EFECTOS DEL PESTICIDA FLUTRIAFOL SOBRE LA LIBERACION IN VIVO DE

DOPAMINA EN EL NÚCLEO ESTRIADO DE RATAS. UN ESTUDIO MEDIANTE

MICRODIALISIS CEREBRAL.

Profa. Dra. Lilian Rosana Ferreira Faro

Pesticidas

Definición

Los pesticidas o plaguicidas son sustancias químicas destinadas a matar, repeler, atraer, regular o interrumpir el crecimiento de plagas en su sentido mas amplio.

Consideramos plaga a aquellos organismos nocivos que transmiten enfermedades, compiten por alimentos y/o dañan bienes económicos y culturales.

Pesticidas. Tóxicos en potencia.

Son biocidas: compuestos químicos destinados a eliminar organismos interfiriendo en mecanismos vitales que son comunes a la mayoria de los seres vivos, incluidos los humanos.

Uso muy extendido: por lo que parece dificil sustraerse a su contacto.

Los pesticidas poseen dos características que les hacen interesantes para el estudio desde el punto de vista de la salud:

Uso de plaguicidas en España

• Existe una gran cuantidad de productos usados como pesticidas en el mundo.

• En España, hay unos 500 ingredientes activos y unos 5000 productos comerciales.

Uso de plaguicidas en España

Gasto en 2003: 650 millones de Euros

Cuantidad utilizada: 112.000 Tm

Los más utilizados: Fungicidas: 28% Herbicidas: 25% Insecticidas: 20%

CLASIFICACIÓN DE LOS PESTICIDAS

A. SEGUN EL TIPO DE ORGANISMO QUE COMBATEN.

B. SEGUN SU FAMILIA QUIMICA.

C. SEGUN SU TOXICIDAD AGUDA.

En cuanto a la toxicidad...

• Extremamente tóxico• Altamente tóxico• Medianamente tóxico• Poco tóxico• Muy poco tóxico

En cuanto al grupo químico

Grupo Características químicas

Organofosforados

Compuestos orgánicos devivados del ácido fosfórico, tiofosfórico o ditofosfórico. Ex.: paration, malation...

Carbamatos Ésteres derivados de los ácidos n-metil o dimetil carbámico. Ex.: carbaril, furadan.

Organoclorados

Compuestos a base de carbono, con radicales de cloro. Son derivados del ciclobenzeno, ciclohexano o ciclodieno. Ex.: DDT, lindano, endosulfan

Ditiocarbamatos

Carbamatos que contienen, cuasi siempre, un metal en su estructura química. Ex.: maneb, zineb, mancozeb.

Dipiridilos Herbicidas sólidos, insípidos e inodoros muy solubles en agua. Ex.: paraquat

PiretroidesCompuestos sintéticos que presentan estructuras parecidas a la piretrina,

sustancia existente en las flores del crisantemo. Ex.: aletrina, dismetrina,

Neonicotinoides

Compuestos que presentan estructura química parecida a la nicotina, con efecto biológico similar a esta. Ex.: Tiametoxam.

En cuanto al organismo que combaten

Tipo de Pesticida

• Acaricida• Antimicrobiano• Avicida• Fungicida• Herbicida• Inseticida• Moluscicida• Piscicida• Rodenticidas• Raticida

Insecticidas Fungicidas Organoclorados Organoclorados Organofosforados Organo mercuriais Carbamatos Triazoles Piretroides Ditiocarbamatos Herbicidas Raticidas Bipiridilos Dicumarínicos Organoclorados Triazinas Acaricidas / Sarnicidas Piretroides

CLASIFICACION DE LOS PESTICIDAS

Toxicidad de los pesticidas

OrganocloradosEx.: DDT, Lindano, Dicofol

Persisten en el ambiente POPs DDT

Estimulantes del SNC, siendo sus efectos manifestados principalmente por

convulsiones. Otros signos:

Parestesia, agitación involuntaria, ataxia y hiperreflexia.

Estos signos pueden ser consecuencia de efectos a nivel molecular tales como:

Aumento de la concentración de amonio libre

Disminución de los niveles de GABA y de la concentración de acetilcolina

Toxicidad de los pesticidas

Organofosforados y Carbamatos

Muy tóxicos, usados principalmente como insecticidas.

Colinesterasas (ChEs)

Organofosforados

Carbamatos

Irreversible

Reversible

Alteración Colinérgica

(Taylor, 1985 )

CansacioDolor de cabeza

MareosSudoresis

Visión borrosa VómitoCalambres

Dolor de estómago

Principales síntomas de la intoxicación por Organofosforados y Carbamatos

Paraquat

Produce degeneración de las neuronas dopaminérgicas nigro-estriatales en animales experimentales.

Estimula la liberación de glutamato y toda la cascada que lleva a la

produción de especies reactivas al oxígeno.

Glutamato Receptores no NMDA entrada de Ca++ activación de la NOS Óxido nítrico ROS

EXPOSICION HUMANA Y EFECTOS TOXICOS

Excitabilidad;

Vertigo;

Dolor de cabeza;

Mareo, Vómito y Diarrea;

Parestesia;

Ataxia;

EFECTOS AGUDOS

Sudoresis;

Constricción de la Pupila;

Salivación;

Latidos Cardiacos alterados;

Convulsión;

Broncoespasmo;

Coma.Alavanja, 2004

Polineuropatia periférica;

EFECTOS CRONICOS

Alteraciones de Humor;

Desordenes Afectivas;

Déficits en actividades neurocomportamentales;

Alteraciones en la función sensorial;

Alteración en la función motora;Enfermedad de Parkinson.

Enfermedad de Alzheimer;

Depresión;

Esquizofrenia;

?

Disminución de la Cognición; Alavanja, 2004

EXPOSICION HUMANA Y EFECTOS TOXICOS

ENFERMEDAD DE PARKINSON

PARAQUAT;

MANEB;

DIELDRIN;

DDT y metabolitos.

ROTENONA;

HEPATOCLOR;

•Degeneración Nigroestriatal;

•Alteración en la actividad motora;

•Terminales dopaminérgicas alteradas;

•Reducción de la actividad mitocondrial;

•Muerte de las células dopaminérgicas.

Neurotransmisión dopaminérgica

Caudado-Putamen

Córtex Pré-Frontal

Núcleo Acumbens

Tubérculo Olfatório

Haz prosencefálico medial

AmígdalaSubstância NegraHipo-

campo

Núcleo CaudadoPutamen

Giro CinguladoNúcleo

Accumbens

Hipotálamo

FISIOLOGIA DE LA TERMINAL DOPAMINERGICA

DOPA

DA

MAO

3MT

HVAMAO

DOPAC

DOPAC extracelular

HVA

COMT

COMT

Tyr

CompartimentoCitoplasmático

Insecticidas Fungicidas Organoclorados Organoclorados Organofosforados Organo mercuriais Carbamatos Triazoles Piretróides Ditiocarbamatos Herbicidas Raticidas Bipiridilos Dicumarínicos Organoclorados Triazinas Acaricidas / Sarnicidas Piretroides

CLASSIFICACION DE LOS PESTICIDAS

TRIAZOLES

FLUTRIAFOL TRIADIMEFON VORICONAZOL

FLUCONAZOL CLOTRIMAZOLTEBUCONAZOL

EFECTOS NEUROTOXICOS DE LA EXPOSICION A LOS TRIAZOLES

TRIADIMEFON

TEBUCONAZOL

FLUTRIAFOL

RATAS

HIPERACTIVIDAD;

COMPORTAMIENTOS ESTERIOTIPADOS;

AUTO-MUTILACION.

DÉFICIT DE APRENDIZAJE

(PERDIDA DE CÉLULAS HIPOCAMPALES)

FASE EMBRIONARIA

?

Crofton, 1996; Moser, 2001

OBJETIVOS DE ESTE TRABAJO

Estudiar los efectos de la administración del pesticida flutriafol sobre la liberación in vivo de dopamina en el núcleo estriado de ratas utilizando la técnica de Microdialisis Cerebral acoplada a la Cromatografia Líquida de Alta Eficacia (HPLC) con detección electroquímica.

Materiales y Métodos

Microdialisis cerebral

Cromatografia Líquida de AltaEficacia (HPLC)

Microdialisis

Local de implantación de la sonda

Proceso de microdialisis

Sonda de microdialisis

HPLC

Sistema de microdialisis y HPLC

A - DOPAC

B - Dopamina

C - 5-HIA

D - HVA

Valores basales

DA = 0.41 0.19 ng/ 20 min

20 min

Medio Ringer Flutriafol Medio Ringer Medio Ringer

60 min 60 min 60 min 60 min

Flutriafol

1 mM

6,6 mM

12 mM

Protocolo de administración in situ de flutriafol

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

-40 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Tempo (min)

DA

(%

do

ba

sa

l)

Flutriafol 1 mM

Flutriafol 6,6 mM

Flutriafol 12 mM

Veículo (DMSO 2,5%)

*

******

*** ***

**Flutriafol

POSIBLE MECANISMO DE ACCION DEL FLUTRIAFOL PARA INDUCIR LA LIBERACION DE DOPAMINA

HIPÓTESIS:

DOPA

DA

Tyr

1 - Aumento exocitótico de la liberación de DA

Flutriafol

MECANISMO DE ACCION DEL FLUTRIAFOL PARA INDUCIR LA LIBERACION DE DOPAMINA

HIPÓTESIS:

2 – Alteración de la actividad del DATDOPA

DA

Tyr

Flutriafol

x

Grupos experimentales

1. Administración de medio libre de calcio

2. Administración de medio libre de sodio

3. Administración de TTX4. Administración de reserpina5. Administración de nomifensina

DOPA

DA

TyrP.A.

Na+

Ca++Ca++

Administración de medio libre de calcio o de sodio

Medio Ringer sin Calcio o sin sodio

20 min

Medio Ringer Sin calcio

Sin sodio

Medio Ringer

60 min 60 min 60 min 60 min

6,6 mM Flutriafol + Ringer sin Calcio

CARACTERIZACION DE LA LIBERACION ESTRIATAL DE DOPAMINA

S/ Ca++

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120

Tempo (min)

DA

(%

do

ba

sa

l)

Flutriafol 6,6 mM Flutriafol 6,6 mM / Sem Ca++

*** a

Flutriafol

a***

*** a

** a

#

92%

S/ Na+

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120

Tempo (min)

DA

(%

do

ba

sa

l)

Flutriafol 6,6 mM Flutriafol 6,6 mM / Sem Na+

*** a

a **

*** a

** a

Flutriafol

#

***

70%

DOPA

DA

TyrP.A.

Na+

TTX

X

Administración de TTX

Animales tratados con 10 µM TTX

20 min

Medio Ringer Medio Ringer com TTX

6,6 mM Flutriafol + TTX

Medio Ringer

60 min 60 min 60 min 60 min

TTX

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120

Tempo (min)

DA

(%

do

ba

sa

l)

Flutriafol 6,6 mM + TTX Flutriafol 6,6mM

a***

*** b

*** a

Flutriafol ** a

*

*

#

73%

DOPA

DA

Tyr

RESERPINA

DAx

Administración de Reserpina

Animales tratados con 10 mg/Kg i.p. de Reserpina

20 min

6,6 mM Flutriafol

Medio Ringer

80 min 60 min 60 min 60 min

Reserpina i.p.

Medio Ringer

RESP.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

-40 -20 0 20 40 60 80 100 120

Time (min)

DA

(%

of

ba

sa

l)Flutriafol 6,6 mM + Reserpina Flutriafol 6,6 mM

*** b

Flutriafol

a***

*** a

** a

** ** **

86%

DOPA

DA

Tyr

NOMIFENSINA

x

Administración de Nomifensina

Tratamiento con 20 µM Nomifensina y 6,6 mM de Flutriafol

20 min

20 µM Nomifensina + 6,6 mM Flutriafol

Meio Ringer

60 min 60 min

Medio Ringer

60 min

NOM

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

-40 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Time (min)

DA

(%

of

ba

sa

l)Nomifensina 20 uM

Flutriafol 6,6 mM

Flutriafol 6,6 mM + 20 µMNomifensina

***b

##

Flutriafol

***

***

***

******

*****

DOPA

DA

Tyr

FLUTRIAFOL

Na+

Ca++

TTX

DOPA

DA

TyrFLUTRIAFOL

Pré-tratamento

RESERPINA 10mg/Kg

DOPA

DA

Tyr

NOMIFENSINA

FLUTRIAFOL

CONCLUSIONES 1. La infusión intraestriatal de diferentes concentraciones de

flutriafol aumenta los niveles extracelulares de dopamina de manera dependiente de la concentración utilizada. Estos son los primeros resultados que demuestran la acción de ese fungicida sobre la neurotransmisión dopaminérgica en el núcleo estriado.

3. La liberación de dopamina inducida por flutriafol es mediada por un mecanismo exocitótico dependiente de calcio, sodio, inhibido por TTX y dependiente de la dopamina vesicular.

4. La liberación de dopamina inducida por flutriafol no es mediada por una acción sobre el transportador de dopamina, una vez que este fungicida no ha alterado los efectos producidos por la nomifensina.