“EFECTOS DEL OZONO EN UN MODELO … · Nfkb e incrementó significativo de IL-6, IL-1, Col4 y...

Título del Programa de Doctorado: Clínica Veterinaria e Investigación Terapéutica. Mención de Calidad Otorgada por el Ministerio de Ciencia e Innovación del Gobierno de España (2008). Centro/Departamento Responsable del Programa: Dpto. de Patología Animal, Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Campus Universitario de Arucas, Facultad de Veterinaria. Unidad de Investigación. Entidades: Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín.

“EFECTOS DEL OZONO EN UN MODELO EXPERIMENTAL DE FIBROSIS PULMONAR INDUCIDA CON BLEOMICINA”

Tesis Doctoral presentada por:

Dña. CHARLÍN MÉNDEZ CORDOVEZ

Dirigida por los Doctores:

Dr. Bernardino Clavo Varas

Dr. Norberto Santana Rodríguez

Dr. Pedro R. Llontop Santisteban

Dra. Mª Dolores Fiuza Pérez

Director, Director, Director, Director, Doctoranda

(Firma) (Firma) (Firma) (Firma) (Firma)

Las Palmas de Gran Canaria, a 9 de Noviembre de 2015.

BERNARDINO CLAVO VARAS, Doctor en Medicina por la Universidad Autónoma de Madrid, Médico Especialista en Oncología Radioterápica e Investigador en la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín. CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “Efectos del ozono en un modelo experimental de fibrosis pulmonar inducida con bleomicina” ha sido realizado por Dña. Charlín Méndez Cordovez, en la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, bajo mi dirección y asesoramiento, una vez revisada la presente memoria la encuentro apta para su defensa como Tesis Doctoral, para optar al grado de doctor. Y para que así conste y surta los efectos oportunos, extiendo el presente certificado, en Las Palmas de Gran Canaria a 9 de Noviembre de dos mil quince.

Fdo. Bernardino Clavo Varas.

Hospital Universitario de Gran Canaria Dr.Negrín. Unidad de Investigación.

Barranco de la Ballena, Sn 35010 – Las Palmas de Gran Canaria

Telf.: 630751093

NORBERTO SANTANA RODRIGUEZ, Doctor en Medicina por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Médico Especialista en Cirugía Torácica y Responsable de Cirugía Experimental e Investigador en la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín.

CERTIFICA:

Que el trabajo de investigación titulado “Efectos del ozono en un modelo experimental de fibrosis pulmonar inducida con bleomicina” ha sido realizado por Dña. Charlín Méndez Cordovez, en la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, bajo mi dirección y asesoramiento, una vez revisada la presente memoria la encuentro apta para su defensa como Tesis Doctoral, para optar al grado de doctor. Y para que así conste y surta los efectos oportunos, extiendo el presente certificado, en Las Palmas de Gran Canaria a 9 de Noviembre de dos mil quince.

Fdo. Norberto Santana Rodríguez.



Telf.: 630751093

PEDRO ROLANDO LLONTOP SANTISTEBAN, Doctor en Veterinaria por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria e Investigador en la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín.

CERTIFICA:

Que el trabajo de investigación titulado “Efectos del ozono en un modelo experimental de fibrosis pulmonar inducida con bleomicina” ha sido realizado por Dña. Charlín Méndez Cordovez, en la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, bajo mi dirección y asesoramiento, una vez revisada la presente memoria la encuentro apta para su defensa como Tesis Doctoral, para optar al grado de doctor.

Y para que así conste y surta los efectos oportunos, extiendo el presente certificado, en Las Palmas de Gran Canaria a 9 de Noviembre de dos mil quince.

Fdo. Pedro Rolando LLontop Santisteban.



Telf.: 630751093

Mª DOLORES FIUZA PÉREZ, Doctora en Medicina por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Médico Especialista en Medicina Preventiva y Salud Pública y Epidemióloga Clínica del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín.

CERTIFICA:

Que el trabajo de investigación titulado “Efectos del ozono en un modelo experimental de fibrosis pulmonar inducida con bleomicina” ha sido realizado por Dña. Charlín Méndez Cordovez, en la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, bajo mi dirección y asesoramiento, una vez revisada la presente memoria la encuentro apta para su defensa como Tesis Doctoral, para optar al grado de doctor.

Y para que así conste y surta los efectos oportunos, extiendo el presente certificado, en Las Palmas de Gran Canaria a 9 de Noviembre de dos mil quince.

Fdo. Mª. Dolores Fiuza Pérez



Telf.: 630751093

Financiación

La presente Tesis Doctoral ha recibido financiación del Gobierno de Canarias, Consejería de Sanidad, a través de la convocatoria pública de la Fundación Canaria de Investigación y Salud (FUNCIS) del año 2008, de ayudas para Personal Investigador en Formación otorgada a la doctoranda.

El Proyecto de investigación “Efectos del Ozono en un modelo experimental de fibrosis pulmonar inducida con bleomicina” ha sido financiado por el propio grupo investigador.

Investigador principal: Dr. Norberto Santana Rodríguez.

A mis padres, Aida y Jesús.

La distancia que nos ha separado estos años no ha sido inconveniente para sentir sus ánimos, apoyo y cariño que me han permitido seguir adelante para cumplir mis sueños.

Agradecimientos

Después de un largo tiempo de trabajo, quiero agradecer en primer lugar a las instituciones que han hecho posible la realización de esta Tesis Doctoral tanto por su ayuda económica, formación, así como por todos los medios puestos a mi alcance: a la Fundación Canaria de Investigación y Salud, a la Facultad de Veterinaria (ULPGC), a la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, sería muy difícil lograrlo si no es con el apoyo y estímulo de todas las personas que forman parte de ellas

En segundo lugar, mi más sincero agradecimiento a mis directores de Tesis, por su ayuda incondicional y por acogerme en su Grupo de Investigación de “Cirugía Experimental”, en especial al Dr. Santana y a mi Tutor el Dr. Bernardino Clavo, por su predisposición y aliento desde el principio, e impagable generosidad intelectual; a la Dra. Fiuza, por formarme en el área de la Metodología de la Investigación en Medicina y por su ayuda incondicional para realizar el análisis estadístico de este proyecto; a mi compañero de trabajo, el Dr. LLontop por romper la rutina al brindarme su apoyo “Verás …Charlín…verás” , etc.

Agradezco a los doctores de la Facultad de Veterinaria, donde di mis primeros pasos como investigadora, su formación en el Área de la Investigación Clínica y Terapéutica Veterinaria, donde desarrolle el “gusanillo” este de la investigación, en especial al Dr. Alberto Montoya, a la Dra. Maite Tejedor, Dr. Carlos Gutiérrez, al Dr. Pablo, a la Dra. Candelaria Juste, y al Dr. Antonio Espinosa de los Monteros y Zayas.

Agradecer al Dr. Camacho, Jefe de Servicio de Anatomía Patológica, y a la Dra. Ana Bordes del Servicio de Microbiología del Hospital Universitario Dr. Negrín, su predisposición y asesoramiento en el procesado y análisis de las muestras de este proyecto.

A todos los compañeros que he tenido en los Servicios por los que he rotado, en mi formación como investigadora, de la mano del Dr. Carlos Rodríguez Santana (Servicio de Inmunología) y la Dra. Teresa Gómez (Servicio de Hematología).

A mis compañeros de la Unidad de Investigación, en mi corazón solo puede haber agradecimiento hacia ustedes porque son como una familia para mí: Ángela, Rosa, Miguel, Fran, José Luis, Lidia, Tatiana, y en especial a Yanira, por su ayuda técnica en el laboratorio.

Agradecer al Servicio de Ilustración, a D. Juan y a D. Ramón por estar siempre que los he necesitado en la elaboración del diseño e imagen de las presentaciones a congresos, a los que he asistido y su ayuda en la presente Tesis.

Agradecer a toda mi familia, en especial a mi madre, mi mayor fuente de inspiración, fortaleza, lucha, dedicación y amor.

RESUMEN

INTRODUCCIÓN: La fibrosis pulmonar (FP) idiopática es la forma más frecuente y la de peor

pronóstico de FP, con media de supervivencia de 3-5 años. Las opciones terapéuticas son muy

limitadas. El modelo experimental de FP inducida por instilación orotraqueal (IOT) de bleomicina (BLM)

se ha mostrado útil en el estudio del desarrollo de la FP, condicionada por la perpetuación de estrés

oxidativo e inflamación. Múltiples trabajos han evidenciado que el tratamiento con ozono (O3) puede

modular esos factores.

OBJETIVOS: Estudiar en un modelo de FP inducida mediante IOT de BLM en ratas, los posibles

efectos protectores del O3, algo que, hasta la fecha, ningún estudio ha evaluado previamente.

MATERIAL Y MÉTODO: se emplearon 21 ratas distribuidas en cuatro grupos. A): Control, 3 animales

(analizados 6 pulmones). Resto de grupos con 6 ratas: B) Sham; C) BLM; D) Bleomicina+O3. Al grupo

Control no se le realizó instilación IOT. Al grupo Sham se le realizó IOT de suero fisiológico. A los

grupos BLM y BLM+O3 se les indujo FP mediante IOT de BLM. Al grupo de BLM+03, además, se le

administró O3 vía rectal, desde el 2º día pos-IOT hasta el momento del sacrificio a los 28 días pos-IOT.

RESULTADOS: El grado de FP fue mayor en el grupo Sham que en el grupo Control (p= 0.002), y en

el grupo BLM respecto al grupo SHAM (p= 0.002). El grupo BLM+O3 mostró menos fibrosis que el de

BLM (p= 0.026). El estudio de expresión génica mostró alteraciones en el grupo Sham respecto al

grupo Control. Respecto al grupo Sham, el grupo BLM mostró un incremento significativo de la fibrosis

y de la expresión de Hsp27, Nfkb, IL-6, IL-1, Col4 y Tgfb-1. El tratamiento con O3 disminuyó

significativamente el grado de fibrosis y la expresión de Hsp27, con normalización de la expresión de

Nfkb e incrementó significativo de IL-6, IL-1, Col4 y Tgfb-1.

CONCLUSIONES: Nuestro modelo experimental de FP mediante IOT de BLM se mostró útil en la

producción de la enfermedad. La administración de O3 vía rectal, disminuyó significativamente el grado

de fibrosis y de expresión de Hsp27 y normalizó Nfkb, lo que muestra su capacidad para influir en la

evolución de la enfermedad. Desde el punto de vista traslacional, el O3 se plantea como una nueva

opción potencialmente aplicable en la FP, enfermedad grave y con limitadas opciones terapéuticas.

ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE DE TABLAS.

ÍNDICE DE FIGURAS.

ABREVIATURAS.

I.- INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………. 1

1.- Fibrosis Pulmonar…………………………………………………………………………... 2

1.1.- Definición……………………………………………………………………………………. 2

1.2.- Epidemiología………………………………………………………………………………. 2

1.3.- Factores de riesgo…………………………………………………………………………. 3

1.3.1.- Factores genéticos hereditarios…………………………………………………………. 3

1.3.2.- Factores ambientales…………………………………………………………………….. 3

1.3.3.- Enfermedad por reflujo gastroesofágico……………………………………………….. 3

1.3.4.- Infecciones virales………………………………………………………………………… 4

1.3.5.- Autoinmunidad…………………………………………………………………………….. 4

1.3.6.- Exposición a fármacos………………………………………………………………….... 4

1.3.7.- Otros factores a tener en cuenta………………………………………………………... 5

1.4.- Patogénesis………………………………………………………………………………… 5

1.4.1.- Daño y activación de las células epiteliales alveolares (CEA)………………………. 5

1.4.2.- Efectos profibróticos de la activación anómala de las CEA en el microambiente pulmonar…………………………………………………………………………………………….

5

1.4.3.- Diferenciación de los fibroblastos en miofibroblastos………………………………… 6

1.4.4.- La ausencia de neumocitos tipo I………………………………………………………. 6

1.4.5.- Metaloproteinasas de la matriz (MMPs) y la anormal remodelación pulmonar……. 7

1.4.6.- Angiogénesis y remodelación microvascular…………………………………………. 7

1.4.7.- Relación entre FPI y envejecimiento…………………………………………………… 7

1.4.8.- Los pericitos y las células mesoteliales pleurales…………………………………….. 8

1.5.- Prevención...………………………………………………………………………………... 8

1.6.- Diagnóstico 8

1.6.1.- Manifestaciones clínicas y analíticas…………………………………………………. 9

1.6.2. Diagnóstico radiológico……………………………………………………………………. 10

1.6.2.1.- Radiografía de toráx……………………………………………………………. 10

1.6.2.2.- Tomografía Computadorizada de Alta Resolución (TCAR)……………….. 11

1.6.3.- Pruebas de función pulmonar…………………………………………………………… 13

1.6.4.- Lavado broncoalveolar (LBA)……………………………………………………………. 13

1.6.5.- Biopsia pulmonar………………………………………………………………………….. 14

1.6.6.- Estudio histológico………………………………………………………………………... 14

1.7.- Tratamiento…………………………………………………………………………………. 15

1.7.1.- Terapia farmacológica……………………………………………………………………. 16

1.7.1.1.- Pirfenidona……………………………………………………………………… 16

1.7.1.2.- Nintedanib………………………………………………………………………. 17

1.7.1.3.- N-Acetilcisteína………………………………………………………………… 18

1.7.1.4.- Otros fármacos…………………………………………………………………. 18

1.7.2.- Rehabilitación respiratoria……………………………………………………………….. 19

1.7.3.- Trasplante pulmonar……………………………………………………………………… 19

1.8.- Pronóstico…………………………………………………………………………………... 20

2.- Bleomicina y Modelo Experimental de Fibrosis Pulmonar………………………….. 21

2.1.- Bleomicina…………………………………………………………………………………... 21

2.1.1.- Estructura de la bleomicina……………………………………………………………… 21

2.1.2.- Mecanismos de acción de la bleomicina……………………………………………….. 22

2.1.3.- Farmacocinética y metabolismo………………………………………………... 22

2.1.4.- Toxicidad pulmonar por bleomicina…………………………………………… 23

2.2- Modelo Experimental de Fibrosis Pulmonar…………………………………………. 23

3.- Ozono…………………………………………………………………………………………... 25

3.1.- Historia………………………………………………………………………………………. 25

3.2.- Definición y propiedades………………………………………………………………… 26

3.3.- Mecanismos de acción…………………………………………………………………… 27

3.4.- Vías de administración…………………………………………………………………… 31

3.5.- Efectos secundarios y contraindicaciones de la ozonoterapia………………… 32

II.- JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………………………. 33

III.- OBJETIVOS…………………………………………………………………………………… 35

IV.- MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………………………… 37

4.1. Material……………………………………………………………………………………….. 38

4.1.1.- Animales de experimentación…………………………………………………………… 38

4.1.2.- Salas, equipos y material inventariable………………………………………………… 39

4.1.3.- Material quirúrgico………………………………………………………………………… 40

4.1.4.- Medicación anestésica y analgésica…………………………………………………… 41

4.1.5- Material para conservación del tejido pulmonar………………………………………. 42

4.2.- Método……………………………………………………………………………………….. 42

4.2.1.- Diseño……………………………………………………………………………………… 42

4.2.2.- Inducción de fibrosis pulmonar por BLM……………………………………………… 43

4.2.2.1.- Anestesia……………………………………………………………………….. 44

4.2.2.2.- Intubación y ventilación………………………………………………………. 44

4.2.2.3.- Administración de BLM………………………………………………………. 44

4.2.2.4- IOT de solución salina isotónica 0,9% (solución fisiológico) y BLM……. 45

4.2.3.- Tratamiento con ozono………………………………………………………………….. 45

4.2.4.- Evolución clínica en el periodo postoperatorio……………………………………….. 46

4.2.5.- Obtención y recogida de muestras…………………………………………………….. 46

4.2.6.- Mediciones………………………………………………………………………………… 49

4.2.6.1- Análisis microbiológico………………………………………………………….. 49

4.2.6.2.-Análisis histológico……………………………………………………………….. 49

4.2.6.2.1.- Procesamiento de las muestras……………………………………………. 49

4.2.6.2.2.- Lectura de las muestras…………………………………………………….. 50

4.2.6.3. Análisis de la expresión genómica……………………………………………… 51

4.2.6.3.1- Extracción de RNA y síntesis de cDNA……………………………………. 51

4.2.6.3.2- Análisis de la expresión genómica mediante qRT-PCR………………… 52

4.2.7.- Análisis estadístico……………………………………………………………………….. 53

V.- RESULTADOS……………………………………………………………………………….. 54

5.1.- Resultados y datos clínicos de los animales………………………………………… 55

5.2.- Descripción macroscópica………………………………………………………………. 56

5.3. Estudio histológico. Cuantificación del grado de fibrosis según escala Ashcroft……………………………………………………………………………………………

57

5.4.- Análisis microbiológico………………………………………………………………….. 59

5.5.- Análisis de Expresión génica……………………………………………………………. 59

VI.- DISCUSIÓN…………………………………………………………………………………… 70

VII.- CONCLUSIONES……………………………………………………………………………. 76

VIII.- BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………………... 79

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Pruebas de laboratorio ante sospecha de FPI……………………………………………... 10

Tabla 2. Criterios de patrón de neumonía intersticial usual (NIU) en la TCAR…………………… 12

Tabla 3. Recomendaciones basadas en la evidencia para el tratamiento de la FPI……………. 16

Tabla 4. Resumen de algunos de los efectos tópicos y sistémicos del ozono médico…………. 30

Tabla 5. Diseño de grupos para el estudio histológico, microbiológico y de expresión génica…. 43

Tabla 6. Volumen de IOT de los grupos de estudio………………………………………………….. 43

Tabla 7. Criterio para valorar el grado de fibrosis pulmonar………………………………………… 51

Tabla 8. Genes y condiciones de la PCR a tiempo real…………………………………………….. 52

Tabla 9. Evolución del peso de los animales…………………………………………………………. 55

Tabla 10. Días empleados en recuperar el peso inicial del estudio según grupos……………….. 55

Tabla 11. Grado de fibrosis pulmonar según la escala de Ashcroft y su significación estadística.. 59

Tabla 12. Expresión de los genes analizados entre el grupo Control va SHAM………………….. 60

Tabla 13. Expresión de los genes analizados entre el grupo Control vs BLM……………………… 61

Tabla 14. Expresión de los genes analizados entre el grupo Control vs BLM+O3………………… 62

Tabla 15. Expresión de los genes analizados entre el grupo SHAM vs BLM……………………… 63

Tabla 16. Expresión de los genes analizados entre el grupo SHAM vs BLM+O3…………………. 64

Tabla 17. Expresión de los genes analizados entre el grupo BLM y BLM+O3……………………. 65

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Algoritmo diagnóstico de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI)………………………….. 9

Figura 2. Hallazgos en imágenes con opacidades panal de abeja con una disminución periférica y basal……………………………………………………………………………….

11

Figura 3. Hallazgos en imágenes con opacidades panal de abeja con una disminución periférica y basal……………………………………………………………………………….

11

Figura 4. La tomografía computerizada de alta resolución (TCAR) puede mostrar la estructura en panal de abeja aparece como sombras anulares estrechamente aproximadas, el hallazgo implica enfermedad pulmonar en estado avanzado. Izquierda: imagen de un corte axial. Derecha: imagen de un corte coronal…………………………………………

12

Figura 5. Patrón de neumonía intersticial usual en la biopsia pulmonar: fibrosis periférica (A) con focos de actividad fibroblástica en áreas de interface (B) y focos de micropanal (C…………………………………………………………………………………………………

15

Figura 6. Estructura de la bleomicina (BLM)………………………………………………………….. 21

Figura 7. Esquema del modelo de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina………………….. 24

Figura 8. Leyes de Ohms y de Poiseuille, donde F= Flujo, P= Presión de flujo, R= Resistencia, η= Viscosidad sanguínea, r= Radio y L= Longitud del vaso…………………………….

29

Figura 9. Esquema de la acción del O3 sobre la oxigenación y flujo de los tejidos. ROS: radicales libres; LPO: lipoperóxidos; A.O.: antioxidantes; Nrf2: factor nuclear eritroide-2; 2,3-DPG: 2,3 difosfoglicerato; NO: óxido nítrico; PG: prostaglandinas; Hb: hemoglobina……………………………………………………………………………………

29

Figura 10. Esquema de cómo la ozonoterapia sistémica (vía insuflación rectal o mediante autohemoterapia) y los lipoperóxidos a los que da lugar, pueden inducir una respuesta adaptativa en distintos órganos……...............................................................

30

Figura 11. Jaula 20 x 35 x 55 cm…………………………………………………………………………. 38

Figura 12. Sala del postoperatorio……………………………………………………………………….. 39

Figura 13. Instalaciones quirúrgicas…………………………………………………………………….. 39

Figura 14. Ventilador Servo 900C………………………………………………………………………… 40

Figura 15. Generador de O3………………………………………………………………………………. 40

Figura 16. Microscopio de pie Carl Zeiss………………………………………………………………... 40

Figura 17. Congelador Jouan – 80º C…………………………………………………………………… 40

Figura 18. Instrumental quirúrgico………………………………………………………………………... 41

Figura 19. Anestésicos y analgésicos empleados en las ratas……………………………………….. 41

Figura 20. Muestra el proceso de IOT…………………………………………………………………… 45

Figura 21. Insuflación rectal de O3 en la rata……………………………………………………………. 45

Figura 22. Esternotomía media. Acceso a bloque cardio-pulmonar………………………………….

46

Figura 23. Rata en posición de decúbito supino, traqueotomía y ventilación mecánica…………… 47

Figura 24. Esternotomía media…………………………………………………………………………… 48

Figura 25. Extracción del bloque cardio-pulmonar……………………………………………………… 48

Figura 26. Procesador de tejidos Leica TP 1020……………………………………………………….. 50

Figura 27. Dispensador de parafina Leica EG 1160……………………………………………………. 50

Figura 28. Microtomo de rotación Thermoscientific HM 340 E………………………………………... 50

Figura 29. Microscopio óptico Olympus BX40………………………………………………………….. 50

Figura 30. Gráfica de evolución del peso de los animales durante los 28 días del estudio……….. 56

Figura 31. Pulmón grupo Control y grupo Sham……………………………………………………….. 56

Figura 32. Pulmón grupo BLM……………………………………………………………………………. 56

Figura 33. Pulmón grupo BL+03…………………………………………………………………………... 57

Figura 34. Estudio histológico grupo Control……………………………………………………………. 57

Figura 35. Estudio histológico grupo SHAM…………………………………………………………….. 58

Figura 36. Estudio histológico grupo BLM…………………………………………………………………………………………………….. 58

Figura 37. Estudio histológico grupo BLM+03................................................................................... 58

Figura 38. Expresión de los genes analizados entre control vs SHAM……………………………… 60

Figura 39. Expresión de los genes analizados entre control vs BLM………………………………… 61

Figura 40. Expresión de los genes analizados entre control vs BLM+O3.…………………………... 62

Figura 41. Expresión de los genes analizados entre grupo SHAM vs BLM + O3…………………... 64

Figura 42. Expresión de los genes analizados entre BLM vs BLM+O3………………………………. 65

Figura 43. Expresión de HSP27 entre Sham vs BLM vs BLM+O3……………………………………. 66

Figura 44. Expresión de Vegfa entre Sham vs BLM vs BLM+O3……………………………………... 67

Figura 45. Expresión de Nfkb entre Sham vs BLM vs BLM+O3………………………………………………………………. 67

Figura 46. Expresión de IL6 entre Sham vs BLM vs BLM+O3………………………………………….. 68

Figura 47. Expresión de Col4 entre Sham vs BLM vs BLM+O3………………………………………. 68

Figura 48 Expresión de IL1 entre Sham vs BLM vs BLM+O3……………………………………....... 69

Figura 49. Expresión de Tgfb entre Sham vs BLM vs BLM+O3………………………………………... 69

ÍNDICE DE ABREVIATURAS

AHT: Autohemoterapia.

ALAT: Asociación Latinoamericana del Tórax.

AO: Sistemas antioxidantes.

AOS: Apnea obstructiva del sueño.

AP-1: Proteína activadora 1.

AR: Artritis reumatoide.

ATP: Adenosina trifosfato.

ATS: American Thoracic Society.

BP: Biopsia pulmonar.

BPA: Biopsia pulmonar abierta.

BPQ: Biopsia pulmonar quirúrgica.

BR – EPI: Bronquiolitis respiratoria asociada a enfermedad pulmonar intersticial.

BTB: Biopsia transbronquial.

BTS: Sociedad Británica del Tórax.

CE: Células epiteliales.

CEA: Células epiteliales alveolares.

(CIO- ): Anión hipoclorito.

CO: Monóxidos de carbono.

CVF: Capacidad vital forzada.

CPT: Capacidad pulmonar total.

DLCO: Capacidad de “difusión del monóxido de carbono”.

DM: Diabetes mellitus.

2,3- DPG: 2,3 difosfoglicerato.

EAC: Enfermedad de las arterias coronarias.

EDPP: Enfermedad difusa del parénquima pulmonar.

EMC: Estatus Microbiológico Convencional.

EPID: Enfermedades pulmonares intersticiales difusas.

ERGE: Enfermedad por reflujo gastroesofágico.

ERS: European Respiratory Society.

F: Flujo sanguíneo.

FELASA: Federaciones de Asociaciones Europeas de las Ciencias del Animal de Laboratorio.

FP: Fibrosis pulmonar.

FPF: Fibrosis pulmonar familiar.

FPI: Fibrosis pulmonar idiopática.

FPIF: Fibrosis pulmonar idiopática familiar.

GITC: Tiaocinato de guanidino.

GSH: Glutatión.

4-HNE: 4-hidroxinonenal.

HO: Hemo oxigenasa.

HP: Hipertensión pulmonar.

HP secundaria: Hipertensión pulmonar secundaria.

HPS: Síndrome de Hermansky- Pudlak.

HSP-70: Proteínas de shock térmico de 70 KDa.

HE: Hematoxilina- eosina.

IgG: Inmunoglobulinas G.

IP: Vía intraperitoneal.

IOT: Instilación orotraqueal.

IR: Insuflación rectal.

JRS: Sociedad Respitaroria Japonesa.

LBA: Líquido del lavado brocoalveolar.

LPO: Lipoperóxidos.

MALT: Tejido linfoide asociado a mucosas.

NADPH: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato.

NFAT: Factor nuclear de las células T activadas.

NH: Neumonitis por hipersensibilidad.

NII: Neumonía intersticial idiopática.

NIU: Neumonía intersticial usual.

NID: Neumonía intersticial descamativa.

NIL: Neumonía intersticial linfoide.

NINE: Neumonía intersticial no específica.

Nrf2: Factor de transcripción nuclear.

N2O2: Peroxinitrilos.

O2: Oxígeno atmósferico.

O3: Ozono.

(0=N00- ): Peroxinitrilo.

PCR: Proteína c reactiva.

PTEN: Gen de la fosfatasa y tensina homólogo.

PLA2: Fosfolipasa A2.

P (A-a) O2: Diferencia alvéolo-arterial de oxígeno en reposo.

PUFA: Grasos poliinsaturados.

R: Resistencia vascular.

RCP: Resucitación cardio-pulmonar.

SEPAR: Sociedad Española de Patología del Aparato Respiratorio.

Shn: Gen Sonic hedgehog.

SOD: Superóxido dismutase.

TCAR: Tomografía axial computarizada de alta resolución.

TEM: Transición epitelio mesenquimal.

TEV: Tromboembolismo venoso.

TP: Trasplante pulmonar.

UIP: Neumonía interstical usual.

RL: Radicales libres.

RXT: Radiografía de tórax.

UV: Radiación ultravioleta.

UVB: Ultravioleta de onda media.

UVC: Ultravioleta de onda corta.

VEB: Virus de Epstein-Barr.

VHC: Virus de la hepatitis C.

VEMS: Volumen espirado máximo en el primer segundo de la espiración forzada.

VSG: Velocidad de sedimentación.

I. INTRODUCCIÓN.

Tesis Doctoral Charlín Méndez Cordovez

2

1.- Fibrosis Pulmonar Idiopática (FPI).

1.1.- Definición.

La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) pertenece a una familia de aproximadamente 200

enfermedades relacionadas conocidos como enfermedades pulmonares intersticiales (EPID) que se

caracterizan por la afección difusa del parénquima pulmonar. Existen EPID en las que predominan los

procesos inflamatorios, como la sarcoidosis o la neumonitis por hipersensibilidad. En otras EPID

predominan los procesos de fibrosis, y entre ellas destaca por su mayor prevalencia la FPI.

La FPI se define como una forma específica de neumonía intersticial fibrosante, crónica,

progresiva, de causa desconocida, que ocurre generalmente en adultos de edad media o avanzada, y está

limitada a los pulmones. Está asociada a un patrón radiológico y/o histológico de la neumonía intersticial

usual (NIU). Se caracteriza por deterioro progresivo de disnea y función pulmonar y se asocia con mal

pronóstico y escasas opciones terapéuticas, con una supervivencia media de aproximadamente tres años

desde el momento del diagnóstico (1-3).

1.2.- Epidemiología.

La FPI es una enfermedad huérfana que afecta a un creciente número de personas en los Estados

Unidos (EE.UU.) y en Europa.

En EE.UU., los datos más fiables estiman que la prevalencia de la FPI varía en unos 14 a 27,9

casos por cada 100.000 habitantes utilizando definiciones estricta de casos y alrededor de 42,7 a 63 casos

por cada 100.000 habitantes utilizando definiciones de casos más amplia, dependiendo de la población

estudiada (4). La definición estrecha de casos cumple con todos los criterios mayores y menores de la

American Thoracic Society (ATS) y la European Respiratory Society (ERS) (5) y requiere patrones de

neumonía intersticial usual (NIU) definidas en tomografía computarizada de alta resolución pulmonar

(TCAR), mientras que la definición de casos generales incluye que los pacientes respondan a la definición

estrecha, así como aquellos con TCAR que ofrecen alguna característica posible de NIU. La incidencia

reportada fue de unos 6,8 a 8,8 casos por cada 100.000 habitantes.

En Europa la prevalencia de esta enfermedad varía de 1,25 a 23,4 casos por 100.000 habitantes

(6, 7) y su incidencia anual se estima entre 0,22 y 7,4 por 100.000 habitantes (6, 8).

De acuerdo a la normativa sobre diagnóstico y tratamiento de la FPI de la Sociedad Española de

Patología del Aparato Respiratorio (SEPAR), se estima que en España la FPI puede estar afectando a unas

7.500 personas (9). Se desconoce si la incidencia y prevalencia están influidas por factores étnicos, raciales

o geográficos. En los últimos años se ha observado un incremento en la prevalencia, probablemente debido

a la optimización de los métodos diagnósticos y al aumento de la esperanza de vida (8, 10).


3

1.3.- Factores de riesgo.

Los factores de riesgo potenciales para el desarrollo de la FP incluyen: las exposiciones

ambientales y ocupacionales, el consumo de tabaco, las comorbilidades y los polimorfismos genéticos.

Conocer los factores de riesgo potenciales en el desarrollo de la FPI permitiría optimizar estrategias de

prevención, diagnóstico precoz y tratamiento más adecuadas, incluyendo el trasplante pulmonar (TP).

1.3.1.- Factores genéticos y hereditarios.

Las principales alteraciones genéticas relacionadas con FP son: mutaciones en los genes que

mantienen la longitud de los telómeros (TERT, TERC) y que son más frecuentes en las formas familiares,

en la proteína C del surfactante, en la región promotora de la mucina 5B (MUC5B) y polimorfismos de los

genes que codifican citoquinas como interleuquinas, factor de necrosis tumoral α (TNFα), factor de

crecimiento transformante β1 (TGF β1) o metaloproteinasas de la matriz extracelular (MMPs).

La presentación familiar supone menos del 5% de los casos de FPI, siendo éstos clínica e

histológicamente indistinguibles de los casos de presentación esporádica. La forma más probable de

transmisión genética de FPI familiar es a través de una herencia autosómica dominante con penetrancia

variable.

Entre las enfermedades hereditarias relacionadas con mayor riesgo de aparición de FP están: el

síndrome de Hermansky- Pudlak, la enfermedad de la disqueratosis congénita o el síndrome de insuficiencia

hereditaria de la médula ósea (1, 11).

Aproximadamente el 15% de los casos de FPI familiar y el 5% de los casos esporádicos portan la

mutación heterocigótica en alguno de sus genes, las células de los pacientes retienen el 50% de la actividad

de la polimerasa.

1.3.2.- Factores ambientales.

Múltiples líneas evidencian que la exposición a los agentes ambientales inhalados (tales

como el polvo de metales, piedras, maderas y textiles, asbesto o sílice), tabaquismo (≥ 20

paquetes/año) y actividades en la agricultura y la ganadería, se asocian a un riesgo aumentado de

FPI.

1.3.3.- Enfermedad por reflujo gastroesofágico (ERGE).

La ERGE ha sido asociada a la FPI debido a la presencia de ácidos de pepsina y / o biliares en el

líquido del lavado broncoalveolar (LBA) (12). El reflujo puede predisponer a la microaspiración, iniciando y/o

conduciendo a la inflamación pulmonar, que puede progresar a FP en un individuo susceptible, y la

evidencia acumulada ha vinculado ERGE con aspiración como factor para la predisposición y la progresión

de la FPI (13). El procedimiento quirúrgico de la funduplicatura de Nissen es la técnica de elección para

el tratamiento de la ERGE, mejorando significativamente la supervivencia de los pacientes con FPI (14).


4

1.3.4.- Infecciones virales.

La FPI se caracterizada por una acumulación de macrófagos alveolares y neutrófilos en el tracto

respiratorio inferior, lesión del parénquima y fibrosis intersticial. Aunque no existe evidencia suficiente para

considerar que las infecciones virales sean factores etiológicos de la FPI, su potencial contribución sigue

siendo objeto de estudio. Además del herpes virus y de los adenovirus, cabría destacar:

El virus de Epstein-Barr (VEB), que normalmente infecta el tracto respiratorio superior, pero que

también se ha demostrado que infecta y se replica en el tracto respiratorio inferior (15). Se han identificado

tanto la proteína VEB y la expresión de ADN en el tejido pulmonar de pacientes con FPI. (16). El supuesto

papel de VEB en el desarrollo de la FPI se ha ampliado ante los hallazgos de que la expresión de la proteína

de la membrana EBV latente 1 en las células del epitelio alveolar se asocia con un mal pronóstico en

pacientes con FPI (17).

EL virus de la hepatitis C (VHC), en especial en pacientes con trastornos inmunes, puede

desencadenar una alveolitis linfocitaria subclínica, aunque se necesitan más estudios para definir su

importancia en la etiología de la enfermedad pulmonar intersticial (18).

1.3.5.- Autoinmunidad.

Un posible factor autoinmune se basa en que las manifestaciones radiológicas y/o histológicas de

la NIU se asocian a la presencia de enfermedades del tejido conectivo, como lo es la artritis reumatoide, la

esclerodermia, el lupus eritematoso sistémico, la granulomatosis de Wegener y la sarcoidosis, aunque estas

suelen cursar con histología de neumonía intersticial no específica.

1.3.6.- Exposición a fármacos.

Ciertas investigaciones sugieren una asociación entre la exposición a antidepresivos y el riesgo de

desarrollar FPI. Un estudio de casos y controles analizó la hipótesis de que los pacientes con alveolitis

fibrosante criptogénica (AFC) tenían más probabilidades de haber sido expuestos a ciertos medicamentos.

Analizando todas las recetas hasta la fecha del diagnóstico, se encontró que un número significativamente

mayor de prescripciones de antidepresivos en el grupo de casos que en los sujetos control. La asociación

se observó con antidepresivos tricíclicos y compuestos relacionados, en particular con la imipramina, la

doxeprina, y la mianserina (19).

La FP puede ser una toxicidad tardía de algunos tratamientos oncológicos, como la exposición

pulmonar o torácica a radioterapia, o el empleo de algunos quimioterápicos como bleomicina o metotrexate,

pudiendo llegar a ser una toxicidad limitante de dosis.

De hecho, como veremos en el apartado (2.2.),uno de los modelos animales existentes de FP se

basa en su inducción mediante bleomicina.


5

1.3.7.- Otros factores a tener en cuenta.

Las comorbilidades y ciertas enfermedades pulmonares fibróticas pueden tener un impacto

negativo en la evolución de la enfermedad comprometiendo la vida de los pacientes con FPI (20) (21).

Estos incluyen: hipertensión pulmonar secundaria, enfermedad coronaria (22, 23), tromboembolismo

venoso (24), apnea obstructiva del sueño, enfisema coexistente, osteoporosis, diabetes mellitus, ansiedad

y depresión.

1.4.- Patogénesis (20).

El concepto de FPI ha evolucionado desde el de una “enfermedad inflamatoria crónica” al de una

“enfermedad heterogénea y multifactorial caracterizada por un proceso de cicatrización aberrante” (25). En

su patogénesis vamos a destacar ocho puntos que se consideran fundamentales:

1.4.1.- Daño y activación de las células epiteliales alveolares (CEA).

Los factores de riesgo (genéticos y/o ambientales) pueden causar un aumento del estrés del

retículo endoplasmático en las células epiteliales alveolares (CEA) pudiendo inducir en ellas tanto apoptosis

como una transición epitelio-mesenquimal (TEM) (26). A pesar de la muerte de las CEA tipo I (encargadas

del intercambio de gases), las CEA tipo II (progenitoreas de las tipo I y responsables de la producción de

proteinas surfactantes) se activan y recubren los quistes de la lesión en forma de panal de abeja.

En la FP están alterados varios genes y proteínas con función morfogenética. Las CEA y los

fibroblastos sobre-expresan diferentes ligandos de la vía de señalización Wnt-β-catenina, encargada de la

producción de glucoproteínas necesarias en los procesos morfogenéticos. Por otra parte, una

sobreexpresión del gen Sonic hedgehog (Shh) y una disminución de la expresión del gen del homólogo de

la fosfatasa y tensina (PTEN) en las CEA sugieren un proceso de reparación defectuoso, que favorecerá

una disminución de la apoptosis en los fibroblastos y aumento de proliferación de miofibroblastos.

1.4.2.- Efectos profibróticos de la activación anómala de las CEA en el

microambiente pulmonar.

En la FPI, la activación anómala de las CEA permite la activación del factor X de la coagulación.

Este factor (de la superficie de las plaquetas) estimula los fibroblastos e induce activación de la protrombina

(factor II, también en la superficie plaquetaria) convirtiéndolo en trombina, que a su vez estimula la

diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos vía “receptor-I activado por proteasa”. Los miofibroblastos

tienen mayor capacidad profibrótica que los fibroblastos, e inducen depósito de matriz extracelular y

destrucción de la arquitectura pulmonar.


6

Las CEA producen diversos mediadores como factor derivado de plaquetas (PDGF), factor de

crecimiento transformante beta (TGF-β), factor de necrosis tumoral (TNF-α) y endotelina-1, que contribuyen

a la migración, proliferación y diferenciación de las células mesenquimales. Por otra parte, en la FPI, las

CEA también presentan una marcada sobreexpresión del factor derivado de células del estroma-1

(CXCL12) que, activando el receptor de quimioquina CXC tipo-4 (CXCR4) presente en los fibrocitos

circulantes, lleva a un reclutamiento de fibrocitos desde la sangre al pulmón.

Por último, las CEA pueden aumentar directamente el número de fibroblastos y miofibroblastos

mediante TEM. En este proceso, las células epiteliales adquieren propiedades de las células

mesenquimales, por las que aumentan su capacidad para moverse y sintetizar matriz intersticial. En la FPI,

las células mesenquimáticas locales, los fibrocitos circulantes y la TEM participa en la expansión de los

fibroblastos y los miofibroblastos.

En resumen, a partir del daño y activación de las CEA se activa una vía de señalización

procoagulante, el aumento de fibroblastos y miofibroblastos y el reclutamiento de fibrocitos al sitio de la

lesión.

1.4.3.- La diferenciación de los fibroblastos en miofibroblastos.

Tres factores principales intervienen en la diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos:

1. la elevada tensión mecánica (mecanotransducción) que induce la diferenciación a

protomiofibroblastos,

2. el incremento de la actividad del TGFβ1

3. y la presencia de proteínas especializadas de la matriz celular.

Posteriormente, los miofibroblastos inducirán la acumulación excesiva de matriz extracelular, la

rotura de la membrana basal y la muerte de células epiteliales.

La eliminación de los miofibroblastos mediante el mecanismo de apoptosis es esencial durante las

fases finales del proceso normal de cicatrización. Pero esto no parece producirse en los focos fibroblásticos

de la FPI. Se desconocen las razones por la que los fibroblastos y miofibroblastos sobreviven mientras que

las CEA mueren dentro del mismo microentorno. Una explicación posible sería la deficiencia de

prostaglandina E2 que se observa en la FPI (27), que aumenta la sensibilidad de las CEA a la apoptosis

pero disminuye la sensibilidad de los fibroblastos a la apoptosis.

1.4.4.- La ausencia de neumocitos tipo I.

En condiciones normales las CEA tipo I (neumocitos tipo I) cubren más del 90% de la superficie

alveolar, y su estrecha relación con los capilares pulmonares proporciona una superficie fácilmente

permeable para los gases. Los pacientes con FPI tienen una importante pérdida de neumocitos tipo I,

aunque este efecto no está claro. Por otra parte, la transdiferenciación de las CEA tipo II (neumocitos tipo

II) en neumocitos tipo I (indispensable para poder restablecer la función epitelio alveolar) está alterada en

la FPI, debido a las anormalidades severas de la matriz extracelular y la rotura de la membrana basal.


7

La pérdida de las CEA tipo I podría provocar la reducción de algunas moléculas antifibróticas

importantes (caveolina-1). Sin embargo, se desconoce si en la patogénesis de la FPI está involucrada la

disminución de las concentraciones de caveolina-1, específicamente atribuible a la pérdida de los

neumocitos tipo I. Por otra parte, el receptor de los productos finales de la glicación avanzada (RAGE) está

también disminuido en la FPI. Este receptor es un miembro de la superfamilia de los receptores de

inmunoglobulinas de la superficie celular que son altamente expresados por las CEA tipo I normales. La

pérdida de este receptor podría resultar en una disminución de la unión de las CEA tipo I a la membrana

basal, lo que impide la correcta reepitelización de los alvéolos durante la fibrogénesis.

1.4.5.- Metaloproteinasas de la matriz (MMPs) y la anormal remodelación

pulmonar.

Los fibroblastos están repartidos por toda la estructura pulmonar y juegan un papel clave en la

regulación de la homeostasis. Los fibroblastos modulan la renovación de la matriz extracelular a través de

la expresión de diversas metaloproteinasas de la matriz extracelular (MMPs) (que degradan la matriz

extracelular) y de inhibidores tisulares de las MMPs.

La fibrosis es inducida por la activación, proliferación y migración de estas células en el sitio de la

lesión y el depósito de proteínas en la matriz.

1.4.6.- Angiogénesis y la remodelación microvascular.

Se desconoce el papel de la angiogénesis en el pulmón fibrótico experimental. Al igual que ocurre

con los procesos profibróticos, la neovascularización es esencial en la regeneración de un tejido después

de una lesión y depende del equilibrio entre diversos factores que promueven o inhiben la angiogénesis.

En los pulmones se produce una remodelación vascular anormal, pero las áreas fibróticas apena

presentan neovascularización, mientras que el tejido de las zonas no fibróticas la neovascularización es

abundante. Por tanto, parece que en la FPI el proceso fibrótico no necesita de neovascularización.

1.4.7.- Relación entre FPI y envejecimiento.

En la FPI, al igual que en el envejecimiento, se produce un acortamiento acelerado de los telómeros

después de cada división celular. Ambos procesos se relaciona también con un aumento del estrés oxidativo

o la disminución de los mecanismos antioxidantes, con un desequilibrio redox, que puede provocar daños

directos en el ADN y alterar el funcionamiento de enzimas.


8

1.4.8.- Los pericitos y las células mesoteliales pleurales (28).

Los pericitos pulmonares son células derivadas del mesénquima que se localizan dentro de la

membrana basal de los vasos sanguíneos (29, 30) . Pueden dar lugar a miofibroblastos y están implicados

en la cicatrización de las heridas y la producción de colágeno. Sin embargo, se necesita estudiar mejor la

contribución específica de los pericitos en la FPI.

Por último, comentar que la pleura está constituida en gran parte por mesotelio, que se origina en

el mesodermo embrionario. Las células mesoteliales pleurales han sido implicadas en el proceso de

migración y transformación en miofibroblastos, tanto in vitro como in vivo, a través de un proceso

dependiente de TGF-β1 (30). Las células mesoteliales pleurales están presentes en los pulmones con FPI

grave (31).

1.5. - Prevención.

Las únicas medidas con las que se puede prevenir la FPI consisten en prevenir las posibles

factores de riesgo, enfermedades subyacentes e inhalaciones de gases irritantes, humos y sustancias

tóxicas en general.

Por otra parte, pueden resultar de gran importancia la prevención y tratamiento precoz de las

potenciales comorbilidades y complicaciones puede resultar de gran importancia para enlentecer, en lo

posible, la evolución de la enfermedad y el deterioro de la calidad de vida.

1.6.- Diagnóstico.

El primer consenso sobre criterios diagnósticos y recomendaciones para evaluar, la evolución de

la FPI se estableció en el año 2000 por la American Thoracic Society (ATS) y European Respiratory Society

(ERS) (32). Los nuevos hallazgos y ensayos clínicos llevaron a un nuevo consenso 2011 con la participación

de la ATS, la ERS, la Sociedad Respiratoria Japonesa (JRS) y la Asociación Latinoamericana del Tórax

(ALAT) (1). Estas recomendaciones han sido más recientemente adaptadas y publicadas en forma de

“normativa” por la Sociedad Española de Patología del Aparato Respiratorio (SEPAR), que se han resumido

a continuación (9).

El diagnóstico definitivo de FPI requiere (figura 1):

1.- La exclusión de otras EPID de causa conocida (enfermedades del tejido conectivo, toxicidad por

fármacos, exposición ambiental u ocupacional)

2.- La presencia de un patrón histológico de NIU en la tomografía axial computarizada de alta resolución

(TCAR) en individuos no sometidos a una biopsia pulmonar (BP).

3.- La presencia de un patrón histológico de NIU, o una combinación específica de patrones de TCAR y de

histología en los individuos sometidos a BP.


9

El consenso de 2011 recomienda que el diagnóstico de la FPI se debe basar en el consenso entre

el clínico, el radiológico y el patólogo.

SI

NO NIU

NIU POSIBLE NIU NO CONCORDANTE CON NIU

NO NIU

NIU

PROBABLE NIU / POSIBLE NIU NO - CLASIFICABLE FIBROSIS

Figura 1. Algoritmo diagnóstico de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI) (1).

1.6.1.- Manifestaciones clínicas y analíticas.

El cuadro clínico de la FPI empieza de manera insidiosa y se caracteriza por disnea de esfuerzo

progresiva de meses a años de evolución, tos seca persistente estertores crepitantes en el 90% de los

casos y acropaquias en el 20%-50%. En la fase avanzada es frecuente la aparición de cor pulmonale, con

signos de hipertensión pulmonar (HP) (acentuación del segundo tono pulmonar o desviación del impulso

apical a la derecha) y finalmente signos de insuficiencia cardiaca derecha. También se va instaurando

progresivamente un cuadro de hipoxemia y pruebas de función pulmonar restrictivas con una disminución

de la capacidad de difusión del monóxido de carbono (DLCO) (20).

En los análisis sanguíneos no existen determinaciones específicas para la FPI, aunque la velocidad

de sedimentación, la proteína C reactiva y las inmunoglobulinas G pueden estar alterados y los anticuerpos

antinucleares y el factor reumatoide son positivos en el 10%-20% de los casos. Se recomienda realizar

estudio de posibles conectivopatías y de Ig G frente a anticuerpos relacionados con neumonitis por

hipersensibilidad (ver tabla 1).

Sospecha de FPI

¿Causa identificable de enfermedad pulmonar intersticial difusa (EPID)?

TCAR

Biopsia pulmonar quirúrgica

Discusión multidisciplinar

FPI / NO FPI FPI

NO FPI


10

Tabla 1. Pruebas de laboratorio ante sospecha de FPI.

Hemograma

Velocidad de Sedimentación

Perfil hepático

CPK

Enzima Convertidora de la Angiotensina (ECA)

Factor reumatoide

Análisis de orina

Prueba de hipersensibilidad

Anticuerpos Antinucleares (ANA)

1.6.2.- Diagnóstico radiológico:

1.6.2.1.- Radiografía de tórax.

Es la exploración básica e inicial en la mayoría de los pacientes con síntomas respiratorios. Para

una correcta valoración debería constar siempre de las proyecciones posteroanterior y lateral. Ambas se

realizan con el paciente de pie, en inspiración máxima y con técnica de alto kilovoltaje. Proporciona

información sobre el parénquima pulmonar, pleura, pared torácica, silueta cardíaca y mediastino. La

radiografía lateral es imprescindible para la localización de lesiones, confirmar imágenes y valorar zonas

ciegas o de difícil valoración en la proyección posteroanterior. La utilización de una técnica con alto

kilovoltaje permite una mejor visualización del parénquima pulmonar y del mediastino, teniendo como

inconveniente la disminución en la capacidad de detectar calcio en las lesiones y una pérdida en el detalle

óseo.

En la radiografía de tórax muestra opacidades reticulares asociadas o no a imágenes en panal, de

distribución basal y bilateral (figura 2 y figura 3) ante la presencia de imágenes alveolares debe plantearse

la posibilidad de un diagnóstico definitivo.


11

1.6.2.2.- La Tomografía (Axial) Computarizada de Alta Resolución (TCAR).

Generalmente la TCAR se realiza tras la práctica de una radiografía de tórax, ya sea para estudiar

una alteración observada en la misma o por una sospecha clínica. La TCAR, se basa en la realización de

cortes de 1 a 2 mm, sin medio de contraste, tiene una sensibilidad del 90%, y puede ser útil para:

1. obtener el diagnóstico específico de FPI, cuantificar su extensión y valorar su evolución durante

el seguimiento.

2. Identificar un sitio apropiado para la biopsia pulmonar en caso de ser necesaria.

3. valorar la presencia de comorbilidades y/o complicaciones asociadas (enfisema, HP, cáncer de

pulmón)

4. descartar la presencia de otras EPID.

En el consenso de 2011 (1, 9), se estableció que en la TCAR, el diagnóstico de certeza de la NIU

se basa en la identificación de los 4 “hallazgos típicos” (tabla 2) (figura 4)

1. la afectación pulmonar debe tener un predominio basal y una localización subpleural

2. presencia de reticulación evidente

3. existencia de panalización con/sin bronquiectasias/ bronquiectasias de tracción

4. demostrar la ausencia de hallazgos considerados excluyentes de un patrón de NIU, como

micronódulos broncovasculares. La presencia del patrón de vidrio deslumbrado debe ser mínima

o inexistente.

La panalización (formada por espacios quísticos agrupados con paredes finas, habitualmente de localización subpleural y de 3-10 mm de diámetro, aunque pueden ser mayores) es un hallazgo imprescindible para el diagnóstico de certeza de NIU.

Figura 2 y Figura 3.- Hallazgos en imágenes con opacidades panal de abeja con una disminución periférica y basal


12

Cuando no hay panalización visible, el diagnóstico mediante la TCAR será el de “posible patrón de NIU”; en estos casos, el diagnóstico definitivo de NIU deberá realizarse mediante biopsia. La biopsia pulmonar podrá evitarse únicamente cuando la TCAR muestre un patrón de certeza típico de NIU.

Puede haber anomalías en la TCAR antes de que las pruebas de la función pulmonar se deterioren pero, en cambio, puede ser normal ante una EPID demostrada por biopsia. Una TCAR con resultados normales no debería excluir una sospecha de EPID.

FIGURA 4.- La tomografía computarizada de alta resolución (TCAR) puede mostrar la estructura en panal de abeja

aparece como sombras anulares estrechamente aproximadas, el hallazgo implica enfermedad pulmonar en estado

avanzado. Izquierda: imagen de un corte axial. Derecha: imagen de un corte coronal.

Tabla 2. Criterios de patrón de neumonía intersticial usual (NIU) en la TCAR (1).

Patrón de NIU (las 4 características) Posible patrón de NIU (las 3

características) No concordante con patrón de NIU

(cualquiera de las 7 características)

1.- Predominio basal, subpleural 1.- Predominio basal, subpleural 1.- Predominio en campos superior o

medio

2.- Anomalía reticular 2.- Anomalía reticular 2.- Predominio peribroncovascular

3.- Panalización con o sin bronquiectasias

por tracción 3.- Ausencia de características

incompatibles con el patrón NIU 3.- Alteración extensa en vidrio esmerilado

(extensión > alteración reticular)

4.- Ausencia de características

incompatibles con el patrón NIU 4.- Abundantes micronódulos (bilateral,

predominantemente en lóbulos superiores)

5.- Quistes discretos (múltiples, bilaterales,

además de las áreas de panalización)

6.- Discreta atenuación en

mosaico/atrapamiento aéreo (bilateral, en 3

o más lóbulos)

7.- Consolidación en

segmento(s)/lóbulos(s)


13

1.6.3.- Pruebas de función pulmonar.

Las pruebas de función pulmonar ayudan a demostrar las anormalidades fisiológicas que

acompañan a las EPID, a precisar su gravedad y a valorar la evolución y la respuesta al tratamiento.

Las alteraciones fisiológicas en la EPID son la reducción de los volúmenes pulmonares (capacidad

vital forzada (CVF), capacidad pulmonar total, reducción de DLco y relación normal o alterada entre VEF1 y

CVF). La elasticidad pulmonar también se reduce (disminuye el volumen pulmonar para cualquier presión

transpulmonar) y la presión transpulmonar máxima aumenta (se debe generar una presión negativa muy

alta para abrir los alvéolos fibrosados).

Las excepciones de este cuadro clásico son histiocitosis X, linfangioleiomiomatosis,

neurofibromatosis, sarcoidosis y esclerosis tuberosa; en ellas, las alteraciones provocan aumento de la

capacidad pulmonar total y limitación del flujo de aire. En la neumonía organizada con bronquiolitis

obliterante (BOOP) se observa un patrón mixto tanto restrictivo como obstructivo.

Los gases arteriales traducen hipoxemia leve. Rara vez existe retención de dióxido de carbono,

incluso en las últimas fases de la enfermedad. La mayoría de los pacientes con EPID muestran un aumento

de la ventilación por minuto durante el reposo y el esfuerzo, lo que reduce la Pco2 y conlleva alcalosis

respiratoria compensada. Este incremento se logra al aumentar la frecuencia respiratoria en lugar del

volumen de ventilación pulmonar. La hiperventilación no se debe a anormalidades del equilibrio ácido-

básico, ni a hipoxemia, sino a un mayor estímulo del centro respiratorio por las señales neurales originadas

en los mecanorreceptores alterados del parénquima pulmonar desorganizado. En los pacientes con EPID,

la prueba de esfuerzo se acorta, y con el ejercicio la Po2 desciende y la Pco2 permanece constante.

La hipoxemia es consecuencia de una relación anormal entre la ventilación y la perfusión y

anormalidades en la difusión. En un principio se creía que estas últimas eran el resultado del engrosamiento

de las paredes alveolares, pero ahora se sabe que se deben a la pérdida del área capilar transversal, y a

que el paso de eritrocitos a través de los capilares pulmonares funcionales es tan rápido que permite una

saturación completa de la hemoglobina. El pH arterial suele ser normal, pero puede descender con el

ejercicio por efecto del metabolismo anaeróbico en los músculos carentes de oxígeno.

1.6.4.- Lavado broncoalveolar (LBA).

En la actualidad, y tras el último consenso 2011 se recomienda que el LBA “no se debe realizar”

en la evaluación diagnóstica de la FPI en la mayoría de los pacientes. (1). Sin embargo, puede ser apropiado

en una minoría de pacientes para diagnóstico diferencial de trastornos alternativos como neumonitis por

hipersensibilidad, neumonía intersticial no específica, sarcoidosis, infecciones o tumores (1, 33, 34).


14

1.6.5- Biopsia pulmonar.

Siguiendo el consenso 2011 la biopsia pulmonar quirúrgica (abierta) está indicada cuando el

diagnóstico es dudoso o incierto después de revisar las pruebas diagnósticas, en especial si la TCAR no

muestra un patrón de certeza típico de NIU (1, 9). Sin embargo un gran porcentaje de los pacientes con

sospecha de FPI no pueden someterse a un procedimiento de BP quirúrgica, debido a contraindicaciones

(p.ej. condiciones comórbidas, gravedad de la enfermedad, edad avanzada, etc.) o porque el paciente

rechaza el procedimiento (35).

La toracoscopia y la minitoracotomía son preferibles a la cirugía convencional mediante

toracotomía. La toracoscopia, en especial, supone reducción del tiempo operatorio, de la estancia

hospitalaria y de las posibles complicaciones postquirúrgicas Deben tomarse muestras de al menos dos

lóbulos diferentes, incluyendo áreas con aspecto macroscópico patológico y otras con aspecto

macroscópico normal.

La BP transparietal con aguja no debe utilizarse, debido al pequeño tamaño de las muestras

obtenidas y a la gran incidencia de neumotórax secundario.

La BP transbronquial tampoco está indicada habitualmente. Sin embargo, en casos seleccionados

puede ser útil para confirmar/ descartar otros procesos específicos (sarcoidosis, tumores…).

1.6.6.- Estudio histopatológico

El patrón histológico de NIU en la FPI se asocia con un pronóstico significativamente peor y

mortalidad más precoz, que otros patrones histológicos de neumonía intersticial crónica (8, 36). La tasa de

supervivencia media es de 2-5 años, peor que la de varios tipos de cáncer (8).

El patrón histológico típico de NIU (figura 5) debe cumplir los siguientes 4 criterios (1, 9):

1. Evidencia de marcada fibrosis/ de formación de la arquitectura pulmonar, asociada o no a

panalización con distribución predominante subpleural y paraseptal.

2. Afectación parcheada del parénquima pulmonar por fibrosis.

3. Presencia de focos fibroblásticos.

4. Ausencia de hallazgos histopatológicos incompatibles con diagnóstico de NIU, y que pudieran

sugerir un diagnóstico alternativo.

Entre las características “no compatibles” con el patrón de NIU estarían la presencia de alguno

de los siguientes 6 criterios (1) (9):

1. membranas hialinas,


15

2. focos con neumonía organizativa,

3. granulomas,

4. marcado infiltrado inflamatorio intersticial alejado de las zonas de panalización,

5. cambios predominante centrados en la vía aérea

6. otros hallazgos sugestivos de un diagnóstico alternativo.

Figura 5.- Patrón de neumonía intersticial usual en la biopsia pulmonar: fibrosis periférica (A) con focos de actividad fibroblástica

en áreas de interfase (B) y focos de micropanal (C) (Tomado de Xaubet 2013, Referencia (9)

Un patrón histológico indistinguible de la NIU se puede observar en enfermedades sistémicas

(artritis reumatoide y esclerodermia), neumonitis por hipersensibilidad crónica, neumonitis por fármacos,

asbestosis y fibrosis familiares. Por ello, siempre hay que destacar en el estudio histológico de la biopsia la

presencia de granulomas, cuerpos de asbesto, infecciones específicas u otros agentes exógenos. Por esto

motivo, un patrón de NIU no debe ser interpretado directamente como la FPI hasta haber descartado

previamente todas las enfermedades. Recordemos que en el consenso de 2011 se recomienda que el

diagnóstico de FPI se base en el consenso entre el clínico, el radiólogo, y el patólogo (1, 9).

1.7.- Tratamiento.

El tratamiento de la FPI viene determinado por el estadio de la enfermedad, los factores

pronósticos y las comorbilidades. Una adecuada terapia deberá tener en cuenta: el empleo del tratamiento

antifibrótico más adecuado, evitar las causas agravantes de la enfermedad y de las comorbilidades, valorar

la posibilidad de trasplante pulmonar en los pacientes que cumplan criterios y tratar los síntomas

(especialmente la tos y la disnea) (9) (37).


16

1.7.1.- Terapia Farmacológica.

El tratamiento farmacológico de la FPI busca evitar a al menos reducir la progresión de la

enfermedad a través del uso de antifibróticos, identificar y el tratar las complicaciones específicas de la

enfermedad y al alivio de los síntomas.

En la (tabla 3) se especifican las recomendaciones del tratamiento farmacológico específico de la fibrosis pulmonar idiopática, aunque como podemos ver, el arsenal terapéutico es muy limitado.

Tabla 3. Recomendaciones basadas en la evidencia para tratamiento de la FPI. (Modificada/actualizada de la Referencia. (9).

Agente

Mecanismo de acción

Recomendaciones

Recomendado en pacientes seleccionados Pirfenidona

Nintedanib

NAC c en monoterapia

Antifibrótico + antiinflamatorio + antioxidante + anti TGF β 1

Antifibrótico + antiangiogénico

Antioxidante

Sí, recomendación débil a Sí, recomendación débil a, b No, recomendación débil

No recomendados Esteroides + Azatioprina + NAC

Anticoagulación Bosentán

Esteroides en monoterapia Esteroides + terapia inmunomoduladora Colchicina

Ciclosporina A Etanercept Interferón gamma

Inmunosupresor + antioxidante + antiinflamatorio Anticoagulante Antagonismo dual del receptor de la endotelina Inmunosupresor Inmunosupresor Inhibidor proliferación/síntesis de colágeno Inmunosupresor Anti TNF alfa Antifibrótico e inmunomodulador

No utilizar

No utilizar No utilizar

No utilizar No utilizar No utilizar

No utilizar No utilizar No utilizar

ª En pacientes con FPI leve/moderada. b Aprobado en España el 11-2014. c N-acetil-cisteina.


17

1.7.1.1.- Pirfenidona.

La pirfenidona (Esbriet®) fue el primer fármaco en demostrar eficacia contrastada en el tratamiento

de la FPI en ensayos clínicos controlados.

El papel de la pirfenidona en el tratamiento de la FPI se evaluó en 3 ensayos controlados

multicéntricos fase 3, aleatorizados, doble ciego, controlados con placebo en pacientes con FPI en Europa,

EEUU, Australia (estudios CAPACITY con 779 pacientes) y uno de dichos ensayos se llevó cabo en Japón

con 275 pacientes, donde el tratamiento con pirfenidona redujo la declinación de la CVF a la semana 52 y

mejoró la supervivencia libre de la enfermedad.

Sin embargo, y pese a ser el primer fármaco activo aprobado para el tratamiento de la FPI, no está

claro que la pirfenidona disminuya el grado de disnea o aumente la supervivencia global o la ligada a FPI,

habiéndose descrito los beneficios significativos en un metaanálisis de 3 ensayos clínicos pero no en cada

uno de los ensayos por separado (38).

La dosis recomendada de pirfenidona es de 2.403 mg/24 h tras un aumento gradual de la dosis.

Así, durante la primera semana de tratamiento se debe tomar una cápsula de 267 mg/8 h, en la segunda

semana 2 cápsulas/8 h y, a partir de la tercera semana 3 cápsulas/8h, durante 12 meses como mínimo. Si

el paciente responde adecuadamente debe continuarse con el tratamiento. Esto se traduce en una

reducción de la disminución de la CVF del 30%. Además, el intervalo libre de progresión y la distancia

recorrida en la prueba de marcha de 6 minutos (PM6M) fue significativamente mejor en pacientes con una

CVF > 50% y DLCO > 35% (39-41).

Las principales reacciones adversas asociadas con este fármaco son: náuseas (32%), erupción

cutánea (26%), diarrea (19%), cansancio (19%), dispepsia (16%), anorexia (11%), cefalea (10%) y,

reacciones de fotosensibilidad (9%). Estos efectos son dependientes de la dosis, y generalmente reducibles

al disminuir la dosis administrada (42) (Ficha técnica de la Agencia Europea del Medicamento (EMEA)

http://www.ema.europea.eu/docs/es_ES/document_library/EPAR_-

Product_Information/human/002154/WC500103049.pdf.

1.7.1.2.- Nintedanib.

Bajo el nombre comercial de Ofev®, nintedanib fue designado medicamento huérfano para el tratamiento de la FPI por la EMEA el 26 de abril del 2013. A finales del 2014, la Agencia Española del Medicamento y Productos Sanitarios (AEMPS) aprobó en España la indicación de este anticuerpo monoclonal para el tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI) en adultos (http:// www.aemps.gob.es/informa/boletinMensual/2014/noviembre/boletin-noviembre.htm#cambiosEspecial).

También conocido como (BIBF 1120), nintedanib es un inhibidor de la tirosina quinasa que bloquea la actividad quinasa de los receptores del (43) (44):

1. Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR 1-3), que estimula la angiogénesis.

2. Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR alfa y beta)

3. Y del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR 1-3) crucial para la proliferación y migración de los fibroblastos pulmonares.


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El primer ensayo randomizado, placebo, controlado, doble ciego, con nintedanib fue el estudio TOMORROW, un fase 2 con 432 pacientes. Aunque en él no se encontraron diferencias significativas en la variable principal, CVF, sí se encontraron diferencias significativas favorables en alguna de las variables secundarias: exacerbaciones agudas y disminución en la calidad de vida (44).

Los dos estudios fundamentales fueron 2 ensayos clínicos fase III doble ciego y aleatorizados (INPULSIS 1 y 2) que examinaron la eficacia y seguridad de nintedanib versus placebo en 1066 pacientes con diagnóstico de FPI, que emplearon dos dosis diarias de 150 mg de nintedanib frente a placebo, durante 52 semanas. El criterio primario de valoración fue la tasa anual de deterioro de la CVF en ml a las 52 semanas. El uso de nintedanib se asoció a un retraso significativo de la progresión de la FPI reflejado en una reducción del 50% en la tasa anual de declinación de la CVF en comparación con placebo en ambos ensayos, tanto el INPULSIS-1 (-114,7 ml nintedanib vs. -207,3 ml placebo, p < 0,001) como el INPULSIS-2 (-113,6 mL nintedanib vs. -207,3 mL placebo, p< 0,001).. El INPULSIS-2 mostró, además, una disminución significativa del tiempo transcurrido hasta la primera exacerbación aguda (p = 0,005) y un menor deterioro de la calidad de vida media con el St. George's Respiratory Questionnaire (2,80 vs 5,48 p = 0.02) (45).

Las reacciones adversas más comunes observadas durante los ensayos clínicos fueron los trastornos gastrointestinales, siendo el más frecuente la diarrea (3 veces más frecuente en los grupos de nintedanib que en los placebo), seguida de vómitos, náuseas, y aumento de las transaminasas.

1.7.1.3.- N-Acetilcisteína.

La N-Acetilcisteína (NAC) aumenta la síntesis de glutatión, un potente antioxidante, y disminuye la respuesta fibrótica en modelos animales de fibrosis pulmonar.

En el ensayo fase III IFIGENIA, se encontró que frente a un tratamiento con azatioprina + prednisona + placebo, la sustitución del placebo por NAC preservaba mejor la función pulmonar (46). Esto llevó a que la combinación de estos tres fármacos (prednisona, azatioprina y NAC) se convirtiera en el tratamiento de elección y recomendado como opción terapéutica en las guías de consenso hasta hace pocos años.

Más tarde, el estudio randomizado PANTHER comparó la combinación de 3 fármacos (prednisona, azatioprina y NAC) frente a NAC y frente a placebo, en pacientes con FP y compromiso funcional leve a moderado. Este estudio demostró que los pacientes con terapia triple presentaban mayor mortalidad e ingresos hospitalarios que los pacientes del grupo placebo o del grupo NAC. Por tanto, en la actualidad se recomienda “no utilizar” esta triple terapia (47). Posteriormente, se continuó sólo con los grupos de NAC y placebo. Pero frente al grupo placebo, la NAC no mostró beneficio en CVF, morbilidad ni en la frecuencia de exacerbaciones agudas (48). Por tanto, en la actualidad, no existe evidencia para su uso específico como tratamiento de la FPI.

1.7.1.4.- Otros fármacos antifibróticos.

Durante la última década se han realizado varios ensayos clínicos aleatorizados, fase II y III, con fármacos antifibróticos considerados experimentales, pero que no han demostrado ninguna eficacia para el tratamiento de la FPI (49). Entre ellos se incluyen:

1. Imatinib (Gleevec®), es un medicamento utilizado originalmente para el tratamiento de la leucemia mieloide crónica (LMC). Actúa como un inhibidor selectivo de la tirosina quinasa con actividad contra los receptores del factor de crecimiento derivado de


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plaquetas (PDGFR), c-kit, y c-Abl tirosina quinasa. Imatinib ha demostrado proteger contra la fibrosis en modelos de roedores de la lesión pulmonar (50-52). Sin embargo, un ensayo fase II controlado con placebo que incluyó a pacientes con FPI de leve a moderada, imatinib no mostró ningún efecto sobre la variable principal de evaluación, la supervivencia libre de progresión (definida por una disminución del 10% de la CVF) o la supervivencia durante un período de 96 semanas (50).

2. Anti-IL 13: La interleucina IL-13 es un potente estimulador de la proliferación de fibroblastos y de la síntesis de la matriz extracelular (53, 54), que induce citoquinas profibróticas como el TGF-β, PDGF, el factor de crecimiento similar a la insulina que se llaman FCI-1, la metaloproteinasa de la matriz 9 (MMP9), ligandos de quimiocinas CC (CCL18), el factor de crecimiento de tejido conectivo (FGTC), y la producción de fibronectina. En los pacientes con FPI (55), los niveles de IL-13 están aumentados en LBA. La sobreexpresión de IL-13 en ratones induce la FPI (56), mientras que la inmunoneutralización de la IL-13 en la lesión pulmonar inducida por bleomicina atenúa la fibrosis pulmonar. El anticuerpo monoclonal humano anti IL-13 (QAX 576) (57) se está evaluando actualmente en un ensayo clínico fase II aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo y multicéntrico (NCT01266135).

3. Anticuerpo anti- LOXL2 o GS-6624 (AB0024): en el modelo de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratón , la regulación positiva LOXL2 es atenuada por un anticuerpo monoclonal anti-LOX2 (AB0024), se observa reducción del colágeno fibrilar, fibroblastos activados, citoquinas inflamatorias, y el TGF-β1 (58). Actualmente, están comenzando los primeros ensayos clínicos.

4. Otros en estudio: Interferón gamma 1-beta, antagonistas del factor de necrosis tumoral-α (etanercept), anticoagulantes (warfarina), antagonistas de la endotelina (bosentán, macitentán, ambrisentán) y sildenafilo se están evaluando en ensayos clínicos fase I o II, así como otras moléculas (www.clinical.gov).

Posiblemente, una adecuada terapéutica farmacológica contra la FPI debería incluir la asociación de fármacos que actúen sobre diferentes vías patogénicas de la enfermedad de forma sinérgica: contra la fibrosis (los aprobados hasta ahora), modulando el estrés oxidativo (¿NAC?) +/- modulando los procesos inflamatorios.

1.7.2.- Rehabilitación respiratoria.

Una reciente actualización de The Cochrane Collaboration en enfermedad pulmonar intersticial y en FPI, muestra que la rehabilitación pulmonar mejora la capacidad funcional ante el ejercicio, la disnea y la calidad de vida, si bien no se ha evidenciado impacto sobre la supervivencia a largo plazo (59).

1.7.3.- Trasplante pulmonar.

Actualmente, el trasplante de pulmón (TP) es el único tratamiento del que se dispone para incrementar la supervivencia en los pacientes afectados con FPI de una manera considerable. El momento más adecuado para realizar el TP está en función de los factores pronósticos del paciente.

http://www.clinical.gov/


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Lo más idóneo sería realizar el TP en el momento en el que está justificado por el mal pronóstico

de la enfermedad a corto o medio plazo, pero no tan tarde para que el deterioro físico del paciente haga

previsible que no soportará la intervención. Los beneficios del trasplante deben sopesarse con los

inconvenientes que supone el mismo. Estos inconvenientes incluyen: una limitada disponibilidad de órganos

y los riesgos quirúrgico, de infección, de rechazo del órgano trasplantado y de la terapia inmunosupresora.

Según las directrices de la Sociedad Internacional de Trasplante de Corazón y Pulmón (SITCP),

se recomienda que los pacientes con FPI deben ser indicados para el trasplante, si su DLco es < 40%, si

durante los 6 meses anteriores al trasplante han sufrido una disminución de la CVF > 10%, o si la oximetría

de pulso o pulsioximetría muestra una saturación < 88% durante la prueba de caminata en 6 minutos.

Los datos disponibles en el Reino Unido, sugieren que la FPI representa el 20% de todos los

trasplantes de pulmón. La tasa de supervivencia a los 5 años tras el trasplante de pulmón se sitúa en un

45% - 50% (60, 61).

1.8.- Pronóstico.

La FPI es una enfermedad de curso clínico variable, por lo que es importante identificar factores

que puedan ayudar a definir el pronóstico de los pacientes (9).

Entre los factores basales adversos (en el momento del diagnóstico) están: 1) Edad avanzada (>

70 años) y sexo masculino. 2) Grado de disnea basal, medido con la escala de MRC. (62). 3) DLCO < 40%

(porcentaje del valor predicho). 4) Saturación de oxígeno percutánea SpO2 ≤ 88% en la prueba de

marcha de 6 minutos (PM6M) (63). 5) Extensión del patrón en “panal de abeja” en la TCAR. 6)

Hipertensión pulmonar arterial 7) Biomarcadores, tanto a nivel histológico si hay biopsia (profusión de focos

de fibroblastos) como niveles séricos del péptido natriurético cerebral o de proteínas relacionadas con el

daño de las CEA, la inflamación o el estrés oxidativo.

Entre los factores adversos durante la evolución de la enfermedad cabe destacar: 1) El

aumento del grado de disnea > 5% (valor absoluto). 2) Descenso en 6-12 meses de la CVF ≥ 10

% o de la DLCO ≥ 15% (64), 3) Disminución en 6 meses de la distancia recorrida durante la

PM6M > 50 m (63). 4) Disminución en 6 meses de la SpO2 > 15%. 5) Extensión y progresión de la

fibrosis en la TCAR.

En pacientes con SpO2 ≤ 88%, la disminución > 15 % de la DLCO en 6 meses es el mejor

predictor de mortalidad, mientras que en aquellos con SpO2 > 88% el parámetro más significativo es

la disminución > 10% de la CVF. Se están desarrollando escalas multidimensionales para intentar predecir

el riesgo individual de mortalidad en pacientes con FPI, pero aún no existe suficiente evidencia científica

para su uso en la práctica clínica (65, 66).

Entre las comorbilidades y complicaciones que pueden empeorar el curso clínico y el pronóstico

de la FPI están: las exacerbaciones agudas, HTP, enfisema pulmonar, reflujo gastroesofágico, síndrome de

apnea/ hipopnea del sueño, carcinoma de pulmón (prevalencia 5-10%), neumotórax (incidencia 11%),

enfermedad coronaria o tromboembólica venosa.


21

2.- Bleomicina y Modelo Experimental de Fibrosis Pulmonar.

Los estudios realizados en modelos animales juegan un papel importante en la investigación biomédica. Entre los modelos animales para inducir FP están el empleo de radiaciones ionizantes a nivel torácico en un animal susceptible y la administración de un agente fibrogénico bien vía sistémica (paraquat o la propia bleomicina (BLM)) o bien mediante instilación oro-traqueal (IOT) como BLM, amiodarona (67), sílice, cobalto o asbesto) (68-70). Pero entre todos ellos, el modelo más empleado para la inducción de FP experimental es la IOT de BLM (69).

2.1.- Bleomicina.

Las bleomicina (BLM) es un antibiótico antineoplásico del tipo glucopéptido aislado de una cepa

de Streptomices verticillus (71, 72). Tiene un efecto mínimo como mielosupresor e inmunosupresor;

destacando su toxicidad dermatológica, que puede llegar a ser grave. Sin embargo, su eficacia terapéutica

se ve limitada por su toxicidad pulmonar, que es “limitante en dosis” por su capacidad de inducir neumonitis

y fibrosis pulmonar (FP) en forma dosis-dependiente (73) (74) (69).

2.1.1.- Estructura de la bleomicina.

Las bleomicinas comparten la misma estructura central (figura 6), pero pueden diferir según el tipo

de carbohidratos y cadenas cargadas positivamente que contienen (75) (74).

Figura 6. Estructura central de la bleomicina (BLM).

La BLM presenta diferentes dominios funcionales:

1.- Dominio de unión a metales: este dominio contiene átomos de nitrógeno que reaccionan con el

metal, sobre todo con metales de transición como el cobre y el hierro. En presencia de oxígeno, esta unión

puede dar lugar a la rotura de cadenas de ADN (tanto simples como dobles cadenas) así como la formación


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de especies reactivas del oxígeno (ROS) o radicales libres (RL) que pueden potenciar o perpetuar el daño

(74, 76-81).

2.- Dominio de unión al DNA: dependiente de la pirimidina y el grupo tiazol de la BLM. Las cargas

positivas del grupo tiazol favorecen la unión electrostática de la BLM con el DNA (74, 79, 80, 82).

3.- Carbohidratos: la bleomicina puede estar glicosilada con α-D-manosa y L-gulosa. No se conoce

con precisión el papel de los carbohidratos, pero existen evidencias de que pueden modular la afinidad de

la BLM por el DNA (74, 83).

2.1.2.- Mecanismos de acción de la bleomicina.

Para activarse, la BLM requiere de la unión con un metal de transición reducido [Fe (II) o Cu (I)],

la presencia de una molécula de oxígeno y un agente reductante. La BLM activa ejerce su efecto citotóxico

por daño directo sobre el DNA y RNA, e indirectamente a través de la generación de RL (75, 79, 80, 82,

84).

Daño al DNA: estudios in vitro han mostrado que la BLM puede romper directamente tanto las

cadenas simples como las cadenas dobles de DNA, e inhibe la reparación de DNA mediante inhibición de

la DNA ligasa. El grado de lesión de la BLM sobre el DNA depende de la dosis y del ciclo celular. La BLM

se considera ciclo-celular específico de la fase 2, aunque también es activa (en menor cuantía) en la fase

G1 tardía y en la fase S y M. Así mismo, también depende del estado de activación transcripcional, siendo

más susceptible la eucromatina que la heterocromatina. La bleomicina no interfiere directamente con la

replicación del DNA, ni con la síntesis del RNA y de las proteínas (81, 82).

Daño al RNA: recientemente se ha demostrado in vitro que la BLM puede degradar el RNA

mediante hidrólisis directa o indirecta mediada por la generación de RL (84).

Radicales libres (o especies reactivas de oxígeno): la generación de RL por la BLM (como los

radicales hidroxilo, superóxido y peróxido de hidrógeno) dará lugar a un daño indirecto, mediado por la

acción de estas sustancias altamente reactivas con capacidad para oxidar rápidamente cualquier molécula

a su alcance, incluyendo proteínas, lípidos y el propio DNA y RNA (79).

2.1.3.- Farmacocinética y metabolismo de la bleomicina.

La BLM es un fármaco muy soluble en agua, lo que facilita su administración por múltiples vías, y

permite su utilización vía orotraqueal en el modelo animal que se describe más adelante. Apenas se une a

las proteínas plasmáticas, y tiene una vida media de unas 2 horas tras su administración intravenosa. Se

elimina por vía renal, el 50%-70% en las primeras 24 horas. La BLM tiene una amplia distribución por todos

los tejidos y es ampliamente degradada en todos los tejidos excepto en la piel y el pulmón, que carecen de

la enzima “hidrolasa de bleomicina” necesaria para su degradación. Esta enzima es una proteasa de

cisteína, perteneciente a un grupo de enzimas que incluye la familia de las caspasas, calpaína y papaína.


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Bajos niveles de esta enzima (como ocurre en piel y pulmón) dan lugar a toxicidad, mientras niveles

elevados en células tumorales se asocian a resistencia a BLM (78, 85-87).

2.1.4.- Toxicidad pulmonar por bleomicina.

La neumonitis por BLM puede llegar a ser mortal, y es una toxicidad limitante de dosis. Se

caracteriza por disnea, tos seca, estertores finos y húmedos en las bases, hipoxemia, hipocapnia y

radiología con patrón intersticial.

Entre los factores que aumentan el riesgo de toxicidad pulmonar por BLM están: la edad, la

presencia de enfermedad pulmonar previa, la irradiación pulmonar o torácica previa o concomitante, la

oxigenoterapia a altas concentraciones sobre todo la dosis acumulada de BLM.

El riesgo de FP e insuficiencia respiratoria es de un 1% para pacientes que reciben dosis

acumuladas de < 200 U/m2 y del 10 % para pacientes que reciben dosis > 200 U/m2. En su uso clínico se

recomienda no sobrepasar una dosis total acumulada de > 300-400 U/m2 (según distintos oncólogos).

Como ocurre con la FPI, no hay tratamiento curativo. El manejo es principalmente

sintomático, y sólo en ocasiones se ha descrito mejoría con corticoides, especialmente en casos con

reacciones de hipersensibilidad.

2.2.- Modelos Experimentales de Fibrosis Pulmonar..

La capacidad de la BLM para inducir FP experimental se observó inicialmente en perros, por

Fleischmann, en 1971. Más tarde se utilizaron hámsters y cobayos, y Snyder en 1978 describió su

administración vía intratraqueal. Los efectos de la toxicidad pulmonar por BLM en este modelo son

semejantes a los encontrados en humanos, y se ha mostrado de gran valor para profundizar en los

mecanismos que llevan a FP. Actualmente la IOT de BLM es el modelo más empleado para el estudio in

vivo de la FP.

Como se describe en los mecanismos de acción de la BLM, ésta es capaz de generar daño directo

en el DNA y generar RL en el interior de la célula, que indirectamente causarán daño adicional en el DNA y

en otros componentes celulares (RNA, proteínas, enzimas, mitocondrias…). A través de todos estos

mecanismos, la IOT de BLM generará un daño directo sobre las CEA mediado por el proceso de apoptosis

(muerte celular programada). Este daño, a su vez, inducirá la liberación de citocinas y factores de

crecimiento que a nivel local producirán un reclutamiento de células inflamatorias y fibroblastos (figura 7).


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Figura 7. Esquema del modelo de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina. (Tomado de Referencia (75)).

A los tres días tras la IOT, se produce un aumento de celularidad en los septos alveolares debido

a la infiltración de células inflamatorias, principalmente macrófagos y neutrófilos. Entre el 6º día y un mes

tras la IOT, se produce un progresivo incremento de linfocitos que pueden liberar factores profibróticos, con

posterior inducción de la proliferación de fibroblastos y la síntesis de colágeno, liberando factores de

crecimiento profibrogénicos. A las 2 semanas tras la IOT, aparecen cambios difusos y multifocales como

hiperplasia epitelial y fibrosis intersticial e intraalveolar. Tras la 3ª semana de la IOT aparecen grandes focos

de fibrosis en forma difusa, caracterizados por la presencia de fibroblastos, miofibroblastos y depósito de

colágeno (75).

Los avances en los modelos experimentales han permitido estudiar patrones de susceptibilidad a

la fibrosis pulmonar, tales como alteraciones en la expresión de citoquinas y factores de crecimiento

específicos que pueden estar implicados en este proceso (enzimas, proteínas y otros componentes

intersticiales y del epitelio alveolar). Los animales transgénicos pueden portar un fragmento de ADN

exógeno en su genoma, lo cual permite el estudio del patrón de expresión de ese gen y las consecuencias

biológicas de la sobreexpresión de la proteína exógena codificada por el transgen en tejidos específicos.

Para decidir qué genes estudiar, es útil investigar previamente como influye la inducción del

proceso fibrótico en el cambio de la expresión génica. Este análisis se ha visto facilitado por la aparición de

la técnica de micromatrices (microarrays) (88).

En los últimos años se han cruzado ratones transgénicos para obtener modificaciones genéticas

combinadas que permiten evaluar varios factores implicados en el proceso fibrótico. Este modelo se ajusta

más a la realidad, dado que actualmente se cree que la FPI es una enfermedad poligénica. El inconveniente

básico de trabajar con ratones es que son pocos los laboratorios que trabajan en este campo.


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Probablemente la mayor accesibilidad al uso de estos animales sea una de las mejoras que se producirán

en los próximos años.

Sin embargo, se sabe que la historia natural de la FP en humanos difiere en varios aspectos de la

inducida en animales. Por una parte, no hay ningún modelo que siga una reproducción precisa de la

cronicidad o progresión de la enfermedad, probablemente por el desconocimiento de los factores que

provocan en el pulmón humano que un evento reparativo patológico lleve a la perpetuación de la fibrosis.

Además, en la mayoría de los modelos animales los cambios producidos por una inducción inicial

tienden a revertir, lo que no ocurre en humanos. Por este motivo, para extrapolar a la clínica los resultados

obtenidos en un modelo animal será primordial su correcta y cautelosa interpretación. La tendencia a

experimentar con fenotipos que reproduzcan lo más posible el proceso en humanos, es la base para mejorar

los modelos animales en el estudio de la fibrosis pulmonar en un futuro próximo.

3.- Ozono.

3.1.- Historia.

El Ozono tiene más de 200 años de historia, y la ozonoterapia más de 100

(http://www.aepromo.org/en/historia.php) (89).

El Ozono (O3) se detecta por primera vez en 1.785 por el físico Martinus Van Marum (1.750-1.837)

al percibir un olor peculiar detectado cerca de las máquinas eléctricas, pero no fue hasta 1839 que el químico

alemán Christian Friedrich Schönbein (1.799-1.868), lo produce y le da el nombre de ozono (del griego

“ozein”, oloroso).

En 1.857 Werner Von Siemens, construye el primer tubo de inducción superior, con el cual

Kleinmann realizó los primeros ensayos para destrucción de microorganismos y la primera insuflación del

gas en animales y humanos.

En 1.870, el médico alemán Lender realizó la primera publicación sobre efectos biológicos

prácticos, en relación a la desinfección de aguas.

En 1.873, Fox descubre la capacidad de este agente químico para la eliminación de

microorganismos. Existen evidencias como desinfectante a partir del 1.881, de acuerdo a lo mencionado

por el Dr. Kellogg en su libro sobre difteria. El descubrimiento de las propiedades antimicrobianas del

ozono revolucionó la medicina de la época, recordemos que la penicilina no se descubriría hasta 70 años

más tarde.

Nikola Tesla (1.856-1.943), patentó el primer generador de ozono (1.896), y en 1.900 funda la “The

Tesla Ozone Company”, empresa fabricante de generadores de uso médico.

En 1.911, el Dr. Noble Eberhart, jefe del departamento de Fisiología de la Universidad de Loyola Chicago, en el “Manual de Funcionamiento de alta frecuencia”, indica que utilizaba el ozono para tratar la

http://www.aepromo.org/en/historia.php


26

tuberculosis, anemia, clorosis, zumbidos, tos ferina, asma, bronquitis, fiebre del heno, insomnio, pulmonía, diabetes, gota y sífilis.

En 1943, el Dr. Blass funda la primera asociación alemana de ozonoterapia.

En 1.935 el austriaco-alemán Payr presenta en el Congreso de la Sociedad Alemana de Cirugía sus resultados sobre la capacidad cicatrizante del ozono, y en 1.936 el francés Aubourg publica un artículo proponiendo la insuflación rectal de O3 en colitis crónica y fístulas.

Sin embargo, la ausencia en esos años de materiales plásticos resistentes al ozono limitó la aplicación y difusión de la ozonoterapia, hasta que aparecen y se incorporan nuevos materiales plásticos durante la segunda mitad del siglo XX.

En 1957, el Dr.Hansler fabrica en Alemania el primer generador de ozono moderno, en cuyo diseño se basan los generadores actuales.

En 1961, el Dr. Hans Wolf introdujo en su práctica médica la autohemoterapia mayor y menor.

3.2.- Definición y propiedades.

El O3 es una forma alotrópica del oxígeno, compuesto por tres átomos de oxígeno. El ozono tiene

un peso molecular de 48 g/mol y es veces más soluble en agua que el O2 (49,0 ml en 100 ml de agua a 0°

C, 0,02 M), obedeciendo a la Ley de Henry, lo que le confiere su capacidad de reaccionar rápidamente con

cualquier compuesto soluble y biomoléculas llevando a la generación de RL.

El O3 es un gas inestable y su vida media depende de la temperatura (40 min a 20° C y de unos

140 minutos a 0° y 3 meses a 50ºC bajo cero, lo que imposibilita su almacenamiento (89) (90-92). Se

conserva en estado líquido a la temperatura de -111,9°C con un peso específico de 1,571 g/ml.

En la naturaleza el O3 es el gas más importante de la estratosfera (más o menos de los 15 a 50

km de la superficie de la terrestre) produciéndose y destruyéndose continuamente en un equilibrio dinámico

que consume la mayor parte de la radiación ultravioleta (UV) de longitud de onda < 290 nm. Aquí están

incluidos los UV de onda corta (UVC: 100-280 nm) y parte de los UV de onda media (UVB: 280-315 nm),

siendo ambos los UV de capacidad más mutagénica e inductora de tumores cutáneos. Así, en la

estratosfera, la radiación solar convierte la molécula de oxígeno atmosférico (O2) en dos átomos de oxígeno

altamente reactivos, proceso causado por la radiación ultravioleta en consonancia con la teoría de

Chapman, cada uno de estos átomos de oxígeno se combina con la molécula de O2 para formar el oxígeno

triatómico (O3) en una reacción endotérmica. Posteriormente, la radiación UV convierte una molécula de

ozono en una de oxígeno diatómico y un átomo de oxígeno diatómico y un átomo de oxígeno.

O2 + UV (<290 nm) → O + O

O2 + O → O3

O3 + UV (<290 nm) → O2 + O


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Las principales repercusiones clínicas del O3 atmosférico dependen de su localización:

● En la estratosfera el O3 tiene efecto beneficioso, y su disminución (agujero de la capa de ozono)

se relaciona con el cambio climático y el aumento de la incidencia de los tumores de piel.

● En la troposfera (0,03 ppm), su aumento juega un papel negativo como contaminante ambiental.

Su capacidad de producir toxicidad pulmonar ha llegado a la generalización del dogma de que el

O3 es siempre tóxico, a cualquier concentración y en cualquier tejido. Esto no sólo “no es cierto”

sino que, en los últimos quince años, varios publicaciones relevantes han descrito que la

producción de O3 por el propio organismo podría jugar un importante papel en la función del sistema

inmune (93, 94).

Por tanto, para el uso de O3 con fines médicos, se debe evitar su toxicidad asegurándose que tanto

el paciente como el personal lo inhalen. La obtención de O3 para uso clínico debe realizarse exclusivamente

a partir de O2 medicinal, ya que el producido a partir del aire genera altos niveles de peroxinitrilos (N2O2).

Se debe emplear un generador de ozono preciso y equipado con un fotómetro bien estandarizado,

que permita; a) determinar la concentración de O3 en tiempo real; b) la obtención de un volumen de gas

preciso; c) la selección y producción de una concentración de ozono definida, que será variable en función

del efecto terapéutico deseado; d) recoger el O3 sobrante que no se utilice para destruirlo (reconvirtiéndolo

en O2 mediante un catalizador). Recientemente se ha publicado en detalle las características ideales que

deben poseer (95).

La concentración de ozono médico producido por el generador será inversamente proporcional al

flujo de O2 por unidad de tiempo. En la mezcla final de O3-O2, la concentración máxima de este último será

del 5%. El proceso de formación de O3 a partir de O2 medicinal en el equipo se consigue mediante un

proceso endotérmico que tiene lugar gracias a los gradientes de voltaje muy elevados que se consiguen

entre los electrodos de un tubo de Siemens (89).

3O2 ↔ 2O3 – 68400 cal

3.3.- Mecanismos de acción de la ozonoterapia.

El O3 no actúa sobre receptores celulares específicos y su principal mecanismo de acción es

indirecto, mediante la producción de un “moderado y controlado” estrés oxidativo.

El O3 tiene mayor capacidad oxidante que el O2, siendo el tercer agente oxidante en orden de

potencia, después del flúor y del persulfato. Esta propiedad, junto con su alta solubilidad, hará que reaccione

en cuestión de segundos con todos los compuestos que estén a su alcance en el plasma y las membranas

celulares, formando ozónidos y RL. Los diferentes sistemas antioxidantes (AO) intentarán eliminar todos

estos compuestos oxidados u ozonizados. El resultado final dependerá de la concentración y cantidad de

O3, del tipo los RL formados y de los sistemas AO presentes, siendo ambos variables en las distintas células,

tejidos y localizaciones del organismo.


28

En condiciones fisiológicas, los RL actúan como reguladores de la transducción de señales,

mediadores de la defensa del huésped y en la respuesta inmune. Un exceso de RL puede ocasionar la

formación de compuestos como el peroxinitrilo (N2O2) y el anión hipoclorito (CIO-), de muy alta reactividad.

Aunque el tiempo de vida media de los RL es muy corto (< 1 segundo), son capaces de dañar distintos

componentes celulares.

A dosis y concentración adecuada, el estrés oxidativo producido por el O3 inducirá una respuesta

de adaptación en el organismo con modulación del sistema inmune y potenciación de los sistemas AO,

mediante mecanismos de acción bien descritos (96, 97). Por otra parte, hay que tener en cuenta que el

efecto del O3 no tiene una relación dosis/respuesta lineal, sino que sigue el concepto de hormesis: debe

alcanzar una dosis suficientemente alta para inducir una respuesta adaptativa, pero no tan alta como para

sobrepasar la capacidad de adaptación y ocasionar un efecto dañino (97).

Entrando un poco más en detalle, el O3 reacciona rápidamente sobre todo con:

● Los AO hidrosolubles (ácido ascórbico y ácido úrico), compuestos de tiol con grupos SH,

tales como la cisteína, glutatión reducido (GSH) o la albúmina. Estos serán los encargados

de eliminar en pocos segundos las RL.

● Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), formando lipoperóxidos (LPO) que tienen una

vida media mucho mayor que los RL.

La peroxidación lipídica producida a nivel de las membranas celulares inducirá la producción de

segundos mensajeros a nivel intracelular, destacando entre ellos el peróxido de hidrógeno (H2O2), y los

alquenos (hidrocarburos insaturados que tienen uno o varios dobles enlaces carbono-carbono en su

molécula). Entre estos últimos, el más importante es el 4-hidroxinonenal (4-HNE) (98). Estos segundos

mensajeros llevan a la activación de factores de transcripción nuclear como el factor nuclear eritroide-2

(Nrf2) que a su vez induce la transcripción de elementos de respuesta antioxidante con la posterior

producción de enzimas AO como superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPX), proteínas de

shock térmico de 70 KDa (HSP-70) o hemo oxigenasa-1 (HO-1) (98-100).

A nivel del sistema inmune, Nrf2 es capaz de suprimir la activación del factor nuclear kappa B

(NFkB) el cual tiene efecto pro-inflamatorio. Esta acción inmunomoduladora del O3 se complementa

mediante la inducción de otros factores de transcripción nuclear como el factor nuclear de las células T

activadas (NFAT) o la proteína activadora 1 (AP-1) y la capacidad del O3 para modular la acción de

interferones e interleucinas (89).

En los eritrocitos, la peroxidación lipídica y los segundos mensajeros inducen:

● La activación del ciclo de las pentosas para asegurar así una cantidad suficiente de la sustancia

redox nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH), necesaria para la regeneración del

glutatión (GSH). El metabolito más importante del efecto anterior es el 2,3-DPG (2,3

difosfoglicerato), que desplaza la curva de disociación de la hemoglobina hacia la derecha. Esto

confiere menor afinidad de la Hb por el O2 y, por consiguiente, mayor liberación de O2 hacia los

tejidos (89). Se ha descrito que este aumento podría ocurrir sólo en aquellos pacientes con niveles

basales (pre-O3) disminuidos de 2,3-DPG (101).


29

Modificación de su carga eléctrica induciendo:

− Disminución del pH en el eritrocito, que producirá un desplazamiento hacia la derecha de la curva

de disociación de la hemoglobina (efecto Bohr) independiente de los niveles de 2,3-DPG (102).

− Aumento de la flexibilidad de la membrana del eritrocito, que disminuye la viscosidad sanguínea y

la resistencia vascular, mejorando finalmente las propiedades rheológicas de la sangre y el flujo

sanguíneo (103, 104). Según las leyes de Ohms y de Poiseuille, la disminución en la viscosidad

sanguínea (η) y/o aumento del radio (r) de los vasos, producirán una disminución de la resistencia

vascular (R), que llevará a un aumento del flujo sanguíneo (F) (figura 8).

Figura 8. Leyes de Ohms y de Poiseuille, donde F= Flujo, P= Presión

de flujo, R= Resistencia, η= Viscosidad sanguínea, r = Radio y L=

Longitud del vaso.

Sobre las células del endotelio vascular, los segundos mensajeros pueden inducir la producción

de prostaciclina, óxido nítrico, IL-8, produciendo vasodilatación a nivel de la micro-circulación, con la

consiguiente disminución de la resistencias vasculares y aumento del flujo sanguíneo. Esta acción se

complementa con el aumento de adenosina trifosfato (ATP) y modulación de prostaglandinas (figura 9).

Figura 9. Esquema de la acción del O3 sobre la oxigenación y flujo de los tejidos. ROS: radicales libres; LPO: lipoperóxidos; A.O.:

antioxidantes; Nrf2: factor nuclear eritroide-2; 2,3-DPG: 2,3 difosfoglicerato; NO: óxido nítrico; PG: prostaglandinas; Hb:

hemoglobina.

𝑹 =𝟖 ∗ 𝜼 ∗ 𝒍

𝝅 ∗ r4

𝑭 =∆𝑷

𝑹


30

Nuestro grupo de investigación ha descrito el impacto de estos factores sobre varios parámetros

relacionados con el flujo sanguíneo y la oxigenación (105, 106) y el beneficio clínico que se puede obtener

de la ozonoterapia en pacientes con toxicidad crónica por radioterapia, la cual suele estar mediada por

procesos de fibrosis a nivel de la microvascularización y del tejido conectivo (107-111).

Por último, hay que destacar otro hecho de gran relevancia. Los variados productos de la

peroxidación producidos por el O3 en el plasma (o que llegan a él) serán capaces de alcanzar los distintos

órganos y tejidos. Las acciones de éstos sobre la médula ósea, hígado, sistema nervioso central o las

glándulas endocrinas, aunque no bien conocidas, justifican los múltiples y diversos efectos del O3 a nivel

sistémico (figura 10).

Figura10. Esquema de cómo la ozonoterapia sistémica (vía insuflación rectal o mediante autohemoterapia) y los lipoperóxidos a

los que da lugar, pueden inducir una respuesta adaptativa en distintos órganos. LPO: Lipoperóxidos, MALT: tejido linfoide asociado

a mucosas (modificado a partir de Ref. (96).

Tabla 4. Resumen de algunos de los efectos tópicos y sistémicos del ozono médico.

Efecto tópico Efecto sistémico por acción en los

eritrocitos y endotelio vascular Efecto sistémico por acción en

células inmunitarias

Efecto microbicida:

bactericida,fungicida,virustático Mejoría de las propiedades

rheológicas Activación moderada de células

mononucleares


31

Efecto de limpieza de heridas Activación del metabolismo

eritrocitario: aumento de 2,3-DPG y

ATP

Liberación de citoquinas:IL-1,IL-2,

IFN-G, TNF-α y TGF-β

Desplazamiento del equilibrio

HbO2/Hb hacia la derecha, con

mejoría de la liberación de oxígeno.

Mejoría de la cicatrización de las

heridas Liberación de prostaciclinas (acción

vasodilatadora e inhibición de

agregación plaquetaria).

Inmunomodulación

Inmunoactivador eficiente Activación/potenciación de rutas

enzimáticas ligadas al metabolismo

de la glucosa (G-6pdh),y de los

mecanismos antioxidantes (GSH-

Px,GSHred, SOD)

Liberación de prostaciclinas (potencial

acción antimetastásica).

3.4.- Vías de administración.

La principal toxicidad del ozono es debida a la inhalación, por la limitada presencia de AO a nivel

pulmonar. Así, en el epitelio respiratorio el O3 induce un aumento de la fosfolipasa A2 y con ello de ácido

araquidónico y RL, lo que se relaciona con la toxicidad pulmonar. Sin embargo, la adecuada administración

de O3 por vías “no respiratorias” ha mostrado un efecto potenciador de AO y una posterior disminución de

RL, junto con una disminución de la fosfolipasa A2 y de la síntesis de prostaglandinas inflamatorias,

colaborando así en la acción antiinflamatoria.

Dado el gran número de patologías en las que se utiliza la Ozonoterapia, la vía de administración

(y la concentración) dependerá de la patología y características del paciente. En Junio de 2015 se ha

publicado la 2ª edición de la Declaración de Madrid sobre la Ozonoterapia, una guía clínica de consenso

internacional accesible en la página web del International Scientific Committee Of Ozone Therapy

(www.isco3.org), y en Octubre de 2015 se ha publicado una Revisión sobre ozonoterapia basada en la

evidencia accesible en la página web de la World Federation of Ozone Therapy. ttp://www.wfoot.org/wfots-

review-on-evidence-based-ozone-therapy/).

Puesto que el O3 es tóxico a muy pequeñas concentraciones sobre el epitelio pulmonar, es

indispensable durante la aplicación de ozonoterapia, evitar la exposición, tanto del paciente como del

personal sanitario que lo administra. Las principales rutas de administración del O3 para obtener efectos

sistémicos son la autohemoterapia y la insuflación rectal. Sus efectos pueden ser básicamente

superponibles, siendo la insuflación rectal la técnica más empleada en los experimentos con animales, y en

menor medida la vía intraperitoneal.

La insuflación rectal ha sido la vía de administración de ozono utilizada en la realización de esta

Tesis Doctoral.

En 1936, el Dr. P. Aubourg fue el primero en proponer las insuflaciones de ozono mediante el uso

de una cánula a través del recto para tratar la colitis crónica, fisuras y fístulas anales. Aquí, el O3 interactúa

http://www.isco3.org/


32

con la mucosa intestinal generando segundos mensajeros a ese nivel, y cuyos efectos se extenderán vía

vena porta al sistema linfático intestinal.

En humanos, generalmente se insuflan entre 100 y 300 ml de gas O3/O2 en el recto, a concentraciones entre 10 y 30 µg/ml. En cambio, en ratas suelen utilizarse unos 6-8 ml de gas y las concentraciones habitualmente empleadas en los estudios son de 50 µg/ml, las que se han empleado para la realización de esta Tesis Doctoral.

3.5.- Efectos secundarios y contraindicaciones de la ozonoterapia.

Si la ozonoterapia se realiza correctamente, no suele ocasionar efectos secundarios de

importancia. Los casos, anecdóticos, de toxicidad severa publicados en la literatura fueron debidos a un

procedimiento médico defectuoso (técnica de infiltración, de transfusión) o directamente a una mala praxis

médica, más que al efecto directo del Ozono en sí mismo. En cualquier caso, el especialista en ozonoterapia

debe ser capaz de superar cualquier emergencia porque un retraso en la intervención puede terminar con

la muerte del paciente. Debe saber todos los pasos de la resucitación cardio-pulmonar (RCP) y tener a la

mano el ambú, oxígeno médico, un desfibrilador automatizado y algunas ampollas de adrenalina, atropina

y corticoides.

Las principales contraindicaciones para el empleo de ozonoterapia son:

● Pacientes con deficiencia significativa de la enzima glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G-6PD),

favismo. Esta enzima participa en los mecanismos AO de los eritrocitos, y por tanto estos

pacientes pudieran presentar una deficiente adaptación al estrés oxidativo generado por el ozono.

● Embarazo. Aunque estudios en ratas no han evidenciado efecto mutagénico en fetos, es preferible

no utilizarlo.

● Pacientes con tratamiento con fármacos inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina

(IECA) usados como antihipertensivos.

● Situaciones graves o no controladas de: hipertiroidismo, inestabilidad cardiaca, trombocitopenia o

estados de hipocoagulación (especialmente para la autohemoterapia).

● Alergia conocida al ozono.

En conclusión, no se puede evitar decir que el ozono puede ser tóxico como cualquier tipo de

fármaco o sustancia pero, hasta el momento, los datos experimentales y la evidencia clínica han demostrado

un gran margen de seguridad. Los efectos adversos severos prácticamente siempre han estado ligados a

una deficiente técnica médica o mala praxis. Por otro lado, a pesar de su famosa “toxicidad”, un estudio

realizado por Jacobs en 1982 sobre posibles efectos negativos de la ozonoterapia encontró que la incidencia

de toxicidad importante fue de 0,0007%, realmente baja para lo que habitualmente encontramos en

medicina.


33

II.- JUSTIFICACIÓN.


34

En la actualidad, la FPI es una enfermedad pulmonar progresiva que compromete de una forma

muy seria la vida del paciente. Las opciones terapéuticas son muy escasas. Sólo muy recientemente han

aparecido 2 fármacos capaces de ofrecer un claro beneficio, aunque es limitado en cuantía y duración, En

los estadios finales de la enfermedad, el trasplante pulmonar se mantiene como la única alternativa

terapéutica eficaz, pero sólo indicada en pacientes muy seleccionados.

Los procesos de óxido-reducción intracelular y las defensas frente a los mismos están presentes

y regulados genéticamente en la fibrosis pulmonar, y se inician desde las primeras fases de la lesión. De

forma que en el pulmón con lesiones fibróticas se produce una situación de estrés oxidativo celular crónico

responsable del daño tisular irreversible. La administración de un potente inductor de antioxidantes, como

el ozono, de forma continua y mantenida, no utilizado antes en modelos de fibrosis pulmonar podría paliar

esta situación de estrés celular, daño en el epitelio alveolar y, de esta forma, cambiar la evolución de la

fibrosis pulmonar.

Para inducir la fibrosis pulmonar en animales de experimentación se ha optado por el modelo de

fibrosis pulmonar mediante instilación orotratraqueal (IOT) de bleomicina provocado con nuestra técnica

la aparición de lesiones pulmonares similares a las observadas en los enfermos con FPI.

El pobre pronóstico de los pacientes con FPI y las escasas opciones terapéuticas demandan un

esfuerzo mayor en el campo de la investigación traslacional. Esta Tesis Doctoral se ha diseñado con

carácter traslacional, con el objetivo último de que si el tratamiento con ozono fuera capaz de reducir el

grado de fibrosis pulmonar, su efecto podría ser evaluado en humanos mediante el diseño de los pertinentes

ensayos clínicos.


35

III.- OBJETIVOS.


36

1. “Desarrollar un modelo experimental válido en ratas de fibrosis pulmonar

inducida con bleomicina”.

2. “Valorar si el tratamiento con ozono disminuye el daño pulmonar en un

modelo experimental de fibrosis pulmonar inducido por bleomicina”.

3. “Estudiar si la expresión de los genes analizados se relaciona con el daño

pulmonar y su respuesta al tratamiento”.


37

IV.- MATERIAL Y MÉTODOS.


38

4.1- Material.

4.1.1.- Animales de experimentación.

Este estudio se llevó a cabo con 21 ratas (Rattus norvegicus) de la cepa Sprague-Dawley, machos,

de 5 meses de edad y pesos comprendidos entre los 300-350g, con un Estatus Microbiológico Convencional

(EMC) y de acuerdo Normas Europeas vigentes en las recomendaciones de las Federaciones de

Asociaciones Europeas de las Ciencias del Animal de Laboratorio (FELASA) sobre el cuidado y protección

de los animales de experimentación, bajo estrictas condiciones sanitarias. Estos animales proceden del

bioterio de la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín. Las condiciones

de estabulación, bienestar y salud de los animales se cumplieron de acuerdo a las recomendaciones y

exigencias recogidas en el R.D. 1201/05 y la directiva 86/609/CEE.

En cuanto a las condiciones de estabulación, todos los animales fueron destetados a los 21 días

de edad, ubicándose en jaulas con cubeta de macrolón de 20 X 35 X 55 cm., tapa de rejilla de acero

inoxidable y provisto de biberón, agrupados de cuatro en cuatro e identificados individualmente. El lecho

que se utilizó fue de abeto (figura 11).

Figura 11. Jaula con cubeta de macrolón 20 x 35 x 55 cm.

La iluminación es regulada artificialmente mediante fotoperiodos con un ciclo de luz/ oscuridad de

12 horas y una intensidad de 270 lux. El sistema de ventilación de las salas permite mantenerlas en presión

positiva. El sistema de renovación del aire se realiza mediante un sistema de extracción que permite que la

humedad relativa se encuentre dentro de los límites establecidos (16 renovaciones/hora y una temperatura

ambiente de 21° ± 1°C).


39

Figura 12. Sala del postoperatorio. Figura 13.- Instalaciones quirúrgicas.

Los animales se sometieron a una dieta ad libitum con la siguiente composición: vitamina A 6000

U.I/Kg.; vitamina D3 600 U.I/Kg; Fe 50 mg/kg.; Mn 44 mg/Kg.; Zn 31 mg/Kg.; Cu 7 mg/Kg.; I 6,2 mg/Kg.;

Co 0,5 mg/Kg.; proteína bruta 14,5%; materia grasa bruta 4 %; fibras brutas 4,5%; cenizas brutas 4,7%.;

P.O. Box 44220, Madison, Italy). El agua también se les suministró ad libitum con un pH 6,5-8,5.

En el postoperatorio, los animales se observaron durante los 28 días que duró el experimento,

monitoreándose la supervivencia de los mismos. Siguiendo las recomendaciones de FELASA, durante la

observación diaria de los animales, se registró el peso, aspecto externo, así como la cromodacriorrea y

aspecto del pelaje.

En cuanto a las condiciones de estabulación, todos los animales fueron destetados a los 21 días

de edad, ubicándose en jaulas con cubeta de macrolón de 20 X 35 X 55 cm., tapa de rejilla de acero

inoxidable y provisto de biberón, agrupados de cuatro en cuatro e identificados individualmente. El lecho

que se utilizó fue de abeto

4.1.2.- Salas, equipos y material inventariable.

Las salas de alojamiento (preoperatorio y postoperatorio) donde se ha llevado a cabo la

investigación experimental, dispone de los sistemas adecuados para mantener a una temperatura e

iluminación constante. (fig. 12), (fig. 13).

Las instalaciones quirúrgicas disponen de un quirófano experimental con un nivel de contención

de seguridad biológica tipo II y con equipamiento completo para microscopía quirúrgica.

Equipamiento utilizado ha sido un ventilador Servo 900 C® (Siemens-Elema, Suecia) (fig. 14), un

generador de ozono (Ozonosan alpha plus, Dr. Hänslerr, Alemania) (fig.15), microscopio de pie Carl Zeiss

OPMI® 9-12,5x (West, Alemania) (fig.16), congelador Jouan modelo VXE 490 de -80 ºC (fig. 17).


40

Figura 14. Ventilador Servo 900C. Figura 15. Generador de ozono

Figura 16. Microscopio de pie Carl Zeiss. Figura 17. Congelador -80ºC

4.1.3.- Material quirúrgico.

Para garantizar la esterilidad se han utilizado paños quirúrgicos estériles, así como bisturís nº 22,

jeringas de 1ml y de 2 ml, agujas 21 G, tijeras de Metzembaum y Mayo, pinzas de disección, pinzas de

Adson, pinzas hemostáticas de mosquito, pinzas de microcirugía (relojero), tijeras de microcirugía, tijeras

de microcirugía Westcott, y seda negra 3/0 (Silkan®. B. Braun Surgical S.A. España), torundas y gasas

estériles (figura 18).


41

Figura 18.- Instrumental quirúrgico.

4.1.4.- Medicación anestésica y analgésica.

Los fármacos que se han empleado en la anestesia de los animales han sido: Lidocaína 1%

(Xilonibsa®, Inibsa, Barcelona, España), Hidrocloruro de medetomidina (Dormilan® Vetpharma Animal

Health, Barcelona, España), Ketamina (Ketalar 500®, Pfizer, Madrid, España) y Atropina 1% (Atropina®,

Braun, Madrid, España). El efecto de la medetomidina se ha revertido con su antagonista, el Atipamezol

(hidrocloruro) (Antisedan®, Esteve, Barcelona, España.) Como analgésico postoperatorio se ha empleado

la Buprenorfina (Buprex®, Shering-Plug, Barcelona. España) (figura 19).

Figura 19.- Anestésicos y analgésicos empleados en las ratas.


42

4.1.5.- Conservación del tejido pulmonar.

Las muestras de tejido fresco son fijadas en formaldehído ya que preserva la morfología histológica

del tejido pulmonar 3,7-4% pH7 y embebido en parafina (Leica, EG 1160, Microsystems, Nussloch Gmbh,

Alemania). La deshidratación se llevó a cabo con una batería de alcoholes y el aclarado posterior se realiza

en baños de xilol.

Para el procesamiento de muestras histológicas, se utiliza como técnica de corte para obtener las

secciones el micrótomo rotación (Thermoscientific Microm HM 340 E, Walldorf, Alemania), un calentador

de agua JP Selecta y láminas portaobjetos 76 x26 (HistoBond®SX, Knittel Glasser).

Además, las muestras se tiñeron rutinariamente con hematoxilina- eosina (HE), el material

empleado: xilol, alcohol absoluto (100°), alcoholes, agua corriente, agua destilada, hematoxilina alumínica

de Harris, alcohol ácido, sustancias alcalinas (agua amoniacal), solución de bicarbonato de sodio al 2% y

carbonato de litio al 1%.

Para purificar el RNA se usó el tiaocinato de guanidino (GITC)-fenol/cloroformo. El bromuro de

etidio (BrEt) (Pierce, Rockford, Ll). Par la síntesis del cDNA se usó el Kit iScrip cDNA síntesis (BioRad,

Barcelona-España). Se utilizó la herramienta on-line www.thermo.com para fabricar los cebadores. Para

realizar las PCRs en tiempo real se utilizó SYBR Green Master Mix (Foster, California). El resto de los

reactivos procedían de Sigma- Aldrich Chemical Co. (St. Louis, Mo).

4.2.- Método.

4.2.1.- Diseño.

El Comité Ético de Experimentación y Bienestar Animal del Hospital Universitario de Gran Canaria

Dr. Negrín evaluó favorablemente el procedimiento CEEBA-HUGCDN 013/2011 para la realización de este

trabajo de investigación.

Se han utilizado 21 ratas machos de la cepa Sprague- Dawley, para el desarrollo del modelo

experimental, con pesos comprendidos entre 300 y 350 g, y en condiciones óptimas de estabulación. Los

animales se han distribuido en cuatro grupos de la siguiente manera (tabla 5): A) Un grupo Control (n= 6

pulmones de 3 animales) no se les realizó ninguna manipulación terapéutica ni experimental. Se les extrajo

muestra de sangre y de pulmón derecho e izquierdo sanos (pulmones analizados = 6); B) Un grupo Sham

(n=6) se les realizó IOT de suero fisiológico y se les extrajo muestras de sangre y de pulmón derecho e

izquierdo a los 28 días de instilación; C) Un grupo Bleomicina (BLM) (n=6) a los que se le ha realizado IOT

de BLM (2,5 mg/Kg de peso). Se les ha extraído muestras de sangre y de pulmón derecho e izquierdo sano

a los 28 días de instilada la BLM; y D) Un grupo BLM + O3 (n=6). Se les ha instilado BLM de la misma forma

que el “Grupo BLM”. Además, los animales fueron tratados con O3 por vía rectal desde el segundo día de

la IOT de BLM hasta el final del estudio.

La IOT se ha realizado mediante un catéter intravenoso (i.v.) calibre 14G x 51mm (Abbocath®-T,

Abbott Ireland Ltd., Sligo, Irlanda). Tras la IOT, las ratas pasaron al postoperatorio donde se les ha

administrado H2O y comida ad líbitum. Transcurridos 28 días después de cada procedimiento, se han

http://www.thermo.co/


43

sacrificado los animales y se les ha extraído el árbol broncopulmonar. Se han tomado muestras tanto del

pulmón derecho como del izquierdo para su estudio histológico, microbiológico y expresión génica.

TABLA 5. Diseño de grupos para el estudio histológico, microbiológico y de expresión génica.

GRUPO

TRATAMIENTO

Nº ANIMALES

TOTAL

A

GRUPO CONTROL

6 pulmones de

3 animales

3

B

GRUPO SHAM

6

6

C

GRUPO BLM

6

6

D

GRUPO BLM + O3

6

6

Total

21

Tabla 6. Volumen de IOT de los grupos de estudio.

GRUPO

TRATAMIENTO

INSTILACIÓN

RATAS

A

GRUPO CONTROL

------

0

B

GRUPO SHAM

SUERO FISIOLÓGICO

(Volumen de 500 µl)

6

C

GRUPO BLM

BLEOMICINA

(2,5 mg/Kg en 500 µl de solución salina)

6

D

GRUPO BLM + O3

BLEOMICINA

(2,5 mg/Kg en 500 µl de solución salina)

6

4.2.2 – Inducción a la fibrosis pulmonar por BLM.


44

4.2.2.1.- Anestesia.

En la inducción de la anestesia se utilizó la combinación de un α–2 agonista (medetomidina) y un

agente que produce disociación, la ketamina, vía parenteral (VP) (112). De este modo se procede a la

premedicación con 0,5 mg/Kg por vía subcutánea (s.c.) de medetomidina (Dormilan® Vetpharma Animal

Health, Barcelona, España), transcurridos cinco minutos y una vez comprobada la sedación de las ratas se

indujo una anestesia corta, inyectando al animal por vía intraperitoneal (i.p.) 25 mg/kg de ketamina (Ketolar

500®, Pfizer, Madrid, España). Posteriormente se le inyectó intramuscular (i.m.) 0,04 mg/Kg de atropina 1%

(Atropina® Braun, España) (figura 19).

4.2.2.2.- Intubación y ventilación.

Una vez que el animal es anestesiado, se realiza la maniobra de intubación orotraqueal (IOT)

según protocolo descrito (113). Para ello, se colocó al animal en decúbito dorsal fijado, seguidamente se le

aplicó una luz en la parte central del cuello para visualizar por transiluminación los pliegues de la laringe

junto con la entrada de la tráquea. Después de retirar la lengua con una pinza atraumática, y previa

aplicación de lidocaína 1% (Xilonibsa®, Inibsa, Barcelona, España), se introdujo la cánula 14G (Abbocath®-

T) por la boca en la epiglotis con la ayuda de una guía de teflón, con cuidado de no tocar la glotis, evitando

un posible edema o moco que dificulte la respiración. Una vez introducida la cánula se comprueba el la

estabilidad respiratoria, se fija al maxilar superior, evitando así su desplazamiento durante el procedimiento.

Para la ventilación mecánica de los animales, se ha utilizado un ventilador mecánico (Servo 900,

Siemens, Madrid, España) (figura 14) con una presión inspiratoria de 12 cmH2O, con una relación

inspiración/espiración de 1:2, una fracción inspirada de oxígeno (FiO2) de 0,2 y un volumen corriente (VC)

de 1ml/100g de peso vivo, una presión positiva al final de la expiración de 2 mbar, una fracción de O2

espirado (FiO2) de 0,21, se modificó la relación inspiración espiración a 1:2, y una frecuencia respiratoria

de 60 respiraciones por minuto (rpm).

4.2.2.3. Administración de BLM.

La BLM fue preparada en el Servicio de Farmacología del Hospital Universitario de Gran Canaria

Dr. Negrín, y consistió en una mezcla estéril de 2,5 mg/kg de BLM en un volumen total de 500 ul de solución

salina en jeringas de insulina.

Una vez anestesiado e intubado el animal, como previamente se ha descrito, inclinamos la mesa

quirúrgica, colocándola lo más vertical posible. Acto seguido, se procedió a la IOT con la ayuda de una

jeringa de insulina conectada a una aguja Nº 21G de 50 mm de largo, permitiendo de este modo llegar lo

más lejos posible hasta antes de la carina. Esta aguja se introdujo dentro de la cánula de 14 G, asegurando

de este modo no lesionar la tráquea y que la dosis a instilar sea más exacta. El vaciado de la jeringa coincidió

con el momento de la inspiración del animal, evitando de esta forma alguna resistencia por la espiración.

Para asegurarnos que la BLM se disperse a la mayor área pulmonar posible, y siempre con la

mesa quirúrgica inclinada, se procedió inmediatamente a intubar al animal, dejándolo con la ventilación

mecánica 5 min. Transcurrido ese tiempo se inició el proceso de revertir la anestesia con 0,5 mg/Kg (im) de

atipamezol (hidrocloruro) (Antisedan®, Esteve, Barcelona, España.).


45

4.2.2.4- IOT de solución salina isotónica 0,9% (solución fisiológico).

Tras iniciar el procedimiento de intubación, se inclina la camilla del quirófano unos 60º colocando

los animales tal y como se indica en la imagen (figura 20). La instilación del suero fisiológico, en el grupo

Sham, se ha realizado de la misma forma y el mismo volumen (500 ul) que la BLM. Trascurrido 5 min de

ventilación mecánica, se han desentubado y, finalmente, revertida la anestesia con la administración de 0,5

mg/kg intramuscular (i.m) de atipamezol (Antisedan®, Pfizer, Madrid, España).

Figura 20. Muestra el proceso de IOT.

4.2.3.- Tratamiento con O3.

El O3 se ha administrado por vía rectal (insuflación rectal) con una sonda de silicona flexible 14G, por medio de un generador médico de ozono. La concentración de ozono se ha controlado por medio de espectrofotometría UV a 254 nm. El volumen de gas (mezcla de O3/O2) fue de 20 ml/kg. La administración de O3 se realizó de forma diaria durante 5 días a la semana, desde el segundo día tras la IOT de BLM, a concentraciones crecientes (de 5 en 5 µg/ml - µg de O3 por ml de O2 -) desde 20 µg/ml hasta 50 µg/ml. Posteriormente, la concentración se mantuvo constante en 50 µg/m, y en el mismo número de veces/semana hasta el momento del sacrificio. El gas se ha insuflado lentamente para evitar disconfort abdominal en la rata. El proceso suele durar de uno a dos minutos. Posteriormente, se presiona el ano durante 2 minutos después de cada insuflación, para evitar así la salida del gas.

Figura 21. Insuflación rectal de O3 en la rata.


46

4.2.4.- Evolución clínica en el periodo postoperatorio.

Tras la IOT, los animales fueron llevados a áreas de postoperatorio de la Unidad de Investigación

del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín. Allí se les hizo un seguimiento clínico, donde se

recogieron datos de control del dolor (piloerección, dacriorrea, inmovilización, ojos cerrados) y presencia de

signos de depresión.

Hasta los 28 días tras IOT, las ratas estuvieron en sus respectivas jaulas (convencionales

Tipo1000, con rejilla y biberón de 500 ml), donde dispusieron de comida y agua ad libitum, provistas de

confort térmico (mantas calefactoras, lámparas de calor) para prevenir la hipotermia.

4.2.5.- Obtención y recogida de muestras.

El sacrificio de los animales, salvo el grupo Control, se ha realizado a los 28 días de instilarles la

BLM o el suero fisiológico. Para la obtención de muestras, los animales han sido profundamente

anestesiados con medetomidina (0,5 mg/Kg) SC y Ketamina (75 mg/Kg) IP y premedicados con Atropina

(0,04 mg/Kg) im. Una vez anestesiado, y tras comprobar la existencia de un plano profundo de la misma

antes de comenzar el procedimiento (falta de reflejos al pinchar almohadilla plantar, relajación y respiración

regular) (figura 22), se rasura la parte anterior del tórax.

Figura 22.- Esternotomía media. Acceso a bloque cardio-pulmonar.


47

Los animales fueron colocados en posición decúbito supino, y luego de ventilados, se les realizó

una traqueostomía, accediendo, de esta forma, a los órganos intratorácicos como pulmón, corazón,

esófago, mediastino, aorta y cava. Para la extracción del bloque cardio-pulmonar, se procedió a la ligadura

y sección de la tráquea con el pulmón en semiinsuflación y mediante tracción, se ha separado del esófago,

con sección de los troncos supraaórticos, aorta, venas cavas y ligamento pulmonar (figura 23) (figura 24).

Una vez extraído el bloque, se separan los pulmones y se extrajeron muestras para el estudio histológico,

genómico y análisis microbiológico.

Figura 23.- Rata en posición de decúbito supino,traqueostomía y ventilación mecánica.

La extracción del bloque cardio-pulmonar, se ha procedido a la ligadura y sección de la tráquea

con el pulmón en semiinsuflación y a la extracción del bloque cardiopulmonar mediante tracción,

separándolo del esófago, con sección de los troncos supraaórticos, aorta, venas cavas y ligamento

pulmonar. Una vez se extrajo el bloque (figura 25), se separaron los pulmones para el estudio histológico

y genómico.

Para el estudio histológico las muestras se depositaron en formaldehído a una concentración del

4%. Para el estudio genómico, las muestras de pulmón se depositaron en PBS fría, cuya composición es

NaCl (8 g/L), KCl (0,2g/L), Na2HPO4 (1,15 g/L), KH2PO4 (0,2 g/L) y glucosa (1g/L), congelándose de forma

inmediata en N2 líquido y posteriormente fueron almacenadas a -80º C hasta su análisis. Para el estudio

microbiológico, las muestras de tejido pulmonar fueron depositadas un bote de boca ancha estéril y se

añadió 2 gotas de suero fisiológico estéril (de modo que el tejido quede humedecido, pero no embebido).

y llevadas inmediatamente al Servicio de Microbiología del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín

para procesamiento inmediato (figura 24).


48

Figura 24.- Esternotomía media.

Figura 25.- Extracción del bloque cardio-pulmonar.


49

4.2.6.- Mediciones.

4..2.6.1.- Análisis microbiológico.

Las muestras de biopsia de pulmón se remitieron en un contenedor estéril al laboratorio de

Microbiología para cultivo.

Se introdujo la biopsia en BD Fluid Thioglicollate Medium (Becton Dickinson) el cual se incubó

durante 7 días a 35º C y se visualizó diariamente para detección de turbidez que indicará crecimiento. Si se

detectaba turbidez antes de los 7 días de incubación se realizaba un subcultivo en agar sangre, agar

chocolate y agar McConkey (BBL, BD Diagnostic Systems) que se inocularon durante 48 horas a 35º C en

atmósfera con 5% de CO2 para investigación de bacterias aerobias y en agar Brucella suplementado con

vitamina K1 y hemina (BBL, BD Diagnostic Systems) que se incubó durante 4 días a 35º C en atmósfera

anaerobia para investigación de bacterias anaerobias. Para la identificación y test de susceptibilidad de las

bacterias aisladas se disponía del sistema ViteK2 (BioMérieux).

4.2.6.2.- Análisis histológico.

Tras la extracción del bloque cardiopulmonar, se ha tomado de cada muestra una biopsia

pulmonar.

Estas muestras han sido fijadas en formol tamponado al 3,7 - 4% a temperatura ambiente.

4.2.6.2.1.- Procesamiento de las muestras.

Posteriormente las muestras histológicas fueron sometidas a deshidratación, inclusión y corte de

las secciones.

Deshidratación: Mediante un procesador de tejidos (Leica, TP 1020, Leica Biosystems, Nussloch

Gmbh, Alemania) (figura 26).

Inclusión: Las muestras se incluyeron en parafina por medio de un dispensador de parafina (Leica,

EG 1160) Microsystems, Nussloch Gmbh, Alemania) (figura 27). Así, una vez deshidratadas las muestras

se depositaron en un medio que contenía parafina líquida a 60º C. Posteriormente, se procedió a enfriar la

parafina y se dejó reposar todo el material durante 12 horas.

Transcurrido este tiempo, se fundió la parafina y se extrajeron las muestras para luego

confeccionar los bloques colocados con la orientación correcta en cada una de las muestras. Se han dejado

solidificar los bloques, primero sobre una base fría. Los bloques se identificaron y se guardaron en un


50

ambiente seco, oscuro y fresco hasta el momento de su corte sin identificar en los mismos el grupo de

estudio al que pertenece.

Corte de las secciones: Los cortes se efectuaron a 5μm de grosor con un micrótomo de rotación

(Thermoscientific Microm HM 340 E, Walldorf, Alemania) (figura 28). Estos se han dejado calentar en un

calefactor a agua, se han recogido las muestras y se han colocado en los portaobjetos. Se han secado y

dejado enfriar a temperatura ambiente. Posteriormente se han teñido las preparaciones histológicas con

hematoxilina y eosina y tricrómico.

A continuación se procedió al montaje de la lámina cubreobjetos con fosfato dibutil xileno (DPX).

Teñidor automático Citolab 1000.

Figura 26.- TP1020 Figura 27.- Leica EG 1160. Figura 28.- Microtomo de rotación

4.2.6.2.2.- Lectura de las muestras.

Las muestras histológicas del pulmón han sido estudiadas por el Especialista en Anatomía

Patológica, en forma ciega con un microscopio óptico Olympus BX40 (Olympus España S.A., Madrid,

España) (figura 29) y se han clasificado de modo didáctico teniendo en cuenta los fenómenos que

acontecen según la escala de Ashcroft, a los 28 días post IOT de la BLM.

Figura 29. Microscopio óptico Olympus BX40.

Se ha determinado el grado de fibrosis según la Escala Numérica de Ashcroft (tabla 7):


51

Tabla 7. Criterios para valorar el grado de fibrosis pulmonar.

GRADO

HALLAZGOS HISTOLÓGICOS

0

Pulmón normal

1

Mínimo engrosamiento de pared sin daño de arquitectura

2 3

Moderado engrosamiento de pared definido de estructura pulmonar

4 5

Fibrosis con daño definido de estructura pulmonar

6 7

Distorsión severa de estructuras y áreas fibróticas.

8

Obliteración fibrosa total.

4.2.6.3. Análisis de la expresión genómica.

Las muestras de pulmón se homogeneizaron siguiendo el protocolo citrato sódico (Sigma Sigma,

Saint Louis, Missouri, USA) y cloroformo (Merck KGaA, Darmstadt, Germany). Posteriormente se ha

realizado la extracción de ARN total. Se ha determinado la concentración de ARN en las muestras mediante

espectrofotometría de absorbancia (NanoDrop 1000 Spectrophotometer V3,7, Thermo Scientific). La

síntesis del cDNA monocatenario se ha realizado con primers de hexanucleótidos al azar (Iscript cADN

Synhesis Kit, Biorad).

4.2.6.3.1.- Extracción de RNA y síntesis de cDNA.

La extracción de RNA se llevó a cabo utilizando el protocolo de Tri- Reagent de extracción de RNA

total. Las muestras conservadas a -80ºC, se homogenizaron con Tri-Reagen® (Sigma, Saint Louis,

Missouri, USA), utilizando un homogenizador Ultra-Turrax T- 10 Basic® (Instrumentación científico técnica,

España) y se centrifuga a 12.000 g, 10’ a 4º C.

La extracción se realizó con cloroformo al 100% (Sigma-aldrich, USA), posteriormente para

eliminar una posible contaminación de proteínas se realizó un lavado con fenol-cloroformo isoamílico

(sigma-aldrich, USA). No se realizó en ningún caso.


52

Finalmente, para la purificación y aislamiento del RNA, se agregó citrato sódico/NaCl e isopropanol

para precipitar el RNA, se incubó a -20ºC durante overnight (24h), se centrifugó a 12.000g, 4ºC durante 10

minutos. Después se realizaron dos lavados con etanol al 75%, se eliminó lentamente el sobrenadante y

seco el pellet de RNA, se disolvió en agua DEPC.

Una vez que se obtuvo el RNA, y que se determinó su pureza química por medio del NanoDrop

1000 Spectrophotometer V3.7, Thermo Scientific) en un ratio de 28S/18S.

Para la síntesis de cDNA se ha utilizado el kit iScriptTM cDNA Synthesis de (Bio-Rad®) (REF#170-

8890). Se mezclaron 2µg de RNA total con 4µl, 5x de la mezcla de reacción conteniendo “random primers”

y la transcriptasa reversa en un volumen final de 20µl. la mezcla se mantuvo durante 5 minutos a 25ºC para

permitir el correcto anillamiento de los cebadores y durante 30 minutos a 42ºC para producirse la extensión.

Finalmente las muestras se mantuvieron a 85ºC durante 5 minutos. Disminuyendo la temperatura hasta 4º

de forma indeterminada. Con el propósito de inactivar la transcriptasa reversa para que no interfiera en la

PCR.

4.2.6.3.2.- Análisis de la expresión genómica mediante qRT-PCR.

Se ha utilizado un termociclador de placas de 96 pocillos (C1000 Thermal Cycler, CFX96TM Real

Time System) y se ha seguido el protocolo del fabricante.

Para realizar el diseño de cebadores se ha utilizado software online “Primer3”

(http://frodo.wi.mit.edu/), se ha optimizado la temperatura predicha por el programa informático y la

concentración de MgCl2. La especificidad de los cebadores ha sido visualizada mediante electroforesis en

gel de agarosa, para ello se ha realizado un pool de cada grupo experimental y con cada pareja de primers

de los genes estudiados, se ha hecho una PCR. El fragmento amplificado se ha analizado mediante una

curva de melting que permite la identificación y diferenciación de las variantes genéticas.

Los cebadores específicos que se han empleado y las condiciones de la RTPCR en tiempo real

han sido recogidos en la tabla 8. Los resultados han sido corregidos mediante el gen PPIA (peptidil-prolil

isomerase A, ciclofilina A) como housekeeping gene (114), ya que es el que presenta una expresión más

estable.

Tabla 8. Genes y condiciones de la PCR a tiempo real

GEN

DESCRIPCIÓN

PRIMER FORWARD

PRIMER REVERSE

Nfkβ

Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas

GTATGGCTTCCCGCACTATGG

TCGTCACTCTTGGCACAATC

HSpb27

Heat shock protein-1 27KDa

GGCACACTCACGGTGGAGGC

GGGAGGGCTGGTGACGGCTA

http://frodo.wi.mit.edu/


53

TGFβ1

Factor de crecimiento transformante beta 1

TGAGTGGCTGTCTTTTGACG

TGGGAGTGATCCCATTGATT

VEGF-A

Factor de crecimiento endotelial vascular

CCAGGCTGCACCCACGACAG

CGCACACCGCATTAGGGGCA

IL-1

Interleucina 1

GGAGGCCATAGCCCATGATT

TCCTTCAGCAACACAGGCTT

IL-6

Interleucina 6

CATTCTGTCTCGAGCCCACC

GCTGGAAGTCTCTTGCGGAG

Col4

Colágeno de tipo IV

GCCAAGTGTGCATGAGAAGA

AGCGGGGTGTGTTAGTTACG

PPIasa

Peptidil - prolil isomerasa A ( la ciclofilina A (CypA))

AGCACTGGGGAGAAAGGATT

AGCCACTCAGTCTTGGCAGT

4.2.7.- Análisis estadístico.

El análisis estadístico se ha realizado mediante el paquete estadístico SPSS v15,0 para Windows

(2005, SPSS Inc. Illinois, USA). La expresión de los genes la mostramos como media con su desviación

estándar (SD), salvo Vegfa que se ha valorado en base a la mediana con valores mínimo y máximo. Las

determinaciones histológicas se expresan en porcentajes. Para los contrastes de hipótesis hemos

considerado un error α= 0,05. Hemos aplicado el test de la U de Mann Whitney para dos muestras

independientes para verificar las diferencias en el peso y en la expresión de los genes, ya que estas no

siguen una distribución normal (Test de Kolmogorov- Smirnov). Se ha realizado el Test de Chi-Cuadrado

con la razón de verosimilitud (RV) para valorar la asociación de las determinaciones histológicas de los

tratamientos versus los controles.


54

V.- RESULTADOS


55

5.1.- Resultado y datos clínicos de los animales.

No se observó ningún caso de mortalidad entre los animales del estudio. Los animales del grupo BLM + O3, presentaron un comportamiento más activo y reactivo que las del grupo BLM. No se observaron diferencias significativas entre los grupos Sham, BLM y BLM + O3 en los parámetros clínicos evaluados de temperatura, signos de dolor (piloerección, dacriorrea, inmovilización, ojos cerrados), presencia de signos de depresión respiratoria.

Si se observaron diferencias significativas en la variable del peso de los animales (tabla 9), de forma que respecto al grupo Sham, la disminución de peso en el grupo de BLM resultó estadísticamente significativa a la 1ª semana (p= 0,010), 2ª semana (p = 0,032) y 3ª semana (p = 0,029), no así a la 4ª semana. Respecto al grupo Sham, la disminución de peso en el grupo de BLM + O3 resultó ser también estadísticamente significativa a la 1ª semana (p = 0,010), la 2ª semana (p = 0,010) y la 3ª semana (p = 0,010) y a la 4ª semana (p = 0,190). Sin embargo, las diferencias de peso entre los grupos BLM y BLM + O3 no fueron significativas.

En los grupos BLM y BLM+O3, el tiempo medio empleado en la recuperación del peso que los animales mostraron al iniciar el estudio (tabla 9) fue 15,83 ± 6,61 y 11 ± 5,21 días respectivamente. La recuperación del peso de los animales Sham fue mucho más rápida con un valor medio 3,25 ± 0,95 días.

Tabla 9.- Evolución del peso de los animales.

PESOS/GRUPOS

GRUPO SHAM

GRUPO BLM

GRUPO BLM + O3

Pesos (1ª semana post IOT BLM)

402 ±75 Kg

292 ± 36 Kg

304 ± 62 Kg


417 ± 76 Kg

321± 27 Kg

327 ± 10 Kg


427 ± 72 Kg

338 ± 12 Kg

349 ± 11 Kg


441 ± 67 Kg

363 ± 17 Kg

358 ±19 Kg

Tabla 10. Días empleados en recuperar el peso inicial del estudio según grupos.

Grupos

Media ± SD (días)

Sham

3,25 ± 0,95

BLM

15,83 ± 6,61

BLM + O3

10,33 ± 1,75


56

Figura 30. Gráfica de evolución del peso de los animales durante los 28 días del estudio.

5.2.- Descripción macroscópica.

Macroscópicamente, los pulmones de los animales del grupo Control y grupo Sham, mostraron una apariencia y una consistencia normal, con una adecuada expansión y sin adherencias pleuropulmonares ni presencia de focos atelectásicos o fibróticos.

Figura 31. Pulmón grupo Control y grupo Sham.

Los pulmones de los animales del grupo de BLM, mostraron áreas parcheadas de color rojo oscuro

con una consistencia más dura a la palpación, sobre todo en las más hiliares, con ausencia de la función

ventilatoria en dichas zonas a pesar de las maniobras de reclutamiento alveolar. Tampoco se observaron

adherencias entre el pulmón y pleura parietal.

Figura 32. Pulmón grupo BLM.


57

En el grupo de animales de grupo BLM+O3, los pulmones presentaron un aspecto y consistencia

más parecido al pulmón normal. Las lesiones fueron menores en tamaño y cantidad que las observadas en

el grupo BLM y el pulmón presentaba una adecuada expansión en su mayor parte. Tampoco se observaron

adherencias entre el pulmón y pleura parietal.

Figura 33. Pulmón grupo BLM+O3.

5.3.- Estudio histológico. Cuantificación del grado de fibrosis según

escala Ashcroft.

El análisis histológico del grupo Control mostró una arquitectura pulmonar normal. No se

observaron signos de fibrosis, siendo su cuantificación según el método de Ashcroft de 0.

Figura 34. Estudio histológico grupo Control.

En el grupo Sham se observó un leve engrosamiento de las paredes alveolares conservando la

normalidad del resto de las estructuras pulmonares. El valor medio de la cuantificación de la fibrosis según

el método de Ashcroft con respecto al grupo control fue de 3,5 ± 0,28 (p = 0,002).


58

Figura 35. Estudio histológico grupo Sham.

En los pulmones del grupo de BLM se observó una desaparición casi completa de los espacios

alveolares, que presentaron ocupación por macrófagos alveolares, células epiteliales alveolares con núcleo

prominente (más bien típicas), algunos hematíes y muy pocos linfocitos. El valor medio de la cuantificación

de la fibrosis según el método de Ashcroft con respecto al grupo control fue de 6,53 ± 0,44 (p = 0,002).

Figura 36. Estudio histológico grupo BLM.

En los pulmones del grupo BLM+O3, se observó una recuperación parcial del espacio aéreo con

persistencia del engrosamiento de las paredes alveolares y de los cambios del epitelio bronquiolar. El valor medio de la cuantificación de la fibrosis según el método de Ashcroft con respecto al grupo fue de 5,07 ± 1.01 (p = 0,026).

Figura 37. Estudio histológico grupo BLM+03.


59

A continuación se representa gráficamente el valor medio de la cuantificación de la fibrosis según

el método de Ashcroft.

Tabla 11.- Grado de fibrosis pulmonar según la escala de Ashcroft y su significación estadística.

Control

GRUPO SHAM

p

GRUPO

BLM

p*

GRUPO

BLM + O3

p**

0

3,5 ± 0,28

p = 0,002

6,53 ± 0,44

p = 0,002

5,07 ± 1,01

p = 0,026

5.4.- Análisis microbiológico.

El cultivo de las muestras de pulmón de los grupos Control, Sham, BLM y BLM + O3 fue negativo

para bacterias aerobias y anaerobias

5.5.- Análisis de expresión génica.

El análisis de la expresión de RNA mensajero de las muestras de pulmón del grupo Control vs

SHAM, BLM y BLM+O3 mostró los siguientes resultados para cada uno de los genes analizados.


60

Tabla 12. Expresión de los genes analizados entre el grupo Control vs Sham.

SHAM

Genes

Controles

SHAM

p

Hsp27

1 ± 0,09

0,94 ± 0,10

0,522

Vegfa

1 ± 0,05

0,98 ± 0,09

0,631

Nfkb

1 ± 0,03

0,97 ± 0,11

0,715

IL6

1 ± 0,22

2,02 ± 0,34

0,006*

Col4

0,99 ± 0,10

1,25 ± 0,19

0,016*

IL1

1 ± 0,14

3,08 ± 0,56

0,006*

Tgfb

1 ± 0,12

0,17 ± 0,03

0,006*

Figura 38. Expresión de los genes analizados entre Control vs SHAM.


61

Tabla 13. Expresión de los genes analizados entre el grupo control vs BLM.

BLEOMICINA

Genes

Controles

BLEOMICINA

p

Hsp27

1 ± 0,09

1,24 ± 0,17

0,045*

Vegfa

1 ± 0,05

1 ± 0,53

0,855

Nfkb

1 ± 0,03

1,29 ± 0,12

0,006*

IL6

1 ± 0,22

2´,14 ± 0,47

0,006*

Col4

0,99 ± 0,10

2,21 ± 0,33

0,004*

IL1

1 ± 0,14

1,43 ± 0,26

0,010*

Tgfb

1 ± 0,12

2,54 ± 0,44

0,004*

Los valores se muestran en función de la media ± desviación típica. La significación estadística

entre ambos grupos (p < 0,005) se indica con un *.

Figura 39. Expresión de los genes analizados entre Control vs BLM.


62

Tabla 14. Expresión de los genes analizados entre el grupo control vs BLM+O3.

OZONO

Genes

Controles

BLEOMICINA + O3

p

Hsp27

1 ± 0,09

0,97 ± 0,12

0,855

VEGFA

1 ± 0,05

1,06 ± 0,19

0,873

Nfkb

1 ± 0,03

1,07 ± 0,21

0,715

IL6

1 ± 0,22

3,63 ± 0,76

0,006*

Col4

0,99 ± 0,10

2,48 ± 0,59

0,006*

IL1

1 ± 0,14

3,16 ± 0,81

0,006*

Tgfb

1 ± 0,12

3,49 ± 0,78

0,004*



Figura 40. Expresión de los genes analizados entre Control vs BLM+O3.


63

El análisis de la expresión de RNA mensajero de las muestras de pulmón del grupo Sham vs

BLM y BLM + O3 mostró los siguientes resultados para cada uno de los gens analizados.

Tabla 15. Expresión de los genes analizados entre el grupo SHAM vs BLM.

BLEOMICINA

Genes

CONTROLES

SHAM

BLEOMICINA

p

Hsp27

1,06 ± 0,11

1,40 ± 0,20

0,018*

Vegfa

1,03 ± 0,09

1,05 ± 0,05

0,885

Nfkb

1 ± 0,11

1,33 ± 0,13

0,009*

IL6

1,02 ± 0,17

1,08 ± 0,24

0,602

Col4

1,01 ± 0,15

1,78 ± 0,26

0,004*

IL1

1,06 ± 0,19

0,49 ± 0,09

0,006*

Tgfb

1 ± 0,20

14,44 ± 2,50

0,006*

Los valores se muestran en función de la media ± desviación típica. La

significación estadística entre ambos grupos (p < 0,005) se indica con un *.


64

Tabla 16. Expresión de los genes analizados entre el grupo Sham vs BLM+O3.

OZONO

Genes

Controles

SHAM

BLEOMICINA + O3

p

HSP27

1,06 ± 0,11

1,10 ± 0,14

0,465

VEGFA

1,03 ± 0,09

1,12 ± 0,20

0,631

NFKB

1 ± 0,11

1,11 ± 0,22

0,465

IL6

1,02 ± 0,17

1,84 ± 0,38

0,009*

Col4

1,01 ± 0,15

2 ± 0,48

0,006*

IL1

1,06 ± 0,19

1,09 ± 0,28

0,917

TGFb

1 ± 0,20

19,81 ± 4,45

0,006*

Los valores se muestran en función de la desviación típica. La significación estadística entre ambos

grupos (p < 0,005) se indica con un *.

- Figura 41. Expresión de los genes analizados Sham vs BLM+O3.


65

Tabla 17. Expresión de los genes analizados entre el grupo BLM y BLM + O3.

OZONO

Genes

Controles

BLEOMICINA

BLEOMICINA + O3

p

HSP27

0,96 ± 0,09

0,75 ± 0,09

0,047*

VEGFA

1,03 ± 0,05

1,09 ± 0,20

0,855

NFKB

0,96 ± 0,09

0,80 ± 0,16

0,117

IL6

1,12 ± 0,25

1,90 ± 0.39

0,016*

Col4

0,91 ± 0,13

1,02 ± 0,24

0,584

IL1

0,92 ± 0,17

2,03 ± 0,52

0,006

TGFb

0,97 ± 0,16

1,33 ± 0,30

0,025



- Figura 42. Expresión de los genes analizados BLM vs BLM+O3.


66

A continuación se muestra el análisis de la expresión de RNA mensajero de cada gen de forma

individual.

HSP 27

No se observaron diferencias significativas en la expresión de Hsp 27 entre el grupo Control y el

grupo Sham. La expresión Hsp27 en el grupo BLM (1,40 ± 0,20) fue significativamente mayor (p = 0,018)

que en el grupo Sham (1,06 ± 0,11), mientras que su expresión en el grupo BLM + O3 (1,10 ± 0,14) resultó

significativamente menor que el grupo BLM (p = 0,047) pero sin mostrar diferencias significativas (DNS) con

el grupo Sham (p = 0,465).

Figura 43.- Expresión de HSP27 entre Sham vs BLM vs BLM+O3.


67

Vegfa

No se observaron diferencias significativas en la expresión de Vegfa entre el grupo Control y el grupo Sham. No hubo diferencias significativas de la expresión de Vegfa entre los distintos grupos: BLM (1,05 ± 0,05), Sham (1,03 ± 0,09) y BLM + O3 (1,12 ± 0,20).

Nfkb

No se observaron diferencias significativas en la expresión de Nfkb entre el grupo Control y el grupo Sham. La expresión de Nfkb en el grupo BLM (1,33 + 0,13) fue significativamente mayor (p = 0,009) que en el grupo Sham (1 + 0,11). La expresión en el grupo BLM + O3 (1,11 + 0,22) mostró DNS con el grupo BLM y con el grupo Sham.

IL6

Figura 44.- Expresión de Vegfa entre Sham vs BLM vs BLM+O3.

Figura 45.- Expresión de Nfkb entre Sham vs BLM vs BLM+O3.


68

IL6

Se observaron diferencias significativas en la expresión de IL6 (1,97 + 0.37 vs 1 + 0,22; p = 0,004)

entre el grupo control y el Sham. La expresión de IL6 en el grupo (1,08 + 0,24) mostró DNS con el grupo

Sham (1,02 + 0,17). La expresión en el grupo BLM + O3 (1.84 + 0,38) resultó significativamente mayor que

en el grupo BLM (p = 0,016) y que en el grupo Sham (p = 0,009).

Col4

Se observaron diferencias significativas en la expresión de Col4 (1,2 + 0.19 vs 0,99 + 0,10; p=

0,015) entre el grupo Sham y el control. La expresión de Col4 en el grupo BLM (1,78 + 0,26) mostró

diferencias estadísticamente significativas (p = 0,004) con el grupo Sham (1,01 + 0,15). La expresión en el

grupo BLM + O3 (2 + 0,48) mostró DNS con el grupo BLM pero resultó significativamente mayor que el

grupo Sham (p = 0,006).

Figura 46.- Expresión de IL6 entre Sham vs BLM vs BLM+O3.

Figura 47.- Expresión de Col4 entre Sham vs BLM vs BLM+O3.


69

IL1

Se observaron diferencias significativas en la expresión de IL1 (2,88 + 0,40 vs 1+ 0,14; p= 0,004)

entre el grupo Sham y el grupo control. La expresión de IL1 en el grupo BLM (0,49 + 0,09) fue

significativamente menor (p = 0,006) que en el grupo Sham (1,06 + 0.19). La expresión en el grupo BLM +

O3 (1,09 + 0,28) resultó significativamente mayor que en el grupo BLM (p = 0,006) pero con diferencias no

significativas (DNS) con el grupo Sham.

Tgfb

Se observaron diferencias significativas en la expresión de Tgfb (0,17 + 0,04 vs 1 + 0,12; p = 0,004)

entre el grupo Sham y el Control. La expresión de Tgfb en el grupo BLM (14,44 + 2,50) fue significativamente

mayor (p = 0,006) que en el grupo Sham (1+ 0,20). La expresión en el grupo BLM + O3 (19,81+ 4,45) resultó

significativamente mayor que en el grupo BLM (p = 0,025) y que el grupo Sham (p = 0,006).

Figura 48.- Expresión de IL1 entre Sham vs BLM vs BLM+O3.

Figura 49.- Expresión de Tgfb entre Sham vs BLM vs BLM+O3.


70

VI.- DISCUSIÓN


71

La FPI es una enfermedad pulmonar progresiva, que afecta de forma importante a la cantidad y a

la calidad de vida de los pacientes considerándose un problema de “homeostasis tisular alterada” y

“comunicación aberrante” entre distintas células del pulmón (26). Existen limitadas opciones terapéuticas

en la actualidad, sin que se haya descrito un tratamiento médico eficaz que pueda frenar o cambiar el curso

evolutivo de la misma y evitar su fatal progresión. El pobre pronóstico de los pacientes con FPI y las escasas

opciones terapéuticas demandan un esfuerzo mayor en el campo de la investigación traslacional”.

Este trabajo recoge varias de las recomendaciones para investigación en FPI recientemente

propuestas en un workshop de National Heart Lung and Blood Institute – NHLBI (115) como son: 1) el

estudio de nuevos tratamientos durante las fases de fibrogénesis y de inicio de la fase inflamatoria, 2) el

estudio de los cambios en la matriz extracelular y la histología de la arquitectura pulmonar, 3) caracterizar

y explotar vías endógenas que inhiban la inflamación y la fibrosis y 4) realizar estudios génicos para

identificar nuevas dianas que influencien el desarrollo de la FPI.

En este sentido, los modelos experimentales de enfermedad son una gran herramienta de trabajo

para la investigación traslacional siempre que se realicen bajo la estricta regulación de la normativas

internacionales de uso de animales de experimentación y con el máximo cumplimiento de las conocidas 3

R, descrita por los biólogos ingleses, Russel y Burch, en su libro “The Principle of Humane Experimental

Technique” en la década de los 60 y que hacen referencia a los métodos de reemplazo, reducción y

refinamiento. Las alternativas de reemplazo aluden a métodos que eviten o sustituyan el uso de animales

que incluyen tanto los reemplazos absolutos (es decir, sustituir animales por modelos informáticos), como

los reemplazos relativos (es decir, sustituir vertebrados, por animales con una menor percepción del dolor,

como algunos invertebrados). Las alternativas de reducción aluden a cualquier estrategia que tenga como

resultado el uso de un menor número de animales para obtener datos suficientes que respondan a la

cuestión investigada, o la maximización de la información obtenida por animal, para así limitar o evitar

potencialmente el uso posterior de otros animales, sin comprometer el bienestar animal. Las alternativas

de refinamiento aluden a la modificación de la cría de animales o de los procedimientos para minimizar el

dolor y la angustia, así como para mejorar el bienestar de los animales utilizados en la ciencia desde su

nacimiento hasta su muerte. Así, siguiendo el segundo principio “alternativas de reducción”, en el grupo

control en vez de emplear 6 pulmones de 6 animales distintos, decidimos analizar por separado pulmones

derechos e izquierdos de 3 animales (6 pulmones igualmente) minimizando el número de animales. Por el

mismo motivo, aunque la mayoría de las publicaciones con modelos experimentales de ozonoterapia

incluyen un grupo control con oxígeno sin ozono, nosotros decidimos no incluirlo. En todos esos estudios,

el grupo de oxígeno muestra menor generación inicial de radicales libres y, por consiguiente, una ausente

(ocasionalmente mínima) inducción de los sistemas antioxidantes y una nula acción protectora en los muy

variados modelos estudiados.

El modelo de desarrollo de fibrosis pulmonar en ratas mediante la instilación orotratraqueal (IOT)

de bleomicina utilizado por nuestro grupo, ha demostrado ser un buen modelo experimental dada la: 1)

aparición de lesiones pulmonares similares a las observadas en los enfermos con FPI en un grado

significativamente mayor que el observado en el grupo SHAM, 2) pérdida de peso de los animales en

relación con la instauración de la enfermedad, 3) ausencia de mortalidad entre los animales de los grupos

tratados y 4) expresión significativa de los genes relacionados con la fibrosis pulmonar como son Hsp27,

Nfkb, IL6, IL1, Tgfb y Col4. Además, dicho modelo cumple con las 3 R descritas en cuanto que no existen

alternativas de reemplazo y que se han extremado las alternativas de reducción del número de animales y


72

las técnicas de refinamiento durante la realización de los procedimientos y durante el sacrificio de los

animales. Por todo ello, podemos dar por cumplido el primer objetivo de nuestro trabajo de “desarrollar un

modelo experimental válido en ratas de fibrosis pulmonar inducida con bleomicina”. En este sentido,

a pesar de ser un buen modelo experimental pensamos que, desde un punto de vista traslacional, el modelo

puede ser mejorable a la hora de mantener de forma crónica el proceso de fibrosis pulmonar para que se

asemeje más a lo que ocurre en la FPI en humanos, de forma que permita ensayar diferentes alternativas

terapéuticas de forma más prolongada, modelo en el que ya estamos trabajando.

Por otra parte, se ha demostrado la capacidad de la ozonoterapia por vía sistémica (96-100) de

modular el sistema inmunológico, el equilibrio pro/antioxidante y los procesos de inflamación y reparación

del organismo, con un efecto general de “regulación” que tiende a la recuperación de la homeostasis del

individuo cuando se utiliza de forma progresiva y mantenida. Se sabe que los procesos de óxido-reducción

intracelular y las defensas frente a los mismos están presentes y regulados genéticamente en la fibrosis

pulmonar, y que se inician desde las primeras fases de la lesión. De esta forma, en el pulmón con lesiones

fibróticas se produce una situación de estrés oxidativo celular crónico que es responsable del daño tisular

irreversible.

La administración de forma progresiva y mantenida, de un potente inductor de los sistemas

antioxidantes como el O3, no utilizado antes en modelos de fibrosis pulmonar, ha paliado de forma

significativa en nuestro modelo esta situación de estrés celular y el daño pulmonar subsecuente asociado a

la fibrosis pulmonar. La disminución significativa de las lesiones pulmonares y del grado de fibrosis en el

grupo tratado con O3 sugiere que la ozonoterapia es capaz de modular los procesos de estrés oxidativo que

conducen a la aparición de la fibrosis pulmonar. Estos hechos adquieren un valor adicional teniendo en

cuenta que: 1) el análisis histológico se realizó de forma ciega respecto al grupo de procedencia de las

muestra y 2) los resultados negativos del análisis microbiológico en todas las muestras descarta que la

gradación del proceso de fibrosis observado entre los distintos grupos pudiera haberse debido a infecciones

intercurrentes. En este sentido, damos también por cumplido el segundo objetivo de nuestro trabajo de

“valorar si el tratamiento con ozono disminuye el daño pulmonar en un modelo experimental de

fibrosis pulmonar inducido por bleomicina”.

La presencia de cambios histológicos en el grupo SHAM con un leve engrosamiento de las paredes

alveolares y un grado de fibrosis pulmonar significativamente superior al de los animales controles, así como

la expresión significativa de los genes relacionados con la fibrosis, creemos que tiene relación con la

administración del suero fisiológico a través de la tráquea o con la propia ventilación mecánica. No es el

objeto de estudio de esta tesis doctoral, pero desde luego abre un interesante camino de estudio en este

campo.

Los resultados observados en los cambios de expresión génica, con aumento en el grupo de BLM

y significativa reducción en el grupo de BLM+O3 de la expresión de los genes descritos en la FPI, nos

permiten dar por cumplido también el tercer objetivo de nuestro trabajo de “estudiar si la expresión de los

genes analizados se relaciona con el daño pulmonar y su respuesta al tratamiento”.

En este sentido, Hsp27 es una pequeña proteína miembro de la familia de los Heat Shock Protein

capaz de formar largas cadenas que actúan como chaperonas involucradas en el plegado y la re-

naturalización de las proteínas y en la degradación de aquellas que se han desnaturalizado de manera


73

irreversible. Entre sus acciones más destacadas se encuentran: 1) su capacidad para modular las ROS y

estimular la expresión de GPX actuando entonces como un citoprotector, 2) inhibir la apoptosis y proteger

a los filamentos de actina de la fragmentación, así como, 3) tener un papel esencial en la diferenciación de

los tejidos y en la termotolerancia y en la citoprotección bajo condiciones de estrés y oxidación. Sin embargo,

a pesar de sus propiedades protectoras Wettstein G et al. (116) describieron que esta proteína está

directamente relacionada con la FPI y que su inhibición bloquea el desarrollo en la fibrosis pulmonar. De

hecho, otros autores como Vidyasagar (117), la señalan como un biomarcador de enfermedad y una

potencial diana terapéutica. Una posible explicación a todos estos hallazgos podría ser la existencia de un

efecto diferencial de Hsp27, con mayor acción o sobre expresión en fibroblastos y miofibroblastos

(disminuyendo su apoptosis y favoreciendo su perpetuación más allá de acabado el proceso de reparación)

y con un menor efecto o sobreexpresión sobre las CEA (y por tanto con menor acción protectora sobre las

mismas). En nuestro estudio, hemos podido observar que la Hsp27 se expresa de forma significativa en el

grupo de BLM y que el tratamiento con O3 disminuye su expresión hasta niveles normales lo que indica que:

o bien esta proteína efectivamente está directamente implicada en el desarrollo de la FP y que el efecto

protector del O3 reduce su expresión contribuyendo a la disminución del grado de fibrosis pulmonar, o bien

Hsp27 se expresa ante el daño pulmonar inducido por fibrosis en un intento por proteger a las células del

daño oxidativo, de forma que su expresión se disminuiría con el O3 al disminuir éste el estrés oxidativo y la

lesión pulmonar. Esta segunda hipótesis, se ve apoyada por dos trabajos de nuestro grupo de investigación.

El primero corresponde a un estudio con DNA microarrays del rechazo crónico (RC) en el trasplante

pulmonar (118) en el que se concluyó que Hsp27 protege el citoesqueleto del RC e inhibe la apoptosis. El

segundo estudio, sobre los efectos del O3 sobre el rechazo crónico del trasplante pulmonar, fue financiado

por una beca del ISCIII (PI 10/01485) y motivo de una Tesis Doctoral Europea cuyos resultados están

pendientes de publicación; en él se observó que en los animales tratados con O3 la expresión de Hsp27

estaba también disminuida, como muestra del efecto antioxidante con carácter reparador sobre la

sobreexpresión de estas proteínas. Por estos motivos, pensamos que para averiguar cuál es el papel real

de Hsp27 en la FPI se requiere de más estudios, en los que nuestro grupo está en la actualidad trabajando.

Nfkb es un factor de transcripción nuclear con importante actividad proinflamatoria que, una vez

activado, se traslada al núcleo donde estimula la expresión de genes implicados en una amplia variedad de

funciones biológicas, incluida la síntesis de citocinas proinflamatorias como IFNg, TNFα e IL-8. Nfkb se

activa por numerosos estímulos intracelulares y extracelulares como son las citocinas, RLO, radiación

ultravioleta y productos bacterianos o víricos. Su activación se ha asociado con numerosas enfermedades

inflamatorias y se ha podido comprobar que existe un incremento de su activación en la fibrosis pulmonar

(119). Como se comentó en el apartado 3.3, el O3 (a través de segundos mensajeros) es capaz de activar

Nrf2, que a su vez induce la transcripción de elementos de respuesta AO con la posterior producción de

enzimas antioxidantes como SOD, GPX, HSP-70 o hemo oxigenasa-1 (HO-1 o HSP-32) (98-100). Por otra

parte, se ha descrito que la activación de Nrf2 está implicada en la reparación del DNA (120) y es capaz de

disminuir los efectos proinflamatorios de Nfkb (121). Así, el aumento de Nrf2 durante la ozonoterapia podría

justificar su efecto positivo sobre la FPI. En nuestro estudio observamos un incremento significativo de la

expresión de Nfkb en el grupo tratado con BLM respecto al grupo Sham, demostrando su relación

proinflamatoria en la fibrosis pulmonar. A su vez, el grupo tratado con BLM+O3 mostró menor expresión de

Nfkb. Y si bien esta disminución no fue estadísticamente significativa respecto al grupo de BLM, sí fue lo

suficiente como para que tampoco mostrara diferencias significativas con el grupo Sham. Esto evidencia

que el tratamiento con O3 ejerció una clara tendencia a la regulación (en este caso disminución) de la

sobreexpresión de Nfkb.


74

El pulmón fibrótico se asemeja marcadamente a un órgano "supercicatrizado", sugiriendo que la

fibrosis podría visualizarse como un proceso de reparación "excesivo" probablemente como resultado de la

inflamación continuada. De hecho, un número considerable de estudios ha examinado la interacción entre

células inflamatorias y células del parénquima pulmonar, principalmente fibroblastos, ilustrando la

relevancia de estas interacciones en la patogénesis de la fibrosis pulmonar. Así, el incremento en el depósito

de fibras colágenas en el intersticio pulmonar que caracteriza a esta enfermedad, ocurriría como resultado

de la activación de los fibroblastos por moléculas liberadas por varias células inflamatorias (citoquinas),

particularmente por macrófagos alveolares y linfocitos.

En este sentido, la IL-6 es una glicoproteína de pequeño tamaño (21 KDa), una citoquina producida

por las células del sistema inmunológico innato como potente inductor de la fase de respuesta aguda. Su

acción proinflamatoria y de su acción profibrótica han sido descritas en modelos experimentales de fibrosis

pulmonar inducida con BLM (122). La IL-6 ha sido también conocida como interferon-R2 (IFN-R2) o B-cell

stimulating factor-2 (BSF-2) y es idéntica al factor estimulante de hepatocitos (HSF), lo que prueba su

capacidad para estimular los hepatocitos y producir proteínas de la fase aguda, como el fibrinógeno y la

alfa-1-antitripsina entre otros (123).

La IL-1 otra citoquina producida por los macrófagos activados, posee numerosas actividades

biológicas, como son la proliferación de linfocitos T a través de la liberación de IL-2, la proliferación y

diferenciación de los linfocitos B, actuar como factor de crecimiento de los fibroblastos, como pirógeno

endógeno, y liberar prostaglandinas y colagenasas. Se ha descrito que los macrófagos alveolares producen

IL-6 e IL-1 y los fibroblastos pulmonares producen IL-6. A su vez, la producción de IL-1 por los monocitos

regula la expresión de IL6 por los fibroblastos pulmonares, de forma que ambas están íntimamente

entrelazadas (124).

Se ha descrito que Tgfb-1, además, es capaz de estimular directamente a los fibroblastos y

miofibroblastos e inducir fibrosis pulmonar (125) por lo que sus actividades están íntimamente relacionadas

con la generación de enfermedad obstructiva pulmonar e hipertensión pulmonar. Es interesante destacar

que, en un gran número de células, el Tgfb-1 es capaz de provocar una respuesta de estrés oxidativo la

cual parece estar asociada con la actividad del factor de transcripción TIEG (Tgfb-1-inducible early-response

gene) (126).

El gen Col4a1 se localiza en el brazo largo del cromosoma 16 (16q12.5) y codifica una proteína de

la membrana basal que actúa como constituyente estructural de la matriz extracelular, el colágeno tipo IV.

Dicho colágeno se encuentra implicado en la diferenciación de las células epiteliales, la organización de la

membrana basal, la morfogénesis de los vasos sanguíneos y sus alteraciones se han asociado con múltiples

enfermedades: angiopatía hereditaria, nefropatía, aneurismas y calambres musculares, sistema nervioso

central con vasos de pequeño calibre y con hemorragia. Las ratas que recibieron un tratamiento previo con

un inhibidor específico para la enzima inducible que produce óxido nítrico (iNOS) mostraron menores niveles

de expresión de colágeno Tipo IV. Por otro lado, la señalización generada por el óxido nítrico potencia la

expresión de Tgfb1, TIMP-1 y HSP47 en fibroblastos pulmonares que juegan un papel importante en la

fibrosis pulmonar.

Conviene puntualizar que la capacidad del organismo para articular una reacción inflamatoria en

respuesta a agresiones tisulares es esencial para la supervivencia del organismo. De modo que para

comprender la patogénesis de la fibrosis pulmonar es fundamental entender las causas que alteran una

reacción, esencialmente homeostática, como es la inflamación. De hecho, la FPI es la expresión de la


75

enfermedad como la continuación de los procesos fisiológicos más allá de los límites requeridos para una

función homeostática. Tan pronto como el pulmón es dañado, se inician mecanismos de reparación, donde

las mismas citoquinas y factores de crecimiento juegan un papel central en la orquestación de estos

mecanismos de inflamación-reparación, en constante tendencia al desequilibrio para producir o bien

enfermedad o bien reparación.

Es probable que el incremento en la expresión de IL-1, IL-6, Tgfb-1 y Col4 observado en los

animales tratados con O3 esté en relación con esa delicada línea de equilibrio entre inflamación y reparación

que hacen que el órgano dañado se recupere o muera; es decir, que el incremento en la expresión de estos

genes junto a la significativa disminución del grado de fibrosis y de lesión pulmonar inducido por el O3, no

descrito con anterioridad en un modelo de fibrosis, pueda tener relación con el desequilibrio que se inclina

hacia el efecto reparador del tejido, por varios caminos como podrían ser, 1) la inducción de apoptosis de

las células lesionadas a través del aumento de expresión de citoquinas, la activación de macrófagos para

la fagocitosis de los restos celulares, 3) la estimulación de la división y crecimiento celular y 4) la producción

de nuevo colágeno en aras de regenerar el tejido dañado. Este sistema de interacción entre citoquinas y

factores de crecimiento entre c inflamatorias y células estructurales es extraordinariamente complejo y,

hasta hoy, sólo se ha descifrado una mínima parte de su modus operandi. Es aparente que la instrucción

final que una célula recibe depende de cómo es articulado el mensaje en cuanto al número de citoquinas

participantes, las interacciones entre ellas, su secuencia de acción y modo de presentación.

La evolución del ser humano ha conllevado un precio biológico considerable. De forma que cuando

un ser de estirpe filogenética inferior pierde una extremidad, como el caso de la rana o del lagarto ésta se

regenera en su totalidad. Los humanos, como otros animales de estirpe filogenética superior, han perdido,

o reprimido, el aparato genético requerido para la regeneración de órganos; poseen, en su lugar, sólo

mecanismos de reparación. Estos mecanismos son eficaces frente a agresiones tisulares moderadas. Sin

embargo, son probablemente inadecuados en situaciones de agresión prolongada asociadas a considerable

destrucción tisular. Tal y como sugirió Shmuel Shoshan, la fibrosis podría ser no más que la segunda mejor

solución, y la única posible, en un organismo o microambiente determinado, al problema creado por la

disrupción de la integridad tisular generado por la fibrosis pulmonar, por cuanto la alternativa a este es la

muerte del individuo.

Finalmente, en nuestro estudio, el tratamiento con O3 ha disminuido de forma significativa el grado

de fibrosis y de lesión pulmonar inducido por la BLM debido a la inducción en el organismo de un efecto

antiinflamatorio, antioxidante y probablemente inmunosupresor a nivel local. Estos resultados abren una

nueva alternativa de tratamiento y/o prevención de la fibrosis pulmonar. La expresión de los genes

estudiados Hsp21, Nfkb, IL-1, IL-6, Col4 y Tgfb1 podrían servir como marcadores de respuesta al

tratamiento con O3, o como potenciales dianas para su modulación terapéutica. Dado que administrado en

concentración y vía apropiada el O3 no produce efectos adversos, es económico y fácil de administrar,

desde el punto de vista traslacional supone una nueva opción potencialmente aplicable en esta patología

donde los tratamientos no quirúrgicos son casi inexistentes hasta la fecha. Los futuros estudios

experimentales y los ensayos clínicos que devengan nos ayudarán a confirmar esta singular aplicabilidad

terapéutica del O3 en la fibrosis pulmonar.


76

VII.- CONCLUSIONES.


77

Primera.- El modelo de desarrollo de fibrosis pulmonar en ratas mediante la instilación orotratraqueal de bleomicina utilizado por nuestro grupo, ha demostrado ser un buen modelo experimental de estudio de la enfermedad, dada: 1) la aparición de lesiones pulmonares similares a las observadas en los enfermos con FPI en un grado significativamente mayor que el observado en el grupo SHAM, 2) la pérdida de peso de los animales en relación con la instauración de la enfermedad, 3) la ausencia de mortalidad entre los animales de los grupos tratados y 4) la expresión significativa de los genes relacionados con la fibrosis pulmonar como son Hsp27, Nfkb, IL6, IL1, Tgfb y Col4 en el grupo de animales tratados con BLM.

Segunda.- La administración de ozonoterapia de forma progresiva y mantenida, no utilizada antes

en modelos experimentales de fibrosis pulmonar, ha disminuido de forma significativa

el grado de fibrosis pulmonar y el daño pulmonar subsecuente asociado a la fibrosis

pulmonar.

Tecera.- Estos hechos, adquieren un valor adicional teniendo en cuenta que: 1) el análisis

histológico se realizó de forma ciega respecto al grupo de procedencia de las muestra

y 2) los resultados negativos del análisis microbiológico en todas las muestras descarta

que la gradación del proceso de fibrosis pulmonar observado entre los distintos grupos

pudiera haberse debido a infecciones intercurrentes.

Cuarta.- La administración de O3, de forma progresiva y mantenida, ha disminuido de forma

significativa la expresión de Hsp27, ha reducido la sobreexpresión de Nfkb hasta

niveles cercanos a los del grupo Sham y ha incrementado significativamente la

expresión de IL6, IL1, Col4 y Tgfb1.

Quinta.- Hsp27 se expresa de forma significativa en el grupo de BLM y el tratamiento con O3

disminuye su expresión hasta niveles normales lo que indica que o bien este gen está

directamente implicado en el desarrollo de la FP y que el efecto protector del O3 reduce

su expresión contribuyendo a la disminución del grado de fibrosis pulmonar, o bien, que

la Hsp27 se expresa ante el daño pulmonar inducido por la fibrosis en un intento de

proteger a las células del daño oxidativo, de forma que su expresión se disminuiría con

el O3 al disminuir éste el estrés oxidativo y la lesión pulmonar.


78

Sexta.- En nuestro estudio observamos un incremento significativo de la expresión de Nfkb en

el grupo tratado con BLM, demostrando su relación proinflamatoria en la fibrosis

pulmonar. El grupo tratado con BLM+O3 mostró menor sobreexpresión de Nfkb y, si

bien las diferencias con el grupo de BLM no fueron significativas, tampoco lo fueron con

el grupo Sham, evidenciando una clara tendencia a la normalización de la expresión de

Nfkb

Séptima.- Es probable que el incremento en la expresión de IL-1, IL-6, Tgfb-1 y Col4 observado

en los animales tratados con O3 esté en relación con esa delicada línea de equilibrio

entre inflamación y reparación que hacen que el órgano dañado se recupere o muera.

Es decir, que el incremento en la expresión de estos genes junto a la significativa

disminución del grado de fibrosis y de lesión pulmonar inducida por el O3 (no descrito

con anterioridad en un modelo de fibrosis) pudiera tener relación con un desequilibrio

que se inclina más hacia el efecto reparador del tejido, por varios caminos como podrían

ser: 1) la inducción de apoptosis de las células lesionadas, o de los fibrocitos

excedentes, a través del aumento de expresión de citoquinas, 2) la activación de

macrófagos para la fagocitosis de los restos celulares, 3) la estimulación de la división

y crecimiento de las células epiteliales alveolares y 4) la producción de nuevo colágeno

en aras de regenerar el tejido dañado.

Octava.- La expresión de los genes estudiados Hsp21, Nfkb, IL-1, IL-6, Col4 y Tgfb-1 podría

servir como marcador tanto de la evolución de la fibrosis pulmonar, como de la

respuesta al tratamiento con O3.

Novena.- Dado que administrado en concentración y vía apropiada el O3 no produce efectos

adversos, es económico y fácil de administrar, desde el punto de vista traslacional

supone una nueva opción potencialmente aplicable en la fibrosis pulmonar, donde los

tratamientos no quirúrgicos son casi inexistentes y, hasta la fecha, sólo ofrecen una

mejoría limitada en cuantía y duración. Los futuros estudios experimentales y los

ensayos clínicos que devengan nos ayudarán a confirmar esta singular aplicabilidad

terapéutica del O3 en la fibrosis pulmonar.


79

VIII. BIBLIOGRAFIA


80

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