile(métronidazole / vancomycine). Le taux de mortalité

13

FR

associé à l’infection CDI varie entre 6% et 30%, surtout sile patient souffre de PMC. L’infection CDI induite par untraitement aux antibiotiques peut exiger une hospitalisationde 6 à 10 jours entraînant des coûts additionnels pouvants’élever à 6000 - 8000 euros3.

Description de C.difficile

Clostridium difficile est une bactérie anaérobie gram-positive, capable de produire des spores, et présente defaçon asymptomatique dans une proportion pouvants’élever jusqu’à 5% de la population saine. A cause deshospitalisations, la proportion de personnes porteusespeut s’élever jusqu’à 30%.Les jeunes enfants sont colonisés par C.difficile peu aprèsleur naissance mais n’ont pas, en général, tendance àévoluer vers des cas cliniques. Des études récentessuggèrent que cela peut être dû à l’absence de récepteurspour ces toxines sur les entérocytes, ou alors au fait que lepH fécal de l’enfant, différent de celui de l’adulte, bloquel’action des toxines.Comme déjà mentionné, C.difficile peut produire deuxtoxines distinctes4 :

La toxine A (TcdA) (308 kDa) est appelée entérotoxineà cause du fait qu’elle peut induire tous les symptômeschez le hamster. TcdA possède aussi une cytotoxicitéélevée, mais seulement dans le cas de cellules spécifiquesqui y sont particulièrement sensibles, comme par exemplecelui des cellules HT-295.

La toxine B (TcdB) (279 kDa), classifiée commecytotoxine, est environ 1000 fois plus puissante que latoxine A dans la majorité des cellules cultivées enlaboratoire (comme Vero, CHO, HeLa, etc.). La séquenced’acides aminés de TcdB varie en fonction des souches6.

Détection des toxines TcdA / TcdBSelon la production de ces toxines, on classe les souchesde C.difficile dans les groupes suivants:Souches non toxigènes: ne sont pas pathogènes etproduisent ni TcdA, ni TcdB ni toxine binaire.Souches A+ B+: ce sont les souches pathogènes les pluscourantes qui induisent une infection CDI, et parmilesquelles les ribotypes 001, 014 et 078 sont les plusfréquents en Europe7.Souches A- B+: ont été identifiées pour la première foisen Belgique par Depitre et al8. On les considère commeétant pathogènes malgré le fait qu’elles ne produisent pasla toxine A9. Parmi ces souches, on trouve le ribotype 017responsable de plusieurs infections endémiques enAmérique du Nord.Souches A+ B-: ces souches peuvent être identifiéesdirectement à partir de l’échantillon fécal avec le test 2A-Bdiff, le seul test sur le marché qui permet la détectionrapide, simple et séparée des toxines A et B en une seuleétape. Jusqu’à présent, peu d’exemplaires de ces souchesont été isolés. Des études récentes ont indiqué que dessouches de C.difficile à toxine TcdB ayant subi unemutation sont toujours capables d’induire une infectionCDI chez le hamster à cause de la production de Toxine

A2. Ces résultats indiquent la présence de ces souchesdans des échantillons cliniques.

PRINCIPES DE BASE DU TESTLe test 2A-Bdiff utilise un mélange:1) de particules de latex rouges conjuguées à unanticorps spécifique à la toxine A qui coopère avec unautre anticorps spécifique à la toxine A et situé sur lamembrane, en dessous de la bande de contrôle.2) d’autres particules de latex rouges conjuguées à unanticorps spécifique à la toxine B qui coopère avec unautre anticorps spécifique à la toxine B et situé sur lamembrane, au dessus de la bande de contrôle.3) et de particules de latex bleues conjuguées à unantigène reconnu par un anticorps spécifique à cemême antigène et fixé sur la membrane pour former labande de contrôle du test.Lors du déroulement du test, l’échantillon est traité toutd’abord avec un tampon de dilution d’échantillon(inclus dans le kit) pour extraire les toxines desmatières fécales. Après l’extraction, une partie dusurnageant est déposée sur la membrane du test et laréaction se déroule en 15 minutes.Lorsque l’extrait d’échantillon passe au travers de lamembrane du test, les particules colorées migrent.Dans le cas d’un échantillon positif, les anticorpsspécifiques fixés au préalable sur la membranecapturent les particules colorées couvertes parl’antigène.Différentes lignes colorées seront visibles en fonctiondes toxines présentes dans l’échantillon. On utilise ceslignes pour interpréter le résultat après incubation de15 minutes à température ambiante (voir Fig.1).

FORMATS DU TESTLe test 2A-Bdiff est disponible dans deux formatsdifférents:

- Format Stick (bandelette): la bandelette réactiveest conditionnée dans une enveloppe en aluminium oucontenu dans un tube en plastique de 25 unités. Poureffectuer le test, on dépose l’extrait d’échantillon dansun tube (inclus dans le kit) ou dans un puits de une 96-puits microplaque à fond plat.

- Format Simple (cassette): la bandelette réactive setrouve à l’intérieur d’un dispositif «cassette» enplastique. On ajoute directement l’extrait d’échantillondans la fenêtre du dispositif indiquée par une flèche.Les deux formats donnent des résultats identiques,l’unique différence étant la manière d’effectuer le test(voir plus bas les paragraphes correspondants dans lasection “Procédure”).

MATÉRIEL INCLUS DANS LE KIT▪ Dispositifs de réaction (cassette ou bandelette).

14

▪ Tampon de dilution d’échantillon. Le tampon diluant de l'échantillon est la même que pour le produit Simple/Stick GDH. ▪ Pipettes en plastic jetables non graduées (jaunes).

BIOSIGMA S.r.l.Via Valletta, 6 – Zona Ind. Cantarana30010 - Cona (VE) - ITALY

▪ Pipettes en plastic jetables graduées.▪ Applicateurs en bois pour la prise d’échantillons solides.▪ Micro-tubes de 1,5 ml en plastique avec capuchon.▪ Tubes à essai.▪ Supports pour maintenir lesdits tubes à essais en position stable et verticale.

MATÉRIEL NON INCLUS DANS LE KIT

▪ Centrifugeuse adaptée aux micro-tubes de 1,5 ml▪ Vortex▪ ChronomètreIl existe des contrôles disponibles pour l'utilisateur afin devalider les résultats obtenus. Ces contrôles peuvent êtreacquis en tant que référence commerciale indépendante.

PRÉCAUTIONS

1. Les échantillons des patients (selles) doivent êtremanipulés avec précaution car ils peuvent renfermer desagents infectieux. Il convient d’utiliser des protectionsnécessaires (gants jetables, lunettes protectrices, blouse delaboratoire et d'autres ) tout au long de la procédure.

2. Le tampon de dilution de l’échantillon contient del’azoture de sodium comme agent antimicrobien. Éviter lecontact direct avec la peau et les muqueuses. Jeter defaçon appropriée. Ne pas utiliser le tampon s’il présentedes signes de contamination ou de précipité.3. Ne pas boire, ni manger, ni fumer, ni préparerd’aliments à proximité de l’endroit où les réactifs et leséchantillons sont manipulés.

4. Une fois le travail terminé, jeter les gants et se laver lesmains d’abord avec un désinfectant alcoolique et ensuiteavec du savon. Et pour terminer, décontaminer l’évier avecun désinfectant sporicide car les spores de C.difficile nesont pas éliminées par l’alcool.

5. Ne pas échanger les éléments de différents kits dont lesnuméros de lot ne sont pas les mêmes.

6. En cas de stockage du test réfrigéré, attendre que tousles éléments du kit et les échantillons fécaux atteignent latempérature ambiante, étant donné que des réactifs et/oudes échantillons froids peuvent réduire l’efficacité du test.Il est conseillé d’attendre 20 à 30 minutes pour atteindrela température ambiante.7. Utiliser tous les réactifs uniquement in vitro.

8. Ne pas utiliser les éléments du kit après la date depéremption.

9. En cas de rupture de l'emballage primaire(aluminium ou flacon), le produit ne doit pas être utilisémême si aucun des composants n'a été endommagé. 10. Dans le cas du format Simple (cassette), il est trèsimportant d’ajouter le volume exact d’extraitd’échantillon au dispositif de réaction. Si ce volume estinférieur à celui indiqué, il se peut que lachromatographie ne se déroule pas correctementparce qu’une quantité insuffisante d’échantillonparvient à la zone de réaction. Si le volume estsupérieur, des lignes brunes peuvent apparaître à laplace des lignes rouges et bleues.

11. Après utilisation, les réactifs doivent être éliminésconformément à la législation en vigueur.12. Ne pas utiliser le test si une quelconque lignecolorée apparaît dans la zone de résultats avant sonutilisation.

13. Il est très important d’utiliser la quantité adéquated’échantillon: environ 75 mg dans le casd’échantillons solides (une petite boule d’environ 3mm de diamètre) ou 75 µl dans le cas d’échantillonsliquides ou semi-liquides; ces quantités sont extraitesdans 1 ml de diluant d’échantillon inclus dans le kit. Sil’on utilise une plus grande quantité d’échantillon, ilsuffit alors de maintenir la proportion de 75 mg (ou 75µl) d’échantillon pour 1 ml de diluant d’échantillon.Une quantité excessive d’échantillon par rapport à laquantité de tampon ajoutée entrave le bondéroulement de la chromatographie; ceci estparticulièrement critique dans le cas d’échantillonssolides car il est moins facile de prélever une quantitédéfinie. Il convient de garder à l’esprit que le test 2A-Bdiff a été conçu pour l’analyse d’échantillons liquideset semi-liquides.

14. Pour les tests «bandelettes» conditionnés en tube, ilest très important de refermer celui-ci immédiatementaprès en avoir extrait une bandelette car une humiditéambiante importante pourrait endommager le restedes bandelettes à l’intérieur du tube.15. Ne jetez pas la boîte externe du kit jusqu'à ce queson contenu ait été totalement utilisé. La boîte externecontient des informations essentielles concernant lemarquage CE et les lots de composants.

CONSERVATIONLe test peut être conservé à une température compriseentre 2ºC et 30ºC.La date de péremption est imprimée sur les tubes ousur les sachets en aluminium.

ÉCHANTILLONS▪ Ce test a été conçu pour l’analyse d’échantillons dematières fécales liquides ou semi-liquides; il estcependant possible d’analyser des échantillons solides,bien que ce ne soit pas le cas le plus courant étant

15

donné que la diarrhée est un symptôme inhérent àl’infection à C.difficile.▪ Ne pas utiliser d’échantillons qui ont été prélevés dansles milieux de transport, ou auxquels on a ajouté desagents de conservation (tels que le formaldéhyde, le milieuSAF, PVA ou d’autres du même type) ou des milieuxenrichis étant donné que leur présence pourrait entraver lebon déroulement du test.▪ Il est conseillé d’analyser des échantillons frais nontraités. Il est malgré tout possible, de conserver leséchantillons de selles au réfrigérateur (+ 2°C à + 8 º C)pendant 1 ou 2 jours. Pour les périodes plus longues, il estnécessaire de les congeler à -20ºC, tout en gardant àl’esprit que certains échantillons deviennent négatifs aprèsavoir été congelés.▪ Faire attention pour l'analyse des échantillonshémorragiques qui donnent souvent des problèmes denon-spécificité lorsque la teneur en sang est élevée. Uneindication de ce manque de stabilité du test se traduitgénéralement par la coloration bleue de la bande decontrôle (tendance violet ou bleu très foncé).▪ Dans le cas d’échantillons congelés, attendre leur dégelcomplet à température ambiante avant de procéder à leuranalyse.▪ Éviter les cycles de congélation et de décongélation deséchantillons fécaux car de tels cycles peuventendommager l’intégrité des toxines.

PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS FÉCAUXRemarque générale: il est recommandé d'utiliserprotections appropriées pendant toute la durée du test àcause du maniement d’échantillons infectieux. Une fois letravail terminé, suivre les précautions d’hygiène indiquéesau point 4 de la section “Précautions”.Le tampon diluant de l'échantillon est la même que pour leproduit Simple/Stick GDH. Le protocole de préparation des échantillons fécaux estidentique pour les formats Stick (bandelette) et Simple(savonnette):1. Pour les selles liquides ou semi-liquides, ajouter 3gouttes (ou 75 µl) d’échantillon dans un micro-tube de1,5 ml à l’aide de la pipette jetable non graduée (jaune).Pour les échantillons solides, prélever environ 75 mg (unepetite boule d’environ 3 mm de diamètre) avecl’applicateur en bois, et les transférer dans un micro-tubede 1,5 ml étiqueté.IMPORTANT: Homogénéiser l’échantillon tout enprélevant de la matière fécale en trois endroits différentsafin d’obtenir un échantillon le plus représentatif possible.2. Ajouter ensuite 1 ml de diluant d’échantillon au micro-tube de 1,5 ml (ou le volume approprié pour garder lamême proportion de 75 µl (ou 75 mg) d’échantillon pour1 ml de tampon de dilution).3. Agiter au vortex pendant 30 secondes ou durant letemps nécessaire pour s’assurer que la totalité del’échantillon soit remis en suspension dans le tampon.

4. Centrifuger les micro-tubes de 1,5 ml pendant 5minutes à 700 g (environ 3000 rpm) dans une petitecentrifugeuse adaptée à ces micro-tubes afin desédimenter les particules solides. Si l’on ne dispose pasd’une centrifugeuse adéquate, attendre 3 à 5 minutesjusqu’à ce que les particules solides se soient déposéesau fond du tube. Cependant, le test fonctionne defaçon optimale lorsqu’on utilise une solution claireobtenue par centrifugation de l’extrait d’échantillon.

PROCÉDURE SIMPLE 2A-Bdiff (test en cassette)Une fois les échantillons préparés comme indiqué auxparagraphes précédents, on procède de la manièresuivante:- Sortir la cassette de l’enveloppe aluminium. Jeter lesachet dessiccateur étant donné que celui-ci ne sertqu’ à préserver le test de l’humidité.- Prélever du surnageant de l’échantillon centrifugéavec une pipette jetable jaune (fournie) et ajouter 4gouttes (ou 100 µl) dans la zone du dispositif deréaction prévue pour accueillir l’échantillon (fenêtrecirculaire indiquée par une flèche).- Attendre exactement 15 minutes avant de lire etd’interpréter le résultat.

PROCÉDURE STICK 2A-Bdiff (test en bandelette)Une fois les échantillons préparés comme indiqué auxparagraphes précédents, on procède de la manièresuivante:- Sortir la bandelette immunochromatographique del’enveloppe en aluminium ou du tube protecteur(refermer celui-ci immédiatement afin d’éviter lesaltérations dues à l’humidité de l’air).- Si on utilise un tube à essai inclus dans le kit,introduire celui-ci dans le support également inclusdans le kit. Prélever 265 µl (quatre graduations de lapipette jetable graduée) de surnageant de l’échantilloncentrifugé, et transférer ce volume dans le tube à essai.- Si on utilise une micro-plaque 96 puits, déposer danschaque puits environ 150 µl (trois graduations de lapipette jetable graduée) de surnageant de l’échantilloncentrifugé.- Introduire la bandelette immunochromatographiquedans le tube à essai (maintenu dans le support) oudans un puits de la micro-plaque en veillant à ce queles flèches soient orientées vers le bas.- Incuber et lire le résultat après exactement 15 minutesdans la zone centrale blanche de la bandelette (voirFig. 1).

LECTURE DES RÉSULTATSLes cinq bandelettes montrées à la Fig. 1 illustrent lesdifférents cas possibles de résultats que l’on peutobtenir avec le test 2A-Bdiff.On distingue trois bandes colorées différentes:

16

Bande bleue: (au centre) constitue la bande decontrôle qui indique que le test a bien fonctionné.

Bande rouge supérieure: indique la présence de Toxine B TcdB dans l’échantillon.

Bande rouge inférieure: indique la présence de ToxineA TcdA dans l’échantillon.La bande bleue de contrôle doit toujours apparaître. Laprésence additionnelle de l’une ou l’autre bande rougeindique la présence d’une souche de C.difficile produisantTcdA et/ou TcdB dans l’échantillon analysé.Bandelette 1: résultat NÉGATIF: l’échantillon ne contientpas C.difficile, ou alors il contient une souche qui neproduit ni TcdA ni TcdB. Il apparaît uniquement une lignetransversale BLEUE dans la zone centrale du dispositif deréaction (alignée, dans le format Simple «savonnette»,avec la lettre “C” indiquée sur le dispositif). Cette bandereprésente la bande de contrôle et doit toujours êtreprésente vu qu’elle indique que la chromatographie s’estdéroulée correctement.

Fig. 1 : Différents cas possibles de résultats. Ces derniers sontindiqués juste en dessous des bandelettes.

Bandelettes 2 à 4: résultats POSITIFS:Bandelette 2. Détection de TcdA: apparaissent à la foisune bande BLEUE (contrôle) et une bande ROUGE justeen dessous de la bande de contrôle (alignée, dans leformat Simple «cassette», avec la lettre “T1” indiquée surle dispositif). L’intensité dépend de la concentration entoxine A dans l’échantillon.Bandelette 3. Détection de TcdB: apparaissent à la foisune bande BLEUE (contrôle) et une bande ROUGE justeau dessus de la bande de contrôle (alignée, dans leformat Simple «cassette», avec la lettre “T2” indiquée surle dispositif). L’intensité dépend de la concentration entoxine B dans l’échantillon.Bandelette 4. Détection de TcdA et TcdB: apparaissent à lafois une bande BLEUE (contrôle) et deux bandes ROUGES

(l’une au dessus (TcdB) et l’autre en dessous (TcdA) dela bande de contrôle).Bandelette 5: résultat INVALIDE: aucune bande decontrôle bleue n’apparaît, la couleur bleue de labande est nettement altérée (bleu très foncé ou violet)ou des couleurs non spécifiques apparaissent à laplace des bandes positives (autres que le rouge). Engénéral, toute combinaison de couleur différente decelles indiquées sur les bandes 1 à 4 indique uneperformance de test anormal. Les causes possiblessont:- certains réactifs se sont détériorés, ou alors la date depéremption du test est dépassée.- l’échantillon n’a pas été préparé comme indiquédans le mode d’emploi.- l'échantillon a une teneur élevée en sang. Dans le cas de résultat invalide, il est conseillé derecommencer le test avec un nouveau test en suivantstrictement le mode d’emploi décrit dans ce manuel.En cas d’échantillons contenant du de sang, Il estrecommandé d’utiliser une technique alternative, leproblème de stabilité ne dépendant pas en général dutest employé mais de la matrice de l'échantillon.D'autres essais rapides commerciaux ont donné desrésultats similaires avec ces échantillons. Toute ligne apparaissant après 15 minutes de réactionn’a pas de valeur diagnostique.REMARQUE: Le diagnostic final et définitif concernantune infection à Clostridium difficile CDI ou une colitepseudomembraneuse CPM doit être établi par lemédecin. Ce test ne fait que détecter les toxines TcdA /TcdB dans un échantillon, mais ne constitue pas undiagnostic absolu pour affirmer que le patient souffred’une infection à Clostridium difficile CDI.

AVERTISSEMENT : il est recommandé d'effectuer noscontrôles avec un résultat connu pour s'assurer que lesdonnées obtenues sont correctes.

LIMITES DE LA PROCÉDURE1. Le test 2A-Bdiff analyse des selles humaines deconsistance liquide ou semi-liquide; l’analysed’échantillons solides est toutefois possible, bien quele test n’ait pas été optimisé pour cela, car danscertains cas isolés des phénomènes de séquestrationdes toxines ont été observés pour ce type de matricesolide.

2. Ce test est qualitatif, et non quantitatif, bien quel’intensité des bandes positives soit fonction de laquantité de toxines présente dans l’échantillon fécal.

3. Plus de 200 échantillons fécaux ont été testés pourvérifier les performances du test. On a observé unebonne corrélation avec d’autres techniques (ELISA etCytotoxicité). Cette étude n’exclut pas pour autant lapossibilité d’interférences avec le test lors de l’analysed’autres échantillons fécaux.

17

4. Une prise d’échantillon en quantité insuffisante peutentraîner des résultats très faiblement positifs. Dans cecas, il convient de recommencer le test avec une plusgrande quantité d’échantillon tout en veillant à maintenirla proportion conseillée par rapport au volume du diluantd’échantillon (voir section “Préparation des échantillons”).5. Un échantillon trop important peut entraîner uneréponse du test très lente, voir même masquer entièrementla réponse (ligne de contrôle invisible). Dans ce cas, il fautrecommencer le test avec une quantité d’échantillonmoindre. Faire particulièrement attention à ce point lorsde l’analyse d’échantillons solides.

6. Un résultat négatif n’exclut pas totalement la possibilitéd’une infection à C.difficile (CDI). Le résultat du test doitêtre interprété en tenant compte du contexte clinique dupatient. De plus, les toxines sont des molécules fragiles quipeuvent facilement se dégrader suite, par exemple, à uneconservation inadéquate de l’échantillon ou à la présenced’inhibiteurs, de sorte que la concentration des toxines soiten deçà du seuil de détection du test (voir section“Sensibilité Analytique”).

7. Un résultat positif obtenu pour un échantillon solidedoit être interprété avec beaucoup de précaution. Ladiarrhée est, en principe, un symptôme inhérent àl’infection à C.difficile (CDI), et un échantillon solideimplique l’absence de diarrhée. Le Biologiste doit fournirau médecin les informations sur la nature de l’échantillon,permettant, selon l’historique clinique du patient, d’établirun diagnostic le plus précis possible.

8. On a observé une certaine réactivité croisée avec deséchantillons fécaux fortement positifs pour Entamoebahistolytica. Cela ne se produit cependant pas lors del’analyse d’un extrait pur de ce parasite, sans matrice fécale. D’autres tests rapides disponibles sur le marché, etles tests ELISA, ont donné des résultats similaires avec ceséchantillons. 9. Il a été constaté que les échantillons fécaux avec uneteneur élevée en sang interfèrent négativement dans le test,des problèmes de non spécificité peuvent apparaître avecdes échantillons négatifs pour le C.difficile. Ce manque destabilité du test est souvent accompagnée d'une altérationde la couleur de la bande de contrôle qui apparaît bleuefoncée ou violette au lieu de bleue claire (voir les imagesdans "Lecture des Résultats").

10. Des taux de colonisation de C.difficile atteignant 50 %ont été décrits chez les enfants. Des taux de colonisationélevés ont également été observés chez les patients atteintsde fibrose kystique (mucoviscidose). Normalement, cesdeux groupes de patients demeurent asymptomatiques et,comme tels, ne requièrent aucun traitement spécifique. Ilfaut accorder une attention particulière à ces résultatspositifs sans signification clinique étant donné que lespatients affectés ne nécessitent pas de traitement contreC.difficile.

SENSIBILITÉ ANALYTIQUEPour déterminer la sensibilité du test 2A-Bdiff, lestoxines A et B provenant de tgc BIOMICs ont étédiluées dans le tampon de dilution spécifique du test2A-Bdiff atteignant des niveaux d'environ 0,75 ng / mlpour les deux toxines.

SENSIBILITÉ ET SPÉCIFICITÉ DIAGNOSTIQUELa moyenne des résultats de toutes les évaluationsréalisées avec le test 2A-Bdiff, les valeurs moyennes desensibilité et de spécificité pour l'ensemble de test sont:

Sensibilité: 97,4 %Spécificité: 96, %

Le test 2A-Bdiff présente un excellent comportementavec des valeurs de sensibilité et de spécificitésupérieures à 95%.

Ensuite sont inclues deux évaluations réalisée avec letest:

A.- Évaluation Externe:Le test 2A-Bdiff de Operon a été évaluée dans unhôpital espagnol par la mesure d'un total de 150échantillons négatifs et 44 échantillons positifs selon latechnique de référence, la Cytotoxicité. Tous leséchantillons étaient frais. Les résultats obtenus étaient:

Sensibilité: 42 / (42 + 0) > 92,5%Spécificité: 70 / (70 + 3) = 95,5%

B.- Évaluation Interne:Le test 2A-Bdiff est évaluée en interne par la mesured'un total de 242 échantillons négatifs et 105échantillons positifs selon la Cytotoxicité développédans le lieu d'origine des échantillons (différentshôpitaux espagnols). Tous les échantillons analysés ontété gelés.Les résultats obtenus sont les suivants:

Sensibilité: 99.0%Spécificité: 96.3%

REPETIBILITEDes courbes de sensibilité ont été préparées avec lestoxines A et B pures afin de déterminer la sensibilité dutest dans diverses conditions. Chaque dilution ½ faisantpartie de la courbe a été analysée en trois répétitions,au cours d’une seule session par une seule et mêmepersonne. La variation maximale des résultats obtenusavec le test 2A-Bdiff a été d’une seule dilution 1/2, cequi reflète une grande précision intra-essai.

REPRODUCTIBILITÉ

PRÉCISION INTER-JOURS

18

La courbe de sensibilité susmentionnée a été analyséedurant quatre jours espacés dans le temps, et ce enutilisant le même lot du test 2A-Bdiff. Les résultats ont ététrès reproductibles (une sensibilité identique a été obtenuepour les quatre jours de mesure tant pour TcdA commepour TcdB).

PRÉCISION INTER-OPÉRATEURSCinq personnes sans entraînement préalable ont mesuré,en deux répétitions, la courbe de sensibilité des deuxtoxines pures. Les différences, observées pour les dilutionsles plus fortes de la courbe (réponses les plus ténues), ontété au plus d’une seule dilution ½.

PRÉCISION INTER-LOTSLa courbe de sensibilité de chacune des deux toxines puresà été analysée en deux répétitions avec trois lots différentsdu test 2A-Bdiff. L’analyse a été effectuée par une seulepersonne au cours de la même journée. Les différencesn’ont jamais dépassé une seule dilution ½, ce qui estacceptable et tolérable pour l’essai en question.

Les différences mentionnées dans les sections concernantla précision sont acceptables dans le cadre d’une

technique immunochromatographique qualitative avec unevariabilité inhérente à celle-ci.

EFFET DE HOOKPlusieurs publications indiquent que dans le cas desinfections les plus graves à C.difficile, la plus forteconcentration de toxines trouvées dans les selles estd'environ 112 ng/ml10. Pour évaluer l'effet d'une très forteconcentration de toxines (valeurs bien supérieures à cellesque l'on peut trouver parmi la population touchée par leCDI), des concentrations de toxines A et B jusqu'à 5000ng/ml ont été mesurées avec le test 2A-Bdiff. Cetteconcentration est d'environ 400 fois le test de LPC pour latoxine A (12,5 ng/ml) et environ 1500 fois le test de LPCpour la toxine B (3 ng/ml). Aucune diminution de l'intensitédes signaux positifs n’a été observée. SUBSTANCES INTERFERENTESLes substances indiquées dans le tableau ci-dessous, à laconcentration spécifiée, n’ont pas interféré avec les résultatsdu test après ajout à des échantillons de selles (positifs etnégatifs).

Racecadotrile 5% (p/v) Ibuprofène 20% (p/v)

Cimétidine 10% (p/v) Ac. Acetylsalicylique 30% (p/v)

Loperamide 5% (p/v) Edulcorant 5% (p/v)

Metronidazole 10% (p/v) Ac. palmitique 40% (p/v)

Omeprazole 3% (p/v) Sulfate de Baryum 5% (p/v)

Ampicilline 15% (p/v) Mucine 5% (p/v)

RÉACTION CROISÉE AVEC D’AUTRES MICROORGANISMESCette étude a été menée dans deux centres différents:

▪ OPERON: L'essai 2A-bdiff a été testé contre les sellesfortement positive pour les micro-organismes suivants: Adenovirus - Rotavirus - Norovirus - Astrovirus -Helicobacter pylori - Entamoeba histolytica - Giardialamblia - Cryptosporidium parvu.

Certains réactivité croisée n'a été observée avecfortement positive pour Entamoeba histolyticaéchantillons fécaux (voir le point 8 «Limites de laméthode").

▪ CENTRE HOSPITALIER NATIONAL (Espagne): le test2A-Bdiff a été testé avec différentes bactériessusceptibles d’être présentes à certains moments dansles intestins à une concentration suffisamment élevée.Les analyses ont été réalisées sur des suspensions debactéries à une concentration de 108 ufc/ml. Le test 2A-Bdiff n’a présenté de réactivité croisée avec aucune desbactéries citées ci-dessous:Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila, Bacilluscereus, Bacillus spp, Bacteroides nordii, Campylobacterjejuni, Candida albicans, Clostridium butyricum,Clostridium cadaveris, Clostridium perfringens,Clostridium sordellii, Enterobacter aerogenes,Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis,Enterococcus faecium, Escherichia coli 1, Escherichiacoli 2, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus gosseri,Listeria monocitogenes, Plesiomonas shigelloides,Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonellaenteriditis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium,Serratia marcescens, Shigella dysenterie, Shigellaflexnerii, Shigella sonneii, Staphylococcus aureus,Staphylococcus epidermidis, Vibrio cholerae, Vibrioparahaemolyticus, Yersinia enterocolitica.

19