Escuela Nacional de Ciencias Biológicastesis.ipn.mx/jspui/bitstream/123456789/9501/1/21.pdfII....

“Síntesis y estudio teórico de

aductos Diels-Alder derivados de

los ácidos maleico y fumárico, y su

actividad biológica sobre la enzima

aminotransferasa del GABA”

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:

DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS

P R E S E N T A:

M. en C. Juan Alberto Guevara Salazar

Directores de tesis:

Dr. Hugo Alejandro Jiménez Vázquez

Dr. José Guadalupe Trujillo Ferrara

México, D.F. DICIEMBRE DEL 2010

Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

v

ÍNDICE

Pág.

I. ÍNDICE DE TABLAS vii

II. ÍNDICE DE FIGURAS x

III. ACRÓNIMOS Y ABREVIATURAS xvii

Pág.

RESUMEN 1

ABSTRACT 2

1. INTRODUCCIÓN 3

1.1 Panorama histórico y diseño de fármacos 3

1.2 Docking 6

1.3 Farmacología de los fármacos que actúan en el sistema nervioso central 11

1.4 Sinapsis GABAérgica y enzima aminotransferasa de GABA 15

1.5 Actividad encefálica: ondas cerebrales 18

1.5.1 Epilepsia 20

1.5.2 Farmacología de las epilepsias 23

1.5.2.1 Convulsiones parciales. Aspectos moleculares 25

1.5.2.2 Convulsiones generalizadas. Aspectos moleculares 28

2. ANTECEDENTES 31

2.1 Vigabatrina 31

2.2 Cicloadiciones [4+2] tipo Diels-Alder 32

2.2.1 Regioselectividad de la reacción Diels-Alder 33

2.2.2 Estereoquímica de la reacción Diels-Alder 34

2.2.3 Mecanismo de reacción 35

3. JUSTIFICACIÓN 36

4. HIPÓTESIS 37

V. OBJETIVOS 38

5.1 Objetivo General 38

5.2 Objetivos particulares 38

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 40

6.1 SÍNTESIS 40

6.2 DOCKING 84

vi

6.3 CINÉTICA ENZIMÁTICA 108

6.4 MODELO IN VIVO DE LAS CONVULSIONES INDUCIDAS CON

PENTILENTETRAZOL

166

7. CONCLUSIONES 124

8. PARTE EXPERIMENTAL 127

8.1 Instrumentación 127

8.2 Reactivos 128

8.3 Síntesis 130

8.4 Análisis conformacional y metodología de los cálculo teóricos para el aducto

Diels-Alder 4b

149

8.5 Estudios de interacción ligando-enzima asistido por computadora 150

8.5.1 Preparación de los ligandos 150

8.5.2 Preparación de la enzima aminotransferasa del GABA 150

8.5.3 Preparación de los archivos de la proteína y los ligandos 152

8.5.4 Preparación de los scripts de la proteína y los ligandos 153

8.5.5 Realización de los estudios de interacción ligando-enzima (Docking) 155

8.6 Cinética enzimática sobre la aminotransferasa del GABA de Pseudomonas

fluorescens

155

8.7 Modelo in vivo de las convulsiones inducidas con pentilentetrazol (PTZ) 157

8.7.1 Animales 157

8.7.2 Determinación de la dosis mínima efectiva de PTZ 157

8.7.3 Determinación del efecto protector de los aductos Diels-Alder que hayan

resultado inhibidores de la GABA-AT

159

9. REFERENCIAS 160

vii

I. ÍNDICE DE TABLAS

TABLA Pág.

Tabla 1. Eventos históricos relevantes en el desarrollo de la química

farmacéutica

5

Tabla 2. Receptores de GABA 17

Tabla 3. Clasificación y tratamiento farmacológico de las epilepsias 24

Tabla 4. Características físicas de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d 41

Tabla 5. Caracterización de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d por

espectrofotometría IR (pastilla de KBr)

42

Tabla 6. Caracterización por RMN de 1H (300 MHz) y

13C (75 MHz) en

DMSO-d6 de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d

43


13C (125 MHz) en

CDCl3 de los aductos Diels-Alder 4a-d derivados de isopreno

48

Tabla 8. Ángulos diedros (, °) y constantes de acoplamiento calculadas (3J,

Hz) derivadas de la optimización de los confórmeros de bote (b) y media-silla

(hc) del aducto 4b al nivel B3LYP/6-31+G(d,p). Se muestran los valores

experimentales de 3J (exp), así como los valores estimados de la distribución

de Boltzmann (avg)

51

Tabla 9. Rendimientos obtenidos de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d y para

los aductos 4a-d obtenidos en dos pasos sintéticos y bajo una MCR

53

Tabla 10. Condiciones de reacción en la investigación de la secuencia de pasos

por la que se lleva a cabo la reacción MCR. La reacción se llevó a cabo con

AcOEt como disolvente

54


13C (125 MHz) en

DMSO-d6 de la mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6a y 7a

derivados

57

Tabla 12. Características físicas de los aductos Diels-Alder 8, 10a, 10b y 13 59

Tabla 13. Caracterización de los aductos Diels-Alder 8, 10a y 13 por

espectrofotometría IR obtenidas en pastilla de KBr

60


13C (75 MHz) en

CDCl3 de los aductos Diels-Alder 8, 10a, 10b y 13 derivados del anhídrido

maleico

61

viii

Tabla 15. Características físicas de la mezcla de regioisómeros de los aductos

Diels-Alder 6a-d y 7a-d derivados de isopreno

64

Tabla 16. Caracterización de la mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-

Alder 6a-d y 7a-d derivados de isopreno por espectrofotometría IR obtenidas

en pastilla de KBr

65

Tabla 17. Caracterización por RMN de 1H (300 y 500 MHz) y

13C (75 y 125

MHz) en DMSO-d6 de la mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder

6a-d y 7a-d derivados de isopreno

67

Tabla 18. Características físicas de los aductos Diels-Alder 11a-d derivados de

ciclopentadieno

68


13C (125 MHz) en

DMSO-d6 de los aductos Diels-Alder 11a-d derivados de ciclopentadieno

71

Tabla 20. Características físicas de los aductos Diels-Alder 14a-d derivados de

furano

72

Tabla 21. Caracterización de los aductos Diels-Alder 14a-d derivados de

furano por espectrofotometría IR obtenidas en pastilla de KBr

73


13C (125 MHz) en

DMSO-d6 de los aductos Diels-Alder 14a-d derivados de furano

75

Tabla 23. Características físicas de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d 76

Tabla 24. Caracterización de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d por

espectrofotometría IR obtenidas en pastilla de KBr

78


13C (125 MHz) en

DMSO-d6 de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d

79


13C (75 MHz) en

DMSO-d6 de la mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 17a-d y

18a-d derivados de isopreno

83

Tabla 27. Análisis de homología de la enzima GABA-AT de P. fluorescens

comparada con las especies E. coli, M. musculus, S. scrofa y H. sapiens.

Comparación de los aminoácidos del sitio activo que cambian en cada uno con

respecto a P. fluorescens

89

Tabla 28. Criterio de selección del modelo 92

Tabla 29. Optimización por mecánica molecular de la GABA-AT modelada

con PLP como coenzima

93

ix

Tabla 30. Constantes de disociación (KD) y radio (KD1/KD2) de cada uno de los

aductos Diels-Alder derivados de los ácidos maleico y fumárico con isopreno

94


aductos Diels-Alder derivados de los ácidos maleico y fumárico con

ciclopentadieno

100


aductos Diels-Alder derivados de los ácidos maleico y fumárico con furano

103

Tabla 33. Cernimiento de actividad inhibitoria de los aductos Diels-Alder

sintetizados, comparados con GABA a una concentración de 0.8 mM

111

Tabla 34. Parámetros cinéticos de la mezcla de regioisómeros sobre la enzima

GABA-AT

112

Tabla 35. Propósitos que persiguen los modelos animales para la evaluación

de sustancias nuevas o conocidas

115

Tabla 36. ensayo preliminar de determinación de la DE95 de PTZ 117

Tabla 37. Efectos de la VGB en el modelo de las convulsiones inducidas con

PTZ (D = 110 mg/kg)

119

Tabla 38. Efectos de la VGB en el modelo de las convulsiones inducidas con

PTZ (D = 75 mg/kg)

120

Tabla 39. Bioensayo sobre los compuestos 6b y 7b utilizando como control

positivo a VGB contra la dosis de PTZ de 75 mg/kg

139

Tabla 40. Volúmenes utilizados de cada reactivo en la determinación de la

actividad enzimática de GABA-AT con y sin inhibidor

156

x

II. ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA Pág.

Figura 1. Etapas fundamentales para llevar a cabo un estudio de Docking 7

Figura 2. Selección del sitio de unión a ligando 8

Figura 3. Diagrama de energía-radio para el modelo de fuerzas de Van der

Waals. reqm = Equilibrio de separación internuclear

10

Figura 4. Clasificación de los tipos de receptores más importantes que

participan en el SNC

13

Figura 5. Canales iónicos dependientes de ligando y canales iónicos

dependientes de voltaje

14

Figura 6. Canales metabotrópicos que regulan canales iónicos dependientes de

voltaje en el SNC

14

Figura 7. Tres estados eléctricos de una neurona 16

Figura 8. Biosíntesis de GABA. PLP: Fosfato de Piridoxal; GAD: Glutamato

Descarboxilasa

16

Figura 9. Sinapsis GABAérgica. Biosíntesis, liberación, transmisión,

regulación y degradación. GABA-T: Aminotransferasa de GABA; GAD:

Glutamato descarboxilasa; GDP: Difosfato de guanosina; SSA: Semialdehído

succínico; SSADH: Semialdehído succínico deshidrogenasa

17

Figura 10. Función bioquímica de la enzima GABA-AT 18

Figura 11. Patrón eléctrico de los distintos tipos de ondas cerebrales (, , y

) registradas en un EEG

19

Figura 12. Electroencefalogramas de los diferentes tipos de epilepsia 21

Figura 13. Mecanismo de acción de los fármacos antiepilépticos. (+):

Activación; (-): inhibición

25

Figura 14. Estructura de los bloqueadores de canales de Na+ voltaje-

dependientes en período refractario

27

Figura 15. Mecanismo de acción de los fármacos bloqueadores de canales de

Na+ voltaje- dependientes

27

Figura 16. Estructura de los moduladores de GABA durante la sinapsis 28

Figura 17. Transmisión sináptica incrementada del GABA 28

xi

Figura 18. Estructuras de los principales fármacos bloqueadores de los canales

de Ca2+

tipo T

29

Figura 19. Reducción de la corriente de Ca2+

tipo T inducida por

anticonvulsivos

30

Figura 20. Mecanismo de reacción de la inhibición irreversible de la

vigabatrina con la Lys329 del sitio activo de la enzima aminotransferasa de

GABA

31

Figura 21. Estructura de la vigabatrina R y S 32

Figura 22. Interacción HOMO-LUMO de las especies involucradas en una

reacción de Diels-Alder

33

Figura 23. Regioselectividad de la reacción Diels-Alder. Los estereoisómeros

no se muestran

33

Figura 24. Posibles mecanismos de reacción por los cuales se podría lleva a

cabo una cicloadición. a: concertado; b: dirradical; c: iónico

35

Figura 25. Analogía estructural de los aductos Diels-Alder propuestos con el

ácido -aminobutírico (GABA). Se muestran los derivados con sustitución en

meta

37

Figura 26. Reacción general de síntesis de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d 40

Figura 27. Reacción de formación del los aductos Diels-Alder 4a-d 44

Figura 28. Espectro de RMN de 1H del compuesto 4b 45

Figura 29. Espectro bidimensional de acoplamiento 1H-

1H COSY del aducto

4b. a = H7, b = H4, c = H4, d = H7

46


13C a tres enlaces

HSQC para 4b

47

Figura 31. Geometrías optimizadas al nivel B3LYP/6-31+G(d,p). Se muestran

las energías relativas calculadas (G a 25°C, kcal/mol) y las proporciones de

cada confórmero asumiendo una distribución de Boltzmann para los botes y las

sillas del aducto 4b

50

Figura 32. Síntesis general de los aductos Diels-Alder 4a-d a través de una

MCR

52

Figura 33. Síntesis de la mezcla de regioisómeros 6a y 7a a partir de 5a y 2 54

Figura 34. Mezcla de regioisómeros 6a y 7a obtenidos a 60 °C por 120 h a

agitación constante con AcOEt como disolvente

55

xii

Figura 35. Secuencia de eventos que ocurren durante la reacción

multicomponente para el aducto 4a

56

Figura 36. Reacciones generales de síntesis de los aductos Diels-Alder 6a-d,

7a-d, 11a-d y 14a-d a partir de los aductos 8, 10a y 13

58

Figura 37. Reacciones generales de síntesis de los aductos Diels-Alder 6a-d,

7a-d, 11a-d y 14a-d a partir de los aductos 8, 10a y 13

62

Figura 38. Mezcla de regioisómeros 6b y 7b obtenidos a partir del aducto 8 63

Figura 39. Diagrama de obtención del aducto 11b por medio de dos rutas

sintéticas

68

Figura 40. Espectro de RMN de 1H para el aducto 11b obtenido bajo el primer

método (a partir de 5b y 2 en acetona, a 40°C por 96h)

69

Figura 41. Espectro de RMN de 1H para el aducto 11b obtenido bajo el

segundo método (a partir de 10a y 3b en THFanh., a t.a. por 16h)

70

Figura 42. Espectro de RMN de 1H para el aducto 14b 74

Figura 43. Reacción general de síntesis de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d 76

Figura 44. Reacción general de síntesis de la mezcla de regioisómeros de los

aductos Diels-Alder 17a-d y 18a-d

80

Figura 45. Espectro de RMN 1H para las mezcla de regioisómeros de los

aductos 17b y 18b

81

Figura 46. Alineamiento de GABA-AT de Pseudomonas fluorescens vs Homo

sapiens. *: aminoácidos idénticos, : : aminoácidos diferentes pero que puede

sustituirse, . : aminoácidos con cierta homología, Amarillo: aminoácidos

idénticos del sitio activo para las dos secuencias. Verde: aminoácidos

diferentes que no son homólogos en el sitio activo

85

Figura 47. Alineamiento de GABA-AT de Pseudomonas fluorescens vs Sus

scrofa. *: aminoácidos idénticos, : : aminoácidos diferentes pero que puede




86

xiii

Figura 48. Alineamiento de GABA-AT de Pseudomonas fluorescens vs Mus

musculus. *: aminoácidos idénticos, : : aminoácidos diferentes pero que puede




87

Figura 49. Alineamiento de GABA-AT de Pseudomonas fluorescens vs

Escherichia coli. *: aminoácidos idénticos, : : aminoácidos diferentes pero que

puede sustituirse, . : aminoácidos con cierta homología, Amarillo:

aminoácidos idénticos del sitio activo para las dos secuencias. Verde:

aminoácidos diferentes que no son homólogos en el sitio activo

88

Figura 50. Estructura tetramérica tridimensional determinada por difracción de

rayos X de la GABA-AT de Escherichia coli

90

Figura 51. Gráfico de Ramachandran 90

Figura 52. Ángulos de torsión y del enlace peptídico 90

Figura 53. A: Secuencia molde 1sffC de E. coli. B: Modelo de P. fluorescens.

Determinados en Swiss Model

91

Figura 54. A: Secuencia molde 1sf2A de E. coli. B: Modelo de P. fluorescens.

Determinados en I-Tasser

91

Figura 55. A: (gris) molde 1sffC de E. coli; (rojo): modelo de P. fluorescens

generado por Swiss-Model. B: (gris) molde 1sf2A de E. coli; (azul) modelo de

P. fluorescens generado por I-Tasser

92

Figura 56. Enzima GABA-AT modelada y optimizada a 1500 con la coenzima

PLP

93

Figura 57. Comparación de las constantes de disociación (KD) de cada uno de

los enantiómeros de los aductos Diels-Alder derivado de isopreno. 6a-d y 7a-

d: corresponden a la mezcla de regioisómeros derivados de ácido maleico

obtenidos experimentalmente. 17a-d y 18a-d: corresponden a la mezcla de

regioisómeros derivados del ácido fumárico obtenidos experimentalmente

95

Figura 58. A: p-COOEt-RS-Amec-Acax-IP (KD = 505.77 M); B: p-COOEt-

SR-Amec-Acax-IP (KD = 662.82 M); C: p-COOEt-RS-Amec-Acax-IP (KD

= 291.62 M); D: p-COOEt-SR-Amec-Acax-IP (KD = 138.07 M)

96

xiv

Figura 59. A: p-COOEt-RR-Amec-Acec-IP (KD = 56.12 M); B: p-COOEt-

SS-Amec-Acec-IP (KD = 96.00 M); C: p-COOEt-RR-Amec-Acec-IP (KD =

136.49 M); D: p-COOEt-SS-Amec-Acec-IP (KD = 14.28 M)

97


los enantiómeros de los aductos Diels-Alder derivado de ciclopentadieno. 11a-

d: corresponden a los compuestos sintetizados

99

Figura 61. A: p-COOEt-RS-exo-CP (KD = 37.05 M); B: p-COOEt-SR-exo-

CP (KD = 239.73 M); C: p-COOEt-RS-endo-CP (KD = 137.35 M); D: p-

COOEt-SR-endo-CP (KD = 424.08 M)

101

Figura 62. A: p-COOEt-RR-Amexo-Acendo-CP (KD = 84.79 M); B: p-COOEt-

SS-Amexo-Acendo-CP (KD = 137.71 M); C: p-COOEt-RR-Amendo-Acexo-CP (KD

= 144.22 M); D: p-COOEt-SS-Amendo-Acexo-CP (KD = 150.88 M)

102


los enantiómeros de los aductos Diels-Alder derivado de furano. 14a-d:

corresponden a los compuestos sintetizados

104

Figura 64. A: p-COOEt-RS-exo-Fur (KD = 8.42 M); B: p-COOEt-SR-exo-Fur

(KD = 254.97 M); C: p-COOEt-RS-endo-CP (KD = 18.34 M); D: p-COOEt-

SR-endo-CP (KD = 22.37 M)

104

Figura 65. Interacción del GABA en el sitio activo de la GABA-AT 106

Figura 66. A. Interacción con la R-vigabatrina. B. Interacción con la S-

vigabatrina

107

Figura 67. Reacción enzimática acoplada llevada a cabo en la determinación

de la actividad de GABA-AT de P. fluorescens

108

Figura 68. Gráfico que muestra la actividad de la enzima GABA-AT a

distintas concentraciones de sustrato en función del tiempo

109

Figura 69. Representación de la actividad enzimática de GABA-AT como

función de la concentración de GABA. Curva de Michaelis-Menten

109

Figura 70. Determinación de los parámetros cinéticos de la GABA-AT por el

método de Hanes-Wolff

110

xv

Figura 71. Análisis del tipo de inhibición de la mezcla de regioisómeros 6b y

7b por el método de la doble recíproca de Lineweaver-Burk: (1/r0) =

(Km/rmáx)(1/[S]) + 1/rmáx; donde r0 es la rapidez a cierta concentración de

sustrato, [S] es la concentración de sustrato. Análisis de regresión lineal por

mínimos cuadrados. Parámetros analizados con la prueba t de Student. n = 6.

Los coeficientes de regresión lineal (r) y las pendientes (B) fueron

estadísticamente significativas (p < 0.001). Las ordenadas al origen (A) no

difieren de cero (p > 0.20), excepto para la línea recta con [I] = 0.00 mM con p

< 0.001

112

Figura 72. Determinación de la Ki por el método de Schild: log[(B’/B)-1] =

nHlog[I] – nHlogKi. B’: pendiente en presencia de inhibidor, B: pendiente sin

inhibidor, nH: coeficiente de Hill, Ki: constante de inhibición. Análisis de

regresión lineal por mínimos cuadrados. Parámetros analizados con la prueba t

de Student. El coeficiente de regresión lineal (r), la pendiente (B) y la ordenada

al origen (A) fueron estadísticamente significativos (p < 0.02)

113

Figura 73. Gráfica de Michaelis mente descrita por la enzima GABA-AT

según la ecuación:

r0 = (rmáx [S])/ (Km + [S])

113

Figura 74. Pentilentetrazol (PTZ) 116

Figura 75. Picrotoxina: psicoestimulante que aumenta los niveles de actividad

motriz y cognitiva, refuerza la vigilia, el estado de alerta y la atención, y se ha

utilizado como antídoto para la intoxicación con barbitúricos, ya que la

picrotoxina es un antagonista no competitivo del receptor GABAA

116

Figura 76. Curva dosis respuesta cuantal de crisis convulsivas para la

determinación de la DE95 de PTZ bajo el método logit

118

Figura 77. Efecto de la VGB sobre la latencia a la primera crisis convulsiva

tónico-clónica. ANOVA de una vía, el análisis de medias fue realizado por el

método de Duncan; * p < 0.005

120

Figura 78. Gráfico que muestra el efecto sobre la latencia a la primera crisis

convulsiva para las distintas dosis de VGB (rojo), aductos (amarillo) en

comparación con el grupo control (verde). Se muestran barras que

corresponden a la media + EEM. Los datos fueron analizados con la prueba t

de Student. Todos los resultados presentaron una p > 0.05

122

http://es.wikipedia.org/wiki/Alerta

http://es.wikipedia.org/wiki/Atenci%C3%B3n

xvi

Figura 79. Diagrama de flujo para la preparación de la enzima GABA-AT y

generar el archivo *.pdbqt

152

Figura 80. Diagrama de flujo para la preparación de los ligandos y generar los

archivos *.pdbqt

153

Figura 81. Diagrama de flujo para la preparación de los archivos *.gpf 154

Figura 82. Diagrama de flujo para la preparación de los archivos *.dpf 154

Figura 83. Administración subcutánea (s.c.) practicada en ratones 158

Figura 84. A: Convulsión tónica; B: Convulsión clónica 158

xvii

III. ACRÓNIMOS Y ABREVIATURAS

a.C.: Antes de Cristo

AcOEt: Acetato de etilo

Act: Actividad enzimática

AM1: Austin Model 1 (modelo 1 de Austin)

Amec-Acec: Amida en posición alfa-ecuatorial y ácido carboxílico en posición beta-

ecuatorial

Amec-Acax: Amida en posición beta-axial y ácido carboxílico en posición alfa-

ecuatorial

Amendo-Acexo: Amida con esteroquímica endo y ácido carboxílico con estereoquímica exo

Amexo-Acendo: Amida con estereoquímica exo y ácido carboxílico con estereoquímica

endo

AMPA: Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico

AMPC: Monofosfato de adenosina cíclica

anh.: Anhidro

ANOVA: Análisis de variancia

B3LYP: Becke, three-parameters, Lee-Yang-Parr

°C: Grados Celsius

CC: Con convulsiones

CHARMM: Chemistry at Harvard Molecular Mechanics

CICATA: Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnología Avanzada

CINVESTAV: Centro de Investigaciones Avanzadas

COSY: Correlation Spectroscopy

CP: Ciclopentadieno

d.C.: Después de Cristo

DCM: Diclorometano

DE75: Dosis efectiva 75, a la cual el 75 % de los sujetos experimentales responde

DE95: Dosis efectiva 95, a la cual el 95 % de los sujetos experimentales responde

D.F.: Distrito Federal

DMSO-d6: Dimeltilsulfóxido deuterado

DNA: Ácido desoxirribonucleico

DRX: Difracción de rayos X

DVGB: Dosis de vigabatrina

xviii

: Coeficiente de absortividad molar

EEG: Electroencefalograma

EEM: Error estándar de la media

EI: Electronic impact (impacto electrónico)

EMBL-EBI: The European Molecular Biology Laboratory- European Bioinformatics

Institute

EM: Espectrometría de masas

ENCB: Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

ESM: Escuela Superior de Medicina

FES: Facultad de Estudios Superiores

FMO: Frontier Molecular Orbital (Orbitales moleculares frontera)

Fur: Furano

g: Gramos

GAD: Glutamato descarboxilasa

GABA: Ácido -aminobutírico

GABAA: Receptor a GABA tipo A

GABAB: Receptor a GABA tipo B

GABAC: Receptor a GABA tipo C

GABA-AT: Aminotransferasa de GABA

GAT-1: Transportado de GABA tipo 1

GDP: Difosfato de guanosina

HF: Hartree-Fock

HOMO: Highest-Occupied Molecular Orbital (Orbital Molecular Ocupado de más alta

energía)

HRMS: High Resolution Mass Spectrometry (espectrometría de masas de alta resolución)

HSQC: Heteronuclear single quantum coherence

Hz: Hertz

[I]: Concentración de inhibidor

i.p.: Vía intraperitoneal

IP: Isopreno

IPN: Instituto Politécnico Nacional

3Jcis: Constante de acoplamiento vecinal entre hidrógenos en configuración cis

3JH-H: Constante de acoplamiento vecinal entre hidrógenos

xix

3Jgem: Constante de acoplamiento geminal o a dos enlaces entre hidrógenos

3Jo: Constante de acoplamiento vecinal entre hidrógenos en posición orto

3Jtrans: Constante de acoplamiento vecinal entre hidrógenos en configuración trans

k: Constante experimental de rapidez

kcal: Kilocalorías

KD: Constante de disociación

kg: Kilogramo

Ki: Constante de inhibición

Km: Constante de Michaelis-Menten

IR: Infrarrojo

máx: Longitud de onda máxima

LUMO: Lowest-Unoccupied Molecular Orbital (Orbital Molecular Desocupado de menor

energía)

MCR: Multicomponent reaction (reacción multicomponentes)

MeOH: Metanol

MES: Maximal electroshock (electrochoque máximo)

mg: Miligramo

MHz: Megahertz

min: Minuto (s)

mM: Concentración milimolar

MMFF: Merck Molecular Force Field (campo de fuerza molecular Merck)

mmol: Milimol

mL: Mililitro

L: Microlitro

mol: mol

n: Tamaño muestral

máx: Número de onda máximo

-NADP+: Beta-fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina oxidado

-NADPH: Beta-fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido

NAMD: Nanoscale Molecular Dynamics

ND: No determinado

xx

nH: Coeficiente de Hill

nm: Nanómetros

PDB: Protein Data Bank

P.f.: Punto de fusión

PLP: Fosfato de piridoxal

PMP: 5’-fosfato de piridoxamina

ppm: Partes por millón

PPSE: Potencial posináptico excitador

PPSI: Potencial presináptico inhibidor

PTZ: Pentilentetrazol

QSAR: Quantitative Structure-Activity Relationship (Relación Cuantitativa Estructura-

Actividad)

r0: Rapidez enzimática a cierta concentración de sustrato

Rf: Retention factor (factor de retención)

rmáx: Rapidez máxima de actividad enzimática

RMN: Resonancia Magnética Nuclear

RNA: Ácido ribonucleico

[S]: Concentración de sustrato

s.c.: Vía subcutánea

SSA: Semialdehído succínico

SSADH: Semialdehído succínico deshidrogenasa

SNC: Sistema nervioso central

t.a.: Temperatura ambiente

THF: Tetrahidrofurano

UNAM: Universidad Nacional Autónoma de México

UV: Ultravioleta

UV-Vis: Espectrofotometría ultravioleta-visible

VGB: Vigabatrina

1

RESUMEN

El ácido -aminobutírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibidor del

sistema nervioso central (SNC), y es responsable de muchos procesos de regulación

fisiológica en los mamíferos; entre ellos, regula los procesos de excitación-inhibición de

las neuronas. Cuando la actividad del GABA está alterada se pierde el balance y

aumenta de manera sustancial el proceso excitatorio sobre el inhibitorio y sobreviene

una crisis convulsiva. En este trabajo se presenta la síntesis de aductos Diels-Alder

derivados de los ácidos maleico y fumárico cuyas estructuras poseen una analogía

estructural con el GABA. El propósito de esto es inhibir a la enzima aminotransferasa

del GABA (GABA-AT) y con ello retrasar la degradación bioquímica del

neurotransmisor, incrementando la concentración de GABA en el espacio sináptico.

Todos los compuestos sintetizados fueron caracterizados espectroscópicamente.

Además, fueron evaluados biológicamente, in vitro sobre la enzima GABA-AT de

Pseudomonas fluorescens, in vivo con el modelo de las convulsiones inducidas con

pentilentetrazol (PTZ) e in silico con la evaluación de la interacción ligando-enzima de

cada uno de los aductos a través del modelado de la GABA-AT de P. fluorescens,

tomando como molde la secuencia de la enzima de Escherichia coli cuya estructura

tridimensional ha sido resuelta por difracción de rayos X (DRX). Los resultados

obtenidos mostraron que la mezcla de regiosisómeros 6a y 7a induce inhibición sobre

GABA-AT con aproximadamente 10 veces más afinidad que la vigabatrina (VGB,

principal inhibidor de la enzima), y con una ligera tendencia a la protección contra las

convulsiones inducidas con PTZ a la dosis de 75 mg/kg. La evaluación de la interacción

ligando-enzima por Docking mostró que los aductos se unen en el sitio activo de la

enzima con una afinidad en promedio más alta que el neurotransmisor GABA y la

vigabatrina.

2

ABSTRACT

The -aminobutyric acid (GABA) is the main central nervous system (CNS) inhibitory

neurotransmitter; responsible of several physiological processes on mammals; among

them, it regulates the control of the excitation-inhibition processes of neurons. When the

activity of GABA is altered, the equilibrium is lost, a fact that causes an increase of the

excitatory process over the inhibitory, leading to seizure crisis. In this work, the

synthesis of Diels-Alder adducts of maleic and fumaric acids is presented; these adducts

possess a certain structural analogy with GABA. It is expected that they would inhibit

the GABA aminotransferase enzyme (GABA-AT), leading to an increase in the

concentration of GABA at the synapsis. All compounds synthesized were characterized

spectroscopycally. The compounds were also biologically evaluated, in vitro on the

GABA-AT of Pseudomonas fluorescens, in vivo with the pentylenetetrazole-induced

seizure model in mice, and in silico on the evaluation of the ligand-enzyme interaction

by means of docking, GABA-AT protein of P. fluorescens taking the sequence of the

enzyme of Escherichia coli as template, the structure of which has been determined by

X-ray diffraction. The results showed that the regioisomer mixture of 6a and 7a

inhibited GABA-AT with an affinity approximately ten times higher than vigabatrin

(VGB: main inhibitor of GABA-AT), it also showed a light tendency on the blocking

PTZ-induced seizures at a dose of 75 mg/kg. Finally the evaluation of the ligand-

enzyme interaction by means of Docking showed that adducts bind to the active site

with an average affinity higher than GABA and vigabatrin.

3

1. INTRODUCCIÓN

Las crisis epilépticas son un trastorno transitorio del comportamiento causado por la

activación desordenada, sincrónica y rítmica de poblaciones enteras de neuronas

cerebrales.1 Por lo tanto, a un trastorno de la función cerebral que se caracteriza por

surgimiento periódico e impredecible de crisis, se le denomina epilepsia.

La epilepsia es una enfermedad que afecta aproximadamente al 1%2 de la población

mundial con una incidencia de 1000 a 100 0003 nuevos casos por año; en México,

representa un problema de salud pública, ya que el 1.8% de la población la padece,4 y

más del 80% de las personas afectadas son menores de 15 años. Sin embargo, existen

diferentes estrategias para tratar y controlar a la enfermedad, las cuales incluyen una

terapia tanto psicológica como farmacológica.

En la actualidad existen diferentes fármacos con acción antiepiléptica que actúan de

diferente manera sobre las células neuronales; la gran mayoría de ellos actúan sobre

canales iónicos (de conductancia a Na+, K

+, Ca

2+ y Cl

-),

1,5 seguidos por aquellos que

actúan sobre la recaptura de neurotransmisores1 y enzimas regulatorias de las sinapsis

(Aminotransferasa del GABA).1

Hoy por hoy, se buscan nuevos fármacos más selectivos hacia blancos biológicos. Por

tal motivo, en este trabajo se pretenden sintetizar una serie de aductos tipo Diels-Alder

derivados de los ácidos carboxifenilmaleámicos y carboxifenilfumarámicos, con el fin

de inhibir a la enzima aminotransferasa del GABA que está involucrada en la

biotransformación del ácido -aminobutírico (GABA).

1.1 Panorama histórico y diseño de fármacos

Los fármacos pueden ser considerados como el descubrimiento más importante del

siglo XX ya que la vida del hombre está estrechamente relacionada con su uso; tan es

así que actualmente la humanidad cuenta con una gran serie de sustancias que se han

desarrollado a partir de un prototipo molecular6 denominado ―cabeza de serie‖. La

búsqueda de estos prototipos y las modificaciones moleculares que pueden sufrir los

mismos es el objetivo de la química farmacéutica también conocida como química

medicinal.

4

La historia del descubrimiento de los fármacos se encuentra relacionada con el

desarrollo de las ciencias experimentales, sobre todo de la química orgánica y la

biología molecular, sin dejar de hacer mención del desarrollo de los métodos

instrumentales de análisis y la aplicación de la informática que han sido la piedra

angular de la dilucidación de la estructura de las proteínas y el establecimiento de la

relación estructural de los fármacos con su actividad biológica.

Cabe mencionar que el uso de sustancias relacionadas con el restablecimiento de la

salud se conoce desde la antigüedad pasando por el uso de metales y sus sales por la

influencia ejercida por Hipócrates (460-370 a.C.) hasta Galeno (131-200 d.C.) en la

Europa occidental. De la misma manera en Medio Oriente y en algunas regiones de

Asia como China e India también utilizaron por muchísimo tiempo los minerales en el

campo de la terapéutica. No fue sino hasta finales del siglo XV con Paracelso (1493-

1541) que comienza propiamente la química farmacéutica al utilizar las plantas frente a

los minerales. Asimismo civilizaciones indoamericanas (incas, aztecas, etc.) ya

utilizaban las plantas con fines medicinales en el mismo período. A partir del siglo XVII

después del descubrimiento de América por los españoles, los exploradores habían

estudiado las sustancias de las plantas, y una de las más representativas fue la corteza

del árbol de la quina (Cinchona pubescens); este período estuvo marcado por el uso de

plantas medicinales y la organización de las primeras expediciones sistemáticas de

clasificación botánica (Linnaeus 1707-1778) y su relación con sus efectos biológicos.

Para el siglo XVIII predominó el pensamiento de relacionar la acción de las sustancias

activas de las plantas en diferentes órganos.

El siglo XIX es considerado el ―comienzo de la era de los fármacos‖ con el

advenimiento de la anestesia general y la resolución del problema del dolor; así mismo

se inició la síntesis química de compuestos que trataban de resolver el mismo problema.

Al mismo tiempo fueron purificados distintos extractos vegetales y se realizaron

aproximaciones de su dilucidación estructural.

En el siglo XX se inició con la utilización del ácido acetilsalicílico y la síntesis de la

adrenalina, así como de algunos otros fármacos bactericidas, anticoagulantes,

antihistamínicos, el aislamiento de hormonas (esteroides, insulina) y la determinación

de la función de la acetilcolina, etc. La edad de oro de la introducción de nuevos

fármacos corresponde al período comprendido de 1940 a 1960, en gran parte por el

inicio de la segunda guerra mundial (1939-1945).

5

Tabla 1. Eventos históricos relevantes en el desarrollo de la química farmacéutica.

Descubridor Descubrimiento Período

Cullen Primeros intentos para relacionar la acción de las sustancias

activas de las plantas con distintos órganos

1712-1790

Sertürner Aislamiento de la morfina de Papaver somniferum 1806

Pelletier, Dumas

y Caventou

Extracción de la quinina de la corteza peruana de la Cinchona

pubescens

1823

Mein Aislamiento de la atropina de la planta Atropa belladona 1831

Niemann Utilización de la cocaína como anestésico local 1860

Davy Descubrimiento del N2O (óxido nitroso) como anestésico 1778-1829

Long Utilización del éter etílico como anestésico 1815-1875

Simpson Utilización del cloroformo como anestésico 1811-1870

Knorr Síntesis de la antipirina para tratar el dolor 1883

Dreser Síntesis del hedonal como hipnótico 1889

E. Fischer y von

Mering

Síntesis del primer barbitúrico (veronal) 1903

Paul Ehrlich Fundador de la quimioterapia. Planteó las relaciones estructura

química con la actividad biológica de los fármacos, así como,

el planteamiento del concepto de receptor.

1854-1915

Hoffman Inicio de la utilización del ácido acetilsalicílico 1898

Stolz y Dakin Síntesis de la adrenalina 1904

Gelmo Síntesis de las sulfanilamidas 1908

McLean y

Howell

Se consideró a la heparina como anticoagulante natural 1916-1922

Loewi Se determinó la función de la acetilcolina como mediador en

la transmisión nerviosa

1921

Banting y Best Aislamiento de la insulina para el tratamiento de la diabetes 1921

Zilva y Szent-

Györgyi

Aislamiento de la vitamina C 1918-1928

Bovet y Staub Síntesis de los antihistamínicos 1937

Florey y Chain Se demostró la actividad bacteriostática y manufactura de la

penicilina

1940

6

La tragedia de la talidomida supuso una llamada de atención a las autoridades

sanitarias de todo el mundo que reforzaron los requisitos necesarios para la

introducción en el mercado de nuevos medicamentos (Tabla 1).

Actualmente descubrir y desarrollar un fármaco implica encontrar un compuesto con

cierta actividad biológica que eventualmente pueda hacerse más selectiva y potente, al

modificar ciertos parámetros fisicoquímicos que permitan a la molécula tener mejor

selectividad hacia su blanco biológico vía reconocimiento, o una farmacocinética

adecuada que permita encontrar una mejor eficacia, así como disminuir su toxicidad.6

Encontrar el fármaco ideal es difícil; sin embargo, existen distintas metodologías

como la modificación química de la estructura de moléculas con potencial biológico o

fármacos probados, las cuales se han ido mejorando y creando compuestos prototipo o

líderes. Los compuestos líderes se pueden desarrollar de una manera racional y dirigida

con la ayuda de métodos computacionales como el Docking con el fin de sintetizar

nuevos compuestos con gran afinidad, potencia y eficacia hacia receptores específicos.

1.2 Docking

Como se mencionó anteriormente la mayoría de los fármacos conocidos han sido

aislados de los productos naturales, por síntesis o serendipia, así como sus análogos y

derivados químicos; sin embargo, hoy en día se dispone de tecnología más avanzada y

sofisticada para encontrar nuevas moléculas para uso terapéutico a través de búsquedas

sistemáticas empleando métodos computacionales7.

Para iniciar con la búsqueda es necesario encontrar un blanco biológico y molecular en

el cual será el punto de enfoque; entre los blancos más comunes destacan las proteínas

(receptores, enzimas, canales iónicos y receptores nucleares), las hormonas y factores, y

finalmente el RNA y el DNA7.

Cabe mencionar que cuando se trabaja con proteínas y en particular con enzimas es

importante considerar tres aspectos fundamentales: especificidad y selectividad por la

enzima, afinidad con la cual se une el sustrato a la proteína y la geometría del sitio

activo.

Una vez escogido el blanco o receptor de estudio es necesario escoger una serie de

compuestos para identificar de ellos una molécula líder o cabeza de serie6, a los cuales

se les hace pasar por pruebas a microescala o rastreo para seleccionar aquellas

moléculas que tengan la mejor actividad biológica sobre el blanco escogido; para

7

eventualmente sintetizar nuevos análogos y probarlos biológicamente con el fin de

establecer una relación cuantitativa estructura-actividad6,7

(QSAR). Esta es la forma

tradicional de hallar nuevas moléculas activas; sin embargo, este trabajo requiere de

mucho tiempo y de recursos. Por esto se han ideado metodologías más rápidas,

eficientes y menos costosas, como la simulación de la interacción ligando-receptor

asistido por computadora (Docking); a este tipo de ensayos se les denomina estudios in

silico.

La metodología Docking consta de una serie de etapas; la primera de ellas es disponer

de la estructura tridimensional de la molécula blanco; la segunda consiste en tener una

numerosa serie de ligandos potenciales con estructura tridimensional conocida; y la

tercera etapa consiste en un algoritmo de computadora que toma cada uno de los

ligandos y los hace interaccionar con la molécula blanco en el sitio de unión

previamente escogido (Figura 1).

Figura 1. Etapas fundamentales para llevar a cabo un estudio de Docking

Para hacer un estudio de docking, es necesario tener la estructura de la macromolécula

en tercera dimensión determinada por difracción de rayos X, por Resonancia Magnética

Nuclear (RMN) o modelado molecular (folding). La fuente principal de estructuras

tridimensionales de proteínas es el Protein Data Bank (PDB), el cual es de acceso

gratuito a través de la página web http:www.pdb.org. Las proteínas que se obtienen de

esta base de datos generalmente no pueden ser utilizadas directamente para realizar un

estudio de interacción con algún ligando; antes de este proceso es necesario realizar un

tratamiento previo que consiste en la adición de átomos de hidrógeno que constituyen

casi la mitad de los átomos de la proteína, remover las moléculas de agua y las

8

moléculas ajenas a la proteína, exceptuando a los grupos prostéticos o coenzimas que

están ocupando el sitio de unión del receptor, y por último la asignación de cargas

eléctricas formales y parciales a los átomos de los aminoácidos que componen a la

proteína de acuerdo al pH en la simulación.

Una vez realizado el tratamiento, se escoge una región de la proteína para la

exploración con los ligandos, siempre y cuando se conozca el sitio activo o algún sitio

alostérico al cual se unan los ligandos; sin embargo, también es posible explorar toda la

proteína para encontrar posibles sitios de unión con moléculas nuevas, aunque ello

requiere más tiempo de cómputo y por lo tanto el cálculo se hace un poco más

complicado. En relación a lo anterior existen dos alternativas para delimitar la selección

de la región a explorar; una de ellas consiste en revisar la superficie molecular con

ciertas características de tamaño, hidrofobicidad y grupos funcionales. La otra

alternativa es meramente experimental y sugiere determinar los sitios en donde las

moléculas de disolvente orgánico se albergan; y su determinación se hace constar con la

proteína cristalizada y visualizada en difracción de rayos X7. La ubicación del

disolvente sobre la proteína se consideran como sitios potenciales de unión a ligando.

En general, a este tipo de búsqueda de sitios de unión a ligando se le conoce como

mapeo por rejillas (celdas) o ―Grid Maps‖, el cual consiste en una celosía tridimensional

de puntos centrados y alrededor de la región de interés. Las distancias entre cada punto

varían desde 0.02 hasta 0.1 nm

Cada punto en la celda debe tener coordenadas tridimensionales nx, ny y nz, las cuales

representan una energía potencial para cada átomo o grupo funcional estudiado en la

proteína (Figura 2).

Figura 2. Selección del sitio de unión a ligando.

9

Por otro lado, es importante definir lo que entendemos por ligandos, los cuales son

una serie de moléculas que tienen ciertas características químicas capaces de

interaccionar sobre una molécula blanco; estos ligandos pueden estar definidos como la

cabeza de serie o líder y sus derivados. Cada una de estas moléculas deben pasar por un

tratamiento computacional previo a la interacción con la diana biológica, y esto consiste

en minimizar u optimizar la estructura de cada molécula, para obtener su confórmero

más estable y de menor energía8; así como añadir átomos de hidrógeno, estimación de

cargas formales y parciales, asignación del número de enlaces de rotación libre, masa

molar, hidrofobicidad, etc.

Ya preparados tanto la proteína como los ligandos, el siguiente paso es hacer

interaccionar el ligando con la región del blanco previamente seleccionada; el programa

computacional toma al ligando haciéndolo explorar dentro del sitio de unión, mediante

esquemas numéricos de puntaje en función de la orientación adoptada por el ligando en

una interacción. Durante una interacción el ligando adopta una orientación con un cierto

número de contactos con la macromolécula; si estos contactos son permisibles y

positivos para la interacción tendrá un alto puntaje, de lo contrario esa orientación e

interacción son desechadas, es decir, el programa selecciona aquellas interacciones con

el más alto número de contactos permisibles (en función de las distancias y cargas)

hasta encontrar la mejor; a este tipo de esquema numérico se le conoce como

metodología Simplex7.

Una de las formas para obtener puntajes confiables es tener programas de

regularización de geometría empleando ecuaciones de la física clásica que determinen la

energía no covalente de la unión ligando-receptor como función de las distancias

atómicas entre moléculas; por ejemplo se puede utilizar la ecuación de Coulomb, la cual

calcula la energía electrostática entre dos átomos cargados:

E = k [(q1.q2)/(r1-2)2]

Donde k, es una constante (1/(40)), q1 es la carga de un átomo del blanco y q2 la

carga de un átomo del ligando, y r es la distancia entre ambos átomos7.

Cuando se trata de una interacción con distancias cercanas entre los átomos, la ecuación

de la energía potencial de van der Waals es calculable:

10

E = (Ae-br

/r) – (C6/r6)

Donde (Ae-br

/r) representa el intercambio de energía repulsiva y – (C6/r6) representa la

dispersión de energía atractiva entre los átomos. En general el término (Ae-br

/r) es

aproximadamente (C12/r12

), quedando la ecuación:

E = (C12/r12

) – (C6/r6) E = (Cm/r

m) – (Cn/r

n)

Donde C12 y C6, son constantes que dependen de la intensidad de energía y la

separación de equilibrio entre los núcleos de los átomos. 6 y 12, son los parámetros de

Lennard-Jones (m = 12, n = 6), que se refieren al modelo de las fuerzas de van der

Waals (Figura 3).

Figura 3. Diagrama de energía-radio para el modelo de fuerzas de Van der Waals. reqm = Equilibrio de

separación internuclear.

En un análisis de docking, existen algoritmos con los cuales es posible correr la

interacción entre el ligando y el receptor, entre los más comunes se encuentran el

método Monte Carlo que simula el reconocimiento, así como los algoritmos genéticos y

el algoritmo genético Lamarckiano. En la actualidad los algoritmos genéticos son los

más socorridos para un análisis de docking y se basan en el lenguaje de evolución

natural genética y biológica. En el caso de docking los arreglos espaciales de los

11

ligandos y la proteína pueden ser definidos por el establecimiento de valores descritos

para la traslación, orientación y conformación del ligando con respecto a la proteína; es

decir, los ligandos poseen estados variables que corresponden a un gen dentro del

algoritmo genético. El estado del ligando corresponde al genotipo, y sus coordenadas

atómicas corresponden a su fenotipo.9

El algoritmo toma un par de individuos (genes) que son cruzados por un proceso de

entrecruzamiento para generar nuevos individuos con genes heredados del padre y la

madre; sin embargo, durante este proceso la progenie puede sufrir mutaciones productos

de la gran cantidad de aleatorizaciones ocurridas. Por tal motivo, es necesario que el

algoritmo haga una selección de la progenie basada en el anclado de los individuos9.

El docking molecular o fitness es la energía de interacción total del ligando con la

proteína, y es evaluado a través de funciones de energía.

Además de obtener información de tipo cualitativo como los residuos de aminoácidos

de unión con el ligando, información sobre como mejorar la estructura del ligando, etc.,

también es posible generar información cuantitativa que relacionen los parámetros de

dicha unión con la actividad biológica.6 La situación más ambiciosa es la que pretende

estimar la constante de disociación (Kd) de cada ligando mediante el modelado teórico

de la correspondiente G que se relacionan con la siguiente ecuación:

G = -RT lnKeq

Donde G es la energía libre de Gibbs de la interacción ligando-proteína, R es la

constante de los gases ideales, y Keq es la constante de equilibrios (constante de

disociación).

1.3 Farmacología del sistema nervioso central2

Entre los primeros fármacos descubiertos por los humanos de la antigüedad se

encuentran los que actúan en el sistema nervioso central (SNC), que siguen siendo el

grupo farmacológico de mayor uso.

No siempre se han comprendido claramente los mecanismos por los cuales diversos

fármacos actúan en el SNC; sin embargo, en los últimos 30 años se han logrado grandes

avances en la metodología farmacológica del SNC, a tal grado que actualmente es

posible estudiar la acción de un fármaco en células individuales e incluso en simples

canales iónicos dentro de las sinapsis. La información obtenida de estos estudios es la

base de importantes avances en el entendimiento del SNC:

12

1) La mayoría de los fármacos con efectos en el SNC actúan en receptores

específicos que modulan la transmisión sináptica. Muy pocos fármacos

pueden tener acciones inespecíficas en las membranas, incluso estas acciones

no mediadas por receptores causan cambios demostrables en la transmisión

sináptica.

2) Los fármacos se encuentran entre las herramientas más importantes para el

estudio de todos los aspectos fisiológicos del SNC, desde el mecanismo de

las convulsiones hasta el establecimiento de recuerdos a largo plazo. Tanto

los agonistas que se asemejan a los neurotransmisores naturales como los

antagonistas son extremadamente útiles en estos estudios.

3) Descifrar las acciones de los fármacos con eficacia clínica reconocida ha

conducido a algunas de las hipótesis más sobresalientes sobre los

mecanismos de las enfermedades. Por ejemplo, la información acerca de la

acción de los antipsicóticos en los receptores dopaminérgicos, ha

proporcionado la base de importantes hipótesis sobre la fisiopatología de la

esquizofrenia. De la misma manera, los estudios de los efectos de una

diversidad de agonistas y antagonistas en los receptores del ácido -

aminobutírico (GABA), están aportando nuevos conceptos que conciernen a

la fisiopatología de diversas enfermedades, incluyendo la ansiedad y la

epilepsia.

Las membranas de las células nerviosas contienen dos tipos principales de receptores

de membrana denominados receptores ionotrópicos y receptores metabotrópicos (Figura

4). Los primeros son receptores que permiten pasar iones a través de ellos provocando

cambios rápidos en la permeabilidad de la membrana por medio de un cambio eléctrico

en la membrana. Los segundos son receptores de repuesta más lenta que los canales

iónicos, y con la diferencia que actúan a través de proteínas que activan ciertas proteínas

o enzimas, muchos de ellos generan moléculas llamadas segundos mensajeros que son

elementos importantes en la transducción de señales para provocar un cambio

bioquímico en las células que se traduce a un cambio fisiológico total.

13

Figura 4. Clasificación de los tipos de receptores más importantes que participan en el SNC.

Los canales iónicos están definidos en función de los mecanismos que controlan sus

compuertas (apertura y cierre), los cuales son dependientes de voltaje, y canales

dependientes de ligando (Figura 5). Los canales dependientes de voltaje responden a

cambios en el potencial de la membrana de la célula. En las células nerviosas, estos

canales están concentrados tanto en el segmento inicial como en el axón, y son

responsables de la acción rápida del potencial, el cual transmite la señal desde el cuerpo

celular hasta la terminal nerviosa.

Los canales de unión a ligando se abren mediante la acción de neurotransmisores; este

tipo de receptores están constituidos por subunidades y el canal es una parte integral del

complejo receptor. Estos receptores son responsables de una transmisión sináptica típica

de vías jerárquicas en el SNC.

Por otro lado, los receptores acoplados a proteínas G modulan canales dependientes de

voltaje (Figura 6), en general canales de K+ y Ca

2+. Cuando las proteínas G interactúan

con los canales de Ca2+

inhiben la función del canal; por lo tanto este mecanismo se

considera una inhibición presináptica que sucede con receptores metabotrópicos

presinápticos, mientras que con los receptores metabotrópicos postsinápticos se activan

los canales de K+ ocasionando una inhibición postsináptica lenta.

RECEPTORES

Ionotrópicos Metabotrópicos

Dependientes de

voltaje

Dependientes de

ligando

Acoplados a

proteínas G

14

Figura 5. Canales iónicos dependientes de ligando y canales iónicos dependientes de voltaje.

Figura 6. Canales metabotrópicos que regulan canales iónicos dependientes de voltaje en el SNC

En relación a la activación e inhibición de canales iónicos y su transmisión es

importante destacar que el primer análisis sistemático de los potenciales sinápticos en el

SNC se realizó a principios del decenio de 1950 por Eccles et al., quienes los

registraron de manera intracelular a partir de las motoneuronas espinales. Cuando un

microelectrodo entra en una célula, ocurre un cambio súbito en el potencial registrado

por el electrodo, el cual suele ser cerca de unos -70 mV (potencial de membrana en

reposo). Existen dos vías de incidencia en la motoneurona que se denominan excitadora

e inhibidora; la vía excitadora cuando se estimula registra una pequeña despolarización

o potencial posináptico excitador (PPSE). Este potencial se debe al transmisor excitador

que actúa en el receptor ionotrópico, incrementando la permeabilidad del Na+ y K

+. Su

duración es muy breve, regularmente menor a 20 ms. El cambio de la intensidad del

estímulo a la vía y, por tanto, a la cantidad de fibras presinápticas activadas, cambia de

manera gradual la magnitud de la despolarización. Esto indica que la contribución que

una sola fibra hace al PPSE es muy pequeña. Cuando se activa una cantidad suficiente

15

de fibras excitadoras, el PPSE despolariza la célula posináptica hasta alcanzar el umbral

y se genera un potencial de acción de todo o nada.

Por el contrario, cuando se estimula la vía inhibidora, la membrana posináptica es

hiperpolarizada, produciendo un potencial posináptico inhibidor (PPSI). Deben

activarse conjuntamente una cantidad de sinapsis inhibitorias para modificar el potencial

de membrana notablemente. Esta hiperpolarización se debe a un aumento selectivo en la

permeabilidad de la membrana a los iones Cl- que fluyen dentro de la célula durante la

PPSI.

Por último, es importante destacar que existen una gran variedad de moléculas

(neurotransmisores) que generan acciones en el SNC interaccionando con sus receptores

respectivos generando PPSE o PPSI. Los neurotransmisores más conocidos son los

siguientes: Glicina, ácido -aminobutírico (GABA), glutamato, acetilcolina, serotonina,

etc.

1.4 Sinapsis GABAérgica y enzima aminotransferasa de GABA

Las sinapsis inhibidoras por lo general abren canales iónicos de Cl− y favorecen la

entrada de los mismos. Es importante recordar que una neurona en reposo tiene un

potencial eléctrico de −65 mV, y este eventualmente va a cambiar cuando una fuerza

externa mediada por iones aumentan o disminuyen tal voltaje,10

es decir, cuando la

neurona es excitada el voltaje se hace más positivo, y cuando es inhibida se hace más

negativo (Figura 7).

Como se puede apreciar en esta figura, la inhibición de una neurona se puede llevar a

cabo por dos mecanismos, por salida de iones K+ y por entrada de iones Cl

−, con el

único fin de hiperpolarizar a la célula generándose un voltaje más negativo o PPSI.

El PPSI se puede generar de dos maneras, una de ellas es la hiperpolarización de la

membrana dependiente de voltaje, ya sea por apertura de canales de K+ o apertura de

canales de Cl−; la otra forma es la apertura de canales iónicos dependiente de ligandos

tales como lo son la glicina y el GABA.

16

Figura 7. Tres estados eléctricos de una neurona10

El ácido -aminobutírico es un neurotransmisor biosintetizado a partir de ácido

glutámico por medio de la enzima glutamato descarboxilasa (GAD), dependiente del

cofactor fosfato de piridoxal (PLP) (Figura 8).

O

O

NH3

O

O

CO2

O

O

NH3GAD

Glutamato Ácido -aminobutírico

PLP

Figura 8. Biosíntesis de GABA. PLP: Fosfato de Piridoxal; GAD: Glutamato Descarboxilasa

Una vez sintetizado el neurotransmisor es almacenado en vesículas en la neurona

presináptica, para finalmente fusionarse con la membrana de la célula bajo un estímulo

excitador y liberar el GABA al espacio sináptico y así, ejercer su acción sobre

receptores específicos para este neurotransmisor.

Los receptores de GABA se clasifican como: ionotrópicos (GABAA y GABAC) y

metabotrópicos (GABAB) (Tabla 2); los primeros son canales iónicos de conductancia a

Cl−, y el segundo acoplado a proteínas G.

17

Tabla 2. Receptores de GABA.11

Receptor Distribución Mecanismo de Acción

GABAA Corteza cerebral, hipocampo, cerebelo Canal iónico de conductancia

a Cl-

GABAB

Corteza cerebral, hipocampo, cerebelo

Acoplado a proteína Gi.

Inhibición de adenilato

ciclasa (disminución de

AMPC), Inhibición de canales

de Ca2+

y apertura de canales

de K+)

GABAC

Retina

Canal iónico de conductancia

a Cl-

El sistema de regulación sináptica del GABA consiste en la recaptura del

neurotransmisor por medio de un sistema de transportación presináptica o en células

gliales; una vez recapturado el neurotransmisor puede almacenarse nuevamente en

vesículas o degradado a semialdehído succínico (SSA) por medio de la enzima

aminotransfersasa de GABA en las mitocondrias neuronales (Figura 9).

Figura 9. Sinapsis GABAérgica. Biosíntesis, liberación, transmisión, regulación y

degradación. GABA-AT: Aminotransferasa de GABA; GAD: Glutamato descarboxilasa; GDP:

Difosfato de guanosina; SSA: Semialdehído succínico; SSADH: Semialdehído succínico

deshidrogenasa.5

La aminotransferasa del GABA (GABA-AT) es una enzima dependiente de fosfato de

piridoxal que se encarga principalmente de desaminar al GABA y transformarlo en

semialdehído succínico. Esta misma enzima también tiene la capacidad de transformar

18

al 2-oxoglutarato a L-glutamato dependiendo del cofactor 5’-fosfato de piridoxamina

(PMP)12

(Figura 10).

O

O

O

O

O

H

O

O

O

PMP

H3N

O

O

H3N

O

O

OO

GABA-AT

PLP

L-Glutamato -cetoglutarato

GABA Semialdehído Succínico

GABA-AT

Figura 10. Función bioquímica de la enzima GABA-AT12

Esta enzima está ampliamente distribuida en la matriz mitocondrial de las neuronas y

células gliales, debido a la formación de SSA a partir del GABA, y su transformación

posterior (oxidación) a ácido succínico que fácilmente es incorporado al Ciclo de Krebs

en la misma mitocondria.

La estructura tridimensional de la GABA-AT de cerdo y su sitio activo se han

determinado por difracción de rayos X,13,14,15

así como la de la Escherichia coli.16, 17

Los datos cinéticos de la GABA-AT de humano muestran una actividad específica

que oscila entre 17.518

a 18.719

[g GABA /min mg proteína] y una Km de 1.27 mM16

mientras que para la GABA-AT de cerdo es de 1.1 mM.19

; de igual forma se ha

reportado la actividad de la GABA-AT de Pseudomonas fluorescens (0.79 mM) la cual

se utiliza de manera rutinaria en estudios cinéticos.20,21

1.5 Actividad encefálica: ondas cerebrales

La actividad eléctrica del cerebro es continua, es la conclusión a la que han llegado

diversos investigadores al analizar los registros eléctricos tanto de la superficie cerebral

como de la superficie exterior de la cabeza. Dentro de sus análisis han observado que la

intensidad y los patrones eléctricos están determinados por el nivel de excitación del

cerebro resultante del sueño, vigilia o de enfermedades cerebrales como la epilepsia o

psicosis.7

19

La intensidad de las ondas cerebrales sobre la superficie del cuero cabelludo varía

entre 0 y 200 V, y su frecuencia desde una cada varios segundos hasta 50 ó más por

segundo. La mayor parte del tiempo las ondas cerebrales son irregulares y en el

electroencefalograma (EEG) no se discierne un patrón general; sin embargo, en algunas

ocasiones se pueden diferenciar y en otras hay características ondulatorias en anomalías

específicas del cerebro, como en el caso de la epilepsia.

Para entender los patrones eléctricos de la epilepsia es importante conocer los estados

eléctricos normales del encéfalo, y para ello se estudian los distintos tipos de ondas

cerebrales que se presentan en las personas sanas y que se clasifican en: ondas alfa,

beta, theta y delta (Figura 11).

Figura 11. Patrón eléctrico de los distintos tipos de ondas cerebrales (, , y ) registradas

en un EEG.

Las ondas alfa son rítmicas con una frecuencia de entre 8 y 13 Hz y su intensidad es

aproximadamente 50 V y se encuentran en los EEG de las personas adultas sanas y

despiertas con un estado mental tranquilo y en reposo. Estas ondas se acentúan en la

región occipital, pero suelen presentarse también en zonas parietales y frontales del

cuero cabelludo. Como se mencionó antes, estas ondas se presentan en estado mental

tranquilo, pero, cuando la atención de la persona despierta y se dirige a algún tipo de

actividad mental, las ondas alfa son sustituidas por ondas beta asíncronas, de mayor

frecuencia y menor intensidad.10

Las ondas beta tienen una frecuencia mayor a 14 Hz, pero suelen alcanzar hasta los 80

Hz. Su mayor distribución se registra en las regiones parietal y frontal del cuero

cabelludo, durante la activación extraordinaria del sistema nervioso central o durante

los estados de tensión.10

20

Las ondas theta tienen frecuencia de entre 4 y 7 Hz y se observan de ordinario en las

regiones parietales y temporales de los niños, pero también en el transcurso del estrés

emocional de algunos adultos, en especial con el desánimo y la frustración. Con

frecuencia este tipo de ondas también se presentan en estados de degeneración cerebral.

Finalmente, las ondas delta comprenden todas las ondas del EEG con una frecuencia

menor a 3.5 Hz, mientras su voltaje suele duplicar a cuadruplicar el de casi todos los

tipos de ondas. Se producen con el sueño muy profundo, en la lactancia y en

enfermedades orgánicas graves del cerebro. Así pues, las ondas delta corresponden

únicamente a la corteza con independencia de la actividad de las regiones inferiores del

cerebro.

Cabe mencionar que el origen general de las ondas cerebrales se debe a la descarga

sincrónica de muchos miles o millones de neuronas o fibras; sólo así sumarán los

potenciales de las neuronas o fibras individuales para su registro a través del cráneo, ya

que de manera individual jamás podrían ser registradas en el EEG. Por lo tanto, la

intensidad de las ondas cerebrales registradas en el cuero cabelludo depende

principalmente del número de neuronas y fibras que descarguen sincronizadas entre sí, y

no del nivel total de actividad eléctrica del cerebro. De hecho, las señales nerviosas

fuertes y asíncronas se suelen anular en el registro debido a su polaridad opuesta.

1.5.1 Epilepsia

La epilepsia se caracteriza por una actividad excesiva e incontrolada de una parte o de

todo el sistema nervioso central. Una persona con predisposición a la epilepsia sufre

ataques cuando el nivel basal de excitabilidad del sistema nervioso se eleva por encima

de un umbral crítico.10

La epilepsia puede clasificarse en tres grandes categorías:

epilepsia de gran mal, epilepsia de pequeño mal y epilepsia focal.

Desde el punto de vista fisiológico y electroencefalográfico la epilepsia de gran mal se

caracteriza por descargas neuronales extremas de todas las áreas del encéfalo, es decir,

de la corteza de las partes profundas del cerebro, e incluso del tronco encefálico y del

tálamo. Por otra parte, las descargas transmitidas a lo largo de la médula espinal

producen casi siempre crisis tónicas generalizadas de todo el cuerpo, seguidas al final

del ataque de contracciones tónicas que alternan con sacudidas musculares

espasmódicas denominadas convulsiones tonicoclónicas, que es el tipo de convulsiones

generalizadas. Este tipo de crisis dura comúnmente desde algunos segundos hasta 3 ó 4

21

minutos. Se caracteriza por una depresión poscrítica de todo el sistema nervioso; por lo

tanto, la persona permanece después de la crisis en un estado de estupor que dura de uno

a varios minutos, y con frecuencia queda muy fatigada y dormida durante varias horas.7

En la Figura 12 se muestra el registro EEG de las convulsiones de gran mal

(tonicoclónicas), pequeño mal (crisis de ausencia) y focales (psicomotora).

Figura 12. Electroencefalogramas de los diferentes tipos de epilepsia10

En el registro es posible apreciar el EEG típico de las convulsiones tonicoclónicas, en

el que las descargas son de alto voltaje y sincrónicas y ocurren en toda la corteza

cerebral. Estas descargas se producen en los dos hemisferios cerebrales a la vez, lo que

demuestra que los circuitos neuronales anómalos responsables del ataque afectan en

gran medida a las regiones basales del cerebro que estimulan de forma simultánea

ambos hemisferios cerebrales.

Lo anterior, se ha demostrado experimentalmente al administrar en animales de

laboratorio estimulantes neuronales como el pentilentetrazol (PTZ), así como la

inducción de hipoglucemia insulínica o el paso directo de corriente por el cerebro.10

Una vez analizado el gran mal, cabe mencionar cómo se desencadena dicha crisis, la

cual consiste en su mayoría en predisposición hereditaria a la epilepsia que se da

aproximadamente en 1 de cada 50 a 100 personas. Sin embargo, existen otros factores

que pueden aumentar la excitabilidad del circuito epileptógeno como son: 1) los

estímulos emocionales intensos, 2) alcalosis desencadenada por hiperventilación, 3)

fármacos, 4) fiebre y 5) ruidos intensos o destellos luminosos. Por otro lado, las

personas no genéticamente predispuestas pero con determinadas lesiones traumáticas de

casi cualquier parte del encéfalo, pueden mostrar excitabilidad excesiva en zonas

localizadas del cerebro.

22

La epilepsia de pequeño mal afecta al sistema básico activador talamocortical y se

caracteriza por inconsciencia o disminución de la conciencia durante 3 a 30 s. En este

período la persona experimenta varias pequeñas sacudidas de los músculos,

normalmente de la cabeza y en particular, de los ojos; luego reaparece la conciencia y se

reanudan las actividades previas. Esta secuencia total de características se denomina

síndrome de ausencia o crisis de ausencia que es un tipo de epilepsia generalizada. El

paciente puede sufrir un ataque una vez cada varios meses, o raramente puede sufrir la

crisis de manera secuencial una tras otra con ataques rápidos.

En la Figura 12 se muestra, también, el registro ondulatorio (con frecuencia de 3 Hz)

para las crisis de ausencias que describe un patrón de punta-cúpula. La punta y la cúpula

se registran en casi toda la corteza cerebral, lo que indica que la convulsión afecta a la

totalidad del sistema activador talamocortical. Estudios con animales de laboratorio

sugieren que es el resultado de la oscilación de un sistema de neuronas que implica: 1)

neuronas reticulares talámicas inhibidoras (neuronas inhibidoras productoras de

GABA), y 2) neuronas excitadoras talamocorticales y corticotalámicas.

En lo que respecta a la epilepsia focal, esta consiste en la afectación de cualquier parte

del encéfalo, ya sea regiones concretas de la corteza cerebral o estructuras más

profundas del cerebro y del tronco encefálico. Casi siempre la epilepsia focal es

consecuencia de alguna lesión orgánica o anomalía funcional, como tejido cicatricial del

encéfalo que tracciona la neuronas contiguas, tumores que comprimen una zona del

encéfalo, un área destruida del tejido encefálico, o una alteración congénita de los

circuitos locales. Estas lesiones pueden provocar descargas extremadamente rápidas de

las neuronas locales; cuando su rapidez de descarga se eleva por encima de unas 1000

veces por segundo, las ondas sincrónicas comienzan a diseminarse por las regiones

contiguas de la corteza. Estas ondas son consecuencia de circuitos reverberantes

localizados que gradualmente reclutan zonas contiguas de la corteza hacia el foco de

descarga epiléptica. El proceso se extiende a las regiones adyacentes de forma muy

lenta, a escasos milímetros por minuto, o muy rápida, de varios centímetros por

segundo. Cuando esta onda de excitación se extiende por la corteza motora, origina un

frente progresivo de contracciones musculares en el lado contrario del cuerpo,

comenzando, en los casos más característicos, por la boca y avanzando progresivamente

hacia las piernas, pero en otras ocasiones la secuencia es la inversa. Esta crisis se

denomina epilepsia jacksoniana (convulsiones parciales).

23

La Figura 12 muestra también el trazado ondulatorio de una convulsión focal

psicomotora, la cual describe una onda rectangular de baja frecuencia (2 a 4 Hz) y con

ondas superpuestas de 14 Hz.

1.5.2 Farmacología de las epilepsias

Durante un tiempo se pensó que podría desarrollarse un fármaco para el tratamiento

de todas las formas de epilepsia, pero las causas de esta enfermedad son diversas como

ya se ha mencionado anteriormente, las cuales incluyen alteraciones genéticas y del

desarrollo, procesos patológicos infecciosos, traumáticos, neoplásicos y degenerativos.

La farmacoterapia actual proporciona poca evidencia de especificidad etiológica; sin

embargo, hay una especificidad de acuerdo con el tipo de convulsión (Tabla 3), entre las

que se encuentran: crisis parciales y las crisis generalizadas.

En términos generales, la fisiopatología de las crisis o epilepsias se debe a una función

defectuosa de la sinapsis entre neuronas; es decir, que la reducción de la actividad

sináptica inhibidora y el fomento de la actividad sináptica excitadora desencadenan una

crisis. Molecularmente, los neurotransmisores que median de manera global la

transmisión sináptica en el cerebro del mamífero son aminoácidos, el ácido -

aminobutírico (GABA) y glutamato que son los principales neurotransmisores

inhibidores y excitadores respectivamente.

Es importante señalar que los receptores involucrados en las convulsiones son los

GABAA, NMDA, AMPA/Kainato, así como canales de Ca2+

tipo T, canales de Na+ y

canales de K+. La Figura 13 ilustra una sinapsis entre neuronas donde se encuentran los

blancos moleculares de los distintos fármacos antiepilépticos.

24

Tabla 3. Clasificación y tratamiento farmacológico de las epilepsias.1,2

Tipo de Convulsión Características Anticonvulsivos

CRISIS PARCIALES

Parciales simples

Duración de 20 a 60 s.

No hay pérdida del conocimiento

La manifestación depende de la parte de

la corteza afectada.

Carbamazepina,

fenilhidantoína, valproato,

gabapentina, lamotrigina,

levetiracetam, tiagabina,

topiramato, zonosamida y

vigabatrina

Parciales complejas Pérdida del conocimiento por 0.5 a 2.0

min, aunada a movimientos propositivos

Los mismo que los anteriores

Parcial con

convulsiones tónico-

clónicas

generalizadas de

manera consecutiva

Pérdida del conocimiento con

contracciones sostenidas de los músculos

del todo el cuerpo, seguido de períodos

de relajación (convulsiones clónicas).

Duración de 1 a 2 min

Los mismos que los

anteriores, además,

primidona, fenobarbital

CRISIS GENERALIZADAS

Crisis de ausencia

Inicio repentino de pérdida del

conocimiento, mirada fija e interrupción

de las actividades que se estaban

efectuando; la crisis dura menos de 30s

Etosuximida, valproato,

lamotrigina

Convulsión

mioclónica

Contracción muscular breve de tipo

choque eléctrico, ya sea circunscrita a

parte de una extremidad, o generalizada

Valproato, lamotrigina,

topiramato

Convulsión tónico-

clónica

Manifestaciones similares a las parciales

con convulsiones tónico-clónicas, pero

hay ausencia de convulsiones parciales

Carbamazepina, fenobarbital,

fenilhidantoína, primidona,

valproato, lamotrigina,

topiramato

25

Figura 13. Mecanismo de acción de los fármacos antiepilépticos. (+): Activación; (-):

inhibición.5

Es importante señalar aspectos generales de los mecanismos moleculares durantes los

distintos tipos de crisis convulsivas, así como los blancos farmacológicos clave para el

tratamiento de la enfermedad.

1.5.2.1 Crisis parciales. Aspectos moleculares1

La comprensión de los mecanismos de la epileptogénesis en términos celulares y

moleculares proporcionaría un marco para la creación de nuevos métodos terapéuticos.

La disponibilidad de modelos animales brinda una oportunidad para investigar los

mecanismos base; uno de ellos es el denominado ―activación inducida‖, el cual consiste

en la estimulación eléctrica periódica, breve y de baja intensidad a las amígdalas u otras

estructuras límbicas. Tales estimulaciones desencadenan una crisis breve registrada en

el EEG, sin cambio de comportamiento, pero las estimulaciones repetidas dan por

resultado intensificación progresiva de las crisis, lo cual culmina en crisis

tonicoclónicas. A pesar de la propensión extrema a crisis intensas, no ocurren crisis

espontáneas o un padecimiento en verdad epiléptico, sino hasta que se han administrado

100 a 200 estimulaciones. Es de importancia saber que el inicio del control de la

actividad inducida, es de manera gradual, con lo cual facilita el estudio experimental

para cuantificar la epiletogénesis que desencadenan las crisis convulsivas. Los estudios

farmacológicos han demostrado que las intervenciones que limitan la activación del

26

receptor de NMDA de glutamato, o el subtipo trkB del receptor de neurotrofina, inhiben

la epileptogénesis en este modelo.

Por otra parte, a partir de estudios recientes de las últimas dos décadas se han obtenido

datos importantes acerca de los mecanismos de acción de los fármacos que son eficaces

contra las convulsiones parciales. Estas observaciones se deben a los estudios

electrofisiológicos de modelos in vitro relativamente simples, como neuronas aisladas

del SNC del mamífero y conservadas en cultivo primario.

Los análisis electrofisiológicos de neuronas individuales durante una crisis convulsiva

parcial muestran que las neuronas presentan despolarización y potenciales de acción de

activación a frecuencias altas. Este modelo de activación neuronal es característico de

las crisis y no es frecuente durante la actividad neuronal fisiológica; por tanto, cabría

esperar que la inhibición selectiva de este modelo de activación redujera crisis con

efectos indeseables mínimos. Los fármacos carbamazepina, lamotrigina, fenilhidantoína

y ácido valproico inhiben la activación de alta frecuencia a concentraciones que son

eficaces para limitar las convulsiones en seres humanos. La inhibición de la activación

de alta frecuencia se considera mediada por el decremento de la capacidad de los

canales de Na+ para recuperarse de dicha activación; es decir, se requiere la abertura

desencadenada por la despolarización de los canales de Na+ en la membrana axoniana

de una neurona, para que se origine un potencial de acción.

Después de la apertura los canales de Na+ quedan inactivados una vez generado el

potencial de acción; a esta inactivación se le denomina período refractario, en el cual los

canales no pueden generar otro potencial de acción hasta que pase un período de tiempo

para que se vuelvan a recuperar para poder generar nuevamente un potencial de acción.

Este fenómeno es importante, ya que el decremento de la rapidez de recuperación de los

canales limitaría la capacidad de las neuronas para generar frecuencias altas y por tanto,

de controlar las crisis convulsivas. Los fármacos que tienen la capacidad de limitar a las

neuronas bajo este mecanismo lo constituyen las carbamazepina, lamotrigina,

fenilhidantoína, topiramato, ácido valproico y zonisamida (Figuras 14 y 15).

27

HN

NH

O

O

N

NH2O

OH

O

H3C

N

NN

Cl

Cl

H2N NH2

O

O

O O

O

H3C

CH3

CH3

CH3

OSO2NH2

N

O

SO2NH2

Fenilhidantoína Carbamazepina

Ácido valproico

Lamotrigina

Topiramato ZonisamidaCH3

Figura 14. Estructura de los bloqueadores de canales de Na+ voltaje-dependientes en período

refractario.

Figura 15. Mecanismo de acción de los fármacos bloqueadores de canales de Na+ voltaje-

dependientes.1

De la misma manera, se han realizado estudios acerca de los mecanismos que

incrementan la inhibición sináptica mediada por GABA que reduce la excitabilidad

neuronal y a su vez aumenta el umbral convulsivo. Diversos fármacos bloquean las

convulsiones al regular la inhibición sináptica mediada por GABA a través de sus

receptores GABAA en sitios distintos de la sinapsis, cuyos mecanismos de acción sean

la base de la eficacia de estos compuestos contra las convulsiones parciales y

tonicoclónicas en el humano. Existen tres mecanismos principales de regulación

GABAérgica, el primero de ellos consiste en la modulación alostérica de las

benzodiazepinas y barbitúricos en sitios específicos del receptor GABAA (Figuras 16 y

17). El segundo mecanismo consiste en el incremento del neurotransmisor GABA por

inhibición de la enzima aminotransferasa de GABA que degrada a la molécula para

inactivarla, y su principal inhibidor el fármaco -vinilGABA (vigabatrina) que se une a

28

la enzima de forma irreversible1 (Figura 16 y 17). El último mecanismo también

consiste en aumento de la concentración de GABA en la sinapsis, pero esta vez es por el

bloqueo del sistema de recaptura mediado por el transportador de GABA (GAT-1),1

cuyo principal bloqueador es la tiagabina (Figuras 16 y 17).

N

N

R1R2

R3

R7

R2'

N NH

OO

aR5 R5b

O

R3

S

OH

O

H2N

H2C

N COOH

H

S

S

H3C

CH3

Benzodiazepinas

o

**

Barbitúricos

Vigabatrina

Tiagabina

Figura 16. Estructura de los moduladores de GABA durante la sinapsis.

Figura 17. Transmisión sináptica incrementada del GABA1

1.5.2.2 Convulsiones generalizadas. Aspectos moleculares1

A diferencia de las crisis parciales, originadas en regiones circunscritas de la corteza

cerebral, las de inicio generalizado se producen en la activación recíproca del tálamo y

la corteza. De las convulsiones generalizadas, las más analizadas son las denominadas

29

crisis de ausencia. La sincronía sobresaliente en la aparición de las descargas neuronales

en zonas diseminadas de la neocorteza dio origen a la idea de que sincronizaba estas

descargas neuronales una estructura situada en el tálamo, el tallo encefálico o en ambos.

La estimulación de baja frecuencia de las estructuras talámicas de la línea media

desencadena un ritmo en el EEG en la corteza, semejantes a las descargas de ondas en

espiga características de las crisis de ausencia. Los registros intracerebrales con

electrodos mostraron afectación talámica y neocortical en la descarga de ondas y

espigas propias de las crisis de ausencia.

Estos ritmos de baja frecuencia son posibles por una combinación de factores como

conexiones sinápticas excitadoras recíprocas entre la neocorteza y el tálamo, lo mismo

que propiedades intrínsecas de las neuronas del tálamo. Dichas propiedades consisten en

una función central en la generación de espigas y ondas con una frecuencia de 3 Hz, es

una forma particular de corriente de Ca2+

regulada por voltaje, la corriente de umbral

bajo tipo T.

Las descargas de potenciales de acción en el tálamo son mediadas por canales de Ca2+

tipo T; y la corriente eléctrica que se genera cumple una función amplificadora en las

variaciones talámicas, y la oscilación corresponde a la espiga y la onda de 3 Hz

característica de las crisis de ausencia. Por lo tanto, estos canales constituyen un blanco

farmacológico importante para una serie de fármacos inhibidores de los canales de Ca2+

tipo T en el tálamo, cuyos exponentes son: la etosuximida y el ácido valproico (Figuras

18 y 19).

OH

O

H3C

Ácido valproico

HN OO

CH3

CH3

EtosuximidaCH3

Figura 18. Estructuras de los principales fármacos bloqueadores de los canales de Ca2+

tipo T

30

Figura 19. Reducción de la corriente de Ca2+

tipo T inducida por anticonvulsivos.1

31

2. ANTECEDENTES

2.1 Vigabatrina

Las investigaciones que buscan fármacos para aumentar los efectos del GABA

incluyen esfuerzos para encontrar agonistas y profármacos del GABA, los cuales

incluyen a aquellos que inhiben la recaptura del neurotransmisor, así como la inhibición

de la enzima GABA-AT.

La vigabatrina (-vinil-GABA) es uno de los fármacos que ha sido comercializado

ampliamente en Europa y América del Sur, y que es un inhibidor irreversible de la

aminotransferasa del GABA (GABA-AT), lo que provoca una potenciación en la acción

del neurotransmisor ya que el fármaco evita su degradación. En la Figura 20 se muestra

el mecanismo de reacción de inhibición de la vigabatrina al sitio activo de la enzima

GABA-AT.14

RHNNHR

O

NH2

NH

CH3

OH

OH

OP

O

O O

Lys N

PLP H2N COO

Lys NH2

Lys NH2

NH

H

PLP

COO

B H

Lys NH2

Lys NH

NH

PLP

COO

Lys NH

NH

PLP

COO

NH COO

PLP

RHN

O

NHR

N

NH

OH

CH3

OP

O

O O

HN

PLP

COO

Lys NH

NH

PLP

COO

Lys329 de la

GABA-AT

5'-Fosfato de piridoxal (PLP)

Generación de la base

de Schiff en el sitio

activo de la enzima

GABA-T

329329

329329

329329

329

Figura 20. Mecanismo de reacción de la inhibición irreversible de la vigabatrina con la Lys329

del sitio activo de la enzima aminotransferasa de GABA.11

32

Adicionalmente se conoce que la vigabatrina se comercializa como racemato, en el

que el enantiómero S-(+) es activo, y se sospecha que el enantiómero R-(−) es inactivo6

(Figura 21).

(R)

OH

O

NH2

HO(S)

O

NH2

Figura 21. Estructura de la vigabatrina R y S.

La vigabatrina es utilizada para el tratamiento de crisis parciales y el síndrome de

West. Las reacciones adversas del compuesto van desde somnolencia, mareos y

aumento de peso, hasta agitación, confusión y psicosis. Recientemente los estudios de

farmacovigilancia han demostrado que el uso a largo plazo del fármaco provoca

alteraciones irreversibles en el campo visual.6 De la misma manera, se han descrito

otros inhibidores de la GABA-AT que muestran inhibición irreversible, los cuales son:

-fluorometil-GABA6 y la gabaculina; esta última es una neurotoxina aislada de

Streptomyces toxacaenis.6

Hoy en día, la vigabatrina es el único fármaco inhibidor de la GABA-AT en el

mercado, de tal suerte que no existen otras opciones que resulten más ventajosas; sin

embargo, los científicos tratan de obtener análogos rígidos de la vigabatrina utilizando

ciclohexenos22

y ciclopentenos23

sustituidos, así como algunos metabolitos secundarios

aislados de fuentes naturales como Gastrodia elata,24

entre otras.

2.2 Cicloadiciones [4+2] tipo Diels-Alder

En una reacción de cicloadición [4+2] tipo Diels-Alder entre un dieno y un dienófilo

se producirá un anillo de 6 miembros; esta reacción se caracteriza generalmente por ser

una reacción rápida y sencilla. Es importante señalar que la predicción de la reactividad

entre el dieno y dienófilo puede ser posible haciendo un análisis de las energías de

(Highest-Occupied Molecular Orbital) HOMO y (Lowest-Unoccupied Molecular Orbital)

LUMO de las especies involucradas (Figura 22).25

33

HOMO

LUMO

Figura 22. Interacción HOMO-LUMO de las especies involucradas en una reacción de Diels-

Alder.

Existen diferentes tipos de dienófilos, que van desde alquenos simples (dienófilos

pobres), hasta aquellos que están sustituidos, con el fin de enriquecer su reactividad y

selectividad.25

Los dienos también pueden ser alquenos simples o sustituidos, además de

estar en forma alifática, endocíclica, exocíclica y mixta.25

2.2.1 Regioselectividad de la reacción Diels-Alder

En términos generales, cuando se adiciona un dieno asimétrico con un dienófilo

asimétrico, hay 2 posibles productos regioisoméricos (Figura 23). La regioselectividad

de este tipo de reacciones por lo general está dada para los isómeros para y orto;

mientras que el isómero meta es el menos favorecido en los dos casos.

La teoría de orbitales moleculares frontera (FMO) explica que la interacción de

reactivos asimétricos durante la reacción de Diels-Alder depende del efecto electrónico

de los sustituyentes tanto en el dieno como en el dienófilo. De esta idea deriva que la

interacción más favorable será aquella en donde la magnitud de los coeficientes de los

orbitales HOMO y LUMO sea más similar.

R

+

X

R

X

+

R

XPRODUCTOMAYORITARIO

+

XX

+

X

PRODUCTOMAYORITARIO

RR R

Figura 23. Regioselectividad de la reacción Diels-Alder. Los estereoisómeros no se

muestran.25

34

2.2.2 Estereoquímica de la reacción Diels-Alder

1) Si el dienófilo tiene configuración Z ó cis; en el producto de Diels-Alder la

relación de estos sustituyentes será syn.

CO2CH3

CH3

H

H

+

CO2CH3

CH3

H

H(Z)-Butanoato de metilo 1, 3-Butadieno

Producto syn

2) Con respecto a dienos 1,4 disustituidos, la reacción es estereoespecífica para el

isómero syn también.

3) Una condición importante es que el dieno debe estar en una conformación

―cisoide‖, ya que si está en forma ―transoide‖ la reacción de cicloadición no se

lleva a cabo.

Cisoide Transoide

4) Cuando el dieno es cíclico, hay 2 posibles vías en la cual la adición puede

ocurrir si el dienófilo es asimétrico. El lado más sustituido del dienófilo puede

estar bajo el dieno (adición endo), o puede estar en el lado opuesto (adición exo).

Por lo regular se favorece la adición endo sobre la exo ya que a decir de muchos

autores en la adición endo hay una mayor sobreposición de los orbitales

interaccionantes entre átomos que no participan de manera directa en la

reacción. A esto se le denomina interacciones secundarias.

HOOCH

HH

COOH

HCOOH

HH

H

H

COOH

Adición endo

Adición exo

5) Como hemos visto, las cicloadiciones [4+2] tipo Diels-Alder pueden ser regio y

estereoselectivas; pero en algunos casos pueden ser también enantioselectivas,

35

aunque en estos casos es necesario que se presente quiralidad en alguno de los

componentes de la reacción.

6) Para reacciones que ocurren bajo condiciones de Demanda Electrónica Normal,

es decir, reacciones que ocurren con dienos como nucleófilos (HOMO) y

dienófilos como electrófilos (LUMO), en donde se ha demostrado que

sustituyentes electrodonadores en el dieno aceleran la reacción; mientras que los

electroatractores la retardan. En el caso del dienófilo sucede lo contrario: los

electrodonadores desaceleran la reacción y los electroatractores la aceleran. A

fin de cuentas, uno de los reactivos en la reacción actúa como donador de

electrones y el otro como aceptor.

2.2.3 Mecanismo de reacción

En general se habla de tres posibles mecanismos de reacción por los cuales se llegan a

los aductos Diels-Alder; el primero de ellos involucra un estado de transición cíclico de

seis centros; este tipo de reacción es concertada y sucede en un solo paso (Figura 24a).

Otro mecanismo propone la formación de un dirradical que conlleva la unión del dieno

y dienófilo (Figura 24b). El tercer mecanismo involucra la formación de un zwiterión

por movimientos de electrones (Figura 24c).

a

b

c

Figura 24. Posibles mecanismos de reacción por los cuales se podría lleva a cabo una cicloadición.

a: concertado; b: dirradical; c: iónico.

Las investigaciones sugieren que el mecanismo (a) es el más sustentable ya que

la reacción es estereoespecífica para el dieno y dienófilo.

36

3. JUSTIFICACIÓN

La epilepsia es una condición neurológica que afecta entre 0.5 y 1.0 % de la población

mundial,2,26

por tal motivo, esta enfermedad constituye un problema de salud pública,

ya que solo en México el 1.8 % de la población la padece.4

La terapéutica actual contra la epilepsia en general, y en particular con la epilepsia de

tipo parcial resulta ser eficaz; sin embargo, aproximadamente el 30 % de la población

tratada con antiepilépticos de primera elección no responde.26

Por este motivo se ha

incluido de manera cuidadosa el uso de vigabatrina (indicada normalmente para el

tratamiento de espasmos infantiles o síndrome de West) para tratar a aquellos pacientes

que presentan crisis parciales resistentes al tratamiento; a dicha resistencia también se le

conoce como epilepsia refractaria. Un estudio sistemático ha mostrado que el uso de la

vigabatrina en pacientes que presentan epilepsia refractaria ha resultado eficaz;26

sin

embargo, los efectos adversos del fármaco van desde aquellos relativamente leves

(somnolencia, mareos y aumento de peso, agitación, confusión y psicosis) hasta los más

graves, como el desarrollo de alteraciones del campo visual2,6,26

que resulta irreversible

en la terapia a largo plazo con el medicamento.

Por lo anterior, es justificable la búsqueda de nuevos compuestos para inhibir a la

enzima aminotransferasa del GABA (GABA-AT) diseñándolos a través de un enfoque

molecular, que involucre la interacción y análisis de las estructuras de los compuestos a

sintetizar con el blanco biológico, con el único fin de obtener compuestos más

selectivos y menos tóxicos de una manera sistemática y racional para un futuro manejo

adecuado de la enfermedad.

37

4. HIPÓTESIS

La aminotransferasa del GABA es una enzima que depende del fosfato de piridoxal, el

cual es esencial para el funcionamiento de la proteína, ya que este catalizador transfiere

el grupo amino del GABA al -cetoglutarato; por tal motivo son esenciales para el

reconocimiento tanto del GABA como de la vigabatrina.13-17

Así, en el presente trabajo

se pretende obtener aductos Diels-Alder derivados de los ácidos N-fenilmaleámico y N-

fenilfumarámico, sustituidos estratégicamente con un grupo carboxilo o carboetoxi en

posición meta o para del anillo aromático mismos que le conferirían una cierta analogía

al neurotransmisor GABA (Figura 25). Se espera que esto permita el reconocimiento de

estos sustratos sintéticos en el sitio activo, inhibiendo a la enzima GABA-AT de forma

competitiva.

NH

OH

O

O

OR

O

NH

OH

O

O

OR

O

O

NH

OH

O

O

OR

O

O

NH

OH

O

O

OR

O

H2N

OH

O

O

NH

OH

O

OR

O

H3C

O

NH

OH

O

O

ORH3C

GABA

R = -H, -CH2CH3

Figura 25. Analogía estructural de los aductos Diels-Alder propuestos con el ácido -

aminobutírico (GABA). Se muestran los derivados con sustitución en meta.

38

5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo General

De acuerdo a lo anterior, en este trabajo se propone la síntesis de aductos de Diels-

Alder que tengan analogía estructural con el neurotransmisor GABA, mismos que se

obtendrían a partir de la reacción entre dienófilos derivados de los ácidos N-

fenilmaleámico y N-fenilfumarámico y los dienos isopreno, ciclopentadieno y furano.

Los dienófilos tendrían como sustituyente un grupo carboxilo o carboetoxi en la

posición para o meta del grupo N-fenilo. Los aductos así obtenidos se probarían como

anticonvulsivantes por técnicas in vivo e in vitro, además de llevar a cabo también la

exploración de la interacción ligando-receptor entre ellos y la enzima GABA-AT, con el

objeto de evaluarlos como inhibidores de la misma. Esto se llevaría a cabo por estudios

computacionales de tipo Docking, sobre las diferentes posibilidades conformacionales

de los aductos.

5.2 Objetivos particulares

Explorar la selectividad de la interacción ligando-enzima por Docking de la

conformación más estable de cada uno de los aductos Diels-Alder propuestos,

con el fin de observar el sitio de unión de dichos compuestos sobre la enzima.

Sintetizar los ácidos N-fenilmaleámicos y N-fenilfumarámicos monosustituidos

con el propósito de obtener los precursores (dienófilos) a la reacción de Diels-

Alder.

Sintetizar los aductos Diels-Alder a partir de los dienófilos obtenidos de acuerdo

al punto anterior, al hacerlos reaccionar con los dienos isopreno, furano y

ciclopentadieno bajo condiciones térmicas, los cuales constituirán los productos

a probar sobre la enzima GABA-AT in vitro.

Caracterizar a todos y cada uno de los compuestos por distintas técnicas

espectroscópicas: Espectrofotometría de Infrarrojo (IR), Espectroscopía de

Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de 1H y

13C, Espectrometría de Masas

(EM) para asegurar su obtención y pureza.

Evaluar la capacidad inhibitoria in vitro de los compuestos sintetizados sobre la

enzima GABA-AT de Pseudomonas fluorescens con el fin de caracterizar el tipo

de inhibición que presentan.

39

Evaluar in vitro como anticonvulsivos a aquellos compuestos que presentaron

actividad sobre la enzima, a través del modelo de las convulsiones inducidas con

pentilentetrazol (PTZ), con el propósito de correlacionar la inhibición enzimática

con la actividad antiepiléptica.

40

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 SÍNTESIS

Como se mencionó en los objetivos, se prepararon en primera instancia los dienófilos

(ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d) que preceden a los aductos Diels-Alder

correspondientes. Estos productos (5a-d) fueron sintetizados a partir del anhídrido

maleico (1) y las anilinas mono sustituidas (3a-d) (Figura 26).

NH2

R1

R2

a: R1 = COOH, R2 = H

b: R1 = COOEt, R2 = H

c: R1 = H, R2 = COOH

d: R1 = H, R2 = COOEt

O

O

O

+

NH

R1

R2

OH

O

OTHF, ta, 16 h

1 3a-d 5a-d

Figura 26. Reacción general de síntesis de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d.

El objetivo de haber sintetizado los dienófilos 5a-d fue el tener desde esta porción

estructural, la analogía con el neurotransmisor GABA obteniendo el aducto

correspondiente del ácido maleico; sin embargo, el equivalente molecular del ácido

maleico utilizado fue el anhídrido, ya que las aminas aromáticas (3a-d) son menos

básicas o menos nucleofílicas que las aminas alifáticas que poseen un pKa más alcalino

que las hace más reactivas27

; este tipo de reacciones son bastante sencillas y los

rendimientos son buenos, como se observa en el caso de los compuestos (3a-d) que

fueron de moderados a muy buenos (Tabla 4).

41

Tabla 4. Características físicas de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d

NH

OH

O

O

OH

O

12

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

5a

NH

OH

O

O

O

O

12

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

5b

NH

OH

O

O

12

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

OH

O

5c

NH

OH

O

O

12

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

O

O

CH3

5d

Rendimiento

(%)

90.3 89.0 95.8 77.7

Punto de

fusión (°C)

215-216 177-179 215-217 155-158

Rf

(AcOEt/MeOH

1:1)

0.64 0.74 0.53 0.75

La reacción genera una amida aromática muy característica y fácilmente identificable

tanto en el espectro de infrarrojo (IR) como en resonancia magnética nuclear de protón

(RMN 1H).

Para estos compuestos las bandas características en IR corresponden a las vibraciones

de estiramiento N-H (alrededor de 3300 cm-1

) y C=O de los ácidos , insaturados

(alrededor 1620 cm-1

) como se muestran en la Tabla 5.

42

Tabla 5. Caracterización de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d por espectrofotometría IR (pastilla

de KBr).

NH

OH

O

O

OH

O

12

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

5a

NH

OH

O

O

O

O

12

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

5b

NH

OH

O

O

12

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

OH

O

5b

NH

OH

O

O

12

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

O

O

CH3

5d

-NH 3316, 1176 3302, 1177 3304, 1123 3312, 1112

-OH 3018 3213 No se observa No se observa

-CH2=CH2- No se observa 3113 No se observa No se observa

-CH3 y

-CH2-

-------- 2920 2883 No se observa

-C=O ,-

insaturado

1626 1638 1624 1683

OHO

1694 -------- 1713 --------

OO

-------- 1709 -------- 1724

HN-C=O 1581 1584 1556 1592

-CO-O -------- No se observa -------- No se observa

O-C-C -------- 1272 -------- 1289

p-di

1543

1550, 867, 853,

772

--------

--------

m-di

--------

--------

1555, 850, 757

1580, 848, 761

Del mismo modo, la evidencia de la presencia de los productos en los espectros de

RMN de 1H corresponden a la señal simple del hidrógeno de la amida (-NH) alrededor

de 10.60 ppm; otras señales importantes corresponden a las dos señales dobles de los

hidrógenos vinílicos (entre 6.30 y 6.50 ppm). Estas señales también demuestran que los

43

ácidos maleámicos obtenidos son derivados del ácido maleico, puesto que las constantes

de acoplamiento en los 4 casos tienen un valor aproximado de 3J = 12.00 Hz, que

corresponde a una constante cis (Tabla 6). Cabe mencionar que en los casos de los

compuesto 5a y 5b las señales correspondientes a los hidrógenos aromáticos presentan

acoplamientos típicos de sustitución para con constantes orto típicas alrededor de 8.00-

9.00 Hz. En relación a los compuestos 5c y 5d muestran señales características de

sustitución meta.


13C (75 MHz) en DMSO-d6 de los ácidos N-

fenilmaleámicos 5a-d.

NH

OH

O

O

OH

O

12

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

5a

NH

OH

O

O

O

O

12

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

5b

NH

OH

O

O

12

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

OH

O

5c

NH

OH

O

O

12

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

O

O

CH3

5d

Posición 1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1 12.00 – 13.00

br

167.45 12.00 – 13.00

br

167.65 12.00 – 13.00

br

167.46 12.00 – 13.00

br

167.68

2 6.33 d

(11.87)

130.73 6.33 d

(12.00)

131.01 6.32 d (12.04) 130.77 6.32 d (12.00) 131.02

3 6.50 d

(11.87)

132.30 6.48 d

(12.00)

132.22 6.48 d (12.04) 132.25 6.47 d (12.00) 131.44

4 -------- 164.23 -------- 164.39 -------- 164.03 -------- 164.19

1’ -------- 126.15 -------- 125.38 -------- 139.40 -------- 139.68

2’ 7.74 d (8.76) 119.30 7.75 d (8.70) 119.51 8.29 s 120.67 8.28 s 120.54

3’ 7.92 d (8.76) 130.98 7.91 d (8.70) 130.92 -------- 131.89 -------- 132.16

4’ -------- 143.24 -------- 143.68 7.66 d (7.92) 125.12 7.66 d (7.80) 124.51

5’ 7.92 d (8.76) 130.98 7.91 d (8.70) 130.92 7.99 t 129.63 7.46 t 129.96

6’ 7.74 d (8.76) 119.30 7.75 d (8.70) 119.51 7.83 d (7.92) 124.79 7.86 d (7.80) 125.03

-NH 10.61 br -------- 10.63 br -------- 10.53 br -------- 10.56 br -------

-COO 12.90 br 167.45 -------- 166.00 12.90 br 167.64 -------- 166.22

-CH2- -------- ------- 4.27 q 61.19 -------- -------- 4.30 q 61.80

-CH3 -------- -------- 1.29 t 14.86 -------- -------- 1.30 t 14.50

s: señal simple, d: señal doble, t: señal triple, q: señal cuádruple, m: señal múltiple, br: señal ancha

Una vez sintetizados los dienófilos del sistema se iniciaron los primeros experimentos

de síntesis de los aductos Diels-Alder con isopreno (2). Esta reacción fue llevada a cabo

44

bajo condiciones térmicas a 160 °C en un tubo de presión con tolueno como disolvente.

La reacción se dejó bajo estas condiciones 96 h; después de este tiempo el producto fue

obtenido y analizado espectroscópicamente; dicho análisis mostró que la reacción [4+2]

de cicloadición se había realizado; sin embargo, los aductos obtenidos no fueron los

esperados (Figura 27).

NH

R1

R2





Tolueno,

160 °C, 96 h

5a-d

+

H3C

2

H3C

N R1

R2

O

O

6a-d

OH

O

O NH

OH

O

O

R1

R2

H3C

Tolueno,

160 °C, 96 h

4a-d

Figura 27. Reacción de formación del los aductos Diels-Alder 4a-d.

Al realizar el análisis de RMN de 1H se esperaba la señal del hidrógeno del grupo

amida (-NH) aproximadamente en 10.10 ppm característico de los compuestos 6a-d

comparable con los dienófilos 5a-d; sin embargo, los espectros mostraban la ausencia

de dicha señal, pero con la sorpresa que la cicloadición sí se había efectuado debido a

que las señales que se presenta a campos altos en el espectro, corresponden a los

hidrógenos saturados del anillo de ciclohexeno, resultado de la cicloadición, las cuales

muestran una multiplicidad característica. Otra evidencia de la formación del aducto,

fue una señal ancha obtenida aproximadamente en 5.60 ppm correspondiente al

hidrógeno vinílico de la posición 6 de la molécula (Figura 28). Pensando en la

formación de estos compuestos fueron analizados con más detalle cada uno de los

espectros y aparentemente se estaba frente a compuestos distintos a los esperados (6a-

d). Los espectros sugerían la formación de un nuevo ciclo en la molécula (además del

45

ciclohexeno) correspondiente a un heterociclo de 5 miembros; es decir, la formación de

una imida, puesto que este grupo funcional carece de hidrógeno en el nitrógeno.

H6

H3’

H5’

H2’

H6’

-CH2-

-CH3

-CH3

H7a H3a

H7? H4?

H4? H7?

Figura 28. Espectro de RMN de 1H del compuesto 4b.

La asignación de cada hidrógeno y carbono de la molécula en los espectros de RMN

en 1H y

13C para cada molécula se realizó con ayuda de los espectros bidimensionales

COSY (1H-

1H) y HSQC (

13C-

1H) del compuesto 4b (Figuras 29 y 30).

46


1H COSY del aducto 4b. a = H7, b = H4, c =

H4, d = H7

El espectro de COSY de la Figura 29 muestra los acoplamientos entre hidrógenos más

significativos de la molécula; se muestran dos señales dobles (H3’-H5’ y H2’-H6’) que

se encuentran a campos bajos correspondientes a los acoplamientos entre los hidrógenos

aromáticos con sustitución para. Un acoplamiento importante corresponde al hidrógeno

vinílico (H6) que se encuentra a 5.61 ppm con los hidrógenos H7, H7 y los

hidrógenos del metilo (-CH3) del ciclohexeno que son hidrógenos que se encuentran a 3,

3 y 4 enlaces respectivamente. Cabe mencionar que los hidrógenos H3a y H7a

correlacionan con los protones de las posiciones 4 y 7 respectivamente. El espectro de la

Figura 28 muestra los acoplamientos asociados a estas correlaciones.

47


13C a tres enlaces HSQC para 4b.

Una vez asignados los protones, fueron asignados inequívocamente los carbonos del

sistema con ayuda del espectro HSQC de correlación 1H-

13C en donde se observan las

correlaciones existentes entre los protones y el carbono que los sustenta (Figura 28). A

campos bajos se puede observar que H5 (vinílico) correlaciona con la señal en 129.29

ppm que corresponde al carbono C5; de la misma manera los protones H3a y H7a

correlacionan con 2 señales que se encuentran alrededor de 39.00 ppm. Las señales

correspondientes a los hidrógenos de las posiciones 4 y 7 del ciclohexeno, se observa

para cada hidrógeno de cada posición 2 contornos que correlacionan con un solo

carbono; así pues, los hidrógenos H4 y H4 correlacionan con un mismo carbono (C4)

a campo más alto que el carbono (C3) que sustenta a los hidrógenos H7 y H7.

En la siguiente Tabla 7 se encuentra la asignación para 1H y

13C de cada unos de los

aductos obtenidos (4a-d).

El análisis conformacional de estos aductos inició con la determinación de las

constantes de acoplamiento de cada aducto, la porción molecular de interés fue

evidentemente los dos anillos fusionados producto de la cicloadición y los hidrógenos

que los conforman.

48


13C (125 MHz) en CDCl3 de los aductos

Diels-Alder 4a-d derivados de isopreno.

1

2

3

4

1'

2' 3'

4'

5'6'

N

H3C

O

O

OH

O

5

6

7

7a

3a

4a

1

23

4

1'

2' 3'

4'

5'6'

N

H3C

O

O

O

O

5

6

7

7a

CH3

3a

4b

1

2

3

4

1'

2' 3'

4'

5'6'

N

H3C

O

O

5

6

7

7a

OH

O

3a

4c

12

3

4

1'

2' 3'

4'

5'6'

N

H3C

O

O

5

6

7

7a

O

O

CH3

3a

4d

Posición 1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1 -------- 179.25 -------- 179.97 -------- 179.49 -------- 179.34

2 -------- -------- -------- -------- -------- -------- -------- --------

3 -------- 179.04 -------- 178.18 -------- 179.26 -------- 179.16

3a 3.25 ddd

(9.51, 7.50,

2.50)

39.58

3.21 ddd

(9.38, 7.25,

2.50)

39.54

3.26 ddd

(8.20, 7.94,

2.75)

39.58

3.12 ddd

(9.38, 7.13,

2.50)

39.47

4 2.33 m

29.10

2.35 m

29.08

2.34 dd

(15.38, 7.94)

29.08

2.20 dd

(15.50, 7.13)

28.97

4 2.60 dd

(15.50, 2.50)

2.58 dd

(15.50, 2.50)

2.61 dd

(15.38, 2.75)

2.48 dd

(15.50, 2.50)

5 -------- 129.29 -------- 130.50 -------- 130.76 -------- 131.76

6 5.63 br 120.39 5.61br 120.38 5.65 br 120.42 5.54 br 120.36

7 2.28 m

24.75

2.28 m

24.71

2.30 m

24.73

2.16 m

24.61 7 2.66 ddd

(15.50, 6.68,

2.50)

2.64 ddd

(15.50, 6.62,

2.50)

2.67 ddd

(15.50, 7.25,

2.62)

2.54 ddd

(15.62, 6.80,

2.50)

7a 3.30 ddd

(9.51, 6.68,

2.50)

40.03

3.28 ddd

(9.38, 6.62,

2.50)

39.98

3.32 ddd

(8.20, 7.25,

2.62)

40.03

3.18 ddd

(9.38, 6.80,

2.50)

39.91

-CH3 1.78 s 23.71 1.77 s 23.69 1.80 s 23.74 1.69 s 23.65

1’ -------- 136.85 -------- 136.21 -------- 136.85 -------- 136.70

2’ 7.42 d (8.50) 126.47 7.36 d (8.75) 126.31 8.01 s 128.45 7.86 s 127.76

3’ 8.20 d (8.50) 131.24 8.12 d (8.75) 130.54 -------- 132.71 -------- 132.62

4’ -------- 137.04 -------- 136.80 8.13 d (7.50) 130.40 7.98 d (9.15) 129.63

5’ 8.20 d (8.50) 131.24 8.12 d (8.75) 130.54 7.58 t 131.90 7.45 t 131.01

6’ 7.42 d (8.50) 126.47 7.36 d (8.75) 126.31 7.51 d (8.55) 129.58 7.36 d (9.15) 129.31

-COO 12.00 – 13.00

br

171.23 -------- 165.94 12.00 – 13.00

br

170.98 -------- 163.67

-CH2- -------- -------- 4.38 q 61.43 -------- -------- 4.29 q 61.47

-CH3 -------- -------- 1.39 t 14.52 -------- -------- 1.30 t 14.47

s: señal simple, d: señal doble, t: señal triple, q: señal cuádruple, m: señal múltiple, br: señal ancha

49

La determinación de las constantes de acoplamiento se inició a partir de las señales

que se encuentran en el intervalo comprendido entre 3.20 y 3.40 ppm correspondientes a

los hidrógenos H3a y H7a que se encuentran más desprotegidos debido a que se

encuentran más cerca de los carbonilos de la imida. Estas señales muestran una

multiplicidad coherente con sus hidrógenos vecinos (H4H4 y

H7H7respectivamente); es decir, cada hidrógeno se acopla con dos hidrógenos

vecinos generando dos señales traslapadas correspondientes dos señales doble de doble

de dobles (ddd). Realizando las relaciones y operaciones pertinentes fue posible

determinar las constantes de acoplamiento a tres enlaces, obteniendo las siguientes: para

H3a se obtuvieron 9.38 Hz para el acoplamiento H3a-H7a, 7.25 Hz para el

acoplamiento H3a-H4 y 2.50 para H3a-H4; de la misma manera se establecieron las

constantes para el hidrógeno H7a, el primero fue de 9.38 Hz para el acoplamiento H7a-

H3a, 6.62 Hz para H7a-H7 y 2.50 para H7a-H7.

Posteriormente fueron analizadas las señales comprendidas en el intervalo de 2.50 a

2.65 ppm correspondientes a los hidrógenos H7 y H4El hidrógeno H7muestra un

patrón de acoplamiento coherente, ya que describe una señal doble de doble de dobles

bien definida con baja intensidad; es decir, este hidrógeno se acopla con otros tres

hidrógenos vecinos. Fueron obtenidas las constantes de acoplamiento de la siguiente

manera: 15.50 Hz para el acoplamiento gem de los hidrógenos H7 H7, 6.62 Hz

para el acoplamiento H7-H6 y 2.50 Hz para H7-H7a. Asimismo, el análisis del

hidrógenoH4generó una señal doble de dobles, es decir, solo se acopla con 2

hidrógenos, debido a que en la posición 5 se encuentra el grupo –CH3. Las constantes de

acoplamiento de este sistema se asignaron de la siguiente manera: 15.50 Hz

correspondiente al acoplamiento gem entre H4 H4 y 2.50 Hz para H4H3a.

En relación a las señales que se encuentran en el intervalo 2.20-2.30 ppm que

corresponden a los hidrógenos H4yH7 el análisis de las constantes de acoplamiento

no se pudo realizar debido a la imprecisión existente en la determinación, debido a que

las señales estaban traslapadas y además ancha por el acoplamiento de H7 con H6

(vinílico). El conjunto de estas señales integran para dos hidrógenos.

A propósito del párrafo anterior, cabe mencionar que para los compuestos 4c y 4d fue

posible discernir las constantes de acoplamiento solo para el hidrógeno H4 que no se

acopla con H6. En ambos casos se observa una señal doble de dobles (acoplamiento con

dos hidrógenos). En el caso de 4c las constantes fueron: 15.50 Hz para el acoplamiento

50

gem entre H4 H4, y 7.13 Hz para H4H3a. En el caso de 4d sucedió algo similar

(Tabla 7).

El estudio de análisis conformacional a través de cálculos teóricos para el compuesto

4b fue realizado por medio de un análisis conformacional inicial para obtener los

confórmeros más estables, de ellos, fueron escogidos los cuatro de menor energía que

fueron tomados como punto de partida para realizar una optimización al nivel de cálculo

ab initio HF-STO/3G. Las estructuras fueron reoptimizadas siguiendo una secuencia de

optimizaciones sucesivas hasta llegar al nivel más alto (HF/3-21G, HF/6-31+G(d,p) y

B3LYP/6-31+G(d,p)). Sobre las geometrías más estables se llevó a cabo el análisis

vibracional para corrección de las energías electrónicas con los valores calculados de

energía libre. Estas estructuras fueron ocupadas también para obtener de ellas los

ángulos diedros entre los átomos involucrados en las constantes de acoplamiento

vecinales.

De esta manera fueron obtenidos cuatro confórmeros más estables correspondientes a

dos botes (b-syn y b-anti) y dos medias sillas (hc-1 y hc-2) (Figura 31).

Figura 31. Geometrías optimizadas al nivel B3LYP/6-31+G(d,p). Se muestran las energías relativas

calculadas (G a 25°C, kcal/mol) y las proporciones de cada confórmero asumiendo una distribución de

Boltzmann para los botes y las sillas del aducto 4b.

51

En la Figura 31 se pueden apreciar las energías relativas calculadas a 25 °C en orden

creciente, donde se puede observar que las conformaciones de bote son las más estables

que las conformaciones de media silla. De las dos geometrías más estables, el

confórmero b-syn es el de menor energía y es la estructura que posee mayor estabilidad

debido a que los carbonos carbonilos tienen una geometría axial que se puede explicar

en términos de una menor tensión torsional de la interacción de estos carbonos con los

carbonos C4 y C7 con respecto al confórmero b-anti. En el mismo sentido, las

proporciones de abundancia de estos confórmeros correlaciona con las energías

relativas; es decir, a medida que la energía relativa aumenta (disminuye estabilidad) la

proporción disminuye.

Por otro lado, cabe mencionar que en el análisis no fueron exploradas las

conformaciones del fenilo ni del grupo carboetoxi, ya que la geometría de los anillos

fusionados es independiente de ellos, además esta misma porción molecular es la de

interés y es donde precisamente fueron determinadas las constantes de acoplamiento de

en RMN de 1H.

Como se mencionó anteriormente, de las geometrías más estables fueron

determinados los ángulos diedros con el propósito de estimar las constantes de

acoplamiento vecinales utilizando la ecuación de Haasnot-de Leeuw-Altona28

implementado en el programa ALTONA.29

(Tabla 8). Además, se estimaron las

constantes de acoplamiento promedio asumiendo una distribución de Boltzmann de los

confórmeros, de acuerdo a sus energías relativas66

.

Tabla 8. Ángulos diedros (, °) y constantes de acoplamiento calculadas (3J, Hz) derivadas de la

optimización de los confórmeros de bote (b) y media-silla (hc) del aducto 4b al nivel B3LYP/6-

31+G(d,p). Se muestran los valores experimentales de 3J (exp), así como los valores estimados de la

distribución de Boltzmann (avg).

Confórmeros

H3a-

H7a

3J

H3a-

H7a

H3a-

H4

3J

H3a-

H4

H3a-

H4

3J

H3a-

H4

H7a-

H7

3J

H7a-

H7

H7a-

H7

3J

H7a-

H7

b-syn 2.0 11.14 -45.9 5.20 69.7 1.80 42.4 5.90 -72.9 1.50

b-anti 0.4 11.20 43.0 6.00 158.6 11.05 -42.5 6.10 -158.1 10.90

Hc-1 35.6 7.27 -16.3 9.56 97.8 1.36 -37.1 6.95 -151.8 10.07

Hc-2 -35.3 7.46 38.1 6.78 152.7 10.22 15.6 9.56 -98.6 1.44

exp 9.40 7.25 2.50 6.60 2.50

avg 10.70 5.69 3.65 6.20 3.46

52

Se pueden observar que las constantes de acoplamiento experimentales son muy

similares a las estimadas para el confórmero b-syn; sin embargo, fue más preciso

considerar el promedio de las 3J estimadas y la similitud es aun mayor, pudiendo

concluir en este aspecto que la conformación de bote syn (b-syn) es la más estable tanto

en fase gas como en disolución.

Los resultados obtenidos hasta el momento habían sido muy interesantes puesto que

normalmente las N-arilimidas son sintetizadas normalmente a partir de los ácidos N-

arilmaleámicos utilizando ciertos catalizadores

y temperatura,

30,31 otras metodologías

incluyen el uso de sustratos diferentes a los ácidos N-arilmaleámicos con o sin

catalizadores.32,33

En relación a las reacciones de cicloadición de Diels-Alder entre

maleimidas N-sustituidas utilizadas como dienófilos se han llevado a cabo con distintos

dienos y bajo diferentes metodologías;25

algunos han reportado su síntesis utilizando

catalizadores quirales,34,35

no quirales,36,37

ácidos de Lewis,38

así como otras reacciones

realizadas bajo condiciones térmicas38

o no térmicas39,40

. En el mismo sentido se han

utilizado técnicas que incluyen la cicloadición utilizando disoluciones buffer acuosas41

y

otras con aceleradores físicos como son el uso de microondas42

con buenos resultados

en cuanto al tiempo de reacción se refieren.

Basado en los antecedentes y resultados obtenidos, se propuso sintetizar las mismas

moléculas pero bajo una reacción de multicomponentes (MCR); es decir, formar los

aductos Diels-Alder 4a-d en un sistema de 3 componentes (anhídrido maleico (1),

isopreno (2) y las anilinas 3a-d). La reacción se llevó a cabo bajo condiciones térmicas

a 160 °C en un tubo de presión por 96 h (Figura 32). Después del tiempo de reacción y

purificados los compuestos se caracterizaron espectroscópicamente; el análisis de las

constantes físicas (puntos de fusión y Rf) fueron iguales que los anteriores; de igual

manera que las señales de RMN de 1H y

13C, IR y UV también fueron las mismas.

NH2

R1

R2





O

O

O

+

Tolueno,

160 °C, 96h

1 3a-d

+

H3C

2

H3C

N R1

R2

O

O

4a-d

Figura 32. Síntesis general de los aductos Diels-Alder 4a-d a través de una MCR

53

Al comparar los rendimientos de las reacciones llevadas a cabo en dos pasos y por

MCR se observa que para los compuestos 4a y 4d existe una diferencia aproximada del

15 % a favor de la MCR al comparar el rendimiento global en dos pasos con la MCR

(Tabla 9). De manera general ambos métodos no se diferencian en cuanto al

rendimiento se refiere.

Tabla 9. Rendimientos obtenidos de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d y para los aductos 4a-d

obtenidos en dos pasos sintéticos y bajo una MCR.

Productos Rendimiento (%)

Rendimiento

global (%) Rendimiento (%)

Obtenidos en dos pasos

5a 90.3 — —

5b 89.0 — —

5c 95.8 — —

5d 77.7 — —

4a 76.8 69.4 90.7

4b 82.7 73.6 71.9

4c 90.2 86.4 76.9

4d 64.2 49.9 96.2

Los siguientes experimentos relacionados con estas reacciones fue la investigación de

la secuencia de pasos por la cual los aductos 4a-d se formaban a partir del sistema de

tres componentes; para ello se tomó como prototipo al compuesto 5a y se hizo

reaccionar con 2 con el propósito de obtener un intermediario anterior al aducto de N-

carboxifenilmaleimida (Figura 33).

54

NHO

AcOEt,

60 °C, 120 h

+

2

H3C

5a

NH

OH

O

O

O

OH

OHO

NH

OH

O

O

H3C

H3C

OH

OH

O

O

+

6a

7a

20 %

H3C

N

O

O4a

+

O

OH

Figura 33. Síntesis de la mezcla de regioisómeros 6a y 7a a partir de 5a y 2.

La reacción se llevó a cabo en un matraz bola con acetato de etilo (AcOEt) como

disolvente ya que el dienófilo no es soluble en otros disolventes como CH2Cl2, hexano,

tolueno, etc. La reacción se realizó bajo diferentes condiciones, como se muestra en la

Tabla 10.

Tabla 10. Condiciones de reacción en la investigación de la secuencia de pasos por la que se lleva a

cabo la reacción MCR. La reacción se llevó a cabo con AcOEt como disolvente.

Temperatura (°C) Tiempo (h) Reacción

Ambiente (~25 °C) 48 No reaccionó

40 48 No reaccionó

60 48 No reaccionó

60

120

Se obtuvieron 4a y la

mezcla de regioisómeros

6a y 7a

55

Como se puede apreciar en la tabla, la materia prima no reaccionó a las temperaturas

ambiente, 40 °C y 60 °C por 48 h. Únicamente se observó reacción cuando se dejó por

72 h más a 60 °C, sumando un tiempo total de 120 h. La c.c.f. reveló que se había

formado el aducto 4a y otro producto más polar que éste. El nuevo producto fue

purificado por diferencia de polaridad utilizando CH2Cl2 (el aducto 4a es soluble) y

hexano frío. Una vez separado el compuesto fue caracterizado por RMN de 1H (Figura

32) y 13

C y sorprendentemente mostró que se trataba de la mezcla de regioisómeros

correspondiente a los aductos Diels-Alder entre el isopreno y el ácido N-arilmaleámico

en una proporción aproximada de 45:55. (Figura 34). Es importante señalar que la

reacción dio un rendimiento muy bajo, que fue del 20 %.

NH

OH

O

O

OH

O

1

23

3a4

5

67a

1'2'

3'

4'

5'

6'

7

NH

OH

O

O

OH

O

1

23

3a4

5

6 7a

1'2'

3'

4'

5'

6'

7

H3C

H3C

H2

H6

H2

H5

H3’

H5’

H2’

H6’

-CH3

H7a

H3a

H4

H7

Figura 34. Mezcla de regioisómeros 6a y 7a obtenidos a 60 °C por 120 h a agitación constante con

AcOEt como disolvente.

Con este resultado se pudo plantear la propuesta de la secuencia de pasos por la que

se lleva a cabo la reacción multicomponente; el primer paso consiste en la formación del

ácido N-carboxifenilmaleámico (5a) que reacciona con el isopreno (2) para formar la

mezcla de regioisómeros (6a 7a) que eventualmente reacciona intramolecularmente

56

para formar el anillo de 5 miembros (N-arilimida 4a) por pérdida de una molécula de

agua (Figura 35).

NH2

O

O

O

+

NH

OH

O

OTHF, ta

1 3a-d

5a

OHO

NH

OH

O

O

NH

OH

O

O

H3C

H3C

OH

OH

O

O

+

7a

6a

H3C

2

H3C

N

O

O

4a

O

OH-H2O

OHO

Figura 35. Secuencia de eventos que ocurren durante la reacción multicomponente para el aducto 4a.

Se analizaron de manera general los espectros de RMN de 1H y

13C para realizar la

asignación de las señales para la mezcla de regioisómeros de los productos (6a 7a)

(Tabla 11). En el espectro de 1H se pueden apreciar que las señales correspondientes al

hidrógeno sobre el nitrógeno de la amida está doble, al igual que los hidrógenos

aromáticos correspondientes al sistema de acoplamiento AA’-BB’, para los que fue

posible determinar las constantes de acoplamiento orto que fueron de 8.5 y 9.0 Hz. En

el mismo sentido también es posible observar las señales alrededor de 5.30 ppm que son

dos señales anchas que corresponden a los hidrógenos de las posiciones 5 ó 6

(hidrógenos vinílicos). Las señales que se encuentran a campos más altos corresponden

a los hidrógenos del anillo de ciclohexeno, las cuales aparecen como multipletes; las

señales que se encuentran entre 2.8 y 3.0 ppm corresponden a los hidrógenos 3a y 7a

que están adyacentes a los carbonilos del ácido o amida. Las señales que se encuentran

57

en el intervalo entre 2.1 y 2.5 corresponden a los hidrógenos de las posiciones 4 y 7. Por

último, cabe señalar que la señal ancha que se encuentra aproximadamente a 1.6 ppm

corresponde a los grupos metilo ya sea de la posición 5 o 6.


13C (125 MHz) en DMSO-d6 de la mezcla de

regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6a y 7a derivados.

H3C

NH

OH

O

O

OH

O

1

23

3a4

5

67a

1'2'

3'

4'

5'

6'

7

4a

Posición

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13

C (ppm)

1 12.00 – 13.00 (br) 173.38, 173.31

2 10.03 (1H, s); 10.02 (1H, s) --------

3 -------- 167.66

3a 2.87 (2H, m) Traslapado

4 y 7 2.13-2.51 (8H, m) 31.63, 31.13, 27.51, 26.73

5 ó 6 5.32 (1H, br); 5.30 (1H, br) 133.07, 131.69, 120.23

7a 3.03 (2H, m) 41.65

-CH3 1.61 (6H, br) 26.01, 23.92

1’ -------- 146.37

2’ 7.67 (2H, d, 9.00); 7.66

(2H, d, 8.50) 119.05, 118.99

3’ 7.85 (2H, d, 9.00); 7.84

(2H, d, 8.50) 130.94

4’ -------- 125.40, 125.37

5’ 7.85 (2H, d, 9.00); 7.84

(2H, d, 8.50) 130.94

6’ 7.67 (2H, d, 9.00); 7.66

(2H, d, 8.50) 119.05, 118.99

-COO 12.00 – 13.00 (br) 175.46, 175.41 s: señal simple, d: señal doble, m: señal múltiple, br: señal ancha

Hasta este momento se habían obtenidos aductos de la N-arilmaleimida 4a-d,

mientras que los aductos de la serie 6a-d o 7a-d sólo fueron preparados como mezcla de

regioisómeros ya que la reacción bajo las condiciones experimentales no es

regioselectiva; además la reacción de síntesis requirió mucho tiempo y sobre todo el

rendimiento fue demasiado bajo (20.0 %). Por la razones anteriores se propuso una

nueva estrategia para preparar los aductos derivados de isopreno, así como también los

derivados de ciclopentadieno y furano; la cual consistió en preparar los aductos Diels-

58

Alder entre el anhídrido maleico (1) como dienófilo y su correspondiente dieno:

isopreno (2), ciclopentadieno (9) y furano (12) (Figura 36).

O

O

O

H3C

O

O

O

O

O

O

O

8

10a

13

+

+

+

THF, 16h, t.a.

THF, 16h, t.a.

THF, 16h, t.a.

NH

OH

O

O

R1

R2

O

NH

OH

O

O

R1

R2

NH

OH

O

O

R1

R2

H3C

Mezcla 6a-d y 7a-d

11a-d

14a-d

R1

R2

NH2

3a-d

R1

R2

NH2

3a-d

R1

R2

NH2

3a-d





Figura 36. Reacciones generales de síntesis de los aductos Diels-Alder 6a-d, 7a-d, 11a-d y 14a-d a partir

de los aductos 8, 10a y 13.

Los aductos derivados de isopreno (8), ciclopentadieno (10a) y furano (13) fueron

preparados en condiciones de reacción similares36, 39

. Este tipo de reacciones son

relativamente sencillas y no requieren mucho tiempo para su preparación; sin embargo,

los rendimientos fueron moderados. Los puntos de fusión no son muy altos y en

relación a sus Rf el único que se pudo obtener fue el aducto 13, ya que el resto no

observa en la placa cromatográfica cuando se ilumina con luz UV a 254 nm (Tabla 12).

59

Tabla 12. Características físicas de los aductos Diels-Alder 8, 10a, 10b y 13.

O

O

O

H3C

1

23

3a4

5

6

7

7a

8

O

O

O

Ha Hb

12

33a

4

5

6

7

8

7a

10a

O

O

O

12

3

4

5

6

Ha Hb

77a

3a

8

10b

O O

O

O

1

23

3a

4

5

6

7

7a

13

Rendimiento

(%)

66.0 59.0 Comparativo* 51.4

Punto de fusión

(°C)

58-60 155-157 140-142 110-114

Rf

(AcOEt/MeOH

1:1)

No absorbe

No absorbe

No absorbe

0.80

*Producto 10b se utilizó con fines comparativos para 10a.

Estos compuestos fueron identificados por IR y RMN de 1H y

13C. En relación a la

identificación por IR, la banda característica de 8 es la banda en 840 cm-1

que

corresponde al sistema monoprótico vinílico; en cuanto a las bandas características de

los compuestos 10a y 10b corresponden a las bandas de 1430 y 1480 cm-1

del

norborneno respectivamente, y por último, la banda característica de 13 es la de 1220

cm-1

, 1210 cm-1

de la vibración de estiramiento del enlace C-O del biciclo (Tabla 13).

Las demás bandas son atribuidas a metilos, metilenos, dobles enlaces y el grupo

anhídrido.

Del mismo modo, los espectros de RMN muestran la presencia de cada uno de los

aductos preparados.

En relación al aducto 8 es importante señalar que el espectro de 1H muestra las

señales relacionadas con los hidrógenos del anillo de ciclohexeno formado durante la

reacción de Diels-Alder (Tabla 14). Los hidrógenos 3a y 7a muestran un acoplamiento

dobles de dobles de dobles, al igual que los hidrógenos de las posiciones 4 y 7 que

también muestran el mismo tipo de acoplamiento. Los hidrógenos 4 y 7 están

traslapados y muestran señales múltiples. Las constantes de acoplamiento son similares

a las analizadas para los aductos 4a-d en la Tabla 7. Por lo anterior, aparentemente se

tiene la conformación b-syn que es la geometría que muestra menos interacciones y

tensión.

60

Tabla 13. Caracterización de los aductos Diels-Alder 8, 10a y 13 por espectrofotometría IR

obtenidas en pastilla de KBr.

O

O

O

H3C

1

23

3a4

5

6

7

7a

8

O

O

O

Ha Hb

12

33a

4

5

6

7

8

7a

10a

O

O

O

12

3

4

5

6

Ha Hb

77a

3a

8

10b

O O

O

O

1

23

3a

4

5

6

7

7a

13

-CH2=CH2- 3050 3020 3010 3030

-CH3 y -CH2- 2940 2970 2970 2970

O

O

O

1860, 1710 1855, 1690 1865, 1770 1860, 1790

-------- 1430 1480 --------

C-O -------- -------- -------- 1220, 1210

H

840 -------- -------- --------

Se sintetizó el aducto 10a que, bajo las condiciones utilizadas para prepararlo, genera la

estereoquímica endo24

. El espectro de 1H muestra a 6.32 ppm una señal triple

correspondiente a los hidrógenos 5 y 6 vinílicos, seguida de la señal a 3.59 ppm con

multiplicidad doble de dobles correspondientes a los hidrógenos 3a y 7a; muy cerca

(3.51 ppm) se observa una señal doble de doble de dobles que corresponden a los

hidrógenos de las posiciones 4 y 7. Las señales de los hidrógenos de la posición 8

muestran dos señales dobles-múltiples debido a que esos hidrógenos son

diastereotópicos.

61


13C (75 MHz) en CDCl3 de los aductos

Diels-Alder 8, 10a, 10b y 13 derivados del anhídrido maleico.

O

O

O

H3C

1

23

3a4

5

6

7

7a

8

O

O

O

Ha Hb

12

33a

4

5

6

7

8

7a

10a

O

O

O

12

3

4

5

6

Ha Hb

77a

3a

8

10b

O O

O

O

1

23

3a

4

5

6

7

7a

13

Posición 1

H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1 -------- 172.18 -------- 171.52 -------- 171.82 -------- 167.63

2 -------- -------- -------- -------- -------- -------- -------- --------

3 -------- 172.02 -------- 171.52 -------- 171.82 -------- 167.63

3a

3.33 ddd

(9.86, 7.27,

2.66)

37.12 3.59 dd

(3.15, 1.65) 52.98

3.01 d

(1.50) 49.00 3.19 s 46.37

4 -------- --------

3.51 ddd

(6.75, 3.30,

1.65)

47.30 3.46 qu

(3.52, 1.72) 47.10

5.57 d

(0.90) 79.88

4 2.28 m

21.19

-------- -------- -------- -------- -------- --------

4

2.50 dd

(15.60,

2.66)

-------- -------- -------- -------- -------- --------

5 -------- 134.31 6.32 t

(1.95) 135.77

6.34 t

(3.60, 1.80)

(1.95)

138.19 6.59 d

(0.90) 134.66

6 5.63 m 117.84 6.32 t

(1.95) 135.77

6.34 t

(1.95) 138.19

6.59 d

(0.90) 134.66

7 -------- --------

3.51 ddd

(6.75, 3.30,

1.65)

47.30 3.46 qu

(3.52, 1.72) 47.10

5.57 d

(0.90) 79.88

7 2.23 m

21.76

-------- -------- -------- -------- -------- --------

7

2.58 ddd

(16.12,

6.82, 2.94)

-------- -------- -------- -------- -------- --------

7a

3.40 ddd

(9.86, 7.05,

2.94)

37.75 3.59 dd

(3.15, 1.65) 52.98

3.01 d

(1.50) 49.00 3.19 s 46.37

8a -------- -------- 1.79 dt

(8.70, 1.65)

46.35

1.68 dqu

(10.35,

3.60, 1.65) 44.35

-------- --------

8b -------- -------- 1.58 dm

(9.00)

1.45 dsep

(10.35,

3.60, 1.95)

-------- --------

-CH3 1.76 s 26.08 -------- -------- -------- -------- -------- -------

s: señal simple, d: señal doble, dd: señal doble de dobles, dt: doble de triples, ddd: señal doble de doble de dobles, dqu: doble

de quíntuples, dsep: doble de séptuples, t: señal triple, qu: señal quíntuple, m: señal múltiple.

62

Con fines comparativos, se adquirió el aducto exo de 10a (10b), y es posible observar

algunas diferencias en el espectro de 1H, sobre todo en las posiciones 3a y 7a donde las

multiplicidades y los desplazamientos químicos cambian: doble de dobles en 3.01 ppm,

y quíntuple 3.46 ppm, respectivamente. Los hidrógenos diasterotópicos también difieren

un poco en desplazamiento químico y en multiplicidad (Tabla 14).

Por último, el aducto derivado de furano (13) muestra 3 señales relacionadas con los

hidrógenos del sistema; sólo es posible apreciar la multiplicidad en la señal de los

hidrógenos vinílicos (5 y 6) correspondientes a un doble de dobles con acoplamiento

con los hidrógenos de las posiciones 4 y 7 con una constante de acoplamiento de 0.90

Hz.

Es importante señalar que el aducto 13 corresponde a una estereoquímica exo según

las condiciones utilizadas y las evidencias reportadas con anterioridad.43

Una vez sintetizados los aductos 8, 10a y 13 fueron sintetizados a partir de ellos los

aductos 6a-d, 7a-d, 11a-d y 14a-d, respectivamente (Figura 37).

O

O

O

H3C

O

O

O

O

O

O

O

8

10a

13

+

+

+

THF, 16h, t.a.

THF, 16h, t.a.

THF, 16h, t.a.

NH

OH

O

O

R1

R2

O

NH

OH

O

O

R1

R2

NH

OH

O

O

R1

R2

H3C

Mezcla 6a-d y 7a-d

11a-d

14a-d

R1

R2

NH2

3a-d

R1

R2

NH2

3a-d

R1

R2

NH2

3a-d





Figura 37. Reacciones generales de síntesis de los aductos Diels-Alder 6a-d, 7a-d, 11a-d y 14a-d a partir

de los aductos 8, 10a y 13.

63

Las reacciones efectuadas con el aducto 8 y sus correspondientes anilinas (3a-d)

generaron la mezcla de regioisómeros en una proporción 55:45; es decir, que la reacción

volvió a ser no regioselectiva bajo este procedimiento (Figura 38); sin embargo, los

rendimientos fueron más altos que los obtenidos con la mezcla de regioisómeros 6a y

7a ya que están por encima del 40 % (Tabla 15).

NH

OH

O

O

O

O

1

23

3a4

5

67a

1'2'

3'

4'

5'

6'

7

NH

OH

O

O

O

O

1

23

3a4

5

6 7a

1'2'

3'

4'

5'

6'

7

H3C

H3C

6b

7b

CH3

CH3

H2

H6

H2

H5

H3’

H5’H2’

H6’

-CH3

H7a

H3a

H4

H7

-CH3

-CH2-

Figura 38. Mezcla de regioisómeros 6b y 7b obtenidos a partir del aducto 8.

64

Tabla 15. Características físicas de la mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6a-d y 7a-

d derivados de isopreno.

H3C

NH

OH

O

O

OH

O

1

23

3a4

5

67a

1'2'

3'

4'

5'

6'

6a y 7a

H3C

NH

OH

O

O

O

O

1

23

3a4

5

6

77a

1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

6b y 7b

H3C

NH

OH

O

O

OH

O1

23

3a4

6

5

77a

1'2'

3'

4'

5'

6'

6c y 7c

H3C

NH

OH

O

O

O

O1

23

3a4

6

5

77a

1'2'

3'

4'

5'

6'

CH3

6d y 7d

Rendimiento

(%)

81.6 42.5 99.4 89.6

Punto de

fusión (°C)

182-184 110-112 144-146 Líquido

Rf

(AcOEt/Me

OH 1:1)

0.84 0.90 0.49 0.89

En cuanto a la caracterización por IR, es importante destacar que aparece una banda

aproximadamente en 3400-3300 cm-1

que corresponde a las vibraciones de estiramiento

del enlace N-H (Tabla 16), mismas que carecen los aductos 4a-d que poseen un grupo

imida.

65

Tabla 16. Caracterización de la mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6a-d y 7a-d

derivados de isopreno por espectrofotometría IR obtenidas en pastilla de KBr.

H3C

NH

OH

O

O

OH

O

1

23

3a4

5

67a

1'2'

3'

4'

5'

6'

6a y 7a

H3C

NH

OH

O

O

O

O

1

23

3a4

5

6

77a

1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

6b y 7b

H3C

NH

OH

O

O

OH

O1

23

3a4

6

5

77a

1'2'

3'

4'

5'

6'

6c y 7c

H3C

NH

OH

O

O

O

O1

23

3a4

6

5

77a

1'2'

3'

4'

5'

6'

CH3

6d y 7c

-NH 3420, 1170 3415, 1170 3400, 1180 3461

-OH 3200 3360 3295 3285

-CH2=CH2- No se observa No se observa No se observa 3102

-CH3 y -

CH2-

2990 2910 2970 2974

-COOH 1690 1690 1710 1692

OO

-------- 1710 -------- 1653

OHO

1595 -------- 1590 --------

HN-C=O 1530 1600 1550 1549

-CO-O -------- 1280 -------- No se observa

O-C-C -------- 1240 -------- 1243

o-di

850, 780 870, 780 -------- --------

m-di

-------- -------- 820, 800, 775,

695

762, 753, 705

Básicamente el espectro es muy similar a aquel obtenido de la reacción realizada en

la investigación de la secuencia de pasos que ocurren en la reacción MCR llevada a

cabo en AcOEt (Figura 34). Es posible apreciar en el espectro de RMN de 1H las dos

señales a campo bajo correspondientes a las hidrógenos de cada grupo amida del

regioisómero correspondiente en aproximadamente 10.10 ppm. Se pueden apreciar dos

66

señales complejas que corresponden al traslape de los dos pares de señales dobles de los

sistemas AA’-BB’ de los hidrógenos aromáticos de cada regioisómero. Las dos señales

anchas de los hidrógenos vinílicos de las posiciones 5 ó 6. Las señales correspondientes

a los hidrógenos 3a y 7a, así como los hidrógenos de las posiciones 4 y 7 en el intervalo

2.18-2.57 ppm como señales múltiples (Tabla 17). Es importante señalar que los

aductos que se obtuvieron son derivados cis, ya que ambos grupos sustituyentes se

encuentran del mismo lado en el anillo de ciclohexeno.

Por otro lado, fueron preparados los aductos 11a-d, para los que es de suponer que los

compuestos obtenidos fueron aquellos con estereoquímica endo, puesto que se partió

del aducto 10a que de inicio tenía dicha estereoquímica. Los rendimientos de la

reacción entre 10a y las anilinas 3a-d van de moderados a muy buenos, tienen puntos de

fusión un poco más altos que el aducto 10a, además de que son compuestos más polares

(Tabla 18).

67

Tabla 17. Caracterización por RMN de 1H (300 y 500 MHz) y

13C (75 y 125 MHz) en DMSO-d6 de la

mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6a-d y 7a-d derivados de isopreno.

H3C

NH

OH

O

O

OH

O

1

23

3a4

5

67a

1'2'

3'

4'

5'

6'

7

6a y 7a

H3C

NH

OH

O

O

O

O

1

23

3a4

5

6

77a

1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

6b y 7b

H3C

NH

OH

O

O

OH

O1

23

3a4

6

5

77a

1'2'

3'

4'

5'

6'

6c y 7c

H3C

NH

OH

O

O

O

O1

23

3a4

6

5

77a

1'2'

3'

4'

5'

6'

CH3

6d y 7d

Posición 1

H (ppm) 3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1 11.50 –

12.50 (br)

175.64,

175.56

11.50 –

12.50 (br)

173.48,

173.40

11.50 –

12.50 (br)

173.13,

173.05

11.50 –

12.50 (br)

175.50,

175.27

2

10.07 (1H, s); 10.09

(1H, s)

-------- 10.12 (1H, s); 10.10

(1H, s)

-------- 9.94 (1H, s); 9.92

(1H, s)

-------- 9.96 (1H, s);

9.97 (1H, s) --------

3 -------- 169.89 -------- 166.08 -------- 167.94 -------- 166.95

3a 2.87 (2H,

m) Traslapada

2.88 (2H, m)

39.36 2.87 (2H,

m) 39.38 2.84 (2H, m) 39.26

4 y 7 2.12-2.57

(8H, m)

33.89,

33.22,

29.67, 28.82

2.18-2.59

(8H, m)

31.62,

31.06,

27.53, 26.70

2.12-2.58

(8H, m)

31.65,

31.13,

27.53, 26.73

2.12-2.51

(8H, m)

31.35, 31.00,

29.11, 26.48,

5 ó 6

5.35 (1H,

br); 5.31

(1H, br)

135.26,

133.85,

122.44

5.36 (1H,

br); 5.31

(1H, br)

133.11,

131.66,

120.30

5.36 (1H,

br); 5.32

(1H, br)

133.07,

131.78,

120.26

5.74 (2H, br) 133.46, 131.32

7a 3.03 (2H,

m) 43.42

3.05 (2H,

m) 41.26

3.01 (2H,

m) 41.17 3.02 (2H, m) 39.90

-CH3 1.62 (6H,

br) 26.14

1.62 (6H,

br) 23.98 1.63 (3H, s) 23.98

1.63 (3H, s);

1.60 (3H, s) 24.50, 23.94

1’ -------- 146.37 -------- 144.54 -------- 140.33 -------- 140.48

2’

7.67 (2H, d, 8.70); 7.66

(2H, d,

9.00)

121.23,

121.16

7.71 (2H, d, 9.00); 7.70

(2H, d,

9.00)

119.10,

119.04

8.24 (2H,

br) 118.99

8.24 (1H, s);

8.25 (1H, s)

119.92,

118.93

3’

7.86 (2H, d,

8.70); 7.85

(2H, d, 8.70)

133.16

7.88 (2H, d,

8.70); 7.87

(2H, d, 9.00)

130.31 -------- 129.53 -------- 129.71,

129.55

4’ -------- 127.53,

127.49 --------

124.44,

124.40

7.27-7.89

(2H, m)

123.94,

123.87 128.00

5’

7.86 (2H, d,

8.70), 7.85 (2H, d,

8.70)

133.16

7.88 (2H, d,

8.70); 7.87 (2H, d,

9.00)

130.31

7.39 (1H, t,

6.90); 7.38 (1H, t,

6.90)

124.37 7.79 (1H, t) 124.14

6’

7.67 (2H, d,

8.70); 7.66

(2H, d,

9.00)

121.23,

121.16

7.67 (2H, d,

8.70); 7.66

(2H, d,

9.00)

119.10,

119.04

7.59 (1H, d,

8.10); 7.58

(1H, d,

8.10)

120.66,

120.57

7.66 (1H, d,

7.80); 7.60 (1H, d, 7.50)

120.71,

120.22

-COO 12.00 – 13.00

177.72, 177.67

-------- 175.51, 175.45

12.00 – 13.00

175.53, 175.48

-------- 179.92, 179.80

-CH2- -------- -------- 4.26 (4H, q,

7.05) 61.10 -------- --------

4.33 (2H, q,

6.90); 4.25

(2H, q, 7.20)

61.05

-CH3 -------- -------- 1.29 (6H, t,

7.20) 14.89 -------- --------

1.31 (3H, t,

7.20); 1.28

(3H, t, 6.90)

14.87

s: señal simple, d: señal doble, dd: señal doble de dobles, ddd: señal doble de doble de dobles, t: señal triple, q: señal

cuádruple, m: señal múltiple, br: señal ancha.

68

Tabla 18. Características físicas de los aductos Diels-Alder 11a-d derivados de ciclopentadieno.

NH

OH

O

O

OH

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

3a

77a

Ha Hb8

NH

OH

O

O

O

O

1

2

3

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

7

3a

7a

Ha Hb8

NH

OH

O

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

OH

O

7

3a

7a

Ha Hb8

NH

OH

O

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

O

O

CH3

77a

3a

Ha Hb8

Rendimiento

(%)

87.2 79.3 91.4 58.9

Punto de

fusión (°C)

175-176 158-160 160-161 132-134

Rf

(AcOEt/MeO

H 1:1)

0.56 0.92 0.41 0.93

Es importante decir que los primeros intentos de formación de estos aductos se

llevaron a cabo de la misma forma que con isopreno (2); es decir, en este caso

particular, se hizo reaccionar el ácido N-fenilmaleámico 5b con 2 para obtener 11b, y en

efecto se consiguió generar dicho compuesto con bajo rendimiento. En la Figura 39 se

muestran las condiciones de reacción por las que se llevaron a cabo las reacciones de

obtención de 11b por ambas rutas sintéticas.

NHOH

O

O

COOEt

O

O

ONH2

COOEt

NH

OH

O

O

COOEt

NH

OH

O

O

COOEt

+Acetona

Tubo cerrado

40°C, 96 h

+THFanh.

t.a., 16 h

5b

9

11b

11b10a 3b

(23.8 %)

(79.3 %)

Figura 39. Diagrama de obtención del aducto 11b por medio de dos rutas sintéticas.

69

La conclusión de esta sección fue la misma que se comentó anteriormente, se decidió

preparar los aductos por la segunda ruta, es decir a partir del aducto 10a por razones de

peso, que consistieron la generación del mismo aducto (Figuras 40 y 41), mejoría

sustancial en el rendimiento y menor tiempo de reacción.

H2

H3’

H4’

H2’

H6’

H4 H5

-CH2-

H8b

-CH3

H7a

H3a

H7

H4

Figura 40. Espectro de RMN de 1H para el aducto 11b obtenido bajo el primer método (a partir de 5b y 2

en acetona, a 40°C por 96h).

70

H2

H3’

H4’

H2’

H6’

H4 H5

-CH2-

H8b

-CH3

H7a

H3a

H7

H4

H8a

Figura 41. Espectro de RMN de 1H para el aducto 11b obtenido bajo el segundo método (a partir de 10a

y 3b en THFanh., a t.a. por 16h).

Como se mencionó anteriormente, ambos espectros muestran el mismo patrón de

señales y desplazamientos químicos (Tabla 19). Los espectros muestran una señal

simple a campo bajo correspondiente al hidrógeno de la amida en aproximadamente

10.20 ppm; seguido del sistema AA´-BB’ de sustitución para de los hidrógenos

aromáticos con una 3Jo = 8.70 Hz; después las señales correspondientes a los

hidrógenos vinílicos que en esta molécula son diferentes y muestran dos señales dobles

de dobles en el intervalo 6.04-6.17 ppm con 3J = 2.70 Hz y

3J = 2.85 Hz con

acoplamiento con los hidrógenos de las posiciones 4 y 7, respectivamente; mientras que

la 3J = 5.40 Hz resulta del acoplamiento entre los hidrógenos vinílicos. Los hidrógenos

de las posiciones 4 y 7 son dos señales anchas que se encuentran en el intervalo 3.00-

3.06 que no muestran constantes de acoplamiento ya que se están acoplando con los

vinílicos.

71


13C (125 MHz) en DMSO-d6 de los aductos

Diels-Alder 11a-d derivados de ciclopentadieno.

NH

OH

O

O

OH

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

3a

77a

Ha Hb8

11a

NH

OH

O

O

O

O

1

2

3

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

7

3a

7a

Ha Hb8

11b

NH

OH

O

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

OH

O

7

3a

7a

Ha Hb8

11c

NH

OH

O

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

O

O

CH3

77a

3a

Ha Hb8

11d

Posición 1

H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1 11.50 - 12.00

br 171.04

11.50 – 12.00

br 171.53

11.50 – 12.00

br 173.34

11.50 –

12.00 br 173.41

2 10.22 s -------- 10.25 s -------- 10.08 s -------- 10.11 s --------

3 -------- 167.35 -------- 166.17 -------- 170.20 -------- 168.64

3a 3.23 dd

(3.30, 10.20) 49.06

3.23 dd

(3.30, 10.35) 49.46

3.22 dd

(3.30, 10.20) 51.58

3.22 dd

(3.30, 10.20) 51.58

4 3.00 br 46.97 3.00 br 47.37 2.99 br 49.56 3.06 br 49.55

5 6.03 dd

(2.85, 5.25) 134.33

6.04 dd

(2.70, 5.40) 134.76

6.03 dd

(2.85, 5.25) 136.90

6.04 dd

(2.70, 5.40) 136.95

6 6.17 dd

(2.85, 5.55) 135.17

6.17 dd

(2.85, 5.40) 135.58

6.17 dd

(2.85, 5.55) 137.73

6.17 dd

(2.85, 5.55) 137.73

7 3.06 br 48.42 3.06 br 48.84 3.05 br 51.03 3.05 br 51.05

7a 3.37 dd

(3.00, 10.20) 49.51

3.37 dd

(3.00, 10.20) 49.93

3.35 dd

(3.15, 10.05) 52.00

3.35 dd

(3.30, 10.20) 52.02

8a 1.25 d (9.75)

45.79

1.34 d (9.00)

46.22

1.33 d (7.80)

48.34

Traslapado

48.37

8b 1.33 d (7.35) Traslapado 1.25 d (8.70) Traslapado

1’ -------- 143.85 -------- 144.55 -------- 142.53 -------- 142.67

2’ 7.60 d (8.85) 118.44 7.63 d (8.70) 118.91 8.21 s 122.61 8.22 s 122.13

3’ 7.83 d (8.85) 130.55 7.85 d (8.70) 130.79 -------- 133.88 -------- 133.05

4’ -------- 124.71 -------- 124.25 7.65 d (8.10) 126.44 7.68 d (8.55) 127.50

5’ 7.83 d (8.85) 130.55 7.85 d (8.70) 130.79 7.36 t (8.10) 131.70 7.39 t (7.95) 131.88

6’ 7.60 d (8.85) 118.44 7.63 d (8.70) 118.91 7.56 d (7.80) 125.95 7.57 d (7.05) 126.21

-COO 11.50 – 12.50 173.73 -------- 174.14 11.50 – 12.50 176.40 -------- 176.39

-CH2- -------- -------- 4.24 q (6.90) 61.16 -------- -------- 4.28 q (6.90) 63.72

-CH3 -------- -------- 1.27 t (6.90) 14.86 -------- -------- 1.28 t (6.90) 17.05



Los hidrógenos de las posiciones 3a y 7a son dos señales con multiplicidad doble de

dobles, ya que se están acoplando entre ellas con 3J = 3.00 Hz, y con los hidrógenos 4 y

7, respectivamente, con 3J = 10.30 Hz aproximadamente. Los hidrógenos del puente

(posición 8) muestran una señal doble de dobles que se traslapa con la señal triple del

grupo- CH3 del éster. Estas señales se pueden apreciar mejor en los espectros de los

aductos 3a y 3c.

72

En relación a los aductos 14a-d el análisis se realizó de la misma manera que los

anteriores, iniciando por los puntos de fusión, Rf y rendimientos, los cuales fueron de

moderados a buenos (Tabla 20).

Tabla 20. Características físicas de los aductos Diels-Alder 14a-d derivados de furano.

O

NH

OH

O

O

OH

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

3a

77a

14a

NH

OH

O

O

O

O

1

2

3

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

O

7

3a

7a

14b

O

NH

OH

O

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

OH

O

7

3a

7a

14c

O

NH

OH

O

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

O

O

CH3

77a

3a

14d

Rendimiento

(%)

57.5 75.5 87.8 ND

Punto de

fusión (°C)

196-198 182-184 192-194 ND

Rf

(AcOEt/MeO

H 1:1)

0.16 0.43 0.16 ND

ND: No determinado por impurezas

Los espectros de IR muestran bandas relevantes para las vibraciones C-O del biciclo

(Tabla 21). El resto de las bandas corresponden a los carbonilos, a los aromáticos,

metilos y metilenos, etc.

73

Tabla 21. Caracterización de los aductos Diels-Alder 14a-d derivados de furano por

espectrofotometría IR obtenidas en pastilla de KBr.

O

NH

OH

O

O

OH

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

3a

77a

14a

NH

OH

O

O

O

O

1

2

3

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

O

7

3a

7a

14b

O

NH

OH

O

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

OH

O

7

3a

7a

14c

O

NH

OH

O

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

O

O

CH3

77a

3a

14d

-NH 3300, 1180 3420, 1180 3325, 1180 ND

-OH No se observa No se observa No se observa ND

-CH2=CH2- No se observa No se observa 3050 ND

-CH3 y -

CH2-

2990 2940 No se observa ND

-COOH 1710 1640 1735 ND

OO

-------- 1710 -------- ND

OHO

1680 -------- 1695 ND

HN-C=O 1595 1610 1595 ND

O

1520, 1315 1520 1540, 1305,

1280

ND

-CO-O -------- 1290 -------- ND

O-C-C -------- 1270 -------- ND

o-di

860, 820, 785 870, 830, 780 -------- ND

m-di

-------- -------- 940, 915, 897 ND

ND: No determinado por impurezas

En cuanto a la caracterización de los espectros de RMN, se tomó como ejemplo de

análisis al aducto 14b (Figura 42).

74

H2

H3’

H4’

H2’

H6’H4 H5

-CH2-

-CH3

H7aH3aH7 H4

Figura 42. Espectro de RMN de 1H para el aducto 14b.

Al igual que los casos anteriores, se observa en el espectro de 1H a campos bajos la

señal del hidrógeno de la amida en 10.20 ppm, el sistema AA’-BB’ de los hidrógenos

aromáticos con una constante de acoplamiento orto de 8.70 Hz. Se puede observar una

señal doble de dobles en 6.48 ppm correspondientes a los hidrógenos vinílicos que se

acoplan entre ellos con una 3J = 1.35 Hz. Las señales correspondientes a los hidrógenos

de las cabezas de puente del biciclo están desplazadas a campos bajos (5.03-5.12 ppm)

debido a la cercanía del átomo de oxígeno; estas señales son anchas debido al

acoplamiento con los hidrógenos vinílicos. Por último se encuentran dos señales dobles

correspondientes a los hidrógenos de las posiciones 3a y 7a con una 3J = 9.30 Hz (Tabla

22).

75


13C (125 MHz) en DMSO-d6 de los aductos

Diels-Alder 14a-d derivados de furano.

O

NH

OH

O

O

OH

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

3a

77a

14a

NH

OH

O

O

O

O

1

2

3

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

O

7

3a

7a

14b

O

NH

OH

O

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

OH

O

7

3a

7a

14c

O

NH

OH

O

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

O

O

CH3

77a

3a

14d

Posición 1

H (ppm) 3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1 11.50 –

12.00 br 170.52

11.50 –

12.00 br 170.58

11.50 –

12.00 br 172.76 ND ND

2 10.15 s -------- 10.09 s -------- 10.01 s -------- ND --------

3 -------- 167.31 -------- 165.73 -------- 170.11 -------- ND

3a 2.70 d (9.60)

47.15 2.70 d (9.30)

47.16 2.69 d (9.00)

49.65 ND ND

4 5.03 br 79.44 5.03 br 79.46 5.04 br 82.00 ND ND

5 6.49 (3.50,

2.50) 136.86

6.48 s

(1.35) 136.85 6.48 s 139.48 ND ND

6 6.47 (3.00,

2.00) 137.72

6.48 s

(1.35) 137.26 6.48 s 139.83 ND ND

7 5.24 br 80.69 5.12 br 80.70 5.12 br 83.27 ND ND

7a 2.82 d

(9.60) 47.76

2.82 d

(9.30) 47.75

2.80 d

(9.00) 50.26 ND ND

1’ -------- 143.50 -------- 143.79 -------- 142.24 -------- ND

2’ 7.63 d

(8.70) 118.66

7.65 d

(8.70) 118.71 8.21 s 122.61 ND ND

3’ 7.86 d (8.70)

130.61 7.88 d (8.70)

130.44 -------- 133.99 -------- ND

4’ -------- 125.09 -------- 124.24 7.70 d

(8.40) 126.76 ND ND

5’ 7.86 d

(8.70) 130.61

7.88 d

(8.70) 130.44

7.41 t

(8.10) 131.79 ND ND

6’ 7.63 d

(8.70) 118.66

7.65 d

(8.70) 118.70

7.60 d

(7.50) 126.14 ND ND

-COO 11.50 – 12.00 br

172.98 -------- 172.97 11.50 – 12.00 br

175.61 ND ND

-CH2- -------- -------- 4.27 q

(7.35) 60.78 -------- -------- ND ND

-CH3 -------- -------- 1.28 t

(7.35) 14.44 -------- -------- ND ND


cuádruple, m: señal múltiple, br: señal ancha. ND: No determinado por impurezas.

Con esta parte se concluye la síntesis de los aducto derivados del ácido maleico; por

tanto, la siguiente sección corresponde al análisis de los derivados del ácido fumárico.

La primera etapa de síntesis fue la síntesis de los dienófilos; es decir, los ácidos N-

fenilfumarámicos 16a-d a partir de las anilinas monosustituidas 3a-d y el cloruro de

76

fumarilo (15). La reacción se llevó a cabo en condiciones anhidras con un equivalente

de cada reactivo con posterior inactivación de los cloruros de ácidos excedentes (Figura

43).

NH2

R1

R2




d: R1 = H, R2 = COOEtNH

R1

R2

O

1) THF, t.a., 16 h

2) H2O, t.a., 3 h

3a-d 16a-d

Cl

Cl

O

O

+ + 2 HCl (g)

15

OHO

Figura 43. Reacción general de síntesis de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d.

Los compuestos obtenidos tuvieron puntos de fusión más altos que sus isómeros 5a-

d, con polaridad similar y de rendimientos que va de buenos a muy buenos (Tabla 23).

Tabla 23. Características físicas de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d.

NH

O OH

O

1 2

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

O

HO

16a

NH

O O

O

1 2

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

O

HO

16b

NH

O

1 2

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

OH

O

O

HO

16c

NH

O

1 2

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

O

O

CH3

HO

O

16d

Rendimiento

(%)

95.0 68.1 82.1 68.4

Punto de

fusión (°C)

280-285

(ennegrece)

228-231 298-300 225-228

Rf

(AcOEt/MeOH

1:1)

0.36 0.59 0.31 0.61

Los espectros de IR (Tabla 24) y RMN de 1H y

13C (Tabla 25) no difieren mucho de

sus isómeros. La diferencia sustancial de los aductos 16a-d se encuentra en el espectro

de 1H para los hidrógenos de las posiciones 2 y 3, es decir, los hidrógenos vinílicos que

77

presentan una constante de acoplamiento trans con respecto a la constante de

acoplamiento cis de los aductos 5a-d. Las constantes vecinales trans son más grandes

debido al ángulo diedro de 180°, que en este caso específico se encuentran alrededor de

3Jtrans = 15.00 Hz (Tabla 25), mientras que para sus isómeros que tienen un ángulo

diedro de 0° muestran una constante de 3Jcis = 12.00 Hz.

78

Tabla 24. Caracterización de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d por espectrofotometría IR

obtenidas en pastilla de KBr.

NH

O OH

O

1 2

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

O

HO

16a

NH

O O

O

1 2

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

O

HO

16b

NH

O

1 2

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

OH

O

O

HO

16c

NH

O

1 2

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

O

O

CH3

HO

O

16d

-NH 3300, 1180 3320, 1185 3280, 1170 3360, 1150

-OH 2960 No se observa 3000 3280

-CH2=CH2- No se observa 3020 3090 3100

-CH3 y

-CH2-

No se observa 2990 No se observa 2985

-C=O ,-

insaturado

1670 1680 1660 1700

OHO

1690 -------- 1700 --------

OO

-------- 1705 -------- 1720

HN-C=O 1598 1597 1595 1600

-CO-O -------- 1280 -------- 1298

O-C-C -------- 1240 -------- 1280

o-di

1520, 855,

770

1540, 880, 780 -------- --------

m-di

-------- ------- 1550, 980, 945,

798

1500, 815, 780

79


13C (125 MHz) en DMSO-d6 de los ácidos

N-fenilfumarámicos 16a-d.

NH

O OH

O

1 2

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

O

HO

16a

NH

O O

O

1 2

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

O

HO

16b

NH

O

1 2

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

OH

O

O

HO

16c

NH

O

1 2

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

O

O

CH3

HO

O

16d

Posición 1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1 12.50 – 13.00

br

167.52 12.50 – 13.00

br

166.90 12.50 – 13.00

br

166.95 12.50 –

13.00 br

166.95

2 6.67 d

(15.50)

132.07 6.67 d

(15.50)

132.13 6.67 d (15.00) 132.11 6.68 d

(15.75)

131.79

3 7.13 d

(15.50)

137.30 7.12 d

(15.00)

137.39 7.11 d (15.50) 137.50 7.18 d

(15.75)

137.48

4 -------- 162.77 -------- 162.83 -------- 162.57 -------- 162.58

1’ -------- 126.61 -------- 125.71 -------- 139.45 -------- 139.58

2’ 7.76 d (9.00) 119.57 7.77 d (9.00) 119.65 8.30 s 120.81 8.33 s 120.49

3’ 7.90 d (8.50) 131.21 7.91 d (8.50) 130.95 -------- 131.68 -------- 131.15

4’ -------- 143.18 -------- 143.45 7.66 d (8.50) 125.44 7.68 d (7.50) 125.28

5’ 7.90 d (8.50) 131.21 7.91 d (8.50) 130.95 7.45 t 129.88 7.48 t 130.05

6’ 7.76 d (9.00) 119.57 7.77 d (9.00) 119.65 7.86 d (8.50) 124.25 7.91 d (9.30) 124.48

-NH 10.77 br -------- 10.79 br -------- 10.67 br -------- 10.78 br -------

-COO 12.50 – 13.00

br

166.90 -------- 165.96 12.50 – 13.00

br

167.71 -------- 166.17

-CH2- -------- ------- 4.25 q 61.23 -------- -------- 4.30 q 61.57

-CH3 -------- -------- 1.27 t 14.82 -------- -------- 1.31 t 14.81



Esta característica estructural es de suma importancia en la generación de los aductos

Diels-Alder debido a que la estereoquímica de los productos generados dependerá en

gran medida de la configuración de los dienófilos; es decir, cuando un dienófilo tiene

configuración Z el cicloaducto tendrá a sus sustituyentes del mismo lado, mientras si la

configuración es E los aductos estarán de distinto lado obteniendo isómeros con

geometrías diferentes.

La reacción para formar los aductos derivados de isopreno se realizó en un tubo de

presión a 160 °C por 48 h (Figura 44).

80




d: R1 = H, R2 = COOEtNH

R1

R2

O

Tolueno,

160 °C, 48 h

17a-d y 18a-d

+

2

OHO

H3C

16a-dNH

OH

R1

R2

O

O

NH

OH

R1

R2

O

O

+

H3C

H3C

Figura 44. Reacción general de síntesis de la mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 17a-

d y 18a-d.

Los resultados obtenidos fueron muy interesantes; bajo las condiciones de reacción se

lograron obtener los aductos Diels-Alder. Sin embargo, dichas reacciones no fueron

regioselectivas obteniendo una proporción aproximada de la mezcla de 45:55. Como se

mencionó antes, la reacción procedió en el tubo de presión a una temperatura alta;

observándose que no hubo la formación de la imida (Figura 45) como sucedió con los

ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d que formaron los respectivos aductos 4a-d; por lo tanto,

en los compuestos derivados del ácido maleico en los que los sustituyentes se

encuentran con estereoquímica cis, se favorece a esa temperatura la formación del anillo

de 5 miembros, mientras que con los compuestos derivados del ácido fumárico al

encontrarse los mismos sustituyentes con geometría trans la reacción de ciclización

intramolecular no fue favorecida.

81

-COOH

-NH

H3’

H5’

H2’

H6’

H6

H5

-CH2-

-CH3

-CH3

H7a

H3a

H4

H7

H3C

NH

OH

O

O

O

O

1

23

3a4

5

6

77a

1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

Figura 45. Espectro de RMN 1H para las mezcla de regioisómeros de los aductos 17b y 18b.

Se analizaron los espectros de RMN de los aductos; en particular, a manera de

ejemplo, se discutirá la mezcla de regioisómeros 17b y 18b. A campos altos es posible

observar una señal ancha aproximadamente en 10.30 ppm que corresponden a los 2

hidrógenos de la amida de los dos regioisómeros; sin embargo, no se observan dos

señales; pero en el caso de los hidrógenos aromáticos que describen un acoplamiento

AA’-BB’ se pueden observar las dos señales dobles de cada regioisómero con una 3Jo =

8.70 Hz (Tabla 26). En 5.41 ppm es una señal ancha que corresponde a los hidrógenos

de las posiciones 5 ó 6 del regioisómero correspondiente; a campos más altos entre 2.0

y 3.0 ppm se pueden apreciar varias señales múltiples que corresponden con los

hidrógenos del anillo de ciclohexeno, exceptuando los vinílicos.

Es interesante hacer notar que los hidrógenos de las posiciones 3a y 7a que son

átomos que están más desprotegidos que los de las posiciones 4 y 7, no describen una

multiplicidad clara, sino que son señales anchas, a diferencia de los que se muestra en la

Figura 38 (espectro de 1H de la mezcla de regioisómeros 6b y 7b) que muestran para las

mismas posiciones un par de señales mejor definidas y diferenciadas; lo mismo sucede

para los hidrógenos de las posiciones 4 y 7. Esta diferencia en el espectro de 1H

evidencia la diferencia en la geometría entre los aductos derivados de ácido maleico

82

(aductos cis 6a-d y 7a-d) y los derivados del ácido fumárico (aductos trans 17a-d y

18a-d) cuyos hidrógenos están del mismo y diferente lado respectivamente, lo que le

confiere distinta geometría al anillo de ciclohexeno y por tanto, los acoplamientos

vecinales son diferentes.

83


13C (75 MHz) en DMSO-d6 de la mezcla de

regioisómeros de los aductos Diels-Alder 17a-d y 18a-d derivados de isopreno.

H3C

NH

OH

O

O

OH

O

1

23

3a4

5

67a

1'2'

3'

4'

5'

6'

17a y 18a

H3C

NH

OH

O

O

O

O

1

23

3a4

5

6

77a

1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

17b y 18b

H3C

NH

OH

O

O

OH

O1

23

3a4

6

5

77a

1'2'

3'

4'

5'

6'

17c y 18c

H3C

NH

OH

O

O

O

O1

23

3a4

6

5

77a

1'2'

3'

4'

5'

6'

CH3

17d y 18d

Posición 1

H (ppm) 3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1H (ppm)

3JH-H (Hz)

13C

(ppm)

1 12.20 – 12.40 br

174.73, 174.58

12.20 – 12.40 br

179.54, 179.38

ND ND 12.20 – 12.40 br

174.50, 174.34

2 10.34 (2H,

br) --------

10.37 (2H,

br) -------- ND ND

10.30 (2H,

br) --------

3 -------- 167.64 -------- 170.76 -------- ND -------- 166.24,

165.72

3a 2.66 (2H,

m)

42.08,

41.55

2.62-2.72

(2H, m) 46.81 ND ND

2.94-3.03

(2H, m) Traslapada

4 y 7 1.96-2.52

(8H, m)

33.98, 33.29,

29.48, 28.81

1.98-2.35

(8H, m)

38.01,

34.21 ND ND

2.27-2.32

(8H, m) 29.96, 25.05

5 ó 6 5.41 (2H,

br)

132.93,

132.83,

119.88

5.41 (2H, br)

137.59, 124.61

ND ND

5.49 (1H,

br); 5.48

(1H, br)

133.66, 133.01

7a 2.82 (2H,

m) 44.01, 43.49

2.72-2.82 (2H, m)

48.23 ND ND 3.04-3.12 (2H, m)

43.38, 42.91

-CH3 1.65 (6H,

br) 23.47

1.66 (6H,

br) 28.22 ND ND 1.73 (6H, br) 24.12

1’ -------- 144.02 -------- 149.08 -------- ND -------- 140.25

2’ 7.70 (2H, d,

8.85)

119.50,

118.87

7.73 (2H, d, 8.70); 7.72

(2H, d,

8.70)

123.72 ND ND 8.28 (1H, s);

8.27 (1H,s) 120.04

3’ 7.88 (2H, d,

8.85) 131.06

7.90 (2H, d, 8.70); 7.89

(2H, d, 8.70)

135.65 -------- ND -------- 130.95,

130.02

4’ -------- 125.55 -------- 129.36 ND ND

7.66 (1H, d,

7.80); 7.61

(1H, d, 8.10)

124.00

5’ 7.88 (2H, d,

8.85) 131.06

7.90 (2H, d,

8.70); 7.89

(2H, d, 8.70)

135.65 ND ND 7.43 (1H, t);

7.39 (1H, t) 124.29

6’ 7.70 (2H, d,

8.85)

119.50,

118.87

7.67 (2H, d,

8.70); 7.66

(2H, d, 9.00)

123.72 ND ND 7.98 (1H, d, 7.50); 7.97

(1H, d, 7.50)

121.44

-COO 12.20 –

12.40 br

176.83,

176.70

12.20 –

12.40 br 181.44 -------- ND --------

176.57,

176.54

-CH2- -------- -------- 4.27 (4H,

q) 65.84 -------- --------

4.33 (2H, q);

4.30 (2H, q) 61.74, 61.41

-CH3 -------- -------- 1.30 (6H, t) 19.63 -------- -------- 1.32 (3H, t); 1.28 (3H, t)

14.83



84

6.2 DOCKING

La primera parte de este trabajo fue realizar estudios de acoplamiento molecular

(Docking) sobre la enzima aminotransferasa del GABA (GABA-AT) de Pseudomonas

fluorescens debido a que los ensayos de cinética enzimática se realizaron sobre esta

enzima.

Es importante señalar que las estructuras tridimensionales reportadas por difracción de

rayos X son únicamente las de Escherichia coli y de cerdo (Sus scrofa). Debido a esta

situación, de inicio no fueron escogidas estas estructuras para realizar los estudios de

Docking dado que los datos experimentales son en la GABA-AT de Pseudomonas

fluorescens, por lo que se efectuó un modelado comparativo usando como secuencia

molde las reportadas. Para iniciar el estudio comparativo se obtuvieron las secuencias

de aminoácidos de la enzima de diferentes especies con distancia filogenética

considerable con el fin de analizar las diferencias y sobre todo las similitudes en el sitio

activo de la proteína. Las especies utilizadas fueron: Homo sapiens (humano), Sus

scrofa (cerdo), Mus musculus (ratón), Escherichia coli (bacteria) y Pseudomonas

fluorescens (bacteria). Las secuencias de aminoácidos fueron descargadas del servidor

Swiss prot44

en formato FASTA.

Una vez obtenidas las secuencias de aminoácidos de las cuatro especies, la secuencia

de Pseudomonas fluorescens fue alineada contra las secuencias de las otras tres especies

utilizando el servidor EMBL-EBI.45

Los resultados de este alineamiento se realizaron en función de la homología sobre

toda la proteína, se compararon las secuencias alineadas de las diferentes especies

contra la de Pseudomonas fluorescens. Se buscaron los aminoácidos que conforman el

sitio activo para determinar si las proteínas lo tienen conservado. Los aminoácidos que

conforman el sitio activo son los siguientes: Ile51, Gln80, Ser113, Tyr139, Arg142,

Tyr156, Gly211, Asp240, Val242, Gln243, Lys269, Ser270, Gly296, Thr298, Leu389 y

Arg399.16

A continuación se presentan los resultados de alineamiento de la secuencia de

Pseudomonas fluorescens contra las otras especies (Figuras 46, 47, 48 y 49).

85

Figura 46. Alineamiento de GABA-AT de Pseudomonas fluorescens vs Homo sapiens. *: aminoácidos

idénticos, : : aminoácidos diferentes pero que puede sustituirse, . : aminoácidos con cierta homología,

Amarillo: aminoácidos idénticos del sitio activo para las dos secuencias. Verde: aminoácidos diferentes

que no son homólogos en el sitio activo.

86

Figura 47. Alineamiento de GABA-AT de Pseudomonas fluorescens vs Sus scrofa. *: aminoácidos




87

Figura 48. Alineamiento de GABA-AT de Pseudomonas fluorescens vs Mus musculus. *: aminoácidos




88

Figura 49. Alineamiento de GABA-AT de Pseudomonas fluorescens vs Escherichia coli. *: aminoácidos




El resultado del alineamiento fue muy interesante y al mismo tiempo esperado; la

homología de la GABA-AT de Pseudomonas fluorescens fue del 73 % con la de

Escherichia coli debido a que ambas enzimas provienen de bacterias, es decir la

distancia filogenética no es demasiada, por lo tanto, las menores homologías de la

primera con Homo sapiens, Sus scrofa y mus musculus fueron de 23, 23 y 24 %,

respectivamente (Tabla 27), ya que la diferencia en la escala filogenética es mayor.

89

Tabla 27. Análisis de homología de la enzima GABA-AT de P. fluorescens comparada con las

especies E. coli, M. musculus, S. scrofa y H. sapiens. Comparación de los aminoácidos del sitio

activo que cambian en cada uno con respecto a P. fluorescens.

Especie

Homología de P.

fluorescens vs. Especie

(%)

Aminoácidos

diferentes en el sitio

activo

Escherichia coli 73 Ninguna

Mus musculus 24 Gln80 por Gly80,

Gly296 por Phe 296

Sus scrofa 23 Gln80 por Gly80,

Gly296 por Phe 296

Homo sapiens 23 Gln80 por Gly80,

Gly296 por Phe 296

Sin embargo, es interesante el análisis de los aminoácidos que conforman el sitio

activo, con E. coli el sitio activo es idéntico, y únicamente dos aminoácidos marcan la

diferencia con las especies (ratón, cerdo y humano), cuyos cambios consisten en la

sustitución de la glutamina-80 (Gln80) por una glicina (Gly80) y la glicina-296

(Gly296) por una fenilalanina (Phe296).

Con estos resultados podemos decir que el sitio activo está altamente conservado en la

escala filogenética (Tabla 27) y, por lo tanto, es posible realizar el modelado

comparativo para obtener la proteína de interés en forma tridimensional de la GABA-

AT de P. fluorescens tomando como secuencia molde la de E. coli debido a su alta

homología, y sobre todo porque el sitio activo está conservado tanto en dicha bacteria

como en los humanos.

La GABA-AT de Escherichia coli es un tetrámero con cuatro monómeros idénticos16

(Figura 50), de tal manera que únicamente el modelado fue realizado para un solo

monómero. Una vez escogido la secuencia molde (E. coli), la GABA-AT de

Pseudomonas fluorescens fue modelada en dos servidores diferentes: 1) El monómero

1SFFC16

de E. coli en Swiss model46

y el monómero 1SF2A16

de E. coli en I-Tasser.47

90

Figura 50. Estructura tetramérica tridimensional determinada por difracción de rayos X de la GABA-AT

de Escherichia coli

Una vez obtenidos los resultados de ambos servidores, cada uno de los modelos

generados fue evaluado con el propósito de elegir aquel modelo de mejor calidad

estructural con respecto a la estructura en DRX de la GABA-AT de E. coli. La

evaluación de cada modelo consistió en un análisis de la calidad de la estructura

terciaria de la GABA-AT con el gráfico de Ramachandran que evalúa los residuos de

aminoácidos que adoptan la conformación de la secuencia molde (Figuras 51 y 52).

Figura 51. Gráfico de Ramachandran. Figura 52. Ángulos de torsión y del enlace peptídico

91

La interpretación del gráfico de Ramachandran consiste en observar en qué región del

gráfico se encuentran los ángulos diedros de los residuos de aminoácidos del modelo,

entre más concentrados estén en las áreas más oscuras, su energía es más optima para la

estructura secundaria proveniente de los ángulos y En el mismo sentido, aquellos

aminoácidos que estén fuera de las áreas oscuras repercute en detrimento de la calidad

del modelo puesto que los ángulos formados son de alta energía. El criterio anterior no

es aplicable para los aminoácidos glicina (Gly) y prolina (Pro).

A continuación se muestra los gráficos de Ramachandran de la secuencia molde de

1sffC de E. coli (Figura 53A) y el modelo de P. fluorescens (Figura 53B) calculados en

el servidor Swiss Model; y el molde 1sf2A de E. coli (Figura 54A) y el modelo de P.

fluorescens (Figura 54 B) calculados en el servidor I-Tasser.

A B

Figura 53. A: Secuencia molde 1sffC de E. coli. B: Modelo de P. fluorescens. Determinados en Swiss

Model.

C D

Figura 54. A: Secuencia molde 1sf2A de E. coli. B: Modelo de P. fluorescens. Determinados en I-Tasser.

El análisis de los gráficos de Ramachandran sugieren que el modelo generado en I-

Tasser es el de mejor calidad ya que solo 4.0 % de los aminoácidos se encuentran en las

áreas no permitidas de conformación, a comparación del modelo generado en Swiss

Model que presentó un 9.35 % de aminoácidos fuera de las áreas permitidas (Tabla 28).

92

Los moldes presentan un porcentaje de aminoácidos fuera de área alrededor del 10.11

%.

Tabla 28. Criterio de selección del modelo.

Porcentaje de aminoácidos

fuera de área Swiss-Model I-Tasser

Molde 10.11 10.82

Modelo 9.35 4.00

En la determinación del porcentaje fueron excluidos la Gly y Pro que se encontraron fuera de área.

En las figura 55A y 55B se muestran las estructuras de los modelos y de su secuencia

molde sobrepuestas, y a simple vista se notan muy similares entre sí.

Figura 55. A: (gris) molde 1sffC de E. coli; (rojo): modelo de P. fluorescens generado por Swiss-

Model. B: (gris) molde 1sf2A de E. coli; (azul) modelo de P. fluorescens generado por I-Tasser.

Escogido el modelo de I-Tasser, era de esperarse que no tuviera a la coenzima PLP

que es esencial en la actividad catalítica de la enzima dado que estos servidores solo

modelan los residuos de aminoácidos. Como se mencionó anteriormente este PLP está

unido covalentemente formando una base de Schiff a la Lys269; por tal motivo, las

coordenadas del PLP se tomaron de la proteína que se usó como molde y se insertaron

en el modelo obtenido por I-Tasser. Sin embargo, la distancia entre el nitrógeno del

grupo –NH2 de la Lys269 y el carbono carbonilo del aldehído del PLP no era la óptima,

por tal motivo la geometría de este nuevo archivo con la GABA-AT-PLP fue

minimizada por mecánica molecular usando los campos de fuerza CHARMM

implementados en el programa NAMD a 1500, 2000 y 4000 pasos. Después de cada

optimización fue analizada la distancia entre los átomos involucrados (Tabla 29).

93

Tabla 29. Optimización por mecánica molecular de la GABA-AT modelada con PLP como

coenzima.

Pasos de optimización Distancia (NLys269-CPLP) (nm)

Normal 0.392

1500 0.315

2000 0.298

4000 0.286

Cuando fue insertado el PLP la distancia entre los átomos en estudio fue de 0.392 nm

que es una distancia alejada y no óptima; la distancia escogida fue de 0.315 nm (Figura

56) debido a que las optimizaciones a 2000 y 4000 pasos generaron traslapes del PLP

con aminoácidos de la periferia.

Figura 56. Enzima GABA-AT modelada y optimizada a 1500 con la coenzima PLP.

El complejo molde enzima-coenzima fue utilizada para realizar la interacción con

cada uno de los aductos Diels-Alder propuestos (ligandos), que fueron construidos y

optimizados tomando en cuenta su estereoquímica. El análisis de los resultados de

interacción asistida por computadora consistió en obtener las energías libres (kcal/mol)

de unión ligando-enzima que se convirtieron las respectivas constantes de afinidad en el

sitio activo de la enzima.

94

En la información que se presenta a continuación (Tabla 30, Figura 57) se muestran

las constantes de disociación derivadas del ensayo de Docking para los derivados de

isopreno.

Tabla 30. Constantes de disociación (KD) y radio (KD1/KD2) de cada uno de los aductos Diels-Alder

derivados de los ácidos maleico y fumárico con isopreno.

Configuración Estereoquímica Sustitución KD (M) R =KD1/KD2

RS Amec-Acax

6a

p-COOH

843.87 5.62

SR 150.02

RS Amec-Acax

6b

p-COOEt

505.77 0.76

SR 662.82

RS Amec-Acax

6c

m-COOH

37.52 0.14

SR 263.30

RS Amec-Acax

6d

m-COOEt

86.07 0.74

SR 116.20

RS Amec-Acax

7a

p-COOH

77.37 1.51

SR 51.19

RS Amec-Acax

7b

p-COOEt

291.62 2.11

SR 138.07

RS Amec-Acax

7c

m-COOH

50.20 0.13

SR 392.02

RS Amec-Acax

7d

m-COOEt

38.03 1.58

SR 24.02

RR Amec-Acec

17a

p-COOH 123.03 10.40

SS 11.82

RR Amec-Acec

17b

p-COOEt 56.12 0.58

SS 96.00

RR Amec-Acec

17c

m-COOH 41.00 0.97

SS 42.07

RR Amec-Acec

17d

m-COOEt 40.83 0.49

SS 82.91

RR Amec-Acec

18a

p-COOH 12.99 0.16

SS 78.38

RR Amec-Acec

18b

p-COOEt 136.49 9.56

SS 14.28

RR Amec-Acec

18c

m-COOH 37.05 0.26

SS 142.63

RR Amec-Acec

18d

m-COOEt 72.86 1.35

SS 53.98

RS, SR, RR y SS: Configuraciones de cada molécula. Amec-Acax: amida--ecuatorial con ácido--axial

para cada regioisómero. Amendo-Acexo: amida-endo con ácido-exo. R = es la relación entre constantes de

disociación entre el enantiómeros con ―menor‖ afinidad sobre la enzima con respecto a de mayor; cuanto

mayor sea el valor de R, es tanta veces es más afín un enantiómero sobre el otro.

95

Tanto en la Tabla como en la gráfica se puede ver que no hay una correlación muy

marcada entre la afinidad entre pares enantioméricos; es decir, que en realidad la

afinidad no está sesgada hacia un enantiómero; sin embargo, en la gráfica se puede

apreciar bastante bien que los aductos Diels-Alder derivados del ácido fumárico (RR y

SS) tienen más afinidad sobre la GABA-AT en el sitio activo que los derivados del

ácido maleico (RS y SR).

0.0

100.0

200.0

300.0

400.0

500.0

600.0

700.0

800.0

900.0

RS SR RS SR RS SR RS SR RS SR RS SR RS SR RS SR RR SS RR SS RR SS RR SS RR SS RR SS RR SS RR SS

Pares enantioméricos

KD (

M)

H3C

NH

OH

O

O

R1

R2

NH

OH

O

O

R1

R2

H3C

H3C

NH

OH

O

O

R1

R2

NH

OH

O

O

R1

R2

H3C

6a-d

7a-d

17a-d 18a-d

Figura 57. Comparación de las constantes de disociación (KD) de cada uno de los enantiómeros de los

aductos Diels-Alder derivado de isopreno. 6a-d y 7a-d: corresponden a la mezcla de regioisómeros

derivados de ácido maleico obtenidos experimentalmente. 17a-d y 18a-d: corresponden a la mezcla de

regioisómeros derivados del ácido fumárico obtenidos experimentalmente.

Tomando como ejemplo la comparación de los pares enantioméricos RS y SR del

compuesto 6b (regioisómeros con –CH3 del lado del grupo amida) se puede apreciar

que el enantiómero RS es un poco más afín que el SR puesto que el primero establece

interacciones intermoleculares de tipo van der Waals entre el anillo de ciclohexeno del

aducto con la ILE51 y la otra corresponde a una de tipo ión-dipolo entre el carboxilato

sustituyente del ciclohexeno con el hidrógeno de la ARG142 (ión-dipolo); en contraste

con la del enantiómero SR donde únicamente se establece una interacción de tipo

puente de hidrógeno entre el hidrógeno de la ARG142 con el oxígeno al carbonilo del

grupo éster del anillo; además es importante hacer hincapié en la forma en que la

molécula está acomodada en el sitio activo; en el isómero RS la interacción con la

96

ILE51 y la ARG142 es del lado del anillo de ciclohexeno y en le isómero SR la

interacción es del lado del anillo aromático (Figuras 58A y 58B).

Por otro lado la comparación de los pares enantioméricos de los productos 7b

(regioisómeros con –CH3 del lado del ácido carboxílico) la afinidad de ambos mejora

por lo menos casi al doble que los regioisómeros 6b. En cuanto a la interacciones que se

establecen entre el aducto con los aminoácidos del sitio activo, el isómero RS forma dos

puentes de hidrógeno, el primero de ellos es entre el hidrógeno del grupo –OH de la

TYR156 con el carbono carbonilo del grupo amida del aducto, y el segundo entre un

hidrógeno del grupo –NH2 de la ARG142 con el carbono carbonilo del grupo éster del

anillo aromático del aducto; mientras que con el isómero SR es posible apreciar un

puente de hidrógeno entre el hidrógeno del –NH2 de la ARG142, pero en este caso se

establece con el oxígeno al carbonilo del grupo amida. Es importante comentar que la

constante de disociación es dos veces mejor en el compuesto SR que en RS, aunque en

realidad no es una diferencia tan importante.

A B

C D

Figura 58. A: p-COOEt-RS-Amec-Acax-IP (KD = 505.77 M); B: p-COOEt-SR-Amec-Acax-IP (KD =

662.82 M); C: p-COOEt-RS-Amec-Acax-IP (KD = 291.62 M); D: p-COOEt-SR-Amec-Acax-IP (KD

= 138.07 M).

97

A B

C D

Figura 59. A: p-COOEt-RR-Amec-Acec-IP (KD = 56.12 M); B: p-COOEt-SS-Amec-Acec-IP (KD =

96.00 M); C: p-COOEt-RR-Amec-Acec-IP (KD = 136.49 M); D: p-COOEt-SS-Amec-Acec-IP (KD

= 14.28 M).

Las interacciones mostradas por los siguientes dos pares de regioisómeros derivados

esta vez del ácido fumárico es la siguiente: en las Figuras 59A y 59B (regioisómeros

con el grupo –CH3 del lado de la amida) se muestran el par de enantiómeros RR y SS

respectivamente, el primero de ellos interacciona con cuatro aminoácidos del sitio

activo, lo que le confiere una afinidad buena con la enzima (56.12 M), es posible

apreciar el puente de hidrógeno entre el oxígeno del grupo –OH de la TYR156 con el

hidrógeno del grupo –NH de la amida del aducto; otra unión importante la constituye

una interacción de tipo ión-dipolo establecida entre el hidrógeno del grupo –NH2 de la

ARG142 con el carboxilato del anillo de ciclohexeno que estabiliza mejor a la molécula

en el sitio activo; de igual manera se pueden observar otras interacciones débiles con el

ciclohexeno que contribuyen a la afinidad como aquellas formadas entre el –CH3 de la

ILE51 y la interacción tipo entre el anillo aromático de la TYR139 con el doble

enlace del anillo. En contraste con su enantiómero SS la molécula forma interacciones

98

similares; sin embargo, el ligando se acomoda en el sitio activo de distinta manera la

cual le confiere una afinidad un poco menor (96.00 M) a su isómero aunque su

diferencia no es tan importante; por ejemplo la interacción ión-dipolo entre la ARG142

y el carboxilato del anillo se perdió debido a que se encuentra del lado opuesto con

respecto al isómero RR, y dicha interacción fue sustituida por un puente de hidrógeno

entre este aminoácido (ARG142) con el grupo –NH de la amida. Esta vez la TYR156

interacciona vía puente de hidrógeno con el carbono carbonilo del grupo éster. Es

importante mencionar que pudiese formarse bastante bien una interacción tipo

(―sándwich‖) entre los anillos aromáticos del la TYR139 y el aducto, aunque en la

imagen están en posición perpendicular, el ligando podría rotar el enlace entre la amida

y el carbono ipso del anillo.

En relación al siguiente par enantiomérico (regioisómeros con el grupo –CH3 del

ciclohexeno del lado del carboxilato) también muestra buena afinidad en el sitio activo

(Figuras 59C y 59B), de hecho mejor que su isómeros derivados del ácido maleico, y

esto es debido a la formación de interacciones importantes como la de tipo puente de

hidrógeno entre la TYR156 y el oxígeno al carbonilo del éster; otra interacción

corresponde a la formada entre la ILE51 y el anillo aromático. Cabe mencionar que

existe una interacción bastante energética correspondiente a una de tipo ión-dipolo entre

el carboxilato del ciclohexeno y la LYS269 que le confiere buena afinidad del ligando

hacia la enzima; sin embargo, hay que ser cuidadosos con esta interacción porque a

pesar de ser un aminoácido clave en la actividad enzimática, de manera natural se

encuentra como base de Schiff con el PLP lo que cambiaría su polaridad y la geometría

de esa porción en el sitio.

Por otro lado, el isómero SS mejora su afinidad con respecto al anterior debido a la

interacción ión-dipolo entre la ARG142 y el carboxilato; a la interacción entre la ILE51

y el ciclohexeno; y aquella formada entre el doble enlace del mismo anillo con la

TYR139. De igual manera, cabe mencionar que la LYS269 está interaccionando con un

puente de hidrógeno con el grupo éster del aducto.

Del mismo modo fueron analizados los aductos derivados de ciclopentadieno (Figura

60, Tabla 31) donde es posible apreciar de manera general un patrón de afinidad similar,

es decir, para el caso de los derivados del ácido maleico los enantiómeros RS tienden a

tener una mayor afinidad hacia el sitio activo de la enzima en comparación con su par

99

enantiomérico; lo mismo sucede en el caso de los derivados del ácido fumárico donde

los enantiómeros RR tienen más afinidad que los SS.

0.0

50.0

100.0

150.0

200.0

250.0

300.0

350.0

400.0

450.0

RS SR RS SR RS SR RS SR RS SR RS SR RS SR RS SR RR SS RR SS RR SS RR SS RR SS RR SS RR SS RR SS

Pares enantioméricos

KD (

M)

NH

OH

R1

R2

O

O

NH

OH

R1

R2

O

O

NH

OH

R1

R2

O

O

NH

OH

R1

R2

O

O11a-d


aductos Diels-Alder derivado de ciclopentadieno. 11a-d: corresponden a los compuestos sintetizados.

De manera particular el análisis sobre los aductos Diels-Alder con sustitución con

éster etílico en posición para, es importante señalar que tanto para los derivados exo y

endo (Figura 60) que la afinidad se conserva en la tendencia general, es decir, los

isómeros RS tienen más afinidad sobre los SR.

Entre los productos exo (Figura 61A, 61B) se puede apreciar que la afinidad del

isómero RS es mayor que la del SR aproximadamente 6.50 veces, y esto es debido a que

el isómero RS interacciona en el sitio activo con aminoácidos propios de él, por ejemplo

el carbono carbonilo del grupo éster forma un puente de hidrógeno con el grupo –OH de

la TYR156, además de establecer una interacción de de tipo del anillo aromático

del aducto con el anillo de la TYR139; en contraste con su isómero SR las interacciones

se modifican siendo la interacción principal con la ARG142 al establecer un puente de

hidrógeno entre el carbono carbonilo del éster del aducto con el hidrógeno del grupo

amina del aminoácido el aducto. Es importante señalar que por ser el enantiómero la

disposición espacial de la parte aromática del aducto SR está del otro lado con respecto

100

al RS lo que provoca la pérdida de la interacción con la TYR139; por tal motivo la

afinidad se pierde de manera importante.


derivados de los ácidos maleico y fumárico con ciclopentadieno.


RS exo p-COOH 34.40 1.07

SR 36.68

RS exo p-COOEt 37.05 6.47

SR 239.73

RS exo m-COOH 22.90 7.35

SR 168.44

RS exo m-COOEt 11.13 7.04

SR 78.44

RS endo p-COOH

11a

12.75 5.36

SR 68.41

RS endo p-COOEt

11b

137.35 3.08

SR 424.08

RS endo m-COOH

11c

153.64 1.75

SR 270.34

RS endo m-COOEt

11d

36.68 1.22

SR 44.79

RR Amexo-Acendo p-COOH 43.47 3.11

SS 135.11

RR Amexo-Acendo p-COOEt 84.79 1.62

SS 137.61

RR Amexo-Acendo m-COOH 37.70 1.61

SS 60.64

RR Amexo-Acendo m-COOEt 19.01 0.79

SS 15.11

RR Amendo-Acexo p-COOH 19.83 0.92

SS 18.35

RR Amendo-Acexo p-COOEt 144.22 1.04

SS 150.88

RR Amendo-Acexo m-COOH 45.92 1.56

SS 71.56

RR Amendo-Acexo m-COOEt 337.95 0.11

SS 34.41

RS, SR, RR y SS: Configuraciones de cada molécula. Amexo-Acendo: amida-exo con ácido-endo. Amendo-

Acexo: amida-endo con ácido-exo. R = es la relación entre constantes de disociación entre el enantiómeros

con ―menor‖ afinidad sobre la enzima con respecto a de mayor; cuanto mayor sea el valor de R, es tanta

veces más afín un enantiómero sobre el otro.

En relación a los isómeros endo (Figuras 61C y 61D) se puede apreciar entre

enantiómeros que la afinidad del RS es aproximadamente 3 veces mayor que el SR como

101

sucedió con los productos exo. El producto RS muestra una interacción importante con

la ARG142 al establecer un puente de hidrógeno con el oxígeno del éster del aducto con

el hidrógeno del grupo –NH2 de la ARG142, en contraste con el producto SR donde

dicho puente se pierde por la disposición espacial del aducto solo interaccionando

primordialmente con la ILE51 con la parte alifática del grupo etilo del éster; de tal

manera que la afinidad se pierde. Es importante señalar que entre los productos exo y

endo los primeros muestran mejor afinidad que los segundos; entre los compuestos RS,

la diferencia sustancial está en la posición de los sustituyentes del biciclo; es decir, la

estereoquímica exo favorece la interacción con la TYR139, mientras que con la

endo se pierde dicha interacción, por ello se pierde la afinidad. En relación a los

productos SR la interacción se pierde y solo interaccionan de manera importante

para el producto exo con la ARG142 y para el endo con la ILE51.

A B

C D

Figura 61. A: p-COOEt-RS-exo-CP (KD = 37.05 M); B: p-COOEt-SR-exo-CP (KD = 239.73 M); C: p-

COOEt-RS-endo-CP (KD = 137.35 M); D: p-COOEt-SR-endo-CP (KD = 424.08 M).

102

Con respecto a los aductos derivados del ácido fumárico donde los sustituyentes del

biciclo están de distinto lado, se encontró una relación estructural importante, y esta se

refiere a la interacción con la TYR139 con el isómero RR cuando el grupo amida

está en estereoquímica exo y el grupo –COOH en estereoquímica endo se establece

dicha interacción (Figura 62A); mientras que las demás combinaciones está interacción

no está presente (Figuras 62B, 62C y 62D); es decir, la estereoquímica exo favorece esta

interacción cuando la configuración es R en ese sustituyente. Además, el compuesto RR

es el más afín de los cuatro.

A B

C D

Figura 62. A: p-COOEt-RR-Amexo-Acendo-CP (KD = 84.79 M); B: p-COOEt-SS-Amexo-Acendo-CP (KD =

137.71 M); C: p-COOEt-RR-Amendo-Acexo-CP (KD = 144.22 M); D: p-COOEt-SS-Amendo-Acexo-CP (KD

= 150.88 M).

En relación a los aductos Diels-Alder derivados de furano evaluados por Docking es

importante mencionar que aparentemente no existe una relación entre la afinidad y los

pares enantiómericos, es decir, no hay mucha diferencia entre la afinidad de uno sobre

otro, salvo algunas excepciones (Tabla 32, Figura 63).

103

En este caso se comenta únicamente a los aductos derivados del ácido maleico con

sustitución con éster etílico en posición para.


derivados de los ácidos maleico y fumárico con furano.


RS exo p-COOH

14a

57.51 0.82

SR 69.58

RS exo p-COOEt

14b

8.42 0.03

SR 254.97

RS exo m-COOH

14c

208.03 1.15

SR 180.68

RS exo m-COOEt

14d

310.96 3.41

SR 91.03

RS endo p-COOH

9.37 0.55

SR 17.04

RS endo p-COOEt

22.37 1.22

SR 18.34

RS endo m-COOH

157.55 0.63

SR 250.04

RS endo m-COOEt

74.05 0.60

SR 122.91

RR Amexo-Acendo p-COOH 69.98 0.41

SS 170.22

RR Amexo-Acendo p-COOEt 230.31 0.51

SS 451.09

RR Amexo-Acendo m-COOH 495.92 1.44

SS 343.05

RR Amexo-Acendo m-COOEt 110.81 1.09

SS 101.75

RR Amendo-Acexo p-COOH 97.27 0.48

SS 200.59

RR Amendo-Acexo p-COOEt 185.89 0.92

SS 201.71

RR Amendo-Acexo m-COOH 295.30 1.20

SS 244.74

RR Amendo-Acexo m-COOEt 49.38 4.19

SS 11.78

RS, SR, RR y SS: Configuraciones de cada molécula. Amexo-Acendo: amida-exo con ácido-endo. Amendo-

Acexo: amida-endo con ácido-exo. R = es la relación entre constantes de disociación entre el enantiómeros

con ―menor‖ afinidad sobre la enzima con respecto a de mayor; cuanto mayor sea el valor de R, es tanta

veces más afin un enantiómero sobre el otro.

104


aductos Diels-Alder derivado de furano. 14a-d: corresponden a los compuestos sintetizados.

A B

C D

Figura 64. A: p-COOEt-RS-exo-Fur (KD = 8.42 M); B: p-COOEt-SR-exo-Fur (KD = 254.97 M); C: p-

COOEt-RS-endo-CP (KD = 18.34 M); D: p-COOEt-SR-endo-CP (KD = 22.37 M).

105

Con respecto a los enantiómeros RS y SR correspondientes a los compuestos exo hay

una diferencia importante entre la afinidad entre ellos, el primero (RS) es casi 300 veces

más afín que el SR, y esto es debido a las interacciones intermoleculares que se forman

en el sitio activo de la GABA-AT. El isómero RS muestra un puente de hidrógeno entre

el carbono carbonilo de la amida con la ARG142 además de mostrar otra interacción

con el mismo aminoácido con el carboxilato del biciclo; una interacción tipo entre

el anillo aromático del aducto y la TYR139, interacciones más débiles entre la ILE51 y

el anillo aromático (Figura 64 A). Es importante mencionar que también se presenta

otro puente de hidrógeno entre el carbonilo del grupo éster y la LYS269, cuya

interacción fue discutida anteriormente. El isómero SR pierde afinidad porque solo

establece ahora un puente de hidrógeno entre el carbonilo del éster y la ARG142, una

interacción ión-dipolo entre la TYR156 y el carboxilato del biciclo, así también muestra

interacción con grupo etilo del éster con la ILE51 (Figura 64B). En este caso la LYS269

y el aducto no comparten alguna interacción. Dependiendo de la rotación del anillo

aromático del aducto y su facilidad para hacerlo pudiese establecer una interacción

con al TYR139 que se encuentra perpendicular a dicho anillo.

Por otro lado, en el caso del compuesto RS-endo sucede algo similar que con el

compuesto exo; es decir, se puede observar en la Figura 64C un puente de hidrógeno

con la LYS269 y el carbonilo de éster, así como el puente formado entre el carbonilo de

la amida y la ARG142 y la interacción ión-dipolo entre la misma ARG142 y el

carboxilato del biciclo del aducto. También es posible apreciar la interacción tipo

―sándwich‖ () entre los anillos aromáticos del aducto y la TYR139; así como la

interacción del grupo etilo con la ILE51. La molécula SR tiene menos afinidad con

respecto a su isómero RS por que solo establece interacciones con el grupo etilo y la

ILE51, y la interacción ión-dipolo entre la ARG142 y el carboxilato (Figura 64D).

De manera muy general se ha discutido el tipo de interacciones intermoleculares

débiles que se establecen en el sitio activo de la GABA-AT con algunos ejemplos de los

aductos Diels-Alder evaluados y su relación con la constante de disociación KD; sin

embargo, es importante mencionar que a pesar que la forma en como se acomodan los

ligandos en el sitio activo es visiblemente diferente en algunos casos, es importante

resaltar el tipo de aminoácidos que participan en la interacción los cuales son muy

frecuentes. Se ha observado de manera general que la ILE51 puede establecer

interacciones de tipo van der Waals con el anillo aromático, el ciclohexeno o con el

106

éster; los puentes de hidrógeno se establecen con la TYR156 y ARG142; otra

interacción interesante en algunos casos es la de ión-dipolo con la ARG142 y los

carboxilatos del ciclohexeno o biciclos. Además las interacciones de tipo que

estabilizan mucho a los aductos y en general están relacionadas con el antagonismo de

receptores farmacodinámicos o inhibición enzimática.6

Por otro lado, fue evaluado bajo la misma metodología la interacción entre el GABA

y la enzima GABA-AT, ya que el neurotransmisor corresponde al sustrato natural de la

enzima. En la figura 65 es posible apreciar los aminoácidos que participan o que están

directamente relacionados con el sitio activo, que interesantemente son los mismos que

intervienen en la interacción con los aductos Diels-Alder. Es importante destacar que el

GABA interacciona directamente con la LYS269 y la coenzima fosfato de piridoxal

(PLP), ambos importantes en la transaminación del GABA. La constante de disociación

del GABA fue de 672.86 M, cuyo valor coincide con el valor experimental reportado

que es de 790 + 110 M21

, y el determinado en este trabajo que fue de 847.4 + 73.5 M.

Figura 65. Interacción del GABA en el sitio activo de la GABA-AT.

De la misma manera que fue analizado el GABA fueron probados el par

enantiomérico de la vigabatrina (Figuras 66A y 66B). Como se puede apreciar en la

Figura 66A que corresponde a la vigabatrina-R está relativamente cerca del PLP y la

LYS269 con los cuales reacciona para formar un aducto de tipo covalente con la enzima

inhibiéndola de manera irreversible. Los mismo sucede con el isómero vigabatrina-S

(Figura 66B), aunque este ligando aparece un poco más alejado del PLP y la LYS269;

sin embargo, no hay una diferencia muy grande entre ellas, de hecho para la (R)-VGB

su KD es de 195.97 M, mientras que para la (S)-VGB es de 78.92 M.

107

A B

Figura 66. A. Interacción con la R-vigabatrina. B. Interacción con la S-vigabatrina.

108

6.3 CINÉTICA ENZIMÁTICA

Para la determinación de la actividad de la enzima aminotransferasa del GABA

(GABA-AT) de Pseudomonas fluorescens in vitro, fue utilizada una reacción

enzimática acoplada con la enzima semialdehído succínico deshidrogenasa (SSDH),

monitoreando el incremento de la concentración del NADPH (Dinucleótido de

nicotinamida y adenina fosfato) producido en la reacción (Figura 67), y seguida por

espectrofotometría UV-Vis.20, 21,48

H3N

O

O

OO

H

O

O

O

H3N

O

O

NADP

PMP

SSDH

O

O

O

O

H

O

O

O

O

O

O

O

O

GABA-AT

PLP

L-Glutamato -Cetoglutarato

GABA Semialdehído Succínico

GABA-AT

Semialdehído Succínico Succinato

NADPH + H

Figura 67. Reacción enzimática acoplada llevada a cabo en la determinación de la actividad de GABA-

AT de P. fluorescens.

Al inicio de los ensayos de cinética enzimática se evaluó la actividad de la enzima y

se normalizaron las condiciones de experimentación, esencialmente el tiempo de

incubación para la temperatura de 25 °C a pH = 8.6. Se probaron diferentes

concentraciones de sustrato (GABA) en escala logarítmica (0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2 y 6.4

mM) a una concentración final de GABA-AT de 0.0209 mg/mL.

Se monitoreó el incremento de la concentración de NADPH en función del tiempo

para cada una de las concentraciones (Figura 68).

109

A = 0,0041t - 0,0018

r2 = 0,9981

A = 0,0093t + 0,0085

r2 = 0,9992

A = 0,0135t - 0,0047

r2 = 0,9995

A = 0,0287t - 0,0257

r2 = 0,9994

A = 0,0305t - 0,0289

r2 = 0,9996

A = 0,0303t - 0,044

r2 = 0,9992

-0.10

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.80

0.90

1.00

0 5 10 15 20 25 30 35

tiempo (min)

Ab

so

rba

nc

ia GABA 0.2 mM

GABA 0.4 mM

GABA 0.8 mM

GABA 1.6 mM

GABA 3.2 mM

GABA 6.4 mM

Lineal (GABA 0.2 mM)






Figura 68. Gráfico que muestra la actividad de la enzima GABA-AT a distintas concentraciones de

sustrato en función del tiempo.

Los resultados fueron los esperados, es decir, según la teoría enzimática de Michaelis-

Menten49

muestra que la actividad enzimática aumenta de manera lineal con una

cinética de orden uno como función de la concentración de sustrato hasta que la

cantidad de enzima se satura y la actividad permanece constante siguiendo una cinética

de orden cero. Fueron determinadas las regresiones lineales por mínimos cuadrados de

cada recta y obtenida la pendiente que corresponde a la constante experimental de

rapidez. Estas constantes fueron graficadas como función de la concentración de

sustrato y fue obtenida la curva típica de tipo Michaelis-Menten (Figura 69).

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

[GABA] (mM)

k

Curva de Michaelis- Menten

Figura 69. Representación de la actividad enzimática de GABA-AT como función de la concentración de

GABA. Curva de Michaelis-Menten.

110

Para estimar la constante de Michaelis-Menten se usó el método de Hanes-Wolff

(Figura 70): 49

([S]/Act) = [S](1/rmáx) + (Km/rmáx)

Donde [S] es la concentración de sustrato, Act es la actividad enzimática, rmáx es la

rapidez máxima y Km la constante de Michaelis-Menten.

(C/k) = 26.75C + 30.96

r² = 0.964

0.0

50.0

100.0

150.0

200.0

250.0

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

[GABA] (mM)

[GABA]/k Hanes-Wolff

Lineal (Hanes-Wolff)

Figura 70. Determinación de los parámetros cinéticos de la GABA-AT por el método de Hanes-Wolff.

Realizando los cálculos pertinentes se obtuvieron los siguientes valores: rmáx = 0.0373

y Km = 1.1573 mM muy cercano al valor reportado.21

Una vez determinada la actividad de GABA-AT y determinado el tiempo de

incubación, se probaron los aductos Diels-Alder sintetizados (la mezcla de

regioisómeros 6a-d y 7a-d, 11a-d, 14a-d y la mezcla de regioisómeros 17a-d y 18a-d)

y vigabatrina como control positivo.

Los primeros ensayos fueron a manera de rastreo, es decir, se comparó la

concentración de 0.8 mM de GABA (control) contra 0.8 mM de cada aducto o

vigabatrina. El criterio que se utilizó fue que aquellos compuestos que inhibieran a la

enzima por arriba del 40 % se estudiarían más a fondo obteniendo una cinética completa

a distintas concentraciones del inhibidor. Los resultados obtenidos se muestran en la

Tabla 33.

111

Tabla 33. Cernimiento de actividad inhibitoria de los aductos Diels-Alder sintetizados, comparados

con GABA a una concentración de 0.8 mM.

Compuesto % inhibición + EEM

6a y 7a 28.18 + 4.82

6b y 7b 57.39 + 0.67

6c y 7c 37.79 + 0.25

6d y 7d ND

11a 38.35 + 7.03

11b 27.40 + 8.78

11c 27.53 + 7.00

11d 38.74 + 7.77

14a 9.10 + 1.78

14b 13.82 + 1.40

14c 13.84 + 1.59

14d ND

17a y 18a No inhibe

17b y 18b 19.44 + 1.17

17c y 18c ND

17d y 18d ND♠

Vigabatrina 49.19 + 0.66

*EEM: Error Estándar de la Media para n = 6. ND: no determinado. ND♠

: no determinado por

insolubilidad en el medio

Los resultados obtenidos muestran una inhibición por arriba del 40% para la mezcla

de regioisómeros 6b y 7b derivados de isopreno, mismo que muestran una inhibición 7

% más alta que la vigabatrina, por lo que esta mezcla resultó interesante, por lo que fue

realizado un estudio cinético más profundo a diferentes concentraciones (0.25, 0.50,

1.00 y 2.00 mM) para determinar el tipo de inhibición que presenta dicha mezcla y su

constante de inhibición Ki.

La mezcla de regioisómeros muestra una inhibición competitiva debido a que la

rapidez máxima (rmáx) no cambia sustancialmente en presencia del inhibidor (Figura

71); es decir, por lo menos alguno de los regioisómeros se une en el sitio activo de la

GABA-AT.

112

(1/Act) = 0.5821(1/[S]) + 0.6869

r = 0.9422

(1/Act) = 1.1116(1/[S]) + 0.4923

r = 0.7852

(1/Act) = 1.8007(1/[S]) + 0.3806

r = 0.8840

(1/Act) = 2.3163(1/[S]) + 0.5067

r = 0.9227

(1/Act) = 5.2345(1/[S]) + 0.4986

r = 0.8567

-5.00

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

-1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00

1/[GABA] (1/mM)

1/A

ct

(mg

.min

/

mo

l)

[I] = 0.00 mM

[I] = 0.25 mM

[I] = 0.50 mM

[I] = 1.00 mM

[I] = 2.00 mM

Lineal ([I] = 0.00 mM)





Figura 71. Análisis del tipo de inhibición de la mezcla de regioisómeros 6b y 7b por el método de la

doble recíproca de Lineweaver-Burk: (1/r0) = (Km/rmáx)(1/[S]) + 1/rmáx; donde r0 es la rapidez a cierta

concentración de sustrato, [S] es la concentración de sustrato. Análisis de regresión lineal por mínimos

cuadrados. Parámetros analizados con la prueba t de Student. n = 6. Los coeficientes de regresión lineal

(r) y las pendientes (B) fueron estadísticamente significativas (p < 0.001). Las ordenadas al origen (A) no

difieren de cero (p > 0.20), excepto para la línea recta con [I] = 0.00 mM con p < 0.001.

Después de este análisis se determinaron los parámetros cinéticos (Km, rmáx y Ki)

(Tabla 34) para la mezcla de regioisómeros 6b y 7b. La Ki fue determinada por el

método de Schild49

(Figura 72).

Tabla 34. Parámetros cinéticos de la mezcla de regioisómeros sobre la enzima GABA-AT.

Parámetros Valor + EEM

rmáx (mol/mg.min) 1.4558 + 0.1756

Km (mM) 0.8474 + 0.0735

Ki (mM) 0.2703 + 0.0262

nH 0.9915 + 0.0828

EEM: Error estándar de la media.

Es importante señalar que los valores obtenidos para la mezcla de regioisómeros, la

rapidez máxima (rmáx) y la constante de Michaelis (Km) son valores esperados según la

teoría que dice que el valor de Km es la mitad de la rmáx (Figura 73).

113

[(B'/B)-1] = 0.9915 log[I] + 3.5378

r = 0.9859

-0.20

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

-4.00 -3.50 -3.00 -2.50 -2.00 -1.50 -1.00 -0.50 0.00

log [I] (M)

[(B

'/B

)-1]

Aductos 6b y 7b

Lineal (Aductos 6b y 7b)

Figura 72. Determinación de la Ki por el método de Schild: log[(B’/B)-1] = nHlog[I] – nHlogKi. B’:

pendiente en presencia de inhibidor, B: pendiente sin inhibidor, nH: coeficiente de Hill, Ki: constante de

inhibición. Análisis de regresión lineal por mínimos cuadrados. Parámetros analizados con la prueba t de

Student. El coeficiente de regresión lineal (r), la pendiente (B) y la ordenada al origen (A) fueron

estadísticamente significativos (p < 0.02).

Cinética de Michaelis-Menten de la mezcla de regioisómeros

6b y 7b

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

0 1 2 3 4 5 6 7

[GABA] (mM)

Act

( m

ol/

mg

.min

)

Aductos 6b y 7b

rmáx

Km

Figura 73. Gráfica de Michaelis mente descrita por la enzima GABA-AT según la ecuación:

r0 = (rmáx [S])/ (Km + [S])

De igual manera se pudo corroborar que la mezcla de regioisómeros 6b y 7b

representa un inhibidor competitivo de la enzima GABA-AT con una afinidad 3 veces

mayor que su sustrato (GABA) aproximadamente. El valor de nH indica el número de

114

sitios de unión que posee la enzima, es decir, solo una molécula puede unirse al sitio

activo de la enzima.

Por otra parte, es importante destacar el valor de Km obtenido es reproducible ya que

coincide con el reportado en la literatura21

que es de 0.79 + 0.11 mM, y aparentemente

la mezcla de regioisómeros inhibe de manera más eficaz a la enzima que la vigabatrina

(Tabla a) puesto la Ki es de 26 + 3 mM, mientras que para 6a y 7a es de 0.27 + 0.0262

mM, es decir, es aproximadamente 10 veces más potente que la primera.

115

6.4 MODELO IN VIVO DE LAS CONVULSIONES INDUCIDAS CON

PENTILENTETRAZOL

Los modelos animales en el laboratorio son de gran utilidad para evaluar los efectos

farmacológicos de sustancias nuevas y conocidas, en investigación sobre epilepsia, sin

embargo, para que sean útiles al investigador es importante que cumplan con ciertos

propósitos50

(Tabla 35).

Tabla 35. Propósitos que persiguen los modelos animales para la evaluación de sustancias nuevas o

conocidas50

.

PROPÓSITOS PROPÓSITOS ANTICONVULSIVOS

1° Búsqueda de nuevas sustancias antiepilépticas

2° Evaluación de las posibles eficacias específicas de aquellos

compuestos nuevos que han mostrado la actividad anticonvulsiva

sobre los distintos tipos de crisis o epilepsias

3° Estos modelos pueden emplearse para clasificar la eficacia preclínica

de nuevos compuestos durante la administración a largo plazo

4° Se usan para la determinación del mecanismo de acción por el cual

los agentes anticonvulsivos nuevos o conocidos ejercen sus efectos

farmacológicos

5° Ciertos modelos pueden usarse para estudiar los mecanismos de

resistencia a los fármacos en la epilepsia

6° Los modelos con animales epilépticos son de utilidad para estudiar si

la epileptogénesis altera el potencial de efectos adversos de un

fármaco dado, debido a que la disfunción cerebral crónica pueda

conducir a una alteración de la sensibilidad

7° Estudiar la fisiopatología de la epilepsia y las crisis epilépticas

Los modelos animales más comúnmente utilizados para probar nuevos compuestos

son el de convulsiones inducidas con electrochoque máximo (MES) y el de inducción

de crisis convulsivas con pentilentetrazol (PTZ).

Se piensa que la prueba MES, en el que las contracciones clónicas de la pantorrilla

son inducidas por la estimulación eléctrica corneal bilateral o transauricular puede ser

predictivo de la eficacia anticonvulsiva contra las convulsiones tónico-clónicas

116

generalizadas; mientras que la prueba de inducción química de convulsiones con PTZ,

en la cual las convulsiones mioclónicas y clónicas generalizadas son inducidas por la

administración (generalmente subcutánea) sistémica de dosis convulsionantes de PTZ,

representa un modelo válido para la ausencia generalizada y/o las convulsiones

mioclónicas en humanos pero su validez predictiva está muy lejos de lo deseable.50

Además de estos modelos animales el modelo kindling (estimulación eléctrica breve y

periódica de la amígdala del lóbulo temporal) ha predicho correctamente el efecto

clínico de los fármacos antiepilépticos utilizados actualmente contra la enfermedad.

El pentilentetrazol (cardiazol, Figura 74) es un fármaco analéptico cardiorrespiratorio6

clasificado como un estimulante general inespecífico del S.N.C. por bloqueo de la

inhibición neuronal1; sin embargo, estudios recientes muestran que el PTZ se une

específicamente al sitio de picrotoxina (Figura 75) del receptor GABAA al demostrar su

unión al receptor GABAA recombinante.51

N

N

N

N

Figura 74. Pentilentetrazol (PTZ).

CH3

H

O

O

H

HO

H

H

O

CH3

CH2

O

O

Figura 75. Picrotoxina: psicoestimulante que aumenta los niveles de actividad motriz y cognitiva,

refuerza la vigilia, el estado de alerta y la atención, y se ha utilizado como antídoto para la intoxicación

con barbitúricos, ya que la picrotoxina es un antagonista no competitivo del receptor GABAA.

La determinación de la dosis mínima efectiva del PTZ, es de suma importancia debido

a que tal dosis asegura que prácticamente el total de la población utilizada en los

ensayos (controles y muestras) presente las crisis convulsivas inducidas con PTZ y

poder hacer de manera más precisa (minimizando errores) el análisis del efecto

protector de los compuestos a utilizar sobre las convulsiones de inducción química en

general.

http://es.wikipedia.org/wiki/Alerta

http://es.wikipedia.org/wiki/Atenci%C3%B3n

117

Para realizar la prueba del efecto protector de sustancias anticonvulsivantes conocidas,

así como de compuestos de los que no se conoce su actividad, se determinó la dosis

efectiva mínima cuya metodología está ampliamente descrita en la literatura sobre la

determinación de la dosis efectiva 95 (DE95).52,53,54

De acuerdo con lo anterior se realizó una curva dosis-respuesta cuantal para la

determinación de la DE95 utilizando las dosis de 35, 50, 65, 80, 95, 110 y 125 mg/kg de

PTZ. Al realizar este ensayo fueron contabilizados el número de ratones que

presentaron crisis convulsivas del tipo tónico-clónicas, así como el número de crisis

convulsivas presentadas (Tabla 36).

Tabla 36. ensayo preliminar de determinación de la DE95 de PTZ.

DPTZ

(mg/kg)

35 50 65 80 95 110 125

No. de

CC

totales

0

1

14

20

22

11

17

Muerte

(%)

0 0 0 0 0 80 100

CC: crisis convulsiva. n = 10 para cada una de las dosis de 35 a 95 mg/kg. n = 5 para las dosis de 110 y

125 mg/kg.

El ensayo preliminar permitió observar que a dosis bajas como la de 35 mg/kg, ningún

ratón presentó alguna crisis convulsiva, y en contraste a las dosis más altas (110 y 125

mg/kg) los ratones presentaron crisis convulsivas y muerte.

La curva dosis respuesta cuantal fue construida por el método logit con las dosis de 35

a 95 mg/kg que fueron aquellas dosis en donde no fue observada la muerte. (Figura 76).

118

log [p/(1-p)] = 8.9046 logD - 16.22

r2 = 0.902

-3.00

-2.00

-1.00

0.00

1.00

2.00

3.00

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50

log D (mg/kg)

p/(

1-p

)

PTZ

Lineal (PTZ)

Figura 76. Curva dosis respuesta cuantal de crisis convulsivas para la determinación de la DE95 de PTZ

bajo el método logit.

Derivado de este análisis fue determinada la DE95 que fue de 92.3 mg/kg, sin

embargo, normalmente, la literatura recomienda utilizar la dosis entre 100 y 110

mg/kg55

sobre todo para aquellos fármacos ampliamente probados y que usualmente se

utilizan como estándares o moléculas nuevas con mucha actividad; no obstante, fue

escogida una dosis menor a las antes mencionadas con el propósito de observar si los

aductos, en particular la mezcla 6b y 7b (que inhiben a la enzima GABA-AT) presentan

actividad anticonvulsiva con una dosis moderada de PTZ (DE75 = 75 mg/kg).

Los primeros experimentos fueron de estandarización, para ello se inició con la

vigabatrina (VGB) como control positivo, puesto que es el principal inhibidor de

GABA-AT14

y utilizado como anticonvulsivo de segunda elección para tratamiento de

convulsiones parciales y el síndrome de West.26

Fue de suma importancia realizar los experimentos con VGB puesto que es inhibidor

de la GABA-AT y es un fármaco que se utiliza actualmente; sin embargo, la literatura

menciona ciertas controversias sobre la VGB y su efectividad en el modelo in vivo de

las convulsiones con PTZ, algunas mencionan que es inefectiva48

, mientras que otros

estudios demuestran su actividad de protección contra convulsiones inducidas en este

modelo52,56

y otras su efectividad clínica contra convulsiones parciales pero no crisis

generalizadas.57

119

Inicialmente fueron probadas las dosis de VGB de 1, 3, 5, 7 y 9 mmol/kg por este

modelo con un tiempo de pretratamiento con el fármaco de 240 min. La administración

se realizó vía intraperitoneal (ip). Posteriormente se administró el PTZ por vía

subcutánea (sc) a la dosis de 110 mg/kg. Los resultados de este experimento sobre los

ratones fueron los siguientes (Tabla 37):

Tabla 37. Efectos de la VGB en el modelo de las convulsiones inducidas con PTZ (D = 110 mg/kg).

DVGB

(mmol/kg)

CC (%) No. de CC

totales

Latencia + EEM

(min)

Protección por

latencia (%)

Control 100 9 0.66 + 0.12 0.00

1.0 100 12 2.90 + 0.40 77.15

3.0 100 14 3.81 + 0.51 82.62

5.0 80 7 6.28 + 0.65 89.45

7.0 80 6 7.33 + 2.15 90.94

9.0 60 8 9.86 + 5.09 93.27

CC: Crisis convulsivas. EEM: Error Estándar de la media. Los porcentajes fueron obtenidos con una n =

5 para cada dosis.

Estos resultados muestran que prácticamente la VGB no protege contra el número de

crisis convulsivas tónico-clónicas inducidas con el PTZ salvo la dosis de 9 mmol/kg que

protege al 40 %; sin embargo, el efecto global muestra que no hay diferencia

significativa en el número de crisis presentadas de manera general comparado con el

grupo control; no obstante, puede observarse un efecto interesante de la VGB, el cual

consistió en incremento de latencia a la primera crisis convulsiva con respecto al

control, cuyo efecto es dependiente de la dosis (Figura 77).

120

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

16.0

Control 1 3 5 7 9

DVGB (mmol/kg)

La

ten

cia

(m

in)

Latencia

**

*

*

*

Figura 77. Efecto de la VGB sobre la latencia a la primera crisis convulsiva tónico-clónica. ANOVA de

una vía, el análisis de medias fue realizado por el método de Duncan; * p < 0.005

Los resultados del efecto dosis-dependiente de la VGB sobre la latencia a la primera

crisis convulsiva tónico-clónica inducida con PTZ son satisfactorios, sin embargo, no

fue suficiente, puesto que se requería un efecto protectivo contra el número de crisis

convulsivas. Por tal motivo se realizó un ensayo preliminar a la dosis de 75 mg/kg

(DE75) de PTZ para inducir las crisis (Tabla 38).

Tabla 38. Efectos de la VGB en el modelo de las convulsiones inducidas con PTZ (D = 75 mg/kg).

DVGB

(mmol/kg)

CC (%) No. de CC totales Latencia + EEM (min)

Control 100 6 7.54 + 1.45

1.0 20 1 11.80

3.0 0 0 SCC

5.0 0 0 SCC

7.0 0 0 SCC

9.0 0 0 SCC

CC: Crisis convulsivas; SCC: Sin crisis convulsivas durante el período de observación. EEM: Error

Estándar de la Media.

Este ensayo mostró que las dosis utilizadas de VGB contra las convulsiones inducidas

con PTZ son efectivas desde 1.0 a 9.0 mmol/kg, como puede apreciarse en la tercera

121

columna; mientras que en la cuarta, para la menor dosis (1.0 mmol/kg) el tiempo de

retardo del ratón que presentó la crisis convulsiva fue a los 11.80 min, casi 4 min

después de la primera crisis convulsiva que presentó el grupo control.

Determinada la efectividad de la VGB contra el número de crisis convulsivas se

realizó el bioensayo con la mezcla de 6b y 7b tomando como control positivo a la VGB

a la misma dosis, midiéndose de igual manera el número de crisis convulsivas tónico-

clónicas presentada por los sujetos experimentales y el tiempo de latencia a la primera

crisis convulsiva (Tabla 39).

Tabla 39. Bioensayo sobre los compuestos 6b y 7b utilizando como control positivo a VGB contra la

dosis de PTZ de 75 mg/kg.

D (mmol/kg) CC (%) No. de CC totales Latencia + EEM (min)

Control 94.1 16 5.49 + 0.76

0.2 (6b y 7b)* 100.0 18 4.77 + 0.35

0.5 (6b y 7b)♠ 52.9** (15.0)

♣ 9 3.92 + 0.39

1.0 (6b y 7b)♠ 57.1 (53.3)

♣ 4 7.91 + 2.91

0.2 (VGB) 83.3 5 4.99 + 0.76

0.5 (VGB) 25.0** 3 5.78 + 0.91

1.0 (VGB) 26.7** 4 7.84 + 1.88

CC: Crisis convulsivas. EEM: Error Estándar de la Media. *Bioensayo realizado en disolución de los

aductos; ♠ bioensayos realizados en suspensión de los aductos,

♣ porcentaje de ratones muertos a la dosis

indicada. ** Estadísticamente significativo con respecto al control bajo la prueba exacta de Fisher p <

0.01

En esta tabla fueron analizados el número de ratones que presentaron crisis convulsiva

contra aquellos que no las presentaron, la dosis de VGB 1.0 mmol/kg mostró diferencia

significativa con respecto al control, por lo que este fármaco demuestra que hay una

disminución en el número de convulsiones inducidas con PTZ; en el mismo sentido

pueden apreciarse las diferencias significativas entre los experimentos probados a la

dosis de 0.5 mmol/kg tanto de VGB como de los aductos (6b y 7b) con respecto al

control en la protección de las convulsiones inducidas con PTZ; no obstante, es

necesario mencionar que no hay diferencia significativa entre VGB y 6b-7b (prueba

exacta de Fisher mostró p = 0.1030) lo que significa que por lo menos uno de los

122

aductos de la mezcla 6b-7b muestra actividad sobre la protección de crisis convulsivas

comparable con la VGB; es decir, tiene un una actividad anticonvulsiva similar. Estos

experimentos sugieren que la actividad anticonvulsiva mostrada por los aductos Diels-

Alder 6b-7b pudieran estar asociados a su actividad inhibitoria sobre la enzima

aminotransferasa del GABA.

Por otro lado, es importante destacar que la mezcla de regioisómeros 6b-7b mostró

cierta toxicidad en la dosis de 0.5 y 1.0 mmol/kg cuya manifestación fue la muerte de

los sujetos experimentales en una relación aparente dosis-dependiente.

El siguiente análisis que se llevó a cabo fue la comparación de la latencia a la primera

crisis convulsiva (Figura 78).

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

Control VGB=0.2 VGB=0.5 VGB=1.0 Aductos=0.2 Aductos=0.5 Aductos=1.0

Dosis (mmol/kg)

Late

ncia

(m

in)

Control

VGB=0.2

VGB=0.5

VGB=1.0

Aductos=0.2

Aductos=0.5

Aductos=1.0

Figura 78. Gráfico que muestra el efecto sobre la latencia a la primera crisis convulsiva para las distintas

dosis de VGB (rojo), aductos (amarillo) en comparación con el grupo control (verde). Se muestran barras

que corresponden a la media + EEM. Los datos fueron analizados con la prueba t de Student. Todos los

resultados presentaron una p > 0.05.

Estos resultados no mostraron alguna diferencia significativa sobre la latencia para

provocar alguna crisis convulsiva tanto de la VGB como de los aductos (6b-7b); es

importante señalar para el caso de los aductos, sobre todo a la dosis de 0.5 mmol/kg la

gráfica muestra una tendencia a la baja en la latencia en la generación de la primera

crisis convulsiva, es decir, aparentemente hay una sensibilización a la generación de la

crisis.

123

Resulta de interés el efecto mostrado con los aductos a la 1.0 mmol/kg, que a pesar de

ser muy tóxica, tiene una tendencia ascendente en el tiempo de retardo, es decir, que

retrasa la generación de la crisis convulsiva con respecto al grupo control; sin embargo,

esta dosis resultaría difícil trabajarla debido a su alta toxicidad.

Por último, las observaciones hechas hacia los ratones en el período de pre-

tratamiento con los aductos (6b-7b) a la dosis de 0.5 mmol/kg, entre los minutos 3 a 5

presentaron letargo con temblores en la extremidades anteriores, cabeza y cola, así

como parpadeo frecuente.

124

7. CONCLUSIONES

Se sintetizaron con buenos rendimientos los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d que

corresponden a los dienófilos de las reacciones de Diels-Alder.

Al intentar sintetizar los aductos Diels-Alder 6a-d y/o 7a-d derivados de

isopreno (2) bajo condiciones térmicas, se generaron otros compuestos

correspondientes a aductos derivados de la N-fenilmaleimida 4a-d.

Los productos 4a-d se analizaron detenidamente a través de los espectros de

RMN en una y dos dimensiones, y se llegó a la conclusión de que se trataba de

los aductos Diels-Alder derivados de la N-fenilmaleimida 4a-d.

Se llevó a cabo el análisis conformacional de los aductos 4a-d, por estimación

de las constantes de acoplamiento de los confórmeros más estables determinados

por cálculos teóricos, mismas que se compararon con las constantes

experimentales, llegando a la conclusión de que el confórmero más estable para

los compuestos 4a-d es el bote-syn.

De acuerdo con lo anterior se propuso una reacción multicomponentes (MCR)

con los reactivos anhídrido maleico (1), isopreno (2) y las anilinas 3a-d bajo las

misma condiciones térmicas, generando los aductos 4a-d.

Bajo distintas condiciones de reacción fue posible dilucidar la secuencia de

pasos que toma la MCR para generar los aductos 4a-d, observando que la

primera reacción corresponde a la formación de los ácidos N-fenilmaleámicos

5a-d, el segundo paso corresponde a la formación de la mezcla de regioisómeros

6a-d y 7a-d, seguida de la tercera reacción por ciclización intramolecular por

pérdida de una molécula de agua.

A consecuencia de las reacciones anteriores se propuso una ruta sintética alterna

para sintetizar los aductos Diels-Alder propuestos (6a-d, 7a-d, 11a-d y 14a-d),

que consistió en generar en primer lugar los aductos Diels-Alder entre anhídrido

maleico (1) y los distintos dienos: isopreno (2), ciclopentadieno (9) y furano

(12); la estereoquímica de los aductos de 2 y 9 fue endo y exo, respectivamente.

Se sintetizaron y caracterizaron los aductos 6a-d, 7a-d, 11a-d y 14a-d bajo el

método propuesto, con rendimientos de moderados a buenos, con la mención de

que no hubo regioselectividad en la obtención de los aductos derivados de

isopreno.

125

Se sintetizaron y caracterizaron los ácidos N-fenilfumarámicos (16a-d) con

rendimientos buenos, constatando que se trataba de los compuestos con

configuración E.

Se sintetizaron y caracterizaron bajo condiciones térmicas los aductos Diels-

Alder derivados de isopreno a partir de los ácidos 16a-d obteniéndose la mezcla

de regioisómeros 17a-d y 18a-d. A diferencia de los dienófilos Z, la reacción

generó los aductos esperados, puesto que la configuración de los dienófilos 16a-

d al formarse el aducto no permite la ciclización intramolecular para formar la

imida.

El análisis de alineación mostró que la secuencia de Pseudomonas fluorescens

tiene alta homología con la GABA-AT de Escherichia coli, y con menor

homología con la de Mus musculus, Sus scrofa y Homo sapiens; sin embargo, el

sitio activo en todas las especies está altamente conservado.

Se modeló la GABA-AT de Pseudomonas fluorescens tomando como secuencia

molde la GABA-AT de Escherichia coli, cuya estructura ha sido resuelta por

difracción de rayos X.

La estructura modelada se minimizó con la coenzima PLP para generar las

mejores condiciones de interacción ligando-enzima.

Se construyeron todos y cada uno de los posibles aductos Diels-Alder derivados

de isopreno, ciclopentadieno y furano de los ácidos N-arilmaleámicos y N-

arilfumarámicos, obteniendo la estructura de mínima energía al nivel HF/3-21G.

Se realizaron los estudios de Docking de los aductos sobre la GABA-AT

modelada, así como del GABA y de la VGB. Los aductos Diels-Alder, GABA y

VGB se unen al sitio activo de la enzima GABA-AT, teniendo relevancia las

interacciones con los aminoácidos ILE51, TYR139, ARG142 y TYR156, que

más frecuentemente aparecen en los estudios de Docking y que se relacionan

estrechamente con la constante de disociación.

Los aductos derivados de isopreno mostraron buena interacción en el sitio activo

de la enzima, siendo los derivados de ácido fumárico más afines que los del

ácido maleico. En relación a los aductos derivados de ciclopentadieno, de

manera general los isómeros con configuraciones RS y RR fueron más afines al

sitio activo que sus respectivos enantiómeros SR y SS, respectivamente.

126

La interacción ligando-enzima asistida por computadora mostró la interacción

del GABA en el sitio activo con una KD = 672.86 M, mientras que la Km

experimental fue de 847.4 M cuyos valores presentan una buena correlación.

Se evaluaron los aductos sintetizados a la concentración 0.8 mM contra GABA

0.8 mM contra la enzima GABA-AT de Pseudomonas fluorescens, siendo la

mezcla de regioisómeros 6a-d y 7a-d la más activa de todos, mostrando una

inhibición del 57 %.

De acuerdo a lo anterior la mezcla de regioisómeros 6a-d y 7a-d mostró una

inhibición de tipo competitiva hacia la enzima, deduciendo que estos

compuestos se unen en el sitio activo de la proteína con una Ki de 0.27 mM,

cuya afinidad es 10 veces mayor que la VGB.

La mezcla de regioisómeros 6b y 7b mostró una actividad anticonvulsiva

comparable con la de la vigabatrina en términos de la protección de las

convulsiones inducidas con PTZ a la dosis de 0.5 mmol/kg.

La dosis de 1.0 mmol/kg de la mezcla de regioisómeros 6b y 7b muestra alta

toxicidad, puesto que aproximadamente la mitad de los sujetos experimentales

presentaron muerte.

127

8. PARTE EXPERIMENTAL

8.1 Instrumentación

Las materias primas, reactivos y productos se pesaron en balanzas analíticas Sartorius

CP224 S y Scientech SP500. Las reacciones se llevaron a cabo en las parrillas de

agitación y calentamiento Fisher, y Corning. Las reacciones de Diels-Alder térmicas, se

llevaron a cabo en un tubo de presión ACE Glass Incorporated. La concentración de los

productos se realizó en un evaporador rotatorio Yamato Rotary Evaporator RE50. Los

puntos de fusión tanto de las materias primas como productos se determinaron en un

aparato de punto de fusión Mel-Temp II Laboratory Devices Inc. U.S.A.; los puntos de

fusión no están corregidos. Para la determinación del Rf de las materias primas y

productos se emplearon cromatofolios de aluminio ALUGRAM SIL 20×20 cm

recubiertos con gel de sílice 60F254 (Micherey-Nagel). El revelado se realizó con una

lámpara de UV UVP modelo UVS-18.

La determinación de los espectros de ultravioleta (UV), y la medición de la

absorbancia de los experimentos de cinética enzimática se midieron en un

espectrofotómetro UV-Vis Beackman Coulter DU 650. Los espectros de infrarrojo (IR)

se determinaron en un espectrofotómetro Spectrum One FT-IR de Perkin Elmer. Los

espectros de resonancia magnética nuclear de 1H,

13C y bidimensionales se obtuvieron

de un espectrómetro Varian VNMRS-500 a 500 MHz (125.787 MHz para 13

C), o en un

espectrómetro Varian Mercury a 300 MHz (75 MHz para 13

C). Los espectros de masas

de alta resolución se obtuvieron de un espectrómetro de masas de impacto electrónico

JEOL GCmateTM

II (EI, 70eV).

Los valores de pH de las disoluciones buffer de fosfatos se obtuvieron de un

potenciómetro Hanna Instruments pH 211 Microprocessor pH Meter. Las disoluciones

de productos a probar en cinética enzimática y en el modelo de convulsiones inducidas

con PTZ se agitaron con un vórtex Constant Speed Mixer, marca Lab-Line. Las

muestras ensayadas en cinética enzimática fueron incubadas en un baño de agua Termo-

Baño Felisa. Se emplearon jaulas de acrílico para observación de los ratones.

Los estudios computacionales se llevaron a cabo en computadoras disponibles en los

grupos de investigación correspondientes en la ENCB y la ESM.

128

8.2 Reactivos

Se utilizaron los siguientes reactivos para la síntesis de todos los compuestos,

purificación y determinación espectral: ácido para-aminobenzoico (Aldrich), ácido

meta-amino benzoico (Aldrich), 4-aminobenzoato de etilo (Aldrich), 3-amino benzoato

de etilo (Aldrich), anhídrido maleico (Sigma), cloruro de fumarilo (Aldrich),

tetrahidrofurano (THF) destilado (ver procedimiento), hexano destilado por destilación

fraccionada, isopreno (Sigma-Aldrich), diciclopentadieno (Aldrich) (ver procedimiento

de obtención de ciclopentadieno), furano (Aldrich), hexano, acetona, metanol y

diclorometano (CH2Cl2, DCM) destilados por destilación fraccionada, tolueno

(Analytyka), agua destilada, sulfato de calcio anhidro (CaSO4, Drierite), nitrógeno (N2,

Infra), bromuro de potasio (KBr, Merck), dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6,

Aldrich), cloroformo deuterado (CDCl3, Aldrich)

Para los experimentos de cinética enzimática se utilizaron los siguientes reactivos:

fosfato dibásico de potasio (K2HPO4, Reactivos Químicos Monterrey S.A. de C.V.),

fosfato monobásico de potasio (KH2PO4, J.T. Baker), glicerol (Productos Químicos

Monterrey S.A. de C.V.), pirofosfato de potasio (K4P2O7, Productos Químicos

Monterrey S.A. de C.V.), ácido clorhídrico concentrado (HClconc., J.T. Baker), ácido 2-

cetoglutárico (Merck), dinucleótido de nicotinamida y adenina sódico oxidado (-

NADP, Sigma), dinucleótido de nicotinamida y adenina fosfato reducido (-NADPH,

Sigma), ácido -aminobutírico (GABA, Merck-Schuchardt), complejo gabasa-

semialdehído succínico deshidrogenasa de (GABA-AT-SSDH, EC de Pseudomonas

fluorescens, polvo liofilizado con 1.1 U/mgprot., Sigma), dinucleótido de nicotinamida y

adenina reducido (-NADPH, Sigma), vigabatrina (tabletas, ver procedimiento de

aislamiento, con agradecimiento por la donación del medicamento a Sandoz S.A. de

C.V. para el desarrollo de este proyecto), agua bidestilada.

Para los experimentos del modelo de convulsiones inducidas con pentilentetrazol

(PTZ) en ratones se utilizaron los siguientes reactivos: Aductos Diels-Alder

previamente sintetizados y purificados, pentilentetrazol (Sigma), vigabatrina (tabletas,

ver procedimiento de aislamiento, Sandoz), cloruro de sodio (NaCl, J.T. Baker), agua

bidestilada.

Todos los reactivos utilizados durante el proyecto tienen grado analítico de pureza.

129

Procedimiento de destilación de tetrahidrofurano (THF)

El THF se dejó en agitación por 12 h en hidruro de litio y aluminio (LiAlH4) bajo

atmósfera de nitrógeno; una vez transcurrido el tiempo se destiló. Después del proceso

de destilación el THF se sometió a reflujo y agitación constante con sodio metálico

(Na°) y benzofenona hasta la aparición de una coloración azul oscura. Posterior a este

proceso de eliminación de oxígeno y humedad, el disolvente se destiló para su uso.58

Procedimiento para la obtención del ciclopentadieno, a partir del

diciclopentadieno

El diciclopentadieno es un dímero obtenido por la cicloadición espontánea de Diels-

Alder de dos moléculas de ciclopentadieno. La reacción ocurre en la dirección opuesta

por calentamiento a alta temperatura, aproximadamente a 140 °C, liberando el

ciclopentadieno, el cual debe emplearse dentro de un período relativamente corto. Así,

entre 20 y 30 mL de ciclopentadieno se colocaron en un matraz bola de 100 mL y se

montaron en un sistema para destilación fraccionada. El calentamiento del matraz

produjo una fracción de ciclopentadieno que destiló aproximadamente a 45 °C, el cual

se recogió en un baño de hielo.59

El ciclopentadieno que no fue empleado

inmediatamente se almacenó a -20 °C por un período máximo de una semana.

Procedimiento de aislamiento de la vigabatrina a partir de tabletas que contienen

500 mg de principio activo

Se tomaron de 2 a 3 tabletas de 500 mg, las cuales se pesaron y trataron de manera

independiente. Cada tableta se colocó en un mortero limpio y seco y se trituró hasta

obtener un polvo fino, el cual se colocó en un vaso de precipitados de 100 mL con 50

mL de agua bidestilada y se dejó en agitación constante durante un período de 3 horas a

temperatura ambiente. La vigabatrina es un producto soluble en agua,60

mientras que el

excipiente es insoluble. Una vez pasado el tiempo, el ingrediente activo fue filtrado a

gravedad de 3 a 4 veces para eliminar el exceso de excipiente. Se redujeron 2/3 del

volumen de agua en el rotaevaporador, y el resto se dejó evaporar a temperatura

ambiente hasta obtener el producto puro. Se determinó el porcentaje de recuperación y

se obtuvieron el punto de fusión y los espectros de RMN de 1H y

13C para identificarla.

130

8.3 Síntesis

Procedimiento general de síntesis de los ácidos N-fenilmaleámicos61,62,63

Se pesaron 2.0 g de las anilinas monosustituidas (3a–d) y aproximadamente 1.1

equivalentes de anhídrido maleico (1), los cuales se disolvieron disueltos por separado

en 20 mL de THF anhidro vía cánula en matraces de bola de 100 mL. La disolución de

1 se adicionó al matraz que contenía la anilina vía cánula, lo cual se llevó a cabo en un

baño de hielo a 0 °C. La reacción se dejó en agitación constante por 16 h a temperatura

ambiente. Después del tiempo de reacción el producto se filtró al vacío con 20 mL de

hexano frío y se caracterizó espectroscópicamente. El producto no sufrió una

purificación posterior.

Ácido N-(4-Carboxifenil)maleámico 5a

NH

OH

O

O

OH

O

12

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

Para esta reacción se siguió el método general, Se pesaron 2.0 g de

3a (0.0146 mol) y 1.57 g (0.0163 mol) de anhídrido maleico (1); la reacción generó un

polvo amarillo con un 90.3% de rendimiento (3.10 g, 0.0132 mol). P.f. 215–216 °C. Rf

= 0.64 (AcOEt/MeOH 1:1). UV-vis (disolución de MeOH): máx = 291.2 + 1.2 nm, con

= 12202.3 M-1

·cm-1

. IR (pastilla de KBr): max 3316, 3018, 1694, 1626, 1581, 1543,

1176 (cm-1

); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm)COO-H (2H,

br)10.61 (1H, s), H-3’ y H-5’ 7.92 (2H, d, 3J = 8.76 Hz), H-2’ y H-6’ 7.74 (2H, d

3J = 8.76 Hz), H-3 6.50 (1H, d,

3J = 11.87 Hz), H-2 6.33 (1H, d,

3J = 11.87 Hz);

13C

RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm) Ar-C-OOR 167.5, C-1 167.4, C-4 164.2, C-4’

143.2, C-3 132.3, C-3’ y C-5’ 131.0, C-2 130.7, C-1’126.1, C2’ y C-6’ 119.3.

Ácido N-(4-Carboetoxifenil)maleámico 5b

NH

OH

O

O

O

O

12

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

Para esta reacción se siguió el método general, Se pesaron 2.0 g

de 3b (0.0146 mol) y 1.30 g (0.0163 mol) de anhídrido maleico (1); la reacción produjo

un polvo blanco en un 89.0% de rendimiento (2.84 g, 0.0107 mol). P.f. 177-179 °C. Rf =

0.74 (AcOEt/MeOH 1:1). UV-vis (disolución de MeOH): máx = 294.4 + 1.7 nm, con

131

= 15691.8 M-1

·cm-1


1584, 1550, 1272, 1177, 867, 853, 772 (cm-1

); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6)

(ppm)COO-H 12.00-13.00 (1H, br), N-H 10.63 (1H, s), H-3’ y H-5’ 7.91 (2H, d, 3J =

8.70 Hz), H-2’ y H-6’ 7.75 (2H, d 3J = 8.70 Hz), H-3 6.48 (1H, d,

3J = 12.00 Hz), H-2

6.33 (1H, d, 3J = 12.00 Hz), C-H2 4.27 (2H, q), C-H3 1.29 (3H, t);

13C RMN (75 MHz,

DMSO-d6) (ppm) C-1 167.6, Ar-C-OOR 166.0, C-4 164.4, C-4’ 143.7, C-3 132.2, C-2

131.0, C-3’ y C-5’ 130.9, C-1’ 125.4, C-2’ y C-6’ 119.5, C-H2 61.2, C-H3 14.9.

Ácido N-(3-Carboxifenil)maleámico 5c

NH

OH

O

O

12

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

OH

O

Se siguió el método general de síntesis. Se pesaron 2.0 g de 3c

(0.0146 mol) y 1.57 g (0.0163 mol) de anhídrido maleico (1), la reacción generó un

producto color beige en 95.8 % de rendimiento (3.05 g, 0.0116 mol). P.f. 215–217 °C.

Rf = 0.53 (AcOEt/MeOH 1:1). UV-vis (disolución de MeOH): máx = 211.2 + 1.6 nm,

con = 29078.8 M-1

·cm-1

. IR (pastilla de KBr): max 3304, 2883, 1713, 1624, 1556,

1555, 1123, 850, 757 (cm-1

); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm)COO-H 12.00-

13.00 (2H, br), N-H 10.53 (1H, s), H-2’ 8.29 (1H, s), H-5’ 7.99 (1H, t), H-6’ 7.83 (1H,

d, 3J = 7.92 Hz), H-4’ 7.66 (1H, d,

3J = 7.92 Hz), H-3 6.48 (1H, d,

3J = 12.04 Hz), H-2

6.32 (1H, d, 3J = 12.04 Hz);

13C RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm) Ar-C-OOR 167.6,

C-1 167.5, C-4 164.0, C-1’ 139.4, C-3 132.2, C-3’ 131.9, C-2 130.8, C-5’ 129.6, C-4’

125.1, C-6’ 124.8, C-2’ 120.7.

Ácido N-(4-Carboetoxifenil)maleámico 5d

NH

OH

O

O

12

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

O

O

CH3

Se siguió el método general para esta reacción. Se pesaron 2.0 g

de 3d (0.0121 mol) y 1.30 g (0.0133 mol) de anhídrido maleico (1), la reacción generó

un polvo color blanco en 77.7 % de rendimiento (2.47 g, 0.0094 mol). P.f. 155–158 °C.

Rf = 0.75 (AcOEt/MeOH 1:1). UV-vis (disolución de MeOH): máx = 291.2 + 1.2 nm,

con = 12202.3 M-1

·cm-1

. IR (pastilla de KBr): max 3312, 1724, 1683, 1592, 1580,

1289, 1112, 848, 761 (cm-1

); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm)COO-H 12.00-

13.00 (1H, br), N-H 10.56 (1H, s), H-2’ 8.28 (1H, s), H-6’ 7.86 (1H, d, 3J = 7.80 Hz),

132

H-4’ 7.66 (1H, d 3J = 7.80 Hz), H-5’ 7.46 (1H, t), H-3 6.47 (1H, d,

3J = 12.00 Hz), H-2

6.32 (1H, d, 3J = 12.00 Hz), C-H2 4.30 (2H, q), C-H3 1.30 (3H, t);

13C RMN (75 MHz,

DMSO-d6) (ppm) C-1 167.7, Ar-C-OOR 166.2, C-4 164.2, C-1’ 139.7, C-3’ 132.2,

C-3 131.4, C-2 131.0, C-5’ 129.9, C-6’ 125.0, C-4’ 124.5, C-2’ 120.5, C-H2 61.8, C-H3

14.5.

Procedimiento general de síntesis de los aductos Diels-Alder derivados de

anhídrido maleico 8, 10a y 1336,39

Se pesaron 5.0 g de anhídrido maleico (1) y colocados en un matraz bola de 100 mL y

disueltos con 20 o 30 mL de dietil éter o AcOEt previamente destilados; por otro lado se

midieron 2.0 equivalentes de los dienos isopreno (2), ciclopentadieno (9) o furano (12),

los cuales se disolvieron por separado en 20.0 mL de dietil éter o AcOEt en una probeta.

La disolución del dieno se adicionó al matraz poco a poco. La reacción se dejó por un

período de 24 h a temperatura ambiente en agitación constante. Una vez terminada la

reacción, el disolvente se evaporó al vacío en el rotaevaporador, se redisolvió en la

mínima cantidad de CH2Cl2 y se precipitó con hexano frío. El producto se filtró a

gravedad y se lavó con 30 mL de hexano. El producto no sufrió una purificación

posterior y se caracterizó espectroscópicamente.

Síntesis de aducto Diels-Alder 8

O

O

O

H3C

1

23

3a4

5

6

7

7a

Se llevó a cabo el método general de síntesis. Se pesaron 5.0 g de 1

(0.0509 mol) y 10.2 mL (0.1019 mol) de 2, la reacción generó un producto color blanco

en 66.0 % de rendimiento (5.60 g, 0.0336 mol). P.f. 58-60 °C. IR (pastilla de KBr): max

3050, 2940, 1860, 1710, 840 (cm-1

); 1H RMN (300 MHz, CDCl3) (ppm)H-

6m), H-7a 3.40 (1H, ddd, 3J = 9.86 Hz,

3J = 7.05 Hz,

3J = 2.94 Hz), H-3a

3.33 (1H, ddd, 3J = 9.86 Hz,

3J = 7.27 Hz,

3J = 2.66 Hz), H-7 2.58 (1H, ddd,

3J = 16.12

Hz, 3J = 6.82 Hz,

3J = 2.94 Hz), H-4 2.50 (1H, dd,

3J = 15.60 Hz,

3J = 2.66 Hz), H-4

2.28 (1H, m), H-7 2.23 (1H, m), C-H3 1.76 (3H, s); 13

C RMN (75 MHz, DMSO-d6)

(ppm) C-3 172.2, C-1 172.0, C-5 134.3, C-6 117.8, C-7a 37.7, C-3a 37.1, C-H3 26.1, C-

7 21.8, C-4 21.2.

133

Síntesis de aducto Diels-Alder 10a

O

O

O

Ha Hb

12

33a

4

5

6

7

8

7a



en 59.0 % de rendimiento (4.93 g, 0.0300 mol). P.f. 155-157 °C. IR (pastilla de KBr):

max 3020, 2970, 1855, 1690, 1430 (cm-1

); 1H RMN (300 MHz, CDCl3) (ppm) H-5 y

H-6 6.32 (2H, dd, 3J = 1.95 Hz), H7a 3.59 (2H, dd

3J = 3.15 Hz,

3J = 1.65Hz), H-4 3.51

(2H, ddd, 3J = 6.75 Hz,

3J = 3.30 Hz,

3J = 1.65 Hz), H-8a 1.79 (1H, dt,

3J = 8.70 Hz,

3J

= 1.65 Hz), H-8b 1.58 (1H, dm, 3J = 9.00 Hz);

13C RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm)

C-1 y C-2 171.5, C-5 y C-6 135.8, C-7a 53.0, C-7 47.3, C-8 46.3.

Síntesis de aducto Diels-Alder 13

O O

O

O

1

23

3a

4

5

6

7

7a



en 51.4 % de rendimiento (4.35 g, 0.0262 mol). P.f. 110-114 °C. Rf = 0.80

(AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3030, 2970, 1860, 1790, 1220, 1210 (cm-

1);

1H RMN (300 MHz, CDCl3) (ppm) H-5 y H-6 6.59 (2H, d,

3J = 0.9 Hz), H-4 y H-7

5.57 (2H, d, 3J = 0.9 Hz), H-3a y H-7a 3.19 (2H, s);

13C RMN (75 MHz, DMSO-d6)

(ppm) C-1 y C-3 167.6, C-5 y C-6 134.7, C-4 y C-7 79.9, C-3a y C-7a 46.4.

134

Procedimiento general de preparación de los aductos Diels-Alder 4a-d a través de

una reacción multicomponente (MCR)

Se pesaron 250 mg de las anilinas (3a–d), 1 equivalente de anhídrido maleico (1) y 2

equivalentes de isopreno (2), los cuales se colocaron en un tubo de presión de 20 mL

con 9.0 mL de tolueno como disolvente. El tubo se cerró y se introdujo en un baño de

arena a 160°C, en agitación constante por 96 horas. Después del tiempo de reacción el

producto se precipitó con hexano frío, se filtró a gravedad y se lavó 2 veces con 20 mL

de hexano a temperatura ambiente. El producto se purificó y caracterizó

espectroscópicamente.

(3aR*,7aS*)-2-(4-Carboxifenil)-5-metil-1,3,3a,4,7,7a-hexahidroisoindol-1,3-diona

4a (MCR).

12

3

4

1'

2' 3'

4'

5'6'

N

H3C

O

O

OH

O

5

6

7

7a

3a

Se siguió el método general, y se pesaron 250 mg (1.823 mmol)

de 3a, 178.8 mg (1.823 mmol) de anhídrido maleico 1 y 0.37 mL (3.646 mmol) de 2; el

producto se recristalizó de una mezcla de CH2Cl2/hexano fría, dicho compuesto fue de

color blanco con un rendimiento de 90.7 % (471.7 mg, 1.653 mmol). P.f. 178–180°C. El

Rf = 0.15 (hexano/AcOEt 6:4). UV-vis (disolución de CH2Cl2): máx = 245.3 + 0.8 nm,

con = 13765.8 M-1

·cm-1

. IR (pastilla de KBr): max 3437, 2935, 1712, 1608, 1456, 791

(cm-1

); 1H RMN (500 MHz, CDCl3) (ppm)COO-H 12.00-13.00 (1H, br), H-3’ y H-5’

(2H, d, 3J = 8.50 Hz), H-2’ y H-6’ 7.42 (2H, d,

3J = 8.50 Hz), H-6 5.63 (1H, br), H-

7a 3.30 (1H, ddd, 3J = 9.51 Hz,

3J = 6.68 Hz,

3J = 2.50 Hz), H-3a 3.25 (1H, ddd,

3J =

9.51 Hz, 3J = 7.50 Hz,

3J = 2.50 Hz), H-7 2.66 (1H, ddd,

2J = 15.50 Hz,

3J = 6.68 Hz,

3J = 2.50 Hz), H-4 2.60 (1H, dd,

2J = 15.50 Hz,

3J = 2.50 Hz), H-4 2.33 (1H, m), H-7

2.28 (1H, m), C-H3 1.78 (3H, s); 13

C RMN (125 MHz, CDCl3) (ppm) C-1 179.2, C-3

179.0, C-OOH 171.2, C-4’ 137.0, C-1’ 136.8, C-3’ y C-5’ 131.2, C-5 129.3, C-2’ y C-6’

126.5, C-6 120.4, C-7a 40.0, C-3a 39.6, C-4 29.1, C-7 24.7, C-H3 23.7; HRMS (EI) m/e

calculada para C16H15NO4 [M+] 285.1001, encontrada 285.0978.

135

(3aR*,7aS*)-2-(4-Carboetoxifenil)-5-metil-1,3,3a,4,7,7a-hexahidroisoindol-1,3-

diona 4b (MCR).

1

23

4

1'

2' 3'

4'

5'6'

N

H3C

O

O

O

O

5

6

7

7a

CH3

3a

Se siguió el método general de síntesis, y se pesaron 250 mg

(1.513 mmol) de 3b, 148.4 mg (1.513 mmol) de anhídrido maleico (1) y 0.30 mL (3.027

mmol) de 2; el producto se recristalizó de una mezcla de CH2Cl2/hexano fría, y se

obtuvo un polvo color blanco con rendimiento de 71.9 % (341.0 mg, 1.088 mmol). P.f.

139–140 °C. El Rf = 0.55 (hexano/AcOEt 6:4). UV-vis (disolución de CH2Cl2): máx =

243.4 + 0.1 nm, con = 14641.8 M-1

·cm-1

. IR (pastilla de KBr): max 3450, 2940, 1709,

1455, 1609, 1279, 755 (cm-1

); 1H RMN (500 MHz, CDCl3) (ppm)H-3’ y H-5’

(2H, d, 3J = 8.75 Hz), H-2’ y H-6’ 7.36 (2H, d,

3J = 8.75 Hz), H-6 5.61 (1H, br), C-H2

4.38 (2H, q), H-7a 3.28 (1H, ddd, 3J = 9.38 Hz,

3J = 6.62 Hz,

3J = 2.50 Hz), H-3a 3.21

(1H, ddd, 3J = 9.38 Hz,

3J = 7.25 Hz,

3J = 2.50 Hz), H-7 2.64 (1H, ddd,

2J = 15.50 Hz,

3J = 6.62 Hz,

3J = 2.50 Hz), H-4 2.58 (1H, dd,

2J = 15.50 Hz,

3J = 2.50 Hz), H-4 2.35

(1H, m), H-7 2.28 (1H, m), C-H3 1.77 (3H, s), C-H3 1.39 (3H, t); 13

C RMN (125 MHz,

CDCl3) (ppm) C-1 180.0, C-3 178.2, C-OOR 166.0, C-4’ 136.8, C-1’ 136.2, C-3’ y C-

5’ 130.6, C-5 130.5, C-6’ 126.3, C-6 120.4, C-H2 61.4, C-7a 40.0, C-3a 39.5, C-4 29.1,

C-7 24.7, C-H3 23.7, C-H3 14.5; HRMS (EI) m/e calculada para C18H19NO4 [M+]

313.1314, encontrada 313.1324.

(3aR*,7aS*)-2-(3-carboxifenil)-5-metil-1,3,3a,4,7,7a-hexahidroisoindol-1,3-diona 4c

(MCR).

1

2

3

4

1'

2' 3'

4'

5'6'

N

H3C

O

O

5

6

7

7a

OH

O

3a

De acuerdo al general, se pesaron 250 mg (1.823 mmol) de 3c,

178.8 mg (1.823 mmol) de anhídrido maleico (1) y 0.37 mL (3.646 mmol) de 2; el

producto se recristalizó de una mezcla de CH2Cl2/hexano fría, y se obtuvo un polvo

color blanco con rendimiento de 76.9 % (399.9 mg, 1.402 mmol). P.f. 197–199 °C. El

Rf = 0.15 (hexano/AcOEt 6:4). UV-vis (disolución de CH2Cl2): máx = 234.4 + 1.5 nm,

con = 10199.5 M-1

·cm-1


720 (cm-1

); 1H RMN (500 MHz, CDCl3) (ppm)COO-H 12.00-13.00 (1H, br), H-4’

(1H, d, 3J = 7.50 Hz), H-2’ 8.01 (1H, s), H-5’ 7.58 (1H, t), H-6’ 7.51 (1H, d,

3J =

136

8.55 Hz), H-6 5.65 (1H, br), H-7a 3.32 (1H, ddd, 3J = 8.20 Hz,

3J = 7.25 Hz,

3J = 2.62

Hz), H-3a 3.26 (1H, ddd, 3J = 8.10 Hz,

3J = 7.94 Hz,

3J = 2.62 Hz), H-7 2.67 (1H, ddd,

2J = 15.38 Hz,

3J = 7.25 Hz,

3J = 2.25 Hz), H-4 2.61 (1H, dd,

2J = 15.38 Hz,

3J = 7.94

Hz), H-4 2.34 (1H, dd, 2J = 15.50 Hz,

3J = 7.50 Hz), H-7 2.30 (1H, m), C-H3 1.80

(3H, s); 13

C RMN (125 MHz, CDCl3) (ppm) C-1 179.5, C-3 179.3, C-OOH 171.0, C-

1’ 136.8, C-3’ 132.7, C-5’ 131.9, C-5 130.8, C-4’ 130.4, C-6’ 129.6, C-2’ 128.4, C-6

120.4, C-7a 40.0, C-3a 39.6, C-4 29.1, C-7 24.7, C-H3 23.7; HRMS (EI) m/e calculada

para C16H15NO4 [M+] 235.1001, encontrada 285.1001.

(3aR*,7aS*)-2-(3-Carboetoxifenil)-5-metil-1,3,3a,4,7,7a-hexahidroisoindol-1,3-

diona 4d (MCR).

12

3

4

1'

2' 3'

4'

5'6'

N

H3C

O

O

5

6

7

7a

O

O

CH3

3a

Siguiendo el método general se pesaron 250 mg (1.513 mmol)

de 3d, 148.4 mg (1.513 mmol) de anhídrido maleico (1) y 0.30 mL (3.027 mmol) de 2;

el producto se disolvió con CH2Cl2 y se filtró por percolación con gel de sílice. El

disolvente se evaporó al vacío en el rotaevaporador, obteniendo un líquido translúcido

color amarillo en un 96.2 % de rendimiento (456.2 mg, 1.456 mmol). El Rf = 0.54

(hexano/AcOEt 6:4). UV-vis (disolución de CH2Cl2): máx = 231.3 + 1.4 nm, con =

10965.1 M-1

·cm-1

. IR: (disolución de CHCl3) max 3451, 2938, 1712, 1277, 1450, 754,

689 (cm-1

); 1H RMN (500 MHz, CDCl3) (ppm)H-4’ (1H, d,

3J = 9.15 Hz), H-2’

7.86 (1H, s), H-5’ 7.45 (1H, t), H-6’ 7.36 (1H, d, 3J = 9.15 Hz), H-6 5.54 (1H, br), C-H2

4.29 (2H, q), H-7a 3.18 (1H, ddd, 3J = 9.38 Hz,

3J = 6.80 Hz,

3J = 2.50 Hz), H-3a 3.12

(1H, ddd, 3J = 9.38 Hz,

3J = 6.80 Hz,

3J = 2.50 Hz), H-7 2.54 (1H, ddd,

2J = 15.62 Hz,

3J = 6.80 Hz,

3J = 2.50 Hz), H-4 2.48 (1H, dd,

2J = 15.50 Hz,

3J = 2.50 Hz), H-4 2.20

(1H, dd, 2J = 15.50 Hz,

3J = 7.13 Hz), H-7 2.16 (1H, m), C-H3 1.69 (3H, s), C-H3 1.30

(3H, t); 13

C RMN (125 MHz, CDCl3) (ppm) C-1 179.3, C-3 179.2, C-OOR 163.7, C-

1’ 136.7, C-3’ 132.6, C-5 131.8, C-5’ 131.0, C-4’ 129.6, C-6’ 129.3, C-2’ 127.8, C-6

120.4, C-H2 61.5, C-7a 39.9, C-3a 39.5, C-4 29.0, C-7 24.6, C-H3 23.6, C-H3 14.5;

HRMS (EI) m/e calculada para C18H19NO4 [M+] 313.1314, encontrada 313.1324.

137

Procedimiento general de preparación de los aductos Diels-Alder 4a-d a partir de

los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d.

Se pesaron 250 mg del ácido N-fenilmaleámico correspondiente (5a–d) y adicionados

2 equivalentes de isopreno (2) y 9.0 mL de tolueno, los cuales fueron depositados en un

tubo de presión ACE de 20 mL. El tubo fue cerrado y se introdujo en un baño de arena a

160°C en agitación constante por un período de 96 h. Después del tiempo de reacción,

el producto fue precipitado con hexano frío y filtrado a gravedad y lavado 2 veces con

20 mL de hexano a temperatura ambiente. El producto fue purificado y caracterizado


Aducto Diels-Alder 4a. Siguiendo el método general se pesaron 250 mg (1.063 mmol)

de 5a y 0.21 mL (2.13 mmol) de 2; el producto fue recristalizado de una mezcla de

CH2Cl2/hexano fría, obteniéndose un polvo color blanco en un 76.8 % de rendimiento

(232.9 mg, 0.816 mmol).

Aducto Diels-Alder 4b. Siguiendo el método general se pesaron 250 mg (0.950 mmol)

de 5b y 0.19 mL (1.90 mmol) de 2; el producto fue recristalizado de una mezcla de

CH2Cl2/hexano fría, obteniéndose un polvo color blanco con un rendimiento del 82.7 %

(246.2 mg, 0.786 mmol).

Aducto Diels Alder 4c. Siguiendo el método general se pesaron 250 mg (1.063 mmol)

de 5c y 0.21 mL (2.13 mmol) de 2; el producto fue recristalizado de una mezcla de

CH2Cl2/hexano fría, obteniéndose un polvo color beige en un 90.2 % de rendimiento

(273.5 mg, 0.959 mmol).

Aducto Diels-Alder 4d. Siguiendo el método general se pesaron 250 mg (0.950 mmol)

de 5d y 0.19 mL (1.90 mmol) de 2; el producto fue disuelto con CH2Cl2 y filtrado por

percolación con gel de sílice. El disolvente fue evaporado al vacío en el rotaevaporador

obteniéndose un líquido translúcido color amarillo con un rendimiento de 64.2 % (231.2

mg, 0.738 mmol).

Método general de preparación de los aductos Diels-Alder 6a-d, 7a-d, 11a-d y 14a-

d a partir de los aductos 8, 10a y 13

Fue pesado 1 equivalente de las anilinas monosustituidas (3a–d) correspondientes y

aproximadamente 1.1 equivalentes de los aductos 8, 10a o 13 correspondiente, los

cuales fueron disueltos por separado en 20.0 mL de THF anhidro vía cánula en matraces

de bola de 100 mL. El matraz que contenía la disolución a los aductos (8, 10a o 13) fue

138

adicionada al matraz que contenía la anilina correspondiente vía cánula. La adición del

aducto a la anilina fue hecha en un baño de hielo a 0 °C. La reacción se dejó en

agitación constante por 16 h a temperatura ambiente. Después del tiempo de reacción el

producto fue filtrado al vacío con 20 mL de hexano frío y fue caracterizado

espectroscópicamente. El producto no sufrió una purificación posterior.

Mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6a y 7a

H3C

NH

OH

O

O

OH

O

1

23

3a4

5

67a

1'2'

3'

4'

5'

6'

7

Para esta reacción se siguió el método general. Se pesaron

0.83 g de 3a (6.054 mmol) y 1.10 g (6.620 mmol) del aducto (8); la reacción generó un

polvo blanco con un 81.6% de rendimiento (1.49 g, 4.91 mmol). P.f. 182-184 °C. El Rf

= 0.84 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3420, 3200, 2990, 1690, 1595,

1530, 1170, 850, 780 (cm-1

); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm) COO-H 11.50-

12.50 (4H, br), N-H 10.09 (1H, s), H-2 10.07 (1H, s), H-3’ y H-7’ 7.86 (2H, d, 3J = 8.70

Hz), H-3’ y H-7’ 7.85 (2H, d, 3J = 8.70 Hz), H-2’ y H-6’ 7.67 (2H, d,

3J = 8.70 Hz), H-

2’ y H6’ 7.66 (2H, d 3J = 9.00 Hz), H-5 o H-6 5.35 (1H, br), H-5 o H-6 5.31 (1H, br),

H7a 3.03 (2H, m), H3a 2.87 (2H, m), H4 y H7 2.12-2.57 (8H, m), C-H3 1.62 (6H, br);

13C RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOH 177.7, C-OOH 177.6, C-1 175.64, C-1

175.56, C-3 169.9, C-1’ 146.4, C-5 o C-6 135.3, C-5 o C-6 133.8, C-3’ 133.2, C-4’

127.53, C-4’ 127.49, C-5 o C-6 122.4, C-2’ 121.23, C-2’ 121.16, C-7a 43.4, C-4 o C-7

3 3.9, C-4 o C-7 33.2, C-4 o C-7 29.7, C-4 o C-7 28.8, C-H3 26.1.

Mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6b y 7b

H3C

NH

OH

O

O

O

O

1

23

3a4

5

6

77a

1'2'

3'

4'

5'

6' CH3


1.01 g de 3b (6.140 mmol) y 1.10 g (6.620 mmol) del aducto (8); la reacción generó un

polvo blanco con un 42.5% de rendimiento (0.85 g, 2.56 mmol). P.f. 110-112 °C. El Rf

= 0.90 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3415, 3360, 2910, 1710, 1690,

1600, 1280, 1240, 1170, 870, 780 (cm-1

); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm)

COO-H 11.50-12.50 (2H, br), H-2 10.12 (1H, s), H-2 10.10 (1H, s), H-3’ y H-5’ 7.88

(2H, d, 3J = 8.70 Hz), H3’ y H-5’ 7.87 (2H, d,

3J = 9.00 Hz), H-2’ y H-6’ 7.71 (2H, d,

3J

139

= 9.00 Hz), H-2’ y H-6’ 7.70 (2H, d, 3J = 9.00 Hz), H-5 o H-6 5.36 (1H, br), H-5 o H-6

5.31 (1H, br), C-H2 4.26 (4H, q, 3J = 7.05 Hz), H-7a 3.05 (2H, m), H-3a 2.88 (2H, m),

H4 y H7 2.18-2.59 (8H, m), C-H3 1.62 (6H, br), C-H3 1.29 (6H, t, 3J = 7.20 Hz);

13C

RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOR 175.5, C-OOR 175.4, C-1 173.5, C-1

173.4, C-3 166.1, C-1’ 144.5, C-5 o C-6 133.1, C-5 o C-7 131.7, C-3’ y C-5’ 130.3, C-

4’ 124.44, C-4’ 124.40, C-5 o C-6 120.3, C-2’ y C-6’ 119.1, C-2’ y C-6’ 119.0, C-H2

61.1, C-7a 41.3, C-3a 39.4, C-4 y C-7 31.6, C-4 y C-7 31.1, C-4 y C-7 27.5, C-4 y C-7

26.7, C-H3 24.0, C-H3 14.9.

Mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6c y 7c

H3C

NH

OH

O

O

OH

O1

23

3a4

6

5

77a

1'2'

3'

4'

5'

6'

Para esta reacción se siguió el método general. Se pesaron 0.84

g de 3c (6.140 mmol) y 1.10 g (6.620 mmol) del aducto (8); la reacción generó un polvo

color café claro con un rendimiento de 99.4% (1.81 g, 5.97 mmol). P.f. 144-146 °C. El

Rf = 0.49 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3400, 3295, 2970, 1710, 1590,

1550, 1180, 820, 800, 775, 695 (cm-1

); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm) COO-

H 11.50-12.50 (4H, br), H-2 9.94 (1H,s), H-2 9.92 (1H, s), H-2’ 8.24 (2H, br), H-6’

7.59 (2H, d, 3J = 8.10 Hz), H-6’ 7.58 (2H, d,

3J = 8.10 Hz), H-5’ 7.39 (2H, t,

3J = 7.90

Hz), H-5’ 7.38 (2H, t, 3J = 6.90 Hz), H-4’ 7.27-7.89 (2H, m), H-5 o H-6 5.36 (1H, br),

H-5 o H-6 5.32 (1H, br), H-7a 3.01 (2H, m), H-3a 2.87 (2H, m), H-4 y H-7 2.12-2.58

(8H, m), C-H3 1.63 (3H, s); 13

C RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOH 175.53, C-

OOH 175.48, C-1 173.1, C-1 173.0, C-3 167.9, C-1’ 140.3, C-5 o C-6 133.1, C-5 o C-6

131.8, C-3’ 129.5, C-5’ 124.4, C-4’ 123.94, C-4’ 123.87, C-6’ 120.7, C-6’ 120.6, C-2’

119.0, C-7a 41.2, C-3a 39.4, C-4 y C-7 31.6, C-4 y C-7 31.1, C-4 y C-7 26.7, C-4 y C-7

27.5, C-H3 24.0.

Mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6d y 7d

H3C

NH

OH

O

O

O

O1

23

3a4

6

5

77a

1'2'

3'

4'

5'

6'

CH3

Para esta reacción se siguió el método general. Se midieron

1.40 mL de 3d (0.0091 mol) y 1.60 g (0.0096 mol) del aducto (8); la reacción generó un

líquido amarillo ámbar con un rendimiento de 89.6 % (2.69 g, 8.11 mmol). El Rf = 0.89

140

(AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3461, 3285, 3102, 2974, 1692, 1653,

1549, 1243, 762, 753, 705 (cm-1

); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm) COO-H

11.50-12.50 (2H, br), H-2 9.97 (1H, s); H-2 9.96 (1H, s); H-2’ 8.25 (1H, s); H-2’ 8.24

(1H, s); H-5’ 7.79 (1H, t); H-6’ 7.66 (1H, d, 3J = 7.80 Hz); H-6’ 7.60 (1H, d,

3J = 7.50

Hz); H-5 o H-6 5.74 (2H, br); C-H2 4.33 (2H, q, 3J = 6.90 Hz); C-H2 4.25 (2H, q,

3J =

7.20 Hz); H-7a 3.02 (2H, m); H-3a 2.84 (2H, m); H-4 y H-7 2.12-2.51 (8H, m); C-H3

1.63 (3H, s); C-H3 1.60 (3H, s); C-H3 1.31 (3H, t, 3J = 7.20 Hz); C-H3 1.28 (3H, t,

3J =

6.90 Hz); 13

C RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOR 179.9, C-OOR 179-8, C-1

175.5, C-1 175.3, C-3 166.9, C-1’ 140.9, C-5 o C-6 133.5, C-5 o C-6 131.3, C-3’ 129.7,

C-3’ 129.5, C-4’ 128.0, C-5’ 124.1, C-6’ 120.7, C-6’ 120.2, C-2’ 119.9, C-2’ 118.9, C-

H2 61.0, C-7a 39.9, C-3a 39.3, c-4 y C-7 31.3, C-4 y C-7 31.0, C-4 y C-7 29.1, C-4 y C-

7 26.5, C-H3 24.5, C-H3 23.9, C-H3 14.9.

Aducto Diels-Alder 11a

NH

OH

O

O

OH

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

3a

77a

Ha Hb8

Para esta reacción se siguió el método general. Se pesaron 0.84 g

de 3a (6.140 mmol) y 1.10 g (6.700 mmol) del aducto (10a); la reacción generó un

polvo color blanco con un rendimiento de 87.2% (1.60 g, 5.31 mmol). P.f. 175-176 °C.

El Rf = 0.56 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3420, 3270, 3090, 2960,

1710, 1695, 1595, 1530, 1170, 790, 730 (cm-1


(ppm)COO-H 11.50-12.50 (2H, br), H-2 10.22 (1H, br), H-3’ y H-5’ 7.83 (2H, d, 3J =

8.85 Hz), H-2’ y H-6’ 7.60 (2H, d, 3J = 8.85 Hz), H-6 6.17 (1H, dd,

3J = 2.85 Hz,

3J =

5.55 Hz), H-5 6.03 (1H, dd, 3J = 2.85 Hz,

3J = 5.25 Hz), H-7a 3.37 (1H, dd,

3J = 3.00

Hz, 3J = 10.20 Hz), H-3a 3.23 (1H, dd,

3J = 3.30 Hz,

3J = 10.20 Hz), H-7 3.06 (1H, br),

H-4 3.00 (1H, br) H-8b 1.33 (1H, d, 3J = 7.35 Hz), H-8a 1.25 (1H, d,

3J = 9.75 Hz);

13C

RMN (125 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOH 173.7, C-1 171.0, C-3 167.3, C-1’ 143.8,

C-6 135.2, C-5 134.3, C-3’ y C-5’ 130.5, C-4’ 124.7, C-2’ y C-6’ 118.4, C-7a 49.5, C-

3a 49.1, C-7 48.4, C-4 47.0, C-8 45.8.

141

Aducto Diels-Alder 11b

NH

OH

O

O

O

O

1

2

3

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

7

3a

7a

Ha Hb8


1.02 g de 3b (6.215 mmol) y 1.10 g (6.700 mmol) del aducto (10a); la reacción generó

un polvo color blanco con un rendimiento de 79.3% (1.59 g, 4.82 mmol). P.f. 158-160

°C. El Rf = 0.92 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3420, 3210, 3100, 2995,

1710, 1700, 1600, 1545, 1190, 780, 730, 690 (cm-1


(ppm) COO-H 11.50-12.50 (1H, br), H-2 10.25 (1H, br), H-3’ y H-5’ 7.85 (2H, d, 3J=

8.70 Hz), H-2’ y H-6’ 7.63 (2H, d, 3J = 8.70 Hz), H-6 6.17 (1H, dd,

3J = 2.85 Hz,

3J =

5.40 Hz), H-5 6.04 (1H, dd, 3J = 2.70 Hz,

3J = 5.40 Hz), C-H2 4.24 (2H, q,

3J = 6.90

Hz), H-7a 3.37 (1H, dd, 3J = 3.00 Hz,

3J = 10.20 Hz), H-3a 3.23 (1H, dd,

3J = 3.30 Hz,

3J = 10.35 Hz), H-7 3.06 (1H, br), H-4 3.00 (1H, br), H-8a 1.34 (1H, d,

3J = 9.00 Hz),

C-H3 1.27 (3H, t, 3J = 6.90 Hz);

13C RMN (125 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOH

174.1, C-1 171.5, C-3 166.2, C-1’ 144.5, C-6 135.6, C-5 134.8, C-3’ y C-5’ 130.8, C-4’

124.2, C-2’ y C-6’ 118.9, C-H2 61.2, C-7a 49.9, C-3a 49.5, C-7 48.8, C-4 47.4, C-8

46.2, C-H3 14.9.

Aducto Diels-Alder 11c

NH

OH

O

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

OH

O

7

3a

7a

Ha Hb8


g de 3c (6.215 mmol) y 1.10 g (6.700 mmol) del aducto (10a); la reacción generó un

polvo color café con un rendimiento de 91.4% (1.68 g, 5.56 mmol). P.f. 160-161 °C. El


1695, 1590, 1545, 1190, 780, 730, 690 (cm-1

); 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) (ppm)

COO-H 11.50-12.50 (2H, br), H-2 10.08 (1H, br), H-2’ 8.21 (1H, s), H-4’ 7.65 (1H, d,

3J = 8.10 Hz), H-6’ 7.56 (1H, d,

3J = 7.80 Hz), H-5’ 7.36 (1H, t,

3J = 8.10 Hz), H-6 6.17

(1H, dd, 3J = 2.85 Hz,

3J = 5.55 Hz), H-5 6.03 (1H, dd,

3J = 2.85 Hz,

3J = 5.25 Hz), H-

7a 3.35 (1H, dd, 3J = 3.15 Hz,

3J = 10.05 Hz), H-3a 3.22 (1H, dd,

3J = 3.30 Hz,

3J =

10.20 Hz), H-7 3.05 (1H, br), H-4 2.99 (1H, br), H-8a 1.33 (1H, d, 3J = 7.80 Hz), H-8b

1.25 (1H, d, 8.70 Hz); 13

C RMN (125 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOH 176.4, C-1

142

173.3, C-3 170.2, C-1’ 142.5, C-6 137.7, C-5 136.9, C-3’ 133.9, C-5’ 131.7, C-4’ 126.4,

C-6’ 125.9, C-2’ 122.6, C-7a 52.0, C-3a 51.6, C-7 51.0, C-4 49.6, C-8 48.3.

Aducto Diels-Alder 11d

NH

OH

O

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

O

O

CH3

77a

3a

Ha Hb8

Para esta reacción se siguió el método general. Se midieron

0.93 mL de 3d (6.091 mmol) y 1.10 g (6.700 mmol) del aducto (10a); la reacción

generó un polvo color blanco con un rendimiento de 58.9% (1.18 g, 3.59 mmol). P.f.

132-134 °C. El Rf = 0.93 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3350, 2990,

1710, 1690, 1590, 1525, 1290, 1220, 1190, 750, 730, 695, 620 (cm-1

); 1H RMN (500

MHz, DMSO-d6) (ppm) COO-H 11.50-12.50 (1H, br), H-2 10.11 (1H, br), H-2’ 8.22

(1H, s), H-4’ 7.68 (1H, d, 3J = 8.55 Hz), H-6’ 7.57 (1H, d,

3J = 7.05 Hz), H-5’ 7.39 (1H,

t, 3J = 7.95 Hz), H-6 6.17 (1H, dd,

3J = 2.85 Hz,

3J = 5.55 Hz), H-5 6.04 (1H, dd,

3J =

2.70 Hz, 3J = 5.40 Hz), C-H2 4.28 (2H, q,

3J = 6.90 Hz), H-7a 3.35 (1H, dd,

3J = 3.30

Hz, 3J = 10.20 Hz), H-3a 3.22 (1H, dd,

3J = 3.30 Hz,

3J = 10.20 Hz), H-4 3.06 (1H, br),

H-7 3.05 (1H, br), C-H3 1.28 (3H, s, 3J = 6.90 Hz); 13

C RMN (125 MHz, DMSO-d6)

(ppm) C-OOR 176.4, C-1 173.4, C-3 168.6, C-1’ 142.7, C-6 137.7, C-5 136.9, C-3’

133.0, C-5’ 131.9, C-4’ 127.5, C-6’ 126.2, C-2’ 122.1, C-H2 63.7, C-7a 52.0, C-3a 51.6,

C-7 51.0, C-4 49.5, C-8 48.4, C-H3 17.0.

Aducto Diels-Alder 14a

O

NH

OH

O

O

OH

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

3a

77a


de 3a (6.080 mmol) y 1.10 g (6.620 mmol) del aducto (13); la reacción generó un polvo

color rosa claro con un rendimiento de 57.5% (1.05 g, 3.46 mmol). P.f. 196-198 °C. El


1520, 1315, 1180, 860, 820, 785 (cm-1

); 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) (ppm)COO-

H 11.50-12.50 (2H, br), H-2 10.15 (1H, br), H-3’ y H-5’ 7.86 (2H, d, 3J = 8.70 Hz), H-

2’ y H-6’ 7.63 (2H, d, 3J = 8.70 Hz), H-5 6.49 (1H, dd,

3J = 3.50 Hz,

3J = 2.50 Hz), H-6

6.47, (1H, dd, 3J = 3.00 Hz,

3J = 2.00 Hz), H-7 5.24 (1H, s), H-4 5.03 (1H, s), H-7a 2.82

(1H, d, 3J = 9.60 Hz), H-3a 2.70 (1H, d,

3J = 9.60 Hz);

13C RMN (125 MHz, DMSO-d6)

143

(ppm) C-OOH 173.0, C-1 170.5, C-3 167.3, C-1’ 143.5, C-6 137.7, C-5 136.9, C-3’ y

C-5’ 130.6, C-4’ 125.1, C-2’ y C-6’ 119.7, C-7 80.7, C-4 79.4, C-7a 47.8, C-3a 47.1.

Aducto Diels-Alder 14b

NH

OH

O

O

O

O

1

2

3

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

O

7

3a

7a


1.01 g de 3b (6.142 mmol) y 1.10 g (6.620 mmol) del aducto (13); la reacción generó un

polvo color amarillo claro con un rendimiento de 75.5% (1.51 g, 4.54 mmol). P.f. 182-

184 °C. El Rf = 0.43 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3420, 2940, 1710,

1640, 1610, 1520, 1290, 1270, 1180, 870, 830, 780 (cm-1

); 1H RMN (500 MHz, DMSO-

d6) (ppm)COO-H 11.50-12.50 (1H, br), H-2 10.09 (1H, br), H-3’ y H-5’ 7.88 (2H, d,

3J = 8.70 Hz), H-2’ y H-6’ 7.65 (2H, d,

3J = 8.70 Hz), H-5 y H-6 6.48 (2H, br), H-7 5.12

(1H, s), H-4 5.03 (1H, s), C-H2 4.27 (2H, q, 3J = 7.35 Hz), H-7a 2.82 (1H, d,

3J = 9.30

Hz), H-3a 2.70 (1H, d, 3J = 9.30 Hz), C-H3 1.28 (3H, t,

3J = 7.35 Hz);

13C RMN (125

MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOR 173.0, C-1 170.6, C-3 165.7, C-1’ 143.8, C-6 137.3,

C-5 136.8, C-3’ 130.4, C-4’ 124.2, C-2’ 118.7, C-7 80.7, C-4 79.5, C-H2 60.8, C-7a

47.7, C-3a 47.2, C-H3 14.4.

144

Aducto Diels-Alder 14c

O

NH

OH

O

O

1

23

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

OH

O

7

3a

7a


de 3c (6.142 mmol) y 1.10 g (6.620 mmol) del aducto (13); la reacción generó un polvo

color café claro con un rendimiento de 87.8% (1.60 g, 5.29 mmol). P.f. 192-194 °C. El


1540, 1305, 1280, 1180, 940, 915, 897 (cm-1


(ppm)COO-H (2H, br), H-2 10.01 (1H, br), H-2’ 8.21 (1H, s), H-4’ 7.70 (1H, d, 3J =

8.40 Hz), H-6’ 7.60 (1H, d, 3J = 7.50 Hz), H-5’ 7.41 (1H, t,

3J = 8.10 Hz), H-5 y H-6

6.48 (2H, br), H-7 5.12 (1H, s), H-4 5.04 (1H, s), H-7a 2.80 (1H, d, 3J = 9.00 Hz), H-3a

2.69 (1H, d, 3J = 9.00 Hz);

13C RMN (125 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOH 175.6, C-1

172.8, C-3 170.1, C-1’ 142.2, C-6 139.8, C-5 139.5, C-3’ 134.0, C-5’ 131.8, C-4’ 126.8,

C-6’ 126.1, C-2’ 122.6, C-7 83.3, C-4 82.0, C-7a 50.3, C-3a 49.6.

Aducto Diels-Alder 14d

Para esta reacción se siguió el método general. Fueron medidos 1.40 mL de 3d (9.080

mmol) y 1.60 g (9.631 mmol) del aducto (13); la reacción generó un polvo color

amarillo; sin embargo, los espectros de RMN de 1H y 13C mostraron que el aducto se

formó, aunque tenía impurezas; se trató de purificar el producto por par de disolventes y

por percolación con gel de sílice, no obstante, no pudo ser purificado.

Método general de preparación de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d

Se pesó 1 equivalente de las anilinas monosustituidas (3a–d) correspondientes y

aproximadamente entre 1.03 y 1.10 equivalentes de cloruro de fumarilo (15), los cuales

se disolvieron por separado en 20.0 mL de THF anhidro vía cánula en matraces de bola

de 100 mL. El contenido del matraz que contenía las anilinas (3a-d) se adicionó a la

disolución que contenía al cloruro de fumarilo vía cánula. La adición se hizo en un baño

de hielo-sal a -10°C. La reacción se dejó en agitación constante por un período de 16 h a

temperatura ambiente. Después del tiempo de reacción se adicionaron 5.0 mL de agua

bidestilada para desactivar el cloruro de fumarilo excedente y se dejó en agitación por 1

h. Pasando el tiempo de, se adicionó hexano frío con el fin de precipitar completamente

el producto, el cual, posteriormente se filtró al vacío y lavado dos veces con 20 mL de

145

hexano frío. Una vez que el producto quedó libre de de disolvente fue pulverizado en un

mortero y lavado con 250 mL de agua destilada en un vaso de precipitados en agitación

constante a temperatura ambiente por 3 h con el fin de eliminar algún excedente de

anilina no reaccionante y ácido fumárico formado. Una vez lavado el producto se filtró

al vacío y se lavó dos veces con 20 mL de agua destilada. El producto se caracterizó


Ácido N-(4-Carboxifenil)fumarámico 16a

NH

O OH

O

1 2

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

O

HO

Para esta reacción se siguió el método general. Se pesó 1.0 g de

3a (7.294 mmol) y se midió 0.92 mL (8.444 mmol) de cloruro de fumarilo (15); la

reacción generó un polvo rosa con un 95.0% de rendimiento (1.22 g, 5.188 mmol). P.f.

280-285 °C (ennegrece). El Rf = 0.36 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max

3300, 2960, 1690, 1670, 1598, 1520, 1180, 855, 770 (cm-1

); 1H RMN (500 MHz,

DMSO-d6) (ppm) COO-H 12.50-13.00 (2H, br), N-H10.77 (1H, br), H-3’ y H-5’ 7.90

(2H, d, 3J = 8.50 Hz), H-2’ y H-6’ 7.76 (2H, d

3J = 9.00 Hz), H-3 7.13 (1H, d,

3J =

15.50 Hz), H-2 6.67 (1H, d, 3J = 15.50 Hz);

13C RMN (125 MHz, DMSO-d6) (ppm)

C-1 167.5, C-OOH 166.9, C-4 162.8, C-4’ 143.2, C-3 137.3, C-2 132.1, C-3’ 131.2, C-

1’ 126.6, C-2’ y C-6’ 119.6.

Ácido N-(4-Carboetoxifenil)fumarámico 16b

NH

O O

O

1 2

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6' CH3

O

HO


3.0 g de 3b (0.0181 mol) y medidos 2.20 mL (0.0197 mol) de cloruro de fumarilo (15);

la reacción produjo un polvo blanco en un 68.1% de rendimiento (3.25 g, 0.0123 mol).

P.f. 228-231 °C. El Rf = 0.59 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3320,

3020, 2990, 1705, 1680, 1597, 1540, 1280, 1240, 1185, 880, 780 (cm-1

); 1H RMN (500

MHz, DMSO-d6) (ppm) COO-H 12.50-13.00 (1H, br), N-H10.79 (1H, br), H-3’ y H-

5’ 7.91 (2H, d, 3J = 9.00 Hz), H-2’ y H-6’ 7.77 (2H, d

3J = 8.50 Hz), H-3 7.12 (1H, d,

3J

= 15.00 Hz), H-2 6.67 (1H, d, 3J = 15.50 Hz), C-H2 4.25 (2H, q), C-H3 1.27 (3H, t);

13C

RMN (125 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-1 166.9, C-OOR 166.0, C-4 162.8, C-4’ 143.4,

146

C-3 137.4, C-2 132.1, C-3’ y C-5’ 130.9, C-1’ 125.7, C-2’ y C-6’ 119.6, C-H2 61.2, C-

H3 14.8.

Ácido N-(3-Carboxifenil)fumarámico 16c

NH

O

1 2

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

O

O

CH3

HO

O Se siguió el método general de síntesis. Se pesaron 3.0 g de

3c (0.0218 mol) y se midieron 2.60 mL (0.0237 mol) de cloruro de fumarilo (15), la

reacción generó un producto color café en 82.1% de rendimiento (4.22 g, 0.0179 mol).

P.f. 298–300 °C. El Rf = 0.31 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3280,

3090, 3000, 1700, 1600, 1595, 1550, 1170, 980, 945, 798 (cm-1

); 1H RMN (500 MHz,

DMSO-d6) (ppm) COO-H 12.50-13.00 (2H, br), N-H10.67 (1H, br), H-2’ 8.30 (1H,

s), H-6’ 7.86 (1H, d, 3J = 8.50 Hz), H-4’ 7.66 (1H, d,

3J = 8.50 Hz), H-5’ 7.45 (1H, t),

H-3 7.11 (1H, d, 3J = 15.00 Hz), H-2 6.67 (1H, d,

3J = 15.50 Hz);

13C RMN (125 MHz,

DMSO-d6) (ppm) C-OOH 167.7, C-1 166.9, C-4 162.6, C-1’ 139.4, C-3 137.5, C-2

132.1, C-3’ 131.7, C-5’ 129.9, C-4’ 125.4, C-6’ 124.2, C-2’ 120.8.

Ácido N-(4-Carboetoxifenil)fumarámico 16d

NH

O

1 2

3 4 1'2'

3'

4'

5'

6'

O

O

CH3

HO

O Se siguió el método general para esta reacción. Se midieron

1.90 mL de 3d (0.0125 mol) y 1.45 mL (0.0133 mol) de cloruro de fumarilo (15), la

reacción generó un polvo color blanco en 68.4 % de rendimiento (2.18 g, 0.0083 mol).

P.f. 225–228 °C. El Rf = 0.61 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3360,

3280, 3100, 2985, 1720, 1700, 1600, 1500, 1298, 1280, 1150, 815, 780 (cm-1

); 1H RMN

(500 MHz, DMSO-d6) (ppm) COO-H 12.50-13.00 (1H, br), N-H10.78 (1H, br), H-2’

8.33 (1H, s), H-6’ 7.91 (1H, d, 3J = 9.30 Hz), H-4’ 7.68 (1H, d

3J = 7.50 Hz), H-5’ 7.48

(1H, t), H-3 7.18 (1H, d, 3J = 15.75 Hz), H-2 6.68 (1H, d,

3J = 15.75 Hz), C-H2 4.30

(2H, q), C-H3 1.31 (3H, t); 13

C RMN (125 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-1 166.9, C-OOR

166.2, C-4 162.6, C-1’ 139.6, C-3 137.5, C-2 131.8, C-3’ 131.1, C-5’ 130.0, C-4’ 125.3,

C-6’ 124.5, C-2’ 120.5, C-H2 61.6, C-H3 14.8.

147

Procedimiento general de preparación de la mezcla de regioisómeros de los

aductos Diels-Alder 17a-d y 18a-d a partir de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d

Se pesaron 500 mg del ácido N-fenilfumarámico correspondiente (16a–d) y se

adicionaron 2 equivalentes de isopreno (2) y 9.0 mL de tolueno, los cuales se

depositaron en un tubo de presión ACE de 20 mL. El tubo se cerró y se introdujo en un

baño de arena a 160 °C en agitación constante por un período de 48 h. Después del

tiempo de reacción, el producto se precipitó con hexano frío y se filtró a gravedad y se

lavó 2 veces con 20 mL de hexano a temperatura ambiente. El producto purificado se

caracterizó espectroscópicamente.

Mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 17a y 18a

H3C

NH

OH

O

O

OH

O

1

23

3a4

5

67a

1'2'

3'

4'

5'

6'


g de 16a (1.06 mmol) y medidos 0.22 mL (2.15 mmol) de (2); la reacción generó un

polvo amarillo claro con un 82.7% de rendimiento (0.28 g, 0.93 mmol). P.f. 214-217


1660, 1597, 1170, 850, 780 (cm-1

); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm) COO-H

12.20-12.40 (2H, br), H-2 10.34 (2H, br), H-3’ y H-5’ 7.88 (4H, d, 3J = 8.85 Hz), H-2’

y H-6’ 7.70 (4H, d, 3J = 8.85 Hz), H-5 o H-6 5.41 (2H, br), H-7a 2.82 (2H, m), H-3a

2.66 (2H, m), H-4 y H-7 1.96-2.52 (8H, m), C-H3 1.65 (6H, br); 13

C RMN (75 MHz,

DMSO-d6) (ppm) C-OOH 176.8, C-OOH 176.7, C-1 174.7, C-1 174.6, C-3 167.6, C-

1’ 144.0, C-5 o C-6 132.9, C-5 o C-6 132.8, C-3’ y C-5’ 131.1, C-4’ 125.5, C-5 o C-6

119.9, C-2’ y C-6’ 119.5, C-2’ y C-6’ 118.9, C-7a 44.0, C-7a 43.5, C-3a 42.1, C-3a

41.5, C-4 y C-7 34.0, C-4 y C-7 33.3, C-4 y C-7 29.5, C-4 y C-7 28.8, C-H3 23.5.

Mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 17b y 18b

H3C

NH

OH

O

O

O

O

1

23

3a4

5

6

77a

1'2'

3'

4'

5'

6' CH3


0.50 g de 16b (1.900 mmol) y se midieron 0.40 mL (4.000 mmol) de (2); la reacción

generó un polvo blanco con un 57.0% de rendimiento (0.36 g, 1.04 mmol). P.f. 179-180


148

1660, 1525, 1280, 1180, 1110, 850, 780 (cm-1


(ppm) COO-H 12.20-12.40 (1H, br), H-210.37 (2H, br), H-3’ y H-6’ 7.90 (2H, d, 3J =

8.70 Hz), H-3’ y H-5’ 7.89 (2H, d, 3J = 8.70 Hz), H-2’ y H-6’ 7.73 (2H, d,

3J = 8.70

Hz), H-2’ y H-6’ 7.72 (2H, d, 3J = 8.70 Hz), H-5 o H-6 5.41 (2H, br), C-H2 4.27 (4H,

q), H-7a 2.72-2.82 (2H, m), H-3a 2.62-2.72 (2H, m), H4 y H7 1.98-2.35 (8H, m), C-H3

1.66 (6H, br), C-H3 1.30 (6H, t); 13

C RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOH

181.4, C-1 179.5, C-1 179.4, C-3 170.8, C-1’ 149.1, C-5 o C-6 137.6, C-3’ y C-5’

135.6, C-4’ 129.4, C-5 o C-6 124.6, C-2’ y C-6’ 123.7, C-H2 65.8, C-7a 48.2, C-3a

46.8, C-4 y C-7 38.0, C-4 y C-7 34.2, C-H3 28.2, C-H3 19.6.

Mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 17c y 18c

H3C

NH

OH

O

O

OH

O1

23

3a4

6

5

77a

1'2'

3'

4'

5'

6'


g de 16c (2.13 mmol) y medidos 0.40 mL (4.00 mmol) de (2); la reacción generó un

polvo color café claro, la espectroscopía mostró que el aducto se había formado, aunque

presentó impurezas, se trató de purificar por recristalización y por percolación con gel

de sílice; sin embargo, las impurezas no pudieron ser removidas.

Mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 17d y 18d

H3C

NH

OH

O

O

O

O1

23

3a4

6

5

77a

1'2'

3'

4'

5'

6'

CH3


0.50 g de 16d (3.02 mmol) y se midieron 0.40 mL (4.00 mmol) de (2); la reacción

generó un polvo color blanco con un rendimiento de 54.3 % (0.342 g, 1.03 mmol). P.f.

345-347 °C. El Rf: = 0.94 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max (cm-1

); 1H

RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm) COO-H 12.20-12.40 (1H, br), H-2 10.30 (2H, br),

H-2’ 8.28 (1H, s), H-2’ 8.27 (1H, s), H-6’ 7.98 (1H, d, 3J = 7.50 Hz), H-6’ 7.97 (1H, d,

3J = 7.50 Hz), H-4’ 7.66 (1H, d,

3J = 7.61 Hz), H-4’ 7.61 (1H, d,

3J = 8.10 Hz), H-5’

7.43 (1H, t), H-5’ 7.39 (1H, t), H-5 o H-6 5.49 (1H, br), H-5 o H-6 5.48 (1H, br), C-H2

4.33 (2H, q), C-H2 4.30 (2H, q), H-7a 3.04-3.12 (2H, m), H-3a 2.94-3.03 (2H, m), H-4 y

H-7 2.27-2.32 (8H, m), C-H3 1.73 (6H, br), C-H3 1.32 (3H, t), C-H3 1.28 (3H, t); 13

C

RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOR 176.6, C-OOR 176.5, C-1 174.5, C-1

149

174.3, C-3 166.2, C-3 165.7, C-1’ 140.2, C-5 o C-6 133.7, C-5 o C-6 133.0, C-3’ 130.9,

C-3’ 130.0, C-5’ 124.3, C-4’ 124.0, C-6’ 121.4, C-2’ 120.0, C-H2 61.7, C-H2 61.4, C-7a

43.4, C-7a 42.9, C-4 y C-7 29.9, C-4 y C-7 25.0, C-H3 24.1, C-H3 14.83.

8.4 Análisis conformacional y metodología de los cálculo teóricos para el aducto

Diels-Alder 4b

Los cálculos fueron llevados a cabo con el programa Gaussian 9464

. La optimización

fue llevada a cabo utilizando la opción TIGHT; de la misma manera, los cálculos al

nivel DFT se llevaron a cabo utilizando la opción INT(GRID=99590). Los cuatro

confórmeros obtenidos del aducto 4b fueron construidos en el programa Molden65

. y

optimizados por un método ab initio a un nivel de teoría HF/STO-3G. Las geometrías

resultantes fueron utilizadas como puntos de partida para realizar optimizaciones

subsecuentes a los niveles HF/3-21G, HF/6-31+G(d,p) y B3LYP/6-31+G(d,p). Se llevó

a cabo el análisis vibracional (25°C, 1 atm) para aquellos resultados obtenidos al nivel

más alto de teoría, con el propósito obtener las correspondientes correcciones de energía

libre a las energías electrónicas; (no se aplicaron factores de corrección a las frecuencias

vibracionales). Para todas las geometrías optimizadas únicamente se obtuvieron

frecuencias vibracionales reales. Los ángulos diedros relacionados con las constantes de

acoplamiento en estudio fueron determinados con el programa Molden sobre las

geometrías optimizadas al nivel más alto de teoría.

Para los cuatro confórmeros de 4b, como fue mencionado anteriormente, fueron

determinados los ángulos diedros más relevantes, y de ellos fueron estimadas las

constantes de acoplamiento vecinales de acuerdo a la ecuación de Haasnot-de Leeuw-

Altona,28

implementada en el programa computacional ALTONA.29

Además, de los

valores de las constantes de acoplamiento y energías relativas calculadas fue posible

estimar el promedio de las constantes de acoplamiento asumiendo una distribución de

Boltzmann de los confórmeros, de acuerdo a la metodología descrita en otros trabajos.66

150

8.5 Estudios de interacción ligando-enzima asistido por computadora

8.5. 1 Preparación de los ligandos

Se utilizó el programa PC Spartan Pro67

para construir todos y cada uno de los

posibles aductos Diels-Alder derivados tanto del ácido maleico, como del ácido

fumárico con sus respectivos estereo y regioisómeros (aductos fusionados con los

dienos isopreno (2), ciclopentadieno (9) y furano (12).

Una vez dibujados los aductos se realizó un análisis conformacional utilizando un

campo de fuerzas MMFF. Una vez terminado el cálculo todos los confórmeros

generados fueron optimizados por un método semiempírico al nivel AM1 de teoría en el

mismo programa (PC Spartan Pro). Obtenidos los resultados de la optimización, la

moléculas más estables o de menor energía (energía relativa = 0), fueron ionizadas en

donde corresponda para un pH = 7.4, las cuales fueron reoptimizadas por un método

ab-initio a un nivel de teoría HF-3-21G utilizando como disolvente H2O en el programa

Gaussian 94.64

Por otro lado, los estándares a utilizar para la evaluación en docking corresponden al

sustrato principal de la enzima GABA-AT correspondiente al ácido -aminobutírico

(GABA), y a su principal inhibidor (Vigabatrina).

De igual manera estos ligandos fueron construidos en PC Spartan Pro, a los cuales se

les realizó un análisis conformacional por un método de mecánica molecular con el

campo de fuerzas MMFF. Una vez terminado el análisis, el conjunto de confórmeros

fue optimizados en el mismo programa por un método ab initio HF-3-21G en Gaussian

94.

Todos los aductos y estándares construidos fueron utilizados para evaluar la

interacción ligando-enzima por Docking.

8.5.2 Preparación de la enzima aminotransferasa del GABA

Alineamiento

Inicialmente fueron obtenidas las secuencias de aminoácidos de la enzima

aminotransferasa del GABA de Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, mus

musculus, Sus scrofa y homo sapiens en formato FASTA, de la base de datos Swiss

151

prot.44

Una vez obtenidas las secuencias, la enzima de Pseudomonas fluorescens fue

alineada contra la de las demás especies en el servidor EMBL-EBI.45

Una vez alineadas las secuencias de la especies con respecto a la de Pseudomonas

fluorescens, fueron analizadas las secuencias y se tomó la decisión de utilizar una de

ellas como secuencia molde.

Derivado del análisis se tomó la decisión de utilizar la secuencia de la enzima de

Pseudomonas fluorescens que tuvo mucho más homología a la GABA-AT de

Escherichia coli que a la de las demás especies. Cabe mencionar que las únicas GABA-

AT cristalizadas y caracterizadas por DRX son aquellas derivadas de las especies

Escherichia coli y Sus scrofa.

Modelado de la proteína GABA-AT de Pseudomonas fluorescens tomando como

secuencia molde la GABA-AT de Escherichia coli

La aminotransferasa del GABA de Escherichia coli es un tetrámero con monómeros

idénticos16

, de tal manera que únicamente el modelado fue realizado para un solo

monómero. Una vez escogida la secuencia molde (E. coli), la GABA-AT de

Pseudomonas fluorescens fue modelada en dos servidores diferentes: 1) El monómero

1SFFC16

de E. coli en Swiss model46

y el monómero 1SF2A16

de E. coli en I-Tasser.47

Una vez obtenidos los resultados de los servidores fue evaluado el mejor modelo de P.

fluorescens comparándolo con el molde de E. coli tomando como criterio el porcentaje

de aminoácidos con ángulos de torsión o conformación espacial ―no permitida‖ excepto

para los aminoácidos glicina (Gly) y prolina (Pro). El análisis se llevó a cabo a través

del gráfico de Ramachandran. La visualización y el análisis fueron llevados a cabo en el

programa VMD.68

El modelo mejor evaluado (I-Tasser) le fue insertado en su molécula la coenzima

fosfato de pirodoxal (PLP) necesario para la actividad de la enzima. El PLP fue

insertado en el modelo de P. fluorescens juntando el archivo de salida del modelo con

las coordenadas del PLP de E. coli. Esta nueva proteína con PLP fue optimizada a 1500,

2000 y 4000 pasos por un método de mecánica molecular steped descendant

minimization en el servidor de I-Tasser47

para verificar que la distancia entre el carbono

carbonilo del PLP y el grupo –NH2 de la Lys269 sea la óptima, debido a la inserción

152

―artificial‖ del PLP puesto que el modelo no fue generado en su forma natural, es decir;

con la base de Schiff entre la Lys269-PLP.

8.5.3 Preparación de los archivos de la proteína y los ligandos

Preparación del archivo *.pdbqt de la proteína

Con el programa Autodocktools 1.5.0.69

fueron colocados los hidrógenos polares y no

polares a la proteína, así como las correspondientes cargas de Kollman. La proteína

preparada es fundamental para realizar los estudios de interacción ligando-enzima

(Docking). La preparación de la enzima genera un archivo de salida *.pdbqt (Figura 79).

Figura 79. Diagrama de flujo para la preparación de la enzima GABA-AT y generar el archivo *.pdbqt

Preparación de los archivos *.pdbqt de los ligandos

De la misma forma que la enzima, los ligandos fueron preparados de manera

individual e independiente con el propósito de asignar enlaces donde la molécula pueda

rotar de manera libre para favorecer la unión con la enzima durante el estudio de

Docking (Figura 80). La preparación de los ligandos se realizó en el programa

Autodocktools 1.5.0. para obtener los archivos *.pdbqt.

Autodocktools

2) Edit 3) Edit 4) Edit 5) Edit

1) File

Read molecule

Abrir archivo de

la enzima

Hydrogens

Add

Polar only

Charges

Add Kollman

charges

Accept

Charges

Compute

Gasteiger

Accept

Atoms

Assign AD4 type

6) File

Save

Write PDBQT

(CONECT, Browse,

Guardar OK)

153

Figura 80. Diagrama de flujo para la preparación de los ligandos y generar los archivos *.pdbqt

8.5.4 Preparación de los scripts de la proteína y los ligandos

Preparación de los archivos *.gpf (grid parameters files)

En este paso se escogió la GABA-AT modelada y minimizada con el fin de

seleccionar el espacio de exploración del ligando hacia la enzima para establecer la

mejor interacción (comúnmente denominado caja de Grid). Fue seleccionada toda la

proteína para evaluar posibles sitios alostéricos. Así también, fue insertado un archivo

con una librería de átomos necesarios que no posee la enzima, por ejemplo, el fósforo

necesario del PLP (Figura 81).

Autodocktools

1) Ligand

2) Ligand

3) Ligand

4) Ligand

5) Ligand

Input

Open…

Accept

Torsion tree

Detect root…

Torsion tree

Choose

torsions

Done

Torsion tree

Set number

of torsions

Dismiss

Output

Save as

PDBQT

Guardar

*.pdbqt

154

Figura 81. Diagrama de flujo para la preparación de los archivos *.gpf

Preparación de los archivos *.dpf (docking parameters files)

Este paso consistió en la generación de los archivos *.dpf (docking parameters files)

con el propósito de asignar rigidez a la proteína y escoger el algoritmo por el cual se

llevó a cabo la interacción (algoritmo genético Lamarckiano). El algoritmo seleccionado

fue de: runs = 100; population = 100; Evaluation = 10 000 000; No. de generaciones =

100 (Figura 82).

Figura 82. Diagrama de flujo para la preparación de los archivos *.dpf

Autodocktools

1) Grid 2) Grid

3) Grid

4) Grid

5) Grid

Macromolecule

Open or Choose

Selection

Yes, accept

Set map types

Open ligand

―Nombre del

archivo‖

Grid box… center

Center on

macromolecule

File

Close saving

current

Other options

Parameters of

library (AD4.1-

bound.dat)

Output

Save GPF

Colocar *.gpf

Autodocktool

s

2) Docking

3) Docking

4) Docking

Macromolecule

Set rigid

filename

Escoger

proteína

*.pdbqt

Ligand

Choose…

Escoger

proteína

(*.pdbqt)

Search

parameters

Genetic

algorithm

Runs 100, Populations

100, Evaluation 10 000

000, Generations 100

Output

Lamarckian GA

Guardar

archivo *.dpf

Accept

155

La preparación tanto de los archivos *.gpf y *.dpf fueron realizados en el programa

Autodocktools 1.5.0.

8.5.5 Realización de los estudios de interacción ligando-enzima (Docking)

Una vez generados todos los archivos, se llevó a cabo la interacción de ligando-

enzima para todos y cada uno de los ligandos en el programa Autodock.70

Terminado el proceso las interacciones entre el ligando y la enzima fueron analizadas

obteniendo las energía libre de unión y sus correspondientes constantes de disociación,

así como los aminoácidos con los cuales interacciona cada ligando. El análisis se llevó a

cabo en el programa Autodocktools 1.5.2.71

8.6 Cinética enzimática sobre la aminotransferasa del GABA de Pseudomonas

fluorescens

Para la determinación de la actividad de la enzima aminotransferasa del GABA

(GABA-AT) de Pseudomonas fluorescens in vitro, fue utilizada cinética de medición

indirecta derivada de una reacción acoplada con la enzima semialdehído succínico

deshidrogenasa (SSDH), monitoreando el incremento de la concentración del NADPH

(Dinucleótido de nicotinamida y adenina fosfato) producido en la reacción, y seguida

por espectrofotometría UV-Vis.20,21,48

Antes de iniciar con el estudio enzimático fue necesario preparar las siguientes

disoluciones:

1) Buffer de pirofosfato de potasio (K4P2O7) 0.1 M a pH = 8.6. El pH fue ajustado

con ácido clorhídrico concentrado (HClconc.).

2) Disolución stock de ácido 2-cetoglutárico 0.04 M. La concentración final en la

cinética enzimática fue de 2.0 mM.

3) Disolución stock de -NADP 0.05 M. La concentración final en la cinética

enzimática fue de 1.25 mM.

4) Disolución stock de GABA 0.32 M. Se realizó una serie de diluciones sucesivas

a partir de la disolución stock para obtener las concentraciones siguientes: 0.128,

0.064, 0.032, 0.016, 0.008 y 0.004 M para obtener una concentración final de

GABA en el estudio de 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4 y 0.2 mM, respectivamente.

156

5) Disolución stock de GABA-AT 3.14 mg/mL. El disolvente del polvo liofilizado

que contiene a la enzima consistió en una disolución buffer de fosfatos 0.0075

M, pH = 7.2 con glicerol al 25 % V/V. La concentración final de la enzima en el

estudio fue de 0.0209 mg/mL.

6) Disoluciones stock de inhibidores (aductos y VGB) 0.020, 0.010, 0.005 y 0.0025

M. Las disoluciones fueron preparadas por diluciones sucesivas. Las

concentraciones finales fueron: 2.00, 1.00, 0.50 y 0.25 mM, respectivamente.

Fueron establecidos los siguientes volúmenes de cada reactivo para evaluar la

actividad de la enzima GABA-AT de Pseudomonas fluorescens sin inhibidor y con

inhibidor (Aductos y VGB) en el orden que aparece en la siguiente tabla (Tabla 40).

Tabla 40. Volúmenes utilizados de cada reactivo en la determinación de la actividad enzimática de

GABA-AT con y sin inhibidor.

Reactivo Sin inhibidor (L) Con inhibidor (L)

Inhibidor 0.00 70.00

Buffer de pirofosfato de

potasio (K4P2O7) 0.1 M a

pH = 8.6

607.84

537.84

Ácido 2-cetoglutárico 35.00 35.00

-NADP 17.50 17.50

GABA 35.00 35.00

GABA-AT 4.66 4.66

Volumen total (L) 700.00 700.00

La reacción enzimática se llevó a cabo a pH = 8.6 a 25°C (en un baño de agua) por un

período de incubación de 30 min.

La reacción de reducción acoplada fue monitoreada por espectrofotometría UV-Vis

midiendo la absorbancia, la cual está relacionada con el incremento de la concentración

de NADPH a partir de NADP. La reacción enzimática fue llevada a cabo en una celda

de cuarzo con un paso óptico de 0.5 cm, monitoreando la absorbancia de NADPH a

157

máx = 340 nm por 45 min en el caso de la cinética en función del tiempo, y por un

período de 30 min en el caso de la cinética enzimática en función de la concentración.

De manera preliminar los aductos de Diels-Alder (6a-d, 7a-d, 11a-d, 14a-d y 17a-d,

18a-d) fueron probados para determinar su potencial actividad inhibitoria de la enzima

GABA-AT utilizando una concentración para cada uno (0.8 mM) vs. GABA a la misma

concentración (0.8mM) bajo las mismas condiciones. Como control positivo fue

utilizada la vigabatrina (VGB).

A los aductos que tuvieron una inhibición mayor al 40%, les fue determinada una

cinética completa a concentraciones que variaron desde 0.25 a 2.0 mM en escala

geométrica.

Las absorbancias obtenidas fueron convertidas a concentración de -NADPH a partir

de una curva patrón de -NADPH con valores de concentración: 0.05, 0.10, 0.20, 0.40,

0.80, 1,60, 3.20 y 6.40 mM.

La determinación de los parámetros cinéticos sin inhibidor (Km y rmáx) fueron

analizadas a través de los métodos de Lineweaver-Burk49

o Hanes-Wolff49

. La

determinación de la Ki fue a través del método de Schild49

. El análisis estadístico fue

llevado a cabo a través de la prueba t de Student para una regresión lineal por mínimos

cuadrados. Un valor de p < 0.05 fue tomado como significativo.

8.7 Modelo in vivo de las convulsiones inducidas con pentilentetrazol (PTZ)

8.7.1 Animales

Todos los experimentos se realizaron con ratones albinos adultos, machos de la cepa

Swiss CD1 con un peso entre 22-26 g52,53

, los cuales estuvieron bajo las mismas

condiciones de trato, las cuales consistieron en libre acceso a alimento y agua (ad

libitum), un ciclo natural de luz-oscuridad a una temperatura de 22 + 1 °C, así como un

tiempo mínimo (4 días) de adaptación de los animales a las condiciones del laboratorio.

8.7.2 Determinación de la dosis mínima efectiva de PTZ

Se realizó una curva dosis-respuesta cuantal, formando 6 grupos con 6-8 animales

cada uno, 5 de ellos fueron de utilidad para construir la curva dosis-respuesta para PTZ

para un intervalo de dosis de 35-125 mg/kg, mientras que el 6° grupo sirvió como grupo

158

control que solo recibió el vehículo (disolución salina isotónica con NaCl al 0.9 %

m/V). La administración del PTZ y del vehículo fue aplicada por vía subcutánea (s.c.)55

con un volumen de inyección de 1mL/100g. La administración s.c. se practicó en el

pliegue de la piel de la parte posterior del cuello del ratón (Figura 83).

Figura 83. Administración subcutánea (s.c.) practicada en ratones.

Una vez administrado el PTZ, en una caja de acrílico cada ratón será observado

durante de 30 min, en este período se contaron el número de crisis convulsivas

generadas y la muerte en aquellos casos en donde se presenten.

Se consideró una crisis convulsiva aquella en donde el ratón presente convulsiones

tónico-clónicas con una duración mínima de 3s.

Nota: El criterio de actividad anticonvulsiva es la protección total contra las

convulsiones de algún tipo. La convulsión está caracterizada por la extensión rígida

verdadera de las extremidades del animal (convulsión tónica)72

(Figura 84A); mientras

que movimientos cíclicos continuos de las extremidades es característica de la

convulsión clónica72

(Figura 84B).

Figura 84. A: Convulsión tónica; B: Convulsión clónica11

159

8.7.3 Determinación del efecto protector de los aductos Diels-Alder que hayan

resultado inhibidores de la GABA-AT

Se formaron de 6-8 grupos de 5-8 ratones cada uno de la cepa Swiss (machos, entre

22-26g de peso), que hayan estado bajo las condiciones antes mencionadas.

Los aductos Diels-Alder, en particular la mezcla de regioisómeros 6b y 7b fueron

probados en disolución en el caso de la dosis de 0.2 mmol/kg, y en suspensión las dosis

de 0.5 y 1.0 mmol/kg en buffer de pirofosfato de potasio (K4P2O7) 0.1 M, pH = 8.6. Fue

utilizada la VGB en disolución en el mismo vehículo como control positivo a las

mismas dosis (0.2, 0.5 y 1.0 mmol/kg). El grupo control solo recibió vehículo.

La primera etapa del ensayo consistió en un pretratamiento por grupo de 4 h52

con el

vehículo, aductos y VGB. La administración se practicó en todos los casos por vía

intraperitoneal (i.p.) con un espacio de tiempo entre grupos de 30 min. Una vez pasado

el tiempo de pretratamiento fue administrada la dosis mínima efectiva de PTZ (75

mg/kg) por vía subcutánea (en disolución salina isotónica) y cada ratón fue observado

en un período de 1 h. En dicho período se observaron el número de crisis convulsivas

tónico-clónicas generadas, así como el tiempo de latencia entre la administración del

PTZ y las crisis consecutivas.

Todos los experimentos fueron analizados por análisis de variancia (ANOVA) de una

vía con el método de Duncan, o por análisis estadístico de t de Student no pareada. La

evaluación del número de ratones que presentaron crisis convulsivas tónico-clónicas

contra el número que no las tuvieron fue analizada con la prueba exacta de Fisher. Un

valor de p < 0.05 fue tomado como significativo.

160

9. REFERENCIAS

[1] Hardman Joel G.; Limbird Lee L.; Las bases farmacológicas de la terapéuticas; 10ª

Edición; Trad. Blengio Pinto José Rafael; Rivera Muñoz Bernardo; Di Girolamo

Guillermo; Vol. I; Cap. 21; Edit. McGraw-Hill; México, D.F.; (2004); p.p. 324, 529-

536. ISBN: 970-10-3880-0

[2] Katzung Bertram G.; Farmacología básica y clínica; 9ª Edición; Trad. Monteón

Batalla Ignacio de Jesús; Edit. El Manual Moderno, S.A. de C.V.; México, D.F.; (2005);

p.p. 339-350; 381-402. ISBN: 970-729-164-8

[3]http://escuela.med.puc.cl/paginas/publicaciones/ManualPed/Convulsiones.html

/11/04/07/

[4] http://www.el-mexicano.info/nota.aspx?idNota=226670&esSecc=True /11/04/07/

[5] Armijo J. A.; Shushtarian M.; Valdizan E. M.; Cuadrado A.; de las Cuevas I. and

Adín J.; “Ion Channels and Epilepsy”; Current Pharmaceutical Design; 11; (2005); p.p.

1975-2003.

[6] Avendaño López María del Carmen: Introducción a la Química Farmacéutica; 2ª

Edición; Edit. McGraw-Hill; España, Madrid; (2001); p.p. 25-40, 139-140, 296-298,

662. ISBN: 84-486-0361-3

[7] Padilla Zúñiga Jacqueline A., Rojo Domínguez Arturo; Simulación del

Reconocimiento entre proteínas y moléculas orgánicas o Docking. Aplicación al diseño

de fármacos; Mensaje Bioquímico, Vol. XXVI; Depto. De Bioquímica, Facultad de

Medicina; U.N.A.M.; México, D.F. (2002); p.p. 129-145.

[8] Reyes Chumacera L. Antonio, Cruz Borbolla Julián, Nicolás Vázquez María Inés,

Reyes Trejo Lino J.; Curso-Taller: Introducción a la Química Computacional; Manual;

FES-Cuautitlán-U.N.A.M.; (2004); p.p. 1-13, 25 - 44.

[9] Morris G.M.; Goodsell D.S.; Halliday R.S.; Huey R.; Hart W.E.; Belew R.K. and

Olson A.J.; “Automated Docking Using a Lamarckian Genetic Algorithm and

Empirical Binding Free Energy Function”; Journal of Computational Chemistry; Vol.

19, No. 14; (1998); p.p. 1639-1662.

[10] Guyton Arthur C.; hall John E.; Tratado de Fisiología Médica; 10ª Edición; Trad.

Agud Aparicio José Luis; Álvarez Beiola Isabel; de Dios Perrino Consuelo; et al.; Edit.

McGraw-Hill Interamericana; México, D.F.; (2001); p.p. 632-635, 831-839. ISBN: 970-

10-3599-2

http://escuela.med.puc.cl/paginas/publicaciones/ManualPed/Convulsiones.html

http://www.el-mexicano.info/nota.aspx?idNota=226670&esSecc=True

161

[11]http://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorDisplayForward?receptorID=2197

/19/09/10/

[12] Tao Yun-Hai; Xu Hui-Bi and Yang Xiang-Liang; “Inactivation of GABA

transaminase by 4-acryloylphenol”; Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters; 16;

(2006); p.p. 3719-3722.

[13] Storici Paola; Capitani Guido; De Biase Daniela; Moser Markus; John Robert A.;

Jansonius Johan N. and Schirmer Tilman; “Crystal structure of GABA-

Aminotransferase, a target for antiepileptic drug therapy”; Biochemistry; 38; (1999);

p.p. 8628-8634.

[14] Storici Paola; De Biase Daniela; Bossa Francesco; Bruno Stefano; Mozzarelli

Andrea; Peneff Caroline; Silverman Richard B. and Schirmer Tilman; “Structures of -

aminobutyric acid (GABA) aminotransferase, a pyridoxal 5’-phosphate, and [2Fe-2S]

cluster-containing enzyme, complexed with -ethynyl-GABA and with the antiepilepsy

drug vigabatrin”; The Journal of Biological Chemistry; Vol. 279, No. 1; (2004); p.p.

363-373.

[15] Toney M. D.; Pascarella S.; De Biase D.; “Active site model for {gamma}-

aminobutyrate aminotransferase explains substrate specificity and inhibitor

reactivities”; Protein Science; 4; (1995); p.p. 2366-2374.

[16] Lui Wenshe, Peterson Peter E.; Carter Richard J.; Zhou Xianzhi; Langston James A.;

Fisher Andrew J.and Toney Michael D.; “Crystal structures of unbound and

aminooxyacetate-bound Escherichia coli -aminobutyrate aminotransferase”;

Biochemistry; Vol. 43; No. 34; (2004); p.p. 10896-10905.

[17] Lui Wenshe; Peterson Peter E.; Langston James A.; Jin Xueguang; Zhou Xianzhi;

Fisher Andrew J. And Toney Michael D.; “Kinetic and crystallographic analysis of

active site mutants of Escherichia coli -aminobutyrate aminotransferase”;

Biochemistry; 44; (2005); p.p. 2982-2992.

[18] Sik Yoon Chang; Won Kim Dae; Ho Jang Sang; Ryong Lee Jang; Young Choi Soo;

et al.; “Cysteine-321 of human brain GABA Transaminase is involved in intersubunit

cross-linked”; Molecules and Cells; Vol. 18; No. 2; (2004); p.p. 214-219.

[19] Gyu Jeon Seong; Hoon Bahn Jae; Sik Jang Joong; Park Jinseu; Kwon Oh-Shin; Cho

Sung-Woo and Young Choi Soo; “Human brain GABA transaminase”; European

Journal of Biochemistry; 267; (2000); p.p. 5601-5607.

http://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorDisplayForward?receptorID=2197

162

[20] Tunnicliff G.; Crites G.J.; “Chemical inactivation of bacterial GABA

aminotransferase”; Bichemistry and Molecular biology international; Vol. 46; No. 1;

(1998); p.p. 43-54.

[21] Sulaiman Saba A.J.; Suliman Fakhr Eldin O. And Barghouthi Samira; “Kinetic

studies on the inhibition of GABA-T by -vinyl GABA and taurine”; Journal of Enzyme

Inhibition and medicinal Chemistry; Vol. 18; No. 4; (2003); p.p. 297-301.

[22] Wang Zhiyong; Yuan Hai; Nikolic Dejan; Van Breemen Richard B. and Silverman

Richard B.; “(+)-(1S, 2R, 5S)-5-amino-2-fluorocyclohex-3-enecarboxilic acid. A potent

GABA Aminotransferase inactivator that irreversibly inhibits via an Elimination-

Aromatization pathway”; Biochemistry; 45; (2006); p.p. 14513-14522.

[23] Yuan Hai; Silverman Richard B.; “Structural modifications of (1S, 3S)-3-amino-4-

difluoromethylenecyclopentenecarboxylic acid, a potent irreversible inhibitor of GABA

aminotransferase”; Bioorganic & Medicinal Chemistry; 17; (2007); p.p. 1651-1654.

[24] Choi Jung-Hyun and Lee Dong-Ung; “A new Citryl Glycoside from Gastrodia elata

and its inhibitory activity on GABA Transaminase”; Chem. Pharm. Bull.; Vol. 54; No.

12; (2006); p.p. 1720-1721.

[25] Smith Michael B.; March Jerry; March’s Advanced Organic Chemistry; 5

th Edition;

Edit. Wiley-Interscience Publication John Wiley & Sons, Inc.; U.S.A.; (2001); p.p. 484,

1062-1075. ISBN: 0-471-58589-0

[26] Hemming K.; Maguire M.J.; Hutton J.L. and Marson A.G.; “Vigabatrin for

refractory partial epilepsy”; Cochrane Database Syst. Rev.; 3; (2008); CD007302.

[27] McMurry John; Química orgánica; Ed. 7ª; Trad. Lanto Arreola María Aurora; Edit.

CENGAGE Learning; México D.F.; (2008); p.p. 495, 921-925. ISBN: 970-686-823-7

[28] Haasnoot, C. A. G.; de Leeuw, F. A. A. M.; Altona, C.; “The relationship between

proton-proton NMR coupling constants and substituent electronegativities-I. An

empirical generalization of the Karplus equation”; Tetrahedron; Vol. 36; No, 19;

(1980); p.p. 2783-2792.

[29] Cerda-García-Rojas, C.; Zepeda, L. G.; Joseph-Nathan, P.; “A PC program for

calculation of dihedral angles from 1H NMP data”; Tetrahedron Comp. Method.; Vol.

3; No. 2; (1990); p.p. 113-118.

[30] Correa-Basurto J.; Vázquez-Alcántara I.; Espinoza-Fonseca L.M. and Trujillo-

Ferrara J.G.; “p-aminobenzoic acid derivatives as acetylcholinesterase inhibitors”; Eur.

J. Med. Chem.; Vol. 40; No.7; (2005); p.p. 732-735.

163

[31] Hiran B.L.; Chadhary J.; Paliwal S.N.; Meena S. and Chaudhary P.R.; “Synthesis

and characterization of some new thermal stable polymers-polymerization of N-[4-N’-

(benzylamino-carbonyl)phenyl]maleimide; E-Journal Chem.; Vol. 4; No. 2; (2006); p.p.

222-231.

[32] Alagic A.; Koprianiuk A. and Kluger R.; “Hemoglobin-superoxide dismutase-

chemical linkages that create a dual-function protein”; J. Am. Chem. Soc.; 127;

(2005); p.p. 8036-8043.

[33] Hulubei C. and Morariu S.; "Alternating copolymers from N-(4-formylphenoxy-4’-

carbonylphenyl)maleide. A comparative study”; Revue Roumaine Chimie; Vol. 51: No.

5; (2006); p.p. 425-433.

[34] Ying-Teck J.S. and Tan C.H.; “Amino-indanol catalyzed enantioselective reactions

of 3-hydroxy-2-pyridones”; J. Am. Chem. Soc.; Vol. 131; No. 20; (2009); p.p. 6904-

6905.

[35] Mukherjee S.and Corey E.J.; “Highly enantioselective Diels-Alder reactions of

maleimides catalyzed by activated chiral oxazaborolidines”; Org. Lett.; Vol. 12; No. 3:;

(2010); p.p. 632-635.

[36] Berson J.A. and Swidler R.; “cis-Addition in the bromination of bicyclic olefins. The

structure and stereochemistry of the dibromides of exo-cis-3, 6-endoxo-4-

tetrahydrophtalic anhydride and endo-cis-3, 6-endomethylene-4-tetrahydrophtalic

anhydride”; Journal American Chemical Society; Vol. 76; No. 16; (1954); p.p. 4060-

4069.

[37] Kiriazis A.; Leikoski T.; Mutikainen I. And Yli-Kouhaluoma J.; “The Diels-Alder

reaction between deactivated dienes and electron-deficient dienophiles on solid

support: stereoselective synthesis of hexahydro-1,3-dioxoisoindoles”; J. Comb. Chem.;

Vol. 6; No. 2; (2004); p.p. 283-285.

[38] Sanyal A. and Snyder J.K.; “Stereoselective Diels-Alder reactions of chiral

anthracenes”; Org. Lett.; Vol. 2; No. 16; (2000); p.p. 2527-2530.

[39] Wooi Goh Y.; Pool B.R. and White J.M.; “Structural studies on cycloadducts of

furan, 2-methoxyfuran, and 5-trimethylsilylcyclopentadiene with maleic anhydride and

N-methylmaleimide”; Journal Organic Chemistry; Vol. 73; No. 2; (2008); p.p. 151-156.

[40] Schwarzer A.; Bombicz P. and Weber E.; “Involvement of organic fluorine

substitution in the crystalline packing structures of tricyclic Diels-Alder adducts derived

from diarylfulvenes and N-arylimides”; Journal of Fluorine Chemistry; 131; (2010);

p.p. 345-356.

164

[41] Hill K.W.; Tauton-Rigby J.; Carter J.D.; Kropp E.; Vagle K.; Pieken W.; McGee

D.P.C.; Husar G.M.; Leuck M.; Anziano D.J. and Sebesta D.P.; “Diels-Alder

bioconjugation of diene-modified oligonucleotides”; J. Org. Chem.; Vol. 66; No. 6;

(2001); p.p. 5352-5358.

[42] Lei X. and Porco J.A.; “Synthesis of a polymer-supported anthracene and its

application as a dienophile scavenger”; Org. Lett.; Vol. 6; No. 5; (2004); p.p. 795-798.

[43] Schmart I.M. and Knot-Tso M.E.; “Endo- vs. Exo-selectivity in Diels-Alder

reactions of maleic anhydride”; J. Chem. Ed.; No. 81; (2004); p.p. 1633-1636.

[44] http://www.expasy.org/sprot/ /20/04/2009/

[45] http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.html /20/04/2009/

[46] http://swissmodel.expasy.org/ /20/04/2009/

[47] http://zhang.bioinformatics.ku.edu/I-TASSER/ /20/04/2009/

[48] Yogeeswari P.; Sriram D.; Thirumurugan R.; Jit L.R.J.S.; Ravagendran J.V.; Kavya

R.; Rakhra K. and Saraswat Vivek; “Synthesis of N4-(2, 4-dimethylphenyl)

semicarbazones as 4-aminobutyrate aminotransferase inhibitors”; Acta Pharm.; 56;

(2006); p.p. 259-272.

[49] Copeland Robert A.; Enzymes: A practical introduction to structure, mechanism and

data analysis; 2nd

Edition; Edit. John Wiley & Sons. Inc.; U.S.A.; (2000); p.p. 109-134;

267-280. ISBN: 0-471-35929-7

[50] “Farmacología básica del valproato: revisión tras 35 años de uso clínico para el

tratamiento de la epilepsia”; RET. Revista de toxicomanías; 47; (2006); p.p. 11-33

[51] Huang Ren-Qi; Bell-Horner C.L.; Dibas M.I.; Covey D.F.; Drewe J.A. and Dillon

Glenn H.; et al.; ―Pentylenetetrazole-induced inhibition of recombinant -aminobutyric

acid type A (GABAA) receptors: mechanism and site action”; The Journal of

Pharmacology and Experimental Therapeutics; Vol. 298, No. 3; (2001); p.p. 986-995

[52] Luszczki Jarogniew J.; Wojcik-Cwikla Joanna; Andres Marta M. and Czuczwar

Stanislaw J.; “Pharmacological and behavioural characteristics of interactions between

vigabatrin and conventional antiepileptic drugs in pentylenetetrazole-induced seizures

in mice: an isobolographic analysis”; Neuropsychopharmacology; 30; (2005); p.p. 958-

973.

[53] Luszczki Jarogniew J.; Zuchora Marek; Sawicka Katarzyna M.; Kozińska and

Czuczwar Stanislaw J.; “Acute exposure to caffeine decreases the anticonvulsant action

of ethosuximide, but not that of clonazepam, phenobarbital and valproate against

http://www.expasy.org/sprot/

http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.html

http://swissmodel.expasy.org/

http://zhang.bioinformatics.ku.edu/I-TASSER/

165

pentetrazole-induced seizures in mice”; Pharmacological Reports; 58; (2006); p.p. 652-

659.

[54] Córdova Moreno Rebeca; Síntesis y evaluación bioquímica y farmacológica de la

maleimida del ácido m-benzoico; Tesis; E.S.M.-I.P.N.; México, D.F.; (1998); p.p. 18,

38-41.

[55] Vogel H. Gerhard and Vogel Wolfgang H.; Drug discovery and evaluation:

Pharmacological assays; 1st Edition; Edit. Springer-Verlag Berlin Heidlberg New York;

Germany; (1997); p.p. 227-228. ISBN: 3-540-60291-7

[56] Świąder M; Łuszczki J.; Wielosz M. and Czuczwar S.; “Influence of vigabatrin. A

novel antiepileptic drug, on anticonvulsant activity, on conventional antiepileptics in

pentetrazole-induced seizures in mice”; Polish Journal of Pharmacology; No. 55;

(2003); p.p. 363-370

[57] White H.S.; “Preclinical development of antiepileptic drugs: past, present and

future directions”; Vol. 44; Suppl. 7; (2003); p.p. 2-8

[58] Quintana Zavala Delia; Estudio preliminar para el desarrollo de una síntesis

asimétrica de -aminoácidos -sustituidos. Preparación y alquilación altamente

diastereoselectiva de N-N’-acetales quirales derivados del ácido -aminopropiónico;

Tesis para obtener el grado de maestro en ciencias; México, D.F.; CINVESTAV-IPN;

(1989); p.p 41

[59] Durst H.D. and Gokel G.W.; Química orgánica experimental; 1ª Edición; Edit.

Reverté; Barcelona, España; (2005); p.p. 199. ISBN: 842917155X.

[60] http://pharmacycode.com/es/Vigabatrin.html /06/10/10/

[61] Trujillo Ferrara J.; Vázquez I; Espinosa J; Santillán R.; Farfán N. and Höpfl H.;

“Reversible and irreversible inhibitory activity of succinic and maleic acid derivatives

on acetylcholinesterase”; European of Pharmaceutical Sciences; 18; (2003); p.p. 313-

322

[62] Trujillo Ferrara J.; Montoya Cano L. and Espinoza Fonseca M.; “Synthesis,

anticholinesterase activity and structure-activity relationship of m-aminobenzoic acid

derivatives”; Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters; 13; (2003); p.p. 1825-1827.

[63] Fruk L. and Graham D.; “The electronic effects on the formation of N-aryl-

maleimides and isomaleimides”; Heterocycles; Vol. 60; No. 10; (2003); p.p. 2305-2313

[64] Gaussian 94, Revision E.2; Frisch, M. J.; Trucks, G. W.; Schlegel, H. B.; Gill, P. M.

W.; Johnson, B. G.; Robb, M. A.; Cheeseman, J. R.; Keith, T.; Petersson, G. A.;

http://pharmacycode.com/es/Vigabatrin.html%20/06/10/10/

166

Montgomery, J. A.; Raghavachari, K.; Al-Laham, M. A.; Zakrzewski, V. G.; Ortiz, J.

V.; Foresman, J. B.; Cioslowski, J.; Stefanov, B. B.; Nanayakkara, A.; Challacombe,

M.; Peng, C. Y.; Ayala, P. Y.; Chen, W.; Wong, M. W.; Andres, J. L.; Replogle, E. S.;

Gomperts, R.; Martin, R. L.; Fox, D. J.; Binkley, J. S.; Defrees, D. J.; Baker, J.; Stewart,

J. J. P.; Head-Gordon, M.; Gonzalez, C.; Pople, J. A.; Gaussian, Inc.: Pittsburgh, PA,

1995.

[65] Schaftenaar, G.; Noordik, J. H.; “The effect of isodensity surface sampling on ESP

derived charges and the effect of adding bondcenters on DMA derived charges”; J.

Comput.-Aided Mol. Design; Vol. 14, No. 3; (2000), p.p. 233-242.

[66] Herrera, R.; Jiménez-Vázquez, H. A.; Tamariz, J.; “A new diastereoselective

approach to the synthesis of -hydroxy--amino acids based on the frame of

captodative olefins”; ARKIVOC; No. 6; (2005); p.p. 233-249.

[67] PC Spartan Pro 1.05; Wavefunction Inc.; 18401; Von Karman Ave.; Suite 370;

Irvine, CA 92612; U.S.A.; (2000).

[68] Humphrey W.; Dalke A. and Schulten K.; ―VMD: visual molecular dynamic”; J.

Mol. Graph.; No. 4; (1996); p.p. 849-857.

[69] Autodocktools 1.5.0

[70] Autodock

[71] Autodocktools 1.5.2

[72] Sugaya, E.; Ishige A. and Sekiguchi k.; ―Pentylenetetrazol-induced convulsion and

effect of anticonvulsants in mutant inbred strain E1 mice”; Epilepsia; Vol. 27; No. 4;

(1986); p.p. 354-358.

Escuela Nacional de Ciencias Biológicastesis.ipn.mx/jspui/bitstream/123456789/9501/1/21.pdfII....

Documents

Transcript of Escuela Nacional de Ciencias Biológicastesis.ipn.mx/jspui/bitstream/123456789/9501/1/21.pdfII....