ESCUELA POLITÉCNICA SUPERIOR. INGENIERÍA TÉCNICA...
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UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA. ESCUELA POLITÉCNICA SUPERIOR. INGENIERÍA TÉCNICA FORESTAL. CONTENIDO DE RESINA TOTAL EN FAMILIAS DE LA POBLACIÓN DE MEJORA DE Pinus radiata DE GALICIA. VARIACIÓN GENÉTICA, INDUCCIÓN MEDIANTE Metil jasmonato Y RELACIÓN CON LA RESISTENCIA A Hylobius abietis EN LABORATORIO. PROYECTO FIN DE CARRERA AUTORA: Mª CLARA FERNÁNDEZ PEÑA DIRECTORES: LUÍS SAMPEDRO PÉREZ XOAQUÍN MOREIRA TOMÉ ABRIL 2009 1
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UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA.
ESCUELA POLITÉCNICA SUPERIOR.
INGENIERÍA TÉCNICA FORESTAL.
CONTENIDO DE RESINA TOTAL EN FAMILIAS DE LA
POBLACIÓN DE MEJORA DE Pinus radiata DE GALICIA.
VARIACIÓN GENÉTICA, INDUCCIÓN MEDIANTE Metil jasmonato Y
RELACIÓN CON LA RESISTENCIA A Hylobius abietis EN
LABORATORIO.
PROYECTO FIN DE CARRERA
AUTORA: Mª CLARA FERNÁNDEZ PEÑA
DIRECTORES: LUÍS SAMPEDRO PÉREZ
XOAQUÍN MOREIRA TOMÉ
ABRIL 2009
1
UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
ESCUELA POLITÉCNICA SUPERIOR DE LUGO
INGENIERÍA TÉCNICA FORESTAL
CONTENIDO DE RESINA TOTAL EN FAMILIAS DE LA POBLACIÓN DE
MEJORA DE Pinus radiata DE GALICIA. VARIACIÓN GENÉTICA,
INDUCCIÓN MEDIANTE METIL JASMONATO Y RELACIÓN CON LA
RESISTENCIA A Hylobius abietis EN LABORATORIO.
TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
AUTORA: Mª CLARA FERNÁNDEZ PEÑA
DIRECTORES: LUIS SAMPEDRO PÉREZ
XOAQUÍN MOREIRA TOMÉ
TUTORA: Mª JOSEFA LOMBARDERO DÍAZ
Convocatoria: ABRIL 2009
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Mi agradecimiento a todas las personas que han participado de alguna forma en
este proyecto; a los directores Luis Sampedro y Xoaquín Moreira, y en especial a mis
padres, a quienes se lo dedico.
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Título: Contenido de resina total en familias de la población de mejora de Pinus radiata
de Galicia. Variación genética, inducción mediante metil jasmonato y relación con la
resistencia a Hylobius abietis en laboratorio.
Autora: Mª Clara Fernández Peña
Directores: Luis Sampedro Pérez y Xoaquín Moreira Tomé
Convocatoria: Abril 2009
Este Proyecto Fin de Carrera se ha realizado en el centro de Investigaciones
Ambientales de Lourizán bajo la dirección de los investigadores Luis Sampedro Pérez y
Xoaquín Moreira Tomé, al amparo de los Proyectos de investigación INIA-RTA 05-173
“Eficiencia del uso del fósforo en coníferas de crecimiento rápido. Variabilidad
genética, mejora y repercusiones fitosanitarias” y RTA-100 “Efectos maternos en Pinus
pinaster: influencia del estado nutricional y sanitario de árboles madre en el vigor y
resistencia de sus progenies. Implicaciones en la evaluación temprana dentro de los
programas de mejora”.
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ÍNDICE
RESUMEN 6
1.INTRODUCCIÓN 7
1.1.- El hospedador (Pinus radiata Don.) 7
1.2. El herbívoro (Hylobius abietis L.) 12
1.3. Sistemas defensivos en coníferas 15
1.4. Metil Jasmonato como inductor de defensas inducidas 17
2. HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS 19
3. MATERIAL Y MÉTODOS 20
3.1. Material vegetal 20
3.2. Diseño experimental 20
3.3. Aplicación de los tratamientos experimentales y cosechado 22
3.4. Captura de H. abietis 23
3.5. Bioensayo “in vivo” 24
3.6. Bioensayo “in vitro” 25
3.7. Medición y análisis de mordeduras 26
3.8. Determinación del contenido de resina 26
4. RESULTADOS 28
5. DISCUSIÓN 35
5.1. Efecto del genotipo sobre la producción de resina en tallos de juveniles
de P. radiata
35
5.2. Efecto de los tratamientos de inducción sobre la producción de resina en
tallos de juveniles de P. radiata
36
5.3. Efecto de los tratamientos de inducción sobre el ataque del herbívoro H.
abietis a juveniles de P. radiata
37
6. CONCLUSIONES 40
7. BIBLIOGRAFÍA 41
8. SUMMARY 47
9. RESUMO 48
5
RESUMEN
Pinus radiata Don. es una de las especies más importantes del sector forestal gallego.
En los años 80 se instaló en Sergude (A Coruña) un huerto semillero injertando clones
de árboles plus con el fin de obtener semilla de alta calidad genética para repoblar los
montes gallegos. Los genotipos de P. radiata seleccionados presentaban mejores
crecimientos, mayor rectitud del fuste y menor ramosidad para aumentar con ello la
producción de volumen de madera, tanto en calidad como en cantidad. Además del
estudio del crecimiento de estas progenies mejoradas, en los últimos años también se ha
mostrado que la resistencia a plagas y enfermedades y los sistemas defensivos que las
plantas emplean para combatir contra ellas también están sujetos a variación genética.
En el presente trabajo se ha evaluado (i) la variación genética en el contenido de
defensas, tanto constitutivas como inducidas, (medido como contenido de resina), (ii) el
efecto de la aplicación exógena de metil jasmonato (MeJa) y la realización de heridas
mecánicas en el tallo de las plantas en las respuestas defensivas (evaluadas como
contenido de resina) y, por último, (iii) la posibilidad de emplear bioensayos para
detectar la variación en la resistencia a Hylobius abietis L. Entre los resultados de este
trabajo, no hemos detectado, con los métodos empleados, efecto familiar en el
contenido de defensas, ni tampoco en la capacidad de expresar defensas inducidas entre
las diferentes familias de pino estudiadas (interacción MJxG no significativa). Por otro
lado, los tratamientos de inducción fueron efectivos a la hora de inducir defensas en las
plantas. Las plantas a las que se realizaron heridas mecánicas presentaron un contenido
de resina un 25 % y un 45 % mayor que las plantas tratadas con MeJa y las plantas
control, respectivamente. Sin embargo, a pesar de que los tratamientos de inducción
incrementaron la producción de resina en los tallos, éstos no redujeron de forma
significativa la preferencia del curculiónido H. abietis, tanto cuando fue evaluada en
bioensayo con planta viva (in vivo) como en bioensayo en placa Petri (in vitro).
Palabras clave: Pinus radiata, resina, Hylobius abietis, variación genética, defensas
constitutivas, defensas inducidas
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1.INTRODUCCIÓN
1.1.- El hospedador (Pinus radiata Don.)
La especie Pinus radiata, pertenece al orden coniferales, familia Pinaceae. Se
conoce vulgarmente como pino insigne, pino de Monterrey o pino radiata. Es originario
del Suroeste de Estados Unidos, principalmente del litoral e islas de California (Figura
1.1), donde su área de distribución natural actual es muy reducida (unas 6000 ha), y en
esta zona está protegida debido a la excesiva presión de herbivoría a la que se encuentra
sometida por una excesiva densidad de cabras (Dans et al., 1999)
Figura 1.1. Mapa de distribución natural de P. radiata. (a) www.plants.usda.gov (b)
www.fao.org/docrep
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Es una especie de crecimiento rápido, pudiendo alcanzar una altura de 30
metros y un diámetro de 50 centímetros en un intervalo de tiempo de 25-35 años. Posee
un follaje verde hierba, que forma una copa cónica de joven y luego bastante regular,
grande y densa. El tronco es derecho y con una corteza oscura y con grietas. Las hojas
forman grupos de tres acículas (7-15 cm) blandas, flexibles, verde oscuras y brillantes,
sobre ramillas pardo encarnadas. Los conos son sésiles, ovalados, asimétricos, de 7-14
cm por 5-8 cm, normalmente aparecen agrupadas (2-3-5); poseen una giba por donde les
da el sol, con una apófisis redondeada, no pinchuda (Figura 1.2). Las piñas permanecen
largos periodos en las ramas (serotina) aunque son bienales.
Figura 1.2. Organografía de P. radita (www.geocities.com)
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P. radiata es una especie de clima suave y húmedo, termófila, que sufre mucho
con las heladas, sobre todo si son tardías. Su mayor crecimiento se produce en suelos de
naturaleza sílice y profundos. Es resistente a fuertes vientos.
La madera de esta especie posee unas cualidades técnicas muy aceptables
(ligera, blanda y con poca resina), destacando su fibra larga, que la hace apreciada en la
industria de al celulosa química (cartones, cartulinas y papeles con cierta resistencia) y
la obtención de fustes sin curvaturas, por lo que las trozas son largas y rectas para su
empleo en la construcción. Actualmente, la mayor parte de la madera de esta especie se
destina a la industria del aserrío y tableros. Esto es debido a las progresivas
sustituciones de masas de Pinus pinaster por el eucalipto en repoblaciones, creando un
déficit en este sector (Dans et al., 1999).
En 1833, esta especie exótica llegó a Inglaterra, poco después a España (País
Vasco) y más tarde a Galicia. Su expansión global comenzó en los años 30 del siglo XX
en Nueva Zelanda, convirtiéndose en país pionero. Su auge como especie de
repoblación, llegó en los años 60, llegando a ocupar el 65% de las plantaciones con
especies exóticas. Otros países donde ha tenido una buena acogida son: Sudáfrica,
Australia, Brasil y Chile (Figura 1.3); esta última destaca ya que sus plantaciones con P.
radiata ocupan el 78% del total de la superficie reforestada (Dans et al., 1999).
La consolidación de esta especie en los montes de Galicia (principalmente en A
Coruña y Lugo Occidental) se produjo en los años 90, siglo XX, gracias a unas ayudas
distribuidas por la Unión Europea destinadas a la forestación de tierras agrarias, como
consecuencia de la reforma de la Política Agraria Comunitaria (reglamento de la UE
2080/92).
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Figura 1.3. Distribución mundial de P. radiata. (www.gabarro.com).
En los años setenta, esta especie experimenta una regresión debido a los problemas
sanitarios que presenta, sustituyéndolo por especies más resistentes (Dans et al., 1999).
Caben destacar algunas de las plagas y enfermedades que más le afectan: Hylobius
abietis (gorgojo del pino), perforador que ocasiona daños en el tronco alimentándose en
el cambium y floema, pudiendo provocar la muerte de la planta en fase juvenil (Zas et
al., 2008); Thamatopoea pityocampa (procesionaria del pino), defoliador, las orugas
producen fuertes defoliaciones en los árboles en el invierno, ocasionando una pérdida de
crecimiento en grosor (Cobos Suarez y Ruiz Urrestarazu, 1990); Tomicus piniperda,
perforador, la hembra realiza galerías para la reproducción y la puesta, las larvas que
nacen se alimentan del floema y el cambium ocasionando la muerte al hospedador y en
la fase de copas causa también una reducción del crecieminto (Cobos Suarez y Ruiz
Urrestarazu, 1990, Lombardero et al., 2008); Mycosphaerella pini (enfermedad de la
banda roja), hongo defoliador activo que reduce el crecimiento tanto en diámetro como
en altura, afectando más a plantas jóvenes que a adultos (Cobos Suarez y Ruiz
Urrestarazu, 1990); y Fusarium circinatum, hongo que causa daño en semillas, planta
de viveros y árboles adultos, puede provocar la muerte punta del árbol (Ioos et al.,
2009).
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Actualmente, P. radiata ocupa una superficie a nivel mundial de 4,1 millones de
ha (www.todochile.cl). Según el tercer Inventario Nacional Forestal del año 2007, la
superficie total española forestal es de 27,527.974 millones de ha (54.44% del territorio
total) de las cuales 18,265.394 ha son monte arbolado (la mayor parte se localiza en la
zona atlántica). P. radiata ocupa 9.918 ha arbolada repartidas por Galicia, País Vasco y
Cornisa Cantábrica. Tiene un turno de 35 años con una producción media de 18
m3/ha.año, con una calidad de estación buena (Dans et al., 1999).
La adaptación de P. radiata como especie exótica es tan próspera que su
producción mundial equivale al 13% del consumo de madera de la UE (Dans et al.,
1999). Es la tercera especie forestal en importancia comercial como materia prima de
Galicia, junto con P. pinaster y Eucalyptus globulus. Estas tres especies conforman el
90% de la industria forestal gallega. En los montes gallegos el crecimiento anual
productivo de esta especie es de 912 miles de metros cúbicos (Xunta de Galicia, 2005).
Según el tercer Inventario Forestal Nacional del año 2007, las existencias de esta
especie son 7,6 millones de metros cúbicos.
En las repoblaciones, sobre todo en Galicia, lo ideal es seleccionar el material a
edades tempranas, en viveros, escogiendo los mejores genotipos o familias (Zas et al.,
2004). Debido a la importancia productiva de P. radiata en el sector forestal gallego, en
los años 80 se impulsó un programa de mejora genética para dicha especie. Su objetivo
fue proporcionar semilla de alta calidad genética por lo que se seleccionaron árboles
plus y se injertaron en un huerto semillero en Sergude (A Coruña). Estos árboles plus
presentaban unas características mejores que el resto: mayor altura y diámetro, rectitud
del fuste y baja ramosidad. Con todo ello se busca un incremento en la producción de
volumen de madera, tanto en cantidad como calidad. La mejora genética de esta especie
es de destacada importancia ya que junto con P. pinaster y E. globulus son las especies
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más utilizadas en repoblaciones en Galicia, donde se plantan anualmente entre 3000 a
6000 ha (Red de información Forestal para Europa).
1.2. El herbívoro (Hylobius abietis L.)
H. abietis es un coleóptero de la familia Curculionidae. Este insecto posee un
ciclo biológico bastante complejo (Figura 1.4). Las hembras, después de invernar entre
la hojarasca del suelo, realizan la puesta (de uno a cinco huevos) sobre tocones o raíces
de árboles recién apeados o enfermos. La puesta se lleva a cabo principalmente en
primavera aunque también lo pueden hacer en otras épocas del año. Se reproducen
continuamente pudiendo llegar a poner una hembra entre 60-100 huevos. Las larvas
nacen de 2-3 semanas después de la puesta. Son blanquecinas, encorvadas,
relativamente gruesas y con la cabeza marrón. Miden de 14-16 mm. Las larvas se
alimentan debajo de la corteza, haciendo galerías descendentes. Para finalizar su
desarrollo entran en una fase de pupación dentro de la galería, que dura entre 2-3
semanas. Pasado este tiempo el insecto perfectamente formado, abandona la cámara de
pupación perforando la corteza. El imago tiene una longitud de 7-13 mm, posee una
trompa ligeramente arqueada y unas antenas insertadas en su extremo anterior. Tiene
una coloración mayoritariamente negruzca. El gorgojo para completar su desarrollo
tiende a volar largas distancias hasta encontrar un sitio idóneo para su alimentación y
reproducción (Orlander et al., 2000). Suelen vivir entre 2-3 años.
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Figura 1.4. Ciclo de vida de Hylobius abietis. (www.forestry.gov.uk/forestry)
H. abietis es una de las plagas más importantes en coníferas en Europa (Leather
et al., 1999). Las masas más importantes de este insecto se sitúan en el norte y centro
de Europa (Bylund et al., 2004; Wainhouse, 2004), siendo muy peligroso para
repoblaciones jóvenes, ya que al ser más pequeñas las plantas, su vulnerabilidad frente
al ataque de la plaga es mayor (Von Sydow, 1997).
El imago come durante todo el periodo vegetativo pero destacan dos ataques,
uno en primavera y otro en otoño. Se alimenta de la corteza y del floema de la planta
(Figura 1.5) pudiendo ocasionar la muerte por anillamiento del tallo si la intensidad del
ataque es lo suficientemente alta (Zas et al., 2005; Zas et al., 2006). Las plantas que
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sobreviven presentan normalmente la pérdida de la guía principal y una reducción
importante de su crecimiento (Zas et al., 2005; Zas et al., 2006).
Figura 1.5. Daño en ramillo causado por H. abietis.
Existen factores que pueden favorecer la permanencia de esta plaga, el
debilitamiento de las plantas y en especial la presencia de restos de corta y tocones, ya
que los imagos se sienten atraídos por el olor que desprende la madera recién cortada
(Leather et al., 1999).
Como medidas preventivas son recomendables realizar después de la corta una
quema de ramas gruesas y eliminación de tocones (algo poco viable porque es muy
caro) (Orlander et al., 2001), retrasar el establecimiento de la masa (para que los
insectos no encuentren plántulas jóvenes y susceptibles de ser atacadas) (Leather et al.,
1999), la escarificación del suelo que afecta a los 5-10 primeros cm del suelo (Petersson
y Orlander, 2003) y proteger el nuevo arbolado con barreras físicas (Nordlander et al.,
2008). Todas estas medidas de prevención suponen un aumento en el coste de las
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repoblaciones por lo que es de interés encontrar un equilibrio donde coexista un buen
crecimiento y una buena defensa contra los posibles ataques.
1.3. Sistemas defensivos en coníferas
Las coníferas son el grupo de árboles superiores más antiguos y han sobrevivido
a las adversidades hasta nuestros días, por lo que es lógico pensar que su capacidad para
defenderse de los ataques ha sido clave (Phillips y Croteau, 1999). Debido a las
numerosas plagas y enfermedades que existen y a las que están expuestos los árboles,
estos deben defenderse u oponer resistencia para poder persistir (Phillips y Croteau,
1999).
Los sistemas de defensas son estructuras físicas o sustancias químicas que
funcionan de forma conjunta para defender a la planta del ataque de los organismos. Las
primeras se basan en la producción de estructuras que protegen a la planta del ataque,
como por ejemplo endurecimiento de las hojas, alto grosor de corteza, aparición de
pelos o espinas o la impregnación de tejidos con lignina (Franceschi et al., 2005). Las
segundas se basan en la producción, acumulación y liberación de sustancias tóxicas o
repulsivas para los herbívoros (Franceschi et al., 2005). En ambas la construcción y
mantenimiento de estas defensas lleva asociado un coste energético de la planta, por lo
que deberá existir una compensación entre el crecimiento y la defensa (Karban et al.,
1997).
Las defensas en las plantas, tanto si son mecánicas como químicas, pueden ser
de dos tipos: constitutivas o inducidas (Berryman, 1972). Las defensas constitutitas son
generalizadas, se localizan por la mayor parte de los tejidos de la corteza, floema, en
tejidos foliares y también en menor medida en el xilema (Franceschi et al., 2005). Estos
mecanismos están siempre presentes en la planta y la protegen de forma continua del
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ataque de insectos herbívoros u otros patógenos (Franceschi et al., 2005). La defensa
constitutiva más importante en coníferas es la producción de oleoresina, una mezcla de
ácidos resinosos y terpenos, que se produce en células resinosas y canales resiníferos del
floema y xilema (Franceschi et al., 2005). Las células de resina acumulan resina
internamente bajo presión, cuando existe un daño la resina bajo presión se lanza contra
el organismo encerrándolo o matándolo con su toxicidad (Franceschi et al., 2005). Otra
defensa química y de gran importancia en coníferas es la producción de compuestos
fenólicos en diferentes tejidos de las plantas, especialmente en las hojas (Franceschi et
al., 2005). Por otro lado, las defensas inducidas son aquellas que aparecen como
consecuencia de un ataque, con la finalidad de incrementar la respuesta a esa primera
invasión, y de prever futuros probables ataques (Karban et al., 1997; Franceschi et al.,
2005). Esta respuesta inducida se localiza normalmente justo donde se produce la
agresión. Entre las defensas inducidas más comunes en coníferas encontramos el
aumento del flujo de resina (Tisdale et al., 2003), la síntesis de células polifenólicas en
el parénquima (Franceschi et al., 2000), la formación de canales resiníferos traumáticos
(Fäldt et al., 2003; Hudgins et al., 2004) o el incremento en el contenido de sustancias
repelentes o tóxicas para los herbívoros como por ejemplo fenoles o alcaloides
(Franceschi et al., 2005). Las defensas constitutivas e inducidas tienen distinta
naturaleza. Las defensas constitutivas normalmente están reguladas por la genética del
individuo y el ambiente en el que viven (Franceschi et al., 2005), mientras que las
defensas inducidas dependen también de la propia naturaleza del ataque (Franceschi et
al., 2005).
Ambas defensas (constitutivas e inducidas) tienen ventajas e inconvenientes. Las
defensas constitutivas al estar formadas antes de que se produzca el ataque o agresión,
cuando éste llega la planta ya están preparadas, obteniéndose de este modo una
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respuesta defensiva rápida. Sin embargo, si no apareciese ningún ataque o agresión, se
habría inmovilizado una alta cantidad de energía de forma inútil necesaria para otros
procesos (Franceschi et al., 2005). En cambio, para las defensas inducidas sólo se
dedica la energía necesaria cuando se produce la agresión (Agrawal et al., 1999;
Franceschi et al., 2005). El gran inconveniente es que esta respuesta inducida, en la
mayoría de los casos, no es inmediata a la agresión (Franceschi et al., 2005). Ambas
defensas son necesarias, y habitualmente una relación óptima entre ambas estrategias
produce una mejor defensa de la planta en cada circunstancia ambiental (disponibilidad
de nutrientes, frecuencia esperable de ataques, agresividad de lo posibles patógenos en
la zona, etc.) (Franceschi et al., 2005).
Existen cuatros fases que definen el mecanismo de defensa de las plantas
(Franceschi et al., 2005). Franceschi et al. (2005) proponen que en una primera fase, las
defensas constitutivas repelen o impiden la invasión, si esto no fuese efectivo, se pasa a
una segunda fase donde el objetivo es matar o frenar la invasión del organismo. En la
tercera fase se procede a sellar los daños producidos para que la planta pueda seguir
funcionando con normalidad y además se evita el ataque de oportunistas (Franceschi et
al., 2005). La última y cuarta fase, se corresponde con la resistencia sistemática a
futuros ataques que serán más fáciles de defender (Franceschi et al., 2005).
1.4. Metil Jasmonato como inductor de defensas inducidas
El Metil jasmonato (MeJa) es una fitohormona que aplicada de forma exógena a
las plantas ha resultado útil para la elicitación de respuestas defensivas inducidas
similares a las que se producirían por el ataque de un herbívoro (Franceschi et al., 2002;
Zeneli et al., 2006). Varios autores han observado que su aplicación en especies de
coníferas induce reacciones defensivas como son: la formación de conductos
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traumáticos de resina (Martin et al., 2002), la síntesis y acumulación de mono y
diterpenos (Martin et al., 2002) o la formación de células parenquimáticas polifenólicas
en la zona cambial (Erbilgin et al., 2006; Zeneli et al., 2006). Todavía se ha investigado
poco sobre este tema en coníferas, pero está demostrado que el tratamiento con MeJa
induce resistencia en Picea abies a los hongos Ceratocystis polonica Siem. (Moreau)
(Franceschi et al., 2002; Zeneli et al., 2006) a Diplodia pinea (Desm.) en P. radiata
(Gould et al., 2008) y a H. abietis en Pinus sylvestris L. (Heijari et al., 2005). Sin
embargo, los sistemas defensivos de las plantas pueden ser también inducidos por otros
métodos, unos son bióticos como herbivoría real y controlada (mediante bioensayos) y
otros son abióticos, con sustancias químicas como el benzo (1,2,3) thiadiazole-7-
carbothioic acid S-methyl ester (BTH) o ácido salicílico, o con héridas mecánicas en
diferentes partes de la planta (‘mechanical wounding’).
En tres proyectos fin de carrera previamente realizados en el CINAM de
Lourizán se ha observado que la aplicación de MeJa en plantas juveniles de P. pinaster
es capaz de estimular la producción de compuestos defensivos como por ejemplo un
incremento del contenido de resina en los tallos (Blanco, 2007), un incremento del
contenido de fenoles foliares (Rodríguez-Morales, 2008) o un menor consumo de
floema por parte de H. abietis en bioensayos realizados en laboratorio con respecto al
control (Costas, 2007). Sin embargo, hasta la fecha se desconoce cuales son los efectos
de la aplicación del MeJa en plantas juveniles de P. radiata.
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2. HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS
En este trabajo pretendemos evaluar la variación genética en la resistencia a
insectos en juveniles de P. radiata. Para ello evaluaremos el contenido de resina en los
tallos de plántulas de 2 años inducidas o no con MeJa, valorando la eficacia de este
carácter como evaluador de la resistencia a insectos mediante el establecimiento de
bioensayos “in vivo” e “in vitro” con el herbívoro generalista H. abietis. Para ello se
plantean los siguientes objetivos:
1. Estudiar si existe variación genética en el contenido de resina constitutiva e inducida
entre familias juveniles de la población de mejora de Galicia de P. radiata.
2. Evaluar si la aplicación exógena de MeJa y la realización de heridas mecánicas en el
tallo de las plantas son efectivas como agentes inductores de respuestas defensivas
(evaluadas como contenido de resina) en plántulas de P. radiata.
3. Estudiar si la aplicación exógena de MeJa y la realización de heridas mecánicas en el
tallo de las plantas aumentan la resistencia contra el herbívoro H. abietis.
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3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. Material vegetal
Para responder a los objetivos de este trabajo, se realizó un experimento en
invernadero en el que se sometieron 36 familias de medios hermanos de P. radiata
procedentes de polinización abierta de árboles plus de primera generación del huerto
semillero de Sergude a tres tratamientos experimentales (un control no tratado y dos
tratamientos de inducción de defensas). En Abril del 2006, las plantas fueron
germinadas y cultivadas en el invernadero del CINAM de Lourizán en condiciones
controladas de luz, temperatura y humedad. Se dispusieron dos plantas, apropiadamente
identificadas, en macetas de polietireno negro de 2 litros. Se sembraron sobre una
mezcla de de turba parda y perlita (1:1 volumen:volumen) y 12 gramos de fertilizante de
liberacion lenta (Multicote®; N:P:K 15:15:15). Fueron regadas diariamente con agua,
mediante aspersión temporizada. Las plantas se dispusieron en el diseño de bloques
definitivo en el primer invierno.
3.2. Diseño experimental
El diseño experimental de este estudio fue un split-plot replicado en cuatro
bloques (Figura 3.1). Cada bloque está dividido en tres tratamientos: un control no
tratado y dos tratamientos de inducción, uno mediante la aplicación exógena de MeJa y
otro basado en la realización de heridas mecánicas en el tallo (‘mechanical wounding’)
(Figura 3.1). Para reducir el esfuerzo experimental, se utilizó un tamaño muestral
diferente para cada uno de los tres objetivos planteados. Por tanto, cada tratamiento tuvo
un número de familias diferente. En los tratamientos control y MeJa se emplearon 36
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familias, mientras que para el tratamineto de heridas mecánicas se emplearon 10
familias elegidas al azar dentro de las 36 totales de las que consta el estudio.
Para un primer objetivo, analizar si la variación genética influye en la cantidad
de defensas constitutivas e inducidas, se emplearon dos tratamientos, un control no
tratado para estudiar las defensas constitutivas, y un tratamiento de inducción de MeJa
para estudiar las defensas inducidas, en 36 familias para un total de 288 plantas (36
familias x 2 tratamientos x 4 bloques).
Para el estudio del segundo objetivo, comparar los daños físicos (‘mechanical
wounding’ o heridas mecánicas) con la inducción mediante MeJa el tamaño muestral se
redujo a 10 familias de las 36, en 3 tratamientos (control, MeJa y heridas mecánicas)
para un total de 120 plantas (10 familias x 3 tratamientos x 4 bloques).
Para el estudio del tercer objetivo, estudiar la efectividad dos tratamientos de
inducción en la resistencia contra H. abietis, se emplearon dos bioensayos, uno “in
vivo” con planta viva y otro “in vitro” con segmentos de tallo en placas de Petri. Para el
bioensayo “in vitro” se emplearon tres tratamientos (un control no tratado y dos
tratamientos de inducción, MeJa y heridas mecánicas). En los tratamientos control y
MeJa se emplearon 36 familias y para el tratamiento de heridas mecánicas 10 familias
para un total de 328 plantas (36 familias x 2 tratamientos x 4 bloques + 10 familias x 1
tratamiento x 4 bloques). En el bioensayo “in vivo” el tamaño muestral se redujo a 10
familias, en 3 tratamientos (control, MeJa y heridas mecánicas) para un total de 120
plantas (10 familias x 3 tratamientos x 4 bloques).
21
22
Figura 3.1. Diseño experimental.
3.3. Aplicación de los tratamientos experimentales y cosechado
A los dos años (Julio 2008) se midió diámetro y altura de todas las plantas, y se
aplicaron los distintos tratamientos experimentales de inducción de defensas (heridas
mecánicas y aplicación del MeJa).
El tratamiento de MeJa se aplicó planta por planta mediante pulverización de
aproximadamente 6 ml de una solucion 25 mM de MeJa en agua destilada con Tween
20® al 0.1% v/v. A las plantas control se le aplicó de idéntica forma agua destilada.
Las heridas mecánicas se realizaron con una herramienta (sacabocados)
practicando una pequeña herida en la mitad del tallo que profundizase hasta el xilema.
Un mes después de la aplicación de los tratamientos de inducción, se midió
diámetro y altura de todas las plantas, y se cosechó una planta por maceta, sellando el
pequeño tocón con masilla. Las plantas cosechadas se cortaron en partes, separando la
fracción destinada a la evaluación de las defensas mediante bioensayo con H. abietis
‘MECHANICAL CONTROL METIL JASMONATO
WOUNDING’
N =36 familias N =36 familias N =10 familias
BLOQUE
(bioensayo “in vitro”), y el resto del material se conservó en bolsas de plástico
etiquetadas en un congelador a -30 ºC para analizarlas posteriormente.
3.4. Captura de H. abietis
Para realizar los bioensayos planificados necesitábamos disponer de unos 300
ejemplares de H. abietis. Para su captura, se colocaron trampas por distintos pinares de
Ourense y Pontevedra. Estas trampas consistían en obtener trozos de corteza y floema
de pino y situarlas en el suelo con la parte externa hacia arriba (Figura 3.2a),
añadiéndole un chorro de esencia de trementina y otro de etanol (Moreira et al., 2008).
El olor de esta combinación de productos atraía intensivamente a estos insectos a las
trampas. Un día o dos después, se levantaban y se capturaban los imagos que podían
aparecer comiendo en el floema, escondidos en las grietas de la corteza, o bien
enterrados por el suelo bajo la trampa. El promedio de capturas fue variable, pero
oscilaba entre 1-4 insectos por trampa y día, dependiendo sobre todo de la zona de
captura. De esta forma se capturaron unos 500 ejemplares aproximadamente. Para
intentar reducir el estrés de los insectos capturados, se simuló su hábitat disponiendo en
la base de un recipiente de polietileno ventilado, una capa de arena y otra superior de
serrín humedecida con agua, y cubierta con trozos de corteza (Figura 3.2b). Las cajas de
cultivo se guardaban en un cuarto oscuro dentro de unas neveras a 14ºC para evitar que
tuviesen demasiada actividad, alimentándolos periodicamente con tallos de juveniles de
P. radiata.
Un día antes de realizar los bioensayos, se sacaron los ejemplares necesarios de
las cajas, se pesaron en una balanza de tres decimales y se dispusieron individualmente
en placas Petri numeradas con una base de papel de filtro humedecido. Se guardaron de
23
nuevo en la nevera a 14ºC y se les dejó 24 horas sin comida. Al día siguiente se
realizaron los bioensayos.
Figura 3.2 (a) Trampas con corteza para H. abietis y (b) caja de cultivo para la captura
de H. abietis.
3.5. Bioensayo “in vivo”
Este bioensayo se realizó en la segunda planta que quedó sin cosechar de cada
maceta. Para encerrar al insecto en la sección media de la planta viva se empleó una tela
de tul con unas dimensiones de 25 x 35 cm. Se dobló por la mitad más ancha y se
graparon los extremos quedando una forma de cilindro (Figura 3.3). La planta se
introdujo por el hueco, los extremos se cerraron con cinta adhesiva dejando una forma
de huso e introduciendo el H. abietis, de peso conocido, en su interior. El insecto se
alimentó de la planta viva durante 24 horas, luego se cosecharon las plantas y se
congelaron a -30ºC para su posterior valoración de las mordeduras y del contenido de
resina.
24
25
Figura 3.3. Bioensayo ”in vivo”.
3.6. Bioensayo “in vitro”
Al cosechar las plantas, se destinaron dos segmentos de los extremos de la parte
central de la planta para este bioensayo, de aproximadamente 2,5 cm cada uno. Los dos
segmentos de cada planta se introdujeron en las placas Petri numeradas con un insecto
previamente pesado (Figura 3.4). La numeración se corresponde con un número de
muestra concreto. El insecto permaneció en una cámara de cultivo a 18 ºC, a oscuras y
durante 24 horas comiendo. Al finalizar, se retiró el insecto y los tronquitos se
guardaron en las placas Petri en la nevera a 4 ºC para el posterior análisis de los daños o
mordeduras.
3.7. Medición y análisis de mordeduras
El análisis de mordeduras de H. abietis, fue idéntico para los dos bioensayos. En
ambos casos se cogió el segmento de tallo empleado, se envolvió en su totalidad con
celo transparente y con un rotulador permanente se dibujaron las mordeduras
ocasionadas; luego se despegó el celo y se pegó en un folio en blanco A4, nombrándolo
con el correspondiente número de muestra. Posteriormente, se escanearon los folios con
los celos pegados y se empleó el programa de análisis de imagen Image-ProPlus® para
calcular el área de la superficie total del tronco y el área de las mordeduras ocasionados
por el insecto (marcadas por el rotulador permanente).
3.8. Determinación del contenido de resina
Para la evaluación del contenido de defensas constitutivas e inducidas de P.
radiata, se determinó el contenido de resina por unidad de peso seco del tallo (mg de
residuo resinoso g-1 peso seco del tallo) siguiendo el método propuesto por Wainhouse
et al. (2000) ligeramente modificado. Para ello, se cortaron pequeños segmentos de tallo
(5 cm aproximadamente) de la parte basal, separada 5 cm del cuello de la raíz. Cada
muestra se colocó en un tubo de vidrio previamente numerado y pesado en una balanza
de precisión, hasta el miligramo. A continuación, se añadió hexano a cada tubo hasta
cubrir la muestra. El hexano es un disolvente volátil que se emplea para la extracción de
resina. Cada uno de los tubos se agitó mediante un vortex VWR (VV3) a velocidad 2x y
se metieron en tandas de 50 tubos en gradillas metálicas en un baño de ultrasonidos
(BRANSON 2510) a 40-45ºC durante 10 minutos, para facilitar la penetración del
hexano en el sistema de canales resiníferos del tronco. Durante un día, se dejó reposar
en la campana extractora. Pasadas las 24 horas, se procedió a filtrar el material vegetal
segmentado con la ayuda de un embudo y con un papel de filtro de fibra de vidrio
26
(Glass Fiber Filters, VWR), recogiendo el solvente en un segundo tubo numerado y
pesado. Después de la primera filtración, se vuelve a añadir hexano a la muestra, a
agitar, a meter en el baño de ultrasonidos e imediatamente después se realiza la segunda
filtración. Los tubos con los restos de los troncos se secaron en una estufa (BINDER) a
80ºC durante 24 horas y los restos de hexano con resina se dejaron en la campana
extractora hasta que se volatilizase todo el hexano, dejando la resina en el tubo
(aproximadamente 72 horas). Por último, se pesaron todos los tubos en balanza de
precisión y por diferencia de peso entre los tubos de la primera y segunda filtración y
los pesos de los mismos vacíos se calcularon los mg de residuo resinoso (suma de los
mg de la primera y segunda filtración). De forma idéntica se pesaron los tubos con los
tallos secos y por diferencia de pesos del tubo lleno (con los tronquitos) y vacío se
calcularon los g de peso seco del tallo. La resina total fue medida como mg residuo
resinoso por g de peso seco del tallo.
27
28
Cuadro 3.1. Diagrama de los bioensayos.
Fig. 1. Trampas en campo para H. abietis .
Fig. 2. Contenedor de cultivo para H. abietis
.
Fig. 3.a. Bioensayo in vivo Fig. 3.b. Bioensayo in vitro
Fig. 4.b. Daños causados
por el insecto
Fig 5. Evaluación de daños con celo transparente
Fig. 6. Análisis de mordeduras con Image Pro Plus
Fig. 4.a. Daños causados por el insecto
29
Fig. 1. Segmentacion del tallo Fig. 2. Añadir hexano muestras
Fig. 3. Gradilla con 50
Fig. 6. Reposo en campana Fig. 5. (Fig. 9.) Baño de ultrasonidos Fig. 4.Agitar con un vortex extractora
Fig. 7. (Fig. 10.) Fig. 8. Añadir hexano de nuevo Filtraciones 2ª extracción
Fig. 11. Estufa 80ºC Fig. 12. Extracciones de resina
Fig. 13. Pesada en balanza de precisión.
Cuadro 3.2. Método de la extracción de resina.
4. RESULTADOS
En las tablas 1 y 2 se muestran los resultados del análisis estadístico de las
mediciones del contenido de resina realizados según los factores de diseño para los
objetivos 1 y 2. En ellas se pueden observar los grados de libertad del numerador (GL
num), los grados de libertad del denominador (error; GL den), el valor del estadístico F
y la probabilidad (p) de aceptar la hipótesis nula para el correspondiente valor de F y sus
grados de libertad para cada uno de los efectos.
Para el primer objetivo, analizar si la variación genética influye en la capacidad
de inducir defensas, observamos que el efecto de la pertenencia a una u otra familia de
P. radiata y la interacción entre el tratamiento de MeJa y la familia (TxG) no resultaron
significativas (Tabla 4.1). Por otro lado, la aplicación experimental de MeJa afectó de
manera significativa al contenido de resina en el tallo de los pinos (Tabla 4.1), de
manera que las plantas tratadas con MeJa presentaron un contenido de resina un 20 %
mayor que las plantas control (Figura 4.1). Esto indica que el tratamiento con MeJa fue
efectivo induciendo la cantidad de resina en el tallo.
Tabla 4.1. Resumen del análisis de varianza según el modelo mixto para el contenido de resina en el tallo de plantas de 2 años de edad pertenecientes a 36 familias de polinización abierta de P. radiata sometidas a dos tratamientos de inducción de defensas (control y 25 mM MeJa).
Efecto GLnum GLden F p
B 3 3 0,10 0,953
T 1 3 22,26 0,018
G 35 104 1,15 0,290
TxG 35 104 1,30 0,153
BxG 105 104 0,97 0,556
30
0
5
10
15
20
25
Control MeJa
b
am
gre
sidu
o re
sino
so g
-1pe
so s
eco
31
Figura 4.1. Contenido de resina en el tallo de plantas de 2 años de edad de P. radiata sometidas a dos tratamientos de inducción de defensas (control y 25 mM MeJa). Los datos mostrados son las lsmeans ± error estándar. N = 144.
Para el segundo objetivo, comparar el efecto de la inducción mediante daños
físicos (‘mechanical wounding’ o mordeduras artificiales) con la inducción mediante
MeJa, observamos que el realizar heridas mecánicas a las plantas afectó
significativamente al contenido de resina en el tallo de los pinos (Tabla 4.2). Las plantas
a las que se realizaron heridas mecánicas presentaron un contenido de resina un 25 % y
un 45 % mayor (ambas significativamente diferentes) que las plantas tratadas con MeJa
y las plantas control, respectivamente (Figura 4.2). Por otro lado, en este grupo de
familias sí que observamos diferencias significativas en el contenido de resina entre las
diferentes familias de P. radiata (Tabla 4.2) y, además, la interacción entre el
tratamiento de inducción de defensas y la familia (TxG) también fue significativo
(Tabla 4.2, Figura 4.3), demostrando de este modo que las diferentes familias de pino
tienen una capacidad de inducción de defensas dispar.
32
Tabla 4.2. Resumen del análisis de varianza según el modelo mixto para el contenido de resina en el tallo de plantas de 2 años de edad pertenecientes a 10 familias de polinización abierta de P. radiata sometidas a tres tratamientos de inducción de defensas (control, 25 mM MeJa y mechanical wounding).
Efecto GLnum GLden F p
B 3 6 0,24 0,863
T 2 6 12,06 0,008
G 9 55 2,97 0,006
TxG 18 55 1,83 0,045
BxG 27 55 1,60 0,069
Figura 4.2. Contenido de resina en el tallo de plantas de 2 años de edad de P. radiata sometidas a tres tratamientos de inducción de defensas (control, 25 mM MeJa y mechanical wounding). Los datos mostrados son las lsmeans ± error estándar. N = 40.
0
5
10
15
20
25
30
Control MeJa Mechanicalwounding
mg
resi
duo
resi
noso
g-1
peso
sec
o
c
a
b
33
Figura 4.3. Contenido de resina en el tallo de plantas de 2 años de edad pertenecientes a 10 familias de polinización abierta de P. radiata sometidas a tres tratamientos de inducción de defensas (control, 25 mM MeJa y mechanical wounding). Los datos mostrados son las lsmeans ± error estándar. N = 4.
Para el tercer objetivo, estudiar si la inducción experimental de defensas es
efectiva contra el ataque del herbívoro H. abietis, observamos en bioensayos in vitro (en
placas Petri) que ni la aplicación de MeJa (Figura 4.4a) ni la realización de heridas
mecánicas (Figura 4.4b) afectaron significativamente a los daños realizados por el
herbívoro con respecto al control. A pesar de que, según lo esperado, el herbívoro
realizó un mayor daño en las plantas control que en las plantas tratadas, con defensas
incrementadas, las diferencias no fueron estadísticamente significativas (Figuras 4.4a,
4.4b). Además, en otro bioensayo realizado in vivo (sobre plantas vivas), tampoco
observamos diferencias significativas entre los diferentes tratamientos de inducción de
defensas (MeJa y heridas mecánicas) en los daños provocados por H. abietis con
respecto al control (Figura 4.5). En este caso también fueron mayores los daños
05
10152025303540
0 22 37 44 51 69 74 78 83 84
Familia de P. pinaster
ControlMeJaMW
mg
resi
duo
resi
noso
g-1
peso
sec
o
34
provocados en las plantas control aunque no lo suficiente para ser considerados como
estadísticamente diferentes.
Figura 4.4. Efecto de la inducción de respuestas defensivas en juveniles de P. radiata mediante (a) la aplicación de 25 mM MeJa y (b) la aplicación de 25 mM MeJa y la realización de heridas mecánicas sobre el % de área consumida por el herbívoro H. abietis en bioensayos in vitro realizados con segmentos de tallo en placas Petri. Los datos mostrados son las lsmeans ± error estándar. N = 144 y N = 40 respectivamente.
Figura 4.5. Efecto de la inducción de respuestas defensivas en juveniles de P. radiata mediante la aplicación de 25 mM MeJa y la realización de heridas mecánicas sobre el % de área consumida por el herbívoro H. abietis en un bioensayo in vivo (sobre planta viva). Los datos mostrados son las lsmeans ± error estándar. N = 40.
0
5
10
15
20
25
30
Control MeJa% á
rea
mor
dida
por
Hyl
obiu
s
0
5
10
15
20
25
30
Control MeJa mechanicalwounding
F1,3 = 4,58; n.s. F2,6 = 1,45; n.s.
In vitro
(a) (b)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Control MeJa
F2,6 = 0,66; n.s.
In vivo
% á
rea
mor
dida
por
Hyl
obiu
s
mechanicalwounding
5. DISCUSIÓN 5.1. Efecto del genotipo sobre la producción de resina en tallos de juveniles de P.
radiata
El efecto familiar sobre la capacidad defensiva basada en la producción de resina
no resultó significativo cuando analizamos las 36 familias de P. radiata objeto de este
estudio y que fueron sometidas a dos tratamientos de inducción de defensas (control y
MeJa), sugiriendo de este modo que no existen genotipos superiores en cuanto a la
producción de resina. Estos resultados no se corresponden con estudios anteriores
realizados por otros autores en otras coníferas donde se encontró que la capacidad
defensiva de las plantas, y entre ellas la producción de resina, está sujeta a un fuerte
control genético (Rosner y Hannrup, 2004; O'Reilly-Wapstra et al., 2006; Donaldson y
Lindroth, 2007). En este sentido, Rosner y Hannrup (2004) observaron que el número y
la densidad de canales resiníferos en Picea abies están afectados significativamente por
la genética del individuo, encontrando además altas heredabilidades en alguna de ellas.
Sin embargo, en otro estudio anterior realizado en el CINAM de Lourizán donde se
analizó el contenido de resina en 34 familias de P. pinaster tampoco existieron
diferencias significativas entre ellas (Blanco, 2007). No obstante, pudiera ser que la
precisión de cuantificación del contenido de resina tanto en este ensayo mencionado
como en el nuestro, no resultase suficiente para encontrar significación, o que fuese
necesario un mayor tamaño muestral, es decir, analizar un mayor número de familias y,
especialmente, una mayor cantidad de individuos dentro de cada familia.
Un dato llamativo de nuestro estudio es que cuando analizamos solamente 10 de
las 36 familias (para el segundo objetivo) sí que encontramos diferencias familiares
significativas, además de que la interacción entre el tratamiento de inducción y la
familia también fue significativa, indicando que dichas familias de pino varían en
35
36
cuanto a su capacidad de inducir defensas. Estas 10 familias fueron seleccionadas al
azar dentro de las 36 que componen el experimento, por lo que podría darse el caso de
que hayan sido seleccionadas justamente las que presentan una mayor variabilidad en
cuanto a la producción de resina. En el contexto de los programas de mejora genética de
la productividad y calidad de madera, la resistencia a plagas y enfermedades de la
población mejorada es un elemento clave. La resistencia resulta de una combinación de
la resistencia constitutiva, la existente previamente al ataque, y de la habilidad para
generar una eficiente resistencia inducida por el propio ataque, por lo que tener en
cuenta la posibilidad de mejorar genéticamente las variables de resistencia contra la
herbivoría, como la cantidad de resina o fenoles en tallos y hojas es de vital
importancia.
5.2. Efecto de los tratamientos de inducción sobre la producción de resina en tallos
de juveniles de P. radiata
Tanto la aplicación éxógena de MeJa como la realización de heridas mecánicas
en el tallo aumentaron significativamente el contenido de resina en el tallo de las
plantas. El uso eficaz del MeJa como elicitador de respuestas inducidas equivalentes a
las de la herbivoría real en juveniles de coníferas está notoriamente demostrado en la
literatura reciente (Martin et al., 2002; Hudgins et al., 2004; Hudgins y Franceschi,
2004; Miller et al., 2005). Martin et al. (2002) observaron que después de la aplicación
de MeJa en P. abies aumentaba significativamente la formación de canales de resina
traumáticos o inducidos en el xilema, aumentando por lo tanto el flujo de resina en el
tallo. En este mismo sentido, Hudgins et al. (2004) observaron que aplicando MeJa en
12 especies de coníferas aumentaba significativamente la concentración de resina,
fenoles y otros sistemas defensivos. El aumento de la capacidad defensiva de las plantas
37
después de realizar heridas mecánicas en el tallo también ha sido encontrado
previamente en otras especies de coníferas (Ruel et al., 1998; Lombardero et al., 2006),
aunque estos autores estudiaron plantas adultas que responden de forma diferente. Ruel
et al. (1998) observaron incrementos significativos del flujo de resina en el tallo de
árboles de P. taeda después de realizar punciones sobre el tallo. Lombardero et al.
(2006) observaron que 55 días después de realizar heridas mecánicas en el tallo de
árboles de P. resinosa se incrementaba al doble el flujo de resina con respecto a los
controles.
A pesar de que varios han sido los autores que han encontrado que la aplicación
exógena de MeJa y la realización de heridas mecánicas provocan respuestas defensivas
similares a las que se producen en la herbivoría real, este es uno de los primeros trabajos
(el primero en P. radiata) en el que se compara la capacidad de inducción de ambos.
Nuestros resultados mostraron que la realización de heridas mecánicas en los tallos
superaba ampliamente la capacidad de inducción de defensas (basada en el contenido de
resina en el tallo) obtenida después del tratamiento con MeJa a pesar de lo reducido de
la herida. Este resultado tiene un gran interés a la hora de realizar experimentos de
herbivoría simulada ya que la gran ventaja de utilizar elicitadores químicos externos es
que se produce un estrés en la planta parecido al de la herbivoría real sin la necesidad de
realizar daños físicos en la misma. Sin embargo, en este trabajo observamos que las
diferencias entre un tratamiento y otro son importantes. En esta misma dirección, son
necesarios nuevos experimentos donde se compare las respuestas defensivas inducidas
por la herbivoría simulada (mediante MeJa y daños mecánicos) y la herbivoría real.
5.3. Efecto de los tratamientos de inducción sobre el ataque del herbívoro H. abietis
a juveniles de P. radiata
38
La aplicación de tratamientos inductores de respuestas defensivas no fue eficaz
contra el daño provocado por H. abietis. Ni la aplicación de MeJa ni la realización de
heridas mecánicas afectaron significativamente a los daños realizados por el herbívoro
con respecto al control, tanto en ensayos in vivo como in vitro. Estos resultados no están
de acuerdo con los encontrados previamente por otros autores en otras especies de
coníferas (Heijari et al., 2005; Miller et al., 2005; Heijari et al., 2008). La aplicación
exógena de MeJa ha sido previamente descrita como un tratamiento eficaz contra el
ataque de un gran rango de insectos herbívoros. Heijari et al. (2005) observaron que
aplicando diferentes concentraciones de MeJa (0, 10 y 100 mM) a P. sylvestris de dos
años de edad se reducía significativamente el área de corteza comida por H. abietis,
siendo menor el daño a medida que se aumentaba la concentración de MeJa. Miller et
al. (2005) encontraron que la aplicación de MeJa a abetos de dos años de edad era
efectiva contra el daño provocado por el curculiónido Pissodes strobi (Peck.). Sin
embargo, y a pesar de que existen varias referencias sobre estos efectos en otras
coníferas, este es el primer trabajo que estudia el efecto de la aplicación de MeJa en
juveniles de P.radiata. En el caso del ‘mechanical wounding’ hasta la fecha apenas
existen referencias previas de cómo afecta en la resistencia a insectos herbívoros en
coníferas. Lombardero et al. (2006) observaron que los árboles tratados con heridas
mecánicas no presentaban ataques de perforadores de corteza. En este trabajo, como
describimos previamente, encontramos que induce significativamente el contenido de
resina en los tallos (un 45 % más que en el control) pero este fenómeno no está
directamente relacionado con un menor consumo por parte de H. abietis. Una posible
explicación a esta falta de efecto en el bioensayo in vivo podría ser que, al igual que se
encontró en trabajos anteriores llevados a cabo en el CINAM de Lourizán, el ataque del
herbívoro induzca en poco tiempo (se ha observado que en tan sólo 48 horas) respuestas
39
defensivas que provoquen que las plantas más atacadas sean las que mayor contenido de
defensas sinteticen. De este modo, estas plantas pueden responder mejor al ataque,
perdiéndose así el efecto inicial del tratamiento.
40
6. CONCLUSIONES
1.- El efecto familiar sobre la capacidad defensiva basada en la producción de resina no
resultó significativo en las 36 familias de P. radiata objeto de este estudio. La
capacidad de inducir defensas tampoco varía entre las diferentes familias de pino
estudiadas (interacción MJxG no significativa).
2.- Sin embargo, cuando se ensayó con la aplicación exógena de MeJa y un tratamiento
basado en heridas mecánicas en el tallo de las plantas (‘mechanical wounding’) en 10 de
esas familias escogidas al azar, estos tratamientos resultaron efectivos como inductores
experimental de defensas en P. radiata, existiendo además variación genética en el
contenido de resina y en la capacidad de inducir defensas (interacción MJxG
significativa).
3.- La realización de heridas mecánicas (‘mechanical wounding’) como inductor de
defensas en P. radiata incrementó significativamente la cantidad de resina respecto a la
aplicación de MeJa, y ambos también sobre el control.
4.- La aplicación exógena de metil jasmonato y el tratamiento ‘mechanical wounding’
no redujeron de forma significativa la preferencia del curculiónido H. abietis con
respecto al control, tanto cuando fue evaluada en bioensayo con planta viva (in vivo)
como en bioensayo en placa Petri (in vitro), a pesar de que las plantas presentaron una
mayor cantidad de resina.
41
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8. SUMMARY
Pinus radiata Don. is one of the most important forest tree species of Galicia. In the
80’, it was installed a seed orchard in Sergude (A Coruña) to obtain seed material with
high genetic quality to restock Galician forests. These P. radiata genotypes have better
growth, stem form and branching characteristics, looking forward increase the
productivity of this species. In the last years, several studies have also showed that
herbivory resistance and plant defenses were under genetic control. In the present study
we evaluated (i) genetic variation in pine constitutive and induced defenses (assesment
as resin concentration in the stem) (ii) the effect of exogenous application of methyl
jasmonate (MeJa) and wound-induced in the stem (mechanical wounding) on pine
defensive responses and, finally, (iii) the possibility of employing laboratory bioassays
to study the variation on phloem feeder Hylobius abietis L. resistance. The results of
this sudy showed that we did not detect significant genetic effects on pine defenses
neither on the capacity of expressing induced responses between pine families (MJxG
interaction not significant). Anyway, induced treatments were effective to induce
defenses on pine seedlings. Mechanical wound-induced seedlings showed 25% and 45%
greater resin concentration than MeJa-induced and control seedlings, respectively.
However, although induced treatments increased resin content in pine stems, these
induced treatments did not significantly reduced H. abietis preference in the in the
laboratory bioassays.
Keywords: Pinus radiata, resin content, Hylobius abietis, genetic variation, constitutive
defenses, induced defenses
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9. RESUMO
Pinus radiata Don. é unha das especies máis importantes do sector forestal galego. Nos
anos 80 instalouse en Sergude (A Coruña) un horto sementeira inxertando clons de
árbores plus co fin de obter semente de alta calidade xenética para repoboar os montes
galegos. Os xenotipos de P. radiata seleccionados presentaban mellores crecementos,
maior rectitude do fuste e menor ramosidade para aumentar con isto a produción de
volume de madeira, tanto en calidade como en cantidade. Ademais do estudo de
crecemento destas proxenies melloradas, nos últimos anos tamén mostrouse que a
resistencia a pragas e enfermidades e os sistemas defensivos que as plantas empregan
para loitar contra elas tamén están suxeitos a variación xenética. No presente traballo
avaliouse (i) a variación xenética no contido de defensas, tanto constitutivas como
inducidas, (medido como contido de resina), (ii) o efecto da aplicación exósena de metil
xasmonato (MeJa) e a realización de feridas mecánicas no talo das plantas nas respostas
defensivas (avaliadas como contido de resina) e, por último, (iii) a posibilidade de
empregar bioensaios para detectar a variación na resistencia o herbívoro Hylobius
abietis L. Entre os resultados deste traballo, non detectamos, cos métodos empregados,
efecto familiar no contido de defensas, nin tampouco na capacidade de expresar
defensas inducidas entre as diferentes familias de pino estudadas (interacción MJxG non
significativa). Por outra banda, os tratamentos de indución foron efectivos á hora de
inducir defensas nas plantas. As plantas ás que se lle realizaron feridas mecánicas
presentaron un contido de resina un 25% e un 45% maior que as plantas tratadas con
MeJa e as plantas control, respectivamente. Sen embargo, a pesar de que os tratamentos
de indución incrementaron a produción de resina nos talos, estes tratamentos non
reduciron de forma significativa a preferencia do curculiónido H. abietis, tanto cando
foi avaliada no bioensaio con planta viva (in vivo) como no bioensaio en placa Petri (in
vitro).
Palabras chave: Pinus radiata, resina, Hylobius abietis, variación xenética, defensas
constitutivas, defensas inducudas
