Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

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Tesis de Posgrado

Efectos de la interacción entreEfectos de la interacción entrecélulas tecales y granulosas sobrecélulas tecales y granulosas sobrela esteroidogénesis en el folículola esteroidogénesis en el folículo

ovárico porcinoovárico porcino

Lischinsky, Adriana Leonor

1983

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Lischinsky, Adriana Leonor. (1983). Efectos de la interacción entre células tecales y granulosassobre la esteroidogénesis en el folículo ovárico porcino. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1775_Lischinsky.pdf

Cita tipo Chicago:Lischinsky, Adriana Leonor. "Efectos de la interacción entre células tecales y granulosas sobrela esteroidogénesis en el folículo ovárico porcino". Tesis de Doctor. Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1983.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1775_Lischinsky.pdf

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

EFECTOS DE LA INTERACCION ENTRE CELULAS

TECALES Y GRANULOSAS SOBRE LA ESTEROIDOGENESIS

EN EL FOLICULO OVARICO PORCINO

AUTOR: Adriana Leonor Líschínsky

DIRECTOR: Dr. David Thomas Armstrong

Tesis presentada poro opfor oI TI'fqu de

DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICAS

-I983­1775qa.

AGRADECIMIENTOS

Quiero expresar mi gratitud al Dr. David T. Armstrong

por la oportunidad que me dio de trabaiar en su Laboratorio, y

por su conseío y apoyo durante el curso de estos estudios. Tam­

bién deseo expresar el respeto y admiración que siento por él

como cientifico y como ser humano.

No tengo palabras para expresar mi gratitud al Dr.

Carlos P. Lantos por su apoyo incondicional en cada etapa de

mis estudios. Desde ¡975 en que me permitió trabaíar a su lado

por algunos meses hasta el presente ha sido la persona ala que

he recurrido siempre que se me presentara un problema, y de

quien siempre recibi especial atención.

Agradezco especialmente al Dr. Ronald Hobkirk por su

conseio asi como por permitirme usar las facilidades de su Labs

ratorio para la cromatografia en DEAE-Sephadex. Sin su ayuda,

todo el trabaío en coníugados esteroideos hubiera sido imposible

de realizar.

Estoy también agradecida a distintos miembros del MRC

Group in Reproductíve Biology de Canadó por su ayuda técnica

asï como por valiosïsímas discusiones.

Agradezco al Dr. Eduardo Charreau por su estímulo pa­

ra que este trabaío fuera presentado.

Finalmente quiero agradecer a mis padres por ser como

son. Nada hubiera sído posible sin su aliento y apoyo íncondí ­

cional.

INDICE

pógina

AGRADECIMIENTOS.H... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

INDlCE....°...v.....,............ ....... ..........¡VABREVIATURASHHun“........ ....... .... v¡¡1.0 INTRODUCCION..... .. .. .t.y. . ..... .. . ..

l.l Estructura del foliculo ovórico y crecimientofolicular............“........c..u.... i1.2 Caminos para la esteroidogénesis en las góna­

51.3 Biosintesis de esteroides en el foliculo ovóri­

co 91.3.1 Unión de gonadotrofinas a células teca­

les y granulosas......°................. . . . . .. 91.3.2 Capacidad esteroidogénica de células

granulosasl....°.b....°. 0I OfiOOI ICOOBÓOOICUQOUI1.3.3 Capacidad esteroidogénica de prepara­

cionestecales..9..s......................... 131.3.4 Factores intraovóricos enla regulación

de la esteroidogénesis folicular . . . . . . . . .. ió1.3.4.1 Esteroides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. ió1.3.4.2 Factores no esteroideos . . . . . . . . .. 19

1.3.5 Resumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 201.4 Formación y probable rol de los sulfatos de

esteroides en las glóndulas esteroidogénicas... 201.5 Propósitos de este trabaio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 28

2.0 MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 3l

2.] Animales . . yo. . . . . . . . . . . . a . . s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3]2.2 Aislamiento de células tecales y granulosas.... 3]2.3 Condiciones generales de cultivo................ 322.4 Determinación de esteroides . . . . . . . . . . . . . . . . . . 352.,5 Determinación de proteinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 392.6 Extracción de esteroides de medio de cultivo.. 40

página

2‘7 Estudio del metabolismo de andrógenos . . . . . . . . . . . . .. 412.7.] Condiciones de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 4]2.7.2 Preparación de las columnas de DEAE­

Sephadex . . . . . . . . . er . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 422.7.3 Cromatografía en DEAE-Sephadex A 25...... 432.7.4 Hidrólísis de sulfatos de esteroides . . . . . . . . .. 442.7.5 Cromatografíaen capa delgado.... .. . . 442.7.6 Cromatografía liquida de alta presión....... 452.7.7 Reducción con borohidruro de sodio . . . . . ..... 47297.8 Oxidación con el reactivo de Jones......... 47267.9 Determinación de la actividad de sulfo­

transferasa....”...nunuunn................ 482.8 Efecto de testosterona sobre la utilización de

progesteronapor células granuiosas...“............. 492.9 Análisisde los resultados.............................. 50

3_o RESULTADOS...“...o...............n....°...9.............. 51

3.] Rol de las células granulosas enla sintesis deandrógenos....................°........9................ 5]3.1.1 Efecto de medio usado por células gra­

nulosas sobre la sintesis tecal de andró­

5]3.1.2 Efecto de medio usado extraido con car­

bón-dextrón sobre Ia sintesis tecaI deandrógenos..,........7........‘.H......“........ 55

3.1.3 Concentración de esteroides en mediousadopor células granulosas................. 58

3.1.4 Efecto de C2¡-esteroides sobre la sinte­sistecaldeandrógenos....s. ó]3.2 Rol de las células granulosas en el metabolis­

mo de andrógenos. . . . u. . a. 643.2.1 Capacidades relativas de los tipos ce­

lulares foliculares para sintetizar an­drógenos y estrógenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 64

3.2.2 Capacidades relativas de los tipos ce­lulares foliculares para metaboiizarandrógenos.... . . . . . . . . . . . . . . . t,. . . . . . . . .. 67

3.2.3 Metabolismo de andrógenos por célu ­lasgranulosas.... 683.2.4 Actividad de sulfotransferasa en cé ­

Iulas granulosas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 70

página

3.2.5 Estudios tendientes a la identificaciónde los metabolitos coniugados por lascélulas granulosas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 73

3.3 Efecto de la teca sobre la sintesis de proges­terona por las células granulosas . . . . . . . . . . . . . . . .. 863.3.] Efecto de los andrógenos sobre la acu­

mulación de progesterona por célulasgranulosas....... . . . . . . . .. . . . . . . .. . . . 86

3.3.2 Efecto de la testosterona sobre el me­tabolismo de progesterona . . . . . . . . . . . . . . .. 92

3.3.3 Efecto de 17 [5 -estradiol sobre la sin­tesis de progesterona. .. . .. . .. . . . 94

3.4 Mecanismo por el cual los andrógenos inhi­ben la sintesis de progesterona por célulasgranulosasen respuestaa FSH...... 963.4.] Relación temporal entre la acumula­

ción de progesterona y l7I5-estradiolen cultivo en presencia de FSH y tes­tosterona.... ................ 96

3.4.2 Efecto de un inhibidor de la aromata­sa sobre la inhibición dela sintesisde progesterona por testosterona........ 99

3.4.3 Efecto de testosterona sobre la sinte­sis de progesterona estimulado por di­butiril-AMP ciclíco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 102

3.4.4 Efecto de los andrógenos sobre la sin­tesis de pregnenolono por c'elulas gra­nulosas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . lOó

4.0 DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 115

4.1 Rol delas células granulosas enla sintesisde andrógenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 115

4.2 Capacidades relativas de los tipos celularesfoliculares aislados y en recombinación pa­ra sintetizar andrógenos y estrógenos......... H9

4.3 Sintesis de Sulfatos de andrógenos . . . . . . . . . . . .. 1224.4 Efecto de la teca sobre la sintesis de proges­

terona por las células granulosas . . . . . . . . . . . . .. 126

5.0 CONCLUSIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 138

6.0 BIBLIOGRAFIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 144

ABREVIATURAS

A4A

4 a A

AMP cíclico

Androsterona

(Bu)2cAMP

C19-Esteroídes

C21-Esferoídes

DEAE-Sephadex

Dehídroepíandrosterona

(DHEA)

D.l.

Dïhídrotesfosferona (DHT)

Epíandrosferona

E.S.

Etíocolanolona

HEPES

HPLC

«4 ,[A -Androsfenedlona.

4-Acefoxí-androstenedíono.

3', 5'-Adenosína monofosfato cïclíco.,­3 0*-Androsfan-3 Ci—o|-Ï7-ona.

N6, o2 -d¡bufírí| adenosína 3‘-5'­

monofosfato cíclico.

Esteroides de 19 átomos de carbono.

Esteroides de 2] átomos de carbono.

DíetílaminoetíI-Sephadex.

5-Androsten-3 ¿ol-l7-ona.

Diámetro ínferno.

5 c<_Androstan—17¿'5-ol-3-ona.

5 Al-Androsfan-Ïi ,5 -oI-]7-ona.

Error standard.

5 á-Androstan-3 d-oI-I7-ona.

N-2-Hídroxíefilpíperazína-N'-2­etanosulfóníco.

Cromatografía líquida de alta presión.

vii

M ¡Wedío usado por células gronuloscs

control.

MB ¡Medio usado por células granulosos

estímulodos con FSH.

MEIM Medio Esencial Mínimo.

RIA Rodíoínmunoensoyo.

T Testosterona.

vÍïí

1.0 INTRODUCCION

1.] Estructura del Foliculo Ovórico y Crecimiento Folicular.

La capacidad para la reproducción normal depende

del doble rol del ovario en proveer células germinales maduras

y hormonas esteroideas que regulan su crecimiento y preparan

al tracto reproductivo para el transporte de óvulos y la implan_

tación. Los componentes funcionales más importantes del ova ­

rio maduro son los foliculos y el cuerpo lüteo.

El foliculo ovóríco maduro es una estructura esférica

casi totalmente embebida en la matriz de teíido conectivo del

ovario, pero visible desde la superficie como una vesicula

translúcída (l). Su pared está compuesta por 3 capas:

l) La teca externa, compuesta de bandas concéntricas de fibro­

blastos conectados entre si por tibrillas de colágeno embebi­

das en mucopolisacórido, responsable de la elasticidad de la

pared folicular.

2) La teca interna, formada por una red de fibroblastos en que

están suspendidas células vacuoladas, secretoras de esteroi­

des. Un plexo capilar denso y varios vasos linfáticos pro ­

veen la irrigación sanguinea y drenaíe linfático a las capas

externas de la pared folicular. Este aporte sanguineo es la

fuente de nutrientes necesarios para mantener a las células

granulosas y al ovocito, ya que no existen capilares luego

de la membrana basal que separa a la teca interna de las

células granulosas.

3) Las células granulosas, células columnares pseudoestratifi­

cadas que encierran una cavidad llena de fluido donde se

encuentra el ovocito. Estas células son muy activas enla

biosintesis de proteinas (2, 3) y serian responsables dela

sintesis de moduladores de ciertas funciones toliculares a­

demós de desempeñar un rol fundamental enla biosintesis

de esteroides.

Una de las caracteristicas notables del ovario es que

desde el nacimiento contiene una cantidad muy grande de cél_u

las germinales no proliferantes, en exceso al número que se n_e

cesitaró durante toda la vida reproductiva. En el humano, al

nacer, el ovario contiene 2.000.000 de ovocitos (4) de los cu_a

les un máximo de 400 ovularó durante todos los años reproduc­

tivos activos. Cada dia un número de foliculos empieza a cre­

cer; aunque las señales que hacen que un determinado folículo

empiece a crecer son desconocidas, una vez que el crecimien­

to es iniciado, estos foliculos continuarón creciendo hasta que

ocurra atresia (degeneración) u ovulación (5, ó).

El crecimiento Folicular está caracterizado por la formación

dela capa granulosa, aparentemente mediado por influencias

inductivas locales del ovocito (7). Esto está seguido por la a­

parícíón de la membrana basal, aparentemente segregada por

la capa de células granulosas, y lo organización de células e_s

tromales circundantes en una capa tecal externa a la membrana

basal El desarrollo folicular posterior involucra crecímie_n

ta del ovocito y proliferación de células tecales y granulosas.

Los cambios en estas células parecen ser interdependíentes y

secuenciales, parcialmente coordinados con, y dependientes

de, los cambios ciclicos en secreción ganadotrófica (8)..

Ovulación y luteínización son los estadios terminales de

diferenciación de foliculos grandes, preovulatarios. En respues

ta al pico gonadotrófico, uno o más foliculos, dependiendo de

la especie, presentan hipertrofia de células tecales y granulg

sas (9), disolución de la membrana basal, ruptura del contacto

célula-célula entre células granulosos (10), iniciación de me­

iosís en el ovocito (ll). El folículo distendido se rompe, y el

óvulo es expulsado hacia la cavidad abdominal, tomado porlos

tubos uterinos y transportado al útero. Elfoliculo que se rompe

al ovular, se llena con sangre. Las células tecales y granulosas

proneranrópidamente, yla sangre coagulada esreemplazada

por célulaslüteas, ricas en lïpidos, esteroidogénicamente ac­

tivas. Si ocurre implantación, el cuerpo lúteo persiste. Si no,

empieza a degeneransíendo reemplazado por el cuerpo albican­

te.

Las hormonas esteroideas, secretadas por células teca

les y granulosas en respuesta a estimulación gonadotrófica, es­

tón involucradas en varios aspectos de la diferenciación de los

componentes delfoliculo ovórico y son esenciales para el man­

tenimiento de lastunciones gonadaleL También son componen­

tes importantes de mecanismos de retroalimentación que regulan

la secreción gonadotrófica mediante acciones sobre el Hstema

hipotólamo-hipofisario (12a). Estudios mós recientes han demos­

trado que los esteroides ovóricos también eiercen acciones sig­

nificativas a nivel de las células esteroidogénicas influyendo

en el tipo y extensión de su respuesta a la estimulación gona­

dotrófica (12 b). Debido a esto es importante entender el control

de su biosintesis.

1.2 Caminos para la Esteroidogénesis en las Gónadas.

Los caminos para la biosintesis de esteroides ganada ­

les estón bien establecidos; los caminos y mecanismos enzimóti_

cos han sido reseñados por Engel (13). Se esta de acuerdo en

que existen caminos esencialmente similares en todo teíido es­

teroidogénico (gónadas, corteza adrenal y placenta) para la

formación de los precursores comunes a estos teiidos (incluyerl

do ácido mevalónico, escualeno, colesterol y pregnenolona).

Alguna divergencia en caminos ocurriria luego, en el camino

hacia los andrógenos, con pregnenolona siendo sometida 0174­

hidroxilación directa y ruptura de cadena lateral (por C17-2o

líasa) (camino A5), antes de la conversión mediante el sistema

3 (5 -hidroxiesteroide deshidrogenasa- A, isomerasa, o siendo

convertida a progesterona por medio de este sistema enzimática

antes de experimentar 17 oí -hidroxilación y ruptura dela cade­

na lateral (camino A”).

Androstenediona y testosterona son canvertidas a estro­

na y 17‘",5-estradio|, respectivamente, por una serie de reac ­

ciones integradas que involucran l9-hidroxilación, escisión .del

metilo en carbono lO, y deshidrogenación del anillo A, referi­

das colectivamente como aromatización' Estas reacciones son

catalizadas por una secuencia de enzimas referidas colectiva ­

mente como aromatasa. Los caminos generalmente aceptados pa­

ra la biosintesis de estrógenos estón resumidas enla Figura l.

En lugar de ser secretados directamente, o convertidas

a estrógenos, androstenediona y testosterona pueden experimen­

tar suertes metabólicas distintas dentro de testiculo y ovario.

Estas incluyen saturación de sus anillos A por la Álesteroíde ­

5d reductasa, dando 5 d-androstan-3,l7-diona y 17 A“-hi _

droxi - 54-androstan - 3 - ona (SX-dinidrotestosterona, DHT),

seguido por reducción estereospecifica de sus grupos 3 - ceto

por la 34-hidroxiesteroide deshidrogenasa, a androsterona y

54-androstan-3fl/, 17 5 —diol. Ya que las SOC-reductasas son

aparentemente irreversibles (14) y los componentes con anilla

A saturado no pueden experimentar aromatización (13), el me­

tabolismo intragonadal de androstenediona y testosterona a lo

largo de este camino podria desempeñar un rol regulatorio en

la biosÏntesis de estrógenos, desviando a estos sustratos del ca_

mino de la aromatasa. Ademós, existe evidencia de que ciertos

andrógenos SKI-reducidos son potentes inhibidores de la aroma­

tasa (15, ló), ofreciendo otro mecanismo potencial para la re­

gulación de la formación de estrógenos.

FiguraÏ: ¿1: J: ó:

CaminosparaIabíosïntesisdeestradïolenlasgónadas.

enzimasderupturadecadenalateraldecolesterol.

A....,'\.

3 ‘-—'n¡drox¡estero¡dedeshxdrogenasa/“JS-¡somerasa. 1/:-.'—Ïrwídroxí|asa. IíOSÜ. 17í—hídroxíesteroide-deshídragenose.aromarasa.

nOrmmquOr

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>ZUzOmHIuImZ|wAusG“¡EOrIl..|vqmqumquOZ)|||.|Vmm4z>U_O_.l._u\w

1.3 Biosintesis de Esteroides en el Foliculo Ovórico Porcino.

1.3.] Unión de Gonodotroiinos a Células Tecales y Granulo­

SOS.

Las células granulosas poseen receptores para la hor ­

mona folículo-estimulante (FSH). Células derivadas de foliculos

pequeños (1-2 mm) unen mós FSH que células de foliculos media_

nos (3 —5 mm) y grandes (7 -12 mm) (17). Esta unión resulta

en mayor producción de AMP cíclico (18), y dibutiril AMP cicli­

co puede simular los efectos esteroidogénicos de FSH en las cé ­

lulas granulosas (19).

Las células granulosas provenientes de foiiculos antra­

les pequeños no poseen receptores para la hormona luteinízante

(LH); células granulosas derivadas de folicuios de tamaño medi-a

no unen cantidades significativas de gonadotrofina corióníca

humana (hCG; esta gonadotrofína se une alos receptores a LH),

mientras que células provenientes de toliculos grandes unen más

hCG (20, 2], 22).

No se han podido detectar receptores a FSH en células

tecales de las distintas especies estudiados. Sin embargo, el te­

¡ido tecal une hCG; teiido proveniente de foliculos grandes

une mas hCG que el obtenido de foliculos pequeños del mismo

-10­

o de otros ovarios (23).

1.3.2 Capacidad Esteroidogénica de Células Granulosas.

Los primeros estudios sobre biosintesis de esteroides

"in vitroII por células granulosas aisladas fueron realizados

en el ovario porcino, por Bíersing y Carstensen (24, 25). Estos

autores incubaron células granulosas provenientes de Foliculos

de tamaño mediano con distintos intermediarios esteroideos en

Ia cadena biosintética, radioactivos. Sus hallazgos más impor­

tantes fueron:

1.- Las células granulosas contienen 3/5-hidroxiesteroide des­

hidrogenasa y ZOX-hidroxiesteroide deshidrogenasa eficientes.

2.- Las células granulosas tienen baja actividad de ¡WK-hi

droxilasa y C¡7_20 Iiasa y, por Io tanto, son relativamen­

te incapaces de sintetizar andrógenos.

3.- Las células granulosas poseen 175-hidroxiesteroide deshi­

drogenasa (que convierte A4-androstenediona a testoste ­

rona) y aromatasa activas.

La mayor parte de estas actividades enzimóticas fueron

confirmadas independientemente mediante estudios histoquu'mi ­

cos (26).

-1]­

Estudios subsiguientes sobre las capacidades esteroidg

génicas de las células granulosas consistieron enla determina_

ción de las esteroides producidos a partir de precursores endó­

genos. En 1970, Channing (27) informó que las células granulci

sas producian progesterona en cultivo, siendo esta sintesis es­

timulada por FSH y/o LH dependiendo del tamaño de ios folicu_

los de los que provenian.

La incapacidad de las células granulosas porcinas de

sintetizar cantidades apreciables de andrógenos a partir de pr_e

cursores endógenos ha sido confirmada por Tsang y col. (28) y

Evans y col. (29), y está de acuerdo con estudios en casi todas

las especies (para una descripción detallada ver 30).

Aunque las células granulosas parecen ser incapaces

de sintetizar cantidades significativas de andrógenos, pueden

convertir eficientemente andrógenos a estrógenos (28). La ca­

pacidad de convertir testosterona a 17"6 —estradio| cambia du­

rante e| desarrollo folicular. Anderson y col. (31) cultivaron

células granulosas derivadas de foliculos antrales porcinos pe­

queños, medianos y grandes (obtenidos de material de matade­

ro) con o sin andrógenos, Las células granulosas de todos los

tamaños de foliculos secretaron pequeñas cantidades de 17(7 ­

-12­

estradiol. La adición de testosterona o Lá-androstenediona re

sultó en un aumento de 8 a 420 veces en la secreción de estró­

genos. Se observó la menor conversión con células granulosas

provenientes de foliculos pequeños y la mayor con células pro­

venientes de foliculos medianos y grandes.

Adición de FSH iunto con testosterona no produio efe_c

to alguno sobre la secreción de 17 ¿e-estradiol por células gr_a

nulosas de foliculos pequeños y medianos, aunque aumentó la

secreción de estrógenos por células granulosas derivadas de f2

liculos grandes. Esto no puede ser explicado por cambios en los

receptores a FSH, que son menores en número en células granu

losas de Foliculos grandes. Los investigadores lo explicaron

considerando que tal vez el porcentaíe de receptores a FSH a­

coplados a una respuesta que resulta en estimulación de la ac­

tividad de aromatasa es mayor en células de foliculos grandes,

o que la aromatasa no es capaz de responder hasta que las cé­

lulas granulosas se encuentren en un estado mós maduro. Usan­

do un modelo distinto, la cerda prepúber tratada con PMSG

(gonadatrofina de suero de yegua preñada) para inducir el de­

sarrollo folicular, Evans y col. (29) observaron menor conver­

sión de andrógenos a estrógenos al madurar el foliculo, y nin­

gún efecto de las gonadatrofinas sobre la aromatasa. La ausen­

_¡3_

cia de un efecto de FSH sobre la aromatasa parece contrastar

con el rol de FSH enla estimulación dela aromatasa "in vivo“

e "in vitroll en células granulosas derivadas de roedores de la­

boratorio (32, 33)e Sin embargo, no se han llevado a cabo es­

tudios para determinar si en el cerdo, como enla rata, FSH i_n

duce actividad de aromatasa en células granulosas que no han

IIsido expuestas a FSH in vivo".

1.3.3 Capacidad Esteroidogénica de Preparaciones Tecales

Las preparaciones tecales sintetizan cantidades elevg

das de andrógenos (predominantemente A4-androstenediona),

siendo esta sintesis estimulado por LH en todos los estadios del

desarrollo (28, 29). La teca es deficiente en ¡7 ¡’5-hidroxiestí

roide deshidrogenasa y, por lo tanto, incapaz de convertir

grandes cantidades de A4—androstenediona a testosterona (25).

La capacidad del teiido tecal porcino de sintetizar

17 Ï-estradiol depende del estadiodel desarrollo folicular.

Stokiosowa y coli (34) separaron teca interna de foliculos

grandes (diámetro: 10-12 mm), ia dispersaron e incubaron co­

mo monocapas; observaron que la producción de estrógenos por

'células tecales era mayor que la producción por células granu

-14­

losas derivadas de los mismos foliculos.

Usando preparaciones tecales derivadas de foliculos

de tamaño mediano (4-ó mm), Tsang y col. (28) fueron incopg

ces de observar sintesis de 'l7¿"/-estradiol. Evans y col. (29)

observaron que la teca contribuye tanto como las células gra­

nulosas ala sintesis folicular de estrógenos en los foliculos

más maduros, mientras que, durante los estadios mós tempranos

del desarrollo Folicular preovulatorio, la teca es incapaz de

convertir andrógenos a estrógenos.

Recientemente, Haney y Schomberg (35) han informa­

do que, en toliculos porcinos de tamaño mediano (4-8 mm ), la

teca es responsable dela mayor parte de la producción folicu­

lar total de estrógenosa Los autores llegaron a esta conclusión

porque la producción basal de estradiol fue mayor en cultivos

tecales que en los de células granulosas y porque no observa­

ron un aumento significativo al co-cultivar ambos tipos celu­

lares. Sin embargo, cuando compararon la capacidad de célu­

las tecales y granulosas aisladas para aromatizar testosterona

exógena encontraron que, en este caso, la producción de es ­

tradiol por las células granulosas era mayor. Ya que en el to­

liculo las células granulosas estan expuestas a niveles eleva­

dos de andrógenos en el fluido folicular (36), esto implica

-15­

que probablemente las células granulosas hacen una contribu ­

ción móssignificativa ala sintesis folicular de estradiol tam­

bién en este estadio, como fue observado anteriormente (28).

La ausencia de efecto sobre la sintesis de estrógenos al C0"CL_J_l

tivar ambos tipos celulares podria deberse a que las células

granulosas metabolicen el andrógeno de origen tecal a otros

compuestos no aromatizablese

En conclusión, parece que la capacidad de la teca de

sintetizar estrógenos aumenta con el desarrollo tolicular. Estos

resultados están de acuerdo con estudios en toliculos ovinos

(37) pero en contraste con estudios en roedores de laboratorio

(38); en estos últimos la teca es incapaz de producir estróge­

nos en todos los estadios del desarrollo folicular que han sido

examinados.

Los resultados obtenidos en distintas especies en ba­

se a estudios "in vitro" con tipos celulares ovóricos aislados

han llevado al planteo dela hipótesis bicelular bigonadotróti

ca para Ia biosintesis folicular de estradiol: las células tec_a

les sintetizan andrógenos, baío la influencia de LH, que son

transportados a las células granulosas, donde son aromatizados

a estradiol, baío la influencia de FSH (30). Esta hipótesis se­

ria vólida en roedores, en todos los estadios del desarrollo to

-16­

licular pre0vulatorio y, en animales mós grandes, en los esta­

dios más tempranos del desarrollo folicular preovulatorio.

1.3.4 Factores lntraovóricos en la Regulación de la Este­

roidogénesis Folicular.

1.3.4.1 Esteroides.

Existe abundante evidencia de que los esteroides ovó­

ricos podrian modular Ia bíosintesis ovóríca de otros esteroides

mediante acciones directas sobre las células ovóricas involucr_a

das.

En preparaciones tecales derivadas de foliculos Ovari_

cos porcinos de tamaño mediano, Tsang y col. (39) demostraron

que 17‘0 -estradiol ¡nhibia significativamente la producción

de testosterona y DHT de una manera dosis dependiente en pre­

sencia de LH. Ya que estradiol no afectó la sintesis tecal de

AMPciclíco y progesterona, esto sugirió que el esteroide ac­

tuarl'a inhibiendo el sistema l7m’ -hidroxilasa//C]7_20 líasa

o desviarïa alos C21-esteroides de este sistema estimulando

caminos alternativos de metabolismo. En la rata, Leung encon­

tró que estradiol ínhibia la sintesis de andrógenos estimulado

_]7_

por LH tanto "in vivo" como "in vitro“ (40, 41). En esta espe­

cie se demostró que estradiol estimularia el metabolismo a preg

nanos 5%—reducidos(42).

Se ha implicado a andrógenos y eHTógenos en el can­

trol de la sfntesh de progesterona en células granulosas. Se op

servó (43) que los estrógenos sinergizaban con hCIG en la esti

mulación de la producción de progesterona por células granuLp

sas derivadas de foliculos de 5-8rnm. Schomberg y col.(44)

examinaron el efecto de estos esteroides en la producción de

progesterona por células granulosas derivadas de foliculos poL

cínosde 3-5 mm°DHTenimulósignHicaHvamentela acumula­

ción de progesterona en cultivos de 2 dias mientras que testoí

terona no eíerció efecto alguno, y tanto dehídroepíandostero­

na (DtlEA)como i7 Ü-estradiolinhibieron significativamente

la acumulación de progeflerona.Los auhnes concluyeron que

la ausencia de efecto estimulatoño de testosterona o DtlEA se

debia a aromatización de estos esteroides a estrógenos, ya que

las células granulosas eran capaces de aromatizar estos esteroí

des. Sin embargo, los autores no demostraron que esto estaba

ocurriendo. Luego informaron que también en células granulo­

sas ahladas defolfculosde 8-10 mm, DHTculmulaba y 17? ­estradiol ínhibia la producción de progesterona (45).

-13­

Otros autores (46, 47) observaron que testosterona y

1746 -estradiol inhibian la producción de progesterona en res ­

puesta a FSH por células granulosas derivadas de toliculos pe­

queños. Dado que DHT, un andrógeno no aromatiza ble, no pro­

duio efecto alguno, estos investigadores concluyeron que éste

era un efecto estrictamente estrogéníco y que testosterona pro_

bablemente actuaba luego de ser aromatizada a estradiol.

Cultivando por 2 dias células granulosas provenientes

de foliculos de tamaño mediano, Anderson y col. (3]) no obser

varon un efecto significativo de los andrógenos sobre la acum_u

loción de progesterona estimulada por FSH; en cambio, cuando

las células fueron mantenidas en cultivo por 4 dias, los andrá

genos actuaron sinergisticamente con FSH estimulando la pro ­

ducción de progesterona.

En conclusión, se ha encontrado que los andrógenos y

estrógenos podrian estimular o inhibir la producción de proge_s

terona por células granulosas "in vitro", dependiendo de la Ion

gitud delos cultivos, el tamaño del foliculo y/o condiciones

de cultivo.

-19­

l.3.4.2 Factores no esteroideos.

Factores no esteroideos también han sido implicados

en el control de la producción de progesterona en células gra­

nulosas. Ledwitz-Rigby y colo (48) observaron que fluido foli­

cular derivado de foliculos porcinos pequeños y medianos, ex­

traido con carbón-dextrón, inhibia la luteinización morfológ_i

ca y secreción de progesterona por cultivos de células granulg

sas de foliculos preovulatorios porcinos. El fluido folicular

también inhibió la acumulación de AMP ciclico basal y en re_s_

puesta a LH luego de un periodo de incubación de 24 a 48 ho­

ras. En cambio, fluido folicular derivado de foliculos preovu­

latorios no produio efecto alguno. Otros autores (49) hicieron

una observación semeiante al estudiar el efecto de fluido fol_i_

cular humano sobre la acumulación de AMP ciclico en ovario

de rata. Este inhibidor actuaria estimulando la actividad de

fosfodiesterasa, ya que adición de ¡sobutil-metil-xantina

(inhibidor de fosfodiesterasa) fue capaz de revertir la acción

del fluido sobre los niveles de AMP ciclica (50). También se

encontró un estimulador dela secreción de progesterona en

fluido folicular porcino (51). Este seria controlado por FSH.

Se ha observado la presencia en el ovario de factores

-20­

que unen gonadotrofinas. Se observó (52)inhibición dela unión

de FSH a células granulosas por fluido folicular b0vino. Estu­

dios en cuerpo lúteo de rata (53) y cerdo (54) sugieren Ia exi_s

tencia en este teiido de factores que unen LH. Se ha informado

que Ia adición de extractos de cuerpo lüteo a células granulo­

sas porcinas inhibe la secreción de progesterona en presencia

o ausencia de LH exógeno (55).

1.3.5 Resumen.

Nuestro conocimiento actual de Ia biosïntesis de es­

teroides por células tecales y granulosas del folículo ovórico

porcino esta resumido en la figura 2. Se ha omitido el efecto

de los andrógenos y estrógenos sobre Ia sintesis de progestero­

na ya que Ia evidencia parece indicar que su efecto es apare_n

te sólo después de 2-4 dias en cultivo, cuando las células gra

nulosas ya han luteinizado (27).

104 Formación y Probable Rol de los Sulfatos de Esteroides

en las Glóndulas Esteroidogénícas.

Por mucho tiempo los sulfatos de esteroides han sido

Figura2:Roldecélulasfecalesygranulosasenlaesteroídogénesís enFolïculosporcinosdetamañomediano. Laslíneasenterosrepresentancaminosesferoídogénícosyacciones LaslíneasquebradasrepresentanHuioíntercelulordeesteroides.

TECAGRANULOSA

LHIFSHl

ÏTY

Colesterol44 Colestero|

+I*+

i.————¿AMP.J—'cAHP-——>l

»—Progesterona

Progecterona___...>

_-Andrógeno——————————-———--—-45Andrógeno—->Butt-¿gano--4-I­

I

-22­

-23­

considerados como meros productos metabólicos de hormonas e_s_

teroideas, sintetizados en el higado y excretados en la orina

o bilis (56). En i959, el sulfato de dehídroepiandrosterona fue

aislado de un tumor adrenal y se demostró que era segregado

por teíído hiperplástíco adrenal (57). Estudios posteriores de­

mostraron que el sulfato de DHEA es uno de los principales es­

teroides segregados por la glándula adrenal humana (58). Evi­

dencia de secreción de este coníugado por una glándula este ­

roidogénica estimuló estudios de biosintesis y metabolismo de

conjugados esteroideos. La cantidad de estudios realizados en

el periodo 1960-1970 fue enorme. Sólo se mencionarán aquellos

trabaios relevantes para entender el probable rol de los sulfa­

tos de esteroides en las glándulas esteroidogénicas, asi como

la mayor parte dela evidencia de SUbiosintesis y metabolismo

en el ovario.

Se ha observado la presencia de pequeñas cantidades

de sulfatasa mamifera en higado, testiculo, ovario y adrenal

(59). Su presencia en las glándulas esteroídogénicas ha suger_i

do un rol para los sulfatos de esteroides enla biosintesis de

esteroides asi como enla regulación de los efectos de los es­

teroides en los teiidos efectores.

-24­

Varios 5-en-3_Ï -hidroxiesteroídes coniugados con ¡o

nes sulfato como sulfato de colesterol, de pregnenolona, de

179€ —hidroxipregnenolona y de DHEAhan sido involucrados

en la biosintesis de hormonas esteroideas (60-63). Se ha demo_s

trado que la secuencia de conversiones de colesterol a DHEA,

via pregnenolona y i7qí-hidroxipregnenolona, tiene lugartag

to para los 5-en-3f3-hidroxiesteroideslibres (64-66) como pa­

ra los correspondientes sulfatos de esteroides (60-63), en cuyo

caso el grupo sulfato permanece en la molécula a través de to­

da la conversión. La participación y regulación de la actividad

de sulfatasa (67-70), asi como el rol de los sulfatos de estero_i_

des como precursores de hormonas activas (58, 60, 63) también

han sido estudiados extensamente. Esta participación ha sido

observada en glándula adrenal, testiculo y placenta. En esta

Última, existe una sulfatasa muy activa, y el sulfato de DHEA

es un precursor importante enla sintesis de estrógenos (7l, 72).

En la glóndula adrenal se observó que la sulfatasa es

la enzima limitante en la biosintesis de esteroides (70, 73).

En eflc glándula, ACTtlestimulaIa shnesh de corHcoides ac­

tuando en una etapa previa a la formación de pregnenolona

(69).. Dominguez y col. (74) observaron que ACTH también est_i

-25­

mula la actividad de sulfatasa por un mecanismo aparentemente

independiente de AMP ciclicos A partir de sus re5ultados espe

cularon que enla adrenal el mecanismo de acción de ACTH a

través de AMP ciclico ocurriria en condiciones de stress mien_

tras que la sulfatasa desempeñaria un rol en los mecanismos de

retroalimentación regulatorios asi como en aumentos pequeños

enla ACTHcirculante.

La importancia regulatoria de Suliotransferasas y Sul­

fatasas ha sido estudiada extensamente en teiido testicular por

el grupo de Notation. Este grupo describió la formación de su_l

fatos de esteroides y su retención enla sangre periférica como

una función de almacenamiento (67). Esto proveeria a cada te­

¡ido con una abundante cantidad de precursores monosulfatados

para regulación "in situ" de los niveles de esteroides. La uti­

lización de estos monosulfatos pareceria estar baio influencia

esteroidea directa (68). Notation (75) presentó una reseña de

evidencias que apoyan la premisa de que, a pesar de la baia

actividad de la sulfatasa, la regulación de la hidrólisis de

los monosulfatos esteroideos es importante para la biosintesis

de andrógenos primariamente en el sitio efector. La sulfatasa,

independientemente del teiido del que proviene,parece ser una

unidad monomérica con un sitio de unión de sulfato y un sitio

-26­

regulatorio de unión de esteroides. La asociación intima del

monómero o sus agregados con la membrana celular implica

transporte y metabolismo de hormonas esteroideas. El autor pre

senta un modelo en que los monosulfatos de esteroides (sustra­

tos) contribuirian ala biosintesis de andrógenos por medio de

hidrólisis reguladas hormonalmente (modificadores o inhibidores

esteroideos alostéricos) en la membrana celular por sulfatasas

en el sitio de utilización dela hormona (producto esteroideo).

Esto ocurriria enla barrera sangre-órgano en los teiidos efec­

tores a andrógenos y, en particular, como manera de regular el

nivel de andrógenos en los tÚbulos seminiieros.

Ha habido controversias con respecto ala capacidad

del ovario de formar sulfatos de esteroides. Estudios con homo­

genatos de tejido ovórico humano demostraron sólo una pequeña

capacidad de sulfatación (76). Se ha observado formación de p_e

queñas cantidades de sulfatos de estrógenos en extractos de o­

varios bovinos (77)o También se informó secreción de sulfato de

DHEA y de estrona (78, 79). Melville y Braunsberg (80) demos­

traron formación de sulfatos de DHEAy de estradiol por sobre­

nadante de teiido ovórico de sólo 7 de 12 ovarios humanos nor_

males, Sin embargo, otros autores (8]) no pudieron detectar se

-27­

'creción o utilización de cantidades medibles de sulfatos de es­

teroides por ovarios humanos normales en ambas fases del ciclo.

Estudios mas recientes demostraron formación de sulfatos de tes­

tosterona, estrona y estradiol por teiido ovórico bovino y de

rata (82) y por ovarios humanos perfundídos "in vitro" (83-85).

La formación de Sulfatos de estrógenos era estimulado por gona_

dotrofinas. En todos los casos se observó sólo una pequeña con­

versión a sulfatos, que los autores atribuyeron a baía actividad

de la sulfotransferasa.

También existe evidencia de utilización de sulfatos

esteroideos para la biosintesis de esteroides en el ovario.

Se encontró actividad de sulfatasa en ovario humano

(86). Se observó que el sulfato de DHEAes un precursor eficien_

te de andrógenos y estrógenos en ovarios humanos perfundidos

(87)o Luego de incubar ovarios de coneio con sulfato de DHEA,

Payne y Mason (88) aislaron A4-androstenediona y testosterona.

PatWordhCIny Lanthier (89) observaron que tanto el teiido fo­

licular como el estroma de ovario humano podian utilizar sulfa­

to de DHEA como precursor para la formación de andrógenos y

estrógenos.

-23­

1.5 Propósitos de este Trabaio.

Los componentes del foliculo ovórico experimentan

cambios notables durante el crecimiento folicular. Aunque es­

tos cambios dependen de la secreción ciclica de gonadotrofinos

hipofisarias, la concentración de gonadotrofinas a la que los

distintos foliculos estón expuestos no explica porqué en cada

ciclo sólo un número limitado de foliculos en crecimiento (uno

o mós dependiendo de la especie) ovula y Iuteiniza en respueí

ta al pico gonadotrófico, mientras que los demós degeneran.

Una explicación posible para esta respuesta diferencial de los

foliculos al mismo medio ambiente hormonal podria ser la con­

centración intrafolicular de hormonas esteroideas.

Los estrógenos estimulan Ia proliferación de las célu­

las granulosas y la sensibilidad del ovario a FSH (90, 9]),

mientras que los andrógenos, ademós de servir como sustratos

para la sintesis de estrógenos, eiercen un efecto opuesto sobre

el crecimiento folicular, promoviendo atresia (92). Por lo tan­

to, el balance entre la acumulación de andrógenos y la forma­

ción de estrógenos desempeñaria un rol significativo en deter­

minar la suerte de un foliculoi Debido a esto, la sintesis y/o

el metabolismo de andrógenos deberian estar precisamente reguladas.

-29­

En toliculos de rata (93; y oveio '94, 37) se ha obser­

vado que la eliminación de células granulosas de preparaciones

tecalesresulta en una disminución en la producción de andrógf

nos. Ya que las células granulosas son incapaces de sintetizar

cantidades apreciables de andrógenos, uno de los propósitos de

este trabaio es examinar el rol de las células granulosas enla

sintesis y/o el metabolismo de andrógenos. También se estudia­

ró el efecto de estos andrógenos sobre la esteroidogénesis por

las células granulosas. Ambos estudios estarian comprendidos

dentro del obietivo general de ampliar nuestro conocimiento

sobre las interacciones existentes entre los tipos celulares to­

liculares.

El modelo elegido para este trabaio ha sido el ovario

porcino, porque provee de un gran número de foliculos de torna

ño óptimo para realizarla separación de tipos celulares folicrilares.

El método usado ha sido el de cultivo de corto térmi­

no "in vitro" de tipos celulares foliculares aislados y en co ­

cultivo, en presencia de distintas sustancias. La ventaio de e_s_

ta técnica es que permite la determinación del potencial este­. I I l o a Irordogenico de cada compartimiento folicular y examinar Ia ma

-30­

nera en que factores esteroideos y no esteroideos la regulan.

Sin embargo, esta técnica presenta variaslimitaciones. Aunque

las células granulosas son fácilmente obtenidas en forma pura

y homogénea, en elfoliculo, las células granulosas son avas­

culares, mientras que, al ser aisladas e incubadas, estén ex ­

puestas a oxigeno; Elteiido tecal es heterogéneo y no fócilde

obtener en forma pura“ Otra limitación es que, al separar estos

tipos foliculares, se interrumpe la asociación estrecha existen

te entre estas células al formar parte del foliculo. Por lo tan­

to, losresultados de este enfoque pueden indicar la capacidad

esteroidogénica de los distintos tipos celulares foliculares pe­

ro no su verdadero rol en la esteroidogénesisfolicular. Sin em

bargo, éste es uno de los meíores métodos disponibles actual­

mente para estudiar las interacciones que tienen lugar en el

foliculo ovóricou

-3]­

2.0 MATERIALES Y METODOS.

2°] Animaleso

Se recolectaron ovarios de cerdas prepüberes inmedia­

tamente después de su muerte en un matadero local; ovarios

con cualquier indicio de ovulación fueron descartados. Para

un solo experimento se obtuvieron ovarios de cerdas maduras

en estadios no determinados del ciclo estral. Los ovarios se

mantuvieron en Medio Esencial Minimo modificado (MEM, ver

mas adelante) suplementado con buffer HEPES (20 mM) a 4° C.

Foliculos de tamaño mediano (diametro = 4-6 mm) se aislaron

de los ovarios, y se limpiaron cuidadosamente de teiido inters­

ticial circundante utilizando forceps finos baio un microscopio

de disección. Aquellos foliculos que presentaban señales visi­

bles de atresia (células granulosas separadas de la pared folí­

cular o dispersas en el antro) fueron descartados, y sólo se u­

saron foliculos de aspecto sano.

2.2 Aislamiento de Células Tecales y Granulosas.

Los foliculos se cortaron en cuartos y las células gra­

-32­

nulosas se separaron de las tecales raspando suavemente el in­

terior de los foliculos con una varilla de vidrio,cuyo extremo

habia sido estirado para dar un diametro de curvatura apropia_

do para el tamaño de los foliculos.

Los trozos de teca se combinaron y colocaron en so|u_

ción salina balanceada de Hanks, libre de magnesio y calcio,

suplementada con buffer HEPES (20 mM). Se agitaron suaveme_n

te sobre un agitador magnético por 5 minutos para liberar las

células granulosas remanentes, y asi obtener preparaciones te_

cales más limpias (95). Las células granulosas se reunieron y

recolectaron por centriiugación. Se lavaron dos veces resus ­

pendiendo en MEMmodificado y centrifugando, y se resuspen­

dieron en MEM fresco.

2.3 Condiciones Generales deCultivo.

El medio de cultivo usado fue Medio Esencial Minimo

de Eagle (Flow Lab.), suplementado con glutamina (4 mM), a­

minoácidos no esenciales (0,1 mM), fungizona (2,5 ug/ml ),

penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 ug/ml) (al

que se refiere como MEMmodificado). Los cultivos se mantuvie

-33­

ron por dhtintostiempos en un incubador humidificado a 36°C

baío una atmósfera de 5‘% C(32 en aire.

Alicuotas conteniendo un número de células granulo­

sas correspondientes a un foliculo (alrededor de 5 x 105 célu­

las viables; 0,20 mg de proteina) se cultivaron en suspensión

en lrnlde medhadeculeo entubosde cuHivo(tubosplóni­

cosestérHes Falcon, 12 x 75 mnfl.

Cuatro trozos de teca (un foliculo equivalente de te­

¡ido) se colocaron sobre reifllas de acero inoxidable en las cg

vídades de placas de plástico Falcon 3047 Nhfltiwell conteniej

do l ml de medio de cultivo, o 0,5 ml de medio fresco más 0,5

ml de medio usado por células granulosas (en el coso de deter­

minar el efecto de las células granulosas sobre la sintesis tecal

de andrógenos)o en medio de culeo conteniendo célulosgra­

nulosas (en el caso de co-cultivosL

Variassustancias, solas o en combinación, se agrega

ron ontesdel cuHivo,Estasfueronzlug/ml FSH(NlH-FSH-SIIL

l ug/ml LH (NlH-LH-B8L vaHos eHeroidesexógenos(Sterohï

ids) a distintas concentraciones, dibutiril AhAPciclico ((BU)2c

AhAP, Sigma). Los detalles de los diseños experimentales se de

rón en la sección de resultados.

-34­

Al final del periodo de cultivo, los medios de cultivo

se guardoron a -20°C paro determinación posterior de esteroi­

des.

Con el obieto de determinar el contenido tisular de

esteroides, alicuotas de etanol redestilado se agregaron a las

cavidades de las placas de cultivo que contenian células gra­

nulosos adheridas, y las placas se agitaron para extraer los ei

teroides; el teiido tecal se colocó en l ml de etanol redestíl_a_

do y se ogitó por 2 minutos. Luego de centrifugar, alicuotas

del extracto etanólico se secaron y redisolvieron en buffer pci

ra determinación posterior de esteroides. El pellet se usó para

determinación de proteinas. En cada experimento, 2 o 3 mues­

tras de teiido no cultivado se usaron para determinar el conte

nido inicial de esteroides; éste se sustraio del contenido en

teiido y medio al finalizar el cultivo para estimar la acumulg

ción de esteroides durante el tiempo de cultivo.

Los resultados se expresaron en términos de acumula­

ción de esteroides en medio de cultivo y teíido por miligramo

de proteina o por foliculo equivalente, corregido por conten_i

do inicial tisular de esteroides. Análisis preliminar de los da_

tos expresados por miligramo de proteina dieron resultados simi

.lares a aquellos expresados por foliculo, y en algunos casos se

eligió esta última expresión para dar una comparación más sig­

nificativa de la producción total de esteroides por cada tipo

celular.

2.4 Determinación de Esteroides.

Se determinaron esteroides en alicuotas del medio de

cultivo sin extraer, y en extractos etanólicos del teiido (eva­

porados y resuspendidos en buffer) por radioinmunoensayo. Pa­

ra cada esteroide se verificó la validez del ensayo directo del

medio de cultivo comparando los valores obtenidos por este mi

todo con los obtenidos luego de extracción de las mismas mue_s_

tras con éter.

El radioinmunoensayo de Aw-androstenediona (A4 A)

fue realizado según la técnica descripta por Leung y Armstrong

(42). El anticuerpo se produío en coneios usando ll °¿-hidroxi­

androst-4-en-3, l7-diona-hemisuccinil-albümina sérica bovina.3 1 .El, 2, ó, 7 H_j-androstenedlona se obtuvo de New England

Nuclear (Boston, Massachusetts, USA). El titulo dando alrede­

dor de 50 % de unión cuando l5.000 cpm de trazador eran usa­

dos, fue de 1:2.000. El rango de la curva standard fue de 12,5­

-36­

I800 pg. El coeficiente de variación intraensayo fue de 3,3 °o

(n:3ó), El coeficiente de variación interensayo fue de 11,7%

(en 26 ensayos). El paralelismo se determinó ensayando andros_

tenediona en distintas alicuotas de extracto etanólico de ava­

rios de rata. La regresión dela dosis en el tamaño de la alicu_o

ta se describió como Y = 1,886 Ï 0,058 x - 27,966, siendo el

coeficiente de regresión significativamente distinto de cero.

Las alicuotas deseadas de muestras se llevaron a 100

Í/wl con buffer fosfo-salino (PBS) pH 6,8 con lO % de gelati­

na. Luego se agregaron lOO/ul de trazador (10.000-15.000 cpm)

y lOO/ul de anticuerpo atodos los tubos“ Luego de incubar por

8 - 20 horas a 4°C se agregó l ml de una suspensión de 25 %

carbón - 2,5 °/odextrón en PBS. Los tubos se mantuvieron a

4°C por l5 minutos y se centrifugaron 01.200 g por 15 minutos

a 4°C. Los sobrenadantes se decantaron en viales a los que se

agregó 5 ml de solución de centelleo. La radioactividad se de­

terminó en un contador de centelleo liquido.

Los radioinmunoensayos para testosterona (T), proges­

terona (P), 175 —estradiol (E2) y estrona se realizaron con an_

tisueros altamente especificos. Estos ensayos fueron validados

previamente en el laboratorio (4], 96). Las reacciones cruza­

das de los anticuerpos empleados se muestran enla Tabla l.

TABLA l

-37­

Reacciones cruzadas de algunos esteroides con los anticuerpos

utilizados.

Anticuerpo anti- A4-androstenediona

Esteroide °/oreacción cruzada

Anticuerpo anti-testosterona

A4-Androste nediona TOO,OO5 a<-Androstano-3, T7-díona 5, OOTestosterona 2, 00Otros Esteroides < 1,00

Esteroide %reacci6n cruzadc

Testosterona 100, 00DHT 53, 0054-Androstano-31, 30, 0017 {b-díol.5 (-Androstano-3É, T3,0017,6 -dío|

A 4 -Androste nediona < 0, 04

Anticuerpo anti- Progesterona Anticuerpo antí-Pregne nolona

Esteroide % reacción cruzada Esteroide °/oreacción cruzada

Progesterona ¡00, OO Pregnenolona TOO,005P-pregnano-3, 20-diona 9, 20 5- Pregnen-3fi, 25, 005“—pregnano-3,20-díona 8,60 204-diolSi-pregnano-3Óol-20-ona 2, 60 5-Pregnen-3P, 8,30Pregnenolona O,80 20,9-diolotros esteroides < 0, TO Progesterona 0,60

17"5-Estradío| < 0,20

Anticuerpo anti-1715-Estradiol

Esteroide % reacción cruzada

17/3-Estradio| TOO,00Estrona 3, 00Testosterona 4 0, 02Progesterona 4 0,01

-38­

El porcentaie de reacción cruzada para cada uno de los estero_i

des probados fue calculado como la relación entre la masa de

esteroide necesaria para producir un desplazamiento del 50 %

en la curva, con respecto a la masa de esteroide en estudio ne

cesario para producir el mismo desplazamiento.

El anticuerpo contra testosterona da 50 °/ode reacción

cruzada con DHT, y las estimaciones de niveles de testostero­

na pueden entonces incluir DHT.

El anticuerpo contra pregnenolona, preparado en con_e

¡os contra el coníugado de albúmina sérica bovina al 16°C­

carboxi-etil tioéter de pregnenolona, fue donado por el Dr. G.

Niswender y el ensayo fue realizado como el descripto por Ing

ba y col. (97), excepto que se ensayaron alicuotas de medio

sin extraer. La validez del ensayo directo se verificó compa ­

rando valores obtenidos para cantidades conocidas de esteroi­

de en medio de cultivo y en buffer fosfato; los valores estaban

significativamente correlacionados (r = 0,99 y y: 0,05 Ï 0,9] x)

Para determinar Ia contribución de otros metabolitos

presentes en el medio de cultivo a la pregnenolona medida en

este ensayo, pregnenolona fue aislada de algunas muestras por

cromatografía en columna. Alicuotas de las muestras se extra­

¡eron tres veces con 3 volúmenes de éter dietilico. Se prepara

-39­

ron columnas de LH-20 y se corrieron usando como solvente

heptano : benceno : metanol (85:10:5) (98). La recuperación. . , 3del esteroude se determlno agregando ( H) -pregnenolona an­

tes de la extracción con éter. La fracción de pregnenolona se' o I O Íensayo por radnonnmunoensayo de allcuotas del extracto etereo.

En los ensayos de los distintos esteroides se incluye­

ron alicuotas de las distintas sustancias presentes en los culti­

vos para determinar su reacción cruzada con los anticuerpos u

tílizados.

2.5 Determinación de Proteinas.

Finalizados los cultivos, las células granulosas se in

cubaron en l ml de NaOH 0,lN por ló horas a temperatura ar:

bíente. El contenido de proteinas se determinó por el método

de Lowry y col. (99) usando albúmina sérica bovina (0-150/¿09

disueltos en agua) como standard.

A alicuotas de 0,3 ml se agregaron 3 ml de solución

4. 5 HZO 0,5 % en tartrato

de sodio y potasio l % + 49 ml de N02C03 2 % en NaOH 0,lN).

alcalina de cobre (l ml de Cu SO

Los tubos se agitaron y deíaron lO minutos a temperatura am­

-40­

bienteg Luego se agregaron 0,3 rnl de reactivo de Folin Cioca_l

teau 2N (Fisher Scientific Company) diluido 1:1 con agua. Se

agitó inmediatamente y luego de una hora a temperatura ambie_n

te, se determinó la absorbancía a óóO nm.

Las preparaciones tecales se hirvieron por 30 minutos

en l ml de NaOH lN. La determinación de proteinas se realizó

de la manera descripto para las células granulosas excepto que

se usó Na2CO3 2% en agua y la curva standard se preparó en

NaOH IN.

2.6 Extracción de Esteroides de Medio de Cultivo.

50 mg de carbón (Norít A, Fisher Scientific Company)

y 0,5 mg de dextrón (T 70, Pharmacia Fine Chemicals) se agre

garon a l ml de medio de cultivo. Luego de incubar por l5 mi­

nutos a 4°C, el medio se centrifugó 01200 g por 15 minutos,

Este procedimiento se repitió 2 veces y el sobrenadante se fil­

tró. La efectividad de este procedimiento para eliminar este ­

roides del medio se confirmó por radíoinmunoensayo de alicuo_

tas del medio extraido.

-4]­

2.7 Estudio del Metabolismo de Andrógenos.

2.7.]. Condiciones de Cultivo.

Células granulosas, preparaciones tecales y co-culti_

vos se incubaron con 4,4 x 10-9 M (l, 2, ó, 7 3H) -andros­

tenediona (New England Nuclear, H4 Ci/mmol) o 3,7 x 10-9M

l, 2, ó, 7, ló, l7 3H) -testosterona (New England Nuclear,

135 Ci/mmol) en MEM modificado por 24 hs a 36°C baío una

atmósfera de 5 % CO2 en aire. La cantidad de esteroide agre­

gado correspondió en masa al contenido inicial de andrógeno

(A4A o T) del teíido tecal. Los blancos para cada experimento

consistieron de l ml de medio de cultivo conteniendo el sus ­

trato radioactivo, en ausencia de teíído.

Finalizados los cultivos, los esteroides se extraieron

del medio 3 veces con 3 volúmenes de éter dieti'líco. En algu­

nos casos, los esteroides se extraíeron del teíído con etanol.

Esto no se realizó sistemáticamente ya que menos del 8 % de

la radíoactividad inicial se encontraba en el teiido al final

del cultivo.

La fase acuosa remanente luego de la extracción del

medio de cultivo con éter se trató con lO volúmenes de etanol

-42­

redestilado para precipitar las proteinas. Luego de centrifugar,

el pellet se descartó; el etanol se eliminó del sobrenadante por

evaporación, y el residuo, disuelto en agua, se sometió a cro­

matografia en DEAE-Sephadex.

2.7.2. Preparación de las columnas de DEAE-Sephadex.

Se mezcló Sephadex A 25 (tamaño de partícula: 40­

120 micrones, Pharmacia Ltd., Montreal, Canadá ) con agua bi­

destilada en una proporción de lO gramos por 150 ml. Esta mea

cla se agitó por lo menos ó veces, a intervalos; cada vez se dE

¡ó que se depositase por 30 minutos, se aspiró el sobrenadante

y se reemplazó con agua antes de volver a agitar.

Se utilizaron columnas de Sephadex (K 9/60) de dió­

metro interno (D.l.) de 0,9 cm (Pharmacia Ltd.). En el extremo

inferior de las columnas se colocó un trozo de tubo de goma

que se cerró con una llave de salida, y la columna se llenó

hasta 4-5 cm del borde superior con agua. Se fue agregando

cuidadosamente la suspensión de gel. Cuando el extremo supe­

rior estaba libre de A 25, el agua se eliminaba con pipeta

Pasteur y se reemplazaba con un volumen similar de la suspen­

-43­

sión0 Esto se repitió hasta que la mitad dela columna se llena

ra con gel sedimentado. Luego se abrió la llave y se permitió

que el liquido fluyera libremente, agregando continuamente

suspensión hasta obtener una altura de columna de 58 cm.

2.7.3 Cromatogratia en DEAE-Sephadex A 25°

Las cromatografias se realizaron a temperatura ambie_n

te según la técnica descripta por Hobkirk y Nilsen (100). Las

muestras, disueltas en 2 ml de agua, fueron aplicadas cuidadg

samente con pipeta Pasteur. El tubo que habia contenido Ia

muestra se lavó varias veces con 2-3 ml de agua, y esto tam ­

bién se agregó a la columna. La columna se conectó a un shte

ma de gradiente compuesto por dos frascos idénticos de ¡000

ml conectados entre si por un trozo de tubo de polietileno y u

no de ellos, el frasco mezclador, agitado magnéticamente. De

este último, un tubo llevaba el eluyente a la columna. El sis­

tema de gradiente utilizado contenia 500 ml de agua en el tra-s

co mezclador y 500 ml de Na Cl 0,8 M en el envase donor.

Se deíó que la columna fluyera libremente baío 50 cm de solu­

ción eluyente. Fracciones de eluido de iO ml se recolectaron

-44­

y la radioactivídad se determinó en alicuotas por espectrome­

tria de centelleo liquido.

2.7.4 Hidrólisis de Sulfatos de Esteroides.

Los coniugados fueron extraidos de solución satura­

da de NaCl, 3 veces con 3 volúmenes de acetato de etilo. Se

agregó sulfato de sodio anhidro y, luego de filtrar, el acetato

de etilo fue evaporado. Al residuo se agregaron 0,25 ml de m_e

tanol y l ml de ácido acético glacial: acetato de etilo (l : 9)

y se incubó ló hs a 50°C (lOl). Luego de evaporar completa­

mente, el residuo fue resuspendido en 2 ml de agua y extraido

3 veces con 3 volúmenes de éter dietilico.

2.7.5 Cromatografia en Capa Delgado.

Las muestras,disue|tas en el menor volumen de bence­

no: metanol (1:1), fueron sembradas en placas de vidrio recu ­

biertas con gel de silica (GF 254, Brínkmann; 0,25 mm de es­

pesor). Esteroides conocidos apropiados fueron sembrados en

bandas adyacentes. Las corridas fueron realizadas a 4°C en el

-45­

sistema cloruro de metíleno : éter díetr'lico (5:2), como des ­

cripta por Armstrong y col. (102). Los esteroides standard con-o

cídos se localizaron por fluorescencia ultravioleta o por expcl

sición a vapores de iodo.

Al final de la corrida, bandas del centimetro fueron

raspadas de las placas y eluidas con etanol. La radioactividad

fue determinada en alr'cuotas del eluïdo con un contador de

centelleo liquido.

Todos los esteroides radioactivos utilizados en los di_s

tintos estudios descriptos en esta tesis fueron purificados me­

diante esta técnica antes de su uso.

2.7.6 Cromatografía Líquida de Alta Presión.

Se utilizó un equipo adquirido de Waters Associates

(Canadá). El sistema de distribución de solvente consistió de

dos bombas modelo 6000 A. Las muestras fueron ínyectadas me­

diante un inyector universal modelo UóK o un procesador de

muestra modelo 7108. Los detectores usados fueron un monitor

de longitud de onda ultravioleta variable modelo 450, un de­

tector ultravioleta modelo 44] o un refractómetro modelo R401.

-46­

La velocidad de fluio y Ia composición de solvente fueron con

troladas por un controlador de shtema modelo 770. Las aHMras

y áreas de los picos y los tiempos de retención se midieron por

un data module modelo 730. Las columnas usadas fueron C18U

Bondapak Uongítudz 30 cm; D.|; 3,9 mm);tamaño de paHicu­

|a=iO/M), C18 RadialPak carhidge Uongitud= iO cm;D.h= 5

mni; tamaño de particula: lO/x), con un módulo de compresión

radial RCfW-ÏOOo microporasi|(longitud= 30 cm; D.L= 3,9 mn1L

(Zomofases móbíles se usaron mezclas binarias de sol­

vente: agua-acetonitñlo, agua-metanol y cloroformo-isoocta_

no, degasHicadosbaío preüón reducida o porinmerflón en un

baño ultrasónico por 20 minutos. Las velocidades de fluio usa­

das fueron de 1,5 ml/min para la columna C18 U Bondapak,

l mI/nfin para el C18 radial carhfldge y 3 ml/min para la cg

Iumna de microporasH.

Debido a la pequeña cantidad de masa presente en

las muestras a analizar, sus tiempos de retención se determina

ron evaluando la radioactividad en alicuotas de las fracccio­

nes obtenidas.

-47­

2.7.7 Reducción con Borohidruro de Sodio.

AI esteroide disuelto en 0,5 mi de isopropanol se a ­

gregaron 25 mg de borohidruro de sodio. Luego de incubar por

una hora a temperatura ambiente, Ia reacción se detuvo agre­

gando 2 ml de metanol. Los productos de reacción se evapora­

ron, resuspendieron en 2 ml de agua y extraíeron tres veces

con 3 volúmenes de éter dietilico.

2.7.8 Oxidación con el Reactivo de Jones.

EI reactivo se preparó disolviendo 26,72 gramos de

trióxido de cromio en 23 mI de ócido sulfúrico concentrado

llevado a 100 ml con agua.

AI esteroide se agregaron 2 mI de acetona y15 ¡url

del reactivo de Jones. La reacción se realizó 012-140C por

4 minutos con agitación constante. Se agregó i ml de metano]

para detener Ia reacción, y se evaporó. El residuo fue resus­

pendido en agua y extraido con 3 volúmenes de éter dietilico.

-48­

2.7.9 Determinación de la Actividad de Sulfotransterasa.

Se siguió la técnica descripto por Sturm y Hannapel

(82). Células granulosas o preparaciones tecales fueron homo­

geneizadas en 5 volúmenes de buffer Tris HCI (0,]M; pH 7,4)

con 0,25 M de sucrosa. El homogenato se centrifugó 0100.0009

por 60 minutos.

La mezcla de incubación consistió en Tris HCl 0,] M

conteniendo 1,4 umol de ATP, 2,8 umol de Mg Cl2 y 7 umol

de K2504. La reacción se realizó a 37°C por 2 horas en pre­

sencia de alicuotas del sobrenadante de 100.000 g y de distin­

tos esteroides radioactivos como sustratos (New England Nuclear).

En algunos casos se agregó (355)-N02504 (New England Nuclear).

La reacción se detuvo sumergiendo los tubos en un baño a 4°C.

El esteroide libre se separó dela mezcla de reacción

por extracción con éter dietilico.

Los blancos consistieron en tubos conteniendo la mez­

cla de incubación y el sustrato rodioactivo.

Como control se usó el sobrenadante de l00.000 g de

homogenatos de higado de rata.

-49­

2.8 Efecto de Testosterona sobre la utilización de Progeste­

rona por Células Granulosas.

Células granulosas se cultivaron por distintos tiemposl4

con lug/ ml de FSH (NlH-FSH-SII) y (4 - C) -progesterono

10-6M (New England Nuclear, 50 mCi/mmol) en presencia o

ausencia de testosterona (5 x 10-6M). Finalizado el cultivo,

los esteroides se extraíeron del medio de cultivo con éter die_

tilico. El extracto etéreo se evaporó baio nitrógeno seco y el

residuo se redisolvió en benceno: metanol (lzl). Esto se some­

tió a cromatografia en capa delgada en el sistema descripto

anteriormente, agregóndose 25/44rgde progesterona a las mues_

tras como standard interno. Luego de la corrida, la banda co­

rrespondiente a progesterona, ubicada por fluorescencia ultrE

violeta, se raspó de las placas y se eluyó con etanol. El elui_

do se evaporó y su radioactividad fue determinada. El sustrato

radioactivo utilizado se sometió al mismo procedimiento; la

cantidad de radioactividad recuperada en ambos casos fue

comparada, calculóndose de esta manera la desaparición de

progesterona.

-50­

2.9 Anólisis de los Resultados.

La existencia de diferencias significativas enla acu­

mulación de esteroides en respuesta alos distintos tratamien ­

tos se determinó mediante técnicas standard de análisis de va­

rianza (103). Cuando la prueba de Bartlett reveló heterogenei­

dad de varianza entre los valores no transformados, los anólisis

se realizaron sobre los valores transformados logaritmicamente.

Sin embargo, para uniformidad enla presentación, los resulta­

dos se presentan usando valores no transformados. En el caso

de usarse porcentaies, los anólisis se realizaron sobre valores

transformados angularmente.

La prueba de rangos múltiples de Duncan se utilizó

para comparaciones especificas entre valores medios.

El efecto de medio usado por células granulosas y de

esteroides sobre la sintesis tecal de andrógenos se analizó me­

diante la prueba no paramétrica de Friedman (¡04) debido a

considerable heterogeneidad de varianza de muchos valores.

-51­

3.0 RESULTADOS

3.] Rol de las Células Granulosas enla Sintesis de Andróge­

nos.

3.1.1 Efecto de Medio Usado por Células Granulosas sobre

la Sintesis Tecal de Andrógenos.

Células granulosas fueron cultivadas por 24 hs sin

hormonas exógenas (A) o con FSH Al final del período de

incubación los medios de cultivo se congelaron para ser usados

posteriormente en cultivos tecales.

Las preparaciones tecales fueran cultivadas en l ml

de medio fresco o 0,5 ml de medio fresco mós 0,5 ml de me­

dio en que células granulosas habian sido cultivadas previame_n

te (medio usado A y B) en presencia o ausencia de LH. Al fina

lizar el periodo de cultivo se determinaron esteroides en medio

de cultivo y proteinas en teíido. Este procedimiento se repitió

en 7 experimentos distintos con ó replicados por tratamiento

en cada uno. Debido ala variabilidad observada en las canti­

dades de testosterona y A4-androstenediona producidos por los

cultivos control en cada experimento, los resultados se expre­

saron como porciento de los cultivos control. Los resultados

combinados de siete experimentos estén representados en las fi

guras 3 y 4. A pesar de las diferencias en valores absolutos o_b

tenidos en los distintos experimentos, los efectos de los disti_n

tos tratamientos fueron consistentes en cada experimento, y

las diferencias entre experimentos desaparecieron cuando los

resultados se expresaron como porciento de valores control.

LH significativamente estimuló de 2 a 4 veces la acu

mulación de testosterona y ¿34-androstenediona.

Células granulosas aisladas de los mismos foliculos si

cretaron cantidades muy pequeñas de ambos andrógenos durante

las 24 hs de cultivo (datos no representados).

En ausencia de LH, la cantidad total de andrógenos

(A4A y T) sintetizados dependió del medio presente en la in­

cubación (P < 0,01). En cambio, el medio no afectó la sfntesís

de andrógenos estimulada por LH. La producción de andrógenos

por preparaciones tecales cultivadas en presencia de medio u­

sado control (MA) no fue significativamente distinta delos

controles (P< 0,05)o Sin embargo, medio en que células gran_u

losas habian sido cultivadas en presencia de FSH (MB) causó

-53­

50°" C] CONTROL

. a LHA soo

‘z‘ B

8 u 400­t:

L’LJ 0U .m 300o _b; 3u zoo­l- RV

|00>

1-!- 4- ..'

50% MA 50% MB

Figura 3: Efecto de medio usado por células granulosas y/o LH so­

bre la producción tecal de testosterona (T) en 24 hs de cultivo. Los

valores representan el promedio Ï E.S. del porciento de cultivos

control.

Abreviaturas: C, control; MA,medio obtenido de células granulo­

sas cultivadas en MEM; MB,medio obtenido de células granulosas

cultivadas en MEM con FSH (l ug/ml).

(Los valores en los cultivos control fueron 10,52 Ï 2,89; 18,32Ï

2,90; 4,74 t 0,73; 5,85 Ï1,35;12,óó t 5,28,- 3,92 Ï 0,56 ng/

mg proteina).

-54­

5°°' [j CONTROL

É ra;A LHO - ¿oo­H oo Ll; uÉ .u o woF ow8 3 mo­D 1'!

35¡:3 mo­74

50%MA

Figura 4: Efecto de medio usado por células granulosas y/o LH

sobrela producción tecal de [34-androstenediona (¿X4A) en

24 hs de cultivo. Los valores representan el promedio Ï E.S.

del porciento de la cantidad de ¿34A en los cultivos controL

(Las cantidades producidas por los cultivos control fueron:

95,65 Ï 26,43; 99,67 Ï 3,65; 51,20 Ï 8,31; 58,68 Í 9,04;

198,06 t 41,29; 74,04 Í 15,90 ng/mg proteína).

-55­

un incremento al doble enla acumulación de Á4-androstene­

díona y al triple en la de testosterona. Este efecto no se debe

ala presencia de FSH en el medio ya que la misma cantidad de

FSH no produjo efecto alguno (P < 0,1) sobre la sintesis de ari

drógenos por las mismas preparaciones tecales (Tabla ll).

3.].2. Efecto de Medio Usado Extraido con Carbón-Dextrón

sobre la Sintesis Tecal de Andrógenos.

Para determinar sí el efecto del medio usado por cél_u

las granulosas se debí'a a un esteroide o a algún otro factor,

el medio se extraío con carbón-dextrón. El efecto de este me­

dio sobre la sintesis tecal de andrógenos esta' representado en

la figura 5. MBestimuló significativamente la sintesis de an­

drógenos (A4- androstenediona mas testosterona) (P < 0,01),

mientras que MBextraido con carbón-dextrón no afectó la sin_

tesis tecal de andrógenos (P < 0,5), Ya que la extracción de

medio fresco con carbón-dextrón no afectó la sintesis basal de

andrógenos (¡00 % del control), estos resultados sugieren que

la capacidad del medio usado de estimular la sintesis de andré

genos se debe a la presencia de alguna pequeña molécula.

TABLA ll

Efecto de FSH sobre lo sfntesh fecal de ondrógenos (ng/mg pro­

fel'na).

4Ao To

Control 58,68 i 9,04 5,85 :1,35

FSH(1 ug/ml) ¿4,03 Í10,06 6,35 t1,51

a Promedio Ï E.S.de ó replicadoa

-57­

300­

ÉEADazoo­Zu< cgg J

lE 35 IOOFzG

C 50% MB cVoe MB

Figura 5: Efecto de la extracción con carbón-dexfrán sobre la

capacidad del medio usado por células granulosas de estimular

_ . . ¿34 . ,Ia Sintesis fecal de androgenos( -androsfened¡ona mas fes­

fosterona). Los valores representan el promedio Ï E.S. del por­

ciento de cultivos control.

Abreviaturas: e MB, MBextraído con carbón-dextrón.

-58­

Con el obieto de determinar si el efecto del medio u­

sado sobre Ia sintesis de andrógenos se debia ala presencia de

esteroides, se midieron en éste las concentraciones de sustra­

tos posibles para la sintesis de andrógenos.

3.1.3 Concentración de Esteroides en Medio Usado por Cé­

lulas Granulosas.

Las concentraciones de A4-androstenediona, testostE

rona, pregnenolona y progesterona en los medios usados (MA

y MB) se muestran enla Tabla lll. Ambos medios contenian can

tidades muy pequeñas de los andrógenos. Las concentraciones

de los C21-esteroides fueron mayores en el medio usado B

(P4 0,001). El contenido de pregnenolona en ambos medios fue

mucho mayor que el de progesterona (P< 0,001).

Debido alos valores elevados de pregnenolona obterli

dos por radioinmunoensayo, se decidió determinar si otros me­

tabolitos producidos por las células granulosas estarian inter­

firiendo en el ensayo. Alicuotas de 10 muestras fueron extrai­

das con éter dietilico y pregnenolona fue aislada por cromatg

grafía de los extractos en columnas de LH-20. La Tabla IV com

TABLA III

-59­

Concentración de algunos esteroides en medio usado por células

granulosas (ng/0,5 mI).

Medio A4A 'T °

MA ND 0,09to,02

MB ND 0,15Ío,03

a Promedio Ï E.S. de 16 muestras.

Abreviaturas:

Pregnenolona Progesterona

41,04t2,21 3,77i 0,62

86,51Ï5,89 27,35Ï 3,81

MA: medio obtenido de células granulosas cultivadas en MEM.

MB: medio obtenido de células granulosas cultivadas en MEM

con Ï ug/ml FSH.

ND: no detecfable.

-60­

TABLA IV

Concentración de pregnenolona (ng/ml, n=5) antes y después de

purificación del medio de cultivo por cromatografía en columnas

de LH-20.

Preparación dela Control FSHmuestra

Medio no extraÍd0(X) 46,96Ï 6,68 112,87Ï11,40

Extracto etéreo 53,48 Ïl4,25 Hó,7óÏ 37,14

cromatografíado en*

LH-20 (Y)

Y =41,36Ï0,45X r=0,9ló

* corregido por recuperación de esteroides de las columnas.

-6]­

para la cantidad de pregnenolona ¡nmunoreactiva obtenida por

ensayo directo con la obtenida luego de extracción y cromato­

grafia. Tanto en cultivos control como en aquellos tratados con

FSH, la estimación del contenido de pregnenolona obtenida lue­

go de cromatografia fue similar a la obtenida por radioinmuno­

ensayo directo del medio de cultivo.

3.1.4 Efecto de CZI-Esteroides sobre la Sintesis Tecal de

Andróge nos.

Se examinó la capacidad de pregnenolona y progeste­

rona exógenas de incrementar la sintesis tecaI de andrógenos.

Preparaciones tecales fueron incubadas por 24 horas en presen­

cia de 0-200 ng de pregnenolona o progesterona. Los resultados

combinados de dos experimentos distintos con 5 replicados por

dosis en cada uno estan representados en las Figuras ó y 7. Aun

que progesterona estimuló significativamente la producción de

A 4-androstenediona (P< 0,001) y de testosterona (P< 0,001),

los niveles presentes en el medio usado (Tabla lll) parecen ser

insuficientes para causar un incremento enla sintesis de andró­

genos.

-62­

aoo_

É‘0‘3 .S g;“1:, 00-150p- L 02“ avo: 1-!z\ EL“4:“ .3IC _‘27V JD4 p

¡.1

PROGESTERONA(nq/m0

Figura ó: Curva de dosis respuesta de cultivos fecales a proges

l'eronCI. Cada punto representa el promedio Ï E.S. de 9 incuba —

ciones.

( ——-—— , A4A;--A--, T)

-63­

200"

<z AO f53 f.Lu o 5°"Z .uLJ 0C s.n­

É a"2<5? m­r< v . i a

o 1 a no ID al)

PREGNENOLONA(ng/nü

Figura 7: Curva de dosis respuesta de cultivos tecales a preg­

nenolona. Cada punto representa el promedio Ï E.S. de 9 incu­

bacíones.

-64­

Pregnenolona, desde concentraciones tan bajas como

25 ng por cuHivo, eflímulósígniHcafivamenle (P< 0,00l)la

sintesis tecal de ¿34 - androstenediona. En presencia de preg­

nenolona,la producción de testosterona fue variable. Sin embaj

go, dado que testosterona representa sólo lO 96 de la cantidad

de andrógeno total( A4Amás T) acumulada en los cultivoste­

cales, los niveles presentes en NlBparecen ser Suficientes pa­

ra provocar un incremento al doble en la sfiflesistotal de an­

drógenos.

Aunque el término "andrógeno total" usado incluye

androstenediona, testosterona y DHT (ya que el RIA usado no

distingue entre estos dos Ülthnos compuestosL se reconoce que

otros andrógenos, como los 5‘(—androstanedioles y androsterg

na, también podrian ser producidos en cantidadessignificati­VOS.

3.2 Rol delas Células Granulosaseriel MetaboHsmo de

Andrógenos.

3.2.1. Capacidades Relativas de los Tipos Celulares Foli­

culares para Sintetizar Andrógenos y Estrógenos.

Células tecales y granulosas derivadas de loliculos

-65­

ovóricos de cerdas prepúberes se separaron y cultivaron, aislo_

dos o en recombinación, por 24 horas. Lo cantidad de esteroi­

des sintetizado en cultivo por foliculo equivalente por los dis_

tintos tipos celulares estó representada enla Figura 8. Los cé­

lulas granulosas produieron cantidades no detectables de todos

los esteroides determinados.

Las preparaciones tecales sintetizaron grandes canti­

dades de andrógenos, predominantemente A4-androstenediona,

siendo la relación de A4-androstenediona a testosterona semi

¡ante a lO . La producción de 17(5 -estradiol por la teca fueescasa.

La acumulación de A4-androstenediona en los co-cul­

tivos fue mucho menor (P< 0,001) que en los cultivos tecales.

La acumulación de testosterona no ditirió significativamente

(P > 0,05) entre co-cultivos y cultivos tecales. Si bien los co­

cultivos produíeron 3 veces mós l7í/al-estrodiol que las prepa­

raciones tecales, la cantidad total de andrógenos (A4A mós T)

y ¡7? -estradiol siguió siendo menor en los co-cultivos que

en los cultivos tecales. También se determinó estrona en algu­

nas muestras pero ésto sólo representó alrededor del 15 °/ode

la producción total de estrógenos (estrona + E 2 ). Lo inclusión

de FSH (l ug/ml) en los co-cultivos no produío efecto alguno

-óó­

El A4-A

NGDEESTEROÍDE/FOLICULO

Teca T+G G

Figura 8: Sintesis de A4—androstenediona ( A4A), testosterona¡Ti y Í7¡3- estradíol (E2) por células tecales y granulosas porci­nas, aisladas y en recombinoción, en 24 hs de cultivo. Cada ba­rra representa el promedio Í E.S. de los resultados de 5 experi­mentos diantos con ó replicados cada uno. Sintesh se refierea la cantidad de esteroide medida en teiido y medio al final delperiodo de culeo menosla cantidad medida en elteiido noin ­cubado.

-67­

sobre la acumulación de A4A y T (datos no mostrados).

3.2.2 Capacidades Relativas delos Tipos Celulares Folicu­

lares para Metabolizar Andrógenos.

Dado que anteriormente se observó que adición de me

dio en que células granulosas habian sido cultivadas estimula­

ba la sintesis tecal de andrógenos, la observación de un efec­

to inhibitorio al co-cultivar células granulosas con preparaci_o

nes tecales sugirió que las células granulosas probablemente

metabolizaban el andrógeno fecal a otros productos. Para exa­

minar esta posibilidad, los distintos tipos celulares foliculares

fueron cultivados en presencia de testosterona o A4-androste­

nediona radioactivas, purificadas por cromatografia en capa

delgada. Al final del periodo de Cultivo, los esteroides se ex_

traíeron a éter dietilico para caracterización posterior, Ines­

peradamente, la radioactividad adicionada alos cultivos no

pudo ser recuperada totalmente en los extractos etéreos en to_

dos los casos. Más aún, los porcentajes de radioactivídad ex­

traibles al éter (esteroideslibres) dependieron del teiido pre­

sente en las incubaciones (P < 0,001). Los porcentaies de radio

-68­

actividad recuperada se muestran en la Tabla V. La mayor par­

te de la radioactividad en los cultivos tecales pudo ser extraí

da con éter. Sin embargo, siempre que los cultivos contuvieran

células granulosas, mas del 50 % de la radioactividad inicial

permaneció en la fase acuosa, no habiendo diferencia alguna

entre los cultivos de células granulosas aisladas y los co-cult_í

vos. En vista de estos resultados se planteó la posibilidad de

que las células granulosas fueran capaces de formar coníugados

de esteroides, solubles en agua.

Al cultivar células granulosas con dehidroepiandroste

rona radioactiva, sólo ll % de la radioactividad permaneció

en la fase acuosa, mientras que al agregar androsterona o DHT

radioactivas, toda Ia radioactividad fue recuperada en el ex­

tracto etéreo.

3.2.3 Metabolismo de Andrógenos por Células Granulosas.

Para obtener mayor evidencia de coniugación de este­

roides y determinar qué tipo de coníugados se formaban, se es­

” l . 3 A4 . ,tudio e metabolismo de ( H) - -androstenediona por celu

las granulosas. En 18 experimentos distintos, 60,4 Í 2,2 % de

-69­

TABLA V

Porcenfoíes de rodíoacfívídod exfrou'ble ol éter luego de cultivo

con (3H)-ondrosfenedíono o (3H)-fesfosferono por 24 horas.

Típo Celular Cultivos con Cultivos con

(3H)-Androsfenedíono ° (3H)-Tesfosterono b

Teco 60,6Ï 4,5 90,9Ï 8,0

Granulosa 24,1i1,2 38,5 :1,4

Teco+Gronulosa 21,3Í 1,0 41,8Ï5,9

° Los valores representan el promedio Ï E.S. de lO replicados.

b Los valores representan el promedio Í E.S. de 5 replícodos .

-70­

la radioactividad inicial permaneció en Ia fase acuosa luego

de extracción con éter dietilico. La tracción acuosa fue exa ­

minada por cromatografia en DEAE-Sephadex. La Figura 9 repr_e

senta el perfil de elución observado en un experimento repre­

sentativo. 57,52 i 4,05 % (n = 18) de la radioactividad en la

fase acuosa eluyó en una posición similar del gradiente (Pico

ll, Figura 9). La Figura lO representa el perfil de elución ob­

servado al cromatografiar en este sistema varios monosulfatos

de esteroides neutros y esteroides libres. Es evidente que el

principal metabolito de androstenediona no corresponde con

testosterona - i7-monosulfato o con androsterona-3 - monosulfa­

to.

El material presente en las fracciones 4-5 (Pico l,

Figura 9) fue completamente extraido al éter. Luego de solvó­

lisis, 98 % de la radioactividad en las fracciones 15-19 (Pico

ll, Figura 9) pudo ser extraido con éter, sugiriendo que 60 %

de la fracción acuosa probablemente consistia de C]9-esteroi_

des neutros coníugados a iones sulfato.

3.2.4 Actividad de Sulfotransferasa en Células Granulosas.

Se realizaron ensayos de actividad de sulfotransferasa

-7]­

20 o 4

3'T Is 9.9 ¡vlx eE n.

o 2o. P zo w

ñ— I

5 tl

o :io

Fracción n'

Figura 9: Perfil de elución de cromatografía en DEAE-Sephadex

de la fracción acuosa obtenida de células granulosas cultivadas

en presencia de (3H)—A4-androstenediona en un gradiente lineal

de NaCl (O-O,8 M).

Pico l: esteroides libres - Pico ll: sulfatos de esteroides ­

El volumen de cada fracción fue de 9,5 ml.

-72­

4

l -03'P 39 í­>-<IO- .02E ,— io. 2 ¿,-— zU '_—

f — ' —o-I ”- z ' Q

a , ' la ' l

a , — lf 1 l l ll­

IO 20 30Fracción h'

Figura 10: Perfil de elucíón de cromatografía en DEAE-Sephadex

en un gradiente lineal (0-0,8 M NaCI) de: pico 'l, DHEA; pico

2, sulfato de testosterona; píco 3, sulfato de DHEA;pico 4, sul­

fato de androsferona.

El volumen de cada fracción fue de 10 ml.

-73­

con el obieto de obtener evidencia independiente de formación

de sulfatos de andrógenos por células granulosas. La Figura ll

representa el perfil de elución en DEAE-Sephadex A25 del pro_

ducto de reacción obtenido al incubar sobrenadante de 100000 g

de células granulosas con (3H) -androsterona, en presencia de

(35 S) - Na2SO4, previa eliminación del sustrato en exceso por35 3extracción con éter dietilico. Se observa que S y H eluye­

ron enla porción del gradiente correspondiente a androsterona­

3-monosulfato, siendo la relación entre 355 y 3H constante

(parte superior de Figura ll). Estos resultados fueron repetidos

dos veces con el mismo sobrenadante de 100000 g. Sin embargo,

sobrenadantes obtenidos de distintos lotes de células granulosas

sólo coniugaron cantidades pequeñas de androsterona, aunque

algunos de ellos coniugaron testosterona. La inconsistencia de

estos resultados sugiere que la capacidad de conjugar estos ari

drógenos no es uniforme en todos los toliculos, o que las con­

diciones óptimas para el ensayo enzimática en teíido ovórico

porcino difieren de aquellas para otros teiidos estudiados.

3.2.5 Estudios Tendientes a la Identificación de los Meta­

bolitos Coníugados por las Células Granulosas.

-74­

0'03 .0.

+ 25 50A T7 IS 40 I° ÏÏ_. 303E 3o.u I-O 20 Zv O

H ¿a¿n 0-5 ¡o 7'

lO 40

Fracción n'

Figura H: Perfil de elucíón de cromatografía en DEAE-Sephadex

de los productos del ensayo enzímóríco de sulfotransferasa en un

gradiente lineal de Na CI (0-0,8 M).

Los sustratos fueron: (3H)-androsterona y (355)—F4025C)4.

EI volumen de cada fracción fue de 9 ml.

-75­

Se realizaron estudios para determinar la identidad de

los esteroides coníugados al cultivar células granulosos en pre

sencia de A4-androstenediona. En la Figura 12 se muestra el

camino de metabolismo de andrógenos que supuestamente se si­

gue en el ovario, en base a resultados obtenidos enla rata

(105, 106). Se llevaron a cabo estudios preliminares tendientes

a encontrar un sistema que permitiera una buena separación de

estos compuestos. El método elegido fue cromatografia liquida

de alta presión (HPLC). Se obtuvo una buena separación de es­

tos compuestos usando una columna de microporasil (fase nor ­

mal) con elsistema cloroformozísooctano(6:4)(Figura 13). El

perfil de elución obtenido ol cromatografiar en este sistema al

producto de solvólisis ¡unto a otros esteroides carrier está re­

presentado enla Figura l4. El pico radioactivo eluyó con un

tiempo de retención de l,2ó-l,40 relativo a A4-androstene ­

diona. La anchura del pico se debe probablemente a que el su_s

trato usado ( A4A) consiste de una población de isótopos. En

efecto, este sistema es capaz de resolver isótopos de un traza_

dor, como se eiemplifica enla Figura 15 para testosterona ra­

dioactiva purificada. Alternativamente, el pico podria conte­

ner varios compuestos, no resueltos por este sistema.

En la Tabla VI se da una lista de los esteroides cromo

“VAL/2029:2862»,#202202»,

mi¡>ZUmOm._.>ZO¡u\_N¡D_OZ>

x/uen¡>ZOxOm._.>ZO¡

A“,uA¡>ZUxOMH>ZOLNm¡OrIuIOZ>

\/

mA¡>ZOmOmfipZOmx¡>Zox0m59ZO

mA¡>ZUmOm._,>ZO

un-OTG-oz>Ï-oT:-oz>mx.Gm-99un:Gm-99

ÏOCmb,dm"ñoamnounaaam.3m_.aco:u30amoaaqmmmaou.

-76­

-77­

AA

‘ DHT

&

A

¿

U 3P' dio' 3<-diol

o é ¡b ¡5 ' 26

Tiempo de Retención (minutos)

Figura 13: Peer de elucíón del cromatógrafo Iïquído de alfa

presión mostrando los Índices de refracción relativos para [x4­

androstenedíono ( [X4A), díhidrotesfosferona (DPíT), androsfe_

rona (A), SOC-androsran-B [3 ,]7(a -dio| (3/5 -d¡o|) y 50( -an _

drostan-30<,17P —dío|(34-dío|L Loscueroídesfueronsepargdos en una columna de mícroporasH yel üsfema de solventes

cloroformozísoocfano ::ó:4; 3 mI/mín.

-78­

y Peron!CHCIJ:nsooctano (6:4)

l 20 3-0 nal/min

"i" IUo W "x l: ¿ Epsondrostuono x|

;‘, OHT": Q Anarosterom m|| g I l

E '° 5': 2 :3 Icx :2 : 5': .". '

° 5 : í : 1 5';I I 1 ' ' |

: '. : : 1| .' x

i ‘. J E a J a

O 5

'T‘iernpode Retención (minutos)

Figura 14: Separación por HPLC de los productos de solvólïsís

de Ia fracción de monosulfafo neutro en una columna de micro­

porasíl y el sistema de solventes cloroformo: ísoocfano z: ó :4,

3 mI/mín.

-79­

l 1

7 3A 1°9 I x

x 5' ,5, CD

s 1: Io. :I .U l:

llll

L'x A5 ¡o

Tiempo de Retención (minutos)

Figura 15: Separación por HPLCde ¡sótopos de (3H)-testostero­

na.

(l, 2, ó, 7, 16, 17 3 H)-Testosterona y testosterona no radio ­

activa fueron cromatografíados en una columna de microporasíl

con el sistema de solventes cloroformo: ísooctano :: ó : 4; 3 ml/

mín.

-80­

TABLA VI

Tiempos de retención relativos de algunos esteroides de 19 ótomos

de carbono en HPLC (columna UPorosíI; CH Cl 3: ísooctono :: ó : 4,­

3 mI/min).

Esteroíde Tiempo de Retención

Relativo a Androstenedíono = 1

Compuesto desconocido I,26-T,40

5<4-D¡hídrotestosterono (DtiT) 1,28

Epíondrosterono 1,45

Androsterona 1,67

Testosterona 2,68

5d-Androstono-3¡/¿,T7í/5 -díol 2,80Etiocolonolono 3,04

5 d -AndroMono-3c4-¡7fl -dio| 3,73

5 vc -Androst-Tó-en-30(-ol 0,59

ScÁ -Androstano-3,T7-díono 0,57

Sci -Androst-Tó-en-3-ono 0,55

Tiempo de retención de A4-Androstenedíono= 5 mÍnUÍOL

-3]­

tografiados en este sistema con sus tiempos de retención en el

mismo. Aquellos esteroides con tiempos de retención semeian­

tes al compuesto desconocido (DHT, epiandrosterona, androst_e

rona) fueron descartados por datos de recristalización. Al oxi_

dar este compuesto por el método de Jones, y someterlo a cro­

matografia en este sistema, la rodioactividad eluyó con un

tiempo de retención semeíante a A4-androstenedíona. La ¡den

tídad del producto de reacción fue confirmada por recristaliz_a

ción con [14C]-A4-androstenediona a relación l4C/3H cons ­

tante.

La reducción con borohídruro de sodio dio lugar a dos

compuestos que se comportaron como dioles en este sistema.

Esto sugiere que el compuesto es un esteroide no saturado con

una función ceto y un hidroxilo.

Aunque el metabolito representó aproximadamente 40%

del producto solvolizado en los dos primeros lotes de células

examinadas, otros lotes produieron cantidades mucho menores

de este compuesto. Se decidió entonces emplear otros sistema

para determinar la identidad de los metabolitos producidos al

incubar células granulosas con A4-androstenediona.

En la Figura ló se ilustra el perfil de elución del pr_o

ducto solvolizado en una columna de fase reversa con el siste­

-32­

30 ILF

I'T 2°"2xEo.9 ID­

1 jO lO 410

Tiempo de Retención (minutos)

Figura ló: Separación por HPLCde los productos de solvólhís de

Ia fracción de monosulfato neutro en una columna C18 Radial Pak

Cartridge y elsístema de solventes acetonítrHo

1 ml/mín.

:agua u 4 :ó,

-83­

ma acetonitrilo:agua (4:6). Se observaron varios picos; el cor_n

puesto más abundante aparece con un tiempo de retención de

3,5-4,5 minutos (O,27-0,35 relativo a ¿4-androstenediona).

Contrariamente al metabolito anterior, la presencia de este

compuesto fue consistente en todas las incubaciones realizadas

(ló lotes de células obtenidos en distintos dias). Este producto

no eluye dela columna de microporasil con el sistema de sol­

ventes usado debido a su alta polaridad.

Los tiempos de retención de varios esteroides en el

sistema de fase reversa empleado se encuentran en la Tabla Vll.

Es evidente que en este sistema sólo l9-hidroxi-androstenedio­

na y l9-hídroxi-testosterona presentan tiempos de retención

milares al compuesto desconocido.

El mayor pico de la Figura ló (ll, tiempo de retención=

3,5-4,0 minutos) se cromatografió luego en una columna de fa­

se reversa con el sistema metanolzagua (6:4), presentando un

tiempo de retención de 4 minutos. Baio las mismas condiciones,

l9-hidroxi-androstenediona y l9-hídroxi -testosterona eluyeron

a 3,90 y 3,75 minutos respectivamente.

Al ser cromatografiado en capa delgada, el metaboli­

to radioactivo se comportó como un compuesto muy polar , con

un Rf semejante a l9-hidroxi-androstenediona standard. Sin em

-34­

TABLA VII

Tiempos de retención relativos de algunos esteroides de 19 átomos

de carbono en HPLC (C18 RAD. CART. 10, 5 mm l.D.; ocetonítrilo:

agua :: 4: ó; 1 mI/mín).

Esteroíde Tiempo de Retención

Relativo o Androstenedíono= 1

Pico 1 de HPLC 0,19Pico 1| de HPLC 0,27-0,3519-Hídroxítestosterono 0,2219-Hídroxí- B4-Gndrostenedíono 0,264-Androsten-3,17';'-d101 0,67Testosterona 0,814-Androsten-3lb, 17‘1-dío1 0,825.a: -Androstono-3¿ ,17 5 —díol 0,854-Androsten-3«v._-Ï,17¡5 -dío| 0,864-Androsten-313—o|—17-ono 0,8650< —Androstano—3<x ,17¿’5—díol 1,08545 —Androstan—3|3—o|-17-ono 1,14Díhídrostestosterona (DHT) 1,2153/5-Androston-30<-o|-17-ono 1,27Androsterona 1,4950€,—Androstano-3,17-díono 1,515°! -Androst -1ó-en-3“/ -o| *5-“4-Androst -1ó-en-3 3-01 *

* No eluído luego de 20 minutos en este sistema.

Tiempo de retención de Ali-androstenedíona = 12,91 minutos.

bargo, recristalízación delcompuesto radioactívo con l9-hidroxi­

androstenediona o l9-bidroxi-testosterona indicó que no ero nin_

guno de estos.

Por los resultados obtenidos en cromatografía en Sepha_

dex A25, en capa delgada y de alta presión, este compuesto pa­

rece ser un hidroxi-esteroide, no saturado, no fenólico.

En este sistema, en algunas incubaciones se observó un

pico a un tiempo de retención de 1,2] respecto a A4-androste­

nedíona, que correspondia al metabolito aislado en el sistema

de fase normal.

La identidad delos compuestos coniugados por las cé­

lulas granulosas porcinas no pudo ser determinada. Los esteroi­

des Sd-y 3M -reducidos, que son producidos por ovarios de o­

tras especies (105, lOó) fueron descartados debido a sus tiem­

pos de retención en los sistemas cromatogróticos usados (Tablas

Vl y Vll). El hecho de que ni androsterona ni DHT Fueron con­

¡ugados por las células granulosas también sugiere que es imprí)

bable que los compuestos coníugados sean metabolitos 54-redg

cidos de A4-androstenediona. Asimismo, se descartó la posibi­

lidad de esteroides 5 [5-reducidos. Es improbable que sean Aló­

andrógenos, formados en grandes cantidades por teíido testicu­

lar de cerdo (l07) debido a su compartamiento en HPLC de fase

-86­

normal (Tabla VI) y reversa (Tabla Vll). Otros estudios usando

métodos fisicos en cantidades mayores de este coniugado serian

necesarios para elucidar sus estructuras completamente.

3.3 Efecto dela Teca sobre Ia Sintesis de Progesterona por

las Células Granulosas.

3.3.] Efecto de los Andrógenos sobre la Acumulación de

Progesterona por Células Granulosas.

Células granulosas fueron incubadas por 24 horas en

presencia de testosterona, A4-androstenediona, DHTo andros­

terona en combinación con o sin l ug de FSH. Cada andrógeno

se incluyó a concentraciones de 0,5 uM y 5 uM. Finalizados

los cultivos, se determinó la cantidad de progesterona y 17,47­

estradiol acumulada. Los experimentos se realizaron por lo me­

nos 2 veces con distintos lotes de ovarios. En cada experimen­

to, cada tratamiento se replicó 4 veces.

Experimentos preliminares indicaron que el contenido

de 17} -estradiol de las células luego del cultivo estaba por

debaío de los limites de detección del ensayo. Aunque el con­

-87­

tenido tisular de progesterona era mós significativo (aproxima­

damente 25 %>de la acumulación totalL el contenido Hsular

estaba siempre altamente correlacionado con el contenido en

el medio de cultivo, independientemente de la presencia de

FSH o FSH y testosterona (controL r = 0,96;+ FSH, r = 0,99;

+ FSH + T, r = 0,99). Por lo tanto, los resultados se expresaron

en términos de acumulación de progesterona o l7 3 -estradiol

en el medio de cultivo por foliculo equivalente.

En ausencia de andrógenos, FSH conshtentemente esü

muló lO vecesla sintesü de progesterona. Ninguno de los an ­

drógenos afectó significativamerne la sintesis basal de proges­

terona; por lo tanto estos resultados no se presentan. Los efec­

tos de los distintos andrógenos sobre Ia acumulación de progeí

terona en respuesta a FSH se presentan en las Figuras 17-20;

en el caso de testosterona y Ót4-androstenediona, se incluyen

los datos para la acumulación de 17 5 -estradiol; dado que los

andrógenos no aromatizables, DHTy androsterona, no afecta­

ron la acun1ulación de 17 5 -estradiol, estos datos no estón gng

ficados.

En la Figura 17 se observa que testosterona inhibió la

producción de progesterona en respuesta a FSH de una manera

dosis-dependiente (P< 0,001), mienhas quela acumulación

-88­

u 75'aO

fi ESTRADÍOL'WB5';“ '3 507u u PROGESTERONAo \­z 3o ‘4­

5 E 25­< c_J v

:2)< c0 0.5 5.0 O 0.5 5.0

MH TESTOSTÏRONA

Figura 17: Efecto de testosterona sobre la acumulación de pro­

gesterona y17P-estradíol por células granulosas en cultivo en

presencia de l ug/ml de FSH (n: 14).

-89­

uOo(zLAJ

i; 7;Lu .5. pRoGESTERONA ESTRÁDIOL'ITOLJ U

D 1-: a42 Oo ‘0­u Ü< fi_J VD5:3<Í

O0 0.5 5.o o 0.5 5.0

un M-ANOROSTENEDMR

Figura 18: Efecto de A4—androstenedíona sobre la acumulación

de progesterona y 17(3 -estradíol por células granuloscls en cul­

tivo en presencia de ï ug/ml de FSH (n: 12).

-90­

25*

FL

PROGESTERONA(ng/folículo)

O 0.5 5.0

uM DHT

Figura 19: Efecto de díhïdrofesfosterona (DHT) sobre la acumu­

lación de progesterona por células gronulosas en cultivo en pre­

sencia de I ug/ml de FSH (n = 10).

-9]­

50'

"3

_L IE\ÜÉ

V 25u‘z‘o5}_

:3Ü8O.

o 0 0.5 5.0

ANDROSTERONA

Figura 20: Efecto de androsterona (A) sobre la acumulación de

progesterona por células granulosas en cultivo en presencia de

lug/ml de FSH (n = 8).

-92­

de 17? -estradiol aumentó al incluirse testosterona en los cu_l

tivos (P< 0,001). Similarmente, A4—androstenediona inhibió

Ia acumulación de progesterona en respuesta a FSH (P<0,001)

y aumentó la de 17:6-estradiol (P< 0,001) (Figura 18). DHT

(Figura 19) y androsterona (Figura 20) no produieron efecto al

guno sobre la acumulación de progesterona estimulado por FSH.

El efecto de testosterona sobre la sintesis de progest_e

rona en presencia de FSH en' células granulosas aisladas de o­

varios de cerdas maduras se presenta enla Tabla Vlll; también

en este caso testosterona inhibió significativamente (P<0,05)

la sintesis de progesterona en respuesta a FSH.

3.3.2 Efecto de Testosterona sobre el Metabolismo de Proges­

terona.

Con el obieto de determinar si testosterona causaba

una reducción en la acumulación de progesterona estimulado

por FSH mediante la inhibición de la sintesis de progesterona

ola estimulación de su metabolismo, células granulosas fueron

incubadas en presencia de (14C) -progesterona (luM) y FSH,

con o sin testosterona (SUM). Luego de un periodo de 24 horas

-93­

TABLA VIH

Acunuflación de progesterona (ng/folículo equivalente) por célu­

las granulosos obtenidas de foliculos de tamaño mediano de cer ­

dos sexualmente maduras en 24 hs de cultivo (n=4).

*

Progesferona

control 4,5 Ï 0,2 a

FSH 36,9Ï7,5bFSH+O,5uMT 20,9Ï4,7°

FSH + 5 UM T

Las diferencias entre a y b, a y c, y, b y c fueron significati­

vas a P<.0,05 (Prueba de rangos mGIlees de Duncan).

-94­

de cultivo, el porcentaíe de recuperación de la radioactividad

inicial asociado con progesterona fue de 43,1Ï10,l %(n:3)

en presencia de testosterona, no significativamente distinto de

los controles sin testosterona (30,9 Í 5,2 %, n :3). Esto sugie­

re que testosterona no estimula el metabolismo de progesterona,

y por lo tanto eíerceria su efecto sobre la acumulación de pro­

gesterona inhibiendo su sintesis.

3.3.3 Efecto de 17;"?-Estradiol sobre la Sintesis de Proges­

teronag

Dado que los andrógenos aromatizables podrian eier­

cer su efecto ínhibitorio sobre la acumulación de progesterona

por via de su conversión 017/5-estradiol, fue importante deter_

minar si estradíol inhibia la sintesis de progesterona en este

sistema. Por lo tanto se incluyó estradíol en los cultivos a con_

centraciones de 0,5/uM y 5/uM. Como se observa enla Figura

2], la acumulación de progesterona en respuesta a FSH disminii

yó en presencia de 173 -estradiol (P4 0,001), confirmando que

estradíol es inhibitorio a estas concentraciones.

-95­

l25<

¡00* r—LT

75­

50­

25*

PROGESTERONA(ng/Fai(culo)

0 0.5 5.0

HM ESTRADIOL'I'IB

Figura 21: Efecto de 17 fi-estradíolsobre Ia acumulación de

progesterona por células granulosas en cultivo en presencia de

I ug/ml de FSH (n= 8).

-96­

3.4 Mecanismo por el cual los Andrógenos Inhiben la Sintesis

de Progesterona por Células Granulosas en Respuesta a

FSH.

3.4.]. Relación Temporal entre la Acumulación de Proges­

terona y l7 .7-Estradiol en Cultivo en Presencia de

FSH y Testosterona.

Células granulosas fueron Cultivadas en presencia de

FSH solo o FSH y testosterona (SUM). Los cultivos se interrum­

pieron alas 4, 8, ló o 24 horas. La acumulación de progester_o

na esta' representada en la Figura 22 y la de estradiol en la Fi_

gura 23. Los datos se analizaron por análisis de varianza en

dos direcciones. Los niveles de progesterona (P4 0,001) y de

17:5 -estradiol (P < 0,00l) aumentaron con tiempo en cultivo.

En presencia de testosterona, la acumulación de progesterona

fue inhibida al nivel de P <' 0,05 a todos los tiempos estudiados

(Prueba de rangos múltiples de Duncan) y, similarmente, la a­

cumulación de ¡75-estradiol estuvo significativamente eleva­

da (P < 0,05) a todos los tiempos estudiados. En ausencia de

testosterona, Ia acumulación de progesterona aumentó marcada­

mente entre 4 y 8 horas de cultivo, pero, en presencia de tes­

tosterona, no aumentó sustancialmente hasta después de 8 horas

-97­

20q

A0Éu

M.

,3 FSH\0ÉV lo.< Jz z8 zlU Il... x{3 ,’FSH+TQ z8 _,—(L “'—

#_—*———_-_F’I I I 1—

o H 8 ¡6 2%

Tiempo en cultivo (horas)

Figura 22: Curva de tiempo para la acumulación de progestero­I O O Ína por celulas granulosas en cultivo. El medio contenla un fo­

lículo equivalente de células, 1 ug/ml de FSH, y ningún este ­

roíde (línea entera) o testosterona 5 uN\(|ïneo quebrada)(n==4).

-98­

g.Ao

3 /y l- FSH+'T' /8 //\ /o lS xV IJ q“ x0 /"' Í3 /a /IC; zu x| lQ ,L_-_J,

N ,1_ lz FSH/

A I Ï ' Í0 H 8 (6 aq

Tiempo en cuLtívo (horac)

Figura 23: Curva detïempo parala acumulación de 17/6-esna

díol por célula; granulosas en cultivo. Elrnedïo contenía un fo­

lículo equivalente de células, 1 ug/ml de FSH, y ningún esteroí

de (línea entera) o testosterona 5 uN\(|ïnea quebrada) (n = 4).

-99­

en cultivo. En presencia de testosterona, la acumulación de

17'?)—estradiol no se alteró entre las 4 y 8 horas de cultivo y

no aumentó notablemente hasta después de las 8 horas. Es decir

que la acumulación de progesterona fue inhibida por testostero_

na antes de un aumento sustancial en los niveles de estradiol;

3.4.2 Efecto de un lnhibidor dela Aromatasa sobre la

Inhibición dela Sintesis de Progesterona por Tes­

tosterona.

Para obtener mayor evidencia de que el efecto inhib¡_

torio sobre la acumulación de progesterona era causado por tes

tosterona misma,sin previa conversión a 171%—estradiol, célu­

las granulosas fueron cultivadas en presencia de FSH, con o

sin testosterona (0,5 u M y 5 uM) y con o sin l ug de 4-ace_

toxi-4-androsten-3,l7-diona( 4 a A). Este Último es un inhib_i

dor efectivo de la aromatasa (108). Los resultados estón repre­

sentados en las Figuras 24 (acumulación de progesterona) y 25

(acumulación de 17 —estradiol). Anólisis de varianza en dos

direcciones demostró que testosterona promovia la acumulación

de estradiol (P< 0,001) y que 4 a A Ia inhibia efectivamente

-IOO­

IZS

¡0° -4-ocfloxy-A “accion-A

PROGESTERONA

(ng/folículo)

u9,

' o 0.3 5.o o 0.5 5.o

uu TESTOSTERONA

Figura 24: Efecto de un inhibidor de la aromarasa sobre la acu­

mulación de progesterona por células granuloscs en cultivo. El

medio contenía un foll'culo equivalente de células, 1 ug/ml de

FSH, 0 o i ug/ml de 4-0cetoxï-androstenediona, y las concen­

traciones indicadas de testosterona. (n=9).

-]O]—

IOOï-4-ocoto¡y-A #4-ncotoly-A_J A

9. 3 75C) :1< Ua: ‘­23 —— 504

w 5|Q ¡a 4N .C 25

00 0.5 5.0 0 0.5 5.0

HH TESTOSTERONA

Figura 25: Efecto de un inhibidor de la oromatosa sobre la o­

cumulacíón de 17(5-estrodíol por células gronulosas en cultivo.

El medio contenía un folículo equivalente de células, 1 ug/ml

de FSH, 0 o] ug/ml de 4-ocetoxí-androstenedíona, y las con­

centraciones indicadas de testosterona. (n- 9).

-102—

(P < 0,001); no habia interacción. Sin embargo, en presencia

de 4 a A, testosterona seguia inhibiendo Ia sintesis de proges

terona. Por lo tanto, 4 a A no pudo impedir la inhibición de

la sintesis de progesterona dependiente de testosterona.

3.4.3 Efecto de Testosterona sobre la Sintesis de Progeste­

rona Estimulada por Dibutiril-AMP ciclico.

Los andrógenos podrian inhibir la producción de pro­

gesterona en respuesta a FSH interfiriendo con la unión de

FSH a su receptor, interfíriendo con el acoplamiento del rece_p

tor ala adenilato ciclasa enla producción de AMPciclico,

estimulando la Fosfodiesterasa y/o inhibiendo las enzimas inv_o

lucradas en Ia biosintesis de progesterona. Para determinar si

los andrógenos actuaban antes o después de la producción de

AMPcíclico, células granulosas fueron cultivadas por 24 horas

en medio conteniendo dibutiril AMP ciclico timM) solo, testo_s

terona (5 UM) sola, o testosterona y dibutiril AMP cíclico, en

un experimento factorial 2x2. Como se observa enla Figura 26,

dibutiril AMPciclico estimuló significativamente (P < 0,001)

la sintesis de progesterona tanto en ausencia como en presencia

-103­

ñ3 IOr'

3 r_J_'8s.\qc

5­ï2gu¡.­UIuÉa. C y

(Bu)2cAMP - 0 - .

T ‘ " t ‘

Figura 26: Efecto de cultivar células granulosas porcinas por

24 hs en medio solo (control), con testosterona (5 uM) y/o

(Bu)2 CAMP (1 mM) sobre Ia acumulación de progesterona (pro­

medio Í E.S.; n :12).

—lO4­

de testosterona, y testosterona eierció una inhibición signifi­

cativa (P< 0,002) sobre la sintesis de progesterona. Una inte­

raccíón altamente significativa (P<0,01) indicó que el efecto

de testosterona sobre la acumulación de progesterona era dife­

rente dependiendo de la presencia o ausencia de dibutiril AMP

cíclico.

Células granulosas fueron cultivadas por 24 horas en

presencia de distintas cantidades de dibutiril AMPciclico y

testosterona. La acumulación de progesterona en el medio de

cultivo está representada en lo Figura 27. En ausencia de tes­

tosterona, dibutiril AMP ciclico estimuló la producción de te_s_

tosterona (P< 0,001) de manera dosis-dependiente; una dosis

de 0,5 mMde dibutiril AMP ciclico fue suficiente para causar

una estimulación significativa (P< 0,05). La presencia de tes­

tosterona inhibió significativamente (P<0,01) la sintesis de

progesterona estimulado por dibutiril AMP cicl ica, pero no a­

fectó la sintesis basal de progesterona (P> 0,1). En presencia

de testosterona 0,5 uM, la menor concentración de dibutiril

AMPciclico necesaria para producir un aumento significativo

enla sintesis de progesterona fue de i mM, mientras que, en

presencia de testosterona 5 u M, se requirieron 2 mM de dibuLi

'ril AMP cíclico. La acumulación de progesterona en presencia

-105­

A yo

— Control5U\..3É

C

V ¡1 OSuMT

U‘- tr_ _ - ' SUHT

É ' Ï

mM (Bu)z CAMP

Figura 27: Relación dosis-respuesta enla estimulación dela

acumulación de progesterona por díbutíril AMP cíclico en pre­

sencía o ausencia de testosterona. Los puntos representan el

promedio Ï E.S. de 4 cultivos replicados.

-lOó­

de l Ug/ml FSH fue de 18,5 Í 4,7 ng/cultivo, y fue disminui­

da a 4,7 0,9 ng/cultivo en presencia de testosterona 5 uM.

Estos resultados sugieren que la inhibición es eiercida a un pa

so posterior a la formación de AMP ciclico.

3.4.4 Efecto de los Andrógenos sobre la Sintesis de Preg­

nenolona por Células Granulosas.

Con el obieto de determinar la capacidad de las célu

las granulosas de sintetizar pregnenolona en cultivo, células

granulosas fueron cultivadas por distintos tiempos en presencia

o ausencia de FSH. Finalizado el periodo de cultivo, pregneng

lona fue determinada por radioinmunoensayo de alicuotas del

medio de cultivo y de los extractos etanólicos del teíido. La

cantidad de pregnenolona acumulada en el medio asi como el

contenido total de pregnenolona en medio y células al final de

los distintos periodos de incubación estan representados en la

Figura 28. Los cultivos control sintetizaron pregnenolona alo

largo de las 48 horas de cultivo, aunque la sintesis fue menor

luego delas primeras 24 horas. FSH estimuló significativamen­

te (P< 0,001) tanto la acumulación en el medio de cultivo co­

-lO7-—

—rsnA

Go .

Ao:3u

‘v

0c...hc 'noob /l/TFSHV /

I< I /z , ___---CONTROLo ’ 1__ _ - - ' 'á I ¡alZ 50" ,g .:"(i) l corme

I ,

1'“,a c'- Ic 4 á Iï ¿a ¿o

TlEHPO EN CULTIVO (horas)

Figura 28: Curva de tiempo para la sïnfesís de pregnenolona

(medida en feiído y medio) en presencia (A) y ausencia (c1)

de FSH, y de Io acumulación de pregnenolona en el medio pa­

ra cultivos control (I ) y tratados con FSH (A Cada punto

representa el promedio Ï E.S. de 4 íncubacíones.

-108­

mola cantidad total de esteroide sintetizado. Esta estimulación

fue evidente a partir de las primeras 4 horas de cultivo.

Como se observa enla Figura 28, la cantidad de preg

nenolona presente en el teiido fue alta tanto a tiempo cero c2

mo al final de los distintos periodos de incubación. Sin embar­

go, eI perfil de acumulación en medio de cultivo no difirió

del de sintesis total (cantidad de esteroide presente en medio

y teiido al final del periodo de cultivo menos el contenido ti­

sular inicial). Más aún, la cantidad total de pregnenolona sir_¡_

tetizada estaba altamente correlacionada con la cantidad pre­

sente en el medio en los cultivos control (r: 0,970) y en los

tratados con FSH (r = 0,991). Dado que en presencia de testo_s

terona 5 uM (datos no mostrados), la cantidad de esteroide a­

cumulada en el medio también estaba altamente correlacione­

da con la cantidad total sintetizado ( r = 0,986), en experi ­

mentos subsiguientes sólo se determinó la acumulación en el

medio de cultivo.

Para determinar el efecto de los andrógenos aromati­

zables sobre la sintesis de pregnenolona, células granulosas

fueron cultivadas por 24 horas en presencia de A4-androsten_e

diona o testosterona a concentraciones de 0,5uM y 5uM,

-109­

con o sin FSH. Como se observa en la Figura 29, adición de

A4-androstenediona a células granulosas estimuló significat_i

vamente la sintesis basal de pregnenolona (P < 0,001). En pre­

sencia de FSH, A4-androstenediona estimuló la sintesis de preg'

nenolona de uno manera dosis-dependiente (P < 0,05).

El efecto de concentraciones bajas (5 x lO-7M) y al ­

tas (5 x lO-óM) de testosterona sobre la producción de pregne­

nolona por células granulosas en cultivo estó representado en

la Figura 30. La concentración alta causó un incremento del

40 % en la acumulación basal de pregnenolona (P< 0,01) y del

60 °/oenla acumulación de pregnenolona estimulado por FSH

(P < 0,05).

Para determinar si los andrógenos estimulaban la si'nte

sis de pregnenolona actuando antes o después de la formación

de AMPciclico, células granulosas fueron cultivadas por 24

horas en medio conteniendo dibutiril AMP ciclico (l mM) solo,

testosterona (5uM) sola o testosterona y dibutiril AMPciclico

en un experimento factorial 2 x 2. Como se observa enla Figura

3], dibutiril AMPciclico estimuló significativamente (P< 0,001)

la acumulación de pregnenolona en presencia o ausencia de tes­

tosterona. Testosterona aumentó significativamente (P< 0,001)

la sintesis de pregnenolona. La ausencia de una interacción

-110­

¡50

A a CONTROL

_°_ Ü FSH:1

O I\_

i D0­cV<23o so»zuZoua:a fi

c 0..CONTROL 0-5 un A‘A 50M a‘A

Figura 29: Efecto de A4-cndrostenedíona ( A4A) y FSH sobre

la producción de pregnenolona durante un período de cultivo

de 24 hs. Los valores representan el promedio Ï E.S. de 8

cultivos.

-H]­

3E3 CONTROL

CJ FSH

3.

PREGNENOLONA(ng/(ol{cuto)

son

o fi fi gCONTROL 05 UMT 50H T

Figura 30: Efecto de testosterona (T) y FSH sobre la acumula­

ción de pregnenolono en 24 hs. Los valores representan el pro­

medio Ï E.S. de 8 cuIt-ívos.

-112­

po 6o

[7(BMZCAMP - o - 6

T - ' ‘ *

PREGNENOLONA(ng/folícul

Figura 3]: Efecto de testosterona (T , 5 x 10-6 M) y díbutí­

ríl AMP cu'clíco (1 mM) sobre la producción de pregnenolona

en 24 hs. Los valores representan el promedio Ï E.S. de 12

cultivos.

-113­

significativa indicó que este efecto era independiente de la

presencia de dibutiril AMPciclico.

Células granulosas fueron cultivadas por 24 horas en

presencia de distintas cantidades de dibutiril AMPciclico. La

acumulación de pregnenolona en el medio de cultivo está repr_e

sentada en la Figura 32. Dibutiril AMPciclico estimuló signi­

ficativamente (P < 0,00l)la sintesis de pregnenolona desde la

menor concentración ensayada (0,5 mM). Testosterona causó un

incremento significativo (P< 0,001) en la sintesis de pregnen_o_

lona en respuesta alas distintas concentraciones de dibutiril

AMP ciclico. La mayor dosis fue efectiva a todos los niveles

de dibutiril AMP ciclico mientras que la menor sólo produío un

aumento significativo (P < 0,05) a una concentración de dibut_i

ril AMP ciclico de l mM. Estos resultados demuestran que los

andrógenos aromatizables aumentan la acumulación de pregne­

nolona en cultivos control asi como en presencia de FSH o de

dibutiril AMPciclico. Dado que anteriormente se observó que

los andrógenos aromatizables inhibian la sintesis de progestero­

na dependiente de FSH en los mismos Cultivos, la observación

de un efecto estimulatorío sobre la sintesis de pregnenolona su­

giere que estos andrógenos actúan sobre la conversión de preg­

nenolona a progesterona dependiente de FSH.

-114­

PREGNENOLONA(ng/rolrculo)

rnM (Bu), CAMP

Figura 32: Relación dosis-respuesta enla estimulación de la

acumulación de pregnenolona por díbufíríl AMPcïclíco en

presencia o ausencia de testosterona. Los puntos representan

el promedio Í E.S. de 4 cultivos replicados.

4.0 DISCUSION

4.1 Rol delas Células Granulosas enla Sintesis de Andróge­

nos.

La mayor parte de la evidencia acumulada en base a

estudios "in vitro" con tipos celulares ovóricos aislados sugie­

re que, al menos en los estadios mas tempranos del desarrollo

folicular preovulatorio, las células tecales y granulosas actúan

sinergisticamente enla biosintesis de estrógenos. La naturaleza

de este sinergismo parece ser el de un pasaíe de sustratos : las

células tecales producen andrógenos que son luego transporta­

dos alas células granulosas, donde son aromatizados a estrógi

nos (38).

Esta bien establecido que las células tecales son res­

ponsables dela sintesis folicular de andrógenos y que LH es la

gonadotrofina responsable de su control (109-114). Los resulta_

dos de la primer parte de esta investigación indican que, en

ausencia de LH, las células granulosas proveerian el sustrato

(pregnenolona), para la sintesis tecal de andrógenos; esto pro

porciona evidencia de interacción entre ambos tipos celulares

-lló­

en la sintesis basal de andrógenos.

Medio en que células granulosas habian sido cultiva ­

das previamente en presencia de FSH estimuló la sintesis tecal

basal de andrógenos ( A4-androstenediona y testosterona).

Estudios en diversas especies han indicado la presen­

cia en el fluido folicular de factores no esteroideos (probable­

mente péptidos) que regularfan la maduración del ovocito, la

luteinización de las células granulosas y la unión de FSH a

células granulosas, asr' como la secreción pituitaria de FSH

(reseñado recientemente, 115). Dado que las células granulo­

sas parecen ser las células folículares responsables dela sinte­

sis de por lo menos dos de estos factores (lló, H7), pareció

razonable suponer que el efecto de las células granulosas so­

bre la sintesis tecal de andrógenos es ejercido mediante la producción de un factor similar.

Al ser extraido con carbón-dextrón, el medio usado

por células granulosas perdió su capacidad de estimular la sin

tesis de andrógenos, indicando que alguna pequeña molécula

presente en dicho medio seria la responsable de esta estimula­

ción. El hecho de que cultivos tratados con 50 °/ode medio u­

sado extraido con carbón-dextrón produieran cantidades signi_

ficativas de andrógenos (similares a los cultivos control) indi

—ii7­

c6 que la ausencia de efecto del medio extraido no se debia a

cantidades limitantes de algún factor necesario para la super­

vivencia delas células tecales en cultivo. Aunque la extrac ­

ción con carbón-dextrón podria eliminar otras moléculas pequ_e

ñas, se examinó la posibilidad de que las células granulosas

actuaran proveyendo un precursor esteroideo.

Se sabe que las células granulosas porcinas producen

grandes cantidades de progesterona, siendo esta sintesis esti­

mulada por FSH (y LH) (27). La sintesis de pregnenolona por

cultivos de células granulosas porcinas no ha sido determinada

anteriormente. Los resultados de este estudio indican que Ia

sintesis de pregnenolona inmunoreactiva es incluso más eleva

da que la de progesterona. También se observó que el fluido

folicular porcino contiene niveles mas elevados de pregnenol_o

na que de progesterona (datos no publicados). Aunque Ia iden­

tidad del material semeíante a pregnenolona no fue confirma­

da quimicamente, Ia relación observada entre los niveles de

pregnenolona inmunoreactiva medida en estos experimentos en

el medio usado por células granulosas, y la capacidad del me

dio de estimular Ia sintesis tecal de andrógenos, respalda nue_s

tra interpretación de su identidad.

Si bien progesterona exógena fue capaz de incremen­

-118­

tar la sintesis tecal de andrógenos, los niveles de este esteroi

de presentes en el medio usado por Cultivos de células granulo

sas parecieron ser baios para causar el aumento observado. Los

niveles de pregnenolona presentes en MB (medio usado por cé­

lulas granulosas cultivadas en presencia de FSH) podrian cau­

sar este aumento. Sin embargo, las cantidades relativas de am

bos andrógenos fueron distintas; medio usado por cultivos de

células granulosas estimuló la sintesis de testosterona al do­

bl I d A4 d d' I ' Ie y a e -an rostene ¡ona a trip e, en tanto que una

cantidad equivalente de pregnenolona exógena causó un aumen

to de 2 veces en la producción de A4-androstenediona y un au

mento menor enla de testosterona.

Estos resultados, que demuestran utilización de preg­

nenolona exógena para lasintesh de andrógenos, estén de a ­

cuerdo con informes previos sobre estudios "in vivo" e "In vr­

tro”. Young Lai y Short (118) inyectaron pregnenolona radioac

tiva dentro de un foliculo ovórico de una yegua y encontraron

. ., . . . N4 .¡ncorporacuon dela radioactiwdad en z. -androstenediona en

sangre de vena ovórica. Lacroix y col. (H9) observaron con ­

ut . - .versnon de pregnenolona radioactlva a -androstenediona por

preparaciones tecales bovinas en cultivo. Fortune (i20) demos

tró interacciones entre células tecales y granulosas bovinas

-ll9­

C -esteroides, en presencia de LH.enla sintesis de Cl9-y 2]Nuestras observaciones indican que, en el ovario porcino, las

células granulosas podrian proveer el sustrato C21-esteroideo

en ausencia de estimulación por LH. De este modo las células

granulosas podrian controlar la sintesis tecal de andrógenos

cuando LH no está disponible. Ya que las células granulosas d_e

rivadas de foliculos medianos de cerdo son capaces de aromat_i_

zar andrógenos a estrógenos (29, 31), el hecho de que estimu­

len la sintesis tecal de andrógenos plantea la interesante pos_i_

bilidad de un rol para las células granulosas en controlar la

sintesis del sustrato que usan para la aromatización.

4.2 Capacidades Relativas de los Tipos Celulares Foliculares

Aislados y en Recombinación para Sintetizar Andrógenos

y Estrógenos.

Las preparaciones tecales produíeron grandes cantida_

des de andrógenos, predominantemente androstenediona. Las

preparaciones de pared folicular (foliculo en que se hizo una

incisión para eliminar el fluido folicular, deíando intactas la

capa tecal y la membrana granulosa) produíeron cantidades más

-120—

elevadas de testosterona que las células tecales (observaciones

no publicadas). Esto está de acuerdo con evidencia en cerdo

(25), hamster (121))! oveia (37) de que las células granulosas

poseen una actividad de l7fi-hidroxiesteroide deshidrogenasa

más elevada que las tecales. Las preparaciones tecales produ­

¡eron cantidades pequeñas de estrógenos; adición de células

granulosas causó un incremento al triple enla producción de

estrógenos. Estos resultados son similares a aquellos obtenidos

por Evans y col. (29) en la cerda prepüber. Aunque estos auto­

res no han incubado células tecales y granulosas en co-cultivo,

sus resultados para la producción de estrógenos por células gr_a

nulosas aisladas, en presencia de testosterona exógena, indi­

can que en su sistema también ocurriria sinergismo.

Recientemente, Honey y Scbomberg (35) informaron

que en foliculos porcinos de 4-5 mm la teca es responsable de

la mayor parte de la producción total de estrógenos, no obser­

vando un aumento significativo en su sintesis al agregar célu­

las granulosas alos cultivos. Podria ser que foliculos deriva ­

dos de animales sexualmente maduros se comportaran de distin­

ta manera, aunque también es posible que las diferencias en

resultados se deban a técnicas de separación de tipos celulares

o a medios de cultivo empleados, Sin embargo, aunque dichos

-i2l­

autores no observaron un aumento en la sintesis de estrodiol al

co-cultivar ambos tipos celulares, sus resultados demuestran

mayor conversión de andrógenos exógenos por células granulo­

sas que por preparaciones tecales.

En conclusión, los resultados obtenidos del cultivo de

tipos celulares folículores respaldan la teoria bícelular bigong

dotrófica para la biosintesis de estradiol en foliculos porcinos

de tamaño mediano. En las condiciones usadas, fuimos incapa­

ces de observar un efecto estimulatorio de FSH sobre la aroma­

tización de andrógenos a estrógenos, confirmando los resulta­

dos obtenidos por Evans y col. (29). Sin embargo, no se ha ex_a

minado la posibilidad de que FSH pueda inducir actividad de ci

romatasa en foliculos menos maduros.

Además, los resultados obtenidos del co-cultivo de t_i

pos celulares foliculores en este estudio sugieren un rol para

las células granulosas en el metabolismo de andrógenos. AI co­

cultivar células tecoles y granulosas se observó una disminució

drástica enla acumulación de andrógenos (A4-androstenediona

más testosterona), que no estaba correlacionada con un aumen­

to enla sintesis de l7fe>-estradiol. Ya que las células granulo­

sas son capaces de aumentar la sintesis tecal de andrógenos pr_c_>

veyendo sustrato esteroideo, un efecto inhibitorio de las célu­

-i22­

las granulosas sobre la sintesis de andrógenos pareció improba

ble. En cambio, se examinó la capacidad de las células granu­l a llosas porcunas de metabollzar androgenos.

4.3 Sintesis de Sulfatos de Andrógenos.

Los resultados de la presente investigación proporcio

nan evidencia para la sintesis de sulfatos de andrógenos por

células granulosas porcinas. Existen varios factores que respa_l_

dan esta evidencia.

(1)Al cultivar células granulosas en presencia de All-andres­

tenediona o testosterona, se obtienen derivados de estos ej

teroides,solub|es en agua.

(2) Luego de precipitar las proteinas, este compuesto se com­

porta en columnas de DEAE-Sephadex A 25 como un monosu_l_

tato de esteroide neutro (Figuras 9 y lO; 122). Los sulfatos

de estrógenos son retenidos más tiempo en estas columnas

(123, 124).

(3) Luego de solvólisís se obtiene un compuesto soluble en éter.

Esto respalda la evidencia de la presencia de un sulfato de

-l23—

C19-esteroide, debido a que los glucurónidos de esteroides

no son hidrolizados baio las condiciones usadas (lOl).

La formación de sulfatos de C19-esteroides en el ovario ha

sido descripto anteriormente. Se observó formación de Sulfato

de dehidroepiandrosterona por homogenatos de ovarios humanos

(76, 80). Sturm y Hannapel (82) observaron formación de sulfg

to de testosterona por homogenatos de foliculos y cuerpos lü ­

teos de rata y bovinos. Experimentos con ovarios humanos de

la fase folicular, perfundidos, (85) mostraron conversión de

sólo l % del sustrato radioactivo a sulfatos esteroideos, sien­

do un tercio de estos,sulfatos de estrógenos. En este estudio

se observó una mayor conversión (alrededor del 40 °/o) a mono­

sulfatos de andrógenos. La baía conversión observada por Sturm

y col. (85) podria deberse a la presencia de grandes cantida ­

des, no fisiológicas, de sustrato, aunque también es probable

que se deban a diferencias entre especies. Más aün, nuestras

observaciones sugieren que los células granulosas son el lugar

en que ocurre la formación folicular de sulfatos de andrógenos.

Se ha especulado que, en los teiidos endócrinos, los

sulfatos de esteroides desempeñan una variedad de funciones,

como productos de desactivación, como precursores de hormo­

nas activas, asi como estando involucrados en los mecanismos

424­

regulatorios dentro de estos tejidos manteniendo niveles de es

teroides libres por interacción con la enzima limitante, la

sulfataso (74, 75). Se podria especular que, en el ovario, la

Formación de sulfatos podria controlar la cantidad intrafolicu­

lar de andrógeno libre, evitando la atresia del foliculo. EstosI Í oandrogenos podrian tal vez ser usados, posteriormente, para

la sintesis de estrógenos, ya que aparentemente no son esteroi

des 5°( - o 5P - reducidos. Esto no requeriría acción previa

de la sulfatasa ya que existe evidencia de aromatización direc

ta de sulfatos de esteroides neutros (87).

El hecho de que 20 °/ode la radioactividad inicial so

Iuble en agua se comportara consistentemente como esteroides

libres en columnas de DEAE-Sephadex, luego de precipitar lasC o I n I Iproteinas (Figura 9), sugiere que estos estaban inICIalmente

unidos a proteinas. En efecto, en fluido folicular de diversas

especies, se han encontrado proteinas que unen esteroides

(124). Estas proteinas podrian originarse en células granulosas,I O O Í I Íya que estas celulas son CCl’lVGSenla blosmteSis de proteinas

(3, 4).

Separación cromatogrófica del producto solvolizado

de los distintos lotes de células granulosas confirmó que los

esteroides coniugados no son ninguno de los productos conoci­

-l25­

dos del metabolismo de andrógenos en el ovario. Si bien el me

tabolito muy polar (aislado en las columnas de fase reversa) a_

pareció en todas las incubaciones, la presencia del metabolito

menos polar (aislado en las columnas de fase normal) no fue

consistente. Podria ser que este Último no fuera estable baio

las condiciones de hidrólisis usadas. Los procedimientos solvo­

liticos pueden ser quimicos o enzimáticos. Los procedimientos

quimicos (altas temperaturas, condiciones ácidos) podrian alt_e

rar la estructura del esteroide, introduciendo artificios (125).

Aunque los procedimientos enzimáticos no presentan este pro­

blema, a nuestro conocimiento, no existen preparaciones de

sulfatasa pura disponibles. Alternativamente, podria ser que

las células granulosas metabolizaran el andrógeno a varios pro

ductos, variando las cantidades relativas de cada uno de estos

con el medio ambiente hormonal al que hubieran sido expuestas

en el foliculo. Aunque en todos los experimentos se usaron fo­

liculos de aproximadamente el mismo tamaño, podria ser que

estos hubieran sido expuestos a distintas concentraciones de ggnadotrofinas

Los resultados inconsistentes obtenidos en los ensayos

enzimáticos de sulfotransferasa también podrian deberse a una

capacidad diferencial de las células de usar los distintos sus­

-l26—

tratos. Las sulfotransferasas son enzimas muy especificas(126)

y es posible que ninguno de los esteroides empleados como sus

tratos sea el Sustrato especifico para la enzima presente en cÉ

lulas granulosas porcinos. Ademós, no pudo realizarse un estu­

dio completo (usando distintos sustratos) de la actividad de la

enzima debido a que la cantidad de material obtenido en cada

experimento no fue suficiente para llevar a cabo más que dos

ensayos enzimáticos. Sin embargo, cuando (355)-Na2SO4 fue

incluido en la mezcla de reacción, se pudo obtener 2 veces

(usando el mismo lote) incorporación en el coniugado, con

(3H) -androsterona como sustrato, obteniendo evidencia inde­

pendiente dela capacidad de las células granulosas de coníu­

gar andrógenos a iones sulfato.

4ü4 Efecto de la Teca sobre la Sintesis de Progesterona por

las Células Granulosas.

La hormona folículo-estimulante (FSH) se une a recep

tores especificos en células granulosas derivadas de foliculos

porcinos de tamaño mediano (17) estimulando la producción de

AMP ciclico (l27) y la sintesis de progesterona (27). Los resul

-127­

tados de este estudio demuestran que los andrógenos aromatiza

bles, androstenediona y testosterona, inhiben esta acumulación

de progesterona en respuesta a FSH.

En ratas, se ha establecido que tanto los andrógenos

aromatízables como los no aromatízables aumentan la sintesis

de progesterona por células granulosas aisladas,estimuladas por

FSH (128-130). La potencia de testosterona y DHTha sido relg

cionada con su velocidad de metabolismo dentro de las células,

y la potencia de otros andrógenos con su grado de conversión

a testosterona y DHT (131). Por otra parte, se ha implicado a

los andrógenos en la inhibición del desarrollo ovóríco en ratas

inmaduras hipofisectomizadas tratadas con dietílestilbestrol

(132). De acuerdo con esto se ha dicho que, en ratas, los an­

drógenos estimulan la sintesis de progesterona y son "atretogé­

nicos" (133).

En cultivos de células granulosas humanas, testosterg

na inhibió la biosïntesis de progesterona cuando las células

provenïan de foliculos grandes (133) pero no de foliculos pe­

queños (134).

En cerdos, Thanki y Channing (47) observaron que te_s

tosterona inhibia la producción de progesterona estimulada por

FSH, mientras que Schomberg y col. (44, 45) informaron que

—128­

los andrógenos estimulaban la sintesis basal de progesterona

en 48 horas de cultivo, siendo esta estimulación significativa

en el caso de DHT pero no en el de testosterona. La discrepan

cia aparente entre los resultados de SchOmberg y los obtenidos

ción de la sintesis de progesterona observada en este estudio

sólo fue evidente cuando FSH estaba presente durante el culti, , 4vo; no se observo efecto alguno de los androgenos (A -andros

tenediona, testosterona, androsterona y DHT)sobre la sintesis

basal de progesterona en 24 horas de cultivo. Nos pareció ade

cuado incluir FSH en los cultivos ya que las células granulo ­

sas están expuestas a FSH "in vivo" Cultivando células gran!

losas en presencia de FSH, Anderson y col. (3]) observaron

que testosterona no eiercia un efecto significativo sobre la

sintesis de progesterona después de 2 dias en cultivo, aunque,

en cultivos de 4 dias testosterona actuaba sinergisticamente

con FSH enla estimulación de la sintesis de progesterona. Da_

do que luego de 2 dias en cultivo, las células granulosas por­

cinas presentan caracteristicas morfológicas de células lutei­

nizadas (27),parecerïa que testosterona es capaz de estimular

la sintesis de progesterona por células luteinizadas. En este

estudio no se prolongaron los cultivos por más de 24 horas pa­

-l29­

ra poder obtener una aproximación de lo que ocurre cuando las

células forman parte del foliculo.

Las diferencias observadas también podrian deberse a

los medios de cultivo y al tipo de animales usados como fuente

de células granulosas. En este estudio se usaron células prove­

nientes de foliculos ovóricos de cerdas prepúberes, que son r3

lativamente inmaduras aunque capaces de desarrollar respues­

tas esteroidogénicas normales (29). Los otros autores (3], 44,

45) también usaron foliculos relativamente inmaduros, aunque

aislados de ovarios de cerdas sexualmente maduras. Usando cé­

lulas granulosas obtenidas de cerdas maduras observamos que la

estimulación de la sintesis de progesterona por FSH era similar

a la obtenida con foliculos comparables de cerdas prepüberes,

y que testosterona inhibia esta respuesta en forma análoga (Ta­

bla VIII). Por lo tanto, las diferencias en resultados no pueden

ser explicadas por diferencias en la fuente de células granulo­

sas.

Es improbable que la inhibición observada en el pre­

sente estudio se deba a un efecto tóxico de los andrógenos so­

bre las células granulosas ya que células cultivadas por 24 ho­

ras en presencia de testosterona y FSH fueron capaces de produ

cir niveles elevados de progesterona durante un periodo subsi­

—i30­

guiente de 24 horas en ausencia de hormona exógena (Tabla IX).

Los datos presentados sugieren que la acumulación di_s

minuida de progesterona en presencia de testosterona se debe

a inhibición de la sintesis de progesterona y no a estimulación

de su metabolismo. Los andrógenos podrian inhibir la sintesis

de progesterona interfiriendo con la unión de FSH a su recep­

tor, interfiriendo con el acoplamiento del receptor a la adeni_

lato ciclasa, estimulando la fosfodiesterasa y/o inhibiendo las

enzimas involucradas en la biosintesis de progesterona. Para de

terminar si la inhibición ocurria a un paso anterior o posterior

a la formación de AlúP ciclico, células granulosas fueron inc!

badas con dibutiril AMP ciclico en presencia o ausencia de d'_s

tintas concentraciones de testosterona. Se observó que testost_e

rona también ¡nhibïa la acumulación de progesterona en respue_s

ta a dibutiril AMP cfclíco. Mós aún, la extensión de la inhibl

ción fue la misma: una disminución de 70 % enla sintesis de

progesterona en respuesta a dibutiril AMP ciclico (4 mM) y de

75 % en la sintesis en respuesta a FSH (l ug/ml).

Esto sugirió que los andrógenos actuaban a una etapa

posterior a la formación de AMP ciclico. Por lo tanto, los an­

drógenos inhibirian alguna enzima en el camino biosintético y/o

estimularian la actividad de fostodiesterasa.

-i3i­

TABLA IX

Acumulación de progesterona (ng/foliculo equivalente) por célu­

las granulosas mantenidas en cultivo por 48 hs (n = 8). Las célu ­

las fueron cultivadas por 24 hs en presencia o ausencia de FSH

(i ug/ml) y testosterOna (5 UM); a las 24 hs el medio fue reemplg

zado totalmente por medio fresco sin hormonas exógenas.

Hormonas Presentes Durante

las Primeras 24 hs de Cultivo 0-24 hs 24-48 hs

2,5 t 0,2 I,ót0,1

FSH+T 6,3 t 0,5 2,9to,3

-i32­

Estudios preliminares con un inhibidor de fosfodieste­

rasa (3-isobutil-metil-xantina, IBMX)demostraron que, aunque

IBMX(0,] mM) aumentaba la sintesis basal de progesterona por

células granulosas en cultivo, adición de IBMXa células cul­

tivadas en presencia de FSH o dibutiril AMP ciclico resultaba

en una acumulación disminuida de progesterona, aunque la a­

cumulación de pregnenolona en los mismos cultivos no era afef

tada.

Esto está de acuerdo con observaciones de que niveles

altos de AMPciclico inhiben notablemente ala 3i’5-hidroxies­

teroide deshidrogenasa-Asisomerasa en teíido adrenal (135) y

ovórico (136) de, rata.

Células granulosas produíeron cantidades elevadas de

pregnenolona, siendo esa sintesis estimulada por FSH (de 2 a

3 veces). Los andrógenos (¿4A o T) aumentaron aún más la sirL

tesis de pregnenolona en respuesta a FSH. Dibutiril AMP cicli­

co estimuló la sintesis de pregnenolona de una manera dosis de

pendiente, siendo esta sintesis también aumentada por testost_e

rona. Ya que baio las mismas condiciones los andrógenos inhi­

bian la sintesis de progesterona, se concluyó que los andróge­

nos aromatizables afectan la conversión de pregnenolona a pre

gesterona.

—]33­

La conversión de pregnenolona a progesterona es cata­

Iizada por un sistema deA5-3ífl5-hídroxiesteroide deshidrogena­

sa / AS- 3 - cetoesteroide isomerasa, que es activo en células

granulosas porcinas (25); Recientemente, Dorrington y Armstrong

(137) informaron que FSH estimula marcadamente la actividad

de este sistema enzimático en células granulosas de rata. Evi­

dencia indirecta confirma que también en células granulosas

de cerdo FSH actúa a este nivel,ya que FSH produio un porcen­

taje mós alto de estimulación de sintesis de progesterona que

de pregnenolona, aunque la cantidad absoluta de pregnenolo ­

na producida por encima de los valores control fue mayor.

Por lo tanto, parece que la sintesis disminuida de progestero­

na en respuesta a FSH en presencial de andrógenos se debe a u­

na inhibición dela AS- 3P -hidroxiesteroide deshidrogenasa

isomerasa. La inhibición de esta enzima por esteroides ha sido

informada anteriormente. En Ia placenta humana, Wiener y

Allen (138) observaron inhibición dela 135-3? -hidroxiesteroi­

de deshidrogenasa por 20°C-hidroxí-4-pregnen-3-ona, mientras

que Townsley (139) observó que los ¿34-3-cetoesteroides eran

potentes inhibidores dela enzima. La inhibición por A4-andros_

tenediona y testosterona era de tipo no competitivo, y sólo po­

dia ser interrumpida por metabolismo del inhibidor y/o su eli ­

-l34­

minación de los alrededores de la enzima. Aunque no se han

realizado ensayos enzímóticos, la observación de una disminu­

ción enla acumulación de progesterona y un aumento enla de. 4 . . .pregnenolona sugieren que los A -3-cetoestero¡des Inhlben a

la A5-3P-hidroxiesteroide deshidrogenasa -L_\5-ísomerasa en

células granulosas de folI'CUlo ovórico porcino como enla pla­

centa.

. A4 .Las concentracuones de -androstenedlona o de tes­

tosterona necesarias para producir inhibición de la sintesis de

progesterona o aumento dela acumulación de pregnenolona pa

receri'an ser elevadas. Los niveles de andrógenos en el fluido

Folicular parecen ser menores (36, 140 , Lischinsky y Armstrong,

datos no publicados). Sin embargo, las preparaciones tecales

porcinas sintetizan grandes cantidades de andrógenos. Por lo. 4 .tanto, las concentracnones de A -androstenedlona y testostero

na en los alrededores delas células granulosas adyacentes a la

capa tecal podrian ser mucho mós elevadas. Además, dado que

los efectos inhibitorios de estos esteroides parecen ser acumu­

lotivos (139), la extensión de la inhibición refleiaria la con­

centración total local de inhibidores.

Nuestros resultados indican que los andrógenos afec­

tan principalmente la actividad dela enzima estimulado por

-l35­

FSH, eíerciendo un efecto menor sobre su actividad basal. Da­

do que el aumento en la acumulación de pregnenolona excedióo I 0' I Íen masa a la disminucron en los niveles de progesterona, podria

ser que los andrógenos también inhiban el metabolismo de preg

nenolona a lo largo de otros caminos. Alternativamente, los an

drógenos podrian estimular la sintesis de esteroides de 21 óto­

mos de carbono en un paso anterior a la formación de pregneno

lona.

No se sabe silos andrógenos producen esta inhibición

por si mismos o luego de ser metabolizados a otro producto. YaÍ ' o 4que solo los androgenos aromatizables testosterona y A -andros

tenediona, pero no DHTy androsterona, fueron capaces de pro

vocar esta inhibición, fue necesario determinar si la reducción

en la acumulación de progesterona se debia ala conversión de

los andrógenos a estrógenos. 1703 -Estradiol inhibió la acumulal —

0' Icron de progesterona en este srstema, de acuerdo con resultados

obtenidos por otros investigadores en células granulosas porci­

nas (45, 47) y bovinas (¡41). Sin embargo, nuestros resultados

indican que testosterona inhibe la producción de progesterona

en respuesta a FSHsin previa aromatización a 17P-estradiol.

La inclusión de testosterona en el medio de cultivo inhibió

notablemente la acumulación de progesterona en 8 horas de

-l3ó­

cultivo, mientras que los niveles de estradiol no aumentaron

sustancialmente hasta después de 8 horas. Aunque el contenido

de esteroides en el medio no es necesariamente un fiel refleio

de los niveles intracelulares, e incluso niveles relativamente

baíos de l7p-estradiol podrian causar efectos fisiológicos,

parecería que testosterona eierce un efecto inhibitorio sobre

la producción de progesterona en ausencia de un aumento im­

portante en la sintesis de estradiol. Si bien esta evidencia no

es concluyente, también se demostró que una reducción sustan_

cial en los niveles de estradiol provocada por la presencia de

un inhibidor de Ia aromatasa era incapaz de prevenir la inhib

ción de la acumulación de progesterona por testosterona. En

realidad, el inhibidor de la aromatasa por si mismo causó una

disminución en lasintesh de progesterona; elinecanismo de er

ta acción es desconocido, pero 4-acetoxi-androstenediona es

un andrógeno y podria eiercer efectos inhibitorios semeiantes

a testosterona y A4-androstenediona.

El hecho de que ni DtlT ni androsterona inhiban la sin­

tesh de progesterona también indica que la reducción en la po­

sición 5 no es probablemente un paso obligatorio enla acción

de testosterona y Af-androstenediona.

Las células granulosas de rata contienen receptores

-i37­

a andrógenos que pueden unir tanto DHT como testosterona

(142). Por lo tanto, testosterona podria actuar luego de unir­

se a su receptor, sin conversión previa a otros intermediarios

activos. Alternativamen'te, la observación de que los esteroides

que inhiben la sintesis de progesterona en respuesta a FSHson

los mismos que pueden ser.con¡ugados por las células granulo­

sas, plantea la interesante posibilidad de un rol regulatorio

de los conjugados de andrógenc en las funciones foliculares.

La modulación de la sintesis de C2¡-esteroides por

andrógenos es otro eiemplo de interacción entre células gran_u

losas y tecales en la sintesis folicular de esteroides en el avg

rio porcino. Es interesante que, en foliculos porcinos de tama_

ño mediano, las células granulosas pueden controlar la conce_n

tración intrafolicular de andrógenos proporcionando una parte

del sustrato (pregnenolona) para la sintesis tecal de andróge­

nos y coníugando los andrógenos a iones sulfato. Estas intera_c

ciones demuestran la importancia de los mecanismos intraovór_i

cos en la regulación de la función folicular.

4)

5)

tempranos del desarrollo folicular preovulatorio,

-i38­

5.0 CONCLUSHDNES

Los resultados de esta investigación indican que:

Las células granulosas porcinas sintetizan grandes cantida­

des de pregnenolona, siendo esta sintesh estimulado por

FSH.

hAediousado por células granulosas cultivadas en presencia

de FSH estimula la sintesh tecal de andrógenos.

Pregnenolona y progesterona pueden estimularla sintesh

tecal de andrógenos.

Las células granulosas pueden coníugar los andrógenos a

¡ones sulfato.

Los andrógenos aromatizables inhiben la sintesis de progeí

terona en respuesta a FSH en 24 horas de cultivo, actuando

probablemente aifivel dela converüón de pregnenolona a

progesterona.

ovario porcino, en los estadiosDe este modo, en el

las células

granulosas podrian regular la concentración intrafolicular de

andrógenom

l) Estimulando la producción tecal de andrógenos; 2) coníugan

do el andrógeno en exceso.

-i39­

Se ha implicado alos andrógenos intraovóricos enla

regulación de la maduración folicular, Louvet y col. (132) ob­

servaron que la administración de hCG a ratos hembras inma­

duras hipofisectomizadas, tratadas con estrógenos, conduce a

atresia folicular, que puede ser revertida por antagonistas de

la acción de los andrógenos (143). De este modo, la capacidad

de las células responsables de la aromatización, las células

granulosas, de controlar la cantidad de andrógeno libre dentro

del foliculo proveeria un medio para seleccionar los foliculos

destinados a ovular o a sufrir atresia.

El hecho de que los andrógenos ( A4-androstenediona

y testosterona) inhiban la conversión de pregnenolona a proge_s

terona en respuesta a FSH sugiere la existencia de un mecanis­

mo de retroalimentación positiva del andrógeno sobre su propia

sintesis. El andrógeno podria luego ser aromatizado a estrógeno,

que puede inhibir la subsiguiente sintesis tecal de andrógenos

(39). Alternativamente, se puede especular que, cuando los ni

veles de andrógenos estón en exceso a la cantidad que puede

ser aromatizado, o cuando la concentración de estrógenos es

alta, las células granulosas podrian coníugar el andrógeno. OE

servaciones recientes por HiIIíer y col. (144) sugieren que esto

—l40­

último podria ocurrir; los niveles de andrógenos aromatizables

libres en el fluido folicular de foliculos humanos que contenian

células granulosas con baia actividad de aromatasa fueron simi­

lares a aquellos de foliculos preavulatorios con células con al­

ta actividad de aromatasa.

El hecho de que los andrógenos,producidos por la teca,

inhiban la sintesis de progesterona, sugiere que los andrógenos

desempeñan un rol en el control intrafolicular dela esteroido­

génesis en esta especie. Este rol podria involucrar la preven­

ción de luteinización prematura de las células granulosas, par­

ticularmente antes de la inducción de la actividad de aromata­

sa y aumento concomitante en los niveles de l7¿5—estradiol.

También es posible que los andrógenos aromatizables sean atre­

togénicos.

Como resultado de este y otros estudios, el modelo de

biosintesis de esteroides en foliculos medianos de cerdo mostra­

do en la Figura 2 puede ser puesto al dia como se representa

en la Figura 33.

Las células tecales sintetizan andrógenos, predomi ­

nantemente A4-androstenediona. Esta sintesis es estimulada

por LH. Aunque las células tecales no poseen receptores para

FSH, las células granulosas unen FSH y responden a esta hor ­

Figura33:¡Modeloparalaesferoídogénesísenfolïculosporcinosde tamañomediano. Laslíneasenterasrepresentancaminosbíosinféfícosyaccionesinfra­ ovórícasdehormonas:+estimulación;-¡nhíbícíón. LasIïneasquebradasrepresentanfluioíntercelulardeesteroides.

TECA

FL<—-CAMP

Colesterol

i #

Pregnenolona+-——

1Proqesferona+———

4 lAndrógeno--————

—+—Andrógeno

GRANULOSA

FSH 4+cAMPL»

Colesterol

¿ &

—————Pregneno|ona

1

-————Progesïerona.

/Es’rrogeno-— \Andrógeno

Sulf0to

-i43—

mona sintetizando grandes cantidades de pregnenolona y pro ­

gesterona. Estos esteroides difunden a Ia capa tecal donde sir­

ven como sustratos para la sintesis de andrógenos en ausencia

de LH.

4A -Androstenediona puede ser convertida a testoste_

rona en la teca. Sin embargo, la teca no es eficiente en esta

conversión. Asi, la mayor parte de A4-androstenediona difun

de a la capa granulosa donde es convertida a testosterona y

luego a 17(17-estradiol, o coníugada a iones sulfato.

Además del pasaie de sustratos de un tipo celular al

otro, los esteroides sintetizados en un tipo celular pueden m2

dular la producción de esteroides en el otro. Los estrógenos,

producidos en las células granulosas, pueden inhibir la sinte­

sis de andrógenos estimulada por LH. Los andrógenos, deriva­

dos de la teca, pueden inhibir la conversión de pregnenolona

a progesterona en células granulosas estimuladas por FSH.

12a.­

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