Ejercicios de repaso curso bioquímica experimental.

Ejercicio 1. Métodos espectrofotométricos

Completar la tabla con las características de los métodos de purificación de proteínas.

Lowry Bradford A 280 nm

Aminoácidos o enlaces que

reconoce

Tirosina y triptófano,

en menor grado cisteína e histidina

Fenilalanina, Prolina, Arginina, Triptófano

Presencia de compuestos aromáticos

de proteínas en solución (tirosina,

triptófano, fenilalanina)

Sensibilidad Alta sensibilidad 1-2µg

Muy sensible 1-15 µg

Poco sensible 100-3000 µg

Compuestos

que interfieren

Sulfato de amonio Glicerol

Mercaptanos Tiempo de adición de

reactivos

Detergentes Tritón X-100

SDS (Dodecil Sulfato Sódico)

Compuestos que absorben a la misma

longitud de onda

Destruye la muestra

SI. Debido a la reacción con cobre

SI. Debido a la precipitación de

proteínas

NO

Compuestos empelados

para la detección de la proteína.

Cobre (Reacción de Biuret)

Reactivo de Folin (Reducción)

Azul de Coomassie Ninguno

Ventajas Aplicaciones

Lowry

Color estable

Alta precisión/exactitud

Muy usado

Utilizado para proteínas de membrana

Bradford

Compatible con agentes reductores

Alta precisión/exactitud

Rápido

Utilizado para medir muestras que contengan

agentes reductores

A 280 nm

Simple y rápido

No hay pérdida de muestra

Extractos crudos, proteínas

parcialmente purificadas

y = 0.1094x + 0.0058 R² = 0.9967

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 2 4 6 8 10 12

Ab

sorb

anci

a

BSA (µg)

Curva estándar BSA

Muestra

diluida 1.5

µL Abs μg µg/ µL

5 0.32 2.856 0.571

10 0.673 6.065 0.606

15 0.981 8.86 0.590

Sin considerar la dilución

Pregunta 2

A) Respecto a los estándares de peso molecular, ¿cual es la banda de alto peso molecular y cual la de bajo peso molecular? B) De acuerdo a lo que sabes de electroforesis el pI de la proteína estará por arriba o por debajo de 8.9. C) Calcula el peso molecular de la banda purificada.

PI debajo de 8.9

Peso molecular

Distancia recorrida

Log peso molecular Rf

148 No detectada 2.17

98 0.8 2 0.117

64 1.3 1.8 0.191

50 1.9 1.7 0.27

36 2.7 1.55 0.39

22 4.7 1.34 0.69

16 5.5 1.204 0.81

Distancia total recorrida por el frente del gel= 6.8 Distancia recorrida por la banda purificada= 2.6

Log PM= -0.927 (Rf) + 1.8943 PM= 10-0.927 (2.6/6.8) + 1.8943= 101.509

PM= 32.359

y = -0.9274x + 1.8943 R² = 0.9581

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2

log

PM

Rf

Curva estándar de proteínas en PAGE-SDS

Proteína [(NH4)2SO4

] para pp

PM

(kDa)

pI

1 45 % 38 3.7

2 80 % 22 4.8

3 65 % 4 5.3

4 20 % 75 6.8

5 30 % 55 9.5

β-galactosidasa 45 % 115 5.3

En el lisado crudo (LC) hay una mezcla de

6 proteínas (1,2, 3, 4, 5, β-galactosidasa) y

tienes como meta purificar a la β-

galactosidasa.

Comienzas la purificación con una

precipitación con (NH4)2SO4 desde ahora

llamado SA. Añades la concentración

adecuada de SA a tu LC e incubas toda la

noche para generar el sobrenadante (SA-S) y el botón (SA-B)

1. Qué concentración de SA usas para pp a la β-galactosidasa? 45 %

2. Después de la adición de SA y la centrifugación, cuáles proteínas tienes en el sobrenadante? 2 y 3

3. ¿Cuáles proteínas tienen en el botón? 1, 4, 5 y b-galactosidasa

4. Después de resuspender SA-B con amortiguador, cuál es el procedimiento que se debe realizar antes de continuar con los pasos cromatográficos DESALADO y porqué? PARA EVITAR LA INTERFERENCIA CON EL PROCESO DE UNIÓN Y/O ELUCIÓN DE LA PROTEÍNA

5. Se te ocurre continuar con la purificación de la β-galactosidasa basado en el peso molecular de la proteína, entonces que columna usarías con este fin?

CROMATOGRAFÍA EN FILTRACIÓN EN GEL TAMBIÉN LLAMADA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

PROBLEMA PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

SI SOLO ESTÁ SOLO EL GEL DE SEPHADEX, SIN NINGÚN RADICAL ADICIONAL, SE USA EN LA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

Sefadex-G25

Proteína [(NH4)2SO4] para pp PM (kDa) pI

1 45 % 38 3.7

2 80 % 22 4.8

3 65 % 4 5.3

4 20 % 75 6.8

5 30 % 55 9.5

β-galactosidasa 45 % 115 5.3

1. Cuáles de las proteínas de la mezcla eluirían primero de la columna de exclusión

molecular LAS DE ALTO PESO MOLECULAR

2. Te das cuenta de que no tienes ese tipo de columna, entonces se te ocurre usar

cromatografía de intercambio iónico, hay de dos tipos cuál

usarías__________________, que carga deben tener las proteínas para que se una

a esta columna _________________

3. Qué pH usarías para que se produjera está carga__________________

4. Cuáles proteínas se unirían a la columna____________

5. y cuáles saldrían de la columna_________________

6. Necesitas algún paso adicional para purificar a tú proteína?, si es así recuerda que

solo tienes columnas de intercambio iónico. Explica que harías

Dietilaminoetil (DEAE)-celulosa

Carboximetil (CM)-sefadex G25

Dietilaminoetil (DEAE)-celulosa

Carboximetil (CM)-sefadex G25

5.- Ejercicio construcción de una tabla

de purificación

Paso Volumen

(mL)

Actividad

total (U)

Proteína

total (mg)

Actividad

específica

(U/mg)

Enriquecimiento

(%)

Veces de

purificación

EC (1) 500 3000 15000 100

SA (2) 100 2400 4000

CII (3) 45 1440 500

FG (4) 50 1000 125 33

Pasos: 1) Extracto crudo 2) Fraccionamiento con sulfato de amonio 3) Cromatografía de intercambio iónico 4) Filtración en gel

Actividad (U ): Cantidad de enzima que cataliza la formación de 1 µmol de producto por minuto (μmol/minuto o mmol/minuto ).

Unidades: μmol min-1 mg-1 o

mmol min-1 mg-1 o

U mg-1

Paso Volumen

(mL)

Actividad

total (U)

Proteína

total (mg)

Actividad

específica

(U/mg)

Enriquecimiento

(%)

Veces de

purificación

EC (1) 500 3000 15000 0.2

SA (2) 100 2400 4000 0.6

CII (3) 45 1440 500 2.88

FG (4) 50 1000 125 8

Rendimiento de la purificación:

Porcentaje de la cantidad inicial de la proteína de interés que queda después de cada paso de purificación.

Paso Volumen

(mL)

Actividad

total (U)

Proteína

total (mg)

Actividad

específica

(U/mg)

Enriquecimiento

(%)

Veces de

purificación

EC (1) 500 3000 15000 100

SA (2) 100 2400 4000 80

CII (3) 45 1440 500 48

FG (4) 50 1000 125 33

Veces de purificación o valor del grado de pureza:

Número de veces que se incrementa la actividad específica después de cada proceso de purificación

Paso Volumen

(mL)

Actividad

total (U)

Proteína

total

(mg)

Actividad

específica

(U/mg)

Enriquecimiento

(%)

Veces de

purificación

EC (1) 500 3000 15000 1

SA (2) 100 2400 4000 3

CII (3) 45 1440 500 14.4

FG (4) 50 1000 125 40

Paso Volumen

(mL)

Actividad

total

(U)

Proteína

total

(mg)

Actividad

específica

(U/mg)

Enriquecimiento

(%)

Veces de

purificación

EC (1) 500 3000 15000 0.2 100 1

SA (2) 100 2400 4000 0.6 80 3

CII (3) 45 1440 500 2.88 48 14.4

FG (4) 50 1000 125 8 33 40

Se obtiene la mayor purificación en el paso de filtración en gel, esto sucede debido a que conforme se van perdiendo proteínas contaminantes en cada uno de los pasos del proceso de purificación (Extracto crudo (1), Fraccionamiento con sulfato de amonio (2), Cromatografía de intercambio iónico (3) y Filtración en gel (4)) el grado de pureza va incrementándose.

Se estudió la cinética de la reacción de la enzima lactato deshidrogenasa en

ensayos de velocidad inicial en ausencia y presencia de un inhibidor. Los datos

de velocidad inicial que se obtuvieron se dan en la siguiente tabla.

A) Gráfica la transformación lineal de la ecuación de Michaelis-Menten

(Lineweaver-Burk o dobles recíprocos).

1/S Sin inhibidor Con inhibidor

16.67 1295.739608 4223.525884

11.11 854.7008547 2890.875241

6.667 549.4505495 1889.084304

4 423.7288136 1336.585692

2.778 387.5968992 925.9259259

2 373.1343284 840.3361345

b 189.8567756 350.7616186

m 63.5138653 231.4032679

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

0 5 10 15 20

1/V

(m

in/m

mo

l)

1/S (mM^-1)

Lineweaver-Burk

Sininhibidor

Coninhibidor

B) Determinar las constantes cinéticas Vmax, Km y Vmax/Km

Sin inhibidor

b= 189.8567756

m= 63.5138653

𝒗𝒎𝒂𝒙 =𝟏

𝟏𝟖𝟗. 𝟖𝟓𝟔= 𝟓. 𝟐𝟔𝒙𝟏𝟎−𝟑𝒎𝒎𝒐𝒍 𝒎𝒊𝒏

𝑲𝒎 = 𝟔𝟑. 𝟓𝟏𝟒 𝟓. 𝟐𝟔𝒙𝟏𝟎−𝟑 = 𝟎. 𝟑𝟑𝟒 𝒎𝑴

𝑽𝒎𝒂𝒙

𝑲𝒎= 𝟎. 𝟎𝟏𝟓𝟕𝟒 𝒎𝒊𝒏−𝟏

𝒗𝒎𝒂𝒙 =𝟏

𝟑𝟓𝟎. 𝟕𝟔= 𝟐. 𝟖𝟓𝒙𝟏𝟎−𝟑𝒎𝒎𝒐𝒍 𝒎𝒊𝒏

𝑲𝒎 = 𝟔𝟑. 𝟓𝟏𝟒 𝟓. 𝟐𝟔𝒙𝟏𝟎−𝟑 = 𝟎. 𝟔𝟓𝟗 𝒎𝑴

𝑽𝒎𝒂𝒙

𝑲𝒎= 𝟒. 𝟑𝟐𝒙𝟏𝟎−𝟑 𝒎𝒊𝒏−𝟏

Con inhibidor

b= 350.7616186

m= 231.4032679

EL INHIBIDOR Disminuye Vmax y aumenta Km

C) Determinar qué tipo de inhibidor es y por qué. inhibidor mixto

INHIBICIÓN Vmax Km

Competitivo No cambia Aumenta

Acompetitivo Disminuye Disminuye

No competitivo Disminuye No cambia

Mixto Disminuye Aumenta

Ejercicios de cinética Un científico trabajando con un

sistema de fermentación observo un

tipo de inhibición de su enzima al

convertir el sustrato en producto. El

observo con cuidado las gráficas que

se le produjeron en condiciones

estándar e inhibidas (ver Figura).

Responde lo siguiente y resuelve el

misterio.

•¿Qué tipo de gráfico se está representando?

•Michaelis-Menten

•Dobles recíprocos

•Hanes

•Sigmoide

•¿Cuál de las dos curvas representa el efecto del inhibidor sobre la

actividad de la enzima?

•La curva A

•La curva B

•Ambas curvas

•Ninguna

•El inhibidor presente en el fermentador produce una inhibición de tipo:

•Irreversible

•Competitivo

•No competitivo

•Mixto

• ¿Cuál es el efecto del inhibidor sobre la Vmax de la reacción?

•Incrementarla

•Disminuirla

•Ninguno

•Datos insuficientes

•¿Cuál es el efecto del inhibidor sobre la Km de la reacción?

•Incrementarla

•Disminuirla

•Ninguno

•Datos insuficientes

•¿Cómo puede el investigador resolver su problema de inhibición en su

fermentador?

•Disminuyendo la concentración de sustrato

•Manteniendo la concentración de sustrato

•Incrementando la concentración de sustrato

•Datos insuficientes

7.- Ejercicio de cinética enzimática

¿Qué es la eficiencia catalítica?

La eficiencia catalítica (ε) de una enzima es la relación de o . Cuanto mayor es el valor de ε, mas eficiente es la enzima.

Parámetros cinéticos

kcat constante de la velocidad catalítica que caracteriza una reacción enzimática

o

Vmax velocidad limite en la que toda la enzima esta formando el complejo enzima-sustrato

Km constante de disociación que caracteriza la unión de una enzima a un sustrato

Un DNA recombinante es un DNA que es creado artificialmente, en donde DNA

de dos o más fuentes es usado para crear una sola molécula distinta.

Por ejemplo en el ejercicio que se te presenta en la figura, se tienen dos plásmidos

que presentan entre otras características resistencia distinta a los antibióticos,

una es resistente a ampicilina (pAMP) y el otro es resistente a Kanamicina

(pKAN);

sin embargo, ambos tienen secuencias de DNA que pueden ser reconocidas por

las mismas enzimas de restricción BamHI y HindIII, hecho que facilitará la

formación de un DNA a partir de estos dos plásmidos, aunque la posibilidad de

que se forme el DNA deseado es de 1/10.

A) Explica porqué la probabilidad es baja, ¿cuáles serán los otros productos?

La probabilidad es baja debido a que se utilizan las mismas enzimas de restricción

y las cuáles generan los mismos extremos y estos pueden interaccionar entre ellos

formando diversos productos y entre ellos el plásmido deseado pKAN /pAMP

Al cortar con las enzimas de restricción se tienen los siguientes productos

Si se ligan como una mezcla de los dos vectores podría ocurrir la ligación entre: Producto 1 con 2 = 2332 bp + 1875 bp Producto 1 con 4 = 2332 bp + 784 bp

Producto 3 con 2= 3755 bp + 1875 bp Producto 3 con 4 = 3755 bp + 784 bp

Después de la transformación del producto de restricción y ligación se realiza la selección

en el medio o medios apropiados, se extrae el DNA y se obtiene el gel que se te presenta.

B) Cuál de las clonas tiene el plásmido que se muestra en C? fundamenta tú respuesta.

• Observando en el gel la clona 1 contiene únicamente las secuencias de los plásmidos

de interés pKAN y pAMP con un peso molecular identificado en 3755 bp y 1875 bp

• Las otras clonas también cuentan también con las secuencias de interés pero no

contienen la resistencia a los antibióticos.

Ejercicio 9. Conjugación.

Un laboratorio de investigación se dedica a la caracterización de cepas bacterianas; en este momento, están trabajando con dos cepas de Escherichia coli. Lo que han descubierto acerca de estas 2 cepas es que ambas son auxótrofas a arginina, leucina y alanina (arg- leu- ala-), que una de ellas es resistente a ampicilina (mientras que es sensible a otros antibióticos) y que la otra es resistente a estreptomicina (y sensible a otros antibióticos). Durante un experimento, accidentalmente mezclan a las dos cepas y para tratar de separarlas, primero las crecen en medio LB y después en medios selectivos (LB + Ampicilina y LB + Estreptomicina). Para la cepa A (AmpR) esperarían que no hubiera crecimiento en el medio LB + Estreptomicina, mientras que en el medio LB + Ampicilina sí. Para la cepa B (StrR) esperarían que no hubiera crecimiento en el medio LB + Ampicilina, LB + Estreptomicina sí.

Sin embargo, al realizar el aislamiento, se percatan de que las nuevas colonias ¡son capaces de crecer en ambos medios selectivos! • ¿Cómo podrías explicar que las nuevas colonias obtenidas, son resistentes a ambos antibióticos? • ¿Cómo podrías demostrar cuál de las dos cepas actúa como donadora y cuál como receptora? •Sí el fenómeno es mediado por plásmidos, ¿Cómo determinarías si la cepa es Hfr ó F’? NOTA: En el laboratorio han caracterizado diferentes cepas, algunas de ellas son: • Cepa C, Escherichia coli F- leu+ • Cepa D, Escherichia coli F’ala+ • Cepa E, Escherichia coli F+ arg- leu- ala-

Cepa A

Cepa B

Auxótrofas arginina, leucina y alanina

arginina, leucina y alanina

Resistencia Ampicilina Estrepetomicina

Crecimiento esperado

LB + Ampicilina LB + Estreptomicina

Datos

¿Cómo podrías explicar que las nuevas colonias obtenidas, son resistentes a ambos antibióticos?

• Transformación. Es una forma de recombinación (intercambio o transferencia de información genética entre organismos) que se efectúa en varias pero no en todas las especies bacterianas. En este proceso no se requiere contacto entre células ni mediación por cualquier vector • Transducción. Tiene lugar cuando bacteriófagos llevan un segmento del cromosoma de una bacteria a otra. • Conjugación. Transferencia de ADN de una célula donadora a una célula recepetora a través de una conexión intercelular especializada o tubo de conjugación que se forma entre ellos

Transformación Transducción Conjugación

Contacto NO NO SI

Requerimiento de energía

Si, por ser un proceso activo

No No

Ocurre naturalmente

No En presencia de bacteriofagos

Células que lo desarrollan

Células competentes con factor de competencia

Bacterias receptoras Con células donadoras y receptoras

Por CONJUGACIÓN, al suponer que alguna de las bacterias es donadora con la capacidad de trasferir los genes que codifican para la resistencia de alguno de los antibióticos Podría justificarse por TRANSFORMACIÓN, suponiendo que algunas bacterias se lisaron y dejaron su material genético en el medio de cultivo y pensando que las células receptoras tienen la capacidad de introducir el material genético. La TRANSDCCIÓN solo podrá justificar este fenómenos si se encontrara evidencia de la presencia de Bacteriófagos dentro del medio de cultivo.

¿Cómo podrías demostrar cuál de las dos cepas actúa como donadora y cuál como receptora?

Cepa A Cepa B

Mezcla

Cepa C F- Leu (+)

Mezcla

Siembra en medio LB + Ampicilina sin Leu

Siembra en medio LB + Estreptomicina sin Leu

En donde se observe crecimiento sabremos que es la cepa donadora, debido a que le pasó el plásmido de la resistencia a su antibiótico a la cepa C y al estar en un medio sin leucina la cepa original no crecerá.

Sí el fenómeno es mediado por plásmidos, ¿Cómo determinarías si la cepa es Hfr ó F’?

Hfr. Bacteria que posee un plásmido F integrado a su cromosoma, tiene la capacidad de transferir porciones de su cromosoma por lo que confiere alta frecuencia de recombinación. No transfiere el plásmido F, por lo que al termino de la conjugación la célula receptora permanece como F- F´. Célula bacteriana que posee un plásmido F extracromosómico, pero que antes estuvo integrado al cromosoma y que escindió llevándose genes bacterianos. Actúa como célula donadora en la conjugación y trasfiere el factor F junto con los genes bacterianos, trasformando a la célula receptora en una célula F´ la cual sería un diploide parcial o merocigoto (Tendrá dos copias de los genes bacterianos que están presentes en el plásmido F)

Por la propiedad de que la cepa F´ puede convertir a la célula receptora en F´ el medio en donde crecieron las células conjugadas se toman algunas colonias y se mezcla con células de la Cepa C (Leu+) y se siembran en medio de cultivo LB + el antibiótico al que son resistentes, si son células F´ la resistencia se trasmitirá a estas nuevas células y crecerán en el medio con antibiótico. Si son Hfr, no crecerán, debido a que estas células resultantes de la conjugación con Hfr no tienen la capacidad de trasferir la característica, en este caso la resistencia al antibiótico.

Cepa conjugada En caso de ser F´

Mezcla con Cepa C

Siembra en medio LB + Antibiótico sin Leu

Crecimiento. Debido a que la cepa F´ tiene la capacidad de transmitir su plásmido

En caso de ser Hfr

Mezcla con Cepa C

Siembra en medio LB + Antibiótico sin Leu

No se observa crecimiento.

Debido a que la cepa Hfr no transmite el plásmido y la cepa resultante no puede trasmitir la resistencia

Problema #10

¿Por qué paso esto?

La glucosa como fuente de carbono hace innecesaria la activación operón lac. Los altos niveles de glucosa disminuyen las concentraciones de cAMP, por lo que no se da el incremento de la afinidad de la RNAp por el promotor y la subsecuente transcripción de genes. CATABÓLICA ¿Qué harías para solucionar el problema?

COMPRAR MÁS MEDIO CON...LACTOSA

Cepa Genotipo β-Galactosidasa (Z) Permesasa (Y) Transacetilasa (A)

c/inductor s/inductor c/inductor s/inductor c/inductor s/inductor

1 I-P+O+Z+Y+A+ + + + + + + 2 I+P+O+Z-Y+A+ - - + - + - 3 I+P-O+Z+Y+A+ - - - - - - 4 IdP+O+Z-Y+A+ - - + + + + 5 IrcP+O+Z-Y+A+ - - - + - +

Tabla 1. Predicción de la expresión de los genes estructurales (Z,Y,A) para las cepas mutantes

La cepa Id es incapaz de que el represor se una al operador, por lo que la transcripción siempre esta activa, Id hace que la expresión de genes sea constitutiva.

Cepa

Genotipo

β-Galactosidasa (Z)

Permesasa (Y)

Transacetilasa

(A)

c/ind s/ind c/ind s/ind c/ind s/ind

1 I-P+O+Z+Y+A+ /

I+P+O+Z+Y+A+ + - + - + -

2 I+P+O+Z-Y+A+/

I+P+O+Z+Y+A+ + - + - + -

3 I+P-O+Z+Y+A+/

I+P+O+Z+Y+A+ + - + - + -

4 IdP+O+Z-Y+A+/

I+P+O+Z+Y+A+ + - + + + +

5 IrcP+O+Z-Y+A+/

I+P+O+Z+Y+A+ + - + + + +

Tabla 2. Predicción de la expresión de los genes estructurales para las cepas mutantes (complementadas con la cepa silvestre).

Bibliografía -»Bioquímica», F. Bennett Armstrong, Reverte, 1982. 550 pag. -»Determinación de estructuras orgánicas», Daniel J. Pastl., Reverte. 1981 670 pag. -»Química orgánica básica y aplicada: De la molécula a la industria» Vol2, Eduardo Primo Yúfera, Reverte 1995. 484 pag. -. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica, Mc Faddin, J. F., 3 edición, México, Ed. Panamericana, 2004