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RESUMENObjetivos. Estudiar el efecto de la administra-cin prenatal de corticoides en la evolucin clni-ca y el patrn histopatolgico de la enterocolitis necrosante (ECN), en un modelo experimental.Mtodos. Se incluyeron neonatos de rata Wistar. El grupo de estudio (GT) recibi tratamiento con hidrocortisona (5 mg/kg) intraperitoneal, 24 y 48 h antes de la cesrea. El control (GC) recibi igual volumen de solucin fisiolgica. Los neo-natos fueron mantenidos en incubadora a 35C sin exposicin a leche materna. Se alimentaron por sonda orogstrica c/3 h. Se indujo ECN mediante hipoxia/hipotermia, tres veces al da durante 72 h. Se realiz reseccin intestinal completa e histo-patologa con asignacin de puntaje de lesin.Resultados. Los signos de ECN fueron irritabili-dad y mal estado general, distensin abdominal, intolerancia alimentaria, eritema de pared y he-matoquezia. El 60% (n= 9) del GC (n= 16) present al menos 1 signo clnico contra 40% (n= 6) del GT (n= 15). La aparicin de signos clnicos y la evo-lucin de los animales del GT llev, objetivamen-te, un curso ms leve y atenuado comparado con el GC. La mortalidad del GC fue del 40% contra 20% del GT. El estudio microscpico mostr que un 80% del GC presentaba histopatologa com-patible con ECN, con grados variables de lesin (50% de grado 3-4, correspondiente al mximo dao), mientras que solo 40% de los GT presen-taba un patrn histolgico compatible (p

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culatoria como integrantes de la fisiopatologa de la ECN.1,2

La ECN presenta una alta mortalidad en sus formas graves y, adems, tanto por su tratamien-to clnico como quirrgico, presenta un espectro de morbilidad que incluyen: estenosis, fstulas, abscesos, sndrome de malabsorcin y ECN recu-rrente. Otras complicaciones son secundarias a la nutricin parenteral prolongada, como la coles-tasis y la trombosis venosa secundaria a accesos venosos centrales; el sndrome de intestino corto, el sndrome compartimental postoperatorio, la oclusin intestinal y las complicaciones de los os-tomas se asocian con su tratamiento quirrgico.3,4

Esta entidad constituye la causa ms comn de morbilidad dentro del grupo de neonatos con patologa quirrgica y alcanza valores de morta-lidad de hasta 60% en los grados IV;5,6 publica-ciones recientes muestran valores menores, pero contina siendo alta.7

La investigacin en este campo ha sido in-tensa, en especial en la bsqueda de desarrollar modelos reproducibles de ECN en animales de laboratorio, con el objeto de estudiar los meca-nismos fisiopatognicos y probar estrategias de prevencin y tratamiento adecuadas.

En el campo de la prevencin, la terapia pre-natal con glucocorticoides en pacientes embara-zadas con riesgo de parto prematuro entre las 24 y las 34 semanas demostr ser un mtodo eficaz para alcanzar un grado de maduracin pulmonar fetal adecuado para disminuir la morbimortalidad fetal; asimismo, se observ un incremento de la madurez intestinal por activacin de la absorcin de lactosa. Un estudio multicntrico sobre el uso de corticoides prenatales observ como resultado secundario disminucin de la incidencia de ECN.8

El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto del tratamiento prenatal con hidrocorti-sona en la incidencia y gravedad de ECN en un modelo animal.

MATERIAL Y MTODOSSe aleatorizaron tres grupos de animales de es-

tudio: hembras de rata Wistar con libre acceso a agua y alimento, mantenidas en bioterio en jaula individual, con ciclos de luz-oscuridad de 12 ho-ras y a 20 C, preadas (ver Figura 1).

Al Grupo Tratamiento (GT) se le administr 2 dosis de hidrocortisona (5 mg/kg) por va intra-peritoneal a las 24 y 48 horas antes de la fecha probable de parto (da 21 de gestacin), mientras que al Grupo Control se le administr, simultnea-mente, el mismo volumen de suero fisiolgico por la misma va. Se estableci, adems, un Grupo Sin Intervencin (grupo testigo simulado [sham]), hembras preadas a las cuales se les permiti con-tinuar con su preez hasta el trmino sin interven-cin alguna.

Induccin de ECN (segn Barlow y Santulli): al cabo de 21 das (tiempo de gestacin prome-dio) se realiz la cesrea a las hembras prea-das de cada grupo. Se la efectu en incubadora luego de induccin anestsica con sevofluorano inhalatorio mediante campana. Se coloc al ani-mal en decbito dorsal, se lo fij y se administr anestesia intraperitoneal con xilocana + ketami-na a dosis estndar segn peso. Se evalu el es-tado anestsico mediante la bsqueda del reflejo palpebral y la respuesta al dolor. La antisepsia se realiz con iodopovidona y luego de la colo-cacin de campos quirrgicos se realiz una inci-sin mediana subxifoidea con diresis por planos y hemostasia.

Figura 1: Diagrama con la estrategia experimental de gnesis de la enterocolitis necrosante

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Luego de la localizacin y exteriorizacin del tero se realiz una incisin longitudinal, extrac-cin manual de los fetos despus de la incisin del saco amnitico y ligadura y seccin del cor-dn umbilical.

Se procedi, por ltimo, al inmediato secado y estimulacin bajo lmpara infrarroja de las cras y la ligadura de pedculos vasculares e histerec-toma, hemostasia y sutura por planos. Antisep-sia y recuperacin en incubadora para mantener normotermia. Todas las cras fueron secadas, es-tabilizadas y pesadas.

Protocolo de alimentacin: se inici a los 30 minutos de vida con la colocacin de sonda oro-gstrica (SOG) (catter Percutneo de Silastic, Vygon calibre 2F) y alimentacin con frmula comercial. Para lograr un aporte de 200 Kcal/kg/da, comparables con las aportadas por la leche de rata, se aliment a cada animal con 0,3 ml de frmula cada tres horas. Se realiz estimulacin manual para favorecer la deglucin en cada tur-no de alimentacin. El control y registro de peso se realiz en forma diaria en balanza electrnica con error de 0,05 gramos.

Estrs por hipoxia: colocacin simultnea de cada animal del grupo en cmara acrlica herm-tica precargada con nitrgeno gaseoso al 100% durante 60 segundos.

Estrs por hipotermia: inmediatamente des-pus de la hipoxia, colocacin de ambos grupos en cmara a 4 C, durante 10 minutos. Una vez finalizado el procedimiento, colocacin del gru-po en su jaula de origen dentro de la incubadora.

Esta secuencia se repiti tres veces al da a las 8:00, 14:00 y 20:00 horas.9

Al cabo de 72 h o ante a la aparicin de uno o ms signos clnicos de ECN (letargia, distensin abdominal, eritema de pared, intolerancia oral, vmitos, hematoquezia o dificultad respiratoria)

se procedi a la ciruga. Los animales que presen-taron mortalidad espontnea antes de completar el protocolo hipoxia-hipotermia fueron exclui-dos, para evitar la interpretacin de fenmenos lticos postmortem como un falso positivo de le-sin intestinal.

Reseccin intestinal: se realiz anestesia ge-neral de las cras con sevofluorano inhalatorio a travs de mscara y con el animal en decbito dorsal; mediante incisin mediana subxifoidea hasta hipogastrio se exterioriz el intestino, se identificaron las reas comprometidas y se efec-tu la reseccin intestinal desde duodeno hasta recto-sigmoides. Luego se procedi al lavado de la pieza quirrgica con solucin fisiolgica y fi-jacin inmediata en formol al 10%. Por ltimo, se procedi a la eutanasia mediante cardiotoma.

Para el estudio histopatolgico se realiz tin-cin con hematoxilina-eosina segn tcnica ha-bitual y anlisis de cada muestra por un mdico patlogo pediatra, ciego al grupo asignado al azar. Se otorg el puntaje de lesin intestinal uti-lizado en modelos animales de ECN descripto por Jilling: 10,11 Grado 0, histologa normal; Grado 1, esfacelo superficial del extremo de la vellosidad intestinal; Grado 2, necrosis vellositaria; Grado 3, prdida vellositaria y Grado 4, destruccin com-pleta de la mucosa con necrosis y hemorragia transmural.

El presente estudio fue aprobado por el Comi-t de investigacin del HIBA (2006) y financiado por una Beca de la Fundacin Gianantonio.

RESULTADOSLa Figura 2 muestra la distribucin de las

cras de los dos grupos estudiados. El Grupo Sham (no incluido en la Figura 2) no mostr le-siones compatibles con NEC; 6 cras (2 en el gru-po tratado y 4 en el control) fallecieron durante

Figura 2: Distribucin de los animales en estudio

Animales de estudio: (n= 31)

Grupo Control (n= 16)

Grupo Tratado (n= 15)

No ECN (n= 4) 25%

ECN (n= 12) 75%

No ECN (n= 9) 60%

ECN: (n= 6) 40%

ECN: enterocolitis necrosante.

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la induccin de hipoxia-hipotermia y no ingre-saron en el estudio.

El peso promedio al nacer de todos animales (trmino) fue de 5,7 0,5 g, sin observarse dife-rencias significativas entre los 3 grupos. Pese al correcto clculo del aporte calrico necesario, se registr una disminucin diaria del peso de 0,5 0,2 g en ambos grupos (NS).

En el Grupo Control (n = 16), 9 (60%) de los animales presentaron al menos 1 signo clnico de ECN, mientras que en el Grupo Tratado (n = 15),

solo 6 (40%) cumpli esta condicin. La aparicin de signos clnicos y la evolucin ulterior de los animales del Grupo Tratado llev, objetivamente, un curso ms leve y atenuado en comparacin con el Grupo Control. La mortalidad antes de las 72 h del Grupo Control lleg al 40% mientras que en el Grupo tratado fue de 20% (Tabla 1). Como puede verse en la Figura 3, se observ un predominio de lesiones macroscpicas en el Grupo Control (A) en comparacin con el Tratado (B).

El estudio histolgico (ver Figura 4) mostr que un 80% de los animales del Grupo Control presentaba histopatologa compatible con ECN, con grados variables de lesin, 50% de grado 3-4, (B) correspondiente al mximo dao, mientras que solo 6 (40%) de los tratados presentaba un pa-trn histolgico (A) compatible con lesin intesti-nal y todos de grado 0-1 (mnima lesin) y el resto sin lesiones. Estas diferencias fueron significativas (p

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del dao con leche humana,13-16 distensin intes-tinal mediante inyeccin de aire intrarrectal,17 hi-poxia- reoxigenacin sin distensin intestinal18,19 y clampeo de la arteria mesentrica superior con inyeccin intraluminal de PAF (factor activador de plaquetas) y sin ella.20,21

El modelo descrito por Barlow y Santulli, y sus sucesivas adaptaciones,9,20 a pesar de las dificul-tades tcnicas para su implementacin, es el ms representativo de la serie de episodios que con-ducen a la ECN13,16,22 en los seres humanos, pues toma en cuenta la ingesta como un factor desenca-denante y significativo en su fisiopatologa.

Una de las dificultades para la induccin de ECN en este modelo es que presenta una alta ta-sa de mortalidad de las cras antes de la iniciacin de la lesin. En nuestro caso, la tasa de prdida de cras fue similar a la comunicada por otros au-tores y por nosotros mismos en la puesta a pun-to del modelo, siendo sta dependiente de causas perinatales e instrumentales. La principal compli-cacin es la recuperacin posanestsica. La ma-dre debe ser sometida a anestesia general, lo cual implica que las cras nazcan tambin anestesia-das, hecho que dificulta la adaptacin a la respi-racin espontnea y constituye la principal causa de muerte. Adems, durante la anestesia intrape-ritoneal y debido al desplazamiento medial del tero bicorne por la cantidad de fetos, aumenta la posibilidad de punzar directamente a un feto intratero, con el consecuente impacto en la mor-talidad fetal y materna, esta ltima por falta de adecuada anestesia.

La recuperacin posanestsica bajo lmpa-ra infrarroja y el traslado inmediato a incuba-dora se vuelven imprescindibles para prevenir

la hipotermia, que se traduce clnicamente co-mo letargia, rechazo al alimento y aumento de la mortalidad durante las primeras 24 h, signos que son tambin compatibles con ECN (por ello se tuvo extremo cuidado en evitarla). La prdida de peso que se registra en los animales de estu-dio (pese al correcto clculo del volumen de la frmula y el aporte calrico), probablemente sea atribuible en parte a las dificultades que presenta la colocacin de una sonda orogstrica y la con-secuente alimentacin con la totalidad del volu-men calculado, y al rechazo del alimento como signo temprano de ECN.

Una de las principales dificultades del estu-dio es que se requieren controles muy estrictos y frecuentes, especialmente a partir de las 24-36 h de comenzada la induccin para resecar el intes-tino mientras el animal todava vive (previo a la muerte espontnea).

La comprobacin de lesin histopatolgica (grados 3-4) en animales expuestos a frmula ms estrs se equipara a los resultados obtenidos por diversos grupos de investigacin que inoculan LPS por va oral, previo al inicio de la alimenta-cin con frmula como medio para maximizar la tasa de obtencin de ECN, por lo cual este modelo muestra capacidad para producir ECN en condi-ciones similares a las de la clnica.

En el presente estudio, el uso de hidrocorti-sona mostr una capacidad de reducir el dao de la mucosa intestinal en ratas sometidas a es-trs. Resta dilucidar cul es el mecanismo de este efecto protector.22,24 Creemos que el uso prenatal de corticoides puede interferir en la lesin epi-telial directa por peroxidacin de la membrana e inhibir la apoptosis25 por inactivacin de la pro-

Figura 4: Histopatologa correspondiente a animal del Grupo tratado (A), grado 1 y del Grupo control (B), compatible con grado 3-4 de lesin intestinal por ECN (10x)

A B

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caspasa 3, evitando el dao mitocondrial por li-beracin del citocromo C. n

BIBLIOGRAFA1. Gabargnati CS, Ceriani Cernadas JM. Enterocolitis necro-

sante. En: Neonatologa Prctica. 4 Ed. Buenos Aires: M-dica Panamericana, 2009: Pgs. 695-703.

2. Gabargnati CS, Lobos P. Enetrocolitis necrosante. En: PRONEO-Programa de Actualizacin en Neonatologa. 5 ciclo, Mdulo 1. Buenos Aires: Mdica Panamericana, 2002: Pgs. 175-193.

3. Henry M, Moss L. Necrotizing enterocolitis. En: Ashcraft KW, Murphy JP, Sharp RJ, Sigalet DL, Snyder CL. Pediat-ric surgery. Ed W.B. Saunders Co, 2000.

4. Martnez Ferro M, Cannizaro C, Rodrguez S, Rabasa C. Neonatologa Quirrgica. Buenos Aires: Grupo Gua, 2004: Pgs. 527-544.

5. Neu J. Neonatal necrotizing enterocolitis: An update. Acta Paediatric 2005; 94(Suppl 449):100-105.

6. Kliegman RM, Fanaroff AA. Necrotizing enterocolitis. N Eng J Med 1984; 310 (17): 1093-1103.

7. Stoll BJ, Hansen NI, Bell EF, Shankaran S, et al. Neonatal outcomes of extremely preterm infants from the NICHD Neonatal Research Network. Pediatrics 2010; 126(3):443-56.

8. Bauer CR, Morrison JC, Poole WK, Korones SB, et al. A decreased incidence of necrotizing enterocolitis after pre-natal glucocorticoid therapy. Pediatrics 1984; 73(5):682-8.

9. Barlow B, Santulli TV. Importance of multiple episodes of hypoxia or cold stress on the development of enterocolitis in an animal model. Surgery 1975; 77(5):687-690.

10. Jilling T, Lu J, Jackson M, Caplan M. Intestinal epithelial apoptosis initiates gross bowel necrosis in an experimen-tal rat model of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatr Res 2004; 55(4):622-629.

11. Hsueh W, Caplan MS, Qu XW, Tan XD, et al. Neonatal nec-rotizing enterocolitis: Clinical considerations and patho-genetic concepts. Pediatr Dev Pathol 2003; 6:6-23.

12. Clark JA, Lan RH, Maclennan NK, Holubec H, et al. Epi-dermal growth factor reduces intestinal apoptosis in an ex-perimental model of necrotizing enterocolitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2005; 288(4):G755-762.

13. Dvorak B, Halpern MD, Holubec H, Dvorakova K, et al. Maternal milk reduces severity of necrotizing enterocoli-tis and increases intestinal IL-10 in a neonatal rat model.

Pediatr Res 2003; 53(3):426-433.14. Halpern MD, Holubec H, Dominguez JA, Williams CS, et al.

Up-regulation of IL-18 and IL-12 in the ileum of neonatal rats with necrotizing enterocolitis. Pediatr Res 2002; 51(6):733-39.

15. Caplan MS, Lickerman M, Adler L, Dietsch GN, Yu A: The role of recombinant platetet-activating factor in a neona-tal rat model of necrotizing enterocolitis. Pediatr Res 1997; 42(6):779-783.

16. Kelly N, Friend K, Boyle P, Zhang XR, et al. The role of the glutathione antioxidant system in gut barrier failure in a rodent model of experimental necrotizing enterocolitis. Surgery 2004; 136(3):557-566.

17. Nadler EP, Dickinson E, Knisely A, Zhang R, et al. Expres-sion of inducible nitric oxide synthase and interleukin-12 in experimental necrotizing enterocolitis. J Surg Res 2000; 92(1):71-77.

18. Caplan MS, Russell T, Xiao Y, Amer M, et al. Effect of poly-unsaturated fatty acid supplementation on intestinal in-flammation and necrotizing enterocolitis in a neonatal rat model. Pediatr Res 2001; 49(5):647-652.

19. Kazez A, Kkaydin N, Kkaydin M, Kontas O, et al. A model of hypoxia-induced necrotizing enterocolitis: the role of distension. J Pediatr Surg 1997; 32(10):1466-1469.

20. Okur H, Kkaydin M, Kse K, Kontas O, et al. Hypoxia-induced necrotizing enterocolitis in the immature rat: the role of lipid peroxidation and management of vitamin E. J Pediatr Surg 1995; 30(10):1416-1419.

21. Akisu M, Kllahioglu GF, Baka M, Hsseyinov A, Kl-trsay N. The role of recombinant human erythropoietin in lipid peroxidation and platelet-activating factor genera-tion in a rat model of necrotizing enterocolitis. Eur J Pediatr Surg 2001; 11(3):167-172.

22. Akisu M, Baka M, Hsseyinov A, Kltrsay N. The role of dietary supplementation with L-glutamine in inflam-matory mediator release and intestinal injury in hipoxia/reoxygenation-induced experimental necrotizing entero-colitis. Ann Nutr Metab 2003; 47(6):262-266.

23. Chung DH, Ethridge RT, Kim S, Owens-Stovall S, et al. Molecular mechanisms contributing to necrotizing entero-colitis. Ann Surg 2001; 233(6):835-842.

24. Dimmitt RA, Glew R, Colby C, Brindle M, et al. Serum cy-tosolic b-glucosidase activity in a rat model of necrotizing enterocolitis. Pediatr Res 2003; 54(4):462-465.

25. Lin PW, Stoll M. Necrotizing enterocolitis. Lancet 2006; 368(9543):1271-1283.