ELECTROFORESIS 2.1.2 Definicin de restricciones

La naturaleza de la carga de la partcula que se mueve en el campo elctrico. El estudio de los parmetros ms importantes para describir la velocidad de migracin de la partcula, que es el campo de estudio de la teora electrocintica. Los fenmenos de dispersin de la muestra que se observan en las operaciones electroforticas. Las tcnicas y diversas formas en que es posible realizar una operacin electrofortica.

Carga y Punto Isoelctrico de las ProtenasEn las protenas su carga se origina principalmente de la ionizacin de ms numerosos grupos amino y carboxilo.La carga neta de una protena depende entre otros factores del pH al que sta se encuentre. A un pH relativamente bajo existen ms grupos NH3+ y COOH y la protena tiene una carga neta positiva; a un pH relativamente alto la protena tiene ms grupos NH2 y COO- y se encuentra cargada negativamente.Existe un pH particular para cada protena donde la carga neta de sta es cero, a este pH se le conoce como punto isoelctrico.La carga que adquiere una protena en determinado pH, as como el punto isoelctrico de sta, son dos propiedades que se utilizan para la correcta separacin electrofortica de protenas.

Figura1. Cambio de la carga neta de una protena con el pH.

Teora ElectrocinticaLa velocidad de migracin de un soluto a travs de un lquido conductor por la accin de un campo elctrico, despreciando efectos gravitacionales y difusivos, est influenciada por algunos fenmenos fsicos microscpicos como: la carga de la partcula, la fuerza de arrastre que se opone al movimiento de la partcula, y las fuerzas de relajacin y de retardamiento que se producen en el ambiente inico que rodea al soluto.La teora electrocintica que ha sido desarrollada para el tratamiento de estos aspectos ha conducido a la elaboracin de varios modelos, los cuales varan en su grado de complejidad. Dos modelos bsicos de gran utilidad son:

- El modelo de una esfera cargada sumergida en un medio contino.- El modelo de la doble capa.

Modelo de una Esfera Cargada Sumergida en un Medio ContinuoUn modelo sencillo para el tratamiento de la electroforesis consiste en considerar a la partcula de soluto, como si se tratara de una esfera sumergida en un medio continuo de solvente.Se hace un balance de las fuerzas que actan sobre la partcula cuando sta se mueve a una velocidad constante (en equilibrio), despreciando los efectos difusivos y gravitacionales, establece que la fuerza que acta sobre la partcula debida al campo elctrico, es igual a la fuerza de arrastre de la partcula.

Modelo de la Doble CapaEl modelo de la capa doble desarrollado en base a la teora de los electrolitos fuertes de Debye y Hckel, permite visualizar las interaccin de una partcula slida cargada, con su microambiente inico.Las partculas como las protenas cuando se encuentran presentes en soluciones de electrolitos desarrollan cargas. Estos grupos cargados atraen especies de la solucin que presenten cargas contrarias.El modelo de la doble capa propone que este conjunto de cargas genera dos regiones o capas con diferente grado de movilidad como se muestra en la siguiente figura:

Figura2. Esquema de la doble capa cerca de una superficie cargada. Adaptada de: Ivory, 1990.

En la primera regin (capa de Sterm) la atraccin que ejerce la partcula sobre las especies es ms fuerte, formando una capa altamente hidratada, relativamente fija, de un espesor aproximado de 10 A Esta capa que envuelve a la partcula misma constituye la superficie de corte del complejo formado. Se considera a esta capa la responsable de la disminucin del campo elctrico intrnseco de la partcula.Dependiendo de la carga neta que se genere dentro de la superficie de corte por accin del rearreglo de cargas, en las proximidades de la superficie de corte se genera una segunda capa de carga contraria (cuya naturaleza no es rgida), constituida por molculas del solvente ligeramente ligadas y iones totalmente hidratados. A esta segunda capa se le conoce como capa difusa o capa de Gody-Chapman.El modelo de la doble capa permite interpretar el hecho que la velocidad de migracin de una partcula cargada en un campo elctrico, es proporcional al potencial Z de la partcula y no a su carga intrnseca.El potencial Z es el potencial elctrico medido en la superficie de corte de la partcula. Actualmente no existen suficientes bases tericas que permitan calcular el potencial Z en funcin de la carga de la partcula y su determinacin es de carcter emprico.El radio de la capa difusa tambin tiene una influencia importante sobre la movilidad de la partcula.

Fenmenos de DispersinCuando se realiza una operacin de electroforesis se requiere que los solutos presentes en la solucin de inters se separen formando bandas bien definidas, es decir se obtenga una resolucin apropiada. Sin embargo, existen varios fenmenos que provocan la dispersin de la muestra, trmino que engloba tanto los efectos de difusin molecular, como los efectos microscpicos de mezclado que se agrupan en la llamada difusividad de remolino. Algunos de estos efectos se describen a continuacin.

DifusinEn una electroforesis generalmente existe algo de dispersin de la mezcla debida a la difusin molecular, sin embargo este fenmeno normalmente no es la causa principal de la dispersin.

Figura3. Dispersin de protenas por difusin en electroforesis. 1)Ovalbmina 2) ImG 3) Colgeno.

ElectrosmosisEsta es el resultado del movimiento de la capa difusa de iones en la proximidad de la superficie cargada fija de la celda por accin del campo elctrico, lo que se traduce en el desplazamiento neto de solvente hacia uno de los polos (en direccin opuesta al movimiento electrofortico). Este efecto microscpico puede alterar el patrn de flujo macroscpico dependiendo de la configuracin de la celda electrofortica, alterando el desplazamiento de la muestra.

Efectos Inicos RegulatoriosLa diferencia de movilidad entre el soluto de inters y los iones del bufer donde se efecta la electroforesis, puede generar dispersin durante la electroforesis. Para atenuar este efecto en la interfase delantera la muestra debe presentar una menor movilidad que el bufer, mientras que en la posterior es conveniente que la movilidad de la muestra sea mayor.

Gradientes de ConductividadSi la conductividad de la muestra es mayor que la del bufer, cuando el campo se incrementa arriba de un valor crtico, puede provocarse una distorsin en "forma de puntas" de la interface. El bufer puede presentar una menor conductividad que la muestra por efecto de los iones que contiene.

Sobrecalentamiento: Efectos TrmicosCuando una, corriente elctrica se hace pasar a travs de un medio con una determinada resistencia parte de la energa se convierte en calor, este fenmeno es conocido como efecto de Joule. En una operacin electrofortica el calor generado es proporcional al cuadrado del campo aplicado y al cuadrado del espesor del gel, de tal manera que la cantidad de muestra est limitada por este espesor.La existencia de gradientes trmicos puede desnaturalizar solutos lbiles, daar el gel o estimular la evaporacin de solvente.

Sobrecalentamiento: Efecto de Conveccin LibreSi la electroforesis se desarrolla en un medio lquido en ausencia del gel de soporte, los gradientes de temperatura pueden originar movimientos convectivos libres debido a la accin de la gravedad sobre los gradientes de densidad que se originan. Esta es la principal causa de mezclado en electroforesis. El grado de conveccin se caracteriza por el nmero adimensional de Rayleigh Ra .

Medios y Modos de la ElectroforesisLa electroforesis ha evolucionado en forma considerable a partir de los trabajos pioneros de Ame Tiselius en 1937 y el desarrollo de la teora de los electrolitos fuertes de Debye y Hckel en 1923. Actualmente existen diferentes medios y formas para efectuar una separacin electrofortica (Ivory, 1990).

Medios AnticonvectivosSe han utilizado diferentes medios para realizar las operaciones electroforticas.A partir de 1959 fueron introducidos los geles de poliacrilamida (PAG de sus siglas en ingls) y de agarosa.Los geles de agarosa tienen una estructura porosa altamente hidratada con poca carga que asemeja un medio lquido. Este tipo de gel es muy utilizado en anlisis de cidos nucleicos.Los geles de poliacrilamida estn formados de polmeros ms entrecruzados que producen poros ms pequeos. Este gel es muy empleado en el anlisis electrofortico de protenas, tcnica conocida como PAGE (de las siglas en ingls de electroforesis en gel de poliacrilamida).Una variante de la tcnica PAGE es la PAGE-SDS. En sta se agrega sulfato de dodecil sodio a la solucin amortiguadora que provoca la desnaturalizacin de las protenas. Las cadenas desnaturalizadas migran a una velocidad proporcional al logaritmo de su peso molecular PM.

Modos de la ElectroforesisEn un proceso electrofortico la velocidad de migracin de las especies, depende de su carga, tamao y forma, y de las propiedades del medio. La resolucin que se puede lograr considerando slo estos parmetros ha sido mejorada imponiendo a los sistemas restricciones adicionales como el uso de geles porosos que incrementan la separacin por filtracin o la utilizacin de gradientes de pH que orientan a las especies de acuerdo a su punto isoelctrico. Este tipo de modificaciones ha dado origen a una amplia gama de tcnicas electroforticas analticas y preparativas, cuya clasificacin es difcil, pero que en trminos generales se pueden dividir en (Bier et al, 1983):- Electroforesis de interfase mvil (MBE).- Electroforesis de zona (ZE).- Isotacoforesis (ITP).- Enfoque isoelctrico (IEF).

Electroforesis de interfase mvilEsta tcnica utiliza una celda en forma de tubo en U como se muestra en la figura 4 Inicialmente se coloca dentro de la celda la solucin que contiene la mezcla proteica en el bufer adecuado, posteriormente se aade una columna de solucin con bufer. Al aplicarse el campo elctrico cada protena migra, de la muestra a la zona de bufer, formando una interfase. Cada banda se detecta en funcin de la velocidad de migracin de la protena particular, utilizando el ndice de refraccin.La protena ms rpida se coloca al inicio del patrn de migracin en el brazo ascendente y la ms lenta al final del brazo descendente de la celda.La separacin completa de los componentes de la mezcla no puede ser alcanzada mediante este tipo de electroforesis, slo el soluto ms rpido puede obtenerse en forma pura. En los desarrollos recientes la electroforesis de interfase mvil acta como una celda donde la banda de muestra aplicada es semi-infinita, de tal manera que slo pueden separarse solutos de igual carga. La colocacin de la muestra depende del polo hacia al que va migrar. Para solutos con carga positiva deber colocarse en el nodo. El resto de la celda se carga con electrolito rpido que permanezca siempre al frente de la migracin y permita disminuir la dispersin de la muestra

Figura 4. Representacin esquemtica de la celda de Tieselius. Electroforesis de interfase mvil.Electroforesis de zonaEn este tipo de electroforesis la muestra es pequea y diluida, entonces es posible lograr la su resolucin completa. Este tipo de electroforesis puede ser empleada para resolver mezclas de cargas diferentes.

IsotacoforesisEn una separacin por isotacoforesis la muestra se inserta entre un electrolito rpido y uno lento (Figura 5), formando una banda finita. En estado estacionario todos los constituyentes se mueven a la misma velocidad, en un orden impuesto por sus movilidades, con la ventaja de que cada banda contiene slo un tipo de electrolito (el ancho de la banda es una medida de la concentracin de la especie en la muestra original).

Figura5. Isotacoforesis de cinco especies inicas(antes y despus). Tomada de: Ivory, 1990.

Enfoque isoelctricoCuando la separacin electrofortica es por medio de enfoque isoelctrico (IEF) se requiere un gradiente de priven el medio donde se realiza la electroforesis (Figura 6). En el medio continuo de pH las molculas como las protenas se ordenan conforme a su punto isoelctrico, es decir al migrar llegan a un punto donde su carga neta es cero y por lo tanto su movilidad es nula.El enfoque isoelctrico es una operacin gobernada por el equilibrio, mientras que las otras operaciones son controladas por la velocidad de transporte.

Figura6. Enfoque isoelctrico de solutos polianfolticos (antes y despus). Tomada de: Ivory, 1990.

2.2 Anlisis y modelacin del proceso

Electroforesis capilar Una de las tcnicas de mayor uso recientemente para la determinacin de antimicrobianos es la electroforesis capilar (CE) esto gracias a su simplicidad operacional, versatilidad, capacidad en la separacin de una gran variedad de especies, adems de que requiere un menor volumen de muestra.

Bsicamente el proceso de electroforesis cuenta con las siguientes etapas: Ensamblaje de la cmara de electroforesis: El procedimiento para el ensamblaje de la cmara de electroforesis vara de acuerdo al modelo del equipo, en consecuencia el investigador deber seguir las instrucciones que recomienda el fabricante. Preparacin de los geles Preparacin del gel de resolucin: El gel de resolucin es la matriz de poliacrilamida donde las molculas de ADN o protenas, van a migrar generando un perfil de bandas o patrn electrofortico. Dicho patrn vara de acuerdo al peso molecular de cada una de las molculas y a la concentracin del gel mismo. Preparacin del gel de empacamiento El gel de empacamiento es la matriz de poliacrilamida que tiene como caracterstica retener a las protenas mantenindolas uniformes antes que ellas migren hacia el gel de resolucin. Este proceso permite mejorar la resolucin de las protenas en la electroforesis. Preparacin de la muestra biolgica Sembrado del marcador de tamao Sembrado de las muestras a separar Conexin de la fuente y aplicacin del campo elctrico Avance de la corrida Fin de la corrida y anlisis de los resultados

Figura7. Proceso de electroforesis ReferenciasTejeda, M.A., Montesinos C,R. , Guzmn, Z.R. (1995). Bioseparaciones, Editorial Unisol, Hermosillo, Sonora. Mxico.Manual de procedimientos de electroforesis. Serie de normas tcnicas n 38. Lima, 2003 (http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Manual%20Electroforesis%2038.pdf)