Electroporación In-Situ: Estudios preliminares

Carlos Sotomayor Ahumada Ingeniería Ambiental, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia

Resumen

Las limitaciones actuales del proceso de bioaugmentación en suelo, han conllevado a la

necesidad de implementar nuevas tecnologías que permitan mantener la capacidad de

biodegradación en el suelo. Una de estas, corresponde al proceso de modificación genética

in situ, la cual requiere de procesos mediante los cuales ADN foráneo se incorpore en

células nativas. En el laboratorio, una de las técnicas más comúnmente utilizadas para

introducir ADN foráneo en células bacterianas se llama electroformación. Sin embargo, para

lograr este método in situ (en la matriz suelo) es necesario utilizar muy altos voltajes para

lograr eficiencias de transformación aceptables. En el presente estudio se desarrollan

pruebas In-Vitro en medio líquido y en suelo utilizando bajos voltajes, con el fin de lograr la

electrotransformación de una cepa de E. Coli con el plásmido pUC19. La eficiencia del

proceso se mide por medio de la resistencia a ampicilina que se le confiere una vez el

plásmido pUC19 entra en la célula de E. coli. De los ensayos realizados, se logró

electroporación en medio líquido a 300 V y con un pulso de 1500 msec. Sin embargo, no

se obtuvieron resultados favorables en suelo.

1. Introducción

Teniendo en consideración, las graves consecuencias que se pueden presentar en la

población humana y animal por la exposición a los diversos contaminantes, y la compleja

distribución de estos en las dinámicas de flujo, distribución y almacenamiento en las

matrices, se han desarrollado diversas metodologías de remediación. Entre estas, se

destaca la bioremediación que consiste en un proceso In-situ en el cual se presenta la

degradación o transformación de compuestos químicos mediante actividad microbiológica.

Para un proceso de bioremediación óptimo se debe contar con los genes que permitan

codificar las enzimas funcionales necesarias para la degradación del contaminante (Lyon,

Pivetal, Blanchard, & Vogel, 2010). Este proceso se encuentra clasificado en dos tipos:

intrínseco y mejorado (enhanced). Ambos se basan en el uso de microorganismos para la

degradación del compuestos, pero se diferencian en que para el tipo intrínseco no se

realizan modificaciones ni mejoras a las condiciones del sitio contaminado, es decir, se

permite la atenuación natural; mientras que para el tipo mejorado se utilizan aditivos como

oxígeno, nutrientes o microorganismos con el fin de optimizar la actividad natural de los

microorganismos nativos (EPA, 2006). Por último, debido a que en muy pocos casos se

cuenta con organismos autóctonos capaces de realizar la degradación o transformación, o

los procesos de atenuación natural requieren de largos períodos de tiempo, se prefiere la

implementación del tipo mejorado.

En cuanto a la bioremediación de tipo mejorada, es importante tener en cuenta que en

aquellos casos en que se realizan modificaciones a las características del medio físico tales

como humedad, pH, temperatura, salinidad, nutrientes, entre otros, se conoce como

bioestimulación (Omokhagbor, Fufeyin, Okoro, & Ehinomen, 2015). Lo anterior, tiene como

finalidad la optimización de las condiciones de los microorganismos nativos, de modo que

degraden de forma más rápida el compuesto. Por otra parte, cuando es necesario inocular

microorganismos o elementos genéticos, se conoce como bioaugmentación. Este caso,

permite aumentar las poblaciones de organismos, y en consecuencia, contrarrestar las

condiciones de estrés en las que se pueden encontrar las comunidades nativas o la

incapacidad de estas para utilizar el compuesto como fuente de carbono (Omokhagbor,

Fufeyin, Okoro, & Ehinomen, 2015).

Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, y las dificultades que enfrentan los

microorganismos para adaptarse a la presencia de contaminantes y de degradarlos, se ha

ahondado en esfuerzos por optimizar la bioaugmentación. Este proceso se encuentra

limitado por factores como la predación, competencia y adaptación del inóculo en la matriz,

la estructura química del compuesto, la concentración en el medio y las características

fisicoquímicas del suelo (Fantroussi & Agatos, 2005). Es por esto, que en los últimos años

se ha propuesto una forma de evitar el problema asociado a la sobrevivencia del inóculo.

Esta, corresponde a la posibilidad de introducir el elemento genético (plásmidos, elementos

transponibles, bacteriófagos o intrones) en la población nativa. Lo anterior, puede suceder

de forma natural mediante transferencia horizontal de genes. Sin embargo, esta forma no

es lo suficientemente efectiva, y requiere de cierto estado de competencia, lo cual no es

fácilmente identificable o predecible en un medio con gran complejidad y heterogeneidad

como el suelo (Lyon, Pivetal, Blanchard, & Vogel, 2010).

Como respuesta a la necesidad de implementar una técnica, que permitiese introducir los

elementos genéticos en las poblaciones nativas, se propuso la electrotransformación. Esta,

consiste en la utilización de un campo eléctrico pulsado para la generación de

electroporación. Lo anterior, permite la formación de poros transmembranales, y en

consecuencia la incorporación de material genético extracelular (Lyon, Pivetal, Blanchard,

& Vogel, 2010). En la actualidad, se cuenta con múltiples equipos e instrumentos

comerciales para realizar este proceso. Sin embargo, sus aplicaciones en suelo son

reducidas, debido a los altos voltajes que se requieren y a la heterogeneidad y complejidad

de la matriz. Estudios realizados por Demaneche et al. en 2001 y Lyon, Pivetal, Blanchard

& Vogel en 2010, han demostrado la capacidad de replicar el proceso en suelo, pero

mediante la utilización e implementación de equipos que generen altos voltajes. El

dispositivo realizado en el montaje de Demaneche et al. buscaba la replicación de la

capacidad de electrotransformación de los rayos en la naturaleza, y en consecuencia, se

contaba con altos requerimientos energéticos. Asimismo, Lyon, Pivetal, Blanchard & Vogel

utilizaron el mismo equipo, y por tanto, contaban con la posibilidad de aplicar voltajes de

entre 4 y 7 kV.

Considerando los altos voltajes utilizados en los estudios previos realizados, en el presente

proyecto de investigación se propone un montaje que permita realizar electroporación en

suelo con menor requerimiento energético. Con el fin de evaluar la eficiencia del proceso

se utilizó el plásmido pUC19 que confiere resistencia a ampicilina. El montaje propuesto se

encuentra enfocado en lograr resultados a pequeña escala. Para esto, se utilizó una fuente

de alimentación de corriente directa (DC), cuya máxima capacidad es de 0.3 kV.

2. Metodología

2.1 Plásmido y cepa bacteriana

Para iniciar el cultivo, se utilizó el plásmido pUC19 (New England BioLabs Inc.,

Ipswich, MA) y la cepa electrocompetente DH10B de Escherichia Coli (New

England BioLabs Inc. ®, Ipswich, MA) que se encontraban disponibles en el

laboratorio de Ingeniería Ambiental de la Universidad de los Andes.

Posteriormente, se mezclaron 40 µL de las células receptoras (E. Coli DH10B)

con 2 µL de la solución del plásmido pUC19 (50 pg/µL) y se incubaron por

aproximadamente 1 minuto en hielo. Esta mezcla, fue electroporada en cubetas

de 0.2 cm (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California), con un voltaje de 2.5

kV y una constante de tiempo entre 5 y 6 ms. Inmediatamente, se agregó 1 mL

(1000 µL) de medio SOC (20 mg triptona, 5 mg extracto de levadura, 4.8 mg

MgSO4, 3.603 mg dextrosa, 0.5 mg NaCl y 0.186 mg KCl) y se incubó por 1 hora

a 37°C en “Incubated Shaker SIF5000” (Jeio Tech. Co., Ltd., Seoul, Korea). Lo

anterior, con el fin de optimizar la oxigenación y recuperación del cultivo posterior

a la exposición al campo eléctrico. El proceso de electrotransformación inicial se

llevó a cabo con el “Micropulser” (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California)

y los parámetros utilizados corresponden a los recomendados en el manual de

operación para Escherichia Coli que se encuentran pre-programados en el

equipo. Por último, se realizó la siembra masiva en medio LB sólido con y sin

ampicilina (100 µg/mL).

Posterior al proceso anterior, fue posible lograr la competencia de las células y

la extracción del plásmido a partir del cultivo establecido. En primer lugar, para

las células competentes, se siguió el protocolo recomendado por Cell Projects

Ltd ® para Escherichia Coli . En este, se incuba una colonia en 10 mL de medio

LB entre 4 y 6 horas (tiempo recomendado por Ana María López).

Posteriormente, se agregaron 4 mL del cultivo anterior en 200 mL de medio LB

fresco y se incubó a 37°C hasta lograr un OD600 igual a 0.6. Con el fin de

acelerar el proceso y aumentar el intercambio de oxígeno, la incubación se llevó

a cabo en “Incubated Shaker SIF5000”. Cuando se obtuvo la absorbancia

requerida, se colocó el cultivo en hielo lo más rápido posible, y se distribuyó el

volumen en 4 tubos de 50 mL . Estos, pasaron a la centrifugadora por 5 minutos

a 3000 rpm, y el pellet obtenido se resuspendió en 25 mL de agua desionizada

estéril. Lo anterior, con el fin de realizar el lavado de las células y eliminar las

sales minerales del medio. Los procesos de centrifugación y resuspensión, se

repitieron al menos 2 veces más. El pellet resultante se resuspendió en 400 µl

de agua desionizada estéril y se tranfirió a tubos Eppendorf® de 0.5 mL. Por

último, se agregó un volumen de glicerol igual al 10% del total transferido (Cell

Projects Ltd®, s.f.).

Por otra parte, para la extracción del plásmido del cultivo establecido

previamente, se utilizó el kit Wizard® Plus Minipreps DNA Purification Systems

y el protocolo adjunto (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, Estados

Unidos). Con el fin de optimizar los resultados se siguió el protocolo de Oswald

(s.f.) para la preparación del cultivo que se describe a continuación. En primer

lugar, se inoculó una colonia de E. Coli DH10B con el plásmido en 5 mL de medio

LB con ampicilina líquido. Este cultivo, se incubó a 37°C hasta lograr un OD600

igual o cercano a 1. Al lograr la absorbancia requerida, se transfirió de forma

inmediata a refrigeración (4°C) por toda la noche. Al día siguiente, se centrifugó

a 10000 x g por 10 minutos y el pellet obtenido se resuspendió en 5 mL de medio

LB sin antibiótico. Lo anterior, con el fin de eliminar la beta-lactamasa producida

por las bacterias (Oswald, s.f.). Posterior a la resuspensión, se tomó 1 mL del

cultivo, el cual se agregó en 100 mL de medio LB con ampicilina líquido y se

incubó a 37° C hasta lograr un OD600 de 3 (Oswald, s.f.).

Por último, se siguieron los pasos del protocolo adjunto al kit. Teniendo en

cuenta las recomendaciones de Oswald y siguiendo el protocolo a cabalidad, se

obtuvieron concentraciones de entre 40 y 98 ng/µl de plásmido. Asimismo, con

el fin de verificar que el material genético extraído correspondiese al pUC19, se

realizó electroforesis y se comparó con la solución del plásmido que se

encontraba disponible en el laboratorio de Ingeniería Ambiental de la

Universidad de los Andes.

2.2 Electroporación In-Vitro en medio líquido

Con el fin de contar con una primera aproximación a las pruebas en suelo, y

dadas las cantidades de plásmido utilizadas por Lyon, Pivetal, Blanchard &

Vogel para su estudio (25 µL) y que serían el punto de partida de la presente

investigación, se decidió realizar electroporación en medio líquido con las

capacidades energéticas del instrumento disponible. Este proceso, se llevó a

cabo siguiendo las recomendaciones del manual del “Micropulser” (Bio-Rad

Laboratories, Richmond, California) para E. Coli en cuanto al volumen de células

y de plásmido a utilizar ( 40 y 2 µL, respectivamente). Asimismo, se utilizaron las

cubetas de 0.2 cm (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California) como recipiente

para que se desarrollase la electrotransformación.

Por otra parte, el montaje propuesto consta de un circuito desarrollado por el

ingeniero electrónico Sebastián Arévalo (Figura 1), el cual se encuentra

conectado a un microcontrolador. Este, se programa dependiendo el tiempo que

se desea que active el relevo que está conectado a la fuente. El tiempo mínimo

que el montaje podía aplicar el voltaje (constante de tiempo) era de 100 msec.

El circuito se conectaba a las cubetas mediante dos cables que se colocaban en

contacto con los electrodos, y que permitían la transferencia del voltaje.

Figura 1. Circuito desarrollado por el ingeniero electrónico Sebastián Arévalo

Figura 2. Montaje realizado para las pruebas In-Vitro en medio líquido

Teniendo en consideración, que el máximo voltaje de la fuente de alimentación

disponible era de 0.3 kV, y que los estudios anteriores habían logrado

electrotransformar generando pulsos con mayor intensidad, se decidió que las

pruebas debían incorporar la variación de los 3 parámetros eléctricos

controlables (voltaje, tiempo del pulso y número de pulsos). Lo anterior, con el

fin de contrarrestar la limitación con la que se contaba y mejorar la eficiencia del

proceso. Para la determinación de las combinaciones, se tuvieron en cuenta los

resultados obtenidos por Dower, Miller & Ragsdale (1988), y las

recomendaciones de la “General Optimization Guide for Electroporation”

desarrollada por BTX®. Las pruebas realizadas se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Parámetros utilizados para cada una de las pruebas en medio líquido.

Número de prueba Voltaje (V) Número de pulsos Constante de tiempo (msec)

1 300 2 100

2 300 3 100

3 300 4 100

4 300 1 500

5 300 1 1000

6 300 1 1500

7 300 1 3000

8 300 1 6000

9 300 1 15000

Para cada una de las fases de pruebas se realizaron dos controles: positivo y negativo. El

control positivo, consistía en la siembra de la solución de células competentes en medio

LB. Esto, permitía eliminar la incertidumbre asociada a la posible muerte de las bacterias,

como consecuencia de errores en la conservación del cultivo. Por otra parte, como control

negativo se realizaba la siembra de 100 µL de la solución que contenía las células

competentes en medio LB con ampicilina. Lo anterior, con el fin de descartar la presencia

del plásmido en las bacterias, previo a la electroporación.

2.3 Electroporación In-Vitro en suelo

2.3.1 Preparación de la muestra de suelo

Teniendo en consideración, que no se necesitaba suelo con características o

trazas de contaminante específicas, fue posible acceder a una muestra de uno

de los laboratorios de Ingeniería Civil. Con la finalidad de contar con tamaños de

partículas que no interfirieran con el proceso de electrotransformación o que

disminuyeran el tamaño de los poros, se decidió tamizar el suelo. Para esto, se

utilizaron dos tamices con aberturas de 0.234 y 0.0469 pulgadas (0.59 y 0.12

cm, respectivamente) (ver Figura 3). Como resultado, se obtuvieron 3

clasificaciones de partículas, aquellas con diámetro menor a 0.12 cm, entre 0.12

y 0.59 cm y mayor a 0.59 cm. Para las pruebas que se realizaron , se utilizó el

suelo cuyas partículas contaran con la mayor área superficial posible, pero que

su vez no generaran un tamaño de poro tan pequeño como para dificultar el

paso del voltaje aplicado. Este, corresponde a la muestra con partículas con

diámetros entre 0.12 y 0.59 cm.

Figura 3. Tamices utilizados en la preparación del suelo

Por otra parte, se realizaron 3 lavados a la muestra de suelo resultante del

proceso descrito anteriormente. En primer lugar, se utilizó agua desionizada

para eliminar impurezas tales como polvo y material de tamaño grande y

mediano. Posteriormente, se empleó peroxido de hidrógeno (agua oxigenada).

Lo anterior, buscaba reducir la materia orgánica disponible para ser degradada

y de forma preliminar reducir la carga microbiológica del suelo. Para el último

lavado, se utilizó agua desionizada, de modo que se lograse remover al máximo

las impurezas restantes y los residuos del peróxido de hidrógeno. Por último,

se autoclavó la muestra de suelo resultante. Este proceso, se llevó a cabo tanto

posterior a los lavados mencionados, como previo a cada una de las pruebas

realizadas.

2.3.2 Proceso de electroporación en suelo

Las pruebas realizadas con suelo, se llevaron a cabo con el mismo montaje

utilizado para el medio líquido. Sin embargo, para este caso aparte de la cubeta

de 0.2 cm, se implementó un prototipo que consistía en dos placas de cobre

ubicadas en una caja de Petri. Las placas, fueron cortadas primero con el

diámetro y forma de la caja, y posteriormente, con las dimensiones de los

electrodos de la cubeta de 0.2 cm. El segundo corte, se realizó con el fin de

reducir el área, y por tanto, lograr un mayor campo eléctrico. Asimismo, se

intentaba simular las condiciones que se presentan en la cubeta y que permiten

la electrotransformación. Por último, es importante notar que aun cuando la

forma de las placas puede influir en la eficiencia del campo eléctrico generado,

para el estudio en cuestión no fueron tenidos en cuenta.

Por otra parte, con el fin de adaptar los parámetros a las necesidades del suelo,

fue necesario realizar variaciones tanto a las variables eléctricas, como a las

cantidades de plásmido y células competentes. Para la variación de los

parámetros eléctricos evaluados, se tuvieron como punto de partida los

resultados de las pruebas In-Vitro en medio líquido. Lo anterior, debido a que el

suelo por lo general cuenta con un porcentaje de humedad considerable; lo que

facilita la conducción de la corriente. Por otro lado, las cantidades de plásmido y

células competentes fueron basadas en los estudios realizados por Demaneche

et al. en 2001 y Lyon, Pivetal, Blanchard y Vogel en 2010. Para cada una de

las fases de prueba realizadas, se contó con los mismos controles positivo y

negativo de los ensayos en medio líquido.

Teniendo en cuenta lo anterior, es posible dividir estas pruebas en dos tipos:

aquellas realizadas en caja de Petri con las placas de cobre (prototipo), y las

que se llevaron a cabo en cubeta. Es importante aclarar, que no se desea

realizar una diferenciación entre las eficiencias de los montajes realizados,

puesto que ambos tenían como finalidad lograr la electrotransformación de la

cepa de E. Coli; sino que corresponden a alternativas planteadas a lo largo de

la investigación realizada, con el fin de optimizar el bajo voltaje con el que se

contaba. Teniendo en consideración, que se requirió variar todos los parámetros

durante los ensayos realizados, a continuación se presenta un resumen de cada

uno de los tipos de pruebas realizadas y las cantidades empleadas.

2.3.2.1 Caja de Petri y placas de cobre

Para los ensayos realizados con el prototipo propuesto, se debió en

primer lugar, realizar el corte de las placas de cobre teniendo en cuenta

las dimensiones de la caja de Petri y de los electrodos de la cubeta.

Como es posible observar en las figuras 3 y 4, el montaje consistía en

colocar una de las placas sobre la caja de Petri, y fijarla mediante el uso

de cinta en la base. Posteriormente, se colocaban en contacto los cables

de conexión con el circuito con cada una de las placas, y se realizaban

las pruebas necesarias para comprobar la transferencia de energía

eléctrica. Sobre la placa que se encontraba en contacto con la caja de

Petri, se agregaba el suelo inoculado con la mezcla de plásmido y células

competentes. A continuación, se colocaba la otra placa encima y se

procedía a aplicar el voltaje. En la Tabla 2 se muestran las variables y

cantidades utilizadas para cada uno de los ensayos realizados a lo largo

de la investigación.

Figura 4. Montaje con placas de cobre de 1.2 x 2.1 cm

Figura 5. Montaje realizado con las placas de cobre de diámetro: 10 cm (ancho aproximado de la caja de Petri)

Tabla 2. Parámetros utilizados para los ensayos implementados con el prototipo propuesto

Número de prueba Voltaje (V)

Número de pulsos

Constante de tiempo

(msec)

Suelo utilizado

(g)

Cantidad de

plásmido (uL)

Cantidad de células

competentes (uL)

Dimensiones de las

placas de cobre (cm)

1 300 1 1500 10 25 400 Diámetro: 10

cm

2 300 1 15000 10 25 400 Diámetro: 10

cm

3 300 1 90000 10 25 400 Diámetro: 10

cm

4 300 2 1500 0,15 2 40 1.2 cm x 2.1

cm

5 300 1 90000 0,15 2 40 1.2 cm x 2.1 cm

6 300 1 90000 0,075 2 40 1.2 cm x 2.1 cm

2.3.2.2 Cubeta

Para el montaje en cuestión, se utilizaban 0,075 g de suelo (75 mg) que

eran introducidos en la cubeta y posteriormente inoculados con la mezcla

de plásmido y células competentes. Asimismo, se contaba con las

mismas conexiones de los ensayos realizados en medio líquido, debido

a que se empleó la misma cubeta.

Tabla 3.Parámetros utilizados para los ensayos realizados con cubeta

Número de prueba

Voltaje (V) Número

de pulsos

Constante de tiempo

(msec)

Suelo utilizado

(g)

Cantidad de

plásmido (uL)

Cantidad de células

competentes (uL)

1 300 1 1500 0,075 2 40

2 300 1 15000 0,075 2 40

3 300 1 15000 0,075 2 40

4 300 1 9000 0,075 2 40

5 300 1 6000 0,075 2 40

6 300 1 1500 0,075 2 40

Figura 6. Montaje realizado con la cubeta para los ensayos en suelo

3. Resultados

De los ensayos realizados en medio líquido, se logró electroporación con un voltaje

de 300 V y 1500 msec de duración del pulso. Lo anterior, se evidenció en el

crecimiento de colonias de E. Coli en medio LB sólido con ampicilina. Con el objetivo

de eliminar cualquier fuente de error, se realizaron además controles negativos de

las células competentes y del medio de cultivo utilizado. Ambos, arrojaron resultados

negativos, es decir, no se evidenció crecimiento de las cepas de E. Coli que no

contenían el plásmido. Por otra parte, es importante notar que las pruebas en las

que se utilizaron constantes de tiempo mayores a los 1500 msec, se presentó

calentamiento de los electrodos de la cubeta, burbujeo e incluso en uno de los casos

ebullición. Lo anterior, puede ser indicio de altas temperaturas internas, lo cual es

probable que pudiese generar una disminución significativa de la eficiencia de

transformación de las células. Los resultados generales se muestran en el Anexo 1.

Por otra parte, en cuanto a las pruebas realizadas en suelo, no se evidenció

electrotransformación en ninguno de los casos. Lo anterior, es posible que se deba

al bajo voltaje con el que se cuenta, y a la alta resistencia que presenta el suelo. La

alta resistencia de la muestra es probable que sea consecuencia de los lavados

realizados durante la fase de preparación. Esto, debido a que el agua desionizada

pudo haber arrastrado consigo los minerales presentes en el suelo, disminuyendo

su conductividad. Los resultados generales de las pruebas realizadas, se muestran

en el Anexo 2.

4. Recomendaciones

Teniendo en consideración las limitaciones del proyecto de investigación en

cuestión, se recomienda en primer lugar ahondar en esfuerzos para la adquisición

de una fuente de alimentación que permita la implementación de mayores voltajes.

Lo anterior, con el fin de contar con un mayor rango que permita la diversificación

de las pruebas, y por tanto, optimizar el estudio. Asimismo, es importante que se

mejoren los procesos de preparación de células competentes y de extracción de

plásmido, con el fin de evitar reducciones considerables en la eficiencia de

transformación, producto de la baja calidad de los resultados obtenidos de estos

procedimientos.

En cuanto a las pruebas en suelo, se recomienda seguir trabajando en simultáneo

con el prototipo y la cubeta. Lo anterior, debido a que el ambiente controlado que se

presenta en la cubeta sólo es una aproximación a las condiciones reales, y no

permite lograr el proceso In-Situ. Asimismo, se recomienda realizar ensayos con

placas de otros materiales que cuenten con mayor durabilidad y capacidad de

conducir electricidad, como por ejemplo el acero inoxidable. Por otra parte, sería

importante controlar que las condiciones de humedad y pH de la muestra no fueran

alteradas. Es por esto, que se sugiere realizar mediciones de humedad y pH antes

y después del pulso eléctrico, de modo que se logre evidenciar si se presentan

cambios significativos en las características fisicoquímicas del suelo.

5. Agradecimientos

Primero que todo a Dios y a mi familia, por permitirme estudiar y formarme en la

Universidad de los Andes, y por el apoyo incondicional y la confianza que me han

brindado a lo largo de todo el pregrado. A mi asesora de tesis Johana Husserl, por

haberme permitido desarrollar este proyecto, por la motivación y la confianza. A

Sebastián Arévalo por su colaboración y ayuda en el montaje de la parte eléctrica

del proyecto y en el desarrollo de los ensayos realizados. Por último, pero no menos

importante a Breiner Arias y Laura Henao, por todo el conocimiento y la ayuda

ofrecida a lo largo de todo el proyecto de investigación.

6. Referencias

1. Demanèche, S., Bertolla, F., Buret, F., Nalin, R., Sailland, A., Philippe, A., & Vogel,

T. (2001). Laboratory-Scale Evidence for Lightning-Mediated Gene Transfer in Soil.

Applied and environmental microbiology, 67(8), 3440-3444.

2. Dower, W. J., Miller, J. F., & Ragsdale, C. W. (1988). High efficiency transformation

of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research, 16(13).

3. EPA. (2006). In Situ and Ex Situ Biodegradation Technologies for Remediation of

Contaminated Sites. Engineering Issue. Obtenido de https://clu-

in.org/download/contaminantfocus/dnapl/Treatment_Technologies/epa_2006_engi

n_issue_bio.pdf

4. Fantroussi, S. E., & Agatos, S. N. (2005). Is bioaugmentation a feasible strategy for

pollutant removal and site remediation? Current Opinion in Microbiology, 8(3), 268-

275. Obtenido de

https://www.researchgate.net/publication/7803656_El_Fantroussi_S_Agathos_SN_

Is_bioaugmentation_a_feasible_strategy_for_pollutant_removal_and_site_remedia

tion_Curr_Opin_Microbiol_8_268-275

5. Cell Projects Ltd. (s.f.). Bacterial Electroporation- Application Notes.

6. Lyon, D. Y., Pivetal, J., Blanchard, L., & Vogel, T. M. (2010). Bioremediation via In

Situ Electrotransformation. Bioremediation Journal, 14(2), 109-119.

7. Omokhagbor, G., Fufeyin, P. T., Okoro, S. E., & Ehinomen, I. (2015).

Bioremediation, Biostimulation and Bioagumentation: A Review. International

Journal of Environmental Bioremediation & Biodegradation, 3(1), 28-39. Obtenido

de http://pubs.sciepub.com/ijebb/3/1/5/

8. Oswald, N. (s.f.). How to: Get Better Plasmid midiprep Yields. Obtenido de

http://bitesizebio.com/13502/how-to-get-better-plasmid-midiprep-yields/

Anexo 1: Tabla de resultados generales en medio líquido

Resultados

Número de prueba

Voltaje (V) Número de pulsos

Constante de tiempo (msec)

Control Resultado Observaciones

1 300 2 100

Controles Negativo 1 y Positivo 1

Negativo

2 300 3 100 Negativo

3 300 4 100 Negativo

4 300 1 500 Negativo

5 300 1 1000 Negativo

6 300 1 1500

Controles Negativo 2 y Positivo 2

Positivo

7 300 1 3000 Negativo

8 300 1 6000 Negativo

9 300 1 15000

Negativo

Se presentó ebullición de la mezcla de células competentes y plásmido

Controles

Control Resultado

Positivo 1

Crecimiento en medio LB, se descartan fallas en células competentes

Negativo 1

No hay crecimiento en medio LB+ ampicilina , se descarta presencia del plásmido en células iniciales

Positivo 2

Crecimiento en medio LB, se descartan fallas en células competentes

Negativo 2

No hay crecimiento en medio LB+ ampicilina , se descarta presencia del plásmido en células iniciales

Anexo 2: Tabla de resultado generales en medio sólido

Controles

Control Resultado

Positivo 1

Crecimiento en medio LB, se descartan fallas en células competentes

Negativo 1

No hay crecimiento en medio LB+ ampicilina , se descarta presencia del plásmido en células iniciales

Positivo 2

Crecimiento en medio LB, se descartan fallas en células competentes

Negativo 2

No hay crecimiento en medio LB+ ampicilina , se descarta presencia del plásmido en células iniciales

Positivo 3

Crecimiento en medio LB, se descartan fallas en células competentes

Negativo 3

Se evidenció crecimiento en medio LB+ ampicilina, es decir, el plásmido se encontraba en el cultivo inicial. Se descartan los resultados

Resultados

Núm

ero

de

prue

baVo

ltaje

(V)

Núm

ero

de

puls

os

Con

stan

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de ti

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(mse

c)

Suel

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tidad

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plás

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Dim

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ones

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ones

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1500

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01

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