EFECTO DEL EXTRACTO ETANOLICO DE Passiflora ligularis Juss. “granadilla” EN EL CRECIMIENTO DE UNA CEPA

BACTERIANA DE Staphylococcus aureus

RESUMEN

Un problema actual que afronta la medicina es la resistencia que vienen adquiriendo

microorganismos patógenos, una bacteria Staphylococcus aureus muestra un claro

ejemplo de ello. Es así que la presente investigación busco determinar si el extracto

de “granadilla” tiene la capacidad de inhibir el crecimiento de una cepa de S. aureus

en condiciones de laboratorio, además de determinar su toxicidad. Para ello se

preparó un extracto etanólico de las hojas de granadilla, y haciendo uso del método

de difusión en disco Bauer se evaluó el diámetro de inhibición. Los Grupos C3 (100

mg/ml) y C4 (200 mg/ml), los de mayor concentración, fueron los únicos que

mostraron diferencias significativas en relación al grupo control (C) con un nivel de

significancia p<0.05. En el bioensayo con Artemia salina se encontró que los

tratamientos C, D Y E presentan diferencias significativas con respecto al grupo

control con un nivel de significancia p<0.05, sin embargo el tratamiento B cuya

concentración fue de 1 µg/ml no mostro significancia alguna respecto al grupo control

(A).

Se concluye que el extracto de P. ligulares es moderadamente toxico y que posee un

reducido potencial de inhibición frente al crecimiento de S. aureus.

Palabras claves: Passiflora ligularis, Staphylococcus aureus, inhibición, toxicidad,

Artemia salina.

I. INTRODUCCIÓN

Las plantas medicinales han acompañado al ser humano desde la más remota

antigüedad, no hay cultura que no haya desarrollado su propia flora medicinal, la

cual es generalmente transmitida por tradición oral (Salaverry y Cabrera, 2014). Ya

desde tiempos inmemoriales numerosas poblaciones indígenas de todo el mundo,

algunas de niveles culturales muy elevadas, tuvieron como base de supervivencia el

uso de diversos productos que extraían de los bosques que constituían su habitad.

Entre tales productos se encuentran los empleados con fines medicinales (Vattuone

y col., 2010). Dentro de su flora Perú cuenta con especies vegetales muy variadas,

con propiedades medicinales, las cuales no se han difundido debido al escaso

conocimiento científico que se tiene de ellas y al poco apoyo que en general se le

brinda a la investigación.

Actualmente el consumo de frutas y verduras está ganando la atención de

todo el mundo por los beneficios para la salud que incluye propiedades

cardioprotectoras, contra el cáncer, anti-diabéticas y anti-obesidad. Los compuestos

bioactivos como polifenoles, incluyendo los flavonoides, taninos, catequinas,

vitaminas C y E, β -caroteno, etc., y varios otros confieren estos beneficios

protectores de la salud. La mezcla de estos compuestos puede proporcionar una

mejor protección debido a sus efectos sinérgicos (Saravanan y Parimelazhagan,

2014).

El género Passiflora constituye una enorme riqueza, tanto a nivel

económico, como nutricional y de recursos genéticos. Algunas pasifloras tienen

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propiedades sedativas, antiespasmódicas y "antibacteriales". Es bien conocido por

sus usos comerciales, muchas especies son ampliamente cultivadas para la

producción de frutas. Otras especies se utilizan como plantas ornamentales por sus

flores de colores vivos. El conocimiento farmacológico del género Passiflora indica

su potencial para el desarrollo de fármacos ansiolíticos y sedantes. Un número

significativo de especies ha sido utilizado en la medicina popular tradicional en

muchos países, como remedio para tratar la ansiedad, el insomnio, la histeria, la

epilepsia, los espasmos y el dolor (Carvajal de Pabón y col., 2011).

P. ligularis es una planta originaria de América Tropical, nativa y cultivada

por los antiguos peruanos debido a sus deliciosos frutos; es una especie trepadora

mediante zarcillos, completamente glabra, con tallos cilíndricos de varios metros de

longitud, cultivada en los Valles Interandinos, Región Andina y Sierra peruana

ubicados entre los 800 – 2500 m.s.n.m. (Mostacero y col., 2009). Dada las

propiedades curativas de esta planta, se utilizan tanto las hojas como el fruto en la

industria química y farmacológica. Se trata de una fruta con propiedades diuréticas

y digestivas, la infusión de las hojas de la planta se utiliza para controlar la fiebre y

la tifoidea (Medina, 2006). La decocción del tallo y la cascara del fruto se usa en

patología digestiva, respiratoria y afecciones hepáticas. La infusión y tintura de las

hojas y tallos es útil para tratar hipertensión, diabetes, cistitis, anemia y diarrea.

Hojas y tallo en decocción, para baños externos, son útiles en afecciones de la piel.

El fruto, las hojas tiernas y las flores tienen propiedades analgésicas, diuréticas,

contra el dolor abdominal, sedante, baja la fiebre, expulsa parásitos intestinales,

fluidifica el moco bronquial y es cicatrizante (Restrepo de Fraume y col., 2005).

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Por sus propiedades medicinales, los frutos del género Passiflora son una

alternativa para el control de enfermedades digestivas, por lo cual tienen un alto

potencial de mercado. Estudios recientes mostraron que las partes herbales (hojas y

flores) de este género poseen propiedades bioactivas y farmacológicas altamente

efectivas (Li y col., 2011), una de ellas es la actividad ansiolítica encontrada en los

extractos de la flor (Pallo, 2012). Dhawan y col., (2004) en P. edullis y P. incarnata

determinaron la presencia de compuestos activos como alcaloides, fenoles,

cianogenicos y flavonoides glicosilados. Por otra parte indican que los alimentos

ricos en compuestos polifenólicos tienen alta relación con la capacidad antioxidante;

igualmente Bisignano y col., (1999) encontraron que la actividad antimicrobiana

está estrechamente ligada a los compuestos bioactivos presentes en las partes

herbales de las plantas.

A pesar del desarrollo de numerosos medicamentos antimicrobianos en los

últimos años, la incidencia de resistencia a los fármacos múltiples por

microorganismos patógenos ha aumentado. Hoy en día las propiedades terapéuticas

de polifenoles vegetales también han demostrado efectos antimicrobianos por

causar daño estructural o funcional a la membrana celular bacteriana. Varios

estudios también han demostrado que las frutas ricos en polifenoles ejercen tanto los

efectos antioxidantes y antimicrobianos (Saravanan y Parimelazhagan, 2014).

Staphylococcus aureus es el mayor patógeno humano causante de

infecciones a la piel y tejidos, neumonía, septicemia e infecciones por dispositivos

asociados. La emergencia de cepas resistentes a meticilina y otros agentes

antibacteriales ha llegado a ser una preocupación mayor especialmente en el

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ambiente hospitalario, esto es por la alta mortalidad debido a las infecciones

sistémicas ocasionadas por Staphylococcus aureus (Mamani y col., 2006).

Desde el primer aislamiento de S. aureus resistente a la oxacilina (SAOR)

obtenido en Inglaterra en 1961, se ha ido incrementando el número de casos de

aislamientos resistentes hasta llegar a la actualidad. Tanto es así, que en la

actualidad SAOR constituye un patógeno en la que este microorganismo se

encuentra distribuido en todo el mundo en porcentajes variables hospitalario

frecuente, que produce estancias en el hospital más largas y costos de salud

crecientes, con una proporción de mortalidad alta (Perazzi y col., 2010).

En este contexto y por lo expuesto anteriormente la presente investigación

tiene como finalidad evaluar en el laboratorio el efecto inhibitorio que produce el

extracto etanólico de Passiflora ligularis en el crecimiento de una cepa de

Staphylococcus aureus, y determinar mediante el bioensayo de toxicidad en Artemia

salina si dicho extracto es inocuo para la salud.

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II. MATERIAL Y METODOS

Área de estudio

La investigación se realizó en la ciudad de Trujillo, siendo los análisis de la

marcha fitoquímica, el bioensayo de toxicidad en Artemia salina y la prueba de

antibiograma con una cepa bacteriana, desarrollados en el Laboratorio de

Fitoquímica del Departamento Académico de Química biológica y Fisiología

Animal de la Universidad Nacional de Trujillo.

Planta y preparación del extracto etanólico

Las hojas de Passiflora ligularis “granadilla” se colectaron en los jardines de

la Ciudad Universitaria. Se lavaron en agua potable y agua destilada y se dejaron

secar a temperatura ambiente. Para la preparación del extracto se cortaron las hojas

en trozos muy pequeños y se colocó 70 gr de la muestra a macerar en 350 ml de

etanol de 96° durante un periodo de 7 días a temperatura ambiente, agitando el

envase por 5 minutos dos veces al día. Al cabo de ese tiempo, se procedió a reflujar

el macerado por 1 hora y media, el sobrenadante se filtró en caliente, se vertió en

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una placa Petri y se secó por per-vaporación hasta que se logre una consistencia

pastosa. El extracto seco se mantuvo en refrigeración hasta su posterior uso.

Marcha fitoquímica preliminar

Para la determinación de los distintos grupos de fitoconstituyentes del

extracto se realizó la marcha fitoquímica propuesta por Lock de Ugaz (1994) con

ligeras modificaciones (Figura 2).

Bioensayo de toxicidad en Artemia salina

Los nauplios de Artemia salina fueron obtenidos de un acuario de la ciudad

de Trujillo, una vez en laboratorio estos fueron colocados en un recipiente que

estuvo sometido a un constante burbujeo con una bomba de oxígeno. Para la

preparación de las distintas concentraciones se disolvió 20 mg de la muestra

(extracto) en 2 mL agua de mar (previamente filtrada). A partir de esta solución, se

prepararon diluciones de 1000, 100, 10 y 1 µg/mL, transfiriendo a cada vial 500, 50,

5 y 0.5 µL respectivamente. Fueron 3 viales por cada concentración (9 en total). Se

hizo también un grupo control que contuvo solo agua de mar. En cada vial se

colocaron 10 nauplios y se agregó agua de mar hasta completar 5 mL por vial.

Luego de 24 horas se contaron el número de individuos muertos en cada vial.

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Ensayo in-vitro de actividad antibacterial

La actividad antimicrobiana en los extractos de P. ligularis se determinó

utilizando el método de difusión en disco Bauer (1966). Para la preparación del

medio de cultivo, en 200 ml de agua destilada se diluyeron 4.2 gr de medio Müller

Hinton y 3 gr de Agar-agar Oxoid. Se vertió aprox. 10 ml de medio de cultivo en

placa Petri y posterior a la solidificación del medio se inoculó con una suspensión

bacteriana de Staphylococcus aureus (Gram-positiva). En la superficie del medio

inoculado fueron dispuestos discos de antibióticos de 5 mm de diámetro

previamente impregnados con el extracto a distintas concentraciones (200 mg/ml,

100 mg/ml, 50 mg/ml y 25 mg/ml). Las placas Petri fueron llevados a incubación

durante 24 h a una temperatura de 37 °C. Se utilizó además un control con agua

destilada. Se realizaron tres repeticiones para cada tratamiento. La medición de la

inhibición microbiana de los extractos frente a la de los controles se determinó

midiendo el diámetro de los halos.

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III. RESULTADOS

Fitoconstituyentes del extracto

Tabla 1. Presencia o ausencia de los distintos grupos de metabolitos secundarios en el extracto etanólico de las hojas de Passiflora ligularis.

Fitoconstituyentes cantidadFlavonoides +

Taninos +++Esteroides ++

Cardenólidos +Alcaloides +

(+)=Baja cantidad; (++)=Mediana cantidad; (+++)=Alta cantidad

Bioensayo de toxicidad

Tabla 2. Número de individuos vivos, muertos y porcentaje de letalidad en nauplios de Artemia salina expuestos a diferentes concentraciones del extracto etanólico de Passiflora ligularis.

A (control) B (1 µg/ml)C (10 µg/ml)

D (100 µg/ml)

E (1000 µg/ml)

Vivos 9 9 5 2 1

Muertos 1 1 5 8 9

Letalidad (%)

6.7 10 50* 76.6* 90*

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* p<0.05 = existe diferencia significativa entre la comparación de medias del grupo control respecto a los demás grupos.

Actividad antimicrobiana del extracto

Tabla 3. Diámetro de los halos de inhibición del crecimiento de Staphylococcus aureus luego de 24 h. expuestos a las diferentes concentraciones de extracto etanólico de Passiflora ligularis.

C (control)C1 (25 mg/ml)

C2 (50 mg/ml)

C3 (100 mg/ml)

C4 (200 mg/ml)

Diámetro de

inhibición (cm)

0.9 1.3 1.2 1.7* 2.5* a, b

S2 0 0.16 0.01 0.01 0.14

* p<0.05 = existe diferencia significativa entre la comparación de medias del grupo control respecto a los demás grupos.

a

p<0.05 = existe diferencia significativa entre la comparación de medias del grupo C4 y el grupo C1.

b p<0.05 = existe diferencia significativa entre la comparación de medias del grupo C4 y el grupo C2.

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IV. DISCUSION

El análisis fitoquímico preliminar indica que en las hojas de Passiflora

ligularis se hallan una gran cantidad de compuestos fenólicos tales como taninos y

flavonoides, una moderada cantidad de esteroides y la presencia de cardenólidos y

alcaloides. Pallo (2012) obtuvo resultados que se asemejan a los nuestro señalando

que esta especie posee una gran cantidad de flavonoides y taninos, además al ser su

análisis mucho más amplio que el nuestro pudo determinar la presencia de una

buena cantidad de compuestos lactónicos y quinonas. En efecto son estos

compuestos químicos con acciones farmacológicas, los denominados principios

bioactivos, que constituyen muchas veces los ingredientes primarios utilizados por

laboratorios farmacéuticos como punto de partida en el desarrollo de formas

comerciales que serán patentadas para su uso terapéutico (Lopez, 2012).

Nuestros resultados en el bioensayo con Artemia salina sugieren que el

extracto de las hojas de “granadilla” posee una moderada toxicidad. También se

verifica en la Tabla 2 que los tratamientos C, D Y E presentan diferencias

significativas con respecto al grupo control con un nivel de significancia p<0.05, sin

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embargo el tratamiento B cuya concentración fue de 1 µg/ml no mostro significancia

alguna respecto al grupo control (A). Esto quiere decir que a partir de la concentración de

10 µg/ml hacia adelante el extracto mostró un marcado porcentaje de letalidad frente a los

nauplios de A. salina y que el porcentaje de letalidad es directamente proporcional al

aumento de la concentración del extracto. Rojas y Diaz (2009) en condiciones

experimentales, determinaron que la administración oral a dosis repetidas durante

28 días del extracto metanólico de las hojas de Passiflora edulis, en ratas, no mostró

toxicidad fisiológica, morfológica, neurológica, de comportamiento, bioquímica

sanguínea ni a nivel anatomopatológico. El hecho de que ambas especies

pertenezcan a la misma familia y género brinda información necesaria para poder

sugerir que las plantas del género Passiflora no contienen en su composición

metabolitos que le confieran toxicidad a estas especies, de ser así la toxicidad podría

llegar a ser considerada únicamente moderada.

En cuanto a la capacidad de P. ligularis para inhibir el crecimiento

bacteriano de una Gram positiva los resultados se muestran en la Tabla 3. Las cepas

de Staphylococcus aureus expuestas a las diferentes concentraciones del extracto P.

ligularis mostraron una mayor inhibición en su crecimiento con respecto al grupo

control, sin embargo los grupos C3 (100 mg/ml) y C4 (200 mg/ml), los de mayor

concentración, fueron los únicos que mostraron diferencias significativas en

relación al grupo control (C) con un nivel de significancia p<0.05 la exposición de

la cepa a concentraciones menores, grupo C1 (25 mg/ml) y C2 (50 mg/ml)

prácticamente inhibió en absoluto el crecimiento de la bacteria. Cabrera y col.

(2014) determinaron que los extractos de Passiflora ligularis tienen la capacidad

para inhibir el crecimiento de cepas Gram negativa como E. coli y de Gram positiva

11  | 

como S. aureus, siendo en la primera el efecto mucho mayor que en la segunda.

Resultados similares fueron obtenidos por Kannan y col. (2010) al exponer las

mismas bacterias frente al extracto de P. mollisima.

Tavares (2000) consideran que la posible causa de este efecto en el

crecimiento de E. coli son las alteraciones en la membrana celular en contacto con

extracto de Passiflora, debidas al efecto de las las saponinas que se encontraron en

dicha especie sobre la doble capa de lípidos presente en la membrana de las

bacterias Gram negativas. Los polifenoles vegetales también han demostrado

efectos antimicrobianos por causar daño estructural o funcional a la membrana

celular bacteriana. Varios estudios también han demostrado que las frutas ricos en

polifenoles ejercen tanto los efectos antioxidantes y antimicrobianos (Saravanan y

Parimelazhagan, 2014). Otros estudios también han confirmado la capacidad

inhibitoria de los extractos de Passiflora sobre distintos microorganismos

patógenos, Bendini y col. (2006) mostraron la presencia de actividad antimicrobiana

en extractos metanolicos de hojas de P. nitida y P. foetida sobre la cepa E. coli.

Alam Ripa y col. (2009) encontraron que los extractos cloroformicos de hojas y

tallos de P. edulis tienen efecto antimicrobiano sobre S. aureus y E. coli. Por último

Saravanan y Parimelazhagan (2014) indican que los frutos de P. ligularis posee

actividad antibacteriana contra bacterias Gram (+) y bacterias Gram (-), además

inhibe las cepas de hongos Candida albicans y Aspergillus niger presentando halos

de inhibición de 14,85 mm y 13,91 mm respectivamente en el método de difusión

en disco.

Con base en los resultados obtenidos podemos afirmar que el extracto de P.

ligularis mostró un reducido potencial inhibitorio con respecto a la cepa de

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Staphylococcus aureus debido a que en nuestros resultados solo se observaron halos

de inhibición a concentraciones muy elevadas del extracto. Aun así presenta una

buena actividad antibacteriana contra otras cepas Gram negativas y una marcada

actividad antifúngica. Es así como estos resultados para P. ligularis, posicionan a

esta especie vegetal como una posible potencial fuente de sustancias biocidas para

determinadas tipos de microorganismos patógenos con posible utilidad a nivel

comercial o como uso para tratamientos alternativos por lo que cabe considerar a

esta especie como un interesante objeto de estudio.

V. CONCLUSIONES

Se encontró que Staphylococcus aureus fue una bacteria muy resistente ante

el efecto inhibitorio del extracto de Passiflora ligularis, Así como también en el

bioensayo de toxicidad frente a Artemia salina se determinó que el extracto de las

hojas de esta especie fue moderadamente toxico.

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VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Alam Ripa, F., Haque, M., Nahar, L. e Islam, M. (2009). Antibacterial, Citotoxic and Antioxidant Activity of Passiflora Edulis Sims. Europ. J. Sci. Res, 31(4), 592 - 598.

Bisignano, G., Tomaino, R., Lo Cascio, G., Crisafi, G., Uccela, N., y Saija, A. (1999). On the in-vitro antimicrobial activity of oleurepein and hydroxytyrosol. J. Pharmacol, 31, 971 - 974.

Cabrera, S., Sandoval, A. y Forero, F. (2014). Potencial antioxidante y antimicrobiano de extractos acuosos e hidroalcohólicos de granadilla (Passiflora ligularis). Acta Agronómica, 63(3), 1 - 11.

Carbajal de Pabón, L., Turbay, S., Rojano, B., Alvarez, L., Restrepo, S., Alvarez, J., Bonilla, K., Ochoa, C. y Sánchez, N. (2011). Algunas especies de Passiflora y su capacidad antioxidante. Plant Med, 16(4).

Dhawan, K., Dhawan, S., y Sharma, S. (2004). Passiflora: a review update. J. Ethnoph, 94 (1), 1 - 23.

Kannan, S., Parimala Devi, B., y Jayakar, B. (2010). In-vitro antibacterial activity of variuos extracts on the leaves of Passiflora mollisima. J. Chem. Pharmac. Res. 5 (2), 225 - 228.

14  | 

Li, H., Zhou, P., Yang, Q., Shen, Y., Deng, J., Li, L., y Zhao, D. (2011). Comparative studies on anxiolytic activities and flavonoid compositions of Passiflora edullis flavicarpa. J. Ethnophar, 133 (3), 1085 - 1090.

Lock de Ugaz. (1994). Investigacion fitoquimica Métodos en de productos naturales. Lima: Fondo Editorial de la Pontifica Universidad Católica del Perú

Lopez, M. (2012). Manual de plantas medicinales para Guinea Ecuatorial. España: Fund. de Religiosos para la salud.

Mamani, E., Luján, D. y Pajuelo, G. (2006). Perfil de sensibilidad y resistencia de Staphylococcus aureus. Experiencia en el Hospital Nacional Hipólito Unanue. Anales de la Facultad de Medicina, 67(2), 120-124.

Medina, G. (2006). Evaluación del efecto ansiolítico del extracto hidroalcohólico de flor de granadilla (Passiflora ligularis). Tesis. Escuela Superior Politécnica de Chimborazo, Ecuador.

Mostacero, J., Mejía F., Gamarra, O. (2009). Fanerógamas del Perú: Taxonomía, Utilidad y Ecogeografía. Trujillo-Perú: Concytec.

Pallo, M. (2012). Evaluación del efecto ansiolítico del extracto hidroalcohólico de flor de granadilla (passifloraligularis) en ratones (mus musculus)” (Perazzi y col., 2010).

Restrepo, M., Quintero, P., Fraume, N. (2005). El milagro de las plantas aplicaciones Medicinales y Orofaríngeas. Bogotá: San Pablo.

Rojas, J. y Diaz, D. (2009). Evaluación de la toxicidad del extracto metanólico de hojas de Passiflora edulis Sims (maracuyá), en ratas. Anales de la Facultad de Medicina, 70(3), 175-180.

Saravanan, S., y Parimelazhagan, T. (2014). In vitro propiedades antioxidantes, antimicrobianas y anti-diabéticos de polifenoles de Passiflora ligularis Juss. pulpa de fruta. Food Science and Human Wellness, 3(2), 56 - 64.

Salaverry, O. y Cabrera, J. (2014). Florística de algunas plantas medicinales. Rev Peru Med Exp Salud Publica, 31(1), 165-168.

Tavares, W. (2000). Bacteria gram positivas problemas: resistencia do estafilococo, do enterococo e de pneumococo aos antimicrobianos. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 33,3.

15  | 

Vattuone, M., Martinez, R. y Corzo, A. (2010). Actividad antimicrobiana de extracto de hojas de Caesalpinia paraguariensis, Par. Burk, “Guayacan”.

ANEXOS

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ANEXO 1

PREPARACION DEL EXTRACTO ETANOLICO

Figura 1. Obtención del macerado y puesto a secar

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ANEXO 2

MARCHA FITOQUIMICA

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Figura 2. Marcha fitoquímica preliminar

19  | 

Figura 3. Reacciones de identificación de metabolitos secundarios

20  | 

ANEXO 3

BIOENSAYO DE TOXICIDAD

Figura 4. Diluciones a diferentes concentraciones preparadas a partir del extracto para el bioensayo en Artemia salina

Figura 5. Colocación de los nauplios en cada vial

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ANEXO 4

ACTIVIDAD ANTIBACTERIAL

Figura 6. Diluciones a distintas concentraciones preparados a partir del extracto para el ensayo de inhibición de Staphylococcus aureus

Figura 7. Placas con medio de cultivo listas para sembrar

22  | 

Figura 8. Inoculación de las bacterias en las placas

Figura 9. Observación y medición del diámetro de los halos de inhibición

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