EFECTOS EN LA CEBOLLA

8/7/2019 EFECTOS EN LA CEBOLLA

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Revista Cientfica Agropecuaria 9(1): 63-70 (2005) 2005 Facultad de Ciencias Agropecuarias - UNER

Notas

OPTIMIZACIN DE UNA TCNICA DE TINCIN PARADETERMINACIN DE EFECTOS CITOGENTICOS EN PICES

RADICALES DE ALLIUM CEPA *

Florencia URTEAGA OMAR1, Vctor H. LALLANA2

1Becaria Auxiliar de Investigacin. Proyecto de Trabajo Final de Graduacin y 2Prof. Tutor y Titular de laCtedra Fisiologa Vegetal. Facultad de Ciencias Agropecuarias. UNER. C.C. 24 (E3100WAA) Paran, EntreRos. Argentina

RESUMENPara poner a punto la tcnica de tincin para observaciones de efectos

citogenticos en los pices radicales de Allium cepa, se realizaron dos ensayosexploratorios con el mtodo de Allium test (Fiskesj, 1985). En el primero seasignaron bulbos de Allium cepa a dos medios de crecimiento: agua destilada(testigo) y dilucin de herbicida. A las 72 horas algunos pices radicales fueronsometidos a tincin con orcena mediante el protocolo convencional.Microscpicamente se observaron campos adecuadamente teidos, con ncleosy cromosomas de color rosceo-morado y campos ms difusos, indicativos dedeficiencias en la tincin. Se ajust el protocolo de tincin en los siguientesaspectos: empleo de segmentos radicales ms pequeos (0,5 cm); agregado deun segundo vidrio de reloj (uno para fijacin y otro para tincin) y duplicacindel tiempo de flameo del colorante (20). La tcnica as modificada fue probadaen un segundo ensayo con cinco diferentes tratamientos: agua destilada

(testigo) y aguas provenientes de plantas de tratamiento de un frigorfico, unmunicipio, un arroyo colector y una papelera. Se lograron tinciones msuniformes que permitieron observar ciertas aberraciones citolgicas y calcularlos ndices mitticos para cada muestra. Las aguas ms contaminadas(efluentes industriales), tuvieron efectos inhibitorios sobre la actividad celular,provocando aberraciones citolgicas (invaginaciones citoplasmticas, clulasredondeadas, bi-nucleadas) y disminucin del ndice mittico por encima del90 % con respecto al testigo (21,9). La tcnica de tincin optimizada permitemejores determinaciones de los efectos citogenticos y se sugiere su empleocomo complemento de la deteccin de sustancias txicas mediante el Alliumtest.

Palabras clave: Allium test - tcnica de tincin - mutgenos - alteracionesciclo celular Allium cepa

*Original recibido (29/04/05)Original aceptado (22/06/05)


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Florencia Urteaga Omar y Vctor H. Lallana

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SUMMARYOptimization of staining technique to evaluate cytogenetic effects withAllium test methodologyWith the purpose of adjusting staining technique for observations ofcytogenetic effects on Allium cepa L root apexes, two exploring assays werecarried out following the Allium test methodology. In the first assay, Allium

cepa bulbs were assigned to two growing media: distilled water (control) andherbicide dilution. After 72 hours some root apexes were stained with orceinfollowing the conventional protocol. At the microscope some fields were foundadequately stained with pink and purple nuclei and chromosomes; and morediffusse fields indicating deficiencies in staining. The staining protocol wasadjusted in the following aspects: usage of smaller radical segments (0.5 cm),adding a second watch glass (one for fixation and the other for staining) andduplication of stain flaming time (20). The technique, modified as describedabove, was tried in a second assay with five different treatments: distilled water(control treatments) and water samples from a meat packing plant, a township,a collector stream and a paper mill treatment plants. More uniform stainingswere achieved that allowed to observe certain cytologic aberrations and to

estimate mitotic indexes for each sample. Most contaminated water (industrialeffluents) had inhibiting effects on cell activity producing cytologic aberrations(cytoplasmatic invaginations, rounded binuclear cells) and a mitotic indexdecrease of above 90 % as compared with control sample (21.9 %). Theimproved staining technique allowed better determinations of cytogeneticeffects reason why its usage is suggested as a complement technique in thedetection of toxic substances when using Allium test.

Key words: Staining technique - mutagens - alterations in cell cycle - onionroots

IntroduccinEn los ltimos aos se observa un

creciente inters por el desarrollo y empleode pruebas biolgicas para evaluar lospotenciales efectos txicos y genotxicos dela contaminacin sobre los seres humanos ylos ecosistemas (Forget et al., 2000). SegnFiskesj y Dutka (1996), los organismosbiolgicos tienen la capacidad de expresarlas alteraciones ms sutiles que operandurante cierto tiempo en un ecosistemamediante respuestas individuales (reacciones

fisiolgicas, etolgicas, morfolgicas,bioqumicas), o de conjunto (cambio en laestructura y dinmica de las comunidades,perturbaciones en las ramas trficas, etc.).Por su capacidad para detectar cambios en lacalidad de los efluentes y controlar que la

toxicidad est por debajo de los lmitespermitidos, los ensayos o tests biolgicos seestn transformando en herramientasvaliosas para la evaluacin del impactoambiental.

Comparativamente con las pruebasanalticas rutinarias, estos bioensayosofrecen una cantidad de ventajas para eldiagnstico ecotoxicolgico. Ya que,mientras que las primeras pueden sercostosas, demandar varias semanas para surealizacin y an as no proporcionar

informacin sobre posibles respuestastxicas sinrgicas o sobre la biovariabilidadde los agentes txicos, los bioensayos soninstrumentos simples, rpidos, econmicos ypueden ser ejecutados con diferentesespecies (especialmente las de fcil


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Optimizacin de una tcnica de tincin para determinacin de efectos citogenticos en pices

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disponibilidad y que germinen y crezcanrpidamente).

En este contexto, las pruebas deecotoxicidad con plantas vasculares, entreellas el Allium test (Fiskesj, 1988), estndemostrado una potencialidad diagnstica

significativa (Kristen, 1997). El Allium testes un bioensayo que permite determinar latoxicidad total y genotoxicidad de diferentesagentes txicos o contaminantes (Fiskesj,1993), a partir de la observacin delcrecimiento y las mutaciones cromosmicasdel pice radical de la cebolla (Allium cepa).Kumar et al. (2000) sealan que las races deplantas superiores, por ser sistemas nofotosintticos y libres de cloroplastos,presentan reacciones similares a las de lostejidos y clulas de los vertebrados, por loque son tan vlidas como los gruposcelulares de los mamferos para detectarcitotoxicidad basal. En esta misma lneaargumental, Fiskesj (1997) subraya que losmeristemas radicales pueden ser empleados,adems, para investigar la genotoxicidadmediante anlisis microscpicos de lasaberraciones celulares durante la divisinmittica.

Estudios microscpicos de clulasradicales de cebolla, creciendo en diferentes

medios txicos, han mostrado un ampliorango de alteraciones citolgicas, lo queindica la fina sensibilidad de las races deAllium cepa para detectar sustanciaspotencialmente peligrosas tanto para la saludhumana como para el medio ambiente engeneral. Particularmente ilustrativas son lasinvestigaciones de Smaka-Kincl et al.(1996), quienes identificaron parmetroscitolgicos en meristemas de cebollatratados con efluentes industriales y aguasmunicipales, tales como inhibicin de la

divisin celular, aparicin de clulasaberrantes tanto en metafase como enanafase y aumento de clulas conmicroncleo en la interfase. En esta mismalnea de estudios, Chauhan et al. (1999),evaluando los efectos de dos insecticidas

comerciales, observaron inhibicin delndice mittico y aberraciones mitticas ycromosmicas desde las 6 a las 24 horas deltratamiento. Odeigah et al. (1997), alestudiar las propiedades txicas ygenotxicas de desechos slidos de

industrias nigerianas, encontraron que lasmezclas lixiviadas causaron modificacionesde los ndices mitticos y alteraciones enprofase, metafase, anafase y telofase. Por suparte, Zoldo et al. (1997), quienesanalizaron la citotoxicidad de qumicoscomunes en los efluentes de fbricas croatasde gas y aceite, encontraron disturbiosmitodepresivos en el ciclo de divisinmittica de las clulas de cebolla.

Resultados similares fueron informadospor Rank y Nielsen (1998), Manosalva et al.(1999) y Nielsen (1997), al estudiar losefectos citotxicos y mutagnicos deinsecticidas de uso frecuente, pertenecientesal grupo de carbamatos; y al evaluar losefectos de aguas de desage provenientes deindustrias papeleras dinamarquesas con altasconcentraciones de metales pesados,respectivamente. Mas recientemente,Evseeva et al. (2003), Monarca et al. (2000)y Vidakovi-Cifrek et al. (2002), a partir deanlisis de agua proveniente de un

reservorio natural prximo a una fbricaeslovena de radio; de diluciones condesinfectantes alternativos al cloro (talescomo dixido de cloro, ozono y cidoperactico), y de soluciones de aguasaturada con cloruro de Ca y bromuro de Ca,comnmente usadas en la industria delaceite, respectivamente, informaron aberra-ciones tales como anafase con puentescromticos trinucleados, desbalanceados, ocon microncleos.

El objetivo del presente estudio es

poner a punto la tcnica de tincin paraobservaciones microscpicas de efectoscitogenticos en los pices radicales deAllium cepa y evaluar el mtodo en muestrasde agua de distintos orgenes.


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Materiales y mtodosEnsayo exploratorio

Se seleccionaron 6 bulbos de Allium cepa(de 4 cm de dimetro aproximado), los quefueron asignados a dos medios de crecimiento: 1testigo con agua destilada y 1 dilucin deherbicida (Tordn D30) de 0,005 l/ha a partir deuna dilucin inicial de 3 l/ha. Al cabo de lasprimeras 72 horas, se retiraron las cebollas de susrespectivos tratamientos y se procedi a preparar2-3 races de cada cebolla para exmenesmicroscpicos. Se realiz la tincin y fijacin declulas en base al procedimiento de Alzola(2001). Se cortaron con bistur dos o tresraicillas, tomando solamente la parte apical de 1-2 cm y se aadieron gotas de la solucin defijacin (Carnoy) hasta cubrirlas. Se fijarondurante 10 minutos. El exceso de fijador seelimin con pipeta y papel de filtro e

inmediatamente se aadi el colorante (orcenaactico-clorhdrica). Se flame hasta la emisinde vapores, evitando la ebullicin. Se dejenfriar y se repiti 2-3 veces durante 15 minutos.Sobre un porta objetos se cort un fragmentoapical de aproximadamente 3 milmetros al quese le aadi una gota del colorante. Se realiz elsquash del tejido y se sellaron los bordes delcubre con barniz de uas transparente para evitarla deshidratacin celular.

Observaciones microscpicas: Lospreparados fueron observados a travs de unmicroscopio ptico equipado con cmara digital.

Se observaron tres campos por preparado. Secalcul el ndice mittico (IM) que estima elporcentaje de clulas en divisin que existe en untejido y, por lo tanto, es una medida del potencialproliferativo del mismo. Para el clculo del IM yla duracin de cada fase del ciclo celular seemplearon las siguientes frmulas:

100

)(% x

clulasdetotaln

TAMPmitosisenclulasdenIM

+++=

6021

xx

totalclulasn

faseclulasnfaseenTiempo =

Resultados preliminares

Con la tcnica de tincin utilizada seobservaron los ncleos y los cromosomas encolor rosceo-morado. La preparacin present

el aspecto de una dispersin de clulas por todoel campo que abarcaba el objetivo. En todas lasclulas se pudieron diferenciar:

a. El citoplasma no teido.b. El ncleo densamente teido y en su

interior una o dos regiones poco o nada teidas,correspondientes a los nucleolos (por ser ricos enRNA no se tien).

c. La pared celular (que aunque sta no setie, se dedujo su presencia por la formarectangular que tiene la clula).

d. Los cromosomas en las clulas que seencontraban en mitosis.

A partir del la observacin de campos enlos que slo o mayoritariamente hubiera clulasmeristemticas, se procedi al recuento de lasmismas, lo que permiti calcular el porcentaje declulas correspondientes a cada etapa del ciclocelular. El procedimiento de conteo se repiti enotros campos cuidando que no se solaparan,hasta obtener los datos de cmo mnimo 50clulas. A su vez, y asumiendo que la duracintotal del ciclo celular de Allium cepa es de 12horas (Bishop y Klein, 1973), se estim laduracin en minutos de cada fase del ciclo(Cuadro 1).

Cuadro 1. Porcentaje de clulas en cada fase delciclo celular y estimacin de la duracin (min) delas fases correspondientes a los segmentosradicales de Allium cepa

Grupo testigo:agua destilada

Grupoexperimental:herbicida

Fases %Duracin(minutos)

%Duracin(minutos)

Interfase 79,80 574 98.98 712,72Profase 10,34 74,48 0.005 3,63

Metafase 3,940 28,37 -- --Anafase 0,009 7,09 -- --Telofase 0,049 35,46 0.005 3,63

La dilucin conteniendo herbicida inhibisignificativamente la actividad mittica de las

clulas de Allium cepa (Cuadro 1). El segmentoradical sometido a crecimiento en la dilucin deherbicida, registr una disminucin del ndicemittico (1,01) por encima del 95 % con respectoal grupo testigo (20,19) y permaneci eninterfase (sin divisin celular) la mayor parte del


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ciclo. Situacin que permite deducir sus efectostxicos. La tcnica de tincin elegida fueapropiada, ya que permiti registrar muchosdetalles de la actividad citolgica. No obstante,como durante las observaciones microscpicasmuchos campos no fueron adecuadamenteobservados, se decidi optimizar el protocolo detincin para lograr an mejores determinacionesde los ndices mitticos. Con tal propsito seprocedi a realizar un segundo ensayo queconst de 4 experimentos mediante la tcnica delAllium test(Fiskesj, 1989) cuya metodologa sedescribe a continuacin:Experimento 1: se utiliz agua de efluente de unfrigorfico (pileta secundaria) preparando 4medios de crecimiento, 1 testigo con aguadestilada y 3 diluciones (10 %, 50 % y 100 %)del agua problema.Experimento 2: con la aguas servidas (piletasecundaria) de un municipio, se prepararon 3medios de crecimiento, 1 testigo con aguadestilada, 2 diluciones (50 % y 100 %).Experimento 3: se prepararon dos medios decrecimiento, 1 testigo con agua destilada y 1 conel agua de un arroyo colector sin diluir.Experimento 4: se utiliz aguas servidas de unaindustria papelera, preparando 4 medios decrecimiento, 1 testigo con agua destilada y 3diluciones (10 %, 50 % y 100 %) del agua dedeshecho.

En cada experimento y por medio decrecimiento se asignaron 12 bulbos de Alliumcepa (n=156). Siguiendo el Protocolo 8(Fiskesj, 1989), al tercer da se retir unacebolla de cada tratamiento para exmenesmicroscpicos. La finalidad de tales exmenesfue la de verificar si, adems de las diferenciasmacroscpicas, observadas a simple vista encuanto a longitudes radicales, los diferentesmedios de crecimiento provocaban algn tipo dealteracin citolgica.

En esta oportunidad se introdujeron lassiguientes modificaciones en el procedimiento detincin y fijacin de las clulas radicales:

a. Se utilizaron segmentos radicales mspequeos (de slo 0,5 cm en lugar de 1-2 cm).

b. Se emplearon dos vidrios de reloj: unopara realizar la fijacin y otro para la tincin conorcena. De esta forma se evit que restos delfijador se mezclaran con el colorante.

c. Se aument de 15 a 25 minutos eltiempo de flameo del colorante

Resultados y discusinLos resultados de los ndices mitticos

de cada Experimento y la duracin de cadafase del ciclo celular se presentan en elCuadro 2.

Cuadro 2. Indices mitticos correspondientes a los 4 experimentos (Exp) realizados y estimacin dela duracin (min) de cada fase del ciclo celular de los efluentes en su estado puro

Tratamientos Internase Profase Metafase Anafase Telofase Total IMExp1: Testigo 162 21 8 2 10 203 20,19Exp1: 10 % 152 25 9 4 9 199 23,61Exp1: 50 % 182 2 -- 1 2 187 2,67Exp1: 100 % 192 -- -- -- -- 192 --Duracin (min) 720 -- -- -- -- 720 --Exp2: Testigo 124 23 3 -- 12 162 23,45Exp2: 50 % 168 10 4 -- 2 184 8,69Exp2: 100 % 166 2 -- 1 2 171 2,92Duracin (min) 698,94 8,42 -- 4,21 8,42 720Exp3: Testigo 128 19 8 3 7 165 22,42Exp3: 100 % 156 2 -- 1 1 159 1,88Duracin (min) 701,88 9,05 -- 4,53 4,53 720Exp4: Testigo 127 15 8 3 9 162 21,60

Exp4: 10 % 141 7 5 2 2 157 10,19Exp4: 50 % 163 3 -- 1 2 169 3,55Exp5: 100 % 163 -- 1 1 2 167 2,39Duracin (min) 702,75 -- 4,31 4,31 8,62 720

Referencias: Exp. 1; Aguas de piletas de tratamiento de un establecimiento frigorfico; Exp2, Aguas de piletas detratamiento de aguas servidas domiciliarias de un Municipio; Exp3, Aguas de un curso colector de aguasservidas industriales y domiciliarias y Exp4, Aguas de desecho de una industria papelera


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Se registro una importante reduccindel ndice mittico de las clulas de cebollasometidas a crecer en los efluentes msconcentrados del frigorfico (Cuadro 2). Laausencia de actividad celular en su estadopuro (Exp1: 100 %) est indicando que se

trata de un efluente altamente txico(Cuadro 2). Por la respuesta celularobservada en las diferentes diluciones de lasaguas de pileta del municipio, se puedeinferir que el efluente municipal est menoscontaminado que el del frigorfico, habidacuenta que no slo se registra una mayoractividad celular en la dilucin intermedia,

sino que tambin se observa cierta actividaden su estado puro. El arroyo colector, sufreel impacto de las aguas provenientes delfrigorfico por lo que las clulas de cebollaresponden con un ndice mittico muy bajo.Finalmente, en los tratamientos conteniendo

agua de la papelera, se registr unadisminucin gradual de los ndices mitticosen funcin del aumento de la concentracindel efluente. A pesar de la probablepresencia de compuestos qumicos conteni-dos en el efluente, se observ ciertarespuesta celular de Allium cepa, an en sumayor concentracin (Cuadro 2).

Clulas con citoplasma invaginado(achatado y deformado) en muestradel frigorfico

Clulas bi y trinucleadas de muestrasdel frigorfico y clulas redondeadasen muestras de la papelera

Clulas con aspecto deshidratadoen muestras del sitio papelera

Figura 1. Clulas de los pices

radicales de cebolla con distintasaberraciones y deformaciones


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De la duracin en minutos de cada fasedel ciclo celular se desprende que cuando lascebollas crecen en los medios que contienenlas aguas problema en su estado puro (100%), sus clulas radicales transcurren lamayor parte del ciclo celular en interfase.

Esta es una evidencia del impacto del mediode crecimiento sobre la actividad mittica.En este sentido, los medios msperjudiciales resultan los provenientes delfrigorfico, la papelera y el arroyo colector,en ese orden. En tales medios se pudieronobservar las aberraciones celulares queilustran la Figura 1.

ConclusionesLas modificaciones introducidas a la

tcnica de tincin han permitido detectar conmayor detalle los efectos citogenticos delos diferentes efluentes agroindustrialessobre los pices radicales de la cebollaconstituyendo un complemento valioso de ladeteccin de sustancias txicas mediante elAllium test.

Los medios de crecimiento con agua deefluentes en su estado puro provocaron losmenores ndices mitticos y sus clulastranscurrieron la mayor parte del ciclo eninterfase.

Las muestras de agua del estableci-miento frigorfico y de una papelera, en suestado puro y diluidas al 50 %, resultaron lasms perjudiciales sobre la actividad mitticade las clulas radicales de cebolla.

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