Estandarización de método de degradación de BTEX a partir ...
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Estandarización de método de degradación de BTEX a partir de interacción entre Bacillus Subtilis W.J. Ruiz Ávila a a Pregrado en Ingeniería Ambiental, Universidad de los Andes, Colombia. Abstract Por medio de experimentación se buscó generar la estandarización del método de degradación de BTEX con microorganismos. Se utilizó la especie Bacillus subtilis y se estableció como metodo de medición la cromatografía de gases. El cromatógrafo tiene diferentes maneras de extraer los hidrocarburos de la muestra, sin embargo se exponen dos: extracción purga-trampa y micro-extracción en fase sólida (SPME). Para el montaje de la extracción purga-trampa se decide utilizar medio Bushnell Haas y se prepara 450mL mezclados con 50mL de Bacillus subtilis en medio nutritivo BHI y 500ppm de gasolina comercial; el montaje para la micro-extracción en fase sólida se diferencia en que se utiliza el consorcio Bacillus subtilis, Enterobacter sp, Serratia fonticola y Pseudomonas fragi. Durante la medición se demostró la dificultad de medición para el método de extracción purga-trampa mediante un análisis estadístico que permitió encontrar diferencias a lo largo del tiempo de degradación, especialmente irregularidades en la degradación de alguno de los hidrocarburos. Para el caso de la medición con el método de micro-extracción se corroboró de una mejor manera la replicabilidad de los datos también con análisis estadístico, pero no se evidenció significativamente la degradación de los hidrocarburos, a lo cual se le atribuye la competitividad creada en el consorcio. Finalmente se evalúa el experimento como tal y se dejan estipuladas varias recomendaciones para mejorar el desarrollo de los procesos descritos en el documento. Palabras clave: BTEX; Degradación; Bacillus subtilis; Consorcio; Cromatografía de Gases; SPME; Purga- trampa; Estandarización; Anova; Boxplot 1. Introducción La gasolina está entre las claras fracciones líquidas del petróleo y consiste principalmente de hidrocarburos alifáticos y aromáticos. Entre los hidrocarburos alifáticos se encuentran los alcanos, alquenos y alquinos, sin embargo, la extensión del documento está centrada en los hidrocarburos aromáticos; basados en anillos bencénicos como unidad estructural que incluyen hidrocarburos monocíclicos como el benceno, tolueno, etilbenceno y los isómeros meta, orto y para- xileno (grupo BTEX). El porcentaje de estos compuestos en la gasolina es considerablemente alto en comparación con otro tipo de combustibles como el diésel, es por esto que se utilizan concentraciones de BTEX para detectar contaminación con gasolina [1]. Adicionalmente, estos compuestos han sido considerados como los mayores contribuidores en el deterioro de la calidad del agua y el aire, contando también con el efecto perjudicial que tienen estos compuestos en organismos vivos, la mayoría de los gobiernos han implementado estándares de calidad estrictos. Consecuentemente, hay una necesidad urgente por el desarrollo de eficientes tecnologías que sean capaces de eliminar o minimizar las concentraciones de manera tal que se reduzca el efecto perjudicial prescrito [2]. En los últimos años se ha evidenciado un método que implica la eliminación de hidrocarburos aromáticos monocíclicos que consiste en la biodegradación a partir de microorganismos [3]. BTEX son altamente receptivos a interacciones microbianas y la degradación ocurre en condiciones aerobias [4- 5]. Dentro del proceso de degradación se busca transformar el compuesto en un producto que resulte menos perjudicial tal como el catecol, para realizarse esta reacción interviene la bacteria y con ayuda de un plasmido o enzima propia genera el consumo y presión necesaria para oxidar el grupo metil y eventualmente las transformaciones necesarias para generar el producto benigno [6]. Particularmente, se ha encontrado que la familia Bacillus sp. tiene las caracteristicas bioquimicas necesarias para realizar el proceso de biodegradación [7-13], y de esta especie se ha
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Estandarización de método de degradación de BTEX a
partir de interacción entre Bacillus Subtilis
W.J. Ruiz Ávilaa
aPregrado en Ingeniería Ambiental, Universidad de los Andes, Colombia.
Abstract
Por medio de experimentación se buscó generar la estandarización del método de degradación de BTEX con
microorganismos. Se utilizó la especie Bacillus subtilis y se estableció como metodo de medición la
cromatografía de gases. El cromatógrafo tiene diferentes maneras de extraer los hidrocarburos de la muestra, sin
embargo se exponen dos: extracción purga-trampa y micro-extracción en fase sólida (SPME). Para el montaje de
la extracción purga-trampa se decide utilizar medio Bushnell Haas y se prepara 450mL mezclados con 50mL de
Bacillus subtilis en medio nutritivo BHI y 500ppm de gasolina comercial; el montaje para la micro-extracción en
fase sólida se diferencia en que se utiliza el consorcio Bacillus subtilis, Enterobacter sp, Serratia fonticola y
Pseudomonas fragi. Durante la medición se demostró la dificultad de medición para el método de extracción
purga-trampa mediante un análisis estadístico que permitió encontrar diferencias a lo largo del tiempo de
degradación, especialmente irregularidades en la degradación de alguno de los hidrocarburos. Para el caso de la
medición con el método de micro-extracción se corroboró de una mejor manera la replicabilidad de los datos
también con análisis estadístico, pero no se evidenció significativamente la degradación de los hidrocarburos, a
lo cual se le atribuye la competitividad creada en el consorcio. Finalmente se evalúa el experimento como tal y
se dejan estipuladas varias recomendaciones para mejorar el desarrollo de los procesos descritos en el
documento.
Palabras clave: BTEX; Degradación; Bacillus subtilis; Consorcio; Cromatografía de Gases; SPME; Purga-
trampa; Estandarización; Anova; Boxplot
1. Introducción
La gasolina está entre las claras fracciones
líquidas del petróleo y consiste principalmente de
hidrocarburos alifáticos y aromáticos. Entre los
hidrocarburos alifáticos se encuentran los alcanos,
alquenos y alquinos, sin embargo, la extensión del
documento está centrada en los hidrocarburos
aromáticos; basados en anillos bencénicos como
unidad estructural que incluyen hidrocarburos
monocíclicos como el benceno, tolueno,
etilbenceno y los isómeros meta, orto y para-
xileno (grupo BTEX). El porcentaje de estos
compuestos en la gasolina es considerablemente
alto en comparación con otro tipo de combustibles
como el diésel, es por esto que se utilizan
concentraciones de BTEX para detectar
contaminación con gasolina [1]. Adicionalmente,
estos compuestos han sido considerados como los
mayores contribuidores en el deterioro de la
calidad del agua y el aire, contando también con el
efecto perjudicial que tienen estos compuestos en
organismos vivos, la mayoría de los gobiernos han
implementado estándares de calidad estrictos.
Consecuentemente, hay una necesidad urgente por
el desarrollo de eficientes tecnologías que sean
capaces de eliminar o minimizar las
concentraciones de manera tal que se reduzca el
efecto perjudicial prescrito [2]. En los últimos
años se ha evidenciado un método que implica la
eliminación de hidrocarburos aromáticos
monocíclicos que consiste en la biodegradación a
partir de microorganismos [3]. BTEX son
altamente receptivos a interacciones microbianas y
la degradación ocurre en condiciones aerobias [4-
5]. Dentro del proceso de degradación se busca
transformar el compuesto en un producto que
resulte menos perjudicial tal como el catecol, para
realizarse esta reacción interviene la bacteria y con
ayuda de un plasmido o enzima propia genera el
consumo y presión necesaria para oxidar el grupo
metil y eventualmente las transformaciones
necesarias para generar el producto benigno [6].
Particularmente, se ha encontrado que la familia
Bacillus sp. tiene las caracteristicas bioquimicas
necesarias para realizar el proceso de
biodegradación [7-13], y de esta especie se ha
encontrado la habilidad de producir surfactantes
que permitan aumentar la solubilización de
diferentes compuestos [14]. En este estudio se
analizará el método de degradación más
conveniente y la estandarización del método para
futuros estudios.
2. Materiales y metodología
2.1. Microorganismos
Para el desarrollo de este documento se
utilizó la especie Bacillus subtilis proveniente de
humedales artificiales, y posteriormente
almacenado mediante congelación en el
Laboratorio de Ingeniería Ambiental de la
Universidad de Los Andes, Colombia [15].
2.2. Crecimiento
Los microorganismos fueron
descongelados por 24 horas y sembrados en
medio agar de soya tríptica (TSA) que ayuda al
crecimiento de Bacillus subtilis. Se toman 250 uL
de microorganismo y se siembran en el medio
masivamente de forma tal que se evidencie su
crecimiento 24 horas después de incubación a
35°C [16]. Después de corroborar
cualitativamente el crecimiento del
microorganismo se dispone a fortificar y duplicar
el número de microorganismos existentes para
llevar a cabo el proceso de degradación. Para este
proceso se dispone a tomar pequeñas cantidades
con asas y sembrarlas en 16 tubos de 25 mL de
medio de infusión cerebro-corazón (BHI), el cual
provee al microorganismo los nutrientes
necesarios para su crecimiento; nitrógeno,
vitaminas y fuente de carbono [17].
2.3. Medio de Cultivo
Al mismo tiempo que se preparan los
tubos con el medio nutritivo, se dispone a
preparar el medio de cultivo que permitirá la
degradación de BTEX con ayuda de Bacillus
subtilis. Este medio es conocido como Bushnell
Haas y se ha caracterizado por tener las
propiedades adecuadas que permiten la
degradación de hidrocarburos a través del uso de
microorganismos [18-21]. Se preparan frascos de
450 mL de medio con la siguiente composición
por litro: 𝐾𝐻2𝑃𝑂4 (1.0g), 𝐾2𝐻𝑃𝑂4 (1.0g),
𝐶𝐻4𝑁2𝑂 (1.0g), 𝑀𝑔𝑆𝑂4 ∙ 7𝐻2𝑂 (0.2g), 𝐹𝑒𝐶𝑙3
(0.05g), 𝐶𝑎𝐶𝑙2 ∙ 2𝐻2𝑂 (0.08g), 500ppm de
gasolina comercial y 50 mL de microorganismo
en medio nutritivo. Para corroborar la efectividad
de los microorganismos a degradar BTEX y con
el fin de verificar que el método sea correcto, se
preparan 6 frascos: 2 de los cuales son muestras
que evaluaran degradación por contener gasolina,
medio y microorganismo. ´Los siguientes dos
contienen microorganismo y medio, los cuales
servirán de blanco para el método al suponer que
ni los microorganismos ni el medio contienen
BTEX, y finalmente dos frascos que contienen
medio y gasolina, éstos con el fin de considerar la
posible volatilización de la gasolina en el medio y
serán reconocidos a lo largo del documento como
controles. Cabe anotar que se realizan dos
muestras de cada experimento para replicar los
resultados y asimismo verificarlos.
2.4. Cuantificación de degradación
Se utilizará para la medición de BTEX el
cromatografo de gases Agilent 6890N, el cual
tiene la capacidad de tomar lo gases de la muestra
y caracterizar la cantidad de benceno, tolueno,
etilbenceno y los isómeros meta, orto y para-
xileno mediante diferentes sistemas capilares que
retienen los gases, los calienta y los cuantifica
[22]. Para la experimentación, se utilizarán tres
tiempos de medición: tiempo 0; que representa el
inicio de la degradación, y los siguientes tiempos
que son a las 24 y a las 48 horas después de
iniciada la degradación. Para aumentar el contacto
entre microorganismos y gasolina en el momento
de la degradación, durante las 48 horas se utilizo el
sistema de mezcla Thermo Scientific MaxQ 3000,
con agitación programada a 100 rpm y diámetro de
orbita de 2.54 cm [23]. El cromatógrafo tiene
diferentes maneras de extraer los hidrocarburos de
la muestra, sin embargo en este documento se
expondrán dos y se verificaran las diferencias
encontradas entre los métodos.
2.4.1. Extracción Purga-Trampa
Este método de extracción es considerado
más automático que los demás dado que la
muestra es instalada en el equipo y éste desarrolla
todo el procedimiento. La extracción tiene como
referencia EPA5030B y funciona mediante el
burbujeo de un gas inerte dentro de la muestra y
transfiere los compuestos volátiles de una fase
acuosa a una gaseosa, estos gases generados son
llevados a una columna absorbente, y cuando es
terminado el proceso de purga la columna se
calienta para luego llevar los compuestos al
cromatógrafo de gas [24]. Sin embargo, este
método tiene una restricción: la muestra no debe
contenener ninguna particula sólida; lo cual lleva
a que se elimine la biomasa de la muestra antes
de ser llevada a la extracción, por lo que se utiliza
el método a continuación descrito de separación
de fase sólida-líquida.
2.4.1.1. Filtración a Vacio
Para este método se cuenta con un
Erlenmeyer autoclavado, un sistema de embudo
Büchner, un papel filtro y una bomba que permita
la absorción del líquido dentro del Erlenmeyer.
Al iniciar el bombeo, el líquido pasa a través del
sistema mientras que las partículas sólidas son
retenidas en el papel filtro [25]. Al finalizar el
proceso se dispone la muestra totalmente líquida
a almacenamiento y posteriormente al sistema de
extracción purga-trampa.
2.4.2. Micro-Extracción en Fase Sólida
Este método difiere en el de extracción
purga-trampa en que el proceso es manual y no
requiere de una previa filtración para su
procedimento. El proceso de extracción se genera
a partir de una microfibra de 1-2 cm de longitud
que está en el interior de una aguja para su
protección. Esta aguja es inyectada en la muestra
y la microfibra es expuesta, al estar dentro de la
muestra la microfibra se comporta como una
esponja ya que absorbe todo lo que se le rodee en
el ambiente [26]. Para este proceso es necesario
calentar la muestra a 50°C por 20 mins, luego se
inyecta la fibra y se deja a exposición por 10 mins
y finalmente se retrae la fibra dentro de la jeringa
y se lleva la jeringa al cromatógrafo de gases para
la inyección y exposición de la fibra a la
columna.
Es importante aclarar que para este
método se varió el proceso de degradación dado
que se realizo un consorcio entre las siguientes
especies: Bacillus subtilis, Enterobacter sp,
Serratia fonticola y Pseudomonas fragi.
Adicionalmente, se realizó dos veces el método
de degradación pero se mantuvo la cantidad de
medio utilizado y el número de replicas y
muestras (seis en total).
2.5. Crecimiento post-degradación
Para verificar que los microorganismos se
mantuvieran vivos las 48 horas después de la
experimentación de degradación, se optó por
realizar una siembra aislada tomando en el caso
de la extracción purga-trampa parte del sólido
retirado en el papel filtro y colocado en agar TSA,
mientras que para la micro-extracción en fase
sólida se tuvo que realizar diferentes medios
selectivos para verificar cuales microorganismos
se mantuvieron y cuales no.
3. Resultados y discusión
3.1. Cuantificación con método de Extracción
Purga-Trampa
Para la cromatografía de gases se utilizó
la muestra blanco para calibrar el equipo, después
se midieron las muestras con sus replicas para
cada compuesto y se verificó que el valor
estuviera dentro de la curva de calibración. Es
preciso destacar que la mayoría de las muestras
tuvo que presentar una dilución con agua para que
los valores entraran en esta curva; ésto
evidentemente aumenta el error del experimento.
Por convención de las tablas y gráficas se define
M como muestra, MD como muestra diluida, MR
como replica de muestra, MRD como replica de
muestra diluida, C como control y CD como
control diluido, además para los tiempos de
medición se toma T0 como el tiempo inicial, 24h
como las 24 horas después y 48h como las 48h
después.
3.1.1. Benceno
Los resultados de las mediciones son
observados en la Tabla 1, sin embargo, es
necesario realizar pruebas estadísticas para
evaluar el diseño experimental; se decide dividir
los resultados en los tres tiempos, además se tiene
en cuenta la muestra control sólo para el el tiempo
inicial. Adicionalmente, se tienen en cuenta las
diluciones por muestra como un dato del mismo
tipo de población y se realiza inicialmente boxplot
para evaluar cualitativamente las poblaciones,
pero para tener una conclusión significativa se
realiza anova de un factor para cada tiempo y así
constatar la replicabilidad. En la prueba anova se
tiene estandarizada como hipótesis nula que las
medias de las diferentes poblaciones son iguales.
Tabla 1. Concentración de Benceno por muestra (ug/L)
Para el caso de los boxplots se observa
que en la Fig 1 las medianas son relativamente
diferentes y los intercuartiles tienen diferente
tamaño, lo cual genera inquietud de si las
muestras realmente son iguales, teniéndose en
cuenta que las tres muestras fueron realizadas de
la misma manera y que cada una en teoría tiene la
misma cantidad de gasolina y además todavía no
se ha presentado la degradación al ser tiempo
inicial de medición. La Fig 2 muestra una
diferencia considerable para las 24 horas de
degradación; primero en el tamaño de los
intercuartiles por la diferencia que hay entre las
diluciones y segundo en la diferencia de las
medianas ya que no son significativamente
diferentes. La Fig 3 presenta lo esperado en cuanto
al tamaño de los intercuartiles ya que al diluirse la
concentración no debe variar, sin embargo, la
diferencia de medianas entre la muestra original y
la replica son representativas, además cabe anotar
que no se consiguió tener un valor de dilución
para la replica. De igual manera, se realiza la
prueba anova para tener cuantitativamente una
aproximación estadística del método tomando las
mismas consideraciones para la realización de los
boxplots.
Fig 1. Boxplot de concentraciones de benceno por muestra en T0
Fig 2. Boxplot de concentraciones de benceno por muestra para t=24h
M MD MR MRD C CD
T0 919.22 1096.51 821.37 714.25 876.75 986.83
24h 862.63 519.09 649.87 568.82 747.98 327.69
48h 489.11 478.76 185.08 - 392.20 148.39
Fig 3. Boxplot de concentraciones de benceno por muestra para t=48h
La prueba anova con un factor separa las
poblaciones por tipo de muestras, de esta manera
se comparan las medias y se establece si existe al
menos en uno de los grupos una media diferente
de las otras. Adicionalmente, para todas las
pruebas estadísticas se asume un nivel de
significancia del 5%. Para el tiempo inicial se
observa en la Fig 4 que el p-value da por encima
de la significancia por lo que existe evidencia
estadística para no rechazar la hipótesis nula. En
el caso de la medición a las 24 horas se muestra
en la Fig 5 que el p-value es considerablemente
mayor que la significancia, de esta manera
también existe evidencia estadística para no
rechazar la hipótesis nula. Finalmente, para el
caso de medición a las 48 horas se muestra en la
Fig 6 que el p-value es considerablemente menor
que la significancia, por lo que se puede afirmar
que existe evidencia significativa para rechazar la
hipótesis nula, dando a corroborancia la
diferencia considerable que se presentaba en la
Fig 3.
Fig 4. Prueba Anova de concentraciones de Benceno por muestra para T0
Fig 5. Prueba Anova de concentraciones de Benceno por muestra para t=24h
Fig 6. Prueba Anova de concentraciones de Benceno por muestra para t=48h
Tabla 2. Porcentaje de remoción de benceno por muestra
Se destaca igualmente el rendimiento que
tuvo el microorganismo en sí para generar la
degradación. De esta forma en los tres tipos de
muestra clasificados se deduce el porcentaje de
remoción de benceno para cada intervalo de
tiempo, donde se toma como valor principal el
promedio entre muestra y dilución; desde el
tiempo inicial a las 24 horas, desde las 24 horas a
las 48 horas y finalmente desde el tiempo inicial a
las 48 horas. Se observa en la Tabla 2 que el
control en la mayoría de los casos presentó mayor
degradación que las muestras con
microorganismo, lo cual genera preocupación ya
que debe existir un error en el método utilizado.
3.1.2. Tolueno
Se realiza el mismo procedimiento
estadístico del benceno, por lo que se presentan
inicialmente los resultados en la Tabla 3.
Para el caso de los boxplots se observa
que en la Fig 7 las medianas son relativamente
diferentes y los intercuartiles tienen diferente
tamaño, lo cual genera la incognita de si las
muestras realmente son iguales a pesar de que la
muestra y la replica tienen un comportamiento
similar. La Fig 8 muestra una diferencia
considerable para las 24 horas de degradación; en
el tamaño de los intercuartiles por la diferencia
que hay entre las diluciones, sin embargo en la
diferencia de las medianas se observa que no son
considerablemente diferentes. La Fig 9 presenta lo
esperado en cuanto al tamaño de los intercuartiles
ya que al diluirse la concentración no debe variar,
sin embargo, la diferencia de medianas entre la
muestra original y la replica son representativas,
además cabe anotar que no se consiguió tener un
valor de dilución para la replica. De igual manera,
se realiza la prueba anova para tener
cuantitativamente una aproximación estadística
del método tomando las mismas consideraciones
para la realización de los boxplots.
Tabla 3. Concentración de Tolueno por muestra (ug/L)
Fig 7. Boxplot de concentraciones de Tolueno por muestra en t0
Intervalo de t Original Replica Control
0-24 31.45 20.64 42.28
24-48 29.95 69.63 49.74
0-48 51.98 75.89 70.99
Porcentaje de remoción benceno por muestra (%)
M MD MR MRD C CD
T0 1468.96 1691.95 1561.55 1327.12 1589.62 1692.16
24h 1662.50 1034.32 1304.13 1142.80 1541.42 743.86
48h 977.75 979.03 358.37 - 900.85 408.05
Fig 8. Boxplot de concentraciones de tolueno por muestra para t=24h
Fig 9 Boxplot de concentraciones de tolueno por muestra para t=48h
Al evaluar la prueba anova para los
diferentes tiempos de medición, para el tiempo
inicial se observa en la Fig 4 que el p-value se
encuentra por encima de la significancia así que
existe evidencia estadística para no rechazar la
hipótesis nula. En el caso de la medición a las 24
horas se muestra en la Fig 11 que el p-value es
mayor que la significancia, de esta manera
también existe evidencia estadística para no
rechazar la hipótesis nula. Finalmente, para el
caso de medición a las 48 horas se muestra en la
Fig 12 que el p-value es menor que la
significancia, por lo que se puede afirmar que
existe evidencia significativa para rechazar la
hipótesis nula, corroborando así la diferencia
vasta que se presentaba en la Fig 913.
Fig 10 Prueba Anova de concentraciones de Tolueno por muestra para T0
Fig 11 Prueba Anova de concentraciones de Tolueno por muestra para t=24h
Fig 12 Prueba Anova de concentraciones de Tolueno por muestra para t=48h
Tabla 4. Porcentaje de remoción de tolueno por muestra
Se destaca igualmente el rendimiento que
tuvo el microorganismo en sí para generar la
degradación de tolueno. De esta forma en los tres
tipos de muestra clasificados se deduce el
porcentaje de remoción de tolueno para cada
intervalo de tiempo, donde se toma como valor
principal el promedio entre muestra y dilución;
desde el tiempo inicial a las 24horas, desde las 24
horas a las 48 horas y finalmente desde el tiempo
inicial a las 48 horas. Se observa en la Tabla 4
que el control en este caso presentó menor
degradación que una de las muestras con
microorganismo, mientras que la original
presenta una degradación minúscula,
atribuyéndose además que una de las muestras
aumentó su concentración de tolueno en el
tiempo y luego volvió a disminuir, lo cual causa
preocupación debido a que se reitera el posible
error en el método, especialmente en la obtención
de la muestra.
3.1.3. Etilbenceno
Se realiza el mismo procedimiento
estadístico del benceno, por lo que se presentan
inicialmente los resultados en la Tabla 5.
Para el caso de los boxplots se observa
que en la Fig 13 las medianas son prácticamente
las mismas pero los intercuartiles tienen diferente
tamaño, lo cual genera la pregunta de si las
muestras realmente son iguales a pesar de la
igualdad en las medianas. La Fig 14 no muestra
una diferencia considerable para las 24 horas de
degradación; solamente en el tamaño de los
intercuartiles por la diferencia que hay entre las
diluciones, sin embargo en la diferencia de las
medianas se observa que son muy parecidas. La
Fig 15 presenta la mayor diferencia de medianas,
adicionalmente para el caso de la muestra original
el tamaño de los intercuartiles es
considerablemente alto comparado con los otros
compuestos en el mismo espacio de tiempo,
además cabe anotar que no se consiguió tener un
valor de dilución para la replica. De igual manera,
se realiza la prueba anova para tener
cuantitativamente una aproximación estadística
del método tomando las mismas consideraciones
para la realización de los boxplots.
M MD MR MRD C CD
T0 295.40 268.8 357.2 225.8 314.2 239.9
24h 382.1 170.6 315.7 213.4 378.9 116.5
48h 234.8 172.7 72.2 - 225.3 54.1 Tabla 5. Concentración de Etilbenceno por muestra (ug/L)
Intervalo de t Original Replica Control
0-24 34.56 13.89 30.36
24-48 5.35 68.64 42.72
0-48 38.05 73.00 60.12
Porcentaje de remoción tolueno por muestra (%)
Al evaluar la prueba anova para los
diferentes tiempos de medición se observa que en
el tiempo inicial la Fig 16 evidencia que el p-
value se encuentra por encima de la significancia
así que existe evidencia estadística para no
rechazar la hipótesis nula. En el caso de la
medición a las 24 horas se muestra en la Fig 17
que el p-value es mayor que la significancia, de
esta manera también existe evidencia estadística
para no rechazar la hipótesis nula. Finalmente,
para el caso de medición a las 48 horas se muestra
en la Fig 18 que el p-value es parecido a la
significancia, por lo que se puede afirmar que
existe evidencia significativa para rechazar la
hipótesis nula, corroborando así la diferencia
vasta que se presentaba en la Fig 15.
Fig 13. Boxplot de concentraciones de Etilbenceno por muestra en t0
Fig 14 Boxplot de concentraciones de Etilbenceno por muestra en t=24h
Fig 15 Boxplot de concentraciones de Etilbenceno por muestra en t=48h
Se destaca igualmente el rendimiento que
tuvo el microorganismo en sí para generar la
degradación de etilbenceno. De esta forma en los
tres tipos de muestra clasificados se deduce el
porcentaje de remoción de etilbenceno para cada
intervalo de tiempo, donde se toma como valor
principal el promedio entre muestra y dilución;
desde el tiempo inicial a las 24horas, desde las 24
horas a las 48 horas y finalmente desde el tiempo
inicial a las 48 horas. Se observa en la Tabla 6 que
el control en este caso presentó menor
degradación que una de las muestras con
microorganismo, mientras que la original
presenta una degradación minúscula,
atribuyéndose además que la mayoría de las
muestras aumentó su concentración de
etilbenceno en el tiempo y luego volvió a
disminuir, lo cual causa preocupación debido a
que se reitera el posible error en el método y en la
forma de toma de muestras. 3.1.4. MP Xileno
Los resultados son presentados en la
Tabla 7 y se realiza el mismo procedimiento que
con los compuestos anteriores.
Para el caso de los boxplots se observa
que en la Fig 19 las medianas son prácticamente
las mismas pero los intercuartiles tienen diferente
tamaño, lo cual genera la duda de si las muestras
realmente son iguales a pesar de la igualdad en
las medianas. La Fig 20 no muestra una diferencia
considerable para las 24 horas de degradación;
solamente en el tamaño de los intercuartiles por la
diferencia que hay entre las diluciones, sin
embargo en la diferencia de las medianas se
aprecia que son parecidas. La Fig 21 presenta la
mayor diferencia de medianas.
Fig 16. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno por muestra para T0
Fig 17. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno por muestra para t=24h
Fig 18. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno por muestra para t=48h
Intervalo de t Original Replica Control
0-24 2.03 9.24 10.60
24-48 26.28 72.72 43.60
0-48 27.78 75.24 49.58
Porcentaje de remoción etilbenceno por muestra (%)
Tabla 6. Porcentaje de remoción de etilbenceno por muestra
Fig 19. Boxplot de concentraciones de MP Xileno por muestra en t0
Fig 20 Boxplot de concentraciones de MP Xileno por muestra en t= 24h
M MD MR MRD C CD
T0 1207.53 1139.8 1444.1 1009.9 1267.1 1019.4
24h 1537.6 777.6 1267.6 928.6 1508.3 570.4
48h 999.2 819.1 346.2 - 1010.2 320.9
Tabla 7. Concentración de MP Xileno por muestra (ug/L)
Fig 21. Boxplot de concentraciones de MP Xileno por muestra en t= 48h
Al evaluar la prueba anova para los
diferentes tiempos de medición se observa que en
el tiempo inicial la Fig 16 evidencia que el p-
value se encuentra por encima de la significancia
así que existe evidencia estadística para no
rechazar la hipótesis nula. En el caso de la
medición a las 24 horas se muestra en la Fig 17
que el p-value es mayor que la significancia, de
esta manera también existe evidencia estadística
para no rechazar la hipótesis nula. Finalmente,
para el caso de medición a las 48 horas se muestra
en la Fig 18 que el p-value es parecido a la
significancia, por lo que se puede afirmar que
existe evidencia significativa para rechazar la
hipótesis nula, corroborando así la diferencia
vasta que se presentaba en la Fig 15.
Fig 22. Prueba Anova de concentraciones de MP Xileno por muestra para T0
Fig 23. Prueba Anova de concentraciones de MP Xileno por muestra para t=24h
Fig 24. Prueba Anova de concentraciones de MP Xileno por muestra para t=48h
Porcentaje de remoción MP Xileno por muestra (%)
Intervalo de t Original Replica Control
0-24 31.78 8.06 9.09
24-48 -16.93 62.72 35.96
0-48 20.23 65.72 41.78 Tabla 8. Porcentaje de remoción de MP Xileno por muestra
Se destaca igualmente el rendimiento que
tuvo el microorganismo en sí para generar la
degradación de MP xileno. De esta forma en los
tres tipos de muestra clasificados se deduce el
porcentaje de remoción de MP Xileno para cada
intervalo de tiempo, donde se toma como valor
principal el promedio entre muestra y dilución;
desde el tiempo inicial hasta las 24 horas, desde
las 24 horas hasta las 48 horas y finalmente desde
el tiempo inicial hasta las 48 horas. Se observa en
la Tabla 8 que el control en este caso presentó
menor degradación que una de las muestras con
microorganismo, mientras que la original
presentó una degradación minúscula y en un caso
presentó degradación negativa, es decir,
formación del compuesto, lo que aumenta la
preocupación del método ya que en los
promedios no se había evidenciado una
degradación negativa.
3.1.5. O Xileno Los resultados son presentados en la
Tabla 9 y se realiza el mismo procedimiento que
para los compuestos anteriores.
Para el caso de los boxplots se observa
que en la Fig 25 las medianas son prácticamente
las mismas pero los intercuartiles tienen diferente
tamaño, lo cual genera la inquietud de si las
muestras realmente son iguales a pesar de la
igualdad en las medianas. La Fig 26 no muestra
una diferencia considerable para las 24 horas de
degradación; solamente en el tamaño de los
intercuartiles por la diferencia que hay entre las
diluciones, sin embargo en la diferencia de las
medianas se aprecia que son parecidas. La Fig 27
presenta la mayor diferencia de medianas,
adicionalmente para el caso de la muestra original
el tamaño de los intercuartiles es razonable y
demuestra la replicabilidad de las muestras,
además cabe anotar que no se consiguió tener un
valor de dilución para la replica. De igual manera,
se realiza la prueba anova para tener
cuantitativamente una aproximación estadística
del método tomando las mismas consideraciones
para la realización de los boxplots.
M MD MR MRD C CD
T0 629.2 596.4 732.3 540.6 662.6 550.3
24h 792.0 411.2 594.9 444.9 716.6 303.6
48h 486.5 446.9 162.4 - 574.1 207.1 Tabla 9. Concentración de O Xileno por muestra (ug/L)
Fig 25. Boxplot de concentraciones de O Xileno por muestra en t0
Fig 26. Boxplot de concentraciones de O Xileno por muestra en t=24h
Fig 27. Boxplot de concentraciones de O Xileno por muestra en t=48h
Al evaluar la prueba anova para los
diferentes tiempos de medición se observa que en
el tiempo inicial la Fig 28 evidencia que el p-
value se encuentra por encima de la significancia
así que existe evidencia estadística para no
rechazar la hipótesis nula. En el caso de la
medición a las 24 horas se muestra en la Fig 29
que el p-value es mayor que la significancia, de
esta manera también existe evidencia estadística
para no rechazar la hipótesis nula. Finalmente,
para el caso de medición a las 48 horas se
muestra en la Fig 30 que el p-value es inferior a la
significancia, por lo que se puede afirmar que
existe evidencia significativa para rechazar la
hipótesis nula, corroborando así la alta diferencia
que se presentaba en la Fig 27.
Fig 28. Prueba Anova de concentraciones de O Xileno por muestra para T0
Porcentaje de remoción O Xileno por muestra (%)
Intervalo de t Original Replica Control
0-24 1.83 18.31 15.89
24-48 22.42 68.77 23.42
0-48 23.84 74.49 35.59 Tabla 10. Porcentaje de remoción de O Xileno por muestra
Se destaca igualmente el rendimiento que
tuvo el microorganismo en sí para generar la
degradación de O xileno. De esta forma en los
tres tipos de muestra clasificados se deduce el
porcentaje de remoción de O Xileno para cada
intervalo de tiempo, donde se toma como valor
principal el promedio entre muestra y dilución;
desde el tiempo inicial hasta las 24horas, desde
las 24 horas hasta las 48 horas y finalmente desde
el tiempo inicial hasta las 48 horas. Se observa en
la Tabla 10 que el control en este caso presentó
menor degradación que una de las muestras con
microorganismo, mientras que la original
presentó una degradación minúscula. Lo que
genera finalmente preocupación del método es
que para todos los compuestos se notó la misma
tendencia, especialmente para las 48 horas donde
se rechazaron las hipótesis nulas. Dada esta
tendencia y los errores contemplados en cada
compuesto se puede verificar que existe un error
en el método. Sin embargo, se verificó el
crecimiento de los microorganismos a las 48h y
resultó en ser masivo como la siembra inicial.
3.2. Cuantificación con método de Micro-
Extracción en Fase Sólida
Para la cromatografía de gases se utilizó
la muestra blanco para calibrar el equipo, después
se midieron las muestras con sus replicas para
cada compuesto y se verificó que el valor
estuviera dentro de la curva de calibración. Es
preciso destacar que para todas las muestras se
tuvo que presentar una dilución con agua de dos
en 25 mL para que los valores entraran en esta
curva, lo cual evidentemente aumenta el error del
experimento. Finalmente se aclara nuevamente
que se utilizó el consorcio en todo este método y
que se realizaron dos muestras con sus replicas
así como dos controles y sus replicas para tener
más claridad de la estandarización del método y
su comportamiento. Por convención de las tablas
y gráficas se define M1 como muestra 1, M2
como muestra 2, M1R como replica de muestra 1,
M2R como replica de muestra 2, C1 como
control de la primera muestra, C1R como replica
del control de la primera muestra, C2 como
control de la segunda muestra y C2R como la
replica del control de la segunda muestra, además
para los tiempos de medición se toma T0 como el
tiempo inicial, 24h como las 24 horas después y
48h como las 48h después. Finalmente se aclara
que este método busca evaluar la estandarización
más no la degradación, especialmente porque se
genera la experimentación con el consorcio y no
se tuvo la oportunidad de evaluar individualmente
el microorganismo para saber si generaba la
degradación de esta manera.
Fig 29. Prueba Anova de concentraciones de O Xileno por muestra para t=24h
Fig 30. Prueba Anova de concentraciones de O Xileno por muestra para t=48h
3.2.1. Benceno
Los resultados de las mediciones son
observados en la Tabla 11. Concentración de
Benceno por muestra (ug/L), sin embargo, es
necesario realizar pruebas estadísticas para
evaluar el diseño experimental; se decide dividir
los resultados en los tres tiempos y en la
experimentación, es decir, se evaluará la muestra
1 y el control 1 con sus replicas, y posteriormente
la muestra 2 y el control 2 con sus replicas. Para
el análisis estadístico se realiza inicialmente
boxplot para evaluar cualitativamente las
poblaciones, pero para tener una conclusión
significativa se realiza anova de un factor para
cada tiempo y muestra para constatar la
replicabilidad. En la prueba anova se desarrolla
como hipótesis nula que las medias de las
diferentes poblaciones son iguales.
Para el caso de los boxplots se observa
que en la Fig 31 las medianas son diferentes y los
intercuartiles tienen diferente tamaño, sin
embargo los intercuartiles presentan un menor
tamaño en comparación con el anterior método,
siendo el tiempo inicial el periodo de evaluación
se ve una pequeña igualdad, cabe anotar que por
cuestiones del laboratorio la muestra 1 no arrojó
ningún valor de benceno. La Fig 32 muestra una
diferencia considerable para la segunda
experimentación en el tiempo inicial, sin embargo
el tamaño de los cuartiles también es minúsculo
en comparación con el anterior método. La Fig 33
presenta la mayor diferencia de medianas,
adicionalmente para el caso de la muestra original
el tamaño de los intercuartiles es realmente
pequeño y demuestra la replicabilidad de las
muestras, dado que se evalúan las 24 horas y no
se demuestra una diferencia significativa se
observa que no hay degradación por parte del
consorcio. La Fig 34 que es la experimentación 2
a las 24 horas tampoco muestra un grado de
degradación, sin embargo muestra valores más
altos de concentración de benceno, lo cual genera
preocupación dado que las cantidad añadidas de
gasolina por experimento fue la misma, asimismo
se observa que las muestras generan tamaños de
intercuartiles considerables y que ayudan a
verificar la estandarización del método. La Fig 35
muestra medianas diferentes pero tamaño de
intercuartil insignificante para control y muestra,
igualmente al evaluar las 48 horas no se evidencia
un cambio severo en la concentración de
benceno. Finalmente, la Fig 36 muestra valores
más altos de concentración que el experimento 1,
pero comparado con las 24 horas se evidencia un
cambio minúsculo en la concentración. De igual
manera, se realiza la prueba anova para tener
cuantitativamente una aproximación estadística
del método tomando las mismas consideraciones
para la realización de los boxplots.
M1 M1R C1 C1R M2 M2R C2 C2R
T0 - 698.0 469.8 697.5 457.5 597.5 599.3 944.3
24h 653.0 648.5 755.1 870.4 1144.0 1144.6 1010.5 1077.1
48h 646.9 697.1 755.1 870.4 1010.5 1077.1 1011.8 971.4 Tabla 11. Concentración de Benceno por muestra (ug/L)
Fig 31. Boxplot de concentraciones de Benceno para Experimento 1 en t0
Fig 34. Boxplot de concentraciones de Benceno para Experimento 2 en t=24h
Fig 32. Boxplot de concentraciones de Benceno para Experimento 2 en t0
Fig 33. Boxplot de concentraciones de Benceno para Experimento 1 en t=24h
Fig 35. Boxplot de concentraciones de Benceno para Experimento 1 en t=48h
Fig 36. Boxplot de concentraciones de Benceno para Experimento 2 en t=48h
Al evaluar la prueba anova para los
diferentes tiempos de medición y diferentes
experimentos se observa que para todos los
tiempos la relación del control y las muestras
cada una con sus replicas hace que no se rechace
la hipótesis nula en ningún momento (Fig 37-42),
lo cual concuerda ya que se está examinando la
estandarización y aunque no se realizó una
degradación per se, sí se evidenció la
replicabilidad para el caso del benceno.
Fig 37. Prueba Anova de concentraciones de Benceno de Experimento 1 para T0
Fig 38. Prueba Anova de concentraciones de Benceno de Experimento 2 para T0
Fig 39. Prueba Anova de concentraciones de Benceno de Experimento 1 para t=24h
Fig 40. Prueba Anova de concentraciones de Benceno de Experimento 2 para t=24h
Fig 41. Prueba Anova de concentraciones de Benceno de Experimento 1 para t=48h
Fig 42. Prueba Anova de concentraciones de Benceno de Experimento 2 para t=48h
3.2.2. Tolueno
Los resultados son presentados en la
Tabla 7 y se realiza el mismo procedimiento que
para el compuesto anterior.
Para el caso de los boxplots se observa
que en la Fig 43 las medianas son diferentes y los
intercuartiles tienen diferente tamaño, sin
embargo los intercuartiles presentan un menor
tamaño en comparación con el anterior método,
siendo el tiempo inicial el periodo de evaluación
se ve una pequeña igualdad. La Fig 44 muestra
una diferencia considerable para la segunda
experimentación en el tiempo inicial, sin embargo
el tamaño de los cuartiles también es minúsculo
en comparación con el anterior método. La Fig 45
presenta la mayor diferencia de medianas,
adicionalmente para el caso de la muestra original
el tamaño de los intercuartiles es realmente
pequeño y demuestra la replicabilidad de las
muestras, especialmente para las muestras de
degradación dado que se evalúan las 24 horas y
no se demuestra una diferencia significativa se
observa que no hay degradación por parte del
consorcio. La Fig 46 que es la experimentación 2
a las 24 horas tampoco muestra un grado de
degradación, sin embargo muestra valores más
altos de concentración de tolueno, lo cual genera
preocupación dado que la cantidad añadida de
gasolina por experimento fue la misma, asimismo
se observa que las muestras generan tamaños de
intercuartiles considerables y que ayudan a
verificar la estandarización del método. La Fig 47
muestra medianas diferentes pero tamaño de
intercuartil insignificante para control y muestra,
igualmente al evaluar las 48 horas no se evidencia
un cambio considerable en la concentración de
tolueno. Finalmente, la Fig 48 muestra valores
más altos de concentración que el experimento 1,
pero comparado con las 24 horas se evidencia un
cambio minúsculo en la concentración. De igual
manera, se realiza la prueba anova para tener
cuantitativamente una aproximación estadística
del método tomando las mismas consideraciones
para la realización de los boxplots.
M1 M1R C1 C1R M2 M2R C2 C2R
T0 654,50 2012,8 1536,4 1638,4 2339,6 2347,8 2265,9 3019,4
24h 1655,9 1634,9 1648,1 1995,0 3573,6 3523,5 3719,8 3538,6
48h 1627,1 1658,1 1821,5 1747,1 2629,6 2719,5 2968,6 3297,3 Tabla 12. Concentración de Tolueno por muestra (ug/L)
Fig 43. Boxplot de Concentraciones de Tolueno de Experimento 1 a t0
Fig 44. Boxplot de Concentraciones de Tolueno de Experimento 2 a t0
Fig 45. Boxplot de Concentraciones de Tolueno de Experimento 1 para t=24h
Fig 46. Boxplot de Concentraciones de Tolueno de Experimento 2 para t=24h
Fig 47. Boxplot de Concentraciones de Tolueno de Experimento 1 para t=48h
Fig 48. Boxplot de Concentraciones de Tolueno de Experimento 2 para t=48h
Al evaluar la prueba anova para los
diferentes tiempos de medición y diferentes
experimentos se observa que para todos los
tiempos la relación del control y las muestras
cada una con sus replicas hace que no se rechace
la hipótesis nula en ningún momento (Fig 49-53),
lo cual concuerda ya que se está examinando la
estandarización y aunque no se realizó una
degradación per se, sí se evidenció la
replicabilidad para el caso del tolueno.
Fig 49. Prueba Anova de concentraciones de Tolueno de Experimento 1 para T0
Fig 50. Prueba Anova de concentraciones de Tolueno de Experimento 2 para T0
Fig 51. Prueba Anova de concentraciones de Tolueno de Experimento 1 para t=24h
Fig 52.Prueba Anova de concentraciones de Tolueno de Experimento 2 para t=24h
Fig 53. Prueba Anova de concentraciones de Tolueno de Experimento 1 para t=48h
Fig 54. Prueba anova para concentraciones de Tolueno de Experimento 2 para t=48h
3.2.3. Etilbenceno
Los resultados son presentados en la
Tabla 7 y se realiza el mismo procedimiento que
para los compuestos anteriores.
Para el caso de los boxplots se observa
que en la Fig 4355 las medianas son diferentes y
los intercuartiles tienen diferente tamaño, sin
embargo los intercuartiles presentan un menor
tamaño en comparación con el anterior método,
ya que siendo el tiempo inicial el periodo de
evaluación se ve una pequeña igualdad. La Fig 56
muestra una diferencia considerable para la
segunda experimentación en el tiempo inicial, sin
embargo el tamaño de los cuartiles también es
minúsculo en comparación con el anterior
método. La Fig 57 presenta la menor diferencia de
medianas, adicionalmente para el caso de la
muestra original el tamaño de los intercuartiles es
realmente pequeño y demuestra la replicabilidad
de las muestras, especialmente para las muestras
de degradación dado que se evalúan las 24 horas
y no se demuestra una diferencia significativa se
observa que hay poca degradación por parte del
consorcio. La Fig 58 que es la experimentación 2
a las 24 horas tampoco muestra un grado
considerable de degradación, sin embargo
muestra valores más altos de concentración de
etilbenceno, lo cual genera preocupación dado
que las cantidad añadida de gasolina por
experimento fue la misma, asimismo se observar
que las muestras generan tamaños de
intercuartiles considerables y que ayudan a
verificar la estandarización del método, y que
podría existir un error de medición del
experimento 2 ya que los compuestos en general
presentan ese incremento severo de concentración
después de las 24 horas. La Fig 4759 y Fig 60
muestra tamaños de intercuartil pequeños y las
medianas están muy cercanas. De igual manera,
se realiza la prueba anova para tener
cuantitativamente una aproximación estadística
del método tomando las mismas consideraciones
para la realización de los boxplots.
M1 M1R C1 C1R M2 M2R C2 C2R
T0 654,5 311,3 328,5 285,1 494,8 463,6 347,3 456,8
24h 222,5 224,4 204,9 304,6 602,3 587,6 594,3 541,3
48h 213,0 211,3 242,1 241,5 364,0 379,1 424,1 494,9 Tabla 13. Concentración de Etilbenceno por muestra (ug/L)
Fig 55. Boxplot de Concentraciones de Etilbenceno de Experimento 1 para t0
Fig 56. Boxplot de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 2 para t0
Fig 57. Boxplot de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 1 para t=24h
Fig 58. Boxplot de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 2 para t=24h
Fig 59. Boxplot de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 1 para t=48h
Fig 60. Boxplot de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 2 para t=48h
Fig 61. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 1 para T0
Fig 62. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 2 para T0
Fig 63. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 1 para t=24h
Al evaluar la prueba anova para los
diferentes tiempos de medición y diferentes
experimentos se observa que para todos los
tiempos la relación del control y las muestras
cada una con sus replicas hace que no se rechace
la hipótesis nula en la mayoría de los casos (Fig
61-64), lo cual concuerda ya que se está
examinando la estandarización y aunque no se
realizó una degradación per se, sí se evidenció la
replicabilidad para el caso del etilbenceno. Para el
caso de la Fig 65 se rechaza la hipótesis nula dado
que el tamaño de intercuartil es tan pequeño que a
pesar de tener una diferencia de medianas
relativamente baja no se considera
estadísticamente significativa. La Fig 66 presenta
significancia como en la mayoría de los casos.
Fig 64. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 2 para t=24h
Fig 65. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 1 para t=48h
Fig 66. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 2 para t=48h
3.2.4. MP Xileno
Los resultados son presentados en la
Tabla 14 y se realiza el mismo procedimiento que
para los compuestos anteriores.
Para el caso de los boxplots se observa
que en la Fig 67 las medianas son diferentes y los
intercuartiles tienen diferente tamaño, sin
embargo los intercuartiles presentan un menor
tamaño en comparación con el anterior método,
siendo el tiempo inicial el periodo de evaluación
se ve una igualdad. La Fig 68 muestra una
diferencia considerable para la segunda
experimentación en el tiempo inicial, sin embargo
el tamaño de los cuartiles también es minúsculo
en comparación con el anterior método. La Fig 69
presenta la menor diferencia de medianas,
adicionalmente para el caso de la muestra original
el tamaño de los intercuartiles es realmente
pequeño y demuestra la replicabilidad de las
muestras, especialmente para las muestras de
degradación dado que se evalúan las 24 horas y
no se demuestra una diferencia significativa se
observa que hay poca degradación por parte del
consorcio. La Fig 70 que es la experimentación 2
a las 24 horas tampoco muestra un grado
considerable de degradación, sin embargo
muestra valores más altos de concentración de
MP Xileno, lo cual genera preocupación dado que
la cantidad añadida de gasolina por experimento
fue la misma, asimismo se observa que las
muestras generan tamaños de intercuartiles
considerables y que ayudan a verificar la
estandarización del método, y que podría existir
un error de medición del experimento 2 ya que
los compuestos en general presentan ese
incremento severo de concentración después de
las 24 horas. La Fig 71 y Fig 72 muestra tamaños
de intercuartil pequeños y las medianas están
muy cercanas. De igual manera, se realiza la
prueba anova para tener cuantitativamente una
aproximación estadística del método tomando las
mismas consideraciones para la realización de los
boxplots.
M1 M1R C1 C1R M2 M2R C2 C2R
T0 3250,1 1470,3 1675,5 1399,5 2380,4 2246,5 1709,0 1982,3
24h 1139,0 1131,8 1085,5 1459,3 2542,1 2479,8 2506,9 2332,1
48h 1097,0 1081,6 1203,3 1200,3 1684,0 1725,4 1913,6 2214,4 Tabla 14. Concentración de MP Xileno por muestra (ug/L)
Fig 67. Boxplot de Concentraciones de MP Xileno de Experimento 1 para t0
Fig 68. Boxplot de Concentraciones de MP Xileno de Experimento 2 para t0
Fig 69. Boxplot de Concentraciones de MP Xileno de Experimento 1 para t=24h
Fig 70. Boxplot de Concentraciones de MP Xileno de Experimento 2 para t= 24h
Fig 72. Boxplot de Concentraciones de Etilbenceno de Experimento 2 para t=48h
Fig 71. Boxplot de Concentraciones de MP Xileno de Experimento 1 para t=48h
Al evaluar la prueba anova para los
diferentes tiempos de medición y diferentes
experimentos se observa que para todos los
tiempos la relación del control y las muestras
cada una con sus replicas hace que no se rechace
la hipótesis nula en la mayoría de los casos (Fig
73-76), lo cual concuerda ya que se está
examinando la estandarización y aunque no se
realizó una degradación per se, sí se evidenció la
replicabilidad para el caso del MP Xileno. Para el
caso de la Fig 77 se rechaza la hipótesis nula
dado que el tamaño de intercuartil es tan pequeño
que a pesar de tener una diferencia de medianas
relativamente baja no se considera
estadísticamente significativa. La Fig presenta
significancia como en la mayoría de los casos.
Fig 73. Prueba Anova de concentraciones de MP Xileno de Experimento 1 para T0
Fig 74. Prueba Anova de concentraciones de MP Xileno de Experimento 2 para T0
Fig 75. Prueba Anova de concentraciones de MP Xileno de Experimento 1 para t=24h
Fig 76. Prueba Anova de concentraciones de MP Xileno de Experimento 2 para t=24h
Fig 77. Prueba Anova de concentraciones de MP Xileno de Experimento 1 para t=48h
3.2.5. O Xileno
Los resultados son presentados en la Tabla 15. Concentración de O Xileno por muestra
(ug/L) y se realiza el mismo procedimiento que
para los compuestos anteriores.
Para el caso de los boxplots se observa
que en la Fig las medianas son diferentes y los
intercuartiles tienen diferente tamaño, sin
embargo los intercuartiles presentan un menor
tamaño en comparación con el anterior método,
siendo el tiempo inicial el periodo de evaluación
se ve una pequeña igualdad. La Fig muestra una
diferencia considerable para la segunda
experimentación en el tiempo inicial, sin embargo
el tamaño de los cuartiles también es minúsculo
en comparación con el anterior método. La Fig
presenta la menor diferencia de medianas,
adicionalmente para el caso de la muestra original
el tamaño de los intercuartiles es realmente
pequeño y demuestra la replicabilidad de las
muestras, especialmente para las muestras de
degradación dado que se evalúan las 24 horas y
no se demuestra una diferencia significativa se
observa que hay poca degradación por parte del
consorcio. La Fig que es la experimentación 2 a
las 24 horas tampoco muestra un grado
considerable de degradación, sin embargo
muestra valores más altos de concentración de O
Xileno, lo cual genera preocupación dado que la
cantidad añadida de gasolina por experimento fue
la misma, asimismo se pudo observar que las
muestras generan tamaños de intercuartiles
considerables y que ayudan a verificar la
estandarización del método, así podría existir un
error de medición del experimento 2 ya que los
compuestos en general presentan ese incremento
severo de concentración después de las 24 horas.
La Fig y Fig muestran tamaños de intercuartil
pequeños y las medianas están muy cercanas. De
igual manera, se realiza la prueba anova para
tener cuantitativamente una aproximación
estadística del método tomando las mismas
consideraciones para la realización de los
boxplots.
M1 M1R C1 C1R M2 M2R C2 C2R
T0 1283,9 580,4 744,8 563,4 733,3 791,1 621,4 801,5
24h 450,8 446,1 440,3 582,1 1012,9 989,0 1051,3 976,1
48h 444,6 439,1 483,0 484,1 725,3 750,6 823,8 932,3 Tabla 15. Concentración de O Xileno por muestra (ug/L)
Fig 78. Prueba Anova de concentraciones de MP Xileno de Experimento 2 para t=48h
Fig 79. Boxplot de Concentraciones de O Xileno de Experimento 1 para t0
Fig 82. Boxplot de Concentraciones de O Xileno de Experimento 2 para t=24h
Fig 80. Boxplot de Concentraciones de O Xileno de Experimento 2 para t0
Fig 81. Boxplot de Concentraciones de O Xileno de Experimento 1 para t=24h
Al evaluar la prueba anova para los
diferentes tiempos de medición y diferentes
experimentos se observa que para todos los
tiempos la relación del control y las muestras
cada una con sus replicas hace que no se rechace
la hipótesis nula en la mayoría (Fig 85-88), lo
cual concuerda ya que se está examinando la
estandarización y aunque no se realizó una
degradación per se, sí se evidenció la
replicabilidad para el caso del O Xileno. Para el
caso de la Fig se rechaza la hipótesis nula dado
que el tamaño de intercuartil es tan pequeño que a
pesar de tener una diferencia de medianas
relativamente baja no se considera
estadísticamente significativa. La Fig 86 presenta
significancia como en la mayoría de los casos.
Fig 84. Boxplot de Concentraciones de O Xileno de Experimento 2 para t=48h
Fig 85. Prueba Anova de concentraciones de O Xileno de Experimento 1 para T0
Fig 83. Boxplot de Concentraciones de O Xileno de Experimento 1 para t=48h
Finalmente se puede evidenciar que el
método mejora la replicablidad del experimento
ya que en la mayoría de los casos no se rechazó la
hipótesis nula, demostrando así que no existía
diferencia en las medias de las poblaciones. Cabe
anotar que la degradación no se evidenció
claramente en el método debido a la competencia
que se presentó en el medio por el consorcio. Una
de las razones para afirmar este hecho es que al
analizar los medios selectivos la única especie
que creció rápida y masivamente fue Bacillus
Subtilis, por lo que se considera que esta especie
se encargó de sobrevivir en vez de degradar la
gasolina.
Fig 89. Prueba Anova de concentraciones de O Xileno de Experimento 1 para t=48h
Fig 90. Prueba Anova de concentraciones de O Xileno de Experimento 2 para t=48h
Fig 86. Prueba Anova de concentraciones de O Xileno de Experimento 2 para t0
Fig 87. Prueba Anova de concentraciones de O Xileno de Experimento 1 para t=24h
Fig 88. Prueba Anova de concentraciones de O Xileno de Experimento 2 para t=24h
En cuanto a las propiedades
fisicoquímicas tomadas durante el proceso no se
evidencia un cambio en pH, conductividad y
temperatura, además cuentan con la misma
tendencia lo cual no genera sentido en la medida
que la interacción con los microorganismos tiene
que generar diferencias en estos aspectos por su
naturaleza, sin embargo, se evidencia un cambio
en oxigeno disuelto a tal punto que para las
muestras 1 y 2 se evidencia un comportamiento
anaerobio desde el momento inicial, lo cual es
provocado por el consorcio ya que al estar en
competencia e inhibición se consumen todo el
oxígeno.
4. Conclusiones
Durante el proceso de experimentación
se logro identificar abundantes errores que
provocaron la inconcordancia en la mayoría de
las muestras tomadas. Inicialmente se realizó el
método de purga-trampa sin una previa
estandarización, ya que se contó con diferentes
personas interviniedo en todos los métodos y no
se estableció un patrón de realización lo que hizo
que se generará un error diferente para cada tipo
de muestra. Adicionalmente, se encontró que el
proceso de filtración tomaba un tiempo
considerable para provocar la volatilización de la
gasolina y la retención de la misma en el filtro de
papel como consecuencia de la acumulación
masiva de microorganismo. La diferencia en los
boxplots del método purga-trampa eran
considerablemente altos para muestras que tienen
la misma concentración inicial. De ahí también
se tiene la duda de si la gasolina comercial
adquirida estaba mezclada homogéneamente, lo
cual causa evidentemente las diferencias en las
concentraciones medidas.
El método de micro-extracción en fase
sólida se realizó con mayor organización,
iniciada con la designación de cada persona en
una única labor con eso se mantendría el mismo
error para cada proceso. De esta manera se
observó que la replicabilidad de los datos sí fue
posible y que se mejoró considerablemente la
toma de las muestras. Un ejemplo claro se dio
con la muestra 1 original en el tiempo inicial ya
que fue el único que arrojó datos de
concentración diferentes a los demás, inclusive la
replica de la muestra 1 tenía valores similares al
control 1 y su replica.
5. Recomendaciones
Para próximos eventos de degradación de
hidrocarburos con microorganismos y que se
tenga en mente evaluar la degradación por medio
de cromatografía de gases se recomienda utilizar
en cualquier medida el método de micro-
extracción en fase sólida; toma mayor tiempo
pero asegura la replicabilidad de los datos.
Posteriormente es imperativo evaluar un
microorganismo individualmente al inicio; si se
decide utilizar Bacillus subtilis es importante
evaluar las propiedades biosurfactantes para
verificar si esta propiedad afecta
considerablemente el proceso de degradación. En
la parte inicial del proceso se recomienda también
generar presión en el microorganismo a través de
la adición de gasolina desde el primer momento
para que se acostumbre; de este mismo tema se
generó la preocupación en cuanto al momento de
servir el microorganismo dentro del Bushnell
Haas con el medio nutritivo incluido se eliminará
la presión de selección y el microorganismo
decidiera no degradar gasolina. Para mejorar este
aspecto se recomienda ejercer presión para evitar
pérdida del plásmido; se centrifuga a 4500RPM a
4°C por 15 minutos, de esta manera se extrae el
microorganismo sin medio nutritivo y se alcanza
la medición exacta [27]. Debido a la
incertidumbre por la concentración inicial de
BTEX a lo largo de la experimentación se
recomienda tener una muestra patrón que sea
homogénea y que claramente no tenga una
concentración inicial variable. Finalmente, para
descartar completamente el error en el método de
extracción se recomienda evaluar las mediciones
en otro lugar certificado; puede ser un laboratorio
externo o compañía, y para evitar errores en la
dilución cuando es requerida se recomienda
utilizar todos los medios mecánicos posibles ya
que para este experimento se tuvo que aforar y
este proceso es cualitativo lo cual genera más
error, asimismo con la mezcla inicial. Finalmente,
se recomienda aumentar el número de replicas de
manera que se realice una mejor valoración
estadística del diseño experimental.
Agradecimientos
Es importante aclarar que este proceso y
consolidación del proyecto ha sido realizado en
conjunto con un equipo de trabajo conformado
por Maria Victoria Castro, Camilo Diaz, Jaime
Cardenas y Valeria Arroyave. Cada uno aportó
de manera importante a la investigación y es por
esto que se destaca su participación y se les
agradece. Adicionalmente, se agradece a todo el
equipo del laboratorio de Ingeniería Ambiental
en el área de muestras y cromatografía ya que
presentó toda la disposición y el apoyo
incondicional para poder desarrollar cada uno
de los procesos antes descritos. Se agradece
también a las investigadoras Raquel Romero y
Juliana Martinez por todos los aportes
significativos que permitieron hacer realidad el
proyecto. Finalmente se agradece al Director
del Centro de Investigaciones en Ingeniería
Ambiental de la Universidad de los Andes
Manuel Rodriguez por brindar la oportunidad
de trabajar en este proyecto, y por transmitir en
sus roles de profesor y asesor del proyecto parte
de todo el conocimiento que posee, así como la
inspiración por el profesionalismo y el buen ser
de un ingeniero ambiental. Este proyecto
realmente ha contribuido en el desarrollo del
conocimiento y la importancia del aprendizaje a
partir de lo práctico.
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