分子克隆技术实验流程 Molecular Cloning Workflow · 分子克隆技术实验流程...

分子克隆技术实验流程Molecular Cloning Workflow

孟文举

上海翊圣生物科技有限公司产品主管

2018.09 匠心品质，快乐科研

Good Science

，Good Products

问题1：了解分子克隆常见方法及原理

问题2：解决克隆实验的难题，提升成功率

通过这场讲座，您可以了解：

匠心品质，快乐科研/Good Products ,Good Science

重组DNA技术基因影响性状

定义：目的是将不同的 DNA片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。也叫分子克隆技术。


主要内容

分子克隆实验中的重组质粒

常见的分子克隆方法

15min完成连接实验

一步法克隆技术的注意事项


第一部分

分子克隆实验中的重组质粒

匠心品质，快乐科研


质粒改造之路

第一个重组质粒：

pSC101

天然质粒：F plasmid 第二代重组质粒：

pBR322


重组质粒

蛋白表达质粒克隆质粒病毒表达质粒报告基因质粒基因敲除质粒

pSpCas9-GFP9325bppUC18/19

2686bppET-28a5369bp

pLenti-puro7067bp

pCMV-luc6226bp


重组质粒的组成元件• 复制起始位点Ori

• 抗性基因

• MCS

• 表达系统元件

• 标签蛋白

• 报告基因

决定拷贝数、兼容性

选择性标记

外源基因插入

调控转录、翻译

FLAG、His、GST

Luciferase


“认识”质粒，读懂质粒图谱

质粒图谱

Promoter

MCS

Transcription Termination

Ribosome binding site

Ampr

Origin of replicationneor

“relaxed” or “stringent”


“认识”质粒，读懂质粒图谱

启动子

genepromoter5＇ 3＇

RNA聚合酶转录因子

真核生物原核生物

CMVEF1α

U6

T7T7lac

常见启动子


中间载体终载体目的基因

T载体(序列分析)

表达载体等(功能研究)

一步法

分子克隆策略


第二部分

常见的分子克隆方法



★

★

★

1. TA克隆2. 酶切连接克隆3. TOPO克隆

克隆方法

连接酶修饰酶

重组

酶

5. SLIC

7. Gateway克隆 6. 一步法克隆★

★

特殊内切酶

混合

酶

4. Golden Gate Clone质粒改造——分子克隆方法


1.传统TA克隆

T4 DNA ligase

• ccdB基因：suicide gene

ccdB

AmpR

pUC originTOPO-Vector1865bp

• Topoisomerse I：末端活化

• T-A配对：特异性

• 依赖布朗运动

2.TOPO克隆

克隆载体构建“有时”很重要


TOPO克隆优势

1/ 简单、快速

2/ 高效，大片段成功率高

3/ 关键点

不能超过5min？


1.传统克隆方式

T4 DNA ligase

T4 DNA ligase


Polymerase

T4 DNA Polymerase

insert

homologyhomology

A5＇3＇

Exonuclease

dTTP

A5＇3＇

Exonuclease

T

homology

vector

2.SLIC方式

NNNNNNNN

NNNNGGTCTCNCCAGAGNNNNN

GGTCTCNNNNNCCAGAGNNNNN


5＇

3＇

recognition sequence homology

insert

BsaⅠ

insert

识别序列丢失

insertVector

T4 DNA ligase

3.Golden Gate Assembly方式


4.Gateway克隆方式• 方向性：BP和LR• 无缝连接：否

• dedicated vector：

• 多片段连接：

酶切连接克隆方法 SLIC Golden Gate克隆技术

Gateway克隆技术

Enzymes ü restriction enzyme

ü T4 DNA ligaseü T4 DNA Polymerase

ü BsaⅠ

ü T4 DNA ligase

ü BP Clonase

ü LR Clonase

Advantages • 性价比高 • 不受酶切位点限制• 多片段连接

• 高通量克隆• 多片段连接

• 高通量克隆• 快速• 效率高

Disadvantages

• 克隆效率低• 酶切位点选择困难• 操作步骤多• 操作时间长• 实验应用性有限

• 克隆效率低• 受载体限制• 应用范围有限

• 受载体限制• 价格昂贵• 步骤较繁琐• 1-4个片段的连

接

Applications CAS9载体构建高通量构建

各种方法的比较


第三部分

15min完成连接实验



一步法克隆技术的原理

3＇

5＇ 5＇

5＇

5＇

3＇

Exonuclease

Annealing

5＇

3＇

High Fidelity Polymerase

Extension

Repair DNA ligase

5＇3＇

质粒载体线性化质粒


一步法克隆技术的实验流程

①质粒线性化

• 线性化方式：酶切或者PCR

• 酶切产物纯化：胶回收

②插入片段的制备

引物设计带末端同源序列的插入片段

• 引物设计：15bp载体重叠序列

• PCR产物纯化：单一产物（建议纯化）

③片段重组&产物转化

• 线性化载体/插入片段：1:2-1:3

• 反应条件：50℃ 15min

• 感受态细胞：108cfu/ug


片段扩增片段纯化片段酶切

连接转化

载体酶切

产物纯化

产物纯化

片段扩增片段纯化 15min连接转化

载体酶切产物纯化

传统方法

One Step

一步法克隆技术更加简便、快速

克隆鉴定

克隆鉴定


连接时间：15-30min 载体/片段比：1:2-1:4

插入片段范围：几百bp- 8kb

载体：pFastBac1，4.7 kb 载体：pCDH，8 kb


点突变载体构建策略

例：某疾病模型机制研究时，需要构建K基因点突变模型，

观察点突变前后疾病严重程度变化。一步法克隆技术的应用

K13 5’UTR K13 3’UTR

K13 ORF (2217b)Chromosome

K13 point mutation ••


点突变载体构建策略

例：某疾病模型机制研究时，需要构建K基因点突变模型，

观察点突变前后疾病严重程度变化。

vector

一步法克隆技术的应用

•••


构建策略：

•••

K13

arm1 3' UTR

•••arm1 3' UTR

•••

1、突变点的引入

2、多个片段的连接

arm1Vector

•••

3' UTR Vector•••


多片段重组

载体：pCAMIBA1302，10kb 载体量：160ng/20μl反应体系重组反应条件50℃，20min。


快速

高效

简单

限制因素少

应用广泛

成本低

不受酶切位点限制

单片段、多片段、点突变

片段制备简单，无需酶切

15min完成连接反应

阳性克隆率达90%以上一步法克隆技术的优势


第四部分

一步法克隆技术的注意事项



http://122.112.245.84:8080/hieff-clone/ 引物设计工具

一步法克隆技术的引物设计

基因扩增的Tm值重叠序列的Tm值


无克隆生长、克隆数少

无克隆或克隆数较少

假阳性率高

一步法克隆技术的疑难问题

①排除试剂失效阳性对照实验

②引物设计不合适检查序列，GC含量

③载体与片段比例错误重新计算

④含抑制剂载体与片段胶回收

⑤感受态细胞问题 ①效率低；②转化体积过大；③克隆感受态细胞

⑥筛选抗生素错误阳性对照



假阳性率高




假阳性率高

★★★ ★★ ★★


★无条带，菌落PCR不含插入片段

有条带，大小不对

有条带，大小正确，测序错误


2.假阳性率高


★无条带，菌落PCR不含插入片段

有条带，大小不对

有条带，大小正确，测序错误

• 插入片段污染质粒：设置阴性对照

• 线性化片段污染质粒：设置阴性对照

• 序列同源性：不适合，换传统方法构建

• 非特异性扩增：提高特异性

• 插入片段污染模板质粒：设置阴性对照

• 插入片段加入量过大：设置以测序引物和基因特异性引物扩

增鉴定


翊圣科技（上海）技术有限公司 400-6111-883 [email protected]

玩转分子克隆，畅游基因世界


玩转分子克隆，畅游基因世界

翊圣科技（上海）技术有限公司 400-6111-883 [email protected]

Hieff Clone TOPO-T Kit

Hieff Clone TOPO-Blunt Kit

Hieff Clone Plus One-Step Clone Kit

Hieff Clone Plus Multi One-Step Clone Kit

分子克隆技术实验流程 Molecular Cloning Workflow · 分子克隆技术实验流程...

Documents

Transcript of 分子克隆技术实验流程 Molecular Cloning Workflow · 分子克隆技术实验流程...