EL DÉFICIT DE IGF-I EN RATONES PREDISPONE A LA PÉRDIDA...
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INTRODUCCIÓN El IGF-I es un agente neuroprotector y el descenso fisiológico de sus niveles circulantes asociado al envejecimiento ha sido relacionado con alteraciones cerebrales y cognitivas. La deficiencia del factor de 1 crecimiento similar a insulina tipo 1 (IGF-I) en el hombre se asocia a sordera sindrómica (OMIM608747) . Así -/- 2 +/+ mismo, el ratón Igf1 presenta sordera congénita profunda . Los animales silvestres Igf1 y los heterocigotos +/- Igf1 muestran, a partir de los 6 meses de edad, un descenso en los niveles circulantes del factor que 3 correlaciona con un incremento de los umbrales auditivos , y que sugiere un papel del IGF-I en la protección de la función auditiva. Hemos estudiado en diferentes edades la susceptibilidad de animales parcialmente deficientes en IGF-I al daño +/- +/+ auditivo utilizando como agente nocivo el ruido. En animales Igf1 e Igf1 jóvenes de 1-3 meses de edad +/- sometidos a ruido, ambos genotipos resultaron igualmente sensibles al daño. En contraste, animales Igf1 de 6 meses de edad presentaron una mayor susceptibilidad al daño inducido por ruido que los silvestres. Los resultados obtenidos apoyan la idea de que bajos niveles de IGF-I predisponen a una mayor susceptibilidad al daño inducido por ruido, y contribuyen a identificar las dianas moleculares que participan en este proceso. MATERIAL Y MÉTODOS +/- +/+ Animales. Ratones Igf1 y Igf1 mantenidos en un fondo híbrido de cepas de ratón MF1OlaHsd*129/Sv. Función auditiva. Los potenciales evocados auditivos del tronco cerebral (PEATC o ABR) se registraron con el software de Tucker-Davis Technologies, antes de la exposición a ruido (pre-noise) y 3, 14 y 28 días después de la exposición. Exposición a ruido. Los animales fueron expuestos a un ruido violeta a una intensidad de 105 dB SPL durante 30 minutos, en el interior de una cámara reverberante 4 diseñada ad hoc Morfología coclear e inmunohistoquímica. Secciones transversales de cóclea (10 m) embebidas en gelatina fueron teñidas con hematoxilina-eosina. Se realizaron tinciones inmunohistoquímicas con los marcadores neurales neurofilamento y sinaptofisina y el marcador de macrófagos Iba1. La cuantificación de la intensidad de la señal de inmunohistoquímica de sinaptofisina e Iba1 se llevó a cabo al menos en tres experimentos independientes con el programa ImageJ. Cuantificación de células ciliadas. Cócleas descalcificadas fueron seccionadas exponiendo un 80% de la membrana basilar. El órgano de Corti (OC) fue diseccionado y 5 teñido con faloidina. La longitud total del OC fue dividida en sectores equidistantes equivalentes al 5% usando software estereológico (CAST®) . El número de células 2 ciliadas internas (CCI) y externas (CCE) fue contado en áreas muestreadas sistemáticamente al azar y la densidad de células total (células/1000 m ) fue estimada RT-qPCR. Los niveles de expresión de ARNm en la cóclea de genes implicados en procesos de inflamación fueron detectados con sondas TaqMan mediante PCR cuantitativa a tiempo real. Los niveles de al menos tres experimentos independientes por grupo fueron normalizados frente al gen Rplp0 y la estimación de la expresión de los -ΔΔCt genes se calculó utilizando el valor 2 . Análisis de proteínas. Extractos de proteína de cócleas congeladas de al menos tres experimentos independientes por grupo fueron sometidos a electrofororesis e inmunotransferencia para estudiar la presencia de las formas activas de p38, JNK, AKT y ERK 1/2. Las bandas obtenidas fueron cuantificadas por densitometría con el software IMAGEQUANT TL. Niveles de IGF-I. Los niveles de IGF-I en suero fueron determinados usando un ensayo ELISA (OCTEIA Rat/Mouse IGF-I kit, IDS Ltd.). Análisis estadístico. Los datos obtenidos fueron analizados mediante un modelo mixto mediante ANOVA o T-Student en el software SPSS v19.0. Las pruebas de Bonferroni y Tamhane se realizaron para analizar las comparaciones post-hoc. Los datos se expresan como media ±SEM y se consideran significativos para p<0.05. EL DÉFICIT DE IGF-I EN RATONES PREDISPONE A LA PÉRDIDA AUDITIVA INDUCIDA POR RUIDO Time post-noise exposure A B D IGF-I (ng/ml) 200 600 1000 Age (month) 1 3 6 *** * Age (month) 1 0 0,5 Igf1 mRNA cohclear expression 1 6 *** B A +/+ Igf1 +/- Igf1 * +/+ Igf1 +/- Igf1 B C A 600 400 200 Pre -noise 14 28 IGF-I (ng/ml) Time (day) *** * * 0 CONCLUSIONES ∙ Los niveles de IGF-I en suero y la expresión génica coclear de Igf1 disminuyen con la edad en ambos +/- genotipos, mostrando los animales heterocigotos (Igf1 ) niveles inferiores en comparación con los +/+ animales Igf1 en todos los tiempos estudiados. +/- ∙ A los 6 meses de edad, los niveles de I G F -I en suero descienden y los ratones Igf1 heterocigotos fueron más susceptibles que los animales silvestres a la exposición a ruido. +/- ∙ Los animales Igf1 presentaron de forma basal una expresión alterada de genes relacionados con la inflamación y un aumento de la respuesta inflamatoria tras el daño así como alteraciones morfológicas y en marcadores sinápticos. ∙ Estos datos sugieren que el déficit moderado de I G F -I aumenta la sensibilidad ótica al daño. De esta manera, las terapias basadas en IGF-I podrían contribuir a prevenir o atenuar la pérdida auditiva inducida por ruido o relacionada con la edad. p-JNK p-p38 3d 28d 4h Time post-noise exposure phospho protein levels (% of WT control) 3d 28d 4h Time post-noise exposure phospho protein levels (% of WT control) p-AKT p-ERK 250 150 50 200 100 200 100 400 200 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + Noise Noise * * * ** ** * # # +/+ Igf1 +/- Igf1 160 120 80 - + - + Noise Relative expression level IBA1 40 Tgfb1 Tgfbr1 5 4 3 2 1 2 1,5 1,0 0,5 Pre-noise 3d 28d 4h Pre-noise 3d 28d 4h # # Time post-noise exposure Fold change +/+ Igf1 +/- Igf1 * * C 1 µV 1 2 3 4 5 6 7 8 Latency (ms) 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 +/+ Igf1 +/- Igf1 ABR Amplitude (mV) Prenoise 3 days post noise exposure I II III IV V I II III IV V I II III IV V I II III IV V 8 16 20 40 Threshold shift (dB) Frequency (kHz) 80 40 0 60 20 Time post-noise exposure (days) Pre-noise 3d 14d 28d * ** * *** ** ** ** *** *** ** ** * 8 16 20 40 8 16 20 40 8 16 20 40 Click Click Click Click +/+ Igf1 +/- Igf1 4 3 2 1 4 3 2 1 3 2 1 3 2 1 2 1,5 1,0 0,5 6 4 2 Tnfalfa Il4 Il6 Il10 Il1b Dusp Fold change Pre- noise 3d 28d 4h # # +/+ Igf1 +/- Igf1 * * * 10 5 4 2 - + - + - + - + 2 number of IHC /1000 m 2 number of OHC /1000 m * * * Noise Noise B A +/+ Igf1 +/- Igf1 Figura 1. Niveles sistémicos de I G F -I y expresión génica coclear. (A) Los niveles de IGF-I en suero y la expresión génica de Igf1 en la cóclea +/- descienden progresivamente con la edad tanto en animales Igf1 ( ) +/+ como Igf1 ( ).Los ratones heterocigotos mostraron una media de niveles inferiores de I G F -I, pero las diferencias estadísticas con los ratones silvestres aparecen a partir de los 3 meses de edad acentuándose a los 6 +/- meses. (B) Los ratones Igf1 mostraron una menor expresión génica en comparación con los ratones silvestres en las dos edades estudiadas. +/- Ratones Igf1 de 6 meses presentan una mayor susceptibilidad al +/+ ruido en comparación con ratones Igf1 Los niveles de I G F -I disminuyen con la edad Figura 2. Función auditiva. (A) Registros PEATC representativos de +/- +/+ ratones Igf1 y Igf1 de 6 meses, antes y 3 días después de la exposición a ruido. Después del ruido se observa una disminución en la amplitud de los picos y diferencias entre genotipos en la velocidad de transmisión entre las ondas I-I I , 10 dB por encima del umbral (línea negra). (B) Los niveles de I G F -I en suero disminuyeron progresivamente a lo largo del +/- estudio en ambos genotipos, los animales heterocigotos Igf1 presentaron valores menores que los animales silvestres. (C) Tres días después de la exposición a ruido los umbrales de P E AT C aumentaron en ambos genotipos y no mostraron signos de recuperación. Los +/- umbrales de los animales Igf1 siguieron empeorando hasta el final del +/+ ensayo. *p<0,05 frente a Igf1 expuesto a ruido. Estudio de la respuesta inflamatoria tras la exposición a ruido en +/+ +/- ratones de 6 meses Igf1 e Igf1 Figura 6. Análisis del curso temporal de la expresión de genes implicados en la respuesta inflamatoria. Niveles de expresión de R N A coclear de genes implicados en la respuesta inflamatoria analizados antes (pre-noise), 4 horas (4h), y 3 y 28 días (3d, 28d) después de la exposición a ruido. Los datos de cada grupo experimental se expresan -ΔΔCt +/- utilizando el valor 2 ± S E M . (A) Los ratones Igf1 muestran una mayor expresión basal de Il1b en comparacióna los ratones silvestres. 4 horas después de la exposición a ruido hay una tendencia al aumento de la expresión de citoquinas proinflamatorias y un descenso de las citoquinas antiinflamatorias, especialmente de Il10, en los ratones +/- +/+ Igf1 con respecto a los ratones Igf1 expuestos a ruido. (B) Inmunohistoquímica del marcador de macrógafos Iba1 en secciones transversales de cóclea. Se muestra señalada +/+ +/- la pared lateral de la cóclea de ratones Igf1 y Igf1 antes (control) y 3 días después del daño. De forma basal se aprecia la existencia de estas células en ambos genotipos especialmente en el ligamento espiral (Le). Tras el ruido hay una tendencia a una mayor infiltración de estas células. (C) Cuantificación de la tinción del marcador en la +/- pared lateral de la cóclea. (D) Se observa una expresión basal aumentada de Tg1 en ratones Igf1 con respectoa los ratones silvestres. Tras la exposición a ruido la expresión +/- +/+ de Tgr1 en los ratones Igf1 se mantuvo aumentada en comparación con los ratones Igf1 expuestos a ruido. * p<0,05 frente a control pre-noise del genotipo +/+ correspondiente y # p<0,05 frente a Igf1 expuesto a ruido. Ev: estría vascular. Barra de escala:100 m Figura 5. Análisis del curso temporal de los niveles de proteínas. Niveles de proteínas analizados antes (pre- noise), 4 horas (4h), y 3 y 28 días (3d, 28d) después de la exposición a ruido. (A) Bandas representativas para las formas activas e inactivas de las proteínas p38, JNK, A K T y E R K 1/2 en cada tiempo estudiado. (B) Niveles de activación representados como porcentaje relativo con respecto al control silvestre no expuesto en cada tiempo. 4 horas después de la exposición a ruido se +/- observa en los ratones Igf1 un incremento en la activación de las quinasas ERK 1/2 y JNK en +/- comparación con los ratones Igf1 no expuestos, así como un aumento en la fosforilación de AKT que ocurre en ambos genotipos. 3 días después del ruido la expresión de todas las proteínas estudiadas recuperó niveles similares a los del grupo control no expuesto. 28 +/- días después de la exposición a ruido los ratones Igf1 mostraron una mayor activación en la proteína relacionada con la inflamación J N K y una menor activación de la proteína relacionada con la supervivencia AKT con respecto a los animales silvestres expuestos a ruido. *p<0,05 frente al control +/+ no expuesto a ruido, # p<0,05 frente a Igf1 expuesto a ruido. Figura 3. Morfología general de la cóclea y cuantificación de células ciliadas. (A) Sección transversal de cóclea teñida con hematoxilina-eosina mostrando las principales estructuras de este órgano. (B) +/+ Los ratones Igf1 presentaron un descenso en la densidad de células ciliadas externas (outer hair cells, O H C ) después del ruido, mientras que la pérdida de células ciliadas (inner hair cells, I H C ) tanto internas +/- como externas fue más evidente en ratones Igf1 . *p<0,05 frente al control no expuesto a ruido. Barra de escala 0,5mm EV: escala vestibular; EM: escala media; ET: escala timpánica; Ge: ganglio espiral; O C : órgano de Corti; Ev: estría vascular; Le: ligamento espiral Figura 4. Estudio de marcadores neurales después del ruido. (A-B, E-F) Secciones transversales de cócleas teñidas con hematoxilina y eosina. Se muestra un detalle del órgano +/+ +/- de Corti en la zona media de la cóclea de ratones Igf1 y Igf1 control y expuestos a ruido. Tras la exposición a ruido se observa la pérdida de C C E (flecha) en los ratones heterocigotos. (C-D,G-H) Inmunohistoquímica en la misma zona coclear de los marcadores neurales neurofilamento (rojo) y sinaptofisina (verde) que muestran respectivamente las fibras nerviosas y las terminales sinápticas eferentes en la base de las C C I y C C E . Núcleos celulares marcados con D A P I . Tras exposición al ruido se +/- +/+ observa, especialmente en las C C E , una mayor reducción de la expresión de sinaptofisina (flechas) en los animales Igf1 comparados con los ratones Igf1 (I) Cuantificación de +/+ la tinción en la base de las células ciliadas internas (I H C ) y las externas (O H C ). *p<0,05 frente al control no expuesto a ruido, # p<0,05 frente a Igf1 expuesto a ruido. Barras de escala 25 mm. +/- Ratones de 6 meses Igf1 expuestos a ruido muestran pérdida de células ciliadas y expresión alterada de marcadores neurales. Referencias: 1) Murillo-Cuesta S, Rodríguez-de la Rosa L, Cediel R, Lassaletta L, Varela-Nieto I. The role of insulin-like growth factor-I in the physiopathology of hearing. Front Mol Neurosci. 2011;(4):1-17. 2) Cediel R, Riquelme R, Contreras J, Díaz A, Varela-Nieto I. Sensorineural hearing loss in insulin-like growth factor I-null mice: a new model of human deafness. Eur J Neurosci. 2006;(23):587-90. 3) Riquelme R, Cediel R, Contreras J, Rodriguez-de la Rosa L, Murillo-Cuesta S, Hernandez-Sanchez C, Zubeldia JM, Cerdan S, Varela-Nieto I. A comparative study of age-related hearing loss in wild type and insulin-like growth factor I deficient mice. Front Neuroanat. 2010;(4):1-13. 4) Cobo P, Murillo-Cuesta S, Cediel R, Moreno A, Lorenzo P, Varela-Nieto I. Design of a reverberant chamber for noise exposure experiments with small animals. Journal of Applied Acoustics 2009;(70):1034-1040. 5) Viberg A, Canlon B. The guide to plotting a cochleogram. Hear Res. 2004 (197):1-10.5. Agradecimientos: Este trabajo ha recibido el apoyo del SAF2011-24391, de la Fundación de Investigación Médica Mutua Madrileña 2012 y del proyecto AFHELO (FP7, European Union). LRR y SMC disfrutan de contratos del CIBERER y AC de AFHELO. 1,2 1,2 1,2 1,2,3 4 1,2,3 1,2 Adelaida Celaya , Silvia Murillo-Cuesta , Lourdes Rodríguez-de la Rosa , Rafael Cediel , Carlos Avendaño , Julio Contreras e Isabel Varela-Nieto 1 2 3 4 Instituto de Investigaciones Biomédicas ‘Alberto Sols’ C S I C -U A M , Madrid Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (C I B E R E R ), Madrid Facultad De Veterinaria, U C M , Madrid Facultad De Medicina, U A M , Madrid 200 150 100 50 200 150 100 50 Relative expression level in OHC Relative expression level in IHC SYN SYN - + - + - + - + * # Noise Noise I p-p38 p-JNK pan PI3K p38 JNK p-JNK p-JNK p-p38 p-p38 pan PI3K +/+ Igf1 +/- Igf1 - - + + noise 4 hours 3 days 28 days A B Le Ev Pre- noise 3d 28d 4h Pre- noise 3d 28d 4h Pre- noise 3d 28d 4h Pre- noise 3d 28d 4h Pre- noise 3d 28d 4h +/+ Igf1 +/- Igf1 - - + + noise p-AKT p-ERK 1/2 pan PI3K p-AKT p-ERK 1/2 pan PI3K p-AKT p-ERK 1/2 AKT ERK 1/2 4 hours 3 days 28 days
Transcript of EL DÉFICIT DE IGF-I EN RATONES PREDISPONE A LA PÉRDIDA...
INTRODUCCIÓNEl IGF-I es un agente neuroprotector y el descenso fisiológico de sus niveles circulantes asociado al envejecimiento ha sido relacionado con alteraciones cerebrales y cognitivas. La deficiencia del factor de
1crecimiento similar a insulina tipo 1 (IGF-I) en el hombre se asocia a sordera sindrómica (OMIM608747) . Así -/- 2 +/+mismo, el ratón Igf1 presenta sordera congénita profunda . Los animales silvestres Igf1 y los heterocigotos
+/-Igf1 muestran, a partir de los 6 meses de edad, un descenso en los niveles circulantes del factor que 3correlaciona con un incremento de los umbrales auditivos , y que sugiere un papel del IGF-I en la protección de
la función auditiva.
Hemos estudiado en diferentes edades la susceptibilidad de animales parcialmente deficientes en IGF-I al daño +/- +/+auditivo utilizando como agente nocivo el ruido. En animales Igf1 e Igf1 jóvenes de 1-3 meses de edad
+/-sometidos a ruido, ambos genotipos resultaron igualmente sensibles al daño. En contraste, animales Igf1 de 6 meses de edad presentaron una mayor susceptibilidad al daño inducido por ruido que los silvestres. Los resultados obtenidos apoyan la idea de que bajos niveles de IGF-I predisponen a una mayor susceptibilidad al daño inducido por ruido, y contribuyen a identificar las dianas moleculares que participan en este proceso.
MATERIAL Y MÉTODOS+/- +/+Animales. Ratones Igf1 y Igf1 mantenidos en un fondo híbrido de cepas de ratón MF1OlaHsd*129/Sv.
Función auditiva. Los potenciales evocados auditivos del tronco cerebral (PEATC o ABR) se registraron con el software de Tucker-Davis Technologies, antes de la exposición a ruido (pre-noise) y 3, 14 y 28 días después de la exposición.Exposición a ruido. Los animales fueron expuestos a un ruido violeta a una intensidad de 105 dB SPL durante 30 minutos, en el interior de una cámara reverberante
4 diseñada ad hoc Morfología coclear e inmunohistoquímica. Secciones transversales de cóclea (10 m) embebidas en gelatina fueron teñidas con hematoxilina-eosina. Se realizaron tinciones inmunohistoquímicas con los marcadores neurales neurofilamento y sinaptofisina y el marcador de macrófagos Iba1. La cuantificación de la intensidad de la señal de inmunohistoquímica de sinaptofisina e Iba1 se llevó a cabo al menos en tres experimentos independientes con el programa ImageJ.Cuantificación de células ciliadas. Cócleas descalcificadas fueron seccionadas exponiendo un 80% de la membrana basilar. El órgano de Corti (OC) fue diseccionado y
5teñido con faloidina. La longitud total del OC fue dividida en sectores equidistantes equivalentes al 5% usando software estereológico (CAST®) . El número de células
2ciliadas internas (CCI) y externas (CCE) fue contado en áreas muestreadas sistemáticamente al azar y la densidad de células total (células/1000 m ) fue estimadaRT-qPCR. Los niveles de expresión de ARNm en la cóclea de genes implicados en procesos de inflamación fueron detectados con sondas TaqMan mediante PCR cuantitativa a tiempo real. Los niveles de al menos tres experimentos independientes por grupo fueron normalizados frente al gen Rplp0 y la estimación de la expresión de los
-ΔΔCtgenes se calculó utilizando el valor 2 .Análisis de proteínas. Extractos de proteína de cócleas congeladas de al menos tres experimentos independientes por grupo fueron sometidos a electrofororesis e inmunotransferencia para estudiar la presencia de las formas activas de p38, JNK, AKT y ERK 1/2. Las bandas obtenidas fueron cuantificadas por densitometría con el software IMAGEQUANT TL.Niveles de IGF-I. Los niveles de IGF-I en suero fueron determinados usando un ensayo ELISA (OCTEIA Rat/Mouse IGF-I kit, IDS Ltd.).Análisis estadístico. Los datos obtenidos fueron analizados mediante un modelo mixto mediante ANOVA o T-Student en el software SPSS v19.0. Las pruebas de Bonferroni y Tamhane se realizaron para analizar las comparaciones post-hoc. Los datos se expresan como media ±SEM y se consideran significativos para p<0.05.
EL DÉFICIT DE IGF-I EN RATONES PREDISPONE
A LA PÉRDIDA AUDITIVA INDUCIDA POR RUIDO
Time post-noise exposure
A B D
IGF
-I (
ng/m
l)
200
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Age (month)
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BA +/+Igf1+/-Igf1
*
+/+Igf1+/-Igf1
B C
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Pre-noise
14 28
IGF
-I (
ng
/ml)
Time (day)
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*
0
CONCLUSIONES
∙ Los niveles de IGF-I en suero y la expresión génica coclear de Igf1 disminuyen con la edad en ambos +/-genotipos, mostrando los animales heterocigotos (Igf1 ) niveles inferiores en comparación con los
+/+animales Igf1 en todos los tiempos estudiados.+/-∙ A los 6 meses de edad, los niveles de IGF-I en suero descienden y los ratones Igf1 heterocigotos fueron
más susceptibles que los animales silvestres a la exposición a ruido.+/-∙ Los animales Igf1 presentaron de forma basal una expresión alterada de genes relacionados con la
inflamación y un aumento de la respuesta inflamatoria tras el daño así como alteraciones morfológicas y en marcadores sinápticos.
∙ Estos datos sugieren que el déficit moderado de IGF-I aumenta la sensibilidad ótica al daño. De esta manera, las terapias basadas en IGF-I podrían contribuir a prevenir o atenuar la pérdida auditiva inducida por ruido o relacionada con la edad.
p-JNK
p-p38
3d 28d4h
Time post-noise exposure
phospho p
rote
in le
vels
(%
of
WT
contr
ol)
3d 28d4h
Time post-noise exposure
phosp
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rote
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(%
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WT
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p-AKT
p-ERK
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- + - + - + - + - + - +
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Noise
Noise
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+/+Igf1
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IBA1
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Pre-noise 3d 28d4h
Pre-noise 3d 28d4h
#
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Time post-noise exposure
Fold
change
+/+Igf1+/-
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*
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C
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1 2 3 4 5 6 7 8
Latency (ms)
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1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
+/+Igf1 +/-Igf1
AB
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I II III IV V I II III IV V
I II III IV V I II III IV V
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Pre-noise 3d 14d 28d
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20 40 816
20 40 816
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+/+Igf1
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1,0
0,5
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Tnfalfa Il4
Il6 Il10
Il1b Dusp
Fold
change
Pre-noise
3d 28d4h
#
#
+/+Igf1
+/-Igf1
**
*
10
5
4
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- + - + - + - +
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m
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C /1000
m
* **
Noise Noise
BA +/+Igf1+/-Igf1
Figura 1. Niveles sistémicos de IGF-I y expresión génica coclear. (A)
Los niveles de IGF-I en suero y la expresión génica de Igf1 en la cóclea +/-descienden progresivamente con la edad tanto en animales Igf1 ( )
+/+como Igf1 ( ).Los ratones heterocigotos mostraron una media de niveles
inferiores de IGF-I, pero las diferencias estadísticas con los ratones
silvestres aparecen a partir de los 3 meses de edad acentuándose a los 6 +/-meses. (B) Los ratones Igf1 mostraron una menor expresión génica en
comparación con los ratones silvestres en las dos edades estudiadas.
+/-Ratones Igf1 de 6 meses presentan una mayor susceptibilidad al +/+ruido en comparación con ratones Igf1
Los niveles de IGF-I disminuyen con la edad
Figura 2. Función auditiva. (A) Registros PEATC representativos de +/- +/+ratones Igf1 y Igf1 de 6 meses, antes y 3 días después de la exposición a
ruido. Después del ruido se observa una disminución en la amplitud de
los picos y diferencias entre genotipos en la velocidad de transmisión
entre las ondas I-I I , 10 dB por encima del umbral (línea negra). (B) Los
niveles de IGF-I en suero disminuyeron progresivamente a lo largo del +/-estudio en ambos genotipos, los animales heterocigotos Igf1
presentaron valores menores que los animales silvestres. (C) Tres días
después de la exposición a ruido los umbrales de PEATC aumentaron
en ambos genotipos y no mostraron signos de recuperación. Los +/-umbrales de los animales Igf1 siguieron empeorando hasta el final del
+/+ ensayo. *p<0,05 frente a Igf1 expuesto a ruido.
Estudio de la respuesta inflamatoria tras la exposición a ruido en +/+ +/- ratones de 6 meses Igf1 e Igf1
Figura 6. Análisis del curso temporal de la expresión de genes implicados en la respuesta inflamatoria. Niveles de expresión de RNA coclear de genes implicados en la
respuesta inflamatoria analizados antes (pre-noise), 4 horas (4h), y 3 y 28 días (3d, 28d) después de la exposición a ruido. Los datos de cada grupo experimental se expresan -ΔΔCt +/- utilizando el valor 2 ± SEM. (A) Los ratones Igf1 muestran una mayor expresión basal de Il1b en comparacióna los ratones silvestres. 4 horas después de la exposición a
ruido hay una tendencia al aumento de la expresión de citoquinas proinflamatorias y un descenso de las citoquinas antiinflamatorias, especialmente de Il10, en los ratones +/- +/+ Igf1 con respecto a los ratones Igf1 expuestos a ruido. (B) Inmunohistoquímica del marcador de macrógafos Iba1 en secciones transversales de cóclea. Se muestra señalada
+/+ +/-la pared lateral de la cóclea de ratones Igf1 y Igf1 antes (control) y 3 días después del daño. De forma basal se aprecia la existencia de estas células en ambos genotipos
especialmente en el ligamento espiral (Le). Tras el ruido hay una tendencia a una mayor infiltración de estas células. (C) Cuantificación de la tinción del marcador en la +/- pared lateral de la cóclea. (D) Se observa una expresión basal aumentada de Tg�1 en ratones Igf1 con respectoa los ratones silvestres. Tras la exposición a ruido la expresión
+/- +/+ de Tg�r1 en los ratones Igf1 se mantuvo aumentada en comparación con los ratones Igf1 expuestos a ruido. * p<0,05 frente a control pre-noise del genotipo +/+ correspondiente y # p<0,05 frente a Igf1 expuesto a ruido. Ev: estría vascular. Barra de escala:100 m
Figura 5. Análisis del curso temporal de los niveles de
proteínas. Niveles de proteínas analizados antes (pre-
noise), 4 horas (4h), y 3 y 28 días (3d, 28d) después de la
exposición a ruido. (A) Bandas representativas para las
formas activas e inactivas de las proteínas p38, JNK,
AKT y ERK 1/2 en cada tiempo estudiado. (B) Niveles
de activación representados como porcentaje relativo
con respecto al control silvestre no expuesto en cada
tiempo. 4 horas después de la exposición a ruido se +/-observa en los ratones Igf1 un incremento en la
activación de las quinasas E R K 1/2 y J N K en +/-comparación con los ratones Igf1 no expuestos, así
como un aumento en la fosforilación de AKT que
ocurre en ambos genotipos. 3 días después del ruido la
expresión de todas las proteínas estudiadas recuperó
niveles similares a los del grupo control no expuesto. 28 +/-días después de la exposición a ruido los ratones Igf1
mostraron una mayor activación en la proteína
relacionada con la inflamación JNK y una menor
activación de la proteína relacionada con la
supervivencia A K T con respecto a los animales
silvestres expuestos a ruido. *p<0,05 frente al control +/+ no expuesto a ruido, # p<0,05 frente a Igf1 expuesto a
ruido.
Figura 3. Morfología general de la cóclea y
cuantificación de células ciliadas. (A) Sección
transversal de cóclea teñida con hematoxilina-eosina
mostrando las principales estructuras de este órgano. (B) +/+Los ratones Igf1 presentaron un descenso en la
densidad de células ciliadas externas (outer hair cells,
OHC) después del ruido, mientras que la pérdida de
células ciliadas (inner hair cells, IHC) tanto internas +/-como externas fue más evidente en ratones Igf1 . *p<0,05
frente al control no expuesto a ruido. Barra de escala
0,5mm EV: escala vestibular; EM: escala media; ET:
escala timpánica; Ge: ganglio espiral; OC: órgano de
Corti; Ev: estría vascular; Le: ligamento espiral
Figura 4. Estudio de marcadores neurales después del ruido. (A-B, E-F) Secciones transversales de cócleas teñidas con hematoxilina y eosina. Se muestra un detalle del órgano +/+ +/-de Corti en la zona media de la cóclea de ratones Igf1 y Igf1 control y expuestos a ruido. Tras la exposición a ruido se observa la pérdida de CCE (flecha) en los ratones
heterocigotos. (C-D,G-H) Inmunohistoquímica en la misma zona coclear de los marcadores neurales neurofilamento (rojo) y sinaptofisina (verde) que muestran
respectivamente las fibras nerviosas y las terminales sinápticas eferentes en la base de las CCI y CCE. Núcleos celulares marcados con DAPI. Tras exposición al ruido se +/- +/+ observa, especialmente en las CCE, una mayor reducción de la expresión de sinaptofisina (flechas) en los animales Igf1 comparados con los ratones Igf1 (I) Cuantificación de
+/+ la tinción en la base de las células ciliadas internas (IHC) y las externas (OHC). *p<0,05 frente al control no expuesto a ruido, # p<0,05 frente a Igf1 expuesto a ruido. Barras de
escala 25 mm.
+/-Ratones de 6 meses Igf1 expuestos a ruido muestran pérdida de
células ciliadas y expresión alterada de marcadores neurales.
Referencias: 1) Murillo-Cuesta S, Rodríguez-de la Rosa L, Cediel R, Lassaletta L, Varela-Nieto I. The role of insulin-like growth factor-I in the physiopathology of hearing. Front Mol Neurosci. 2011;(4):1-17. 2) Cediel R, Riquelme R, Contreras J, Díaz A, Varela-Nieto I. Sensorineural hearing loss in insulin-like growth factor I-null mice: a new model of human deafness. Eur J Neurosci. 2006;(23):587-90. 3) Riquelme R, Cediel R, Contreras J, Rodriguez-de la Rosa L, Murillo-Cuesta S, Hernandez-Sanchez C, Zubeldia JM, Cerdan S, Varela-Nieto I. A comparative study of age-related hearing loss in wild type and insulin-like growth factor I deficient mice. Front Neuroanat. 2010;(4):1-13. 4) Cobo P, Murillo-Cuesta S, Cediel R, Moreno A, Lorenzo P, Varela-Nieto I. Design of a reverberant chamber for noise exposure experiments with small animals. Journal of Applied Acoustics 2009;(70):1034-1040. 5) Viberg A, Canlon B. The guide to plotting a cochleogram. Hear Res. 2004 (197):1-10.5. Agradecimientos: Este trabajo ha recibido el apoyo del SAF2011-24391, de la Fundación de Investigación Médica Mutua Madrileña 2012 y del proyecto AFHELO (FP7, European Union). LRR y SMC disfrutan de contratos del CIBERER y AC de AFHELO.
1,2 1,2 1,2 1,2,3 4 1,2,3 1,2Adelaida Celaya , Silvia Murillo-Cuesta , Lourdes Rodríguez-de la Rosa , Rafael Cediel , Carlos Avendaño , Julio Contreras e Isabel Varela-Nieto1 2 3 4Instituto de Investigaciones Biomédicas ‘Alberto Sols’ CSIC-UAM, Madrid Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER), Madrid Facultad De Veterinaria, UCM, Madrid Facultad De Medicina, UAM, Madrid
200
150
100
50
200
150
100
50
Rela
tive e
xpre
ssio
n le
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in O
HC
Rela
tive e
xpre
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n level
in I
HC
SYN SYN
- + - + - + - +
*#
Noise Noise
I
p-p38
p-JNK
pan PI3K
p38
JNK
p-JNK
p-JNK
p-p38
p-p38
pan PI3K
+/+Igf1
+/-Igf1
- -+ +noise
4 h
ours
3 d
ays
28 d
ays
A B
Le
Ev
Pre-noise
3d 28d4h
Pre-noise
3d 28d4h Pre-noise
3d 28d4h
Pre-noise
3d 28d4h Pre-noise
3d 28d4h
+/+Igf1
+/-Igf1
- -+ +noise
p-AKT
p-ERK 1/2
pan PI3K
p-AKT
p-ERK 1/2
pan PI3K
p-AKT
p-ERK 1/2
AKT
ERK 1/2
4 h
ou
rs3
da
ys2
8 d
ays
