ESPECTROFOTOMETRÍA UV/VIS DE LAS SAPONINAS …

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN TIPO I

“CUANTIFICACIÓN POR ESPECTROFOTOMETRÍA UV/VIS DE LAS

SAPONINAS CONTENIDAS EN EL EPISPERMA DE LA ESPECIE

Chenopodium quinoa willd “QUINUA” PROCEDENTE DE LA

PROVINCIA DE SANTIAGO DE CHUCO - LA LIBERTAD”

AUTORES:

Rojas Avalos, Ana Susana

Tapia Ramírez, Willian Enrique

ASESOR:

Mg. Q.F. Roger Antonio Rengifo Penadillos

Trujillo – Perú

2011

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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Dedicatorias



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A nuestro señor, Dios, por ser

la luz que guía mi vida en

todo momento y darme la

fuerza necesaria para salir

adelante y lograr alcanzar

mis metas, gracias por sus

bendiciones.

Agradezco a mis queridos

hermanos, Henry y José, el

apoyo que siempre me han

brindado con su impulso,

fuerza y tenacidad que son

parte de mi formación, como

muestra de gratitud les dedico

el presente trabajo.

A mis padres, Enrique y

Aida, que me dieron la vida y

han estado conmigo en todo

momento, por sus enseñanzas

y sus buenas costumbres que

han creado en mi sabiduría

haciéndome comprender el

valor del esfuerzo y la

dedicación, los quiero.

Willian



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A Dios por su ayuda en los momentos más difíciles y haberme guiado en el camino correcto.

A mi hermano, Carlos, por ser mi mejor amigo y ejemplo de constancia y tesón, virtudes que fortalecen cada una de mis acciones.

A mis padres, Calixto y Caridad, por sus enseñanzas de vida y cariño, por haber sabido mostrarme que la dedicación y esfuerzo son las herramientas más valiosas de la vida.

Ana



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Agradecimientos



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A la Facultad de Farmacia

y Bioquímica de la

Universidad Nacional de

Trujillo y sus docentes por la

exigencia y elevado nivel

académico brindado a lo largo

de la carrera, responsable de

nuestra formación Académico

– Profesional.

A nuestros familiares, que con

su apoyo y afecto diario son el

motivo que nos impulsa hacia

nuestro desarrollo profesional

humanista, científico y

tecnológico.

A nuestro asesor, el profesor

Mg. Q.F. Roger Rengifo

Penadillos, por su apoyo

incondicional.

Los Autores



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JURADO DICTAMINADOR

Mg. Q.F. Luis Chávez Abanto Presidente

Dr. Q.F. Segundo Guillermo Ruiz Reyes Miembro

Mg. Q.F. Roger Antonio Rengifo Penadillos Miembro



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ÍNDICE

Página

RESUMEN……………………………………………………………………………………..i

ABSTRACT……………………………………………………………………………………ii

I.- INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………...……..1

II.- MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………………….6

III.- RESULTADOS…………………………………………………………………………...12

IV.- DISCUSIÓN………………………………………………………………………………15

V.- CONCLUSIONES…………………………………………………………………………20

VI.- RECOMENDACIONES………………………………………………………………….21

VII.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………………...22

ANEXOS



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RESUMEN

Chenopodium quinoa willd “Quinua” es una hierba anual de origen indígena,

propia de las regiones montañosas de Perú, Bolivia y Ecuador, donde es ampliamente

cultivada. Su semilla es considerada un pseudocereal con un alto valor nutritivo, son

amargas debido a las saponinas contenidas en su episperma “cáscara”. Estudios

fitoquímicos permitieron conocer que las saponinas triterpénicas pentacíclicas se

encuentran en una mayor proporción en la cascarilla de quinua, entre el 20 y 50%, las

cuales constituyen un grupo de diversos glicósidos de alto peso molecular, formados por

una o más cadenas carbohidratadas y una aglicona denominada sapogenina. El objetivo

de este trabajo fue cuantificar las saponinas contenidas en el episperma de la especie

Chenopodium quinoa willd “Quinua” usando como método analítico la

espectrofotometría UV/VIS. Las pruebas de identificación de las saponinas extraídas de

la cascarilla de quinua fueron positivas, tanto para la reacción de Rosell como para la

reacción de Liebermann-Burchard, mostrando evidencia de la presencia de saponinas

triterpénicas pentacíclicas. Se determinó la longitud de onda de máxima absorbancia

mediante un barrido espectral entre 390 y 500 nm, resultando en 412 nm. Se hidrolizó

un extracto seco de saponinas de quinua y se determinó mediante espectrofotometría el

porcentaje de recuperación de sapogeninas siendo de 99,68%, el contenido de saponinas

en el episperma de quinua, fue de 19,76% expresadas como saponinas triterpénicas

pentacíclicas.

Palabras claves: Chenopodium quinoa willd, saponina, episperma,

espectrofotometría UV/VIS.



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ABSTRACT

Chenopodium quinoa Willd "Quinoa" is an annual herb of Indian origin, typical

of mountainous regions of Peru, Bolivia and Ecuador, which is widely cultivated. Its

seed is considered a pseudocereal with a high nutritional value. They are bitter due to

the saponins contained in episperm "shell." Phytochemical studies allowed to know that

the pentacyclic triterpene saponins found in greater proportion in the scale of quinoa,

between 20 and 50%, which constitute a diverse group of high molecular weight

glycosides, consisting of one or more carbohydrate chains and aglycone called

sapogenin. The aim of this study was to quantify the saponins contained in the episperm

of the species Chenopodium quinoa Willd "Quinoa" using the spectrophotometry

UV/VIS as analytical method. The identification tests of saponins extracted from quinoa

bran were positive for both reactions: Rosell and the Liebermann-Burchard, showing

evidence of the presence of pentacyclic triterpene saponins. It was determined the

wavelength of maximum absorbance using a spectral scanning between 390 and 500

nm, resulting in 412 nm. The quinoa saponins dry extract was hydrolyzed and the

percentage recovery of sapogenins was determined by spectrophotometry, this one gets

a value of 99,68%, the saponin content in quinoa episperm, which was 19,76%

expressed as pentacyclic triterpene saponins.

Keywords: Chenopodium quinoa Willd, saponin, episperm, spectrophotometry

UV/VIS.



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TRABAJO DE INVESTIGACIÓN I 1

I.- INTRODUCCIÓN

La quinua (Chenopodium quinoa wild) es una hierba anual, de hasta 3 metros de

alto, con tallos ramificados desde la base, verdes o pigmentados, hojas deltoideas,

inflorescencias densas y los frutos congregados en glomérulos1,2,3.

Esta especie es propia de las regiones montañosas de Perú, Bolivia y Ecuador,

donde es ampliamente cultivada. En el Perú, de acuerdo a la Oficina de Información

Agraria (OIA) para el año 2004 la quinua se produjo en 13 departamentos, de ellos Puno

es el productor de este cultivo por excelencia, donde se concentra el 80% del área

cosechada y el 81% de la producción nacional. Dentro del Departamento de La

Libertad, entre las principales Provincias productoras de quinua se encuentran Santiago

de Chuco, Otuzco y Pataz3,4.

El uso de la Quínoa o Quinua data de por lo menos 3000 años A.C. En época de

los Incas la llamaban grano madre y la veneraban como planta sagrada. Son amargas,

debido a que su episperma (“cáscara” de la semilla) está recubierta por varias capas de

saponina5,6.

Las saponinas son compuestos naturales, metabolitos secundarios, caracterizados

desde el punto de vista estructural por presentar enlaces glicosídos y/o éster entre una

genina poco polar y restos glusídicos1.

Las saponinas, son heterósidos que se definen en función tanto de su química

como de sus propiedades físicas. Pueden tener un esqueleto tipo esteroidal (de base

gonano) o de tipo triterpenoide (derivados del escualeno), las cuales dan lugar a las 2

grandes familias de estos metabolitos: las saponinas esteroidales y las saponinas

triterpénicas.

Las sapogeninas esteroidales siempre se encuentran en la naturaleza formando

parte de una saponina. Entre las saponinas esteroidales, cabe destacar aquéllas que

tienen como aglicona a la hecogenina y la diosgenina, compuestos vegetales que sirven

de base para la industria de hormonas esteroidales7.

Las sapogeninas triterpénicas están ampliamente distribuidas en los reinos

vegetal y animal y se presentan en 3 estructuras químicas diferentes (30-45 carbonos):

aciclícas como el escualeno, considerado como el precursor natural de esta familia;



http://www.monografias.com/trabajos13/mapro/mapro.shtml

http://www.monografias.com/trabajos7/sisinf/sisinf.shtml

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tetracíclicas como el panaxadiol y pentacíclicas como la estallogenina. Estas sustancias

pueden presentarse en sus fuentes naturales: en forma libre: formando ésteres, o como

parte de un glicósido (saponina)6,7.

Las 2 familias de saponinas referidas presentan un grupo de características

generales que sirven de base para su identificación rápida: a) producción de espuma al

ser agitadas sus soluciones acuosas, empleada en el tamizaje fitoquímico; b) producción

de hemólisis de los glóbulos rojos por la mayoría de ellas, propiedad que se aprovecha

en las técnicas en que se cuantifica la potencia de estas sustancias; c) toxicidad en

animales poiquilotérmicos, en especial los peces (sapotoxinas), a los cuales provocan

parálisis de las agallas; d) producción de una reacción positiva en la prueba de

Liebermann-Burchard. Por lo general, las esteroidales en esta prueba manifiestan

colores que van desde el azul hasta el verde y las triterpénicas, rosado, rojo o violeta7,8.

La mayoría de las saponinas son solubles en diferente grado en soluciones de

etanol al 80 %, propiedad que se emplea en diversas técnicas para su extracción y

purificación. La solubilidad en agua de estos compuestos está facilitada por su alto peso

molecular y la presencia de los residuos de monosacáridos y de otros grupos polares en

la aglicona6,7,8.

Desde el punto de vista de su actividad se caracterizan por formar espuma en

soluciones acuosas, hecho que dio origen etimológicamente, al nombre genérico de

estas sustancias provenientes del latín sapon (jabón); y por hemolizar los glóbulos

rojos9.

Las saponinas del episperma de la quinua constituyen un grupo de diversos

glicósidos de alto peso molecular, formados por una o más cadenas carbohidratadas y

una aglicona denominada sapogenina. Estas saponinas son principalmente del tipo

triterpenoide, siendo el ácido oleanólico y la hederagenina los constituyentes

principales, considerando que actualmente se han llegado a identificar hasta 16

saponinas distintas en muestras de quinua. Estas saponinas cuando están presentes en

un extracto, le confieren un pH ácido y actúan como tensioactivos, y en particular en el

agua disminuyen la tensión superficial de esta y forman una espuma jabonosa muy

estable2,6,10.



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Una evidencia que demuestra la presencia y utilidad de las saponinas de la

quinua es el trabajo publicado en la Revista Cubana Medica Militar, por el My. Ricardo

Hernández Royero, en su estudio “Obtención de crudos de saponinas

hipocolesteromizantes del Chenopodium quinoa Willd”, que empleó el principio activo,

la saponina de quinua, para investigar el efecto hipocolesteromizante de éstas. Un

investigación que aporta conocimientos a profundidad acerca de las saponinas en la

quinua es el estudio titulado “Tandem Mass Spectrometric Analysis of a Complex

Triterpene Saponin Mixture of Chenopodium quinoa” realizada por Tobias Madl, Heinz

Sterk y Martin Mittelbach, que llegaron a describir las saponinas presentes en las parte

biológicas de la quinua6,11.

El porcentaje de saponinas que se encuentra en el escarificado de la quinua,

depende de las variedades del grano de la Quinua. Pueden resultar los porcentajes de

saponina entre 20 y 50%. En Chile, según experiencias comprobadas, por la

Universidad Mayor de San Simón-Chile y los Laboratorios Biolab SRL mostraron

resultados entre 22,14% y 48,17% de saponinas en los escarificados de distintas

variedades de quinua10,12.

La “saponina” de la quinua en la actualidad ha adquirido gran importancia en la

industria farmacéutica, de cosméticos, en detergentes y en la industria minera, teniendo

múltiples usos como: agente emulsionante de grasas y aceites, protector de sustancias

coloidales, en cosmética en concentraciones de saponinas entre 5 – 6% son

frecuentemente empleadas en formulaciones de jabones, shampoo y sales de baño. Otras

aplicaciones incluyen su uso en dentífricos, formulación para tinturas y coloraciones

para el pelo10.

La cuantificación de saponinas se ha determinado mediante métodos indirectos

tales como la prueba de la espuma, su capacidad hemolítica o la técnica conocida como

índice de pescado, sin embargo estos métodos no son muy confiables puesto que pueden

dar un falso positivo. El método directo de cuantificación se puede realizar por CLAR o

por espectrometría, sin embargo, se tiene el problema de no contar siempre con el

estándar requerido para su cuantificación, de manera que se debe proceder a la laboriosa

actividad de su purificación6,13.

El análisis de un compuesto (analito) generalmente requiere la separación de

otros compuestos y luego su identificación por métodos analíticos. Una muestra puede



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ser separada, identificada y cuantificada usando sus propiedades físicas y/o químicas,

como densidad, tamaño, solubilidad, entre otras14.

La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para

la detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su

aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc) y

estado de agregación (sólido, líquido, gas)15.

Así, la espectrofotometría es una técnica que permite conocer la concentración

de un compuesto. Se basa en la propiedad que tienen los compuestos de absorber

energía a distintas longitudes de onda del espectro electromagnético de la luz. Cuando

decimos que una sustancia química absorbe luz de longitud de onda, esto significa que

las moléculas de esa sustancia absorben fotones de esa longitud de onda14.

Monje C. Yarko y Raffaillac Jean Pierre en su investigación denominada

“Determinación de saponina total en quinua (Chenopodium quinua Willd) método

espectrofotométrico” en Puno, cuantificaron las saponinas de varias especies de quinua,

obteniendo resultados que van desde 0,18 % hasta 5,01 %, llegando a la conclusión que

la espectrofotometría puede ser usada sin ningún problema para determinar saponina en

quinuas con distintos colores de pericarpio16.

De esta manera, el presente estudio se basa en impulsar los principios de

Desarrollo e Investigación, entendidos como un conjunto de acciones que llevan a

establecer y mantener investigando en pequeña escala, empleando uno de los más

emblemáticos frutos del Perú, a la quinua, utilizando las saponinas de su episperma

como principio activo.

En la actualidad, este principio bioactivo, componente de la quinua, están siendo

de utilidad para las industrias tecnológicas, de tal forma que su producción en distintos

países está adquiriendo gran desarrollo, de allí la importancia de encontrar métodos para

su extracción que sirvan para la obtención y aprovechamiento de la saponina de la

quinua. Por tal motivo, el presente trabajo de investigación es un aporte para la

determinación total del contenido de saponina del episperma de quinua (Chenopodium

quinoa willd), estando orientado a fortalecer el método espectrofotométrico como una

técnica nueva y sencilla para la determinación de la saponina total, de bajo costo, que

pueda ser aplicada por cualquier laboratorio como un medio para su identificación y



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cuantificación. El desarrollo del estudio permitirá demostrar la significancia cuantitativa

del contenido de saponinas en el episperma de quinua, estructura que es desaprovechada

a nivel doméstico e industrial durante su lavado.

El problema planteado fue ¿Cuál es la cantidad de saponinas contenidas en el

episperma de la especie Chenopodium quinoa willd (Quinua) expresadas como

saponinas triterpénicas determinadas por espectrofotometría UV/VIS?

La investigación tuvo como objetivo: Cuantificar las saponinas contenidas en el

episperma de la especie Chenopodium quinoa willd (Quinua) usando como método

analítico la espectrofotometría UV/VIS.



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II.- MATERIAL Y MÉTODO

1. MATERIALES

1.1. Material biológico:

- Se empleó 250 g. de semilla de Chenopodium quinoa willd “Quinua”

procedentes del caserío de Rayambara, Provincia de Santiago de Chuco,

Departamento La Libertad.

1.2. Material y equipo de laboratorio:

1.2.1. Material de vidrio y otros:

- El de uso común en laboratorio

- Saponina triterpénica pentacíclica, standar obtenida del Laboratorio

de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la

UNT.

1.2.2. Equipos de laboratorio:

- Balanza analítica METTLER TOLEDO Modelo: AB 204-5

- Balanza triple brazo OHAUS

- Baño María MEMMERT

- Equipo de fraccionamiento de espuma

- Espectrofotómetro UV/VIS JENWAY Modelo: 6105

- Estufa BINDER Modelo: ED53

- pH-Metro OHMS

- Rotavapor HEIDOLPH MODELO VY 2000



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1.3. Reactivos:

- Acetato de etilo

- Ácido acético glacial

- Ácido clorhídrico cc

- Ácido sulfúrico al 95-98%, ρ = 1,84 g/cc

- Agua destilada

- Anhídrido acético > 97%

- Cloroformo

- Metanol p.a.

- n-butanol p.a.

- Sol. Hidróxido de sodio al 1% y 30%

2. MÉTODO:

2.1. Obtención de saponinas del episperma de las semillas de

Chenopodium quinoa willd (Quinua):

2.1.1. Recolección de la droga:

- Se recolectó 250 g. de semilla de Chenopodium quinoa willd “Quinua”

procedentes del distrito de Rayambara, Provincia de Santiago de Chuco,

Departamento La Libertad durante el mes de noviembre del 20102.

2.1.2. Preparación de la muestra:

- Se procedió a lavar las semillas con 500 mL agua destilada mediante

frotación, para solubilizar el episperma, luego se filtró a través de



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algodón; el filtrado obtenido se concentró en rotavapor hasta un volumen

de 200 mL2.

- Una vez obtenida la muestra, nuevamente se procedió a pesar las semillas

(secas) obteniéndose una diferencia de peso de aproximadamente 2,3 g.

2.1.3. Extracción de saponinas:

- Los 200 mL de la muestra se filtró a través de algodón. El filtrado se

depositó en el balón de burbujeo del equipo de fraccionamiento de espuma

y mediante el uso de la bomba para acuario se hizo burbujear aire a un

flujo alto, hasta que no se formó espuma en el remanente; el volumen del

escurrido obtenido se volvió a procesar en el equipo de fraccionamiento

por dos veces17.

- El escurrido obtenido se llevó a un embudo separador y se sometió a tres

extracciones sucesivas con 30 mL de cloroformo cada vez, se eliminó la

fracción clorofórmica y la fracción acuosa se sometió nuevamente a tres

extracciones sucesivas con 30 mL de acetato de etilo cada vez, se eliminó

la fracción del acetato de etilo y de la fracción acuosa se realizó tres

extracciones con 30 mL de n-butanol cada una, se eliminó la fracción

acuosa y las fracciones n-butanólicas se reunieron y se concentró en

rotavapor hasta obtener un volumen aproximado de 30 mL, el cual se llevó

a estufa a 90 °C por 24 horas para evaporar el disolvente, obteniéndose un

extracto seco; éste se redisolvió con 20 ml de hidróxido de sodio al 1 %, de

esta solución se aislaron las saponinas mediante tres extracciones con 30

mL de n-butanol cada vez, se descartó la fracción acuosa y las fracciones

n-butanólicas se volvieron a concentrar en rotavapor hasta un volumen de

aproximadamente 30 mL, ésta última se llevó a estufa bajo las condiciones

antes indicadas, para evaporar el disolvente. Se obtuvo un producto

pulverulento blanquecino de aproximadamente 456 mg17,18.



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2.1.4. Identificación de saponinas:

- Prueba de Rosell:

Se colocó en un tubo de ensayo una porción del polvo blanquecino,

obtenido de la semilla de Chenopodium quinoa willd, a la cual se le añadió

I gota de ácido sulfúrico concentrado2.

- Prueba de Identificación de núcleo esteroideo:

Reacción de Liebermann-Burchard. Se tomó una pequeña porción del

polvo blanquecino, de la semilla de Chenopodium quinoa willd al cual se

le agregaron III gotas de ácido acético, luego III gotas de anhidro acético y

finalmente I gota de ácido sulfúrico concentrado. Se observaron los

cambios de coloración en el transcurso de unos 30 minutos2,10.

2.2. Cuantificación de saponinas por espectrofotometría:

2.2.1. Determinación de la longitud de onda de máxima absorbancia

(λ max).

Se pesaron muestras de 5 mg, 7,5 mg y 10 mg de sapogenina patrón

(triterpénica pentacíclica), y se transfirieron cuantitativamente a fiolas de

100 ml con 10mL de metanol, se mezclaron por agitación (30 segundos),

luego se agregó el reactivo de color (mezcla de anhídrido acético y ácido

sulfúrico en una proporción de 1:5) y se aforó con metanol. La relación

muestra-reactivo de color fue de 1:3,5 es decir al 22,22%.

Para determinar el λmax se realizó un barrido espectral entre 390 a 500 nm

de cada una de las soluciones preparadas. Las lecturas fueron realizadas

entre 30 y 80 minutos después de haber adicionado el reactivo de color. Se

calibró el instrumento cada vez que se cambió la longitud de onda16, 18.



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2.2.2. Preparación de la curva de calibración.

Se pesaron por quintuplicado muestras de 5 mg, 7,5 mg y 10 mg de

sapogenina patrón, y se transfirieron cuantitativamente a fiolas de 100 ml

con 10mL de metanol, se mezclaron por agitación (30 segundos), luego se

agregó el reactivo de color en una proporción de 3,5:1 con la muestra y se

aforó con metanol, de esta manera se obtuvieron diluciones cuyas

concentraciones fueron de 0,05; 0,075 y 0,1 mg/mL respectivamente.

La absorbancia de cada una de las soluciones preparadas fue leída a la

longitud de onda analítica determinada en el paso anterior (λmax ) entre los

30 y 80 minutos después de haber adicionado el reactivo de color. Se

preparó un blanco y se determinó su absorbancia a la misma longitud de

onda. Con los datos de absorbancia obtenidos se construyó la curva de

calibración de absorbancia vs concentración y se determinó la ecuación de

la recta16, 18.

𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏

Donde:

y = valor de absorbancia

x = valor de concentración conocida

m = pendiente de la recta

b = intercepto

2.2.3. Cuantificación de saponinas.

- Hidrólisis de saponinas:

Se pesó 200 mg de las saponinas purificadas (polvo blanquesino) y se

depositó en un matráz Erlenmeyer de 250 mL, adicionándole 50 mL de

agua destilada. El matráz se colocó en baño maría hasta que alcanzó los

70°C, enseguida se le agregó 20 ml de ácido clorhídrico concentrado,

manteniendo a reflujo durante 20 minutos. Se detuvo la reacción en baño

de hielo y se ajustó el pH con hidróxido de sodio al 30% a 6,5-7,219.



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- Extracción de sapogeninas:

Luego de ajustar el pH, se trasvasó la muestra a una pera de decantación y

se aislaron las sapogeninas con 3 extracciones sucesivas de 20 mL de

cloroformo. La fase clorofórmica se llevó a estufa a 60°C hasta la

evaporación del solvente, obteniéndose un producto seco (sapogeninas)

que fue utilizado para la cuantificación de saponinas.

- Ensayo fotométrico:

De las sapogeninas extraídas se pesaron dos muestras de 5 mg, y cada una

se solubilizó con 5 mL de metanol en una fiola de 25 mL, se añadió el

reactivo de color en una proporción de 1:3,5 (muestra/reactivo), aforando

con metanol. A partir de estas soluciones se transfirió una alícuota de 3 mL

a una fiola de 10 mL aforando con metanol, de esta manera se obtuvo

diluciones cuya concentración fue 0,06 mg/mL. Se leyó la absorbancia de

las diluciones entre los 30 y 80 minutos después de haber adicionado el

reactivo de color. Se preparó una solución blanco16.

La concentración de sapogeninas (mg/mL calculados) fue obtenida a partir

de la pendiente e intercepto de la recta calculada por análisis de regresión

lineal simple en base a las absorbancias de las soluciones estándares

preparadas para la curva de calibración, a partir de la cual se estimó la

cantidad (%) de saponinas contenidas en la muestra problema aplicando la

siguiente relación:

% 𝑠𝑎𝑝𝑜𝑛𝑖𝑛𝑎𝑠 = % 𝑟𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑠𝑎𝑝𝑜𝑔𝑒𝑛𝑖𝑛𝑎 𝑥 𝑔 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 𝑠𝑎𝑝𝑜𝑛𝑖𝑛𝑎𝑠

𝑔 𝑠𝑒𝑚𝑖𝑙𝑙𝑎 𝑑𝑒 𝑞𝑢𝑖𝑛𝑢𝑎

Donde:

% 𝑟𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑠𝑎𝑝𝑜𝑔𝑒𝑛𝑖𝑛𝑎 =

𝑚𝑔𝑚𝐿⁄ 𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜𝑠

0,06 𝑚𝑔

𝑚𝐿⁄ 𝑥 100



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III.- RESULTADOS

Cuadro 1: Pruebas de coloración para la identificación de saponinas

Reacción Coloración Resultado

Rosell Rojo - Violáceo Presencia de saponinas

Liebermann-Burchard Rosada - Púrpura Presencia de saponinas

triterpénicas pentacíclicas

Gráfica 1: Barrido espectral (390-500nm) para determinar la longitud de onda de

máxima absorbancia

412 nm

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500

Ab

sorb

an

cia

Longitud de onda (nm)

0.05 mg/mL 0.075 mg/mL



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Cuadro 2: Datos para la curva de calibración de las saponinas patrón

[mg/mL] Absorbancia

leída

Promedio de

absorbancia

leída

DE

RSD

0.05

0.111

0.112 ± 0.001 0.748 %

0.112

0.112

0.113

0.111

0.075

0.203

0.202 ± 0.001 0.444 %

0.201

0.202

0.201

0.201

0.1

0.321

0.321 ± 0.001 0.261 %

0.322

0.320

0.321

0.32

DE= Desviación estándar; RSD = Desviación estándar relativa

Gráfica 2: Curva de calibración para la cuantificación de saponinas triterpénicas

pentacíclicas

y = 4,18x - 0.101

R = 0.997

R² = 0.993

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.000 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120

Ab

sorb

an

cia

[ mg/mL]

Patrón Lineal (Patrón)



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Cuadro 3: Concentración de saponinas del Chenopodium quinoa willd (Quinua)

Muestra Abs. [mg/mL]

calculado

Promedio

[mg/ml]

cal.

RSD

%

%

Recuperación

sapogenina

% de

Saponina

1 0.150 0.06005 0.05981 0.56748 99.68 19.76

2 0.148 0.05957

DE= Desviación estándar; RSD = Desviación estándar relativa



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IV.- DISCUSIÓN

La semilla de Chenopodium quinoa willd “Quinua” fue recolectada del distrito

de Rayambara, Provincia de Santiago de Chuco, lugar considerado por la Oficina de

Información Agraria (OIA) como uno de los mayores productores de este cultivo en el

Departamento La Libertad4.

Para la extracción de saponinas se lavaron las semillas mediante frotación

usando agua destilada como solvente para evitar una posible incorporación de sales de

calcio, magnesio y/o fierro que puedan causar quelación con los sustituyentes polares de

la estructura del saponósido originando la formación de sales insolubles (precipitado).

La solubilidad en agua de estos compuestos esta facilitada por su alto peso molecular y

la presencia de grupos polares en su aglicona, permitiendo su distribución en medio

acuoso y posterior formación de puentes de hidrógeno con las moléculas de agua10,11.

Una de las propiedades físico-químicas de las saponinas es su solubilidad en

mezclas hidroalcohólicas, siendo insolubles en disolventes orgánicos de baja polaridad,

debido a que su estructura química presenta sitios apolares o liposolubles y polares o

hidrosolubles. Los primeros están dados por la estructura anillada, la cual predomina en

la sapogeninas, siendo solubles en solventes orgánicos como cloroformo. Las

estructuras polares están determinadas por los azúcares y los grupos carboxilos e

hidroxilo, conformando así una estructura polar intermedia fácil de extraer con un

solvente de polaridad semejante como el n-butanol6,10,19.

El extracto obtenido fue sometido a un proceso de aislamiento y purificación

mediante el empleo de disolventes orgánicos de polaridad creciente, comenzando con el

cloroformo, luego acetato de etilo y por último con n-butanol, el cual permitió recuperar

las saponinas presentes en la fase acuosa, corroborando el enunciado anterior. El

tratamiento con hidróxido de sodio al 1% durante la purificación permitió eliminar

posibles residuos de compuestos fenólicos. Finalmente se obtuvo un producto

pulverulento y blanquecino, posible evidencia de la presencia de saponinas en su estado

cristalino.

La identificación de las saponinas de la cascarilla de quinua se realizó mediante

reacciones de coloración, Rosell y Liebermann-Burchard, como se evidencia en el



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Cuadro 01. La reacción de Liebermann-Burchard fue positiva para saponinas

triterpénicas pentacíclicas, resultando en un color rosado-púrpura producto de la

formación de un compuesto cromóforo.

La reacción de Liebermann-Burchard es típica para saponinas que contienen dos

dobles enlaces conjugados en un mismo anillo, en dos anillos adyacentes o un doble

enlace de un anillo adyacente con un grupo hidroxilo, lo cual permitiría la excitación y

deslocalización de un electrón en presencia de luz dando como resultado el fenómeno

de coloración17,20.

Para la reacción de Liebermann-Burchard se procuró conservar un medio

absolutamente anhidro, ya que al existir moléculas de agua estas hubieran reaccionado

con el anhídrido acético, anulando de esta manera la reacción con el núcleo

triterpenoide, o hubieran reaccionado de forma violenta con el ácido sulfúrico20.

El fundamento de la técnica propuesta para la cuantificación de saponinas se

basa en la formación de un compuesto cromógeno como consecuencia de una reacción

entre la saponina y el reactivo de color (anhídrido acético y ácido sulfúrico en una

proporción de 1:5) en un medio ácido fuerte, es por ello que se usa ácido sulfúrico en

una mayor proporción. La etapa inicial de la reacción consistiría en la protonación del

grupo OH del C3 de la saponina obteniéndose un ión y con la consiguiente pérdida de

una molécula de agua lo que constituye el primer paso de la reacción de color. La

oxidación secuencial de este ión por el SO2- produciría el compuesto cromóforo (color

rojo púrpura-Ver Anexos, Fig. 12) con máximos de absorbancia a 390 a 450 nm16,17.

En la Gráfica 01, que corresponde al barrido espectral obtenido entre los 390 y

500 nm de la región del visible, se obtuvo para el compuesto cromóforo una longitud de

máxima absorbancia (max) de 412nm.

La relación muestra-reactivo de color fue de 1:3.5 es decir al 22.22 %, ya que

esta proporción permite una reacción completa, en la que si se llegara a usar una menor

cantidad de reactivo de color quedaría moléculas de saponina sin reaccionar, y por otro

lado, si se usara una mayor cantidad del reactivo resultaría una coloración oscura que se

mantiene en el tiempo, siendo un supuesto de este fenómeno la reducción y

desnaturalización de los anillos de la genina por acción del ácido sulfúrico16.



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Las muestras tuvieron que ser leídas entre 30 y 80 minutos después de la adición

del reactivo de color ya que en este tiempo el color fue estable y permanente. A tiempos

mayores de estancia se produjo una disminución de los valores de absorbancia de las

muestras, así como la decoloración de la misma, posiblemente por una exposición

prolongada a la luz visible.

Se tuvo que tener cuidado al momento de mezclar el reactivo de color con la

muestra ya que esta reacción fue exotérmica por la misma naturaleza del ácido sulfúrico

frente a compuestos orgánicos. Otro punto a considerar fue que la mezcla tuvo una

viscosidad alta y fue necesaria una agitación vigorosa para realizar la mezcla antes de

dejar el tiempo recomendado para que ocurra la reacción16,18.

Los resultados presentados en el Cuadro 02 corresponden a los datos para la

curva de calibración de las saponinas patrón realizado con el espectrofotómetro UV/VIS

para la cuantificación de la saponina ensayo. Se tomaron tres concentraciones

referenciales (0,05; 0,075 y 0,1 mg/mL) de las cuales se sacó una data de cinco lecturas

de absorbancia por concentración con la finalidad de obtener resultados significativos,

lo cual se evidenció con los valores de desviación estándar (DE) que mostraron

dispersiones de ±0,001 para todas las magnitudes indicando la representatividad de las

mediciones. Sin embargo, también se determinó la desviación estándar relativa (RSD o

coeficiente de variación) para comparar la variabilidad de las mediciones de forma

independiente a las magnitudes tomadas, obteniendo valores < 1% evidenciando la

precisión de los resultados16,21,22.

La Gráfica 02 muestra la curva de calibración obtenida por regresión lineal, la

cual permitió establecer la ecuación experimental para la cuantificación de sapogeninas:

y = 4,18x – 0,101. Se obtuvo un coeficiente de correlación lineal simple (R o r) de 0,997

que muestra una asociación lineal significativa entre ambas variables (absorbancia “y”;

concentración “x”). Por otro lado, el coeficiente de determinación lineal (R2) fue de

0,993 lo que indica que el ajuste lineal realizado fue bueno (99,3% de la variabilidad de

“y” es explicada por la regresión)22.

Estudios realizados por la Universidad Mayor de San Simón-Chile reportan

concentraciones del 20 al 50% de saponinas en el episperma de quinua. Sin embargo, se

debe considerar que la diferencia en la concentración de saponinas en cascarilla de



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quinua depende principalmente de la variedad, como lo demuestra Jacobsen et al

(1996) en sus investigaciones en las que reporta que el contenido de saponina en la

quinua es variable y esto depende aparentemente de un grupo de genes en las distintas

variedades de planta12,19.

El Cuadro 03 muestra el resultado de concentración (%) de saponina triterpénica

pentacíclica en la muestra de cascarilla de quinua analizada, la cual fue de 19,76 %,

resultado comparable con lo encontrado en las investigaciones antes mencionadas.

La determinación del contenido de saponinas en la cascarilla de quinua fue de

forma indirecta, ya que primero se tuvo que hallar el porcentaje de recuperación como

sapogenina, que fue de 99,68%, como se evidencia en el Cuadro 03, para luego hacer

una relación proporcional con el contenido de saponinas en la muestra de extracto seco

purificado.

La relación se fundamenta en el mecanismo de reacción entre la muestra y el

reactivo de color, que desencadena la formación del compuesto cromógeno con un

estado de excitación específico durante la absorción de la luz a una determinada

longitud de onda. La reacción se produce en el anillo de la genina y es a este nivel que

se produciría la deslocalización de un electrón durante la exposición a la energía de

los fotones, fenómeno que no está relacionado con la presencia o ausencia de azúcares

en la estructura molecular, por lo que la técnica aplicaría tanto para la saponina en su

estructura fundamental como para su genina aislada. Para este caso se optó en trabajar

con la genina de la saponina por la naturaleza del patrón empleado, que estaba como

sapogenina triterpénica pentacíclica16,20,21.

Los resultados mostrados en el Cuadro 03 evidencian que existe un 0,32 % que

no fue cuantificado como saponina triterpénica pentacíclica, esto posiblemente por la

presencia de impurezas, isómeros o por presencia de saponinas esteroidales, o por la

misma incertidumbre del método analítico.



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Con la presente técnica no se observó interferencia con los colores particulares

de la muestra y/o reactivo de color porque son restados antes de determinar las

absorbancias respectivas, mediante la preparación de un blanco16.

Los resultados obtenidos muestran, que la cascarilla obtenida de la quinua,

considerada un desecho, constituye una fuente para la obtención de saponinas.



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V.- CONCLUSIONES

1. El método espectrofotométrico empleado permite conocer la concentración de

saponinas presentes en el episperma (cascarilla) de la especie Chenopodium

quinoa willd “Quinua”.

2. La concentración de saponinas triterpénicas pentacíclicas en el episperma

(cascarilla) de la especie Chenopodium quinoa willd “Quinua” es de 19,76 %.



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VI.- RECOMENDACIONES

1. Este método espectrofotométrico puede ser usado para determinar saponina en

quinuas con distintos colores de pericarpio. Así también puede ser aplicada a

otros alimentos que presentan una cierta concentración de saponinas como en el

caso de la avena.

2. Se sugiere validar este método espectrofotométrico, para establecer evidencia

documentada de la confiabilidad de los resultados que se obtengan.

3. Se recomienda evaluar la interferencia que pueda causar las sustancias que no

son saponinas pero pueden dar color a la longitud de onda de trabajo.



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VII.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXOS

Figura 01: Extracto acuoso de saponinas

Figura 02: Extracción de saponinas por

fraccionamiento en espuma



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Figura 03: Aislamiento de las saponinas –

disolvente: Cloroformo

Fase acuosa

Fase clorofórmica

Fase del acetato

de etilo

Fase acuosa


disolvente: Acetato de etilo



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Fase n-butanólica

Fase acuosa


disolvente: n-butanol

Figura 06: Extracto seco de saponinas

purificadas



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Figura 07: Reacción de Rosell (rojo-

violáceo)

Figura 08: Reacción de Liebermann-

Burchard (rosada-púrpura)



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Figura 09: Hidrólisis de saponinas purificadas

Figura 10: Aislamiento de sapogeninas con

cloroformo

Fase acuosa

Fase clorofórmica



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Figura 11: Extracto seco de sapogeninas

Figura 12: Compuesto cromóforo (rojo púrpura)



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