Esp. Graciela Rodriguez JTP. Curso Parasitología.UNSL.

DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO

• Recolección de muestras de materia fecal.

En fresco. Con conservantes.

• Procesamiento de muestras fecales.• Técnicas de concentración: Sedimentación: -Carles-Barthelemy.

-Teleman modificado. Flotación: -Método de Willis.

-Método de Sheather.-Método de Faust.

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS DE MATERIA FECAL

Recolección de materia fecal para exámen directo o fresco:

Permite observar trofozoítos móviles. Observar dentro de los 30 minutos de

emitida. Muestra de materia fecal del tamaño de una

cucharadita de café en recipiente limpio. Evitar contaminación con orina

En pacientes que usen pañales tomar la muestra de las nalgas, nunca del pañal.

Recolección de materia fecal en conservantes:

Se usa cuando: -No se puede procesar dentro de los 30 minutos.

-Facilitar el transporte. -Conservar varios meses.

Muestra de materia fecal recién emitida en recipiente con solución conservante. Evitar contaminación con orina. ( 1 porción de materia fecal en 3 volúmenes de solución conservante)

Conservantes para muestras fecales

Conservante Ventajas Desventajas

Solución salina formolada (5 o 10 %)

-Fácil preparación-Larga duración-Buen preservante para quistes de protozoarios, larvas y huevos de helmintos

-Inapropiado para preservar trofozoítos de protozoarios-No apropiado para algunas coloraciones permanentes

MIF ( Merthiolate iodo

formaldheído)

-Fácil preparación-Larga duración-Fija y colorea los organismos

-Inapropiado para coloración permanente con técnica tricrómica-No conserva morfología de trofozoítos-El iodo distorsiona protozoarios

SAF (Acetato de sodio

ácido acético formaldheído)

-Fácil preparación -Larga duración-Apropiado para coloraciones ácido alcohol resistentes

-Requiere aditivos (albúmina- glicerina) para la adhesión de las muestras al portaobjetos-Coloraciones permanentes no tan buenas como con PVA

PVA(Alcohol

polivinílico)

-Buen preservante para trofozoítos y quistes de protozoarios. Tipificación de amebas.-Fácil preparación de preparados para coloraciones permanentes (preserva y fija)

-Inadecuada preservación de morfología de huevos de helmintos, larvas, coccidios y microsporidios-Contiene cloruro mercúrico-Difícil preparación

Solución de dicromato de

potasio

-Útil para estudio de coccidios-Apropiado para esporulación-Impide crecimiento bacteriano

-No es fijador

FRECUENCIA DE LA RECOLECCIÓN

Muestra única: en pacientes hospitalizadosMuestra seriada: - En el lapso de 7 días, no

mayor de 15 días, recoger una pequeña porción de cada deposición espontanea (mínimo 6 muestras). Mezclar con la solución conservadora. ( De esta manera se evitan las fases negativas de las parasitosis).

- Evitar ingesta de bismuto, antidiarreicos no absorbibles, aceites minerales, soluciones de contraste para radiografías (interfieren en la detección)

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS FECALES

Muestras recolectadas en fresco:

- Examen macroscópico: consistencia (sólidas, semisólidas, pastosas, líquidas), olor, color, sangre, moco, proglótides, parásitos adultos, etc.

- Examen microscópico de trofozoítos móviles entre porta y cubreobjetos.

Fase previa en los métodos de concentración: Homogeneización y filtración

FILTRADO

A

TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN

Métodos de sedimentación- centrifugación:

Teleman modificado.Carles-Barthelemy.

Métodos de flotación- centrifugación:

Método de Willis.Método de Faust.Método de Sheather.

Procedimiento:

1. Homogenizar con varilla de vidrio las heces fijadas en solución formolada.

2. Filtrar a través de un embudo con una doble gasa en tubo de centrífuga.

3. Agregar 2 ml de éter.4. Centrifugar a 1000-1500 rpm durante 3-5 minutos.5. Eliminar con golpe seco el sobrenadante.6. Tomar con pipeta pasteur una pequeña cantidad del

sedimento y colocar en portaobjetos.7. Agregar una gota de lugol y sellar con un

cubreobjeto.

Método de Teleman modificado

Método de Teleman modificado

3 a 5 min1000-1500 rpm

Volcar sobrenadante

Éter sulfúrico

Lugol

100x / 400x

2 ml

Líq. ASol. salina formolada (densidad 1,010)

Procedimiento: 1. Homogenizar con varilla de vidrio las heces fijadas

en solución formolada.2. Filtrar a través de un embudo con una doble gasa

en tubo de centrífuga.3. Centrifugar 2 a 3 minutos a 2000 rpm.4. Volcar sobrenadante. Disolver sedimento en

solución B. Agitar. Agregar 2 a 3 ml de éter sulfúrico. Agitar fuertemente. Reposar

5. Centrifugar 2 minutos a 1500 rpm. 6. Romper el anillo (capa éter) con varilla de vidrio.

Evitar que se mezcle con el sedimento.7. Centrifugar 2 minutos a 1500 rpm.8. Observar sedimento.

Método de Carles-Barthelemy

Método de Carles-Barthelemy

Líq. ASol. salina formolada

Diluir

2 a 3 min2000 rpm

Volcar sobrenadante

Éter sulfúrico

Líq. B: Sol. de Ácido cítrico, formolada (Densidad: 1.047)

2 a 3 cc

Agitar

1 min

1000 rpmTirar

Sob.

Lugol

100x / 400x Densidad 1,050-1,150

Procedimiento:1. Colocar en el frasco una muestra de materia

fecal del tamaño de un garbanzo.2. Agregar solución salina sobresaturada. Mezclar.3. Colocar un portaobjetos sobre el borde superior

del frasco y completar con la misma solución hasta que la película superficial haga contacto con el portaobjetos.

4. Dejar la solución 10 minutos a 1 hora ( 20 minutos).

5. Levantar rápida y verticalmente el portaobjetos, invirtiéndolo y colocar un cubreobjetos.

6. Observar al microscopio con bajo aumento.

Método de Willis

Método de Willis

FILTRADOSolución NaCl (densidad 1,200)

Homogeneizar

30 a 45 min

Lugol

100x / 400x

Procedimiento:1. Homogenizar con varilla de vidrio las heces fijadas en

solución formolada.2. Filtrar a través de un embudo con una doble gasa en

tubo de centrífuga.3. Centrifugar 2 minuto a 2000 rpm.4. Volcar el sobrenadante5. Disolver el sedimento en agua destilada6. Centrifugar 2 minuto a 2000 rpm. Repetir hasta que el

sobrenadante quede límpido.7. Volcar el sobrenadante. Agregar al sedimento 3 a 4 ml

de solución sulfato de cinc al 33%8. Centrifuar 2 minutos a 2000 rpm.9. Tomar con pipeta pasteur o ansa el material que flota.10. Observar al microscopio.

Método de Faust

Método de Faust

2 a 3 min2000 rpm

Volcar sobrenadante

Solución de ZnSO4

(33%) (d: 1,180)

Gota de Lugol

100x / 400x

Filtrado

H2O

2 a 3 min2000 rpm

Sacar de la superficie con ansa

Procedimiento:1. Homogenizar con varilla de vidrio las heces fijadas

en solución formolada.2. Filtrar a través de un embudo con una doble gasa en

tubo de centrífuga.3. Agregar 2 ml de éter.4. Centrifugar 3 a 5 minutos a 1000-1500 rpm.5. Eliminar con golpe seco el sobrenadante.6. Tomar una parte del sedimento y resuspenderlo en 1

ml de solución de azúcar.7. Dejar reposar 3 minutos.8. Tomar una muestra de la superficie de la solución

con pipeta pasteur y colocar en portaobjetos.9. Observar al microscopio.

Método de Sheather

Los ooquistes de Cryptosporidium spp se observan de color rosado y las levaduras de color verdoso.

Método de Sheather

3 a 5 min1000-1500 rpm

Volcar sobrenadanteÉter

sulfúrico

Lugol

100x / 400x

2 ml

Solución de sheather (sacarosa-fenol- H2O d)

1 ml

Reposar 3 minutos

Tomar con pipeta pasteur de la superficie

NORMAS DE BIOSEGURIDAD(BIOSEGURIDAD NIVEL II)

A)- Utilización de guantes protectores y ropa protectora cuando se procesan las muestras.B)- Usar cabinas de bioseguridad si es necesario.C)- Descontaminar la superficie de trabajo al comienzo y final del procesamiento de las muestras.D)- No beber, no fumar, no comer o manipular lentes de contacto en el área de trabajo.E)- Al retirarse los guantes lavarse las manos.

¨UN BUEN DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO COMIENZA CON UNA BUENA MUESTRA Y UNA BUENA MUESTRA COMIENZA CON UNA BUENA EXPLICACIÓN Y UNA BUENA EXPLICACIÓN TERMINA CUANDO NOS HEMOS ASEGURADO QUE EL PACIENTE NOS COMPRENDIÓ¨