Establecimiento de un procedimiento diagnóstico para Lawsonia · PDF file...

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  • 14 n SUIS Nº 95 Marzo 2013

    ARTÍCULOS

    14 n SUIS Nº 95 Marzo 2013

    ARTÍCULOS

    Establecimiento de un procedimiento diagnóstico para Lawsonia intracellularis

    Resumen

    Tanto el cuadro clínico como la observación de las lesiones macroscópi- cas son insuficientes para el diagnóstico certero de la enteropatía prolife- rativa porcina (EPP). Además, Lawsonia intracellularis es una bacteria que no crece en medios in vitro convencionales en ausencia de enterocitos, así que tanto el aislamiento como el diagnóstico serológico resultan com- plicados (Huerta y col., 2003). De este modo el examen post mórtem de los animales con diarrea y retraso en el crecimiento resulta de gran interés para su diagnóstico. La constatación del aumento de tamaño del íleon, de los ganglios linfáticos y de las lesiones microscópicas proliferativas típicas son una herramienta determinante a la hora de caracterizar la enfer- medad, cuando se utilizan de forma conjunta. La técnica de Warthin Starry resultó ser rápida y simple en su desarrollo y permitió identificar, además del agente etiológico, estructuras histológicas, patológicas y la respuesta celular. Además, la técnica de inmunoperoxidasa fue la prueba de referen- cia para el diagnóstico de L. intracellularis y permitió identificar diferentes etapas en la patogenia de la enfermedad (incluyendo los animales en recuperación) y grado de infección. La técnica de PCR de mucosa ileal permitió identificar animales con poca cantidad de L. intracellularis en la mucosa y su asociación con las lesiones, por lo que se concluye que su aplicación podría ayudar a determinar infecciones subclínicas. La técnica de PCR de materia fecal dio lugar a la identificación de cerdos que siguie- ron eliminando bacterias de manera intermitente durante varias semanas.

    Palabras claves: Lawsonia intracellularis, enteropatía proliferativa porcina, diagnóstico.

    Summary

    Diagnosis of Lawsonia intracellularis

    Both clinical observation and gross lesions are insufficient for accurate diagnosis of porcine proliferative enteropathy (PPE), so it is recommended laboratory diagnosis, and can be direct or indirect. Furthermore, Lawsonia intracellularis is a bacterium which does not grow on conventional media in vitro in the absence of enterocytes, therefore isolation as serological diag- nosis is complicated (Huerta et al., 2003). Thus the post-mortem exami- nation of animals with diarrhea and growth retardation is of great interest for diagnosis. The finding of increased size of the ileum, the lymph nodes and microscopic lesions typical proliferative, is a reliable tool when cha- racterizing the EPP, when used together. Warthin Starry technique proved to be quick and simple in its development and identified, in addition to the etiologic agent, histological structures, pathological and cellular response. Moreover immunoperoxidase technique was the gold standard for the histo- pathological diagnosis of L. intracellularis, and identified different stages in the pathogenesis of the disease (including animals in recovery) and degree of infection. The PCR technique of ileal mucosa identified animals with little amount of L. intracellularis in mucosa and associated injuries, which conclu- des that its implementation could help determine subclinical infections. The PCR technique stool in turn led to the identification of bacteria eliminating pigs continued intermittently for several weeks.

    Key words: Lawsonia intracellularis, porcine proliferative enteropathy, diagnosis.

    Judith Bertone, Silvia Romanini, Raúl Yaciuk, Natalia Illanes, Bibiana Pelliza y Ana Cabral

    Imágenes cedidas por los autores

    Contacto con los autores: Departamento de Patología Animal - Universidad Nacional de Río Cuarto - Córdoba - Argentina. Email: [email protected]

    Published in IVIS with the permission of the editor Close window to return to IVIS

  • SUIS Nº 95 Marzo 2013 n 15

    ARTÍCULOS

    L a enteropatía proliferativa porci- na (EPP) o ileítis porcina es consi- derada por numerosos investiga- dores como una de las principales

    enfermedades transmisibles en la produc- ción intensiva de cerdos en todo el mundo. Está producida por Lawsonia intracellula- ris, una bacteria Gram (-) que manifiesta como principales signos clínicos anorexia, diarrea, retraso del crecimiento y aumento de la mortalidad en la etapa de finalización (Jensen y col., 2006). La distribución de esta enfermedad es mundial. En Estados Unidos y algunos países de Europa, el porcentaje de explo- taciones afectadas supera al 90% (McO- rist y col., 2003). En un estudio realizado en 22 explotaciones de la zona de mayor producción porcina de Argentina, me- diante la técnica ELISA en suero y PCR en materia fecal, se observó que un 90,9% de las granjas eran seropositivas. En este estudio se concluyó también que L. intra- cellularis está presente de forma endémica a lo largo del país y de las explotaciones, y que el mayor impacto de la enfermedad se da en los animales de 15 semanas de edad (Corrales y col., 2009). La EPP se manifiesta clínicamente de dos formas en las granjas infectadas: una forma crónica, con tres tipos de lesiones macroscópicas bien diferenciadas (que son la adenomatosis intestinal, la ente- ritis necrótica y la ileítis regional) y una forma aguda, la enteropatía proliferativa hemorrágica (Gebhart y Guedes, 2001). Estas formas difieren mucho en sus mani- festaciones clínicas, aunque mantienen la misma lesión de base, macroscópicamen- te caracterizada por el engrosamiento de la mucosa del íleon y, en menor grado, del ciego y del colon, y microscópicamente por la hiperplasia de los enterocitos in- maduros de las criptas (Carvajal y col., 2005a). Además, presenta una tercera forma subclínica, sin diarrea evidente pero con mayor o menor impacto en los parámetros productivos como los índices de conversión, ganancia de peso media diaria y uniformidad en cerdos de termi- nación (McOrist y col., 2007). Tanto el cuadro clínico como la observa- ción de las lesiones macroscópicas son in- suficientes para el diagnóstico certero de EPP, por lo que se recomienda un diagnós- tico laboratorial, directo o indirecto (Law- son y col., 2000; Carvajal y col., 2005). En función del incremento de casos de ileítis en la casuística de nuestro departamento y

    su reciente asociación con otros microor- ganismos como el circovirus porcino tipo 2 (PCV2) (Jensen y col., 2006; Machuca y col., 2008), nos propusimos establecer una rutina de diagnóstico confiable y eco- nómica para ser aplicada en el servicio de diagnóstico histopatológico que brinda el Departamento de Patología Animal.

    MATERIALES Y MÉTODOS Se realizó un muestreo no probabilístico de conveniencia sobre un total de 61 cer- dos con diarrea, de entre 8 y 21 semanas de edad, en 21 criaderos intensivos de 8 provincias de Argentina. El muestreo in- cluyó: necropsia, observación de las lesio- nes macroscópicas, determinación del co- lor y de la consistencia de las heces, toma de muestras de los últimos 10 cm del íleon en formol al 10%, raspado de mucosa y materia fecal. Las técnicas empleadas en mucosa intestinal incluyeron hematoxili- na eosina (HE), Warthin Starry (WS), in- munoperoxidasa (IPX), PCR en mucosa y en materia fecal. El estudio estadístico se realizó a través del análisis de contingencia para variables cate- gorizadas, útiles para comparar dos o más variables categorizadas del programa InfoS- tat versión 2010 (Di Rienzo y cols., 2010).

    RESULTADO Y DISCUSIÓN La mayoría de los cerdos con diarrea mos- traron una importante disminución de su condición corporal en la totalidad de las

    explotaciones lo que lleva a un retraso de la producción y heterogeneidad de los lotes (figura 1). En este estudio se pudo ver una gran varie- dad de consistencias y colores de las heces localizadas en el recto. Las diarreas pre- dominantes no fueron las descritas como características en L. intracellularis, de co- lor gris verdoso o gris cemento (Carvajal y col., 2005a). Esto podría ocurrir por diversas causas: varios agentes patógenos pueden estar presentes como causantes de estas diarreas, pudiendo existir infecciones concomitantes que modifiquen el color original de la diarrea, úlceras gástricas, etc. Por lo que el color y la consistencia de las heces resultaron inespecíficas y no sirvie- ron para caracterizar a EPP.

    Muestras de elección

    Las muestras de elección para ser enviadas a los laboratorios de referencia, incluyen: ■n Para histoquímica e inmunohistoquímica se remitirá una porción de íleon (2 cm), 10 cm por delante de la válvula ileocecal, en formol al 10% bufferado debidamen- te identificado.

    ■n Para PCR de mucosa se recomienda lavar la mucosa con una solución fisiológica estéril con la finalidad de disminuir los potenciales inhibidores que se encuentran en la materia fecal (Ladinig y col., 2009). Posteriormente se raspa la superficie de la mucosa ileal con una espátula de plástico estéril hasta obtener una muestra de aproximadamente un 1 cm3 de mucosa, que se introducirá en tubo Eppendorf es- téril correctamente identificado, conteniendo 1 ml de PBS estéril para evitar la des- hidratación. Se debe transportar la muestra refrigerada a 7 °C hasta el laboratorio.

    ■n Para PCR de materia fecal se debe tomar, con una espátula de plástico estéril, aproximadamente 1,5 ml de contenido intestinal del íleon y colocarlo en el interior de un tubo Eppendorf estéril adecuadamente