ENZIMAS REDOX

ENZIMAS REDOX

Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

APLICACIONES INDUSTRIALES


EJEMPLOS INDUSTRIALES OXIDACIONESEJEMPLOS INDUSTRIALES

1) Reducción de C=O) Reducc ón de O

2) Hidroxilación de anillos)aromáticos

3) Oxidación de alcoholes

4) Oxidación de alcanos

5) Epoxidación de alquenos


1.1.-REDUCCIÓN DE ENLACES C=O

OE

OH

(S)S

E

(S)(S)

S SOO

( )S S

OO6 M th l 7 7 di 6 M th l 7 7 di6-Methyl-7,7-dioxo-6,7-dihydro-5H-7Δ6-

6-Methyl-7,7-dioxo-4,5,6,7-tetrahydro-7Δ6-

thieno[2,3-b]thiopyran 4 one

thieno[2,3-b]thiopyran-4-olb]thiopyran-4-one ol

CATALIZADOR: ALCOHOL DESHIDROGENASA


(S)S S

OE

(S)S

(S)

S

OH

S SOO

S SOO

6-Methyl-7,7-dioxo-6,7-dihydro-5H-7Δ6-

thieno[2 3

6-Methyl-7,7-dioxo-4,5,6,7-tetrahydro-7Δ6-

thieno[2 3 b]thiopyran 4thieno[2,3-b]thiopyran-4-one

thieno[2,3-b]thiopyran-4-ol

Enzima: alcohol deshidrogenasa (NADH/NAD+)g ( )Microorganismo: Neurospora crasaCondiciones de reacción:

T = 33º CT = 33 CMedio: acuoso, pH = 3.8-4.3Estado del biocatalizador: células enteras suspendidasRendimiento > 85%ee > 98%Pureza química > 99%Pureza química > 99%Reactor tipo fed-batchPuesto en funcionamiento en 1994

C ñí Z Lif S i M l l


Compañía: Zeneca Life Science Molecules

Utilidad OH HN

SO

NH2

Inhibidor anhidrasa carbónicaUso tópico contra el glaucoma

S SOO

S SOO

SO

NH2

Trusopt

Uso tópico contra el glaucoma(incremento presión intraocular)

Síntesis química: problemaOH

OM

O ClTs, Py OTs

OM

O SLiS MeO

O

HCl Conc HO

O

Síntesis química: problema

OMe OMe HCONH2 SS SS

TFAAtolueno

OHOHOHHN

O

S S

O

S S

OH

LiAlH4H2SO4, 0ºC

S S

OHH2O2

NaWO4S SH

OH

O OS S

HN

O O

MeCN

H2SO4

HSO3Cl

SOCl2

O O

HN

S S

HN

O O

SCl

O ONH3

THF S S

HN

O O

SNH2

O O BH3·DMS

THF S S

HN

O O

SNH2

O O

T t

Proceso nocuantitativo

Trusopt


Síntesis quimioenzimática Despolimerización de plásticos naturales obtenidosa partir de microorganismos

O

O H+, MeOH OH O 1) ClTs, PyMeO

O

p g

On

(R) OMe 2)

SLiS SS

1) 6 M HCl2) TFAA2) TFAA3) H2O2, NaWO4

ON sp ss

OHHNO O

S SO O

Neurospora crassa

pH = 4S SO O

S SO O

SNH2

O

TrusoptTrusopt

OO

si pH > 5

Control de pH es vital

HO2SSS S

O O



O E(S)O

OO OHO



O E(S)O

O

O

O OHO

Enzima: alcohol deshidrogenasa (NADH/NAD+)Microorganismo: Zygosaccaromyces rouxiiC di i s d ió :Condiciones de reacción:

T = 33-35º CMedio: acuoso, pH = 7.0Estado del biocatalizador: células enteras suspendidasConc. Sustrato: 2g L-1 ( < 11 mM)Rendimiento > 85%Rendimiento > 85%ee > 99.9%Pureza química 95%Reactor tipo batch de 300 LRendimiento espacio-temporal 75 g L-1 d-1

Compañía: Eli Lilly and co, USA


p y ,

El límite de toxicidad para el sustrato es de 6 g L-1. Para evitaralteración del biocatalizador, es el SUSTRATO EL QUE SEINMOVILIZA sobre una resina XAD 7 a una conc de 80 g L-1INMOVILIZA sobre una resina XAD-7, a una conc. de 80 g L 1,de manera que la conc. efectiva de sustrato se mantenga siemprea 4 g L-1.g

Esta resina no es tóxica, y comparada con un disolventeorgánico de semejante polaridad (log P < 2) no produced s t li iódesnaturalización.

La resina puede reutilizarse 3 veces sin pérdidas de actividad.Reactor: un tipo especial de batchReactor: un tipo especial de batchDesorción del educto limitada por la conc. en equilibrio de

aprox. 2 g L-1.p gPara separar las células del producto adsorbido en la resina se

emplea un filtro de 150 µm. Así, la resina (aprox. 500 µm) esid l él l ( 5 ) l fil dretenida y las células (aprox. 5 µm) permanenecen en el filtrado.

Posteriormente, el producto se libera de la resina lavando conacetona


acetona.

Esquema

Utilid d i t i d Utilidad: sintesis de unaBenzo[d]-1,2-diazepina útil

en el tratamiento de la esclerosis amilotrópica

lateral



ClOO E

ClO

OOHCl

O (S) O



ClO

OO ECl

O

OOHCl

O (S) O

Enzima: alcohol deshidrogenasa (NADPH/NADP+)Microorganismo: Geotrichum candidum SC 5469C di i s d ió :Condiciones de reacción:

T = 28º CMedio: acuoso, pH = 6.8Estado del biocatalizador: células enteras suspendidasConc. Sustrato: 10 g L-1 ( 66 mM)Rendimiento 95%Rendimiento 95%ee > 99%Reactor tipo batch de 750 L

Compañía: Bristol-Myers Squibb, USA


Inhibidor de la hidroximetil glutaril CoA reductasa (HMG CoA reductasa)

antagonista del colesterol


EJEMPLOS INDUSTRIALESEJEMPLOS INDUSTRIALES







2.1.-HIDROXILACIÓN DE ANILLOS AROMÁTICOS

R RR

+ O2

ER

OH+ O2

OH(R S)

2 NADH 2 NAD+ (R,S)

R= H, F, Me, CF3

CATALIZADOR: BENZOATO DIOXIGENASA


R R

+ O2

E OH

OH(R S)

2 NADH 2 NAD+ (R,S)

R= H, F, Me, CF3

Enzima: benzoato dioxigenasaMicroorganismo: Pseudomonas putidaCondiciones de reacción:Condiciones de reacción:

Estado del biocatalizador: células enteras suspendidas

Compañía: ICI


Proceso habitual en células

+ OE OH Deshidrogenasa OH

+ O2

2 NADH 2 NAD+

OH(R,S)

OH

1,2-cisdihidroxicatecol pirocatecol

En 1968 se describe un mutante de Pseudomonas putida

,

que carece de actividad deshidrogenasa, lo que permiteacumular el producto deseado

+ O2

E OH Deshidrogenasa OHmutante

2 NADH 2 NAD+

OH(R,S)

OH

1,2-cisdihidroxicatecol pirocatecol


El microorganismo Pseudomonas putida presenta una grantolerancia a sustratos aromáticos que, en la mayoría de loscasos son tóxicos para la mayoría de los microorganismos.

No obstante, el cisdihidrox¡catecol presenta un altof i hibi i b l i i l lefecto inhibitorio sobre el microorganismo, por lo que la

fermentación y la biotransformación deben estarseparadasseparadas.

La regeneración del cofactor se produce en el interior delas células con el aporte de una fuente de carbonolas células, con el aporte de una fuente de carbono.

Selectividad del proceso > 99.5%.Utilidad: sintón para la obtención de β-lactamasUtilidad: sintón para la obtención de β lactamas

antivirales.


2.2.-HIDROXILACIÓN DE ANILLOS AROMÁTICOS

EOH

NH

H2O NH

OH

H1/2 O2

H

i d l d h d d l d lindol 2,3-dihidro-1H-indol-2,3-diol

CATALIZADOR: NAFTALENO DIOXIGENASA


OHE

NH

H2O NH

OH

1/2 O2

indol 2,3-dihidro-1H-indol-2,3-diol

Enzima: naftaleno dioxigenasaMicroorganismo: Pseudomonas putidaCondiciones de reacción:

Estado del biocatalizador: células enteras suspendidasEstado del biocatalizador: células enteras suspendidasMedio acuoso

Compañía: Genencor


Utilidad

DeshidrataciónOH

OH

OHaire

O HN

espontáneaNH

OHNH

NH Oíndigo

colorante azul para2,3-dihidro-1H-indol-2,3-diol indol-3-ol colorante azul paraindustria textil

, h ro H n o , o


Este proceso es realmente complejo:

La actividad naftaleno-dioxigenasa es muy baja tanto enla P putida nativa como en los primeros mutantesla P. putida nativa como en los primeros mutantesexpresados en E. coli.

La vida media del las células capaces de oxidar el indol esLa vida media del las células capaces de oxidar el indol esmuy baja (entre 1 y 2 h.)

Concentraciones de indol mayores de 400 mg L-1 sony gtóxicas para las células (se inactiva la ferredoxina)

El indol es un producto de partida muy caro para unproceso industrial. El triptófano es más barato, pero senecesita un paso previo que implica la acción de unatriptofanasatriptofanasa.


NH2 N OHHN

O

OH 2 N NHONa

aire

2+ Cl

O

OH NaOH N OH 2 NaNH2

KOH.NaOH NH

RUTA QUÍMICA CLÁSICA

N

O HN

RUTA QUÍMICA CLÁSICA

NH Oindigo

2 ROOHMo(CO)6

NH2+ HO

OHcatalizador de Ag

fase gaseosa N2ROHH2Ofase gaseosa N

HH2O

RUTA QUÍMICA MÁS NOVEDOSAMitsui Toatsu Chemicals

En la ruta biocatalizada con mutantes expresados en E.coli se parte de glucosa!!:


coli se parte de….glucosa!!:

Ruta biocatalizada con mutantes expresados en E. coli.

Mejora en el sistema de triptofanasa:Mediante mutagénesis dirigida

COOH

GlucosaN

COOH

NH2 Triptofanasa

E

Naftalenodioxigenasa

E

OH

OHNH

E1 NH

E2 NH

Mejora en el sistema de dioxigenasa:Mejores plásmidos

P t á i t tPromotores más resistentesSe alcanza la productividad de P. putida

wild-type









3.1.-OXIDACIÓN DE ALCOHOLES

EOO OO OO+

OH (R) OH (R) OHO(R) isopropilidenglicerol O

(R,S)-isopropilidenglicerol ácido (R)-isopropilidenglicérico(R)-isopropilidenglicerol

CATALIZADOR OXIDASACATALIZADOR: OXIDASA


EOO OO OO+

OH (R) OH (R) OHO(R)-isopropilidenglicerol

(R,S)-isopropilidenglicerol ácido (R)-isopropilidenglicérico(R) isopropilidenglicerol

Enzima: oxidasaMicroorganismo: Rodococcus erythropolisCondiciones de reacción:

T = 30º CM di H 6 8 7 2Medio: acuoso, pH = 6.8-7.2Estado del biocatalizador: células enteras suspendidasConcentración de sustrato 10 g L-1 (76 mM)Concentración de sustrato 10 g L (76 mM)Conversión 50%ee > 98 % para el R-alcohol, > 90 % para el R-ácido


Compañía: International BioSynthetics

Síntesis químicas alternativas (costosas)

CH2OHOHOH 2 acetona

CH2OHOO Pb(OAc)2 OO2 NaBH4 OO2OH

HOHO

CH2OH

ZnCl2OO

CH2OH

2

(S) HO

(R) OH

CH2OH(L)-manitolno natural

1) NaBH42) NaOH3) H+

OH

OH

OH

O

HO acetonaOH

O

HO

O

O

3) H4) Pb(OAC)2

OHOOácido ascórbico

OO O

Utilid d l (R) i ilid li l i tó i l Utilidad: el (R)-isopropilidenglicerol es un sintón quiral de gran utilidad.


3.2.-OXIDACIÓN DE ALCOHOLES

HN R HN RHO

OHOH

E HOOHOHOH

OHCH2OH

OHO

CH2OHCH2OH CH2OH

1-amino-D-sorbitol

6-amino-L-sorbosaD sorbitol

(N-protegido) (N-protegida)

CATALIZADOR: D-SORBITOL DESHIDROGENASA


HNHO

RE

HNHO

RHO

OHOHOH

H H

E HOOHOHO

CH2OH CH2OH

1-amino-D-sorbitol

(N-protegido)

6-amino-L-sorbosa

(N-protegida)( p g ) p g

Enzima: D-sorbitol deshidrogenasaMi i Gl b t dMicroorganismo: Gluconobacter oxydansCondiciones de reacción:

T = 32º CT 32 CMedio: acuoso, pH = 5.0Estado del biocatalizador: células enteras suspendidasConcentración de sustrato 1M (peso molecular depende del grupo

protector).Compañía: Bayer AG


Compañía: Bayer AG

intermedio en la síntesis de inhibidores orales de a-

glucosidasasUTILIDAD

O HNH2 HN R HN R

HOOHOHOH

CH OH

aminación

reductiva

HOOHOHOH

CH OH

PROTECCIÓNHO

OHOHOH

E HOOHOHO

CH OHCH2OH

D-glucosa

CH2OH1-amino-

D-sorbitol

CH2OH CH2OH

1-amino-D-sorbitol

(N-protegido)

6-amino-L-sorbosa

(N-protegida)útiles en el tratamiento de

1) DESPROTECCIÓN2) NaBH4

útiles en el tratamiento deenfermedades relacionadas

con carbohidratos(DIABETES MELITUS)

NHHO

HO

OHN

HOHO

OHOH

OHHO

1-desoxinojirimicina

OHHO

miglitol


Las síntesis puramente químicas de 1-desoxinojirimicinaLas síntesis puramente químicas de 1-desoxinojirimicinarequieren muchos pasos, y una ardua tarea de prteocción-desprotección.

El grupo amino debe estar protegido (tipo Cbz, pH=8-10) parait bl l dievitar problemas en el medio acuoso.

Las células se producen mediante una fermentación usandoLas células se producen mediante una fermentación usandosorbitol como inductor, y subsiguientemente empleadas para labiotransformación en agua sin adicionar ningún otro nutriente.g g

Las células no están inmovilizadas, pues la alta tasa deó d b í l d lconversión de sustrato que se obtiene se vería limitada por los

problemas difusionales en un sistema inmovilizado.


ESQUEMA DEL PROCESO









4.1.-OXIDACIÓN DE ALCANOS

O

OHO

O

OHO

OO

EO

O

H + O2H

OHSimvastatina 6-β-hidroximetilsimvastatina

(producto mayoritario)

CATALIZADOR: MONOXIGENASAS


Enzima: monooxigenasa (dependiente de flavina)Microorganismo: Nocardia autotropicaCondiciones de reacción:

T = 27º CMedio: acuoso, pH = 6.8Estado del biocatalizador: células enteras suspendidasConcentración de sustrato < 0.02 g L-1 (< 0.05 mM)Concentración de producto: 0.8 g L-1 ( 1.85 mM)

Compañía: Merck Sharp & Dohme


Debido a una gran inhibición por sustrato, la concentración desimvastatina tiene que mantenerse por debajo de 0.05 mM, porlo que tiene que ser añadida en contínuo a partir de unalo que tiene que ser añadida en contínuo, a partir de unadisolución madre de 20 g L-1, que se tiene que mantener a 45ºCpara evitar la precipitación.p p p

Se obtiene una conc. final de producto de 0.8 g L-1, por lo queempleando un reactor de 19.000 L de capacidad, se obtienenh st 15 2 k d d t sió l b l d l 24 %hasta 15.2 kg de producto, con una conversión global del 24 % yuna selectividad del 70%


4.2.-OXIDACIÓN DE ALCANOS

ON E N

O

OH

N + O2 N

OH

2,5-dimetilpirazina ácido 5-metilpirazina2 b íli-2-carboxílico

CATALIZADOR: MONOXIGENASAS


Enzima: xilenooxigenasa (monooxigenasa)Microorganismo: Pseudomonas putida ATCC 33015Microorganismo: Pseudomonas putida ATCC 33015Condiciones de reacción:

T = 30º CT = 30 CMedio: acuoso, pH = 7.0Estado del biocatalizador: células enteras en crecimientoEstado del biocatalizador: células enteras en crecimiento,

suspendidas.Concentración de producto: 24 g L-1 ( 174 mM)Concentración de producto: 24 g L ( 174 mM)

Compañía: Lonza AGCompañía: Lonza AG


Si se emplean células en reposo, se produce una acumulacióndel intermedio 2-hidroximetil-5-metilpirazina, el cual

i difí il d id h l á idposteriormente es difícil de oxidar hasta el ácido.El sustrato que se emplea para la fermentación es una

m zcl d p xil n (75%) 2 5 dim tilpi zin unqu n smezcla de p-xileno (75%) y 2,5-dimetilpirazina, aunque no sedetectan metabolitos de oxidación del primero.

La biotransformación se detiene cuando el crecimientoLa biotransformación se detiene cuando el crecimientobacteriano entra en la fase estacionaria.

La máxima concentración de producto (24 g L-1) vieneLa máxima concentración de producto (24 g L ) vienelimitada por esta inhibición.


Otros productos que se obtiene con la misma metodología:

NO

UTILIDAD:

NO

NO O O

N

NOH

ON

NOH

N

NNH

S NH

NH

OO H

Acipimox (antilipolítico)

Glipicide, antiglucémico (diabetes)


( p ) (diabetes)








5 1 EPOXIDACIÓN DE ALQUENOS5.1.-EPOXIDACIÓN DE ALQUENOS

R ROE

CATALIZADOR: MONOOXIGENASAS


OER R

OE

Enzima: monooxigenasa (dependiente de flavina)Microorganismo: Nocardia corallina B 276Condiciones de reacción:

T = 30ºCMedio: bifásico orgánico/acuosoEstado del biocatalizador: células enteras suspendidas

Compañía: Nippon Mining


CONSIDERACIONES:

Se usa un sistema bifásico para 1-alquenos de longitud decadena comprendida entre C6 y C12cadena comprendida entre C6 y C12.

El disolvente orgánico no debe ser tóxico (ej. hexadecano uotros alcanos)otros alcanos).

Esta segunda fase orgánica disminuye la concentración delepóxido (causa inhibición) y permite la extracción en contínuoepóxido (causa inhibición) y permite la extracción en contínuodel mismo

Para estos 1-alquenos entre C6 y C12 se emplean células enq y preposo, pues los productos son más tóxicos para elmicroorganismo. Para alquenos superiores, se pueden utilizarél l i i tcélulas en crecimiento.


áEn el caso de alquenos más pequeños (C3-C5), al ser gases atemp. ambiente su toxicidad celular es muy alta, y larecuperación de los productos de reacción se complicarecuperación de los productos de reacción se complica.

Las células tienen que hacerse crecer en glucosa u otrasLas células tienen que hacerse crecer en glucosa u otrasfuentes similares de carbono para garantizar de formaefectiva la regeneración del cofactor.efectiva la regeneración del cofactor.

La velocidad de aireación durante la fermentación tiene queLa velocidad de aireación durante la fermentación tiene queincrementarse para extraer el epóxido formado (muy tóxico).Las pequeñas cantidades de epóxido en la fase gaseosa puederecuperarse con un sistema especial de extracción.


ALQUENOSCOMERCIALIZADOS

Pueden ser terminales osubterminales

ALQUENOSEPOXIDABLES

subterminales.Cuando se puedaformar un estereo-EPOXIDABLES formar un estereocentro, predomina laconfig. R


ESQUEMA


UTILIDAD SINTÉTICA DE LOS EPÓXIDOS


5 2 EPOXIDACIÓN DE ALQUENOS5.2.-EPOXIDACIÓN DE ALQUENOS

EO(S)

OO

R+O2

R R

CATALIZADOR: OXIDASA


EO(S)

OO

+O2R R

O2

Enzima: oxidasa.Microorganismo: Pseudomonas oleovaransCondiciones de reacción:

T = 37ºCMedio: acuosoEstado del biocatalizador: células enteras suspendidasConcentración de producto > 7 g L-1 (>0.26 M)ee > 99.9%

Compañía: Shell Brocades (USA)


UTILIDAD

(S)O

ONH2 (S)

OOH H

N(S)

R

(S)

R

Bloqueantes de receptores β-adrenérgicos(cardiotónicos)(cardiotónicos)

OOH H

N OOH H

N OOH H

N(S)

O N(S)

O N

O

(S)O N

H2N

O

propranolol metoprolol atenololp p m p atenolol


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