Efecto del estado de estrés oxidativo sobre núcleos interpuestos del cerebelo en ratas

Autores

Leija-Torres L.; Navarrete-Ramos K.; Ruiz Velasco-Leyva D.; Vázquez-Quintana P.; Zúñiga-

Chacón G.

Asesores

Rivas-Arancibia S.; Gallegos-Ríos C.; García-Valdovino V.

Institución

Escuela Tomás Alva Edison

Área

Ciencias Biológicas, Químicas y de la Salud

(Proyecto con apoyo Externo)

Antecedentes

El estado de estrés oxidativo participa en la fisiopatología de diversas enfermedades neurodegenerativas como Parkinson, Hungtinton, Esclerosis múltiple y Esclerosis lateral amiotrófica. Este estado se caracteriza por la pérdida de equilibrio entre sistemas pro-oxidantes y antioxidantes, lo que se traduce en daño y muerte neuronal. Para detectar el daño causado por el estrés oxidativo, existen proteínas dentro de la célula de las cuales se conoce su función específica, como Citocromo C, Neu-N, Doble Cortina y GFAP; éstas que ayudan a detectar el grado de neurodegeneración causado por este estado.

Por otro lado, los núcleos interpuestos del cerebelo son los encargados de la coordinación y afinación de la actividad motriz.

Objetivos

Conocer el proceso de neurodegeneración en los núcleos interpuestos cerebelares, mediante el estudio de la pérdida de morfología celular como consecuencia del estrés oxidativo.

Cuantificar la muerte neuronal durante el desarrollo de dicho proceso.

Conocer la presencia y concentraciones de ciertas proteínas asociadas a la muerte celular por estrés oxidativo en el cerebelo de ratas.

Marco Teórico

Al cerebro se le puede dividir en dos hemisferios: derecho e izquierdo. Cada uno de los hemisferios posee áreas de especialización diferentes, pero ambos se encuentran relacionados mediante el cuerpo calloso. Al mismo tiempo, también se le puede dividir en corteza cerebral y la subcorteza, la cual está formada por el tallo cerebral dónde se ubica el cerebelo.

El cerebelo se relaciona con la postura, tono muscular, coordinación, equilibrio, control de movimientos oculares y finos, y está encargado del movimiento voluntario y del buen funcionamiento de los sistemas motores. En caso de lesión en cerebelo, hay pérdida de precisión espacial y coordinación del movimiento, falta de equilibrio, reducción de tono muscular y trastornos de aprendizaje motor. (Eccles y Szentagothai, 1967).

Por otro lado, se puede decir que el cerebelo se compone de:

• Una capa exterior o corteza cerebelosa que está cubierta por la sustancia gris (axones

no mielinizados).

• Sustancia blanca interna (axones cubiertos por una capa de mielina).

• 3 pares de núcleos:

1) Fastigial

2) Interpuesto (compuesto por dos núcleos: el globoso y el emboliforme)

3) Dentado

Existen enfermedades relacionadas con la pérdida parcial o total de las funciones de las neuronas. Éstas son llamadas enfermedades neurodegenerativas, y ocurren cuando existe una mutación genética, o bien, también pueden tener una índole hereditaria, como el Huntington. Dichas enfermedades provocan el deterioro de actividades como el equilibrio, el habla, la respiración, etc., afectando estructuras y zonas específicas del sistema nervioso central. (Schüssel, 2004, p. 3 – 5). El estrés oxidativo juega un papel importante en el proceso normal de envejecimiento así como en la fisiopatología de muchas enfermedades neuro- degenerativas

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) y las especies reactivas de nitrógeno (RNS), dependiendo del balance de óxido-reducción del organismo, pueden desempeñar un doble papel en el proceso de estrés oxidativo, pues durante el equilibrio redox, sirven como señalizadores para muchas funciones fisiológicas. Sin embargo, durante un estado de estrés oxidativo crónico, inducen daño y muerte celular. La sobreproducción de ROS puede ser compensado por las defensas antioxidantes del organismo y de esta manera mantener el equilibrio redox. Cuando este mecanismo falla, se genera un estado de estrés oxidativo, el cual se vuelve crónico e irreversible, ya que los sistemas antioxidantes se encuentran en bajas cantidades o están ausentes.

Metodología

En el laboratorio de Estrés Oxidativo y Plasticidad cerebral, de la Facultad de Medicina de la UNAM, se trabajó con cincuenta ratas Wistar macho adultas. Éstas fueron separadas en 6 grupos y expuestas crónicamente a bajas dosis de ozono durante 4 horas diarias por periodos de: 7, 15, 30, 60 y 90 días; el grupo control fue expuesto a aire libre de ozono. Una vez terminado el tratamiento, las ratas fueron anestesiadas profundamente, y perfundidas para poder realizar técnicas inmunohistoquímicas (técnicas de tinción de tejidos). Los cerebros fueron incluidos en parafina y se hicieron cortes transversales de 5 micras de grosor con un micrótomo. En las técnicas se utilizaron anticuerpos que expresaron las siguientes proteínas: Citocromo C, Doble cortina, Neu-N, y GFAP.

Resultados

Citocromo C

Días de tratamiento

7 días

15 días

30 días

60 días

90 días

Promedio de células marcadas

4.6 6 10.75 8 2.5

Doble cortina

Días de tratamiento

Control 15 días 30 días 60 días

Promedio de células marcadas

10 7.6 16.75 4

Neu-N

Días de tratamiento

Control 7 días 15

días 30

días 60

días 90

días

Promedio de células

15.6 10.6 12 8 6.7 5

GFAP Días de

tratamiento Control 15 días 30 días 60 días 90 días

Promedio de células

marcadas 24.25 28.33 35.75 26.66 15.25

Las gráficas, así como las fotografías respectivas de cada marcador, se encuentran en la sección de Anexos.

Análisis y discusión de Resultados

En la Gráfica 1, correspondiente al anticuerpo Citocromo C, se observa un aumento en el promedio de células marcadas, alcanzando su punto máximo a los 30 días de exposición a ozono. A partir de éste último punto, desciende considerablemente la expresión de Citocromo C, hasta su punto más bajo, a los 90 días. Esto significa una respuesta celular inflamatoria en la fase inicial del estado de estrés oxidativo, un déficit en la producción de ATP celular, indicándonos muerte celular programada en los núcleos interpuestos cerebelares. Al no haber células sanas en los núcleos, y lo que es más, al morir éstas, no se desarrollan correctamente las funciones de los núcleos interpuestos, hay una deficiencia en las aferencias procedentes del lóbulo frontal del cerebro, fisiológicamente de importancia motora. La muerte celular, principalmente neuronal, la podemos correlacionar gracias a la evidencia que nos proporciona la gráfica de Neu-N. Durante la primera fase del estado de estrés oxidativo se mantiene relativamente la cantidad de neuronas, y a partir de los 30 días, hay un declive constante de las mismas. Lo anterior se correlaciona de igual forma a los resultados mostrados por GFAP donde se indica que a los 30 días hay una sobre expresión de la proteína glial, dado que los astrocitos buscan reparar el daño neuronal producido por el estado de estrés oxidativo, pero que resulta insuficiente, pues como todas las gráficas lo indican, siempre hay disminución de células en el tratamiento más prolongado, pues éstas ya han sido fagocitadas por la microglía, que finalmente disminuye también como lo indica GFAP.

Conclusiones:

El estrés oxidativo resulta crucial en el proceso neurodegenerativo de los núcleos interpuestos, el cual se caracteriza tanto por la muerte neuronal y glial, como por la incapacidad de los mecanismos de reparación celular para generar nuevas células. Aunado a lo anterior, se concluye que el organismo no produce los suficientes antioxidantes para contrarrestar el daño causado por los radicales libres; sin embargo, la contaminación ambiental, representada por el ozono, juega un papel fundamental, ya que como vemos en los resultados, afecta considerablemente a la regeneración neuronal y glial.

Bibliografía:

• Rivas Arancibia, S. (2010). “Oxidative Stress Caused by Ozone Exposure Induces Loss of Brain Repair in the Hippocampus of Adult Rats” en Toxicological sciences.

Oxford.

• Ischiropoulos, H., Beckman, J. (2003). Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: cause, effect or asociation? J. Clin. Invest. s/d.

• Mansilla, A. (2010). Teorías neurocientíficas: del átomo a la molécula y de la molécula a la función. México: El sevier.

Anexos

El eje de las ordenadas muestra el número de núcleo de células marcadas por campo y el eje de las coordenadas muestra los tratamientos donde 7, 15, 30, 60 y 90 son los días en que los animales fueron expuestos a ozono, el grupo control fue expuesto a aire libre de ozono.

Citocromo C:

Gráfica 1. Efecto de la exposición a ozono sobre la expresión de Citocromo C traslocado al núcleo de la célula para marcar muerte celular en los núcleos interpuestos del cerebelo.

02468

1012

7d 15d 30d 60d 90d

Nº

de

célu

las

inm

un

ore

acti

vas

a C

ito

cro

mo

C

Tratamientos de exposición a ozono (días)

Citocromo C

15 días 7 días

60 días 30 días

90 días

Neu-N

Gráfica 2. Efecto de la exposición crónica a ozono sobre la expresión de la proteína

nuclear Neu-N, la cual es específica para marcar núcleos neuronales.

Nótese los cambios en la expresión de Neu-N en los diferentes tratamientos, donde podemos observar una disminución progresiva de las neuronas a medida que aumenta el tiempo de exposición a ozono en los núcleos interpuestos.

0

5

10

15

20

control 7 d 15d 30d 60d 90d

Nº

de

cé

ula

s in

mu

no

reac

tiva

sa

Neu

-N

Tratamientos de exposición a ozono (días)

Neu-N

Control 7 días

15 días 30 días

60 días 90 días

Doble cortina:

Gráfica 3. Efecto de la exposición crónica a ozono sobre la expresión de la proteína microtubular doble cortina, la cual es específica para marcar neuroblastos.

Nótese los cambios en la expresión de Doble Cortina en los diferentes tratamientos, donde podemos observar una disminución progresiva de las neuronas a medida que aumenta el tiempo de exposición a ozono en los núcleos interpuestos.

0

5

10

15

20

Control 15d 30d 60d

Nº

de

cé

lula

s in

mu

no

reac

tiva

s a

Do

ble

Co

rtin

a

Tratamientos de exposición a ozono (días)

Doble Cortina

Control 15 días

30 días 60 días

GFAP

Gráfica 4. Efecto de la exposición a ozono sobre la expresión de GFAP, la cual es específica para marcar en la glía de los núcleos interpuestos de cerebelo, particularmente astrocitos.

Nótese los cambios en la expresión de GFAP en los diferentes tratamientos, donde podemos observar un aumento desde el grupo control hasta el grupo de 30 días, y una disminución a partir de dicho punto a medida que aumenta el tiempo de exposición a ozono en los núcleos interpuestos.

0

10

20

30

40

control 7d 30d 60d 90d

Nº

de

cé

lula

s in

mu

no

reac

tiva

s a

GFA

P

Tratamientos de exposición a ozono (días)

GFAP

GFAP

Control 7 días

90 días

60 días 30 días