ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA Y POLIACRILAMIDA

Es la migración de fragmentos de ADN o ARN por la acción de un campo eléctrico en función de su tamaño.

¡OJO, NO CONFUDIR!

Electro: electricidad

Foresis: Trasladar

HISTORIAVin Thorne: bioquímico del Instituto de Virología de Glasgow

caracterizar las distintas formas de ADN que se obtenían de partículas purificadas de polyomavirus.

TIPOS DE GELES

Agarosa (ADN) Poliacrilamida (PROTEINAS)

Gelificación térmica Baja Resolución Separan fragmentos de DNA de

entre 300 a 10000pb. Se corren horizonalmente Son mas fáciles de preparar y

manipular

Gelificación química Alta resolución. Separan fragmentos de DNA

<500pb. Se corren de forma vertial Son mas complejos de preparar

ELEC

TRO

FORE

SIS

EN G

EL

DE

AGAR

OSA

CARACTERISTICAS

La separación de las macromoléculas depende de dos variables: carga y masa.

cuanto más baja es la concentración de agarosa mayor es el tamaño de las moléculas que pueden separarse, y viceversa

Los geles de agarosa son ideales para analizar el producto de digestiones con enzimas de restricción, lo que puede

combinarse con otras técnicas como el Southern blot, así como para analizar los productos de una reacción de PCR.

Agarosacoloide natural que se extrae de las algas (Gelidium gracilaria), es un polisacárido lineal formado por la repetición de la unidad básica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6- anhidrogalactosa.

ELEC

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AGAR

OSA

Componentes:

Agarosa

Bufer de carga

Bufer de corrida

Frentes de migración

Muesta de ADN

Bromuro de etidio

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Etapas de la técnica

Preparación de la Muestra

Preparación del gel

Preparación de las muestras con el buffer de carga

Carga de la muestra

Corrida del gel

ELEC

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DE

AGAR

OSA

Ejercicio: como preparar un gel

de agarosaBromuro de tidio: 2μlADN: 10 μl

Buffer TBE 0,5X

𝑣1=400𝑚𝑙𝐶1=0,5 𝑋

𝐶2=5 𝑋

𝑣1∗𝐶1=𝑣2∗𝐶2

𝑣2=40𝑚𝑙

Agarosa 1% ---- gr

40 gr-------------100% X ------------- 1%

𝐶𝑎𝑔𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎=0,4𝑔𝑟

ELEC

TRO

FORE

SIS

EN G

EL

DE

POLI

ACRI

LAM

IDA

En la preparación del gel, la polimerización de los monómeros de acrilamida produce cadenas lineales. Al incluir bisacrilamida, ésta da lugar a puntos de ramificación en el polímero, lo que permite formar una matriz tridimensional, dando lugar al gel de poliacrilamida. El tamaño de los huecos o poros que forma la retícula del polímero depende de la concentración de acrilamida y del grado de entrecruzamiento

CARACTERÍSTICAS

DesnaturalizanteSDS - PAGE

No Desnaturalizante

ELEC

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POLI

ACRI

LAM

IDA

N, N, N, N´Tetrametilen-diamina

O Gaal y otros en 1984

PSA: Oxidante; TEMED: reductor

Polimerización del gel acrilamida• Es sensible al oxígeno

Cubrir el “gel” con agua on-butanol durante lapolimerización previene elcontacto con el oxígeno, asícomo la formación de menisco

Se debe ajustar la cantidad de TEMED y PSA para que lapolimerización no tenga lugar demasiado deprisa, generando asídemasiado calor

Gel “Stacking” (Empaquetador)

• Menor concentración de acrilamida• Tamaño de poro mayor• pH ácido-neutro

Función: acumular las proteínas a la entrada del gel separador para que salgan al mismo tiempo (“Salida Neutralizada”)

Gel “Separating” (Separador)

• Mayor concentración de acrilamida• Tamaño de poro menor• pH alcalino

Función: separar las proteínas

A mayor concentración del

gel menor es el poro.

0,75 mm grosor

• El sistema de electroforesis a emplear dependede los objetivos a alcanzar, los más empleados son:

Sistemas de electroforesis

Gel uniforme y tampón homogéneo: la resolución es menor que con los sistemas heterogéneos, porque no hay efecto concentrador en la primera parte de la corrida. Rápidos y sencillos NO GEL EMPAQUETADOR

Gel y tampón heterogéneno: se varían el poro del gel y los iones del tampón, por lo que se puede concentrar la muestra SI GEL EMPAQUETADOR

La teoría de fue formulada por Jovin.

límite de Kohlraush

NO DESNATURALIZANTELAS PROTEÍNAS SE SEPARAN POR:

• CARGA ELÉCTRICA

• TAMAÑO y FORMAPuesto que utilizamos unascondiciones de pH alcalinas,la mayoría de las proteínas

van a estarCARGADAS NEGATIVAMENTE

¿QUIÉN LLEGARÁ ANTES A LA META??

• separa proteínas en estado nativo• las proteínas siguen siendo funcionales

• permite separar complejos proteicos o proteínas multiméricas como una unidad

• muchas proteínas no migran por no tener carga neta o se pierden por poseer carga neta positiva

• el proceso de separación es muy lento debido a la debilidad de la carga neta de las proteínas

• el proceso de separación no sólo está afectado por el tamaño sino también por la forma de la proteína

VENTAJAS

DESVENTAJAS

Desnaturalizante (SDS – PAGE)

Se lleva a cabo en condiciones desnaturalizantes:

1.se emplea un agente reductor de puentes –s–s–

generalmente dtt (ditiotreitol) o b-mercaptoetanol

2.se emplea el detergente aniónico sds

(sodium dodecyl sulfate)

3. generalmente también se calienta la muestramuestra

Los grupos alifáticos dodecil se colocan en el interior, mientras que los grupos sulfato en la superficie

CÁTODO

ÁNODO

-

+

LAS PROTEÍNAS SE SEPARAN POR:

• TAMAÑO

PreparaciónPara la preparación del gel separador o inferior (5 ml, grosor = 0,75 mm),

mezclar según el % deseado:

Iniciar la polimerización = add 3 ml de TEMED + 15 ml de persulfato de amonio a la mezcla. Inmediatamente mezclar y

verter la solución en los vidrios (molde), hasta 1/3

eliminar la curvatura (menisco) en la superficie, con una delgada capa (1-2 mm) de agua destilada o de isobutanol (dejar por 15-20 min)

Decantar el exceso de líquido,.

Mezclar los componentes del gel superior (compactador).

Adicionar la mezcla , colocar el peine y dejar polimerizar.

Preparar las muestras. Estas se pueden analizar en estado reducido o no reducido, mezclándolas con el respectivo amortiguador de muestras..

Cargar las muestras: (5-15 ml, correspondiendo por ej. a 10-30 mg en el caso de mezclas complejas, o 3-10 µg en el caso de proteínas

purificadas).

.Llenar la cámara con el amortiguador de cámara (180 ml en el tanque inferior y 120 ml en el superior). Colocar el gel en la cámara y correr las muestras a 200 v (voltaje constante) hasta que el azul de bromofenol llegue casi al borde inferior del gel (45-60 min).

Teñir el gel durante 1 hr con azul Coomassie R-250. Eliminar luego el exceso de colorante con varios cambios del decolorador.

Registrar los resultados por fotografía.

• Separación rápida de las proteínas

• La separación no depende de la forma de la proteína nativa

• Se puede estimar el peso molecular de las proteínas

• Aunque desnaturalizadas, las proteínas pueden usarse para la fabricación de anticuerpos (en la mayoría de los casos)

• Las proteínas separadas están desnaturalizadas• no son funcionales

Ventajas

Desventajas

BIBL

IOG

RAFÍ

AB . LOMONTE. Electroforesis en gel de poliacrilamida. Cap 13.pp 93.

FIERRO, Francisco. Electroforesis de ADN. Herramientas moleculares aplicadas en ecología.

Aaij C. y P. Borst. 1972. The gel electrophoresis of DNA. Biochimica and Biophysica Acta 269: 192-200.

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA CON SDS “SDS-PAGE” . Disponible en: file:///D:/Mis%20Documentos/Downloads/practicas%20(1).pdf

GARCÍA. Hilda. Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos,actualidad e importancia. Laboratorios BETERÁ. 200

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