Enzimas presentes en la miel de abejas (Revision)
-
Upload
yamit-castaneda -
Category
Documents
-
view
734 -
download
3
description
Transcript of Enzimas presentes en la miel de abejas (Revision)
REVISIÓN DE ENZIMAS PRESENTES
EN LA MIEL
Ibagué, 28 de septiembre 2010
INTRODUCCIÓN
La miel es una sustancia natural producida por las abejas que tiene como base el
néctar de las flores, según Ajlouni y Sujirapinyokul, 2010, su composición es
ampliamente influenciada por la región y las condiciones climáticas, así como el
sustrato (flores) de las que proviene. La miel como producto natural contiene
diferentes enzimas, entre las más importantes podemos encontrar enzimas como
amilasas, invertasas, glucosidasas, catalasas y fosfatasas. De acuerdo a lo
establecido por Ureña Varela, Arrieta Bolaños, Umaña, Zamora y Arias Echandi en el
2007, la miel como cualquier producto alimenticio debe cumplir con ciertas normas,
que sirven como base para determinar la calidad del producto, entre estos se
destacan como lo indica Vold!ich y Rajchl (2009) la actividad de diastasas (α-β-
amilasas) y la relación directa de esta enzima con el contenido de Hidrometilfurfural
(HMF) que según Ureña Varela, Arrieta Bolaños, Umaña, Zamora y Arias Echandi en
2007, indican aldulteracion por adicion de diferentes copuestos tales como: azucar
invertido, jarabe de maíz de alta fructosa, e inclusive la inclusión de enzimas
foráneas; o por sobrecalentamiento y envejecimiento de una muestra de miel.
DIASTASA (α-, β-, γ-, AMILASA)
La α-amilasa (1,4-α-D-glucano-glucanohidrolasa o glucogenasa) tiene la función de
romper las cadenas de almidón al azar produciendo dextrinas y β-amilasa (1,4-α-D-
glucano-maltohidrolasa o amilasa sacarogénica) como se muestra en la grafica:
Grafica 1: Reacción de la amilasa. Enzimas presentes en la miel (2010)
Según Said Ajlouni y Puripast Sujirapinyokul (2010) el codex alimentario en el año
2010 propone dos indicadores de calidad para la miel, el 5-hidroximetilfurfuraldehido
y la amilasa (número diastasico). Esto ocurre porque la miel es usualmente calentada
para facilitar su procesamiento y mantener su calidad, pero el excesivo tratamiento
con calor genera la formación de HMF, así como la inactivación de las enzimas, lo
que reduce la calidad de la miel. De la misma manera la adición de componentes
como lo mencionan M. Voldrich, A. Raichl, H. Cizkova y P. Cuhra en el 2009, tales
como adición de sacarosa, almidón hidrolizado, jarabe de maíz de alta fructosa o
incluso azucar de mesa, reducen el numero diastasico, pero esta adulteración puede
ser enmascarada por la adción de amilasas foráneas, por ejemplo la amilasa usada
en panadería.
Métodos de detección y cuantificación
Existen diferentes métodos para la detección y cuantificación de la amilasa, en esta
revisión se tocaran diferentes métodos tales como:
El método tradicional de acuerdo a M. Voldrich, A. Raichl, H. Cizkova y P.
Cuhra en el 2009, llamado procedimiento Schada, mide la actividad de la α-
amilasa, de acuerdo a la cantidad de enzima que puede convertir 0,01 gramos
de almidón hasta un punto final en una hora a 40°C. En este ensayo una
solución de almidón, la cual reacciona con el yodo para producir una solución
que servirá de patrón para la prueba. Esta reacción se explica porque el yodo
se coloca en el interior de la hélice que forma la amilosa (en las regiones
hidrofóbicas), formando un complejo de color azul. Cuando la α-amilasa actúa,
degrada la amilosa, se desintegra la hélice y la solución de yodo ya no tendrá
el color establecido
Figura 1: Formación del complejo iodo-
almidón en la detección de la actividad
amilasa Imagen tomada de:
(http://chemwiki.ucdavis.edu/index.php?
title=Biological_Chemistry/Carbohydrates/
C ase_Studies/Starch_%26_Iodine)
Según Said Ajlouni y Puripast Sujirapinyokul (2010) una muestra de miel
tratada con calor (5 gramos) es disuelta en 15 ml de agua mili-Q y 5 ml de una
solución buffer de acetato (pH 5.3), es tranferida a un frasco volumétrico de 50
ml que contiene 3ml de solución de cloruro de sodio y se diluye a volumen.
Usando una pipeta volumétrica, 10 ml de solcion de miel son transferidos a un
frasco de 50 ml y colocados en baño de agua a 40°C con un segundo frasco
que contiene 10 ml de solución de almidon al 1%. Despues de 15 minutos, 5
ml de la solución de almidon son agregados a la solución de miel, mesclados y
temporizados. En intervalos periódicos, por pirmera vez en 5 minutos, alicotas
de 0,5 ml de la mezcla son mezclados con solución de yodo y 22 ml de agua
Mili-Q, e inmediatamente medidos a 660 nm contra un blanco de agua. Una
grafica de absorvancia contra tiempo es usada para determinar el tiempo tn, al
que una absorvancia de 0,235 fue alcanzada.
El número diastasico se calcula siguiendo los patrones de la Comisión Internacional
de Miel (2002), de acuerdo al método Phabedas es el siguiente:
Figura 2: Cálculo del número diastasico. Comisión Internacional de Miel. 2002
INVERTASA
La invertasa (β-D-fructofuranoisdasa, sacarasa, fructohidrolasa), es la enzima
encargada de catalizar la hidrolisis de sacarosa según lo menciona Kotwal y Shankar
(2009), esta enzima se encuantra presente ne las glándulas hipofaringeas dela abeja
de la miel (Apis mielifera), la hidrólisis genera una mezcla equimolar de glucosa y
fructosa, esta es tan dulce como la sacarosa debido al alto grado de dulzura de la
fructosa, lo que indica un incremento del contenido de azucar sin producir
cristalización, asi una de las aplicaciones comerciales más importantes de la
invertasa es la producción de azucares no cristalizables. Debido a su naturaleza
higroscópica, el azucar invertida es usado como humectante en la manufactura de
dulces de centro suave. Esta enzima también es usada en la degradación de
azucares que serán objeto de fermentación, creación de mieles artificiales. El único
inconveniente es el alto valor de producción de esta enzima, la cual en su mayoría es
extraída de bacterias, pero estas poseen muchos inconvenientes como la poca
estabilidad frente a cambios de pH o temperatura.
Para su determinación y cuantificación, según lo establecido por la comisión
internacional de miel 2002, el procedimiento es el siguiente: 5 gramos de miel en una
solución de buffer (fosfato acido de potasio KH2PO4 y fosfato acido de sodio
dihidratado Na2HPO4.2H2O), y se lleva a 25 ml en un frasco, para luego tratarla en
baño de agua a 40°C por 5 minutos. La prueba se basa en la transformación del
sustrato p-nitrofenil-α-D-gucopiranosa (pNPG) a glucosa y p-nitrofenol y esta
actividad es medida a 400 nm por fotometría.
El cálculo del número diastasico se realiza de acuerdo a lo establecido en la
siguiente ecuación:
Figura 4: Cálculo del número invertasico. International Honey Commission
2002
GLUCOSIDASAS
De acuerdo a Low et al 1988, (mencionado por Pontoh, y Low 2002), proponen que
el origen de esta enzima puede darse en la abeja de la miel, la enzima β-glucosidasa
esta presente en los sacos de miel y los órganos segregan enzimas digestivas en la
boca. Muchas glándulas descargan secreciones en las partes bucales, por ejemplo
las torácicas, de la cabeza y las glándulas hipofaringeas. En los insectos, la β-
glucosidasa se subdivide en tres clases de acuerdo al sustrato. La clase I incluye
enzimas con actividad β-glucosidasa y aril β-glucosidasa, estas enzimas tiene la
capacidad hidrolizar celubiosa, lactosa, β-p-nitrofenil-glucosidasa (β-PNPG), β-p-
nitrofenilgalactosidasa (β-PNPGal), β-p-nitrofenilfructosidasa (β-pPNPFru) y otros
sustratos similares. La clase 2 incluye solo los que poseen actividad glicosil β-
glucosidasa, sin embargo ella solo puede hidrolizar sustratos con celubiosa y lactosa.
La clase 3 incluye enzimas con solo actividad aril (o alkil) β-glucosidasa, estas
enzimas tiene una actividad similar a la β-PNPG.
La acción de la β-glucosidasa trae consigo la producción de peróxido de hidrogeno
(H2O2), el cual aporta el componente antibacterial a la miel, y este producto se usa
para determinar la presencia de glucosidasas, mediante la producción de peroxido de
hidrogeno. Se toma una muestra de 10 gr de miel y se diluye en 40 ml de agua Mili.Q
a una temperatura de 20ºC. luego de una hora se mide el máximo de peroxido de
hidrogeno producido mediante Marckoquant hydrogen-peroxide testtrips Nr. 10.011.
Se compara el color de la tira con la escala de 0 a 25 mg de peroxido/litro, este valor
se multiplica por 5 para determinar la cantidad de microgramos de peroxido, creados
por 1 gramo de miel en una hora
FOSFATASA ACIDA
Según Alonso-Torre, Cavia, Fernandez-Muino, Moreno, Huidobro y Sancho 2008, la
fosfatasa acida es una enzima que muestar valores relacionados con la fermentación
de la miel, esta enzima presenta una resistencia menor al calor que la diastasa,
invertasa y glucosa oxidasa. La determinación de lo actividad fosfatasa acida es
hecha mediante un método que determina el fosforo inorgánico producido por β-
glicerol fosfato incubando las muestras 2.25 horas a 35°C.
La actividad fosfatasa acida es determinada por el método de Gunter y Burckhart
1967 (mencionado por Alonso-Torre et al. 2008), este esta basado en la reacion
entre le 4 nitrofenilfosfatode disodio y agua en un pH catalizado por la fosfatasa
ácida. El monto de 4-nitrofenol porducido es medido por espectofotometria a 400 nm.
La actividad es calculada como miligramos de fosforo por 100 gramos de miel en 24
horas.
Figura 5: Cálculo de la actividad de la fosfatasa ácida. Alonso-Torre et al. 2008
CATALASA
Esta enzima tiene una relación directa con el contenido de glucosa oxidasa, ya que el
papel de esta enzima según Weston en el 2000, se encarga de degradar le peróxido
de hidrogeno y convertirlo en agua y oxigeno. Esta enzima se encuantra presente en
el néctar de las flores, pero la cantidad es mínima en comparación con la presente en
el polen, lo que indica que una alta concentración de polen en la miel, tendrá una
relación directa con la disminución del peróxido de hidrogeno.
REFERENCIAS
1. Said Ajlouni, Puripast Sujirapinyokul. Hydroxymethylfurfuraldehyde and
amylase contents in Australian honey. Department of Food Science and
Agribusiness, Melbourne School of Land and Environment, The University of
Melbourne, Australia- Food Chemistry 119 (2010) 1000–1005
2. Maurico Ureña Varela, Esteban Arrieta Bolaños, Eduardo Umaña, Luis Gabriel
Zamora y María Laura Arias Echandi. Evaluación de la posible adulteración
de mieles de abeja comerciales de origen costarricense al compararlas
con mieles artesanales provenientes de apiarios específicos.
ALAN v.57 n.1 Caracas mar. 2007
3. M. VOLD!ICH, A. RAJCHL, H. "Í#KOVÁ and P. CUHRA Detection of
Foreign Enzyme Addition into the Adulterated Honey. Department of Food
Preservation and Meat Technology, Institute of Chemical Technology in
Prague, 166 28 Prague, Czech Republic; Czech Agriculture and Food
Inspection Authority in Prague, 150 06 Prague, Czech Republic. Vol. 27, 2009
4. Stefan Bogdanov. HARMONISED METHODS OF THE INTERNATIONAL
HONEY COMMISSION. Swiss Bee Research Centre. FAM, Liebefeld, CH-
3003 Bern, Switzerland (2002)
5. S.M. Kotwal and V. Shankar. Immobilized invertase. Division of Biochemical
Sciences, National Chemical Laboratory, Pune-411008, India. Biotechnology
Advances 27 (2009) 311–322.
6. J. Pontoh, N.H. Low. Purification and characterization of β-glucosidase
from honey bees (Apis mellifera). Department of Applied Microbiology and
Food Science, University of Saskatchewan, Saskatoon, Canada. Insect
Biochemistry and Molecular Biology 32 (2002) 679–690
7. Jian-Fen Zhang, Yu-Guo Zheng, Yin-Chu Shen. Inhibitory effect of
valienamine on the enzymatic activity of honeybee (Apis cerana Fabr.) α-
glucosidase Institute of Bioengineering, Zhejiang University of Technology,
Hangzhou 310014, People’s Republic of China. Pesticide Biochemistry and
Physiology 87 (2007) 73–77
8. Roderick J. Weston. The contribution of catalase and other natural
products to the antibacterial activity of honey: a review. Industrial
Research Ltd, Lower Hutt, New Zealand. Food Chemistry 71 (2000) 235±239
9. S.R. Alonso-Torre, M.M. Cavia, M.A. Fernandez-Muiñoz, G. Moreno, J.F.
Huidobro, M.T. Sancho, Evolution of acid phosphatase activity of honeys
from different climates. Universidad de Burgos, Área de Nutrición y
Bromatología, Departamento de Biotecnología y Ciencia de los Alimentos,
Facultad de Ciencias, Plaza. Misael Bañuelos García s/n, E-09001 Burgos
(Castilla y León), Spain. Food Chemistry 97 (2006) 750–755