Empleo de métodos biotecnológicos en la producción de semilla de ...

Reseña Científica Biotecnología Vegetal Vol. 12, No. 1: 3 - 24, enero - marzo, 2012ISSN 1609-1841 (Versión impresa)

ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)

Empleo de métodos biotecnológicos en la producción de semillade papa

J. Igarza Castro1*, D. Agramonte2, Y. Alvarado-Capó2, M. de Feria2, T. Pugh3 *Autor para correspondencia.

1Centro de Investigaciones y Servicios Ambientales y Tecnológicos (CISAT). Laboratorio de BiotecnologíaVegetal. CITMA. Calle 18 esquina Maceo. Holguín, Cuba. e-mail: janetigarza@holguín.inf.cu

2Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaníkm 5.5, Santa Clara, Villa Clara, Cuba. CP 54 830

3Escuela Socialista de Agricultura Tropical (ESAT). Instituto de Investigaciones Agrícolas (INIA). Maracay.Aragua. Venezuela.

RESUMENLa papa es un cultivo de gran importancia económica. A nivel mundial, la propagación de papa mediante elcultivo in vitro de yemas axilares se utiliza comúnmente para la producción de plantas in vitro y microtubérculos.Ambos constituyen el material vegetal núcleo de un programa de producción de semilla de papa. El presentetrabajo se realizó con el objetivo de presentar una revisión de la literatura científica sobre la propagación depapa por métodos biotecnológicos. Además, se describen las principales características del cultivo así comode los procesos de tuberización en condiciones naturales e in vitro.

Palabras clave: microtubérculos, minitubérculos, plantas in vitro, Sistemas de Inmersión Temporal

ABSTRACTPotato crop has a large economic importance. Worldwide, propagation of potato by in vitro culture of axillarybuds is commonly used in the production of in vitro plants and microtubers. These constitute the core plantmaterial of a production program of potatoes seeds. This study aimed to present a review of scientific literatureon the potato propagation by biotechnological methods. This also describes the main characteristics of thiscrop and the tuberization processes under natural and in vitro conditions.

Key words: in vitro plants, microtubers, minitubers, Temporary Inmmersion System

CONTENIDOEL CULTIVO DE LA PAPAOrigen, descripción botánica y taxonómica El proceso de tuberización Factores que intervienen en la tuberizaciónMÉTODOS DE PROPAGACIÓN DE PAPA Propagación por métodos biotecnológicos Producción de microtubérculos de papa Sistemas de Inmersión Temporal Aplicaciones de la inmersión temporal en el cultivo de papa Producción de minitubérculos en casa de cultivo y campoREFERENCIAS

INTRODUCCIÓN

La papa (Solanum tuberosum L.), es uno delos cultivos alimenticios más importantes tantoen países desarrollados como en vías dedesarrollo. En cuanto al valor de la producciónmundial que supera los 300 millones detoneladas (FAOSTAT, 2010), ocupa el cuarto

lugar, después del trigo (Triticum vulgareWuild.), el arroz (Oryza sativa L.) y el maíz (Zeamays L.).

Hasta el año 2005, los países en desarrolloproducían poco más del 20.0%. Sin embargo,en ese año se elevó hasta el 52.0% de laproducción, con lo que superó a la del mundo

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desarrollado. Aun así, hoy en día la produccióny el consumo mundial de papa crece a tasasinferiores que la población (FAO, 2008).

La importancia económica de la papa sefundamenta en que, por su elevada capacidadde producción de sustancias alimenticias porunidad de superficie, es tres veces mayor queen los cereales, lo que permite suplir dealimento a un elevado número de personas(Coleman et al., 2001).

Por su valor nutritivo, este cultivo aporta en 100gramos de papa fresca: 78.0% de humedad,2.1% de proteína, 18.5% de almidón, 1.0% decenizas y 0.1% de grasas. Además, contieneminerales (560.0 mg de potasio, 50.0 mg defósforo, 9.0 mg de calcio, 7.0 mg de sodio y0.8 mg de hierro) y vitaminas (0.1 mg deTiamina, 0.04 mg de Riboflavina, 20.0 mg devitamina C y 1.5 mg de Niacina), lo cual colocaa la papa como uno de los cultivos estratégicosmás importantes para contribuir a solucionarlos problemas del hambre en el mundo (FAO,2008).

Este cultivo se propaga asexualmentemediante tubérculos o a través de semillabotánica. Por ello, es propenso a la infecciónacumulativa por microorganismos. Esto provocaafectaciones en los rendimientos, la calidadcomercial de los tubérculos y el intercambio degermoplasma. En los programas de producciónde semilla, la aplicación de técnicas de cultivo invitro, combinadas con el diagnóstico ysaneamiento de los principales patógenos delcultivo, ha contribuido a incrementar sueficiencia (Tovar et al., 1985; Struik y Lomme,1990; Agramonte, 1999).

Desde hace años, a nivel mundial, lapropagación de papa mediante el cultivo in vitrode yemas axilares se utiliza comúnmente parala producción de plantas in vitro ymicrotubérculos. Ambos constituyen el materialvegetal núcleo de un programa de producciónde semilla de papa, libre de microorganismospatógenos. Se obtienen en condicionesasépticas y controladas, en un medio de cultivoartificial y pueden ser transferidos a casas decultivo o campo, donde dan lugar aminitubérculos que posteriormente pueden serusados en otros esquemas de multiplicaciónpara lograr tubérculos semilla. También puedenemplearse para el intercambio y la

conservación de germoplasma (Estrada et al.,1986; Struik y Lomme, 1990; Ahloowalia, 1994;Ranalli et al., 1994; Gopal et al., 2004). Tienencomo ventajas la rápida multiplicación enelevado número, en un corto periodo de tiempoy en un espacio reducido, durante todo el año.Los microtubérculos, además, pueden seralmacenados y se facilita su transportación loque disminuye los costos (Tovar et al., 1985;Struik y Lomme, 1990; Donnelly et al., 2003).

El presente trabajo se realizó con el objetivode presentar una revisión de la literaturacientífica sobre la propagación de papa pormétodos biotecnológicos. Además, sedescriben las principales características delcultivo así como de los procesos detuberización en condiciones naturales e in vitro.

EL CULTIVO DE LA PAPA

La papa (Solanum tuberosum L.) es un cultivoque ha ganado considerable importancia en lasúltimas décadas. Aunque se originó en Américase cultiva en Europa, Asia y África. China es elmayor productor de este tubérculo (FAOSTAT,2010). Es hoy uno de los cultivos másimportantes para la producción de alimentos.Tal vez ningún otro cultivo en la historiacontemporánea ha jugado un papel másimportante en la seguridad alimentaria y lanutrición con un impacto en el bienestar socialde la personas (Sarkar, 2008).

En el cultivo de la papa la producción comercialde tubérculos para consumo fresco,procesamiento industrial o semilla, es el interésprincipal, por lo tanto, las condiciones queestimulan la formación y el almacenamiento dealmidón (tuberización) deben ser las másfavorables para el desarrollo de los tubérculosy el consecuente éxito del cultivo (García ySalas, 2005; Aslam et al., 2011).

Origen, descripción botánica y taxonómica

La papa es originaria de los altos Andes enAmérica del Sur. Su cultivo se inició en el áreadel Lago Titicaca cerca de la frontera actualentre Perú y Bolivia. En estos países seencuentra la mayor variabilidad genética deespecies silvestres y variedades cultivadas, loque se confirma con la existencia 42 especiesde Solanum existentes en Bolivia (Huamán,1997; Ochoa, 2001).

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Figura 1. Esquema de una planta de papa. Tomado de: Huamán (1986).

S. tuberosum L. (Figura 1) es una plantaherbácea, anual, tuberosa, perenne enentornos seleccionados a través de sustubérculos, caducifolia, de tallo erecto o semi-decumbente, que puede medir hasta 1.0 mde altura (Huamán, 1986). La planta de papapuede llegar a producir frutos con semillasviables, pero la forma de propagaciónutilizada a nivel de la producción comerciales la vegetativa a través de tubérculos (Naiky Karihaloo, 2007).

Existe un gran número de especies de papa,pero en la producción comercial se empleanprincipalmente las dos subespecies de S.tuberosum (Huamán, 2007).

La taxonomía del cultivo es la siguiente:• Tipo: Spermatophyta• Clase: Angiospermas• Subclase: Dicotiledonea• Orden: Tubbiflorae• Familia: Solanaceae

• Género: Solanum• Especie: S. tuberosum• Subespecies: andigenum, tuberosum (Hawkes, 1990)

S. tuberosum subsp. andigenum es nativa delos Andes del Perú y se distribuye desdeVenezuela hasta el norte de Argentina (Hawkes,1990).

Las diferencias morfológicas entre las dossubespecies de S. tuberosum son muypequeñas. La principal de ellas es que S.tuberosum subsp. andigenum depende deun fotoperiodo corto para tuberizar. S.tuberosum subsp. tuberosum , t ieneplantas, hojas y tubérculos más grandes,por esta razón se cultiva más (Hawkes,1990; 1994). Además de estas diferenciasmorfológicas, ambas subespecies se hallannetamente diferenciadas a nivel genético, tanto anivel del genoma cloroplástico como nuclear(Hosaka y Hanneman, 1988).


El proceso de tuberización

La planta de papa tuberiza en días cortos ynoches frías. En ella, cada brote tiene elpotencial de tuberizar, y esta plasticidadinherente es definitivamente un obstáculobiológico hacia la comprensión de losmecanismos exactos del control del procesode tuberización (Struik y Lomme, 1999; Sarkar,2008). Además de los estolones, prácticamentetodas las yemas axilares en tallos o esquejespueden formar un tubérculo, siempre que laplanta haya sido inducida a tuberizar.

La tuberización es un proceso morfofisiológicoaltamente coordinado que está influenciado porvariables genéticas, fisiológicas ymedioambientales (Villafranca et al., 1998) y tienelugar en los estolones subterráneos bajo lainfluencia de factores extrínsecos e intrínsecos(Sarkar, 2008). Sin embargo, después de décadasde investigación aún no se dispone de un modeloúnico que integre todos los eventos fisiológicos,bioquímicos y moleculares que tienen lugar en laplanta de papa ante la presencia de diferentesfactores inductores de la tuberización.

Dada la importancia de la papa en laalimentación humana el estudio y comprensióndel proceso de tuberización es de granrelevancia.

Las fluctuaciones en la duración del día sonfundamentales para promover la diferenciaciónde los estolones en tubérculos. La duración deldía se percibe en las hojas por el fitocromo B yen condiciones inductivas éstas sintetizan unaseñal sistémica que se transporta a losestolones subterráneos para inducir eldesarrollo del tubérculo. Los estolonessubterráneos inducidos detienen sualargamiento, comienzan a ensancharse yposteriormente se forman los tubérculos(Vreugdenhil et al., 1999). Si el estolón no formaun tubérculo entonces emerge del suelo yforma un tallo aéreo (Jackson, 1999).

El tubérculo de la papa funciona como unareserva de almacenamiento masivo de unaserie de macromoléculas, principalmentealmidón y proteína. Durante el crecimiento deltallo principal de la papa, brotes lateralessubterráneos (estolones), caracterizados porentrenudos alargados, extremo apical curvado,y el crecimiento diageotrópico (Cutter, 1978) se

desarrollan. Siguiendo las señales ambientalesespecíficas, que incluyen fotoperiodo corto, altaintensidad de luz y bajos niveles de nitrógeno,los estolones son inducidos a formar tubérculos(Ewing y Struik, 1992). La transformación delos estolones en tubérculos repercute en granmedida en la fisiología de la planta completa,porque los tubérculos en desarrolloposteriormente se convierten en los mayoressumideros presentes en la planta (Oparka,1985). Durante las primeras etapas deformación de los tubérculos los estolonesmodifican su hábito de crecimiento, cesa laelongación y se inicia un crecimiento radial enla zona subapical (Jackson, 1999; García-Flórez et al., 2009). El aumento de la divisióncelular y la expansión es seguida rápidamentepor un enorme depósito de almidón y proteínasde almacenamiento, como la patatina, comoresultado de la expresión coordinada de losgenes implicados en la biosíntesis de almidóny proteína (Prat et al., 1990; Visser et al., 1994;Viola et al., 2001).

La floración y la tuberización requieren latransmisión de señales desde las hojas a otraspartes de la planta (Abdala et al., 1996). Elalmacenamiento activo de hidratos de carbonoen los tubérculos conduce a la reducción delcrecimiento vegetativo, la floración, y lafructificación (Ewing, 1995; Sarkar, 2008).Estudios recientes han indicado que lasseñales que inducen la floración y latuberización podrían estar relacionadas y sehan identificado mecanismos molecularesdonde se activan genes específicos de latuberización (Navarro et al., 2011).

Los azúcares no sólo son importantes fuentesde energía y componentes estructurales,también son moléculas reguladoras delmetabolismo, el ciclo celular, el desarrollo y laexpresión génica (Sheen et al., 1999; Raíceset al., 2003). El proceso de tuberizacióninvolucra una descarga de asimilatos en elfloema hacia la región subapical del estolón endesarrollo. La sacarosa es la fuente carbonadamás abundante en el ensanchamiento de losestolones, mientras que la concentración deglucosa y fructosa es más baja y muestra unpatrón similar en todas las etapas de desarrollo(Viola et al., 2001).

Los requerimientos ambientales para queocurra la tuberización varían entre subespecies


y cultivares de papa. S. tuberosum subsp.andigenum requiere estrictamente fotoperiodode día corto para la formación del tubérculo.Sin embargo, plantas de esta subespecie coninactivación del gen del fitocromo B (queparticipan en la detección del fotoperiodo)tuberizan, incluso en presencia de luz continua.Las plantas pertenecientes a S. tuberosumsubsp. tuberosum son menos dependientesde la duración del día (Jackson, 1999).

Factores que intervienen en la tuberización

Entre los factores que intervienen en latuberización se han mencionado lascaracterísticas propias de la variedad, la edadfisiológica de la semilla, la temperatura delsuelo, la humedad, la nutrición de la planta, laintensidad y duración de la luz (favorecido endías cortos), la acción de reguladores delcrecimiento y la incidencia de plagas yenfermedades. Todos estos factores, ademásde afectar el cultivo, influyen directamente ensu rentabilidad (Ewing y Shuik, 1992; Jackson,1999; Coleman et al., 2001; Jiménez-Terry etal., 2010).

Dada la complejidad de las interacciones entrereguladores del crecimiento y carbohidratos enla tuberización (ambas clases involucranmúltiples especies moleculares activas que soninductoras de expresión génica diferencial)parece difícil separar sus efectos. En estesentido, es probable que un enfoque fisiológicodirigido hacia el estudio de las señalesenergéticas primarias (como el potencial redoxen organelos, células y tejidos así como el índicede fosforilación o metilación de proteínas claveen cierta vía metabólica), más que a las señalesbioquímicas dependientes al parecer de laseñalización energética, y por ello ubicadas enun nivel más alto en la jerarquía de laseñalización, pueda resultar en mayoresbeneficios para la comprensión de los eventosque ocurren en la tuberización (Pfannschmidtet al., 1999).

Se ha demostrado que la iniciación de latuberización, ya sea en plantas intactas o ensegmentos nodales, se encuentra bajo elcontrol coordinado de muchos de losreguladores del crecimiento como lasgiberelinas, citoquininas, ácido abscísico, ácidojasmónico y otros (Abdala et al., 1996; García-Flórez et al., 2009). A pesar de que la función

de algunas hormonas en la tuberización siguesiendo controvertida existen evidencias que hanestablecido el papel inhibidor de las giberelinas(Jackson, 1999; Sarkar, 2008).

De esta manera, se conoce que la aplicaciónexógena de giberelinas, promueve laelongación del estolón e inhibe la formación delos tubérculos mientras que ante una caída enel nivel de giberelina, se observan los primerossignos visibles del ensanchamiento en la zonasubapical del estolón. Además de actuar comolos reguladores dominantes de la transición deestolón a tubérculo, las giberelinas tambiénjuegan un papel en la respuesta al fotoperiodoen la tuberización. La reducción de los nivelesde giberelinas, se acompañan de cambios enla morfología, metabolismo y la expresión degenes en las hojas de plantas inducidas atuberizar (Jackson, 1999; Sarkar, 2008; Bou-Torrent et al., 2011).

En general, la señal del fotoperíodo se integracon otros factores del medioambiente talescomo la disponibilidad de nitrógeno,temperatura, intensidad de la luz, así como conel estado metabólico general de la planta, demodo que las plantas pueden tuberizar inclusobajo días de fotoperiodos largos (Jackson,1999).

MÉTODOS DE PROPAGACIÓN DE PAPA

El tubérculo de la papa se considera como lasemilla unitaria tradicional y su calidad reflejalas condiciones en que se ha desarrollado elcultivo, incluyendo su estado fitosanitario. Enmuchos países, la imposibilidad de producirsemilla básica de modo estable haincrementado la importación de ésta encantidades significativas (Lago, 1991).

La papa se propaga vegetativamente portubérculos-semillas lo que asegura laconservación de características varietalesdurante generaciones sucesivas. Sin embargo,debido a su forma de propagación asexual estásometida a un alto riesgo de contaminación porvirus, hongos, bacterias e insectos, durante elperíodo de cultivo y almacenamiento. Tambiénal emplear el material vegetativo por ciclosrepetidos puede ocasionar degeneración delcultivo por la acumulación de enfermedades,especialmente virales (Scherwinski y Luces,2004). También puede ser propagada por


semilla botánica pero esta vía se empleafundamente con fines de mejoramientogenético.

El valor potencial del cultivo de tejidos en laproducción de papa ha sido ampliamentereconocido a nivel mundial. Esta tecnología seemplea en muchos países para obtener semillalibre de patógenos y por el consecuentebeneficio para los productores (Pereira y Fortes,2003; Rafique et al., 2004; Naik y Karihaloo,2007; Hoque, 2010).

Propagación por métodos biotecnológicos

La propagación in vitro de papa es mediante elsubcultivo de yemas axilares. Se puedenobtener tanto plantas in vitro comomicrotubérculos (Salas, 1995; Agramonte,1999; Borda et al., 2001; Donnelly et al., 2003;Gopal et al., 2004; Calderón et al., 2008).

En el cultivo in vitro convencional las plantasse cultivan en recipientes cerrados en unentorno aséptico y con la presencia de unmedio de cultivo sólido, semisólido o líquido. Elmedio de cultivo contiene, además, altasconcentraciones de sacarosa como fuente decarbono, sales inorgánicas, vitaminas y otrosaditivos en dependencia de la especie y de latécnica de cultivo (Aragón et al., 2009).

En la propagación de papa han sidoempleados medios de cultivos en estado líquidoy en estado semisólido, este último ha sido elmás empleado. Los primeros incluyen lafacilidad de preparación, esterilización ymanipulación, pero en condiciones estáticasprovocan un efecto depresivo sobre elcrecimiento del tejido en el cultivo in vitro, yasea por hipoxia o por hiperhidricidad (Debergh,1983; Alvard et al., 1993; Ziv et al., 1998). Lahipoxia es causada por una baja disponibilidadde oxígeno, necesaria para el desarrollo de lostejidos, que le produce serias afectaciones enel crecimiento de los explantes (Orellana,1998).

Las plantas de papa propagadas in vitro puedenproducir microtubérculos cuando se colocanen condiciones adecuadas (Wang y Hu, 1982;Estrada et al., 1986). Estos generalmente seoriginan en estructuras aéreas de la plantaaunque algunos pueden formarse en el mediode cultivo (Hussey y Stacey, 1984). Estos

ofrecen ventajas para el almacenamiento,traslado y plantación en casas de cultivo, asícomo permiten el intercambio de germoplasma(Estrada et al., 1986; Gopal et al., 1998; Pruskiet al., 2003; Kanwal et al., 2006).

La producción de tubérculos in vitro fue descritapor primera vez como una herramientaexperimental para el examen de la tuberizaciónde la papa y los problemas fitopatológicos(Barker, 1953; Mes y Menge, 1954). Desde esafecha se han utilizado diferentes términos paranombrarlos, por ejemplo: mini-tubérculosproducidos in vitro (Lewis et al., 1998),vitrotubérculos (Mandolino et al., 1996), pero seha aceptado internacionalmente el uso deltérmino microtubérculos (Wattimena, 1983).

El empleo de plantas in vitro y microtubérculosen la producción de semilla de papa tieneventajas con respecto a la semilla convencionalya que están libres de patógenos, se obtieneun gran número en cortos periodos de tiempo,se reducen los costos de labores agronómicasen el mantenimiento de germoplasma encampo, etc. Además, pueden ser propagadosen cualquier época del año, se facilita elintercambio de material genético y se reduceel riesgo de pérdidas genéticas al evitar lamezcla del material vegetal por cruzamiento.Sin embargo, se requiere personalespecializado, infraestructura y equipamiento,con productos químicos de elevado costo(Pérez et al., 1998). Por otra parte, en laproducción de semilla de papa por métodosbiotecnológicos en la siembra directa de plantasin vitro en campo se producen pérdidas en eltraslado. En consecuencia, se elevan losrequerimientos de atenciones culturales porpersonal altamente calificado, se hanincrementado las pérdidas de tubérculos en lascosechas por daños o enfermedades así comola conservación, debido principalmente a la altapresencia de microorganismos patógenos delsuelo (Jiménez-Terry et al., 2000).

Producción de microtubérculos de papa

El primer informe sobre tuberización in vitro fuepublicado por Baker (1953), quien utilizó brotesetiolados para inducir tuberización en un mediode cultivo con 8.0 g l-1 (m/v) de sacarosa. A partirde ahí comenzó la utilización de reguladoresdel crecimiento a favor de la tuberización, loque ha sido objeto de intensas investigaciones


(Wang y Hu, 1982; Estrada et al., 1986; Leclereet al., 1994; Gopal et al., 1998; Ebadi eIranbakhsh, 2011).

En condiciones in vitro la formación de lostubérculos es sincrónica (Coleman et al., 2001).Se han obtenido en varios sistemas decrecimiento con medioambiente variado,diferentes constituyentes de los medios de cultivoe intervalos de almacenamiento. Muchas de lasinteracciones entre los parámetros de crecimientoin vitro y la subsiguiente productividad parece serespecífica para el genotipo. A pesar de lasdiferencias, existen evidencias de analogías enla respuesta de crecimiento entre los tubérculosobtenidos en el campo y los microtubérculos(Donnelly et al., 2003).

Los sistemas de producción in vitro demicrotubérculos consisten esencialmente encolocar segmentos nodales de plantas in vitroo plantas completas en un medio de cultivopara la inducción de la tuberización(caracterizado por un alto contenido desacarosa y en algunos casos complementadocon sustancias reguladoras del crecimiento).Los explantes nodales tuberizansincrónicamente cuando se cultivan in vitro, enla oscuridad en un medio con contenido denitrógeno reducido y concentración desacarosa óptima (Jackson y Prat, 1992).

Generalmente, el proceso se desarrolla en dosetapas, una primera de crecimiento y desarrollode los segmentos nodales y otra detuberización. En los protocolos para laobtención de microtubérculos propuestos pordiferentes autores las plantas in vitro en la etapade tuberización se colocan en la oscuridad yaque se ha comprobado que en presencia de laluz, este proceso se puede retrasar (Estradaet al., 1986; Dobranski y Mandi, 1993; Gopal etal., 1998). En dichas condiciones las yemasaxilares se diferenciarán en un tubérculo enlugar de en una hoja (Veramendi et al., 1999).

No obstante, los microtubérculos pueden serobtenidos in vitro en variadas condiciones(Gopal et al., 1998). Por ejemplo, muchoscientíficos han tratado de alterar el balancehormonal de la planta para favorecer latuberización, a través de modificar lasconcentraciones en el medio de cultivo decitoquininas, como 6-Bencilaminopurina (6-BAP), Kinetina y Zeatina o retardantes del

crecimiento como Paclobutazol (Wang y Hu,1982; Agramonte, 1999; Rafique et al., 2004;Aslam et al., 2011). Además, se ha inducido latuberización con elevadas concentraciones desacarosa (6.0 – 8.0%)(m/v), variando elfotoperiodo o la atmósfera interna de losrecipientes de cultivo, respectivamente (Wangy Hu, 1982; Akita y Takayama, 1994; Yu et al.,2000; Ebadi e Iranbakhsh, 2011). Losresultados de estas investigaciones hanpermitido afirmar que la tuberización in vitro omicrotuberización en la papa es un procesomuy complejo, influenciado por factoresgenéticos, ambientales y fisiológicos(Villafranca et al., 1998; Pereira et al., 2005).

En general, hay consenso en la comunidadcientífica acerca de que entre las condicionesque inducen la tuberización in vitro seencuentran: concentración de sacarosa en elmedio de cultivo de 8.0% (m/v) (Garner y Blake,1989; Khuri y Moorby, 1995; Vreugdenhil et al.,1998; Xu et al., 1998; Ebadi e Iranbakhsh, 2011),temperatura de 18-22 ºC y oscuridad o a bajasintensidades de luz (Struik y Lomme, 1990;Seabrook et al., 1993; Jackson, 1999).

Entre los factores principales que influyen eneste proceso se encuentran el genotipo (Gopalet al., 1998), los componentes del medio decultivo, reguladores del crecimiento y elsuministro de carbohidratos como fuentes deenergía (Xu et al., 1998; Vespaciano y Campos,2003; Aslam et al., 2011). Otros factores aconsiderar son el fotoperiodo (Seabrook et al.,1993; Fujiwara et al., 1995; Gopal et al., 1998),la temperatura (Harvey et al., 1992; Akita yTakayama, 1994; Otroshy et al., 2009), la luz(Simmons et al., 1989; Percival, 1999; Hoque,2010) y el control efectivo del medioambienteen el cultivo in vitro (Zimmerman, 1995;Desjardins, 1995; Ashraf et al., 2011).

En la literatura científica se ha informado de latuberización in vitro de numerosos cultivaresde papa, tanto en la subespecie tuberosumcomo en la andigenum, aunque predominan losestudios sobre la primera.

Evidencias experimentales apuntan a que laformación de tubérculos in vitro depende de laconcentración de sacarosa, ya que estos sepueden obtener sin ningún tipo de adición dereguladores del crecimiento en el medio decultivo (Garner y Blake, 1989).


Algunos autores han referido un doble papel dela sacarosa en el desarrollo de losmicrotubérculos. Añadida al medio de cultivo,puede actuar como fuente de carbohidratos,como sustancia osmótica o como ambas.Además de ser una fuente de carbonoadecuada y fácilmente asimilable por lasplantas in vitro y que se convierte en almidónen el desarrollo del microtubérculo, la sacarosa,a una concentración de 80.0 g l-1, tambiénproporciona una osmolaridad favorable para eldesarrollo del microtubérculo (Khuri y Moorby,1995).

Por otra parte, la sacarosa parece ser una señalespecífica ya que ni la glucosa ni la fructosason tan efectivas como la sacarosa para suplirlos requerimientos de azúcares para eldesarrollo de los tubérculos (Ewing, 1987). Lasaltas concentraciones de sacarosa inducen latranscripción de varios genes implicados en elproceso de almacenamiento en los tubérculos(Visser et al., 1994; Raíces et al., 2003).

Otros factores que influyen en la tuberizaciónin vitro se relacionan con la atmósfera gaseosaen el recipiente de cultivo. Se plantea quecuando se cultivan plantas en recipientes conbajo intercambio gaseoso; la masa fresca delas plantas in vitro disminuye y se evidencia unefecto negativo sobre el crecimiento y latuberización (Lugo et al., 2009).

Se ha demostrado que la tuberización de lapapa puede ser modificada por la ventilaciónforzada (Zobayed, 2005). Con este tipo desistema de cultivo estos autores lograronremover la acumulación de etileno del interiorde la atmósfera interna del frasco de cultivo ymantener una concentración de dióxido decarbono y oxígeno cercana a la atmosférica,condiciones que permitieron incrementar latuberización. Los microtubérculos obtenidospresentaron el doble de la masa fresca y secaque los microtubérculos formados en sistemasde cultivo donde no se logró una adecuadarenovación de la atmósfera interna del frascode cultivo.

Los microtubérculos se pueden obtener enmedio de cultivo semisólido, líquido o unacombinación de estos. Sin embargo, el empleode medios de cultivo líquido puede provocarhipoxia de los tejidos que quedan sumergidosy se ha observado hiperhidricidad.

La hiperhidricidad, ha sido descrita como unsevero desorden fisiológico, causado por lapresencia de grandes cantidades de aguaresidual en los espacios apoplásticos de lostejidos y afecta tanto a las plantas herbáceascomo a las leñosas durante su propagaciónvegetativa in vitro (Ziv, 1995).

Las hojas y los tallos de las plantashiperhídricas muestran una apariencia turgentey superficie acuosa, sus órganos son de ciertomodo translúcidos, menos verdes y se quiebrancon facilidad (Piqueras et al., 1998). Estefenómeno ha sido observado en varioscultivares de papa e informado por diferentesautores como Krueger et al. (1991), Simontonet al. (1991), Berthouly et al. (1995) y Calderónet al. (2008).

Para los problemas de hiperhidratación en losprotocolos de propagación de plantas dondese han empleado los medios de cultivo líquidose han hecho diferentes propuestas basadoen la inmersión parcial y temporal de losexplantes en el medio de cultivo, empleo desoportes de papel, bloques de celulosa oesponjas, adición de medio de cultivo líquidoa cultivos establecidos en medios de cultivocon agar (Simonton et al., 1991; Ziv y Shemesh,1996; Akita y Takayama, 1994; Teisson et al.,1996; Jiménez et al., 1999; Pérez-Alonso et al.,2001), etc.

La formación de microtubérculos hapresentado como principal limitante para suempleo en la propagación comercial, el bajonúmero de tubérculos que se obtiene por planta(máximo 1.0- 1.5), así como su pequeñotamaño, lo que dificulta la conservación a largoplazo y la supervivencia en el trasplante. Noobstante, presentan una serie de ventajascomo la posibilidad de realizar produccionesdurante todo el año, almacenar tubérculos yrealizar la siembra en fecha óptima deplantación, lo cual evita los picos productivosque se presentan con la producción de plantasin vitro, además se elimina la fase deaclimatización y las facilidades en la plantaciónen campo, lo que reduce los costos por esteconcepto (Pérez et al., 1998).

Los microtubérculos se obtienen de formaaséptica en medios de cultivo definidos y enun ambiente controlado. Por ello, son unmodelo atractivo para estudios bioquímicos y


fisiológicos sobre la tuberización (Veramendiet al., 1999). Adicionalmente, el uso demicrotubérculos como herramientas deinvestigación experimental tiene potencial enlas áreas del metabolismo de plantas,evaluación y selección de germoplasma,transformación genética, hibridación somáticay biología molecular (Coleman et al., 2001).

Más de medio siglo ha transcurrido desde quelos microtubérculos fueran descritos en papapor primera vez, pero su adopción comopropágulos semilla ha sido irregular a nivelmundial. Falta consenso con respecto a lasprácticas óptimas de producción demicrotubérculos y su relativa productividad enrelación con otros propágulos para laproducción de minitubérculos (Donnelly et al.,2003). En la mayoría de los casos referidosanteriormente los microtubérculos se obtienenen recipientes de cultivo pequeños (de 250 a300 ml de volumen total) a los cuales seadicionan entre 30 y 50 ml de medio de cultivo.Por consiguiente, la altura de las plantas in vitroestá limitada por las dimensiones de losrecipientes y para obtener un elevado númerode microtubérculos se requiere manipulartambién un elevado número de estos, lo cualincrementa los costos. Además, se obtienenentre uno y dos microtubérculos por explanteinicial (segmento nodal de aproximadamente1.0 cm), generalmente son pequeños y conmasa fresca inferior a 0.5 g. Por otra parte, noen todas las yemas axilares se induce laformación de microtubérculos y en algunasplantas que quedan sumergidas cuando seañade medio de cultivo líquido en la etapa detuberización se produce hiperhidricidad. Todoello ha atentado contra el uso demicrotubérculos a escala comercial para laobtención de semilla. Sin embargo, suempleo para la conservación degermoplasma está ampliamente aceptado(Gopal et al., 2004). Entre las alternativaspara solucionar estas problemáticas seencuentran modificaciones en la composicióndel medio de cultivo, uso de reguladores delcrecimiento (Estrada et al., 1986; Leclerc etal.,1994), manipulación de las condiciones decultivo como la temperatura, la luz, elfotoperíodo (Seabrook et al., 1993) y el uso demedios de cultivo líquidos que permiten laautomatización del proceso y reducir los costos(Etienne y Berthouly, 2002), pero pueden causarhiperhidricidad (Ziv et al., 1983).

Con respecto a este último aspecto, desdefinales de los años 80 y principios de los 90 delsiglo XX, Akita y Takayama (1988; 1993, 1994a,b), informaron sobre investigaciones dondese evaluaba el uso de sistemas de cultivo conrecipientes de mayor tamaño (vaso de unbiorreactor) y con suministro semicontinuo delmedio de cultivo líquido para obtenermicrotubérculos de papa.

Más adelante, otros autores han empleadosistemas de más bajo costo que losbiorreactores con inmersión continua o parcialde los explantes en el medio de cultivo y conrenovación o no del medio de cultivo paraobtener microtubérculos en diferentescultivares de papa (Ziv y Shemesh, 1996;Teisson y Alvard, 1999; Jiménez et al., 1999;Yu et al., 2000; Pérez-Alonso et al., 2001; Chunet al., 2003; Montoya et al., 2008; Kamarainen-Karppinen et al., 2010).

El incremento de la aereación en los recipientesdel cultivo (Hussey, 1986) y el contactointermitente entre el material vegetal y el mediode cultivo (con una frecuencia y tiempodeterminado), pueden reducir la hiperhidricidad(Aiken- Christie y Jones, 1987). Estas doscaracterísticas se combinan en los Sistemasde Inmersión Temporal (SIT).

Sistemas de Inmersión Temporal

En la micropropagación de plantas, el ambientein vitro donde éstas se desarrollan secaracteriza por alta humedad relativa,temperatura constante, baja densidad de flujode fotones fotosintéticos (PPFD), granfluctuación diurna en la concentración de CO2,alta concentración de sacarosa, sales ysustancias reguladores del crecimiento en elmedio de cultivo; además de la inclusión deagentes gelificantes, la acumulación desustancias tóxicas y la ausencia demicroorganismos (Aitken-Christie et al.,1995).Estas condiciones nutricionales y ambientalesson responsables de la morfología anormal,anatomía y fisiología de las plantas cultivadasin vitro (Desjardins, 1995). Se ha comprobadoque causan bajas tasas de transpiración,fotosíntesis y absorción de agua, nutrientes yCO2, así como altas tasas de respiración en laoscuridad, todo lo cual resulta en un crecimientopobre del material vegetal (Aragón et al., 2004;Aragón et al., 2010; Ashraf et al., 2011).


Varios estudios han revelado la capacidad delas plantas cultivadas in vitro de realizarfotosíntesis, sin embargo, esta se restringe porlas condiciones del ambiente in vitro (Kubota,2001), la composición del medio de cultivo ylos reguladores del crecimiento (Király et al.,2001).

En general, la fotosíntesis en las plantas bajocondiciones in vitro es menor que encondiciones ex vitro (Desjardins, 1995). Lacausa fundamental es la presencia de un medioheterotrófico con altos niveles de sacarosa(Arigita et al., 2002), lo cual disminuye laactividad de la enzima RubisCO (Hdider yDesjardins, 1994). Además, alteraconsiderablemente los procesos bioquímicos,fisiológicos y la morfología de las plantascultivadas in vitro y es una fuente de estrésabiótico (Khuri y Moorby, 1995). Ashraf et al.(2011) confirmaron estas observaciones,utilizando un perfil de metabolitos yherramientas bioinformáticas. Estos autoresestudiaron los cambios intracelulares delmetabolismo causados por la adición exógenade sacarosa en el cultivo fotomixotrófico deplantas de papa y observaron su efecto en laaclimatización.

Las plantas in vitro bajo condicionesheterotróficas no requieren de la síntesis desacarosa, pues la obtienen del medio de cultivocon gran facilidad. Aragón et al. (2004)describieron la asimilación de sacarosa delmedio de cultivo a través de la actividad de laenzima invertasa ácida.

Para solucionar algunas de las problemáticasmencionadas anteriormente se han desarrolladosistemas de cultivo que permiten mejorar elambiente in vitro y la nutrición. Estos incluyen eluso de medios de cultivo líquido y modificacionesen los recipientes y condiciones de cultivo.

Pérez et al. (1998) destacaron entre lasventajas del uso de medios de cultivo líquido:• la mayor facilidad en la preparación,esterilización y manipulación,• los nutrientes se absorben con mayorrapidez,• hay mayor difusión de sustancias tóxicasproducidas por el propio metabolismo de lasplantas,• se incrementa el número de plantas que seobtiene, dado por la disminución en el tiempo

de subcultivo, lo que disminuye los plazos depropagación,• se produce un aumento en la productividadde los operarios de la cabina de flujo laminar,debido a que los explantes solo deben sercolocados en el medio de cultivo, sin lanecesidad de manipularlos de forma individual,• el cambio en la composición del medio decultivo puede efectuarse por simpletransferencia y esto facilita la automatización.

Sin embargo, tienen las siguientes limitantes:• no todas las especies responden igual alcrecimiento, ni todos los genotipos dentro deuna misma especie se comportan igual,• se observa una tendencia a la reducción delcoeficiente de multiplicación a medida que se dansubcultivos continuos en medio de cultivo líquido,• disminuye la oxigenación de los tejidos, locual reduce o elimina la formación de yemasaxilares en los explantes,• pueden ocasionar hiperhidricidad; undesorden fisiológico causado parcialmente porla presencia de grandes cantidades de aguaresidual en los espacios apoplásticos de lostejidos celulares.

Atendiendo a estos nuevos retos para el cultivode plantas con medio de cultivo líquido, se handiseñado equipos y sistemas de cultivo queposibilitan su utilización en la propagaciónmasiva, en los cuales la intervención de lamano de obra se minimiza. Estos se basanen la inmersión temporal de los explantes en elmedio de cultivo (Aitken- Christie, 1991; Alvardet al., 1994; Teisson et al., 1994), solo duranteunos minutos con determinada frecuenciadiaria o mediante burbujeo.

Todos estos sistemas respetan las condicionesmencionadas por Teisson et al. (1999) entre lasque se encuentran: evitan la inmersión continuadel material vegetal en el medio de cultivo, proveenuna adecuada transferencia de oxígeno, facilitanlos cambios secuenciales y automatizados delmedio de cultivo, reducen la contaminaciónmicrobiana y tienen bajo costo.

Entre las ventajas de los SIT sobre lamicropropagación convencional en medios decultivo semisólidos, se incluyen (Aitken-Christie, 1991; Pérez et al., 1998):• se pueden utilizar recipientes de cultivo demayores dimensiones, y los tiempos desubcultivos pueden ser reducidos,


• contacto directo de los explantes con elmedio de cultivo durante cada inmersión, lo quesignifica un aporte más eficiente de elementosnutritivos,• tiempos de inmersión muy cortos, con locual se logra que los tejidos estén cubiertospor una película de medio de cultivo lo cualimpide la desecación,• hay baja resistencia a la difusión de gasesy por lo tanto una mínima interrupción delintercambio de gases entre la planta o embrióny la atmósfera,• renovación completa de la atmósfera dentrodel recipiente de cultivo a intervalos regulares,lo que significa que no hay acumulación degases nocivos como etileno,• agitación por flujo de aire durante la fase deinmersión, lo que causa la dispersión de lostejidos vegetales.

Se ha señalado que la Inmersión Temporalreduce algunos de los problemas que sepresentan en los cultivos permanentes enmedio de cultivo líquido estático, como son lapobre calidad del propágulo y la necesidad detener que subcultivarlos a medio de cultivosemisólido para el posterior crecimiento yenraizamiento. También permite el intercambiobi-direccional de las plantas con elmedioambiente. En este sistema la renovaciónde gases dentro del frasco de cultivo favorece elcrecimiento y desarrollo de los brotes (Etienne yBerthouly, 2002; Escalona et al., 2003).

Se plantea, además, que en este tipo desistema de cultivo las condiciones derenovación periódica de la atmósfera internadel frasco de cultivo logran en las plantascultivadas una mejor relación entre lafotosíntesis y la transpiración, lo cual permiteuna mayor asimilación de nutrientes del mediode cultivo para su crecimiento (Escalona,2006).

La estrategia de adaptación de las plantas alas condiciones de los Sistemas de InmersiónTemporal es una combinación decaracterísticas morfológicas, bioquímicas yfisiológicas que permiten un uso más eficazde los recursos del medio interno en elrecipiente de cultivo (Aragón et al., 2004;Escalona, 2006).

Por ejemplo, Aragón et al. (2006) encontraroncambios en el metabolismo del carbono en

plantas in vitro de plátano (Musa spp., AAA)cv. ‘CEMSA ¾’ cultivadas en en condicionesde inmersión temporal. Estos seevidenciaron a través de altos niveles deactividades enzimáticas de invertasas ácidas(IA) y piruvato quinasa (PQ) acompañadosde bajos niveles de actividad sacarosa fosfatosintasa (SFS) y fosfoenolpiruvato carboxilasa(FEPC). Estos autores indicaron, además,que los cambios inducidos por el ambientein vitro sobre los indicadores de fotosíntesisneta y transpiración demostraron la tendenciade las plantas in vitro a un comportamientofotomixotrófico. Resultados similares encuanto a la no dependencia total de los brotesde la fotosíntesis han sido obtenidos porotros autores (Escalona et al., 2003; Aragónet al., 2010).

Se ha descrito que los biorreactores para elcultivo de plantas permiten regular condicionesóptimas; entre ellas el pH (Lazzeri et al., 1987;Smith y Krikorian, 1990) y la concentración deoxígeno disuelto (DO2) en el medio de cultivo(Preil, 1991; Jay et al., 1992; Jiménez et al.,1995; De Feria et al., 2003). En consecuencia,los sistemas donde se emplea la inmersióntemporal de los explantes en el medio de cultivo,pero que permiten controlar alguno de losparámetros anteriores u otros se han nombradocomo Biorreactores de Inmersión Temporal(BIT) (Escalona et al., 2003).

Las condiciones de cultivo en SIT puedenafectar el crecimiento de las plantas in vitro ysu estado fisiológico, a través de cambios enel medio ambiente in vitro durante todo elperíodo de cultivo debido a las interaccionesentre cada componente de las condiciones decultivo y el crecimiento de las plantas (Kozai ySmith, 1995). Para lograr el crecimiento omultiplicación eficiente de los tejidos oembriones en SIT es necesario determinar laduración y frecuencia de las inmersiones, conlo cual se variarían las condiciones de cultivodentro del recipiente de cultivo: suministro denutrientes y atmósfera gaseosa. Por lo tantoestos son los factores más importantes quedeben ser estudiados y que varíanconsiderablemente de una especie a otra y deun tejido o fase de la propagación a otra (Pérezet al., 1998).

Para mejorar la ventilación de los recipientesde cultivo se han utilizado filtros de gases con


membranas permeables. Al parecer, laconcentración de CO2 dentro de un recipiente decultivo depende de una serie de factores: elrecipiente (volumen, presión de aire, la cantidadde gas permeable, tipo de filtros, etc.), las plantasin vitro (biomasa o número de explantes,características fotosintéticas), el medioambiente(la concentración de CO2 en la cámara decrecimiento, la velocidad de la corriente de aire,etc.). Al utilizar los filtros, la difusión de aire o laventilación natural del recipiente de cultivo puedeser mejorada y la concentración de CO2 en elinterior el recipiente de cultivo se eleva durante elfotoperiodo, lo que resulta en una mayorfotosíntesis, e índices de crecimiento. Mientrastanto, la humedad relativa dentro del recientese reduce, lo que lleva al aumento de latranspiración, la absorción de nutrientes y elagua por las plantas (Xiao et al., 2011).

A nivel mundial existen muchas investigacionessobre el uso de sistemas semiautomatizadospara el cultivo in vitro de células y tejidos deplantas de diferentes especies.

El efecto positivo de la inmersión temporal seha descrito para la micropropagación,microtuberización y la embriogénesis somáticade varias especies de plantas. Entre ellas, sedestacan: embriogénesis somática en café(Cofea arabica L.) (Jiménez et al., 1995;Berthouly et al., 1995; Etienne et al., 1997),cultivo de meristemos de caña de azúcar(Sacharum spp. híbrido) (Lorenzo et al., 1998),micropropagación de piña (Ananas comosusL. Merr) (Escalona et al., 1999), diferentesornamentales (Daquinta et al., 2001),Eucaliptos (Eucalyptus grandis Hill) (Castro etal., 2001), Hevea brasiliensis Mull. Arg. (Martreet al., 2001), Musa spp. (Aragón et al., 2009).

Tanto en el cultivo del ñame (Dioscorea alataL.) (Cabrera et al., 2008) como en papa(Jiménez et al., 1999; Chun et al., 2003;Montoya et al., 2008) se ha empleado conresultados alentadores la inmersión temporalpara la obtención de microtubérculos.

Estos SIT también han servido de base paraestudios fisiológicos sobre los efectos de lasconcentraciones de CO2, la intensidad de la luzy la concentración de sacarosa y su relacióncon cambios en el metabolismo en las plantas(Van Huylenbroeck y De Riek, 1995; Aragón etal., 2009).

Aplicaciones de la inmersión temporal en elcultivo de la papa

Se ha demostrado que los Sistemas deInmersión Temporal estimulan tanto elcrecimiento de las plantas in vitro como elproceso de tuberización en papa. Autores comoAkita y Takayama (1994) lograron incrementarel número de tubérculos formados en un sistemacon dos frascos de cultivo con respecto aresultados previos. Además, refirieron que losmicrotubérculos no se formaron en condicionesde inmersión completa o continua. Estasevidencias han sido corroboradas por otrosinvestigadores (Tabla 1).

Aunque desde la década del 80, del siglo XX,se tienen referencias sobre el uso de mediosde cultivo líquido y el intento de obtenermicrotubérculos de papa en sistemas consuministro semicontinuo del medio de cultivo,hasta el presente no se ha logrado consensoacerca de cuáles son las condicionesóptimas en SIT para cumplir con estepropósito (Tabla 1). Se han empleadodiferentes sistemas de cultivo, densidadesde explantes, frecuencias de inmersión,tiempos de inmersión y medios de cultivo. Noobstante, en todos ha sido un requisitofundamental la concentración elevada desacarosa en el medio de cultivo (8.0 – 9.0%)(m/v), incluso en muchos casos se planteaque es el factor más importante dentro delconjunto que influye en este suceso (Yu etal., 2000; Pérez-Alonso et al., 2001).

Jiménez et al. (1999) demostraron ventajascomparativas de los SIT para obtenermicrotubérculos de papa en dos cultivarescon respecto al empleo de medios de cultivosemisól ido. Estas se manifestaron enincremento en la longitud de los brotes, mayornúmero de entrenudos por planta, mayorvigor, diámetro y masa fresca demicrotuberculos.

El tiempo y la frecuencia de inmersión, elvolumen de medio de cultivo por explante y ladensidad de explantes por recipientes de cultivoestán entre los principales parámetros que hayque tener presente en la producción demicrotubérculos de papa en SIT. Además, enla composición del medio de cultivo se hanvariado las concentraciones de sacarosa y dereguladores del crecimiento.

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Por ejemplo, Ziv y Shemenst (1996), evaluaronpara la microtuberización de la papa enBiorreactores, el efecto de la renovación delmedio de cultivo. Estos autores reemplazaroncada dos semanas el medio de cultivo ylograron un rápido crecimiento de losmicrotubérculos, debido, según sus resultadosa los altos niveles de sacarosa que sonnecesarios en el medio de cultivo para eldesarrollo de la microtuberización.

Igualmente, autores como Teisson y Alvarad(1999), evaluaron varios tiempos de inmersióncada seis horas para la formación demicrotubérculos en el sistema RITA® yobtuvieron los mejores resultados con untiempo de inmersión de 60 minutos cada seishoras. Además, demostraron que el volumende medio de cultivo por segmento nodal influyóen la producción de microtubérculos de papa.Estos autores variaron el volumen de mediode cultivo según el volumen del frasco.

Por su parte, Yu et al. (2000), evaluaron lautilización de sacarosa durante el crecimientode microtubérculos de papa en biorreactoresrotatorios. Estos investigadores remplazaronel 75.0% del medio de cultivo cada dossemanas de cultivo y lograron cuadruplicar elnúmero de microtubérculos con una masafresca superior a 1.0 g en comparación con eltratamiento donde no hubo reemplazo delmedio de cultivo. Además, señalaron que elprincipal factor para la producción demicrotubérculos de mayor masa fresca enbiorreactores era mantener un adecuadosuministro de sacarosa durante toda la fasede desarrollo de los microtubérculos debido ala rápida hidrólisis que esta sufre.

Chun et al. (2003), estudiaron variasdensidades de inóculo y los mejores resultadoscon microtubérculos de masa fresca, fueronal inocular 50 segmentos nodales del cu.‘Atlantic’, Estos autores describieron unprotocolo simple para la producción demicrotubérculos de papa en biorreactor yrevelaron que el crecimiento de los segmentosnodales y la formación de los microtubérculosfueron mucho más eficientes con la inmersióntemporal que con la inmersión constante enmedio de cultivo líquido sin ventilación, en elcual los explantes crecieron pobremente debidoposiblemente a la carencia de oxígeno y a laacumulación de etileno.

En el cultivar ‘Diacol Capiro’, Montoya et al.(2008), lograron la tuberización in vitro comoresultado de enriquecer el medio de cultivo enla etapa de tuberización con vitaminas,antioxidantes y reguladores del crecimiento.

Los SIT ofrecen la posibilidad de producirmicrotubérculos con diámetros y masa frescaadecuados para que puedan ser plantados encampo (Jiménez et al., 1999; Pérez-Alonso etal., 2001). Además, se elimina la problemáticade trasladar plantas in vitro y se puedeprescindir de la fase de producción deminitubérculos en casas de cultivo (Jiménez-Terry et al., 1999).

El Sistema de Inmersión Temporal tambiénpuede ser utilizado para la multiplicación de brotesfuera de la época de siembra, cuando las plantasin vitro no pueden ser inmediatamenteaclimatizadas y trasplantadas. Por lo tanto, variasestrategias son accesibles mediante lacombinación de la inducción y el almacenamientode microtubérculos, de acuerdo con lospatrones estacionales de la agricultura en elcultivo de la papa (Jiménez et al., 1999).

Estos resultados han evidenciado la factibilidaddel uso de SIT para obtener microtubérculosde papa.

Producción de minitubérculos en casa decultivo y campo

Las desventajas principales de un programade semilla de papa basado en métodos depropagación convencional están relacionadascon la baja tasa de multiplicación de las plantascrecidas en campo lo que resulta en un sistemalento e inflexible, con riesgo creciente deenfermedades virales, fúngicas o bacterianasa medida que se incrementa el número demultiplicaciones. Por ello, una de lasalternativas para disminuir el número demultiplicaciones necesarias en campo paraobtener suficiente cantidad de semilla, esproducir minitubérculos en ambientesprotegidos (Lommen, 1995).

Con el cultivo in vitro de plantas a partir desegmentos nodales se pueden producir plantasenraizadas que posteriormente se aclimatizany pueden plantarse en casas de cultivo o campopara producir minitubérculos (Struik y Lommen1990b; 1999).


Los minitubérculos son pequeños tubérculosde papa obtenidos después de laaclimatización de plantas cultivadas in vitro yplantadas a alta densidad en casas de cultivo,canteros o contenedores donde se usandiferentes mezclas de sustratos. Losminitubérculos pueden producirse durante todoel año siempre que las casas de cultivo cuentencon condiciones para ello y son principalmenteutilizados para la producción de semillaprebásica o básica por siembra directa encampo (Lommen, 1999, Ritter et al., 2001). Conel uso de minitubérculos en un programa desemilla puede reducirse el número demultiplicaciones en campo y el tiemponecesario para obtener volúmenes adecuadosde semilla de un cultivar (Lommen y Struik,1992; 1994).

Algunos sistemas comerciales de producciónde semilla de papa que emplean lamicropropagación se basan en la plantación delos microtubérculos y las plantas in vitro encasas de cultivo, para multiplicar mediantecortes sucesivos a las plantas madre o paraobtener minitubérculos. Ésta se realiza enambientes protegidos por malla antiáfidos odirectamente en campo (Salas, 1995;Agramonte, 1999; Bolandi et al., 2011).

Al igual que en otras especies, la calidad delas plantas in vitro es uno de los factores másimportantes que garantiza el éxito durante latransición a las condiciones ex vitro (VanHuylenbroeck y De Riek, 1995; Estrada-Lunaet al., 2001; Crafts-Brandner et al., 2002).

Cuando se emplean plantas in vitro paraobtener minitubérculos en campo se afrontandificultades con el traslado y se incrementanlas pérdidas por los daños que estas sufren(Jiménez-Terry et al., 2011). En este sentido,los microtubérculos tienen ventajas ya que sumanipulación y traslado es más fácil y sepueden almacenar (Lakhowa y Ellouze, 1993;Pruski et al., 2003; Kanwal et al., 2006). Noobstante, los microtubérculos obtenidos enmedios de cultivo semisólido generalmente notienen el diámetro y la masa fresca adecuadapara su plantación directa en campo (Kanwalet al., 2006; Ebadi e Iranbakhsh, 2011).

Kawakami et al. (2003) informaron sobre elcrecimiento y rendimiento en campo de plantasde papa procedentes de microtubérculos. En

el cultivar ‘Norin 1’, estos autores emplearonmicrotubérculos con 0.5 – 1.0 g y de 1.0 – 3.0g de masa fresca y tubérculos de semillaconvencional de 50.0 g de masa fresca ydemostraron el potencial de losmicrotubérculos para la producción de semilla.Aunque al inicio las plantas procedentes demicrotubérculos tenían menor superficie foliarque las de semilla convencional, en lossiguientes 40 días de cultivo los índices de estavariable fueron similares.

Gopal et al. (1998) evaluaron en campomicrotubérculos de 22 genotipos de papa encomparación con tubérculos semillas. Eltrabajo se desarrolló durante dos años, en dosestaciones, primavera y otoño. Estosinvestigadores concluyeron que es posibleestablecer criterios de selección en las plantasa partir de los microtubérculos, debido a laestabilidad en cuanto a hábito de crecimientode los tallos, características morfológicas delas hojas, pigmentación de los tallos, vigor dela planta, así como para la forma y el color delos tubérculos en comparación con las plantasque se obtuvieron de los tubérculos semillautilizados tradicionalmente para la propagaciónde este cultivo.

Por su parte, Pérez-Alonso et al. (2001)emplearon los Sistemas de Inmersión Temporaly lograron comparar en campo microtubérculosdel cultivar ‘Desirée’ con minitubérculosprocedentes de plantas in vitro . Losmicrotubérculos mostraron un mayorrendimiento, diámetro y masa fresca.

Según Pruski et al. (2003), en losmicrotubérculos de papa producidos en lossistemas de cultivo automatizados, los demayor tamaño y masa fresca, son los másdeseados para la producción comercial, porqueellos pueden ser usados para obtenerminitubérculos en condiciones de casa decultivo o pueden ser plantados en campo sinprevia fase de aclimatización, o almacenadosdurante un período determinado de tiempo, sinpérdida excesiva de masa fresca que puedanafectar su brotación.

También, Montoya et al. (2008) evaluaron encampo la respuesta de microtubérculosobtenidos en SIT. Estos produjeron mayornúmero de minitubérculos que las plantas invitro y los minitubérculos lo que permitió


demostrar que estos materiales vegetales sepueden emplear en programas de producciónde semilla.

El sustrato empleado en las casa de cultivoinfluye en el desarrollo de las plantas in vitro ymicrotubérculos. Por ejemplo, Kowalski et al.(1999) informaron diferencias significativas enla supervivencia y sanidad de poblaciones delas plantas in vitro de papa en la fase deaclimatización cuando utilizaron bolsas consustrato zeolita 100.0%, de forma comparativacon poblaciones de plantas in vitro plantadasen un suelo ferralítico rojo típico. Por su parte,Jiménez- Terry et al. (2011) plantearon que laproducción de minitubérculos de papa cv.‘Desirée’ en casa de cultivo con sustrato zeolitaa partir de plantas cultivadas in vitro puedeincrementarse y que la supervivencia y elrendimiento neto eran mayores que en campo,al igual que las pérdidas desde el traslado parala conservación en frigorífico fueron menores.

CONCLUSIONES

Atendiendo al análisis de la literatura científicaconsultada se puede considerar que laobtención de semilla de papa es una de lasactividades de mayor importancia paragarantizar la producción sustentable de estetubérculo. En este contexto, la biotecnologíaagrícola puede contribuir a incrementar laeficiencia en la multiplicación de material vegetallibre de patógenos y con calidad genética,morfológica y fitosanitaria. Se ha comprobadoque el uso de medios de cultivo líquidos y losSistemas de Inmersión Temporal permitenobtener microtubérculos de mayor calidad quejunto con las plantas in vitro pueden formarparte de un esquema de producción de semilla.Además, los microtubérculos tienen ventajassobre las plantas in vitro ya que se facilita sumanipulación, almacenamiento y conservación,entre otras. Considerando que la tuberizaciónin vitro es un proceso complejo que es afectadopor las condiciones de cultivo, además de otrosfactores genéticos y fisiológicos, se requierenestudiar las condiciones que permitan logrardicho propósito en los cultivares de interéscomercial.

AGRADECIMIENTOS

A las facilidades creadas por el Convenio deColaboración Cuba-Venezuela para el

desarrollo de la tesis doctoral de la autora, dela cual forma parte este trabajo.

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