“EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno:...

92
MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN CIENCIAS MARINAS Departamento de Pesquerías y Biología Marina PRESENTA Que para obtener el grado de TESIS Ma. del Carmen Rodríguez Jaramillo La Paz, Baja California Sur, 2004 “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL CALLO DE HACHA (Sowerby, 1835) (BIVALVIA: PINNIDAE)” Atrina maura

Transcript of “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno:...

Page 1: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN CIENCIAS MARINAS

Departamento de Pesquerías y Biología Marina

PRESENTA

Que para obtener el grado de

TESIS

Ma. del Carmen Rodríguez Jaramillo

La Paz, Baja California Sur, 2004

“EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN

EL CALLO DE HACHA (Sowerby, 1835)

(BIVALVIA: PINNIDAE)”Atrina maura

Page 2: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

INSTITUTO POLITECNICO NACIONALCOORDINACION GENERAL DE POSGRADO E INVESTIGACION

ACTA DE REVISION DE TESIS

En la Ciudad de La Paz, B.C.S., siendo las 10:00 horas del día 23 del mes de

Marzo del 2004 se reunieron los miembros de la Comisión Revisora de Tesis designadapor el Colegio de Profesores de Estudios de Posgrado e Investigación de CICIMARpara examinar la tesis de grado titulada:

"EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL CALLO DE HACHA

Atrina maura (SOWERBY, 1835) (BIVALVIA: PINNIDAE)"

Presentada por el alumno:RODRíGUEZApellido paterno

JARAMILLOmaterno

MARIA DEL CARMENnombre(s)r

Con registro:

Aspirante al grado de:MAESTRAENCIENCIASCONESPECIALIDADENCIENCIASMARINAS

Después de intercambiar opiniones los miembros de la Comisión manifestaron su APROBACIONDE LA TESIS, en virtud de que satisface los requisitos señalados por las disposicionesreglamentarias vigentes.

N REVISORA.

SE1ftIJ

DR. FEDERICO ANDRES GARCIA DOMINGUEZCo-Director

Page 3: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

DEDICATORIA A LA MEMORIA DE MI PADRE Rafael Rodríguez Aguilera † Por el cariño y apoyo que siempre me diste, por infundir en mí la confianza y tenacidad que me ha sacado adelante en la vida y por estar siempre a mi lado… gracias papá. A MI MADRE Adelina Jaramillo Roaro Por el amor, el ejemplo y el apoyo incondicional que toda la vida me haz dado, por brindarme siempre lo mejor de ti. El poder de tu fe es grandioso, gracias por tus oraciones que me acompañan en todo momento...gracias mamá A MI ESPOSO Francisco Javier Encarnación Ramírez Por todo tu amor y comprensión, eres mi fortaleza en los momentos difíciles y un gran compañero en los momentos felices. Tu presencia en mi vida ha sido determinante en el logro de esta meta y espero retribuirte de la misma forma en el logro de las tuyas.

A MIS HIJAS Alejandra, Ángela y Galilea Por ser mi más importante razón de existir, gracias por su amor, por disculpar tantas ausencias. Alex, gracias por cuidar de mis chiquitas, la ayuda que me haz dado es invaluable, esta tesis es por ustedes, son el principal motivo para terminar lo que emprendimos tú y yo juntas hace tantos años, eres la estrella que llego a mi vida y que trajo consigo la realización de tantos sueños….

A MIS HERMANOS Guadalupe, Mónica y Manuel A mi hermana Lupe, a quien le debo la lección de vida más valiosa que nadie me pudo haber dado, gracias por brindarme la oportunidad de estudiar una carrera, gracias a tu apoyo y sacrificio lo he logrado. A Moni, por tu dulce cariño y ayuda en los momentos más difíciles. A Manuel, por tus palabras de aliento que siempre recuerdo y que llevo en el alma, por que un día depositaste en mí tu confianza y compartiste por un instante, ese gran dolor que llevas dentro.

A MI TÍO Joel por el ser el mejor ejemplo en mi vida. A LA FAMILIA ENCARNACION RAMIREZ Ma. de Jesús, Antonio, Silvia, Sonia, Alfredo y David.Mi familia de La Paz, por cuidar de mis hijas durante la realización de esta tesis, especialmente a mi suegra. A LA FAMILIA NUÑEZ GUERRERO Edna, Lorenzo, Loredana, Roció y Adat Por cuidar de Alex durante los cursos de la Maestría, gracias por todo el apoyo y cariño que nos dieron cuando más lo necesitábamos. A MIS AMIGOS quienes me han brindado su valiosa amistad …por los viejos tiempos que nunca olvidaré…a Silvia, Juan Gabriel, Daniel, Javier, Esperanza, Jorge Artu ro, Rox, Juan Carlos, David, Leopoldo y tantos más. Por todo lo que he aprendido de ustedes y por los momentos que hemos compartido… Faby, Cony, Elena, Hortencia, Tere, Lucely, Liliana, Alejandra, Lucía, Eulalia, Ana Isabel, Cesar, Miguel, Pedro, Paty, José, Hervey, Rosy, Laura, Norma, Brenda, Vero, …y a todos los demás compañeros y estudiantes del CIBNOR con quienes he convivido y de los que he aprendido tantas cosas…. … A TODOS MIS FAMILIARES DE CELAYA A MI FAMILIA DE MONTERREY QUE TANTO EXTRAÑO A LA FAMILIA LEON MARTINEZ DE CELAYA

Page 4: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer de manera muy especial al Dr. Alfonso N. Maeda Martínez, director del presente trabajo, por su asesoría y compromiso, por confiar en mí, pero sobre todo, por no dejar de insistir en que terminara este trabajo y por brindarme su apoyo desde el primer día que me conoció... GRACIAS! Al Dr. Federico García Domínguez, co -director de esta tesis por sus valiosas sugerencias y asesoría, por su paciencia y buena disposición. A mi comité de revisión de tesis, M. en C. María Teresa Sicard, Dr. Oscar Holguín Quiñones y M. en C. Arturo Tripp Quezada, por sus acertados comentarios y valiosas observaciones al manuscrito. El presente trabajo se realizó gracias al apoyo de los proyectos CONACYT 1775P-B y G33593-B dirigidos por el Dr. Alfonso N. Maeda Martínez. A la Dra. Fabiola Arcos, a quien tengo mucho que agradecerle y no se por donde empezar…por brindarme incondicionalmente su asesoría, por sus valiosos comentarios que enriquecieron este trabajo y por motivarme a seguir adelante. Al Dr. Cesar Ruiz Verdugo y al Ocean. Miguel Robles por donar los reproductores del medio natural. Al Instituto Politécnico Nacional (IPN), en particular al Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas, por el apoyo brindado durante mi formación. Al Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI), por el soporte económico brindado durante la realización de los créditos de maestría. A todo el personal del Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste que me ayudaron en la realización de esta tesis. Especialmente mi agradecimiento para los M. en C. Ma. Teresa Sicard, Pablo Monsalvo Spencer y Daniel Prado Ancona, al Ocean. Miguel Robles, al Biol. Teodoro Reynoso, a los D.G. Gerardo Hernández, Adriana Landa y a los Lic. Edgar Yuen y Rubí Romero. A la Dirección de Apoyo Técnico y a los Investigadores usuarios del Laboratorio de Histología por darme la oportunidad de terminar esta tesis.

Page 5: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

INDICE

Página

LISTA DE FIGURAS................................................................ I LISTA DE TABLAS.................................................................. III GLOSARIO............................................................................. V RESUMEN.............................................................................. IX ABSTRACT ............................................................................. XI 1. INTRODUCCIÓN................................................................ 1 2. ANTECEDENTES................................................................. 8 2.1 POSICIÓN TAXONÓMICA............................................ 11 2.2 DIAGNOSIS BIOLÓGICA............................................. 11 3. JUSTIFICACIÓN................................................................ 14 4. HIPÓTESIS........................................................................ 16 5. OBJETIVOS....................................................................... 16 6. METODOLOGÍA.................................................................. 18 6.1. Origen de los reproductores........................................... 18 6.2. Gametogénesis de Atrina maura a 3 temperaturas............ 18 6.3. Análisis histológico e histoquímico................................... 20 6.3.1. Validación del método histoquímico Sudán Negro B.............................................................

20

6.4. Análisis cualitativos y cuantitativos................................. 21 6.4.1. Indice lipídico....................................................... 23 6.4.2. Diámetro teórico................................................... 23 6.4.3. Relación núcleo / citoplasma................................... 23 6.4.4. Análisis estadísticos............................................... 6.5. Calidad ovocitaria comparativa de reproductores de Atrina maura madurados en el medio natural y en el laboratorio, en el momento del desove.............................................

24 6.5.1. Hembras del medio natural.................................... 24 6.5.2. Hembras del laboratorio......................................... 24 6.5.3. Histología e histoquímica de las hembras en desove 25 6.5.4. Análisis estadístico de la calidad ovocitaria de hembras en desove...............................................

26

7. RESULTADOS.................................................................... 27 7.1. Validación del método histológico................................... 27 7.1.1. Tinción de triglicéridos y fosfolípidos por la técnica Sudán Negro B y cuantificación por análisis de imágenes..............................................................

27 7.2. Efecto de la temperatura en la inducción a la gametogénesis en el hacha Atrina maura.........................

29

7.2.1. Área de ovocitos.................................................. 29 7.2.2. Diámetro teórico.................................................. 33

Page 6: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

7.2.3. Índice lipídico...................................................... 33 7.2.4. Relación núcleo/citoplasma................................... 35 7.2.5. Análisis integral................................................... 35 7.2.5.1.Temperatura................................................ 35 7.2.5.2 Tiempo....................................................... 36 7.3. Frecuencia de las categorías ovocitarias........................... 37 7.4. Análisis morfométrico y de calidad de ovocitos posvitelogénicos y atrésicos inducidos a la gametogénesis a tres temepraturas y tres fechas de muestreo..................

39 7.4.1. Efecto de la temperatura sobre el diámetro teórico de los ovocitos posvitélogenicos..................................

40

7.4.2. Efecto de la temperatura sobre el lndice lipídico de los ovocitos posvitelogénicos ......................................

40

7.5. Análisis comparativo de los ovocitos en proceso de desove, provenientes de hembras maduradas en el laboratorio y en el medio natural......................................................

42 7.5.1. Descripción del desove........................................... 42 7.5.2. Análisis morfométricos y de calidad de ovocitos provenientes de hembras maduradas en el laboratorio vs. medio natural...................................................

43 7.5.3. Frecuencia de las categorías ovocitarias en hembras en proceso de desove maduradas en el laboratorio y en el medio natural..............................

44 7.5.4. lndice lipídico por categoría ovocitaria en ovocitos en desove.............................................................

46

8. DISCUSIÓN....................................................................... 48 9. CONCLUSIONES................................................................ 56 10. RECOMENDACIONES....................................................... 58 11. LITERATURA CITADA....................................................... 59 12. ANEXOS.......................................................................... 71

Page 7: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma. del Carmen Rodríguez Jaramillo

I

LISTA DE FIGURAS Página Figura 1. Producción de callo de hacha en el período de 1985-

1995. Tomado de Vélez-Barajas y Fajardo-León (1996).

2

Figura 2. Micrografía de ovario de Atrina maura. Corte por congelación a 10 µm de grosor teñido con Rojo Oleoso. Se observan los ovocitos posvitelogénicos (op), el núcleo (n) y los gránulos de lípidos (gl). 400X. Barra = 50 µm.

7

Figura 3. Sistema empleado para la para la inducción a la gametogénesis de Atrina maura, a 20, 25 y 30°C durante 43 días.

19

Figura 4. Efecto del tratamiento de extracción de lípidos por medio de cloroformo-metanol en una gónada femenina de Atrina maura inducida a la gametogénesis a 25°C durante 30 días. A) Corte tratado con cloroformo-metanol. Fosfolípidos (f) y B) Corte control sin tratamiento. Triglicéridos (t). Tinción SNB. 600 X = 25 µm.

28

Figura 5. Micrografías de cortes histológicos de las gónadas de Atrina maura inducidas a la gametogénesis durante 43 días a 20°C (A), 25°C (B), y 30°C (C). Ovocitos vitelogénicos (ov), ovocitos atrésicos (ova), núcleo (n), nucléolos (nc), triglicéridos (t). 400X. Tinción SNB. Barra = 50 µm.

30

Figura 6. Área de los ovocitos (µm²) de Atrina maura durante 43 días de inducción a la gametogénesis a tres temperaturas en el laboratorio. Los valores son la media ± el error estándar. n=120.

32

Figura 7. Diámetro teórico (µm) de los ovocitos de Atrina maura durante 43 días de inducción a la gametogénesis a tres temperaturas en el laboratorio. Los valores son la media ± el error estándar. n=120.

32

Figura 8. Índice lipídico de ovocitos de Atrina maura durante 43 días de inducción a la gametogénesis a tres temperaturas en el laboratorio. Los valores son la media ± el error estándar. n=120.

34

Page 8: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma. del Carmen Rodríguez Jaramillo

II

Figura 9.

Relación núcleo / citoplasma de los ovocitos de Atrina maura durante 43 días de inducción a la gametogénesis a tres temperaturas en el laboratorio. Los valores son la media ± el error estándar. n=120.

34

Figura 10. Frecuencia de las categorías ovocitarias presentes en las gónadas de Atrina maura inducidas a la gametogénesis a 20, 25 y 30°C, durante 15 (a), 30 (b) y 43(c) días.

38

Figura 11. Diámetro teórico de los ovocitos posvitelogénicos a las tres temperaturas de inducción a la gametogénesis, independientemente de la fecha de muestreo.

41

Figura 12. Índice lipídico de los ovocitos posvitelogénicos de Atrina maura inducidos a la gametogénesis a tres temperaturas a los 15, 30 y 43 días de muestreo.

41

Figura 13. Micrografía de gónada de Atrina maura en proceso de desove madurada a 30°C durante 43 días. Tinción Hematoxilina-eosina. Se aprecian ovocitos con la vesícula germinal rota (VGR), células auxiliares (ca) libres de la pared del acino y ovocitos vitelogénicos (ov). 100X. Barra = 200 µm. Tinción Hematoxilina-eosina.

43

Figura 14. Micrografía de ovocitos de gónada de Atrina maura en proceso de desove. A) Hembra madurada en el laboratorio a 30°C durante 43 días. B) Hembra del medio natural. Ovocitos normales (on), ovocitos inmaduros (oi), ovocitos atrésicos (oa). 400X. Barra = 50 µm. Tinción Sudán Negro B.

45

Figura 15. Frecuencia de las categorías ovocitarias de Atrina maura en proceso de desove, maduradas en el laboratorio a 30°C durante 43 días y en el medio natural.

46

Page 9: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma. del Carmen Rodríguez Jaramillo

III

LISTA DE TABLAS Página Tabla 1. Efecto del tratamiento de extracción de lípidos

mediante cloroformo-metanol sobre las variables área del ovocito, diámetro teórico, índice lipídico (triglicéridos), índice de lípidos polares (fosfolípidos) y la relación núcleo/citoplasma de una gónada de Atrina maura inducida a la gametogénesis a 25°C durante 30 días. n = 30.

28

Tabla 2. Área de los ovocitos (µm2) de Atrina maura inducidos a la gametogénesis durante 15, 30 y 43 días a tres temperaturas. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120.

31

Tabla 3. Diámetro teórico (µm) de los ovocitos de Atrina maura inducidos a la gametogénesis durante 15, 30 y 43 días a tres temperaturas. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120.

31

Tabla 4. Índice lipídico de los ovocitos de Atrina maura inducidos a la gametogénesis durante 15, 30 y 43 días a tres temperaturas. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120.

31

Tabla 5. Relación núcleo/citoplasma de los ovocitos de Atrina maura inducidos a la gametogénesis durante 15, 30 y 43 días a tres temperaturas. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120.

31

Tabla 6. Efecto de la temperatura sobre las variables morfométricas y de calidad ovocitaria de Atrina maura. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120.

36

Tabla 7. Efecto del tiempo de inducción a la gametogénesis sobre las variables morfométricas y de calidad ovocitaria de Atrina maura, independientemente de la temperatura. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120.

36

Tabla 8. Variables morfométricas y de calidad de ovocitos posvitelogénicos (inmaduros y normales) y atrésicos. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120.

40

Page 10: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma. del Carmen Rodríguez Jaramillo

IV

Tabla 9. Diámetro teórico e índice lipídico de ovocitos en proceso de desove, madurados en el laboratorio y en el medio natural, independientemente de su categoría ovocitaria. Los valores son la media ± el error estándar. n = 300.

44

Tabla10. Índice lipídico de ovocitos en proceso de desove en las diferentes categorías ovocitarias, independientemente del origen de las hembras. Los valores son la media ± el error estándar. n=300.

47

Tabla 11. Comparación de las categorías ovocitarias de las hembras en proceso de desove (laboratorio y medio natural). (P < 0.05).

47

Page 11: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma. del Carmen Rodríguez Jaramillo

V

GLOSARIO

Acinos: Aplicado en glándulas, son unidades estructurales de forma

redondeada que forman las gónadas en donde se desarrollan los

gametos, cuyas paredes están formadas por tejido germinal.

Atresias: Células en degeneración estructural y/o de reservas

energéticas. Normalmente ocurre en gametos femeninos en etapas de

vitelogénesis avanzadas, aunque puede ocurrir en previtelogénesis. Las

células foliculares adquieren propiedades fagocitarias, reabsorbiendo al

ovocito.

Análisis de imágenes: Método que permite mediante la integración

automatizada de dispositivos electrónicos y digitales, visualizar,

coleccionar y analizar los atributos de las imágenes de forma cualitativa

y cuantitativa.

Bivalvos: Comprende a los moluscos que tienen dos valvas articuladas

e incluye formas como las almejas, ostiones, mejillones y hachas, etc.

Gonocórico: Relativo a organismos del reino animal en los cuales los

órganos reproductores femeninos y masculinos se encuentran en

diferentes individuos.

Fotoperíodo: Duración relativa de los períodos de luz y obscuridad

(horas / luz) al que están expuestos los organismos.

Gametos: Células sexuales que pertenecen a la estirpe germinal.

Tienen una evolución propia que conducirá a la forma haploide gracias a

la reducción cromosómica o meiosis. Su finalidad es el fenómeno de la

Page 12: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma. del Carmen Rodríguez Jaramillo

VI

fecundación, que realiza la fusión de dos gametos, reestableciendo así la

diploidía.

Gametogénesis: Se denomina así al proceso de formación de gametos

o células sexuales femeninas y masculinas partir de las células del

epitelio germinal.

Hermafroditismo: Tipo de reproducción sexual que presentan algunos

organismos que poseen gametos femeninos y masculinos. En moluscos

hermafroditismo funcional o ambisexualidad funcional, sexualidad

consecutiva, sexualidad consecutiva rítmica y sexualidad alternativa.

Hermafroditismo protogínico: Tipo de reproducción sexual en el cual

algunos individuos de la población maduran por primera vez como

hembras y posteriormente se transforman en machos (hermafroditismo

consecutivo).

Hermafroditismo protándrico: Tipo de reproducción sexual en el cual

algunos individuos de la población maduran por primera vez como

machos y posteriormente se transforman en hembras.

Histoquímica: Métodos que tienen por objeto localizar sustancias

químicas conocidas en las células y los tejidos.

Índice lipídico: Indicador cuantitativo del contenido de triglicéridos o

fosfolípidos en un ovocito.

Núcleoplasma: Núcleo de los gametos femeninos en el cual se

encuentra el DNA y los nucléolos, contenidos por la vesícula germinal.

Page 13: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma. del Carmen Rodríguez Jaramillo

VII

Sudán Negro B: Colorante o sustancia “lisocroma” capaz de teñir los

constituyentes celulares disolviéndose en ellos, utilizado para la

detección de lípidos, tiñe diferencialmente fosfolípidos de color gris y

triglicéridos de azul a negro.

Oviducto: Conducto genital que forma la vía de paso de los óvulos

originados en los ovarios o gónadas femeninas, que son evacuados

hacia el exterior del organismo en el momento del desove.

Ovocito: Gameto o célula sexual femenina en desarrollo que se

diferencia durante la ovogénesis.

Ovogénesis: Proceso de formación de gametos femeninos u óvulos,

que se producen en las gónadas femeninas.

Ovogonia: Célula sexual femenina que prolifera del epitelio germinal,

se multiplica por mitosis y se diferencian en óvulos durante la

ovogénesis.

Ovoplasma: Matriz citoplasmática en la cual se encuentran los

organelos y las inclusiones que se forman durante la vitelogénesis

Píxel: Señal digital resultado de la transformación de fotodos que

liberan una carga a través de un dispositivo. El Dispositivo de

Acoplamiento de Cargas o CCD, es una matriz de elementos de imagen,

cuya unidad es el píxel, la cual registra diversas intensidades de luz, que

es captada como energía lumínica obtenida mediante la transformación

de un fotón en una carga eléctrica.

Page 14: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma. del Carmen Rodríguez Jaramillo

VIII

Profase: Etapa del ciclo celular tanto de la mitosis como de la meiosis

(formas de división celular), en la meiosis se inicia a nivel del joven

ovocito I y permanece bloqueada en el estadio de diploteno. El núcleo

aumenta considerablemente de tamaño.

Relación núcleo /citoplasma: Progresión geométrica expresada de la

siguiente forma: Área del núcleo / Área del citoplasma.

Vesícula germinal: Nombre que adquiere el núcleo que se encuentra

inicialmente en el centro del ovocito. Este se rompe, y entonces el

núcleoplasma se extiende por el ovoplasma durante la metafase.

Page 15: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma. del Carmen Rodríguez Jaramillo

IX

RESUMEN

El presente estudio se realizó para comparar las variables

morfométricas y de calidad de los ovocitos de hembras de Atrina maura

inducidas a la gametogénesis a tres temperaturas (20, 25 Y 30°C) en

condiciones del laboratorio. Por otra parte se realizó un análisis

comparativo entre ovocitos de hembras maduradas e inducidas al

desove en el laboratorio, y hembras obtenidas del medio natural durante

la temporada de desove. El desarrollo de los gametos femeninos fue

evaluado en cortes teñidos con técnicas histológicas e histoquímicas

(Hematoxilina-eosina y Sudán Negro B), examinados mediante el uso de

análisis de imágenes. Se desarrolló la metodología para la obtención de

un índice lipídico (IL) para indicar la cantidad de triglicéridos de cada

ovocito, el cual se comparó contra otras variables como el área (AO),

diámetro teórico (DT), y la relación núcleo / citoplasma (N/C) de los

ovocitos, así mismo se clasificaron de acuerdo con el grado de desarrollo

gametogénico en ovogonias, ovocitos previtelogénicos, vitelogénicos,

maduros (posvitelogénicos) y atrésicos. La frecuencia de estos gametos

fue estimada en tres regiones del ovario, contando el número de

ovocitos presentes en un área predeterminada. El análisis comparativo

de las variables medidas a las tres temperaturas mostró diferencias

significativas, observando que la temperatura influye tanto en la talla

de los ovocitos como en la cantidad de triglicéridos (IL). A la

Page 16: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma. del Carmen Rodríguez Jaramillo

X

temperatura de 20 °C se observaron ovocitos de mayor talla y con

mayor IL. Los ovocitos atrésicos fueron más abundantes a las

temperaturas de 25 y 30°C, así como en el desove de la hembra de

campo. El análisis de las hembras en desove mostró la existencia de

diferencias significativas en el contenido de lípidos de ovocitos normales,

inmaduros y atrésicos de las hembras de laboratorio y campo. El IL de

ovocitos de hembras del medio natural en desove fue más heterogéneo

que el de las hembras maduradas en el laboratorio.

Se estandarizó y validó la técnica de Sudán Negro B para la

cuantificación de triglicéridos con el sistema de análisis de imágenes

Image Pro Plus.

Page 17: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma. del Carmen Rodríguez Jaramillo

XI

ABSTRACT

This study compared morphometric and oocyte quality variables of

females of Atrina maura induced to gametogenesis at three

temperatures (20, 25 and 30°C) under laboratory conditions. In addition

a comparison was made between the quality of these oocytes with those

obtained form broodstock individuals brought directly from the field

during the spawning season. Oocyte development was evaluated using

histological and histochemical techniques (Hematoxylin-eosin and Black

Sudan B) and the preparations were digitalized and later studied with an

image analyzer. The oocytes were classified according to their

gametogenic developmental stage (oogonia, previtelogenic, mature and

atresia (reabsorption). The frequency of oocytes in each stage was

estimated, counting the number of oocytes appearing in a

predetermined test area. A methodology to obtain a lipid index (LI) for

each oocyte was developed, which was compared with other variables

such as the oocyte theoretical diameter (TD), oocyte area (OA) and

nucleus/cytoplasm ratio (N/C). Results show significant differences

between LI at different temperatures. The analysis of each spawn

showed significant differences in the lipid content of normal, immature

and atretic oocytes from the field than in oocytes from broodstock

matured in the hatchery. LI of oocytes from wild females was more

heterogeneous than from females matured in laboratory. The

comparative analysis of variables measured in oocytes at the three

temperatures showed significant differences and we observed the

influence of the temperature in both oocyte size and in the oocyte

triglyceride content (LI as an index of quality), and the temperature of

20°C was that the induced the major size oocytes and major LI. The

atretic oocytes were more abundant at the temperatures of 25 and 30

°C, as well as in wild females spawns. The quantification of triglycerides

Page 18: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma. del Carmen Rodríguez Jaramillo

XII

oocyte per oocyte was standarized with the image analysis system

Image Pro Plus.

Page 19: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

1

1. INTRODUCCIÓN

Hasta hace tres décadas las actividades pesqueras en México se

desarrollaban con un gran interés por los moluscos bivalvos debido a sus

cualidades gastronómicas, su gran abundancia y fácil accesibilidad,

(Holguín-Quiñones y González-Pedraza, 1994). Entre los moluscos, una de

las pesquerías que tiene más impulso en México, es la de los bivalvos de

la familia Pinnidae, cuyas especies son conocidas comúnmente como

“hachas”. Actualmente su extracción se lleva a cabo en los estados de

Baja California Sur, Sonora y Sinaloa, y aunque en los estados del sur del

país la explotación es menor, no deja de ser significativa en Michoacán,

Jalisco, Guerrero y Oaxaca (Atlas Pesquero de México, 1994).

En los litorales del Pacífico Mexicano se encuentran cinco especies

de esta familia. En el Golfo de California se distribuyen Atrina maura

(Sowerby, 1835), localmente conocida como hacha china o hacha de

riñón, Atrina tuberculosa llamada hacha espinosa o botijona (Sowerby,

1835) y Pinna rugosa (Sowerby, 1835) conocida como hacha larga. Dos

especies más se encuentran en la costa oeste de la Península de Baja

California: el hacha negra o lisa Atrina oldroydii (Sowerby, 1835), se

distribuye desde el Sur de California a Bahía Magdalena, y Atrina texta

(Sowerby, 1835) desde Banco Gorda frente al extremo de la Península

de B.C. hasta Islas Galápagos (Keen, 1971).

La pesquería de callo de hacha en el estado de Baja California Sur,

está constituida por tres especies; Pinna rugosa, Atrina maura y Atrina

oldroydii. Representa aproximadamente el 20% de la captura de hachas a

nivel nacional (Vélez-Barajas y Fajardo-León, 1996).

La parte del organismo que se comercializa es el músculo aductor

posterior llamado “callo”, que tiene una amplia demanda y precios altos

en el mercado, llegando a alcanzar entre 12.8 y 15.7 dólares

norteamericanos por kilogramo en 1996 (Vélez-Barajas y Fajardo-León,

Page 20: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

2

1996). En 2002 alcanzó precios de 12 a 18 dólares al adquirirlo en la

playa directamente con el pescador, aunque en el mercado sobrepasa los

25 dólares (González-Corona, 2003). Se comercializa principalmente en

los estados de Sinaloa, Sonora, Baja California, Baja California Sur y en

las grandes ciudades del interior como México, D. F., Guadalajara y

Monterrey (Vélez-Barajas y Fajardo-León, 1996).

Durante los últimos 20 años, la explotación de hachas se intensificó,

a tal grado que A. maura se encuentra a punto de desaparecer en algunas

zonas del Pacífico Mexicano (Arizpe-Covarrubias y Félix-Uraga, 1986;

Cardoza-Velazco y Maeda-Martínez, 1997). Los registros de captura de

callo de hacha para Baja California Sur (Atrina maura, Pinna rugosa y

Atrina oldroydii) en el período de 1985 a 1995 (Figura 1), indican una

extracción máxima de 1,148 toneladas de producto fresco. A partir de

1991 la tendencia ha sido a la baja, llegando a una mínima extracción de

91 toneladas en 1995 (Vélez-Barajas y Fajardo-León, 1996).

En las fuentes oficiales de México, la captura de callo de hacha se

incluye en la captura de callos de almeja. Entre 1966 y 2001, el callo de

hacha constituyó el 3.0% de la producción de callos de almeja reportada

por la Subdelegación de Pesca en B.C.S. (Diario Oficial de la Federación,

2004).

0200400600800

10001200

85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95

Año

Ton

elad

as

Figura 1 . Producción de callo de hacha en B.C.S., en el período de 1985-1995. Tomado de Vélez-Barajas y Fajardo-León (1996).

Page 21: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

3

Debido a esta disminución y a la falta de desarrollo del cultivo, los

niveles de producción actuales no pueden satisfacer la demanda del

mercado nacional, por lo que los grupos de productores están buscando

alternativas que les permitan explotar el recurso silvestre de forma

sustentable, e incrementar los volúmenes de producción a través de la

acuicultura.

La importancia de este recurso ha impulsado a varias instituciones

como el Centro Reproductor de Especies Marinas del Estado de Sonora

(CREMES) y al Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste

(CIBNOR), entre otras, a desarrollar una tecnología para su cultivo.

Gracias a ello, las etapas de preengorda y engorda ya se encuentran

dominadas técnicamente (Maeda-Martínez et al., 1996) pero aún existen

problemas en la producción de juveniles. Robles-Mungaray (2000), hizo

una revisión histórica de los avances y los problemas encontrados en

esta etapa, desde los primeros intentos de producción de juveniles en

San Blas Nayarit en los años 80’s, hasta las últimas producciones en el

Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR). Este autor

menciona que tanto la inducción a la gametogénesis como algunos

aspectos del cultivo de larvas, son temas que deberían ser estudiados

con mayor profundidad.

En algunas especies de moluscos se ha logrado la inducción a la

gametogénesis fuera de los periodos naturales de reproducción,

controlando la temperatura y suministrando una alimentación adecuada

(Loosanoff y Davis, 1963; Blake y Sastry, 1979; Devauchelle y Mingant,

1991). Por lo tanto, cuando se trabaja con especies nativas poco

estudiadas como A. maura, es fundamental determinar el rango de

temperatura en donde ocurra la transferencia de nutrientes necesaria

para la vitelogénesis en los ovocitos (Sastry, 1968, 1970, Sastry y Blake,

1971; Blake, 1972, Sastry, 1979).

Page 22: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

4

La cantidad y calidad de vitelo son muy importantes para asegurar

un adecuado desarrollo larvario, ya que las larvas de la mayoría de los

moluscos son inicialmente lecitotróficas y su desarrollo temprano

depende de las reservas bioquímicas que son transferidas de las

hembras a los ovocitos (Holland, 1978; Bayne y Newel, 1983; Marty et

al., 1992).

Así mismo se ha demostrado que durante la vitelogénesis,

embriogénesis y el desarrollo larvario, los lípidos y particularmente los

triglicéridos, juegan un papel de reserva energética (Racotta et al.,

2003b), mientras que los fosfolípidos participan en la formación de

membranas celulares. Por ejemplo, en Mercenaria mercenaria, Mytilus

edulis y Pecten maximus , la tasa de eclosión al estadio prodisoconcha I,

varía directamente proporcional a la cantidad de triglicéridos encontrada

en los ovocitos (Bayne et al., 1975; Gallager y Mann, 1986; Le Pennec

et al. 1990). Besnard (1988) demostró la importancia de los triglicéridos

en la conversión energética durante el desarrollo embrionario y de los

primeros estadios larvarios en Pecten maximus . En base a lo anterior,

Gallager et al. (1986) y Fraser (1989) propusieron que la cuantificación

de este tipo de lípidos podría servir como un índice de la condición

fisiológica y predictivos del éxito en la metamorfosis larvaria en bivalvos

y en otras larvas de moluscos, crustáceos y peces.

Los lípidos pueden ser detectados por métodos bioquímicos e

histológicos. En el caso de los histológicos tradicionalmente, se realizan

cortes por congelación supuestamente para evitar la disolución de los

lípidos con los solventes (alcohol, xilol, etc.) que se emplean en la

técnica de inclusión en parafina, y más tarde son teñidos con el

colorantes como el Rojo Oleoso (RO) que tiñe de rojo específicamente

estas biomoléculas (Gallager et al., 1986; Le Pennec et al., 1990)

(Figura 2). Sin embargo, esta técnica presenta la limitante de que no

permite distinguir entre los lípidos de reserva de los lípidos

Page 23: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

5

estructurales. Además, con los cortes por congelación no es posible

observar la frontera entre un ovocito y otro, en consecuencia, no es

factible estimar el área del ovocito con fines cuantitativos. Por lo tanto,

es necesario desarrollar un índice de calidad histológico que ayude a

cuantificar los lípidos de reserva de manera rápida y confiable.

En el presente estudio se desarrolló un índice lipídico de calidad

ovocitaria, empleando la propiedad del colorante Sudán Negro B (SNB)

de teñir los lípidos de reserva o triglicéridos de color negro o azul oscuro

y los fosfolípidos de color gris (Rodríguez-González, 2001; Burgos-

Aceves, 2003; García-Guerrero, 2003; Martínez-Lagos, 2003). Durante

el desarrollo de la técnica, se comprobó experimentalmente que los

tejidos fijados en solución de Davidson (Shaw y Batle, 1957 citado en

Howard y Smith, 1983), deshidratados con una serie de alcoholes de

menor a mayor concentración, incluidos en parafina, cortados en

secciones finas de 3 µm con el micrótomo y teñidos con SNB,

conservaron los triglicéridos (ver Sección 7.1), lo cual no era esperable

según lo mencionado anteriormente. Esto se comprobó comparando

cortes no tratados y cortes tratados con una mezcla de cloroformo-

metanol (Bancroft y Stevens, 1990). Por lo tanto, se logró la técnica

histoquímica requerida para diferenciar los lípidos de reserva,

separadamente de los estructurales.

Recientemente, la tecnología de análisis digital de imágenes ha

convertido a la histología en una herramienta cuantitativa (Heffernan y

Walker, 1989; Racotta et al., 2003a; Ceballos-Vázquez et al., 2003).

Esto es posible gracias a que el analizador suma áreas de cobertura

comunes por su color, densidad óptica o forma. Por ejemplo, si en la

tinción SNB los triglicéridos se tiñen de color negro y azul oscuro, el

analizador de imágenes es ajustado para cuantificar específicamente

esas áreas de cobertura. Adicionalmente con el analizador de imágenes

Page 24: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

6

se pueden medir las superficies de células completas (ovocitos) o partes

de ellas (organelos), delineando su contorno con el indicador de la

computadora. Con estas medidas se pueden estimar algunas variables

morfométricas como el área del ovocito, el diámetro teórico (Saout et

al., 1999), y la relación núcleo/citoplasma (N/C). Esta última ha sido

empleada como indicador de calidad de ovocitos en A. maura

(Rodríguez-Jaramillo et al., 2001), para distinguir entre células

germinales y periféricas que dan origen y estructura a las gónadas de

gasterópodos (Brisson y Regondaud, 1989), y para detectar

anormalidades celulares de fibroblastos en medicina humana

(Maminishkis et al., 1995). La N/C se fundamenta en que el núcleo

alcanza su tamaño final al inicio de la gametogénesis en la fase de

ovogonia (Raven, 1966), por lo tanto puede tomarse como referencia

para el crecimiento de otras partes de la célula como el citoplasma, el

cual continua su crecimiento hasta la fase posvitelogénica. Si se cuenta

con el área de cobertura de triglicéridos y la del ovocito, es factible por

lo tanto calcular la cantidad relativa de triglicéridos por ovocito, la cual

es equivalente al índice lipídico mencionado.

La reproducción de los moluscos bivalvos en su medio natural puede

ser cíclica ya sea anual, semianual o continua (Sastry, 1979). En A.

maura, González-Corona (2003) encontró que el proceso de

gametogénesis ocurre entre enero y julio en el Canal del Infiernillo y Bahía

de Kino, Sonora. Con el propósito de reducir costos de operación, es

común que los acuicultores prefieran colectar reproductores durante la

época natural de reproducción de las especies. Con ello se piensa que

además de acortar el proceso de inducción a la gametogénesis, los

gametos que se obtengan serán de mayor calidad que los madurados

completamente en el laboratorio, por la mayor abundancia y diversidad

del alimento disponible. Esta especulación se ha mantenido por mucho

Page 25: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

7

tiempo y sería muy útil comparar la calidad de los ovocitos obtenidos de

una u otra fuente.

En este trabajo se presenta el estudio del efecto de la temperatura

sobre la gametogénesis del hacha Atrina maura. Este efecto fue medido

en los gametos femeninos durante 43 días, estimando algunas variables

morfométricas como el área del ovocito, el diámetro teórico, la relación

núcleo/citoplasma, y una variable de calidad, el índice lipídico

desarrollado. Este estudio se realizó en todas las categorías ovocitarias

(ovogonias, ovocitos previtelogénicos, vitelogénicos, posvitelogénicos, y

atrésicos) y posteriormente solo en ovocitos posvitelogénicos. Además,

se describe el proceso celular del desove en esta especie, y se comparan

las variables morfométricas y el índice lipídico de ovocitos en proceso de

desove, provenientes de hembras maduradas en el laboratorio y en el

medio natural, empleando la metodología estandarizada y validada en

este trabajo.

Figura 2. Micrografía de ovario de Atrina maura. Corte por congelación a 10 µm de grosor teñido con Rojo Oleoso. Se observan ovocitos posvitelogénicos (op), el núcleo (n) y los gránulos de lípidos (gl). 400X. Barra = 50µm.

Page 26: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

8

2. ANTECEDENTES

En 1988 se produjeron los primeros juveniles de A. maura en el

Centro Reproductor de Especies Marinas del Estado de Sonora (CREMES).

En 1991 se realizó un nuevo intento con resultados alentadores por el

aumento en el número de juveniles producidos. A finales de 1994 y

principios de 1995 se obtuvo la primera producción comercial de

juveniles en ese laboratorio, con más de 800,000 individuos entre 15 y

25 mm de longitud. Al año siguiente, la producción se incrementó al

doble, pero hubo mortalidad masiva cuatro o cinco días antes de ser

entregada al productor (Robles-Mungaray et al., 1996).

Existen algunas investigaciones sobre la biología reproductiva en A.

maura (Baqueiro y Castagna, 1988; Arizpe-Covarrubias, 1995; Reynoso-

Granados et al., 1996; Robles Mungaray et al., 1996; Rodríguez-Jaramillo

et al., 2001; Enríquez-Díaz et al., 2003; González-Corona, 2003).

Particularmente se han realizado estudios citológicos de la gónada en

algunos miembros de la familia Pinnidae durante la ovogénesis y

espermatogénesis, como en Pinna nobilis (de Gaulejac et al., 1995a, b),

Atrina pectinata (Fang y Qi, 1988) y A. maura (Rodríguez-Jaramillo et

al., 2001; Enríquez-Díaz et al., 2003). En P. nobilis se identificaron y

describieron seis estadios de desarrollo gonádico en hembras a nivel

ultra estructural: protogonia, ovogonia, ovocitos previtelogénicos,

vitelogénicos, postvitelogénicos y en degeneración (atresias). En

machos determinaron cinco estadios de desarrollo: espermatogonia,

espermatocitos primarios, espermatocitos secundarios, espermátidas y

espermatozoides. En A. maura la evolución citológica a nivel histológico

ultra estructural de las gónadas, es similar al descrito en P. nobilis

(Enríquez-Díaz et al., 2003), y en consecuencia, Rodríguez-Jaramillo et

al. (2001) propusieron una escala reproductiva también de seis estadios

de desarrollo gonádico para esta especie.

Page 27: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

9

Enríquez-Díaz (2000) determinó las variaciones en la concentración

de proteínas y lípidos en la gónada, glándula digestiva y músculo aductor

de A. maura durante el proceso de maduración. Sus resultados indicaron

a diferencia de otros moluscos, que la energía utilizada en el proceso de

maduración gonádica fue proporcionada por el alimento suministrado, ya

que no encontró evidencia de la aportación de nutrientes de otros

compartimentos somáticos. Un resultado similar fue encontrado en el

pectínido Nodipecten subnodosus (Racotta et al., 2003a). Esto contrasta

con otros estudios que indican que los moluscos bivalvos toman la

energía para la reproducción de sustratos almacenados en órganos y

tejidos (Ansell 1974; Bayne, 1976; Gabbot, 1975; Bayne et al., 1982;

MacDonald y Thompson, 1986; Barber y Blake, 1991; Mathieu y Lubet,

1993) y específicamente de la glándula digestiva (Taylor y Venn, 1979),

el músculo aductor (Ansell, 1974) o el manto (Barber y Blake, 1981).

Esta movilización de nutrientes almacenados en tejidos como el

músculo, glándula digestiva y el manto, ha sido poco analizadas en

almejas (Lodeiros et al., 2001).

Partiendo de las experiencias en la aplicación de diversas

metodologías para el estudio de la biología reproductiva en otros

moluscos, el conocimiento de los mecanismos naturales de regulación y

de las estrategias reproductivas de las especies, ha implicado el uso de

diversos métodos de estudio que van desde la determinación de índices

gonádicos y de condición, utilización de escalas morfocromáticas de

desarrollo gonádico, hasta el análisis histológico de la gónada. Este último

es considerado como el más adecuado para determinar la cinética del

desarrollo gamético (Giese y Pearse, 1974). Sin embargo, la evaluación

de la calidad de los gametos requiere de metodologías que permitan no

sólo la caracterización morfológica sino su relación con la cantidad de

reservas que indiquen la condición fisiológica de los organismos.

Page 28: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

10

Varios conceptos y términos que se utilizan para evaluar la calidad

y la condición fisiológica de los organismos en la acuicultura, han sido

analizados por Racotta et al. (2003b). Estos autores clasifican los

indicadores de desempeño reproductivo en indicadores productivos

asociados a la reproducción e indicadores de la condición fisiológica de

los organismos, conocida frecuentemente como calidad (Arcos-Ortega,

2003).

Por otra parte, la reproducción está regulada por factores

endógenos, que a su vez dependen de factores exógenos (ambientales),

los cuales sincronizan y regulan los eventos reproductivos. Dentro de los

factores exógenos se incluyen marea, oleaje, fotoperíodo, disponibilidad

de alimento y temperatura, siendo estos dos últimos los más importantes

(Sastry, 1963; Loosanoff y Davis, 1963; Sastry, 1966, 1968; Giese y

Pearse, 1974; Lowe et al., 1982; Taylor y Capuzzo, 1983; Barber y Blake,

1991). Paulet (1990) señala que existe una temperatura crítica en la cual

los organismos de las poblaciones de reproducción sincrónica inician el

desove más significativo de su ciclo anual para un área determinada. La

maduración de la gónada es estimulada durante el período de aumento de

la temperatura para numerosos invertebrados marinos. Barber y

Blake (1983) observaron en Argopecten irradians, que el inicio de la

gametogénesis se asocia a un incremento de la temperatura del mar y a

un incremento en el índice gonádico. En A. maura, la temperatura

óptima de maduración en el laboratorio es de 20 °C (Enríquez-Díaz, 2000;

Rodríguez-Jaramillo et al., 2001). Sin embargo, estos autores difieren en

el tiempo para lograr la fase máxima de madurez (posvitelogénicos) ya

que los primeros la alcanzaron en 20 días, y los segundos en más 30 días.

A esta temperatura y tiempo de inducción Rodríguez-Jaramillo et al.

(2001) encontraron mayores tallas de ovocitos maduros y ausencia de

ovocitos atrésicos. En ese estudio aplicaron el concepto de la relación

núcleo/citoplasma como un indicador de calidad del ovocito. La

Page 29: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

11

temperatura óptima para la maduración reproductiva en A. maura es

diferente a la temperatura óptima para el crecimiento (29 °C) reportada

por Leyva-Valencia (1999) en juveniles de 1.3-3.3 cm de longitud de la

misma especie.

2.1 Posición taxonómica

La taxonomía del callo de hacha según Keen (1971) es:

Phyllum: Mollusca (Linnaeus, 1758)

Clase: Bivalvia

Subclase: Lamellibranchia

Orden: Anisomyaria

Familia: Pinnidae

Género: Atrina

Especie: Atrina maura (Sowerby, 1835)

2.2 Diagnosis biológica

La especie Atrina maura (Sowerby, 1835) se distribuye desde Baja

California hasta el sur de Perú (Keen, 1971).

Son organismos bentónicos que se localizan en zonas intermareales

en bahías protegidas con fondos limo-arcillosos, lodo-arenosos, arenoso-

calcáreos o areno-rocosos, en densidades de 7-9 individuos/m?. Se

pueden encontrar desde el límite inferior de la marea hasta un máximo

de diez metros, aunque se han encontrado en algunas bahías a más de

45 m de profundidad (Noguera y Gómez-Aguirre, 1972). Se encuentran

generalmente enterrados con el extremo anterior en sustratos blandos

adheridos a elementos duros. Las valvas de forma triangular están

Page 30: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

12

unidas por medio de dos músculos aductores, de los cuales el posterior

es de mayor tamaño y diámetro. En la región anterior se localiza el

músculo anterior que es más pequeño. Estos organismos presentan un

pequeño orificio bucal situado cerca de la base del pié, el cual se

comunica con un estrecho canal de forma circular, que desemboca en el

estómago. El intestino y la glándula digestiva se encuentran incluidos

dentro de la masa gonádica cuando ésta se encuentra desarrollada. El

sistema renal se localiza a un lado del músculo aductor posterior. Las

branquias están formadas por cuatro láminas largas y delgadas que se

originan cerca de los palpos labiales. El manto se encuentra rodeando al

organismo. El pie es una estructura muscular y por encima de él se

encuentra la glándula bisal que secreta una serie de fibrillas delgadas y

fuertes (el biso), con los cuales el organismo se fija al sustrato (Keen,

1971; Brusca, 1980).

El callo de hacha es filtrador omnívoro que se alimenta

principalmente de diatomeas, microflagelados, copépodos, protozoarios

y detritus. Frecuentemente, coexiste con ostiones y madreperlas. Sus

depredadores más comunes son jaibas, cangrejos, pulpos, caracoles y

algunos peces (Ruíz-Durá, 1990).

La Familia Pinnidae presenta tanto reproducción gonocórica como

hermafrodita, pudiendo existir la inversión de sexos como en Pinna rugosa

(Noguera y Gómez-Aguirre, 1972). Sin embargo, hasta el momento no se

ha reportado hermafroditismo funcional. En A. maura la reproducción es

gonocórica, cuyos cigotos resultan de la unión de gametos femeninos y

masculinos provenientes de organismos con sexos separados. La

fecundación es externa y su desarrollo larvario es planctónico con larvas

trocófora y veliger (Barnes y Ruppert, 1996). El sexo y estado de

madurez sexual de los callos de hacha se ha determinado

macroscópicamente por la coloración de la gónada. En las hembras se

presenta un color rosa cuando la gónada inicia su desarrollo, y se vuelven

Page 31: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

13

de color naranja intenso en la madurez. La gónada masculina es de color

blanquecino-cremoso.

De acuerdo con los resultados de prospecciones y evaluaciones, A.

maura forma bancos no muy densos, principalmente en bahías y lagunas

costeras en ambos litorales de Baja California Sur. En el litoral occidental,

se distribuye en las lagunas de Guerrero Negro, Ojo de Liebre y San

Ignacio, en los esteros El Dátil, el Bateque y San José de Gracia, así como

en las Bahías Magdalena, Almejas y Santa María. Por el litoral oriental, se

encuentra en la Ensenada y Bahía de La Paz, en el Canal de San Lorenzo,

en la Isla San José, Puerto Escondido, Bahía Concepción y Bahía de Santa

Inés (Baqueiro et al., 1982). Existen estudios sobre la colecta de juveniles

en el Golfo de California (Cendejas et al., 1985; Ruíz-Verdugo y Cáceres-

Martínez, 1990).

La explotación de estos moluscos se basa en bancos naturales. Esta

es de tipo artesanal y la extracción se lleva a cabo por buceo

semiautónomo. La parte del organismso que se comercializa es el músculo

aductor conocido como “callo”, que se vende fresco enhielado, en el

mercado local, regional o nacional.

Page 32: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

14

3. JUSTIFICACIÓN

Uno de los principales problemas que existen para lograr la

producción controlada de una especie, es la disponibilidad de

reproductores maduros que produzcan gametos de calidad que

garanticen la obtención de larvas con altas posibilidades de

supervivencia.

Actualmente no se dominan todos los aspectos técnicos del cultivo

de juveniles de hacha Atrina maura, incluyendo la inducción a la

maduración artificial de reproductores, los métodos de inducción al

desove, la fertilización y el cultivo larvario (Maeda-Martínez et al.,

1996). La información obtenida a partir de experimentos realizados in

situ y en el laboratorio señalan la falta de conocimientos sobre la

fisiología de la reproducción de esta especie. Para resolver este

problema es necesario conocer los diferentes factores endógenos y

exógenos que intervienen durante el desarrollo gonádico hasta la

expulsión de los gametos. La condición fisiológica y calidad de los

gametos se refleja en la talla y composición bioquímica, éstos son un

indicador predictivo del buen funcionamiento o anormalidades del

desarrollo larvario que se refleja en las tasas de sobrevivencia.

En moluscos bivalvos se puede lograr la madurez artificial fuera del

periodo reproductivo natural de campo mediante el control de la

temperatura y el alimento (Loosanoff y Davis, 1963). Para ello, es

necesario conocer el umbral de temperatura óptima en donde ocurra la

transferencia de nutrientes necesaria para el crecimiento de los ovocitos

durante la vitelogénesis (Sastry, 1968; 1970; Sastry y Blake, 1971;

Blake, 1972; Sastry, 1979).

La cantidad de reservas almacenadas en el ovocito es el resultado

final ya sea exitoso o deficiente, de la transferencia de energía del

reproductor a su progenie, es por ello que en el presente trabajo se

Page 33: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

15

propone un método de evaluación individual de gametos, que puede ser

de utilidad en la evaluación de resultados de los métodos acuícolas para

la producción de juveniles.

Por lo anterior, un primer paso es conocer el desarrollo gonádico

de ésta especie a diferentes temperarturas en condiciones

experimentales y su efecto sobre el desarrollo de los gametos, así como

sobre la última etapa (madurez) antes de la fecundación, con el fin de

comprender los factores que determinan la calidad de los ovocitos. En

este estudio se intenta definir por una parte, la temperatura a la que se

obtiene un desarrollo gonádico óptimo comparado con organismos del

medio natural y por otro, un indicador de calidad (denominado índice

lipídico) estimado por el contenido de triglicéridos de los ovocitos como

un indicador de la condición fisiológica y potencial para una

metamorfosis exitosa.

Page 34: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

16

4. HIPÓTESIS

La temperatura afecta la calidad de los ovocitos durante la

gametogénesis. La calidad de los ovocitos depende a su vez de la

cantidad de reservas lipídicas (triglicéridos), y del tamaño y la forma del

ovocito.

5. OBJETIVOS

5.1 General

Comparar las variables morfométricas y de calidad de los ovocitos

de hembras de hacha Atrina maura, inducidas a la gametogénesis en

tres temperaturas (20, 25 y 30°C), y comparar la calidad de los ovocitos

de hembras de cultivo contra hembras del medio natural inducidas al

desove en el laboratorio.

5.2 Particulares

1.-Validar el método histoquímico para la obtención del índice lipídico en

cortes de parafina con la técnica de tinción Sudán Negro B, comparando

ovocitos en cortes no tratados contra cortes tratados para la extracción

de lípidos neutros (triglicéridos) con una mezcla de cloroformo-metanol.

Cuantificar la cantidad de lípidos entre cortes tratados y no tratados por

medio de análisis digital de imágenes.

2.-Determinar las variables morfométricas área, diámetro teórico,

relación núcleo/citoplasma y de calidad (índice lipídico) de ovocitos

inducidos a la gametogénesis a tres temperaturas (20, 25 y 30 °C)

durante 15, 30 y 43 días.

Page 35: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

17

3.-Determinar la frecuencia de las categorías ovocitarias, clasificando y

cuantificando los ovocitos de hembras inducidas a la gametogénesis en

cinco categorías (ovogonias, ovocitos previtelogénicos, vitelogénicos,

posvitelogénicos y atrésicos).

4.-Determinar el efecto de la temperatura sobre las variables

morfométricas y de calidad de los ovocitos posvitelogénicos y atrésicos.

5.-Describir el proceso de desove de hembras maduradas en el

laboratorio y de las del medio natural inducidas con “shock” térmico.

5.-Clasificar los ovocitos en desove, según su morfología en tres

categorías: Inmaduros, maduros y atrésicos, y determinar su área,

diámetro teórico, índice lipídico y relación núcleo/citoplasma.

6.- Determinar la frecuencia de las categorías ovocitarias en hembras en

proceso de desove maduradas en el laboratorio y en el medio natural.

7.-Comparar las variables morfométricas y de calidad de ovocitos en

desove (reinicio de la meiosis), provenientes de hembras maduradas en

el laboratorio contra las del medio natural.

Page 36: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

18

6. METODOLOGÍA 6.1. Origen de los reproductores

Los organismos fueron producidos en el Centro de Reproducción

de Especies Marinas (CREMES) del Estado de Sonora, y fueron enviados

a la granja de acuicultura Rancho Bueno, localizada al sur de Bahía

Magdalena, en las costas del Pacífico de Baja California Sur, México. En

este sitio los organismos se cultivaron en canastas Nestier suspendidas

en un “longline” de 100 m. Después de 6 meses los organismos se

encontraron con gónadas desarrolladas, alcanzando la talla de primera

madurez a los 8.5 cm de longitud de la concha (Maeda-Martínez,

comunicación personal).

Noventa animales de 98 ± 1 mm de longitud de concha fueron

seleccionados y transportados al laboratorio de ecofisiología del Centro

de Investigaciones Biológicas del Noroeste. Los organismos fueron

inducidos al desove exponiéndolos a desecación por un período

aproximado de una hora, y posteriormente fueron colocados en un

tanque de 60 L con agua de mar a 25 °C. Durante la exposición al aire,

los organismos abrieron las valvas y de esa forma se pudo identificar el

sexo, usando como indicador la coloración de la gónada (naranja para

hembras, blanca-cremosa para machos). Bajo estas condiciones todos

los organismos desovaron.

6.2. Gametogénesis inducida en Atrina maura a 3 temperaturas

Los organismos desovados se dividieron en tres grupos de 30

organismos y fueron colocados en tres tanques de fibra de vidrio

conteniendo 700 L de agua de mar a 37‰ y a 20, 25 y 30 °C

respectivamente. Los animales se mantuvieron en un sistema

automático de flujo continuo cuya circulación del alimento fue

Page 37: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

19

controlada por un turbidímetro Hach modelo 7210C (Figura 3). Cada

tanque recibió un flujo constante de agua marina a 37‰ con alimento a

razón de 1,800 L/día. El alimento consistió en una mezcla de tres

microalgas en proporciones iguales de Isochrysis galbana, Monochrysis

lutheri y Chaetoceros gracillis, a una concentración de 130-155 céls/µL-

1. La temperatura en el tanque a 20 °C fue mantenida con un enfriador

de agua Acrytec de 1/8 HP, mientras que la del tanque a 25°C se reguló

con el sistema de aire acondicionado del laboratorio. La temperatura del

tanque de 30 °C se mantuvo con 6 calentadores de inmersión con

termostato integrado Ebo-jager de 200 Watts. Diariamente, las heces

fueron extraídas por sifón.

Figura 3. Sistema empleado para la inducción a la gametogénesis de Atrina maura, a 20, 25 y 30 °C durante 43 días.

Page 38: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

20

6.3. Análisis histológico e histoquímico Al inicio del experimento (tiempo 0) se tomaron 6 organismos

para determinar la condición de los reproductores después del desove.

Para determinar la influencia de cada temperatura en el proceso de

gametogénesis se realizó un muestreo aleatorio de 6 especimenes de

cada temperatura cada quince días, tomando en total 54 organismos. A

cada organismo se le midió el peso total, longitud, peso húmedo de los

tejidos y se identificó el sexo por la coloración de la gónada. El resto de la

gónada y el cuerpo de los organismos se fijó en la solución de Davidson

(Shaw y Battle, 1957 citado en Howard y Smith, 1983). La composición

de los fijadores se presenta en el (Anexo 1). Posteriormente se disecaron

secciones transversales debajo del riñón de toda la región media de los

organismos. Cada sección fue colocada en casetes para deshidratar los

tejidos en una serie de alcoholes de menor a mayor concentración (70,

80, 90, y 100%). Después los tejidos fueron aclarados en xileno e

incluidos en Paraplast X-Tra con punto de fusión de 54-56 °C (Anexo 2).

De las inclusiones en parafina se obtuvieron 2 cortes de cada gónada a 3

µm de grosor con un micrótomo de rotación Leica RM 2125. Para el

estudio histológico e histoquímico se emplearon las técnicas de tinción

Hematoxilina-eosina (H-E) y Sudán Negro B (SNB).

Los cortes teñidos con H-E (Sheehan y Hrapchak, 1973;

Humason, 1979) (Anexo 3) se emplearon para la clasificación de los

ovocitos en cinco categorías ovocitarias de desarrollo (ver Sección 6.4).

6.3.1 Validación del método histoquímico Sudán Negro B. En el presente trabajo se realizó la estandarización y validación de

la técnica de tinción SNB (Bayliss, 1984; Pearse, 1985; Spicer y Schulte,

1992) para la detección y cuantificación de lípidos insolubles en cortes

de parafina. Específicamente, esta técnica tiñe diferencialmente

Page 39: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

21

triglicéridos y fosfolípidos (Anexo 4). La especificidad de la reacción se

verificó comparando cortes teñidos con SNB no tratados contra otros

expuestos a una mezcla de metanol-cloroformo (v/v) durante 24 horas a

60 °C (Bancroft y Stevens, 1990). Para ello se empleó la gónada de una

hembra inducida a la gametogénesis durante 30 días a la temperatura

de 25 °C. El grosor de los cortes (3 µm) y los tiempos de tinción con la

técnica SNB (15 min) fueron estandarizados para que las preparaciones

del tejido gonádico fueran comparables.

6.4. Análisis cualitativos y cuantitativos

Los cortes de tejidos teñidos con las técnicas de tinción descritas

fueron analizados con un sistema de análisis de Imágenes Image Pro

Plus (versión 4.5.19), integrado por un microscopio compuesto marca

Olympus BX41 y una cámara digital CoolSNAP-Pro conectada a una

computadora Pentium III. Las imágenes de los tejidos fueron

digitalizadas con el objetivo de 40X.

De las preparaciones histológicas teñidas con H-E, los ovocitos

fueron clasificados en cinco categorías ovocitarias de acuerdo al estadio

de desarrollo gametogénico a los diferentes tiempos de muestreo y

temperaturas experimentales, considerando la descripción morfológica

de Rodríguez-Jaramillo et al. (2001): ovogonias, ovocitos

previtelogénicos, vitelogénicos, posvitelogénicos y atrésicos. Los

ovocitos posvitelogénicos fueron reclasificados en inmaduros y normales

para el análisis particular de sus variables morfométricas y de calidad,

con el objeto de evaluar solo los ovocitos que potencialmente pueden

ser desovados ya que han llegado al final de la vitelogénesis y se

encuentran libres en el lumen de los acinos. Esta clasificación está

basada en la morfología que presentan, los ovocitos inmaduros son

piriformes, y los normales son poligonales y redondos. Estos criterios

Page 40: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

22

morfológicos serán retomados en la sección 6.5 para el análisis de

ovocitos en proceso de desove.

La frecuencia de estas categorías ovocitarias fue estimada en tres

regiones del ovario, contando el número de ovocitos presentes en un

área predeterminada de 0.3 mm? (Briarty, 1975). El área total del

ovocito y las áreas del nucleoplasma y del ovoplasma fueron

determinados en las tres regiones de cada ovario, usando el analizador

de imágenes Image Pro Plus. Solamente los ovocitos que mostraron

nucleoplasma, cortados aproximadamente en el plano ecuatorial fueron

considerados en el análisis. Las mediciones se realizaron de la siguiente

forma:

1.- La calibración del sistema de análisis de imágenes se hizo mediante

una reglilla micrométrica para el objetivo 40x.

2.- De las 3 imágenes de cada gónada se seleccionaron 20 ovocitos con

nucleoplasma bien definido, delimitando el perímetro de cada ovocito y

de su nucleoplasma de forma manual con el cursor. El programa calculó

automáticamente el área del ovocito y del nucleoplasma. Una vez que el

ovocito quedó definido, se utilizó la herramienta del programa que

identifica sólo los colores azul oscuro y negro y cuantifica mediante la

suma de píxeles del área ocupada por estos tonos de color,

correspondientes a los triglicéridos. Las áreas de cada ovocito ocupadas

por píxeles azul oscuro y negro quedaron registradas en una hoja de

cálculo. En la validación del método por extracción de lípidos se

evaluaron 30 ovocitos tratados y 30 ovocitos control sin extracción de

lípidos.

Page 41: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

23

6.4.1. Índice lipídico

El índice lipídico (IL) se calculó dividiendo la sumatoria de las áreas

ocupadas por los gránulos lipídicos (triglicéridos) entre la superficie

total del ovoplasma, expresada en porcentaje:

IL= Sumatoria del área de cobertura de lípidos X 100

Área del ovoplasma

6.4.2. Diámetro teórico Con los resultados obtenidos del área de los ovocitos (AO) se

calculó el diámetro teórico (DT) que propone Saout et al. (1999)

estandarizando las medidas con base a la fórmula de la circunferencia,

que se deduce de la siguiente forma:

Dt = √4A/π 6.4.3. Relación núcleo/citoplasma N/C = Área del núcleo / Área de citoplasma

6.4.4. Análisis estadísticos Para evaluar y diferenciar el efecto de la temperatura (20, 25 y

30°C) y el efecto del tiempo de inducción sobre la gametogénesis (15,

30 y 43 días) se realizó un análisis de varianza de una vía (ANOVA) para

cada uno de dichos factores, considerando como variables dependientes

las morfometricas: área de los ovocitos (AO), diámetro teórico (DT),

relación núcleo citoplasma (N/C) y la variable de calidad: índice lipídico

(IL). Los valores en porcentajes fueron transformados a arco-seno

(arco-senovP) con el fin de normalizar los datos y realizar los análisis

estadísticos (Zar, 1993). Los valores fueron retransformados y se

presentan como la media ± el error estándar.

Page 42: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

24

Cuando se obtuvieron diferencias significativas (P < 0.05), se

realizó una prueba de comparación de medias de Tukey (Zar, 1993).

Los análisis estadísticos fueron realizados al 95% de confianza,

mediante el software Statistica versión 5.5, utilizando el modelo lineal

general (GLM).

6.5. Calidad ovocitaria comparativa de reproductores de Atrina maura maduradas en el medio natural y en el laboratorio, en el momento del desove.

6.5.1. Hembras del medio natural

Un lote de 20 organismos de 17 ± 1.9 cm de longitud fueron

colectados en la Laguna San Ignacio (El Cardón) y transportados en una

hielera sin agua al laboratorio. Después fueron colocados en un tanque

de fibra de vidrio de 1,200 L, a temperatura de 21°C e inducidos al

desove por shock térmico en un tanque de 70 L, bajando la

temperatura de 21°C a 18°C durante 30 minutos, y posteriormente

incrementada a 26°C. Una vez que los organismos iniciaron la expulsión

de los gametos, se seleccionaron tres hembras que fueron retiradas del

tanque y fueron fijadas en solución de Davidson durante 48 h.

6.5.2. Hembras de laboratorio A los 43 días de iniciado el experimento, seis hembras de cada

tratamiento de temperatura se colocaron en un recipiente de 70 L a

21°C y se indujeron al desove siguiendo el mismo tratamiento de shock

térmico. Tres de los seis ejemplares provenientes del tratamiento a

30°C desovaron y fueron los que se analizaron. Estos tres ejemplares se

fijaron en la solución de Davidson durante 48 h y posteriormente se

trataron como se indica enseguida.

Page 43: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

25

6.5.3 Histología e histoquímica de las hembras en desove

Las hembras fijadas fueron disecadas en 10 secciones

transversales desde el umbo hasta el extremo posterior del músculo

aductor, sin separar el tejido gonadal de los tejidos que lo rodean, con

el objeto de no modificar la anatomía de la gónada y los órganos con los

que se encuentra estrechamente relacionada. Cada sección fue

procesada histológicamente y los cortes fueron teñidos con H-E y SNB

como se indicó en la sección 6.3.

Se evaluaron 100 ovocitos de cada una de las 6 hembras (300 de

laboratorio y 300 del medio natural) a 400 aumentos. Los ovocitos

medidos fueron sólo aquellos que se encontraron en la fase de reinicio

de la meiosis con la vesícula germinal rota (VGR), lo cual indicó que se

encontraba en desove (Lora-Vilchis et al., 2003). El área de los ovocitos,

diámetro teórico y el área ocupada por triglicéridos (IL) fue calculada de

la misma forma descrita en la sección 6.4.

Para la comparación de los ovocitos en proceso de desove de

diferente origen, las categorías ovocitarias fueron diferentes a las

mencionadas en la sección 6.4, ya que se tomó la clasificación de

Dorange et al. (1989) por tratarse únicamente de ovocitos en reinicio de

la meiosis. Esta clasificación está basada en la morfología de los

ovocitos, representada por tres categorías: Inmaduros (ovocitos

piriformes), normales (ovocitos poligonales y redondos) y atrésicos

(ovocitos de forma irregular con prolongaciones citoplasmáticas). Estas

categorías ovocitarias se expresaron en frecuencias. El IL fue calculado

como se indica en la sección 6.4.1.

Page 44: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

26

6.5.4. Análisis estadístico de la calidad ovocitaria de hembras en desove Para poder determinar diferencias en cuanto a la calidad de los

ovocitos provenientes de hembras maduradas en medio natural contra

aquellas maduradas en laboratorio, se realizó un ANOVA de una sola vía

en donde la variable independiente fue el origen de las hembras (medio

natural contra laboratorio) y las variables dependientes fueron el área

de los ovocitos (AO), diámetro teórico (DT) y el índice lipidico (IL).

Posteriormente se realizó una prueba de comparación de medias de

Tukey.

Los valores en porcentajes fueron transformados a arco-seno

(arco-senovP) con el fin de normalizar los datos y realizar los análisis

estadísticos (Zar, 1993).

Los valores de las variables se presentan expresadas como la

media ± el error estándar. Un valor de P < 0.05 fue considerado como

estadísticamente significativo. Los análisis estadísticos se realizaron

usando el modelo lineal general (GLM) del software Statistica versión

5.5.

Page 45: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

27

7. RESULTADOS 7.1 Validación del método histoquímico

7.1.1 Tinción de triglicéridos y fosfolípidos con la técnica Sudán Negro B y cuantificación por análisis de imágenes.

En este trabajo se demostró que la técnica SNB empleada para el

cálculo del índice lipídico, permitió distinguir entre la concentración

relativa de triglicéridos y la de fosfolípidos sin afectar las variables

morfométricas de los ovocitos. Para ello, se comparó el área del ovocito

(AO), diámetro teórico (DT), índice lipídico de triglicéridos (IL), y la

relación núcleo citoplasma (N/C) de cortes de una gónada de A. maura

inducida a la gametogénesis a 25°C durante 30 días, tratados para

extracción de triglicéridos con una mezcla de cloroformo-metanol a 60°C

(Figura 4a), contra las de cortes no tratados (Figura 4b). Los resultados

(Tabla 1) muestran que el tratamiento de extracción de triglicéridos

(Bancroft y Stevens, 1990), no afectó a las variables AO, DT, pero

redujo significativamente el IL (P < 0.05), de 39.3 a 3.1 %. Según esta

técnica los triglicéridos son teñidos de color azul oscuro y negro. El

mismo análisis aplicado a estos cortes pero seleccionando con el

analizador de imágenes únicamente los tonos de gris correspondientes a

la fracción fosfolipídica (lípidos polares), se observó que el tratamiento

produjo un incremento en el valor relativo de esta fracción, de 43.24%

en el corte no tratado, a 65.25% en el corte tratado (Tabla 1), siendo

este incremento significativo al P < 0.05. Este resultado se debe al

manejo de valores relativos (%). Con estos resultados se concluye que

la técnica empleada en este trabajo es adecuada para cuantificar

relativamente los triglicéridos, y en base a ellos calcular el índice

lipídico.

Page 46: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

28

Tabla 1. Efecto del tratamiento de extracción de lípidos mediante cloroformo-metanol sobre las variables área del ovocito, diámetro teórico, índice lipídico (triglicéridos), índice de lípidos polares (fosfolípidos) y la relación núcleo/citoplasma de una gónada de Atrina maura inducida a la gametogénesis a 25°C durante 30 días. Los datos son la media ± el error estándar. n = 30.

Variable

Muestra no tratada

Muestra tratada

ANOVA P

Área del ovocito (µm2) 1,581 ±68a 1,454 ± 3 a 0.106 Diámetro teórico (µm) 44.7 ± 0.9a 42.9 ± 0.4 a 0.109 Índice lipídico (triglicéridos) (%) 39.3 ± 0.9a 3.1 ± 0.2b 0.000 Índice de lípidos polares (%) 43.2 ± 0.9a 65.2 ± 1.3b 0.000 Relación N/C 0.47 ± 0.01a 0.41 ± 0.01b 0.029 Valores con diferente superíndice en la misma fila son significantemente diferentes Figura 4. Efecto del tratamiento de extracción de lípidos por medio de cloroformo-metanol en una gónada femenina de Atrina maura inducida a la gametogénesis a 25°C durante 30 días. A) Corte tratado con cloroformo-metanol. Fosfolípidos (f) y B) Corte control sin tratamiento. Triglicéridos (t). Tinción SNB. 600X. Barra = 25 µm.

Page 47: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

29

7.2. Efecto de la temperatura y el tiempo sobre la inducción a la gametogénesis en el hacha Atrina maura.

El análisis de los cortes de parafina teñidos con SNB, reveló la

localización de los lípidos neutros en forma de triglicéridos, que se

tiñeron de azul oscuro y negro, y los fosfolípidos de color gris (Figura 5).

Las imágenes de las muestras teñidas con ésta técnica permitieron

realizar los análisis cuantitativos, ya que se observó claramente la forma

de los ovocitos y su núcleo. En las Tablas 2 a 5 se presentan los

resultados del área del ovocito (AO), diámetro teórico (DT), índice

lipídico (IL) y la relación núcleo/citoplasma (N/C) con relación a la

temperatura y al tiempo de inducción a la gametogénesis

7.2.1. Área de ovocitos En la Figura 6 se muestra la evolución del (AO) de A. maura a 20,

25 y 30°C. Aquí se puede observar que el tamaño del ovocito tiene un

rápido crecimiento a 25 y 30°C alcanzando más de 1000 µm2 a los

primeros 15 días. Posteriormente, a 30°C los ovocitos continuaron su

crecimiento hasta alcanzar más de 1,500 µm2 al mes de iniciado el

experimento, para después decrecer hasta las 1,173 µm2 a los 43 días.

Sin embargo, a 25°C el AO ya no varió durante el resto del experimento

después de los 15 días. El crecimiento en AO a 20°C a los 15 días fue

inicialmente más lento en contraste con los otros dos tratamientos. Sin

embargo, los ovocitos siguieron creciendo hasta alcanzar su máxima

talla a los 30 y 43 días. En la Tabla 2, se muestran los promedios de AO

a las tres temperaturas y fechas de muestreo. La prueba de Tukey

confirmó el lento crecimiento de los ovocitos a 20°C durante los

primeros 15 días con respecto al resto de las temperaturas de inducción

a la gametogénesis, e indicó diferencias significativas entre el AO a las

tres temperaturas de maduración a los 30 días.

Page 48: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

30

Figura 5. Micrografías de cortes histológicos de las gónadas de Atrina maura inducidas a la gametogénesis durante 43 días a 20°C (A), 25°C (B), y 30°C (C). Ovocitos vitelogénicos (ov), ovocitos posvitelogénicos normales (opn), ovocitos posvitelogénicos inmaduros (opi), ovocitos atrésicos (ova), núcleo (n), nucléolos (nc), triglicéridos (t). Tinción SNB. 400 X. Barra = 50 µm.

Page 49: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

31

Tabla 2 Área de los ovocitos (µm?) de Atrina maura inducidas a la gametogénesis a tres temperaturas durante 15, 30 y 43 días. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120. Temperatura (°C) 15 días 30 días 43 días

20 457.9 ± 57.9a 1,265.2 ± 89.9a 1,195.3 ± 52.8a 25 1,008.9 ± 99.4 b 999.0 ± 67.1b 958.2 ± 44.7b 30 1,039.5 ± 76.1 b 1,577.4 ± 56.4c 1,173.8 ± 49.9a

Tabla 3 Diámetro teórico (µm) de los ovocitos de Atrina maura inducidas a la gametogénesis a tres temperaturas durante 15, 30 y 43 días. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120. Temperatura (°C) 15 días 30 días 43 días

20 22.3 ± 1.4a 38.7 ± 1.6a 37.4 ± 0.9a 25 34.8 ± 1.9b 34.3 ± 1.5b 33.1 ± 1.0b 30 35.0 ± 1.5b 44.5 ± 0.7c 37.4 ± 0.8a

Tabla 4 Índice lipídico de los ovocitos de Atrina maura inducidas a la gametogénesis a tres temperaturas durante 15, 30 y 43 días. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120. Temperatura (°C) 15 días 30 días 43 días

20 47.1 ± 1.7a 46.4 ± 1.0a 41.8 ± 0.8a 25 36.4 ± 0.7b 40.3 ± 1.6b 41.0 ± 1.0a 30 39.0 ± 1.5b 43.1 ± 0.6a 29.9 ± 0.8b

Tabla 5 Relación núcleo/citoplasma de los ovocitos de Atrina maura inducidas a la gametogénesis a tres temperaturas durante 15, 30 y 43 días. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120. Temperatura (°C) 15 días 30 días 43 días

20 0.28 ± 0.008 a 0.27 ± 0.006a 0.29 ± 0.005a 25 0.29 ± 0.010 a 0.27 ± 0.007a 0.30 ± 0.005a 30 0.28 ± 0.009 a 0.33 ± 0.008b 0.32 ± 0.004b

Valores con diferente superíndice en la misma columna son significativamente diferentes. P < 0.05.

Page 50: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

32

0

500

1000

1500

2000

0 15 30 43

Días

Áre

a de

l ovo

cito

(µm

²)

20°C25°C30°C

Figura 6. Área de los ovocitos (µm²) de Atrina maura durante 43 días de inducción a la gametogénesis a tres temperaturas en el laboratorio. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120.

0

10

20

30

40

50

0 15 30 43

Días

Diá

met

ro te

óric

o (µ

m)

20°C25°C30°C

Figura 7. Diámetro teórico (µm) de los ovocitos de Atrina maura, durante 43 días de inducción a la gametogénesis a tres temperaturas en el laboratorio. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120.

Page 51: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

33

Finalmente, se observa que el AO fue estadísticamente similar a 20 y

30°C a los 43 días de tratamiento.

7.2.2. Diámetro teórico

Los resultados del cálculo del diámetro teórico (DT) de los ovocitos

a diferentes temperaturas y tiempos de inducción, se muestran en la

Figura 7 y en la Tabla 3. El DT siguió el mismo patrón que el área del

ovocito, en donde se observa un crecimiento inicial más lento a 20°C

que en las dos temperaturas más altas. A los 30 días de iniciada la

maduración, el DT fue diferente en los tres tratamientos y finalmente

fue mayor y estadísticamente diferente a 20 y 30°C que a 25°C.

7.2.3. Índice lipídico

El índice lipídico (IL) en ovocitos de A. maura inducidos a la

gametogénesis a tres temperaturas, muestra un patrón diferente (Figura

8; Tabla 4). Aquí se puede observar que a 20°C el IL fue el más alto,

ocupando los triglicéridos entre el 41.8 y el 47.1 % del área del

ovoplasma durante todo el experimento. El IL a 25 °C fue ligeramente

menor que a 20°C y tuvo una tendencia al incremento a lo largo del

proceso de maduración. A 30°C el IL fue más elevado que a 25°C a los

15 y 30 días, sin embargo el IL decreció a 29.9 % a los 43 días.

Page 52: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

34

2530354045505560

15 30 43

Días

Indi

ce li

pídi

co (%

)

20°C25°C30°C

Figura 8. Índice lipídico de ovocitos de Atrina maura durante 43 días de inducción a la gametogénesis a tres temperaturas en el laboratorio. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 15 30 43

Días

Rel

ació

n nú

cleo

/cito

plas

ma

20°C25°C30°C

Figura 9. Relación núcleo/citoplasma de los ovocitos de Atrina maura durante 43 días de inducción a la gametogénesis a tres temperaturas en el laboratorio. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120.

Page 53: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

35

7.2.4. Relación núcleo/citoplasma

Los resultados del cálculo de la relación núcleo citoplasma (N/C)

se presentan en la Tabla 5 y en la Figura 9. Como se puede apreciar,

este índice no sirvió como indicador de calidad tal y como se esperaba,

ya que en lugar de ir disminuyendo conforme ocurrió el crecimiento de

los ovocitos, éste aumentó. Posiblemente esto se debió a que el núcleo

creció conforme aumentó el tamaño del ovoplasma, lo cual es contrario

a lo establecido en la literatura (Raven, 1966). No obstante, la relación

N/C fue útil para distinguir entre ovocitos posvitelogénicos atrésicos de

los posvitelogénicos inmaduros, en donde la relación N/C fue

significativamente (P = 0.036) mayor en los primeros (Tabla 8). Estos

resultados coinciden con lo encontrado por Rodríguez-Jaramillo et al.

(2001) en la misma especie.

7.2.5. Análisis integral

7.2.5.1. Temperatura El análisis integral del efecto de la temperatura sobre las variables

morfométricas y de calidad, se muestra en la Tabla 6. El análisis de

varianza realizado indico un efecto significativo (P<0.05) de la

temperatura sobre las variables morfométricas (AO, DT y N/C) y de

calidad (IL). El AO se incrementó con la temperatura al igual que el DT,

siendo estadísticamente diferente a 20°C que a 25 y 30°C. Sin

embargo, los indicadores de calidad ovocitaria IL y N/C mostraron

valores antagónicos a las temperaturas 20 y 25°C.

Page 54: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

36

Tabla 6. Efecto de la temperatura sobre las variables morfométricas y de calidad ovocitaria de Atrina maura. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120.

Variable Temperatura (°C) ANOVA

20 25 30 P

Área ovocito (µm2 ) 959 ± 58a 1,076 ± 37a b 1,134 ± 46b 0.034 Diámetro teórico (µm) 32.6 ± 1.1a 36.1 ± 0.7 b 36.8 ± 0.8b 0.003 Índice lipídico 44.7 ± 0.8a 41.4 ± 1.0 b 40.3 ± 0.6 b 0.000 Relación N/C 0.29 ± 0.004a 0.30 ± 0.005a 0.32 ± 0.005b 0.000 Valores con diferente superíndice en la misma fila son significantemente diferentes.

7.2.5.2 Tiempo

El análisis integral de estos indicadores a los tres días de muestreo

independientemente de la temperatura, muestra que hubo un efecto

significativo (P<0.05) del tiempo de inducción sobre el AO, DT y N/C

excepto para el IL (P = 0.26) como se observa en la Tabla 7.

Tabla 7. Efecto del tiempo de inducción a la gametogénesis sobre las variables morfométricas y de calidad ovocitaria de Atrina maura, independientemente de la temperatura. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120.

Variable Tiempo (días) ANOVA

15 30 43 P

Área ovocito (µm2 ) 801 ± 51a 1,280 ± 47b 1,042 ± 42c 0.000 Diámetro teórico(µm) 29.9 ± 1.1a 39.2 ± 0.9 b 35.4 ± 0.8 c 0.000 Índice lipídico (%) 42.2 ± 0.5 41.7 ± 1.0 43.3 ± 0.7 NS Relación N/C 0.304 ± 0.003a 0.286 ± 0.005a 0.296 ± 0.005 b 0.000

Valores con diferente superíndice en la misma fila son significantemente diferentes.

Page 55: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

37

7.3. Frecuencia de las categorías ovocitarias.

La frecuencia de las categorías ovocitarias obtenidas a tres

temperaturas y a los tres tiempos de muestreo durante la inducción a la

gametogénesis, se muestra en la Figura 10. Aquí se puede observar

que a los 15 días de iniciado el experimento, cerca del 60% de los

ovocitos de los tratamientos 25 y 30°C, ya se encontraban

posvitelogénicos, lo cual contrastó con lo observado a 20°C, en donde

no se encontraron ovocitos en esa categoría (Figura 10a). A 25 y 30°C,

se encontró un porcentaje muy bajo (<10%) de ovogonias, ovocitos

previtelogénicos y vitelogénicos, y un porcentaje más elevado (aprox.

20%) de ovocitos atrésicos (en degeneración). A 20°C, los ovocitos

vitelogénicos se presentaron con mayor frecuencia, seguidos por un

20% de previtelogénicos y 18% de ovogonias, lo cual indica un

desarrollo gametogénico gradual pero mas lento que a temperaturas

superiores. El porcentaje de ovocitos posvitelogénicos y atrésicos fue

nulo.

A los 30 días (Figura 10b), los ovocitos de A. maura inducidos a la

gametogénesis a 20°C, mostraron un avance hacia la madurez, con un

60% de ovocitos posvitelogénicos y solamente >20% en las tres fases

iniciales de desarrollo. A esta temperatura, la frecuencia de ovocitos

atrésicos fue menor a 5%. A las temperaturas más elevadas, la

frecuencia de ovogonias, previtelogénicos y vitelogénicos fue menor al

10%, y fue notoria la dominancia de ovocitos maduros que superaban el

70% de la frecuencia. A esas temperaturas, se mantuvo la presencia de

ovocitos atrésicos cerca del 20%.

Page 56: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

38

0

20

40

60

80

100

20 25 30

Temperatura (°C)

Fre

cuen

cia

(%)

Ovogonias

PrevitelogénicosVitelogénicosPosvitelogénicosAtresias

a

0

20

40

60

80

100

20 25 30

Temperatura (°C)

Fre

cuen

cia

(%)

OvogoniasPrevitelogénicosVitelogénicos

PosvitelogénicosAtresias

b

0

20

40

60

80

100

20 25 30

Temperatura (°C)

Fre

cuen

cia

(%)

OvogoniasPrevitelogénicosVitelogénicos

PosvitelogénicosAtresias

c

Figura 10. Frecuencia de las categorías ovocitarias presentes en las gónadas de Atrina maura inducidas a la gametogénesis a 20, 25 y 30°C, durante 15 (a), 30 (b) y 43(c) días.

Page 57: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

39

A los 43 días (Figura 10c), el 80% de los ovocitos a 20 °C fueron

posvitelogénicos, y las frecuencias de las ovogonias y ovocitos

previtelogénicos cayeron a 5 y 10% respectivamente. A 25 °C, el patrón

de frecuencias cambió notablemente como producto de un desove

espontáneo ocurrido en el día 34. Aquí la frecuencia de ovogonias,

ovocitos previtelogénicos y vitelogénicos fue de 20, 15 y 1%

respectivamente, pero también se encontró un elevado porcentaje de

posvitelogénicos (40%) y atrésicos (30%), indicando que los desoves

fueron parciales. Las frecuencias de ovocitos a 30°C se mantuvieron sin

cambio con respecto al día 30. Es importante señalar la presencia de

ovogonias durante los 43 días de inducción en todos los tratamientos de

temperatura probados.

7.4. Análisis morfométrico y de calidad de ovocitos posvitelogénicos y atrésicos inducidos a la gametogénesis a tres temperaturas y tres fechas de muestreo.

Los resultados de AO, DT, IL y N/C de ovocitos posvitelogénicos

reclasificados según su forma en dos categorías ovocitarias (inmaduros

y normales) y atrésicos, independientemente del tratamiento de

temperatura y de las fechas de muestreo, se presentan en la Tabla 8.

AO y DT fueron significativamente mayores en ovocitos normales que en

el resto de las categorías ovocitarias. Con respecto al IL no hubo

diferencias significativas entre ovocitos posvitelogénicos inmaduros y

normales. Sin embargo, si existieron diferencias entre estos y los

ovocitos atrésicos. La relación N/C fue significativamente diferente entre

inmaduros y atrésicos, pero la N/C de ovocitos normales fue similar a

los inmaduros y a los atrésicos a una P = 0.036.

Page 58: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

40

Tabla 8. Variables morfométricas y de calidad de ovocitos posvitelogénicos (inmaduros y normales) y atrésicos. Los valores son la media ± el error estándar. n = 120.

Variable Categoría ovocitaria ANOVA

Inmaduros Normales Atrésicos P

Área ovocito (µm2) 924 ± 28a 1,792 ± 42b 1,404 ± 92c 0.000 Diám. teórico (µm) 32.8 ± 0.6a 47.6 ± 0.6b 41.8 ± 1.3c 0.000 Índice lipídico (%) 43.0 ± 0.5a 43.2 ± 1.1a 33.1 ± 0.9 b 0.000 Relación N/C 0.30 ± 0.003a 0.31 ± 0.006a b 0.32 ± 0.009b 0.036 Valores con diferente superíndice en la misma fila son significantemente diferentes.

7.4.1. Efecto de la temperatura sobre el diámetro teórico de los ovocitos posvitelogénicos

En la Figura 11 se muestra el efecto de la temperatura sobre el

diámetro teórico de los ovocitos posvitelogénicos. Aquí se puede

observar que el tamaño de los ovocitos posvitelogénicos del tratamiento

a 20°C fue superior al de los dos tratamientos restantes (P> 0.05).

7.4.2. Efecto de la temperatura sobre el índice lipídico de los ovocitos posvitelogénicos

El IL de ovocitos posvitelogénicos a las distintas temperaturas y

tiempos de inducción a la gametogénesis (Figura 12) fue superior a

20°C durante los 30 primeros días de inducción, e inferior a 30°C

durante durante todo el experimento. Sin embargo, el IL fue superior a

25°C que a las dos temperaturas restantes al final del experimento (43

días), posiblemente como resultado de una mayor frecuencia de

ovocitos posvitelogénicos y atrésicos con respecto a los vitelogénicos a

esa temperatura y tiempo de inducción, como puede observarse en la

Figura 10c.

Page 59: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

41

41424344454647484950

20°C 25°C 30°CTemperatura

Diá

met

ro te

óric

o (µ

m)

Figura 11. Diámetro teórico de los ovocitos posvitelogénicos a las tres temperaturas de inducción a la gametogénesis, independientemente de la fecha de muestreo.

0

10

20

30

40

50

60

15 30 43

Días

Indi

ce li

pídi

co (

%)

20°C25°C30°C

Figura 12. Índice lipídico de los ovocitos posvitelogénicos de Atrina maura inducidos a la gametogénesis a tres temperaturas a los 15, 30 y 43 días de muestreo .

Page 60: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

42

7.5. Análisis comparativo de los ovocitos en proceso de desove, provenientes de hembras maduradas en el laboratorio y en el medio natural.

7.5.1. Descripción del desove

Macroscópicamente la gónada cubre la región visceral, desde el

músculo aductor posterior hasta la parte posterior del estómago. El

análisis microscópico reveló una cápsula formada por tres capas de

tejido que la rodean en su región más externa. La primera capa esta

constituida por epitelio cúbico soportado por una membrana basal,

seguida por una delgada capa de tejido conjuntivo que se entrelaza con

tejido muscular liso. Este tejido perigonadal da soporte a los folículos o

acinos. El extremo interior la gónada se encontró en estrecha relación

con la glándula digestiva y el estómago unida por tejido conjuntivo.

Durante el desove, la gónada conserva un arreglo glandular conformado

por acinos rodeados de tejido conjuntivo interfolicular. Dentro de los

acinos se observan escasos ovocitos previtelogénicos y vitelogénicos de

forma pedunculada, abundantes ovocitos posvitelogénicos con un

ovoplasma muy desarrollado, algunos se encuentran libres de la pared

del acino (Figura 13). Estos ovocitos presentan la vesícula germinal rota

(VGR) como indicio del reinicio de la meiosis (profase-diploteno). La

VGR, ocurre de forma sincrónica entre ovocitos posvitelogénicos y

atrésicos, mas no en ovocitos vitelogénicos. En la Figura 13 se observan

además células auxiliares libres de la pared del acino, y ovocitos

vitelogénicos unidos aún a las paredes de éste. Los ovocitos con la VGR

presentaron las siguientes características morfológicas: ovocito

normales de forma poligonal a redonda, ovocitos inmaduros piriformes

adheridos a la pared del acino, y ovocitos atrésicos de escaso

ovoplasma, con invaginaciones y prolongaciones de la membrana

vitelina.

Page 61: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

43

Figura 13. Micrografía de gónada de Atrina maura en proceso de desove madurada a 30°C durante 43 días. Se aprecian ovocitos con la vesícula germinal rota (VGR), células auxiliares (ca) libres de la pared del acino y ovocitos vitelogénicos (ov). 100X. Barra =200 µm. Tinción Hematoxilina-eosina.

7.5.2. Análisis morfométrico y de calidad de ovocitos provenientes de hembras maduradas en el laboratorio vs. medio natural

En la Tabla 9 se muestra el DT y el IL de ovocitos en proceso de

desove, provenientes de reproductores madurados en el laboratorio y en

el medio natural. Aquí se puede apreciar que a pesar de que el tamaño

del ovocito de la hembra del medio natural fue significativamente

mayor, el IL fue muy superior en los ovocitos de laboratorio. Esto indica

que el tamaño del ovocito no necesariamente es indicador de la cantidad

de reservas energéticas disponibles en el ovocito, y se demuestra la

utilidad del índice de calidad desarrollado.

Page 62: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

44

Tabla 9. Diámetro teórico e índice lipídico de ovocitos en proceso de desove, madurados en el laboratorio y en el medio natural, independientemente de su categoría ovocitaria. Los valores son la media ± el error estándar. n=300.

Variable Medio natural Laboratorio ANOVA

P

Diámetro teórico (µm2) 47.68 ± 0.7a 44.92 ± 0.8b 0.02 Índice lipídico (%) 17.38 ± 0.91a 34.58 ± 0.58b 0.0001 Valores con diferente superíndice en la misma fila son significantemente diferentes.

En la Figura 14 se muestran las preparaciones de ovocitos en

proceso de desove madurados en el laboratorio y en el medio natural.

Aquí se puede apreciar una gran similitud en cuanto a la morfología de

los ovocitos, y en la distribución de los mismos en lo acinos. También se

observa en ambas imágenes la ocurrencia de ovocitos en las tres

morfologías: inmaduros, normales y atrésicos.

7.5.3. Frecuencia de las categorías ovocitarias en hembras en proceso de desove maduradas en el laboratorio y en el medio natural

Los ovocitos que presentaron la VGR, fueron reclasificados por su

forma en tres categorías de acuerdo a Dorange et al. (1989) en

inmaduros, normales y atrésicos (Figura 15). Aquí se puede apreciar

que los ovocitos normales tuvieron una mayor frecuencia que los

pertenecientes a las dos categorías restantes independientemente de su

origen, y que en las hembras maduradas en el laboratorio, el 65 % de

los ovocitos fueron normales contra el 45 % en la hembra madurada en

el medio natural. En esta figura, también se aprecia un mayor

porcentaje (32%) de ovocitos atrésicos en las hembras del medio

natural que en las del laboratorio (10%)

Page 63: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

45

Figura 14. Micrografía de ovocitos de gónada de Atrina maura en proceso de desove. A) Hembra madurada en el laboratorio a 30°C durante 43 días. B) Hembra del medio natural. Ovocitos normales (on), ovocitos inmaduros (oi), ovocitos atrésicos (oa). 400X. Barra = 50 µm. Tinción Sudán Negro B.

Page 64: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

46

0

20

40

60

80

100F

recu

enci

a (%

)

Laboratorio Medio natural

InmadurosNormalesAtrésicos

Figura 15. Frecuencia de las categorías ovocitarias de Atrina maura en proceso de desove, maduradas en el laboratorio a 30°C durante 43 días y en el medio natural.

7.5.4. Índice lipídico por categoría ovocitaria en ovocitos

en desove

En la Tabla 10 se observa un IL similar en ovocitos inmaduros y

normales, y superior al obtenido en ovocitos atrésicos,

independientemente del origen de los reproductores. Sin embargo,

cuando el IL se calculó por categoría ovocitaria y tomando en cuenta el

origen de los reproductores (Tabla 11), se observó que el índice fue

significativamente mayor en las hembras de laboratorio que en las

maduradas en el medio natural en las tres categorías ovocitarias (P >

0.00). En la Tabla 11 también se puede observar que el IL de ovocitos

atrésicos del laboratorio, fue significativamente menor que el de

ovocitos inmaduros y normales del mismo origen. El coeficiente de

heterogeneidad (varianza/media), indicó una alta heterogeneidad en los

ovocitos de reproductores del medio natural.

Page 65: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

47

Tabla 10. Índice lipídico de ovocitos en proceso de desove en las diferentes categorías ovocitarias, independientemente del origen de las hembras. Los valores son la media ± el error estándar. n=300.

Variable Inmaduros Normales Atrésicos ANOVA

P Índice lipídico (%) 27.25 ± 1.43 b 27.08 ± 1.22 b 22.02 ± 1.29 a 0.02

Valores con diferente superíndice en la misma fila son significantemente diferentes.

Tabla 11. Comparación de las categorías ovocitarias de las hembras en proceso de desove (laboratorio y medio natural). (P < 0.05).

Variable Inmaduros Normales Atrésicos

Medio natural

Laboratorio

Medio natural

Laboratorio Medio

natural

Laboratorio

Índice lipídico (%)

18.5 ± 1.1

34.4 ± 1.0

15.5 ± 1.6

35.2 ± 0.7

19.1 ± 1.3

30.7 ± 1.2

Coeficiente de

Heterogeneidad

1.42

0.83

7.83

1.05

3.20

0.58

n

60

78

138

183

102

39

Page 66: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

48

8. DISCUSIÓN

La evaluación histoquímica de las gónadas de A. maura, se realizó

con el objetivo de establecer una metodología específica que nos

permitiera una aproximación a la composición bioquímica de los

gametos. Se pretende que dicha información apoye la evaluación

oportuna de los desoves de organismos inducidos a la maduración y que

estos sean comparados con los organismos provenientes del medio

natural.

En el presente estudio se demostró la utilidad del fijador de tejidos

Davidson en la aplicación de técnicas de tinción histoquímicas para

lípidos neutros (triglicéridos) y lípidos polares (fosfolípidos) en cortes de

parafina. Se seleccionó el colorante Sudán Negro B (SNB) por que es un

lisocromo específico para triglicéridos y fosfolípidos. La validación del

método aplicando la extracción de lípidos con la mezcla de cloroformo-

metanol permitió cuantificar los lípidos de reserva en forma de

triglicéridos y lípidos estructurales en forma de fosfolípidos en las

muestras tratadas y no tratadas. Los resultados obtenidos indican que

los triglicéridos son extraídos por este método y que los fosfolípidos no

son susceptibles a ser eliminados por la mezcla de cloroformo-metanol

en cortes histológicos.

La importancia de poder determinar la cantidad individual de

triglicéridos por ovocito, radica en la facilidad de cuantificar estos

componentes que han sido reportados por varios autores como el

principal suministro de energía durante los primeros estadios de

desarrollo larvario (Gallager y Mann, 1986; Fraser, 1989).

Los triglicéridos son lípidos de reserva energética que se

transfieren de los progenitores a la progenie en moluscos (Holland,

1978). Besnard (1988) demostró que los lípidos, bajo la forma de

triglicéridos, aseguran la conversión energética del desarrollo

Page 67: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

49

embrionario y de los primeros estadios larvarios y Racotta et al.

(2003b), indican que los triglicéridos son los lípidos más importantes

para el almacenamiento de energía.

La técnica de tinción SNB en cortes de parafina ha sido aplicada en

gónadas femeninas de otros grupos de organismos acuáticos, tanto

moluscos como crustáceos y peces, dando resultados similares en

cuanto a la reacción positiva de los triglicéridos contenidos en los

ovocitos de Cherax quadricarinatus (Rodríguez-González, 2001; García-

Guerrero, 2003) Paralichthys californicus (Burgos-Aceves, 2003),

Lutjanus argentiventris (Martínez-Lagos, 2003), lo cual demuestra que

esta técnica de tinción es específica para los triglicéridos que

constituyen las lipoproteínas del vitelo de los ovocitos. Sin embargo esos

trabajos solamente fueron cualitativos.

La evaluación cuantitativa de la histoquímica mediante el análisis

digital de imágenes, es una metodología estandarizada y validada en

este trabajo que nos permitió estudiar variables inaccesibles a métodos

histológicos clásicos limitados a la apreciación cualitativa, la cual está

sujeta a la capacidad visual del observador. A diferencia de las técnicas

bioquímicas, ésta metodología provee información sobre la composición

específica de las células sujetas a estudio, sin la fracción de las

moléculas presentes en el tejido conjuntivo o bien otros tejidos

presentes en los órganos analizados, ya que normalmente en los

métodos bioquímicos no es posible separar las concentraciones de las

biomoléculas por cada tipo celular presente en el tejido. Esta nueva

herramienta tiene la ventaja de proporcionar más que un simple valor

promedio, aportando precisión en la medición de los parámetros

estudiados. Sin embargo, es necesario considerar la estandarización del

método en cuanto a tiempos de tinción, grosor del corte y estado del

colorante para poder contar con datos confiables. Además de considerar

en la interpretación de los resultados, que el índice lipídico representa

Page 68: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

50

una tasa de ocupación de lípidos en la superficie de la imagen que

representa la distribución de los gránulos lipídicos en la superficie

celular, por lo que es importante considerar el área del ovocito en el

cálculo del IL y en otras variables derivadas del área como por ejemplo

el diámetro. De acuerdo a lo anteriores se aplicó la metodología

estándar propuesta por Saout et al. (1999), con la cual se obtiene el

diámetro teórico a partir del área, evitando sesgo que pudiera darse al

medir el eje mayor de los ovocitos debido a las formas irregulares que

presentan durante la ovogénesis. Esta metodología evita caer en el error

de establecer el diámetro de los ovocitos de forma arbitraria, ya que es

muy usual tomar un eje mayor como el que se observa en los ovocitos

vitelogénicos pedunculados que aún se encuentran unidos a la pared del

acino. En éstos el eje mayor es superior al de cualquier ovocito maduro.

Como ha sido reportado en otros trabajos, la inducción a la

gametogénesis y la maduración gonádica bajo condiciones de

temperatura controlada, ha sido probada en varias especies de moluscos

bivalvos, teniendo un efecto diferente para cada una de ellas con

respecto al tiempo de inducción. Enríquez-Díaz (2000) indujo la

gametogénesis en A. maura durante 20 días a 20°C y describió la

generación de tres cohortes ovocitarias, además determinó que los

ovocitos en degeneración se presentan a partir de los 30 días con un

diámetro promedio de 58 µm (46-65 µm). En el presente estudio

también se observan tres cohortes ovocitarias. Sin embargo, los

ovocitos en degeneración o atrésicos (41.76 ± 1.32 µm), son más

pequeños que los ovocitos normales (47.63± 0.57 µm) (P = 0.000).

Estos resultados coinciden con de Gaulejac et al. (1995a), quien

describe que los ovocitos atrésicos de Pinna nobilis son de diámetro

pequeño. Por lo anterior existe la posibilidad de que se estén

observando dos fenómenos diferentes en el proceso de degeneración

Page 69: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

51

celular, uno que da cómo resultado el crecimiento anormal de ovocitos

sobre madurados y otro que produzca ovocitos atrésicos.

La aplicación de las tres temperaturas fue efectiva para la

inducción a la gametogénesis de Atrina maura. El efecto de la

temperatura sobre las variables morfométricas y de calidad de los

ovocitos fue demostrado cuantitativamente mediante todos los análisis

estadísticos aplicados. Los resultados obtenidos sugieren que para que se

efectúe la transferencia de nutrientes necesarios para el crecimiento de

los ovocitos durante la vitelogénesis (Sastry, 1968; 1970, Sastry y Blake,

1971; Blake, 1972, Sastry, 1979), la temperatura óptima de maduración

en A. maura es 20°C. A esta temperatura se observa un desarrollo

gradual de la gametogénesis, y la aparición de los ovocitos atrésicos se

presenta 30 días después del inicio de la inducción a la gametogénesis,

además de que a 20°C el IL (44.79 ± 0.8) fue mayor que a 25°C (IL=

41.1 ± 1.0) y a 30°C (IL = 40.3±0.6). No obstante, a la temperatura de

25°C el IL se incrementó de forma gradual, siendo mayor para el día 43.

Esto podría ser importante considerarlo como una ventaja ya que la

energía empleada en el crecimiento de los ovocitos y por consecuencia en

la depositación de lípidos en el ovoplasma, sugiere que mayor eficiencia

en el manejo de energía del organismo. Además, la frecuencia de

ovogonias y ovocitos previtelogénicos es más elevada a 25°C que a otras

temperaturas hasta el día 43. Esto podría ser un indicador de que esta

temperatura es adecuada para la preparación de varias cohortes

ovocitarias, y del potencial para producir varios desoves en un mismo

período reproductivo. Sin embargo, a esta temperatura los ovocitos

atrésicos se presentan a partir del día 15 y con mayor frecuencia hasta el

día 43.

El IL más alto registrado durante la inducción a la gametogénesis

se presentó a los 15 días a la temperatura de 20°C. Esto posiblemente

Page 70: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

52

se debe a que la incorporación de lípidos al ovocito ocurre en etapas

tempranas de la vitelogénesis, posiblemente durante la vitelogénesis

exógena a esta temperatura, mientras que el crecimiento posterior del

ovocito se da por la autosíntesis (vitelogénesis endógena). En otros

moluscos como Crassostrea virginica la vitelogénesis ocurre a través de

un proceso de autosíntesis, que involucra la combinación de la actividad

del complejo de Golgi y el retículo endoplásmico rugoso, y la

heterosíntesis en que precursores extraováricos son incorporados al

ovocito vía endocitosis, envolviendo la superficie basal del ovocito

(Eckelbarger y Davis,1996).

Los resultados obtenidos a las temperaturas de 25 y 30°C

sugieren una aceleración del crecimiento de los gametos, efectiva en

los primeros 15 días sobre todo en los ovocitos vitelogénicos. Sin

embargo, esta aceleración produjo cambios en el volumen celular que se

reflejaron en la talla, forma y cantidad de triglicéridos (IL) de cada

ovocito.

Los ovocitos atrésicos o en degeneración son un fenómeno

observado en los ovocitos de bivalvos que se presenta más comúnmente

en ovocitos vitelogénicos (Lubet et al., 1987; de Gaulejac et al., 1995ª;

Valdez-Ramírez et al., 2002). La degeneración ocurre tanto a nivel

estructural como de reservas vitelinas. Las principales características de

estos ovocitos son la degeneración del retículo endoplásmico, el

deterioro del núcleo y rompimiento de las membranas plasmática y

vitelina. En los ovocitos atrésicos de A. maura se observó evidencia del

deterioro de las membranas en la forma y el tamaño de los ovocitos

atrésicos, siendo estos mas pequeños y con un IL inferior a los ovocitos

normales. Tomando en cuenta el concepto de homeostasis celular, los

ovocitos atrésicos posiblemente sufrieron un cambio funcional ante el

efecto de un factor determinante como la temperatura. Los ovocitos

atrésicos presentaron una alteración del volumen celular, lo que se

Page 71: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

53

demostró en las tallas de los ovocitos más chicos a las temperaturas de

25 y 30°C, con la aparición de prolongaciones e invaginaciones de la

membrana.

Estas respuestas morfológicas se ven reflejadas en la variabilidad

del índice lipídico como resultado al cambio funcional de la célula. En

Pecten maximus se ha encontrado que en los gametos donde la

vitelogénesis está alterada, existe una polarización de lípidos (Le Pennec

et al ., 1990). Dorange (1989) menciona que en P. maximus los ovocitos

provenientes de progenitores originarios de la Bahía de St. Brieuc

muestran frecuentes anormalidades ultraestructurales, (ovocitos

atrésicos). Diferencias similares han sido observadas por Paulet et al.

(1988) en ovocitos provenientes de progenitores del medio natural. En

este trabajo, los desoves de progenitores inducidos a la gametogénesis

en el laboratorio produjeron un porcentaje inferior de ovocitos atrésicos,

comparativamente con los provenientes del medio natural.

La revisión de los cortes en serie de las gónadas femeninas de A.

maura, permitió conocer que el mecanismo de expulsión de gametos, es

diferente al reportado para otras especies de bivalvos. Por ejemplo, la

almeja catarina (Argopecten ventricosus) presenta glándulas

unicelulares mucosas que facilitan el movimiento de los gametos a

través de los conductos del desove (Lora-Vilchis et al., 2003). En A.

maura no se presentan conductos con células mucosas que ayuden a la

expulsión de los gametos. El reinicio de la meiosis, también llamado

maduración meiótica, caracterizado por el rompimiento de la vesícula

germinal (Raven, 1966), fue observado en los ovocitos de A. maura

durante el desove. Estos resultados permitieron observar que el reinicio

de la meiosis puede ocurrir tanto en ovocitos libres en el lumen del

acino como en ovocitos pedunculados unidos a la pared de este, que

han alcanzado aparentemente la madurez, y también en ovocitos

atrésicos.

Page 72: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

54

Como se ha mencionado, el índice lipídico de los ovocitos en

desove de las hembras maduradas a 30°C, fue mayor que en los

ovocitos de la hembra proveniente del medio natural, aún cuando a

30°C el AO y el IL presentaron valores bajos comparados con los

obtenidos a las temperaturas de 20 y 25°C. Leyva-Valencia (1999)

definió la temperatura óptima para el crecimiento en juveniles de 1.3-

3.3 cm de longitud de esta misma especie en 29°C, basándose en

algunos indicadores fisiológicos como el marco de actividad. Esta

temperatura es superior a la encontrada en el presente estudio como

óptima para la maduración reproductiva, lo cual sugiere que la

temperatura óptima puede variar conforme a la edad y/o a la talla del

individuo, o bien que las temperaturas óptimas para el crecimiento y

para la maduración reproductiva sean diferentes. Por ejemplo,

González-Estrada (2003) demostró en juveniles de almeja mano de león

Nodipecten subnodosus cultivados a temperaturas entre 15 y 30°C, que

la tasa de crecimiento de la concha no coincidió con el crecimiento en

biomasa ni con el potencial del crecimiento. La tasa de crecimiento en

biomasa y el potencial de crecimiento fueron máximos a 22°C y

mínimos a 30°C, mientras que el crecimiento en concha fue similar a

22°C y a 30°C

El fundamento de la relación N/C es que en las células, el núcleo

alcanza su mayor tamaño en algún momento de ciclo celular, en el caso

de ovocitos esto ocurre hasta la fase posvitelogénica. Entonces el núcleo

representa un patrón de referencia con respecto al crecimiento de otros

organelos o componentes de la célula, como el citoplasma. En este

estudio se encontró que la relación N/C es un indicador histológico de

calidad útil para comparar ovocitos de la misma categoría, como fue el

caso de los posvitelogénicos atrésicos e inmaduros, en donde la relación

N/C fue significativamente (P=0.036) mayor en los primeros. Sin

Page 73: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

55

embargo la relación N/C no es adecuada para comparar ovocitos de

todas las tallas o categorías entre sí.

El coeficiente de heterogeneidad mostró que el IL es más variable

en la gónada de las hembras provenientes del medio natural. Este

resultado es importante considerarlo cuando se seleccionan los

reproductores para la obtención de larvas, ya que es posible que se

obtengan malos resultados cuando se utilicen organismos sin haberse

madurado en el laboratorio, en donde se sincronizan los estadios de

madurez ovocitaria y mejora la calidad de los gametos. Es importante

evaluar si las variaciones que presentan las hembras del medio natural

se deben al agotamiento de los organismos al final del período de

reproducción o determinar que factores influyen en la variación de los

indicadores morfológicos y de calidad. A pesar de que estos resultados

provienen de 6 hembras en desove (3 del laboratorio y 3 del medio

natural), representan un elevado grado de confiabilidad ya que se

evaluaron 100 ovocitos por organismo (600 ovocitos en total).

Estos resultados pueden ayudar a explicar el poco éxito de los

cultivos larvarios de esta especie. En este sentido, Robles-Mungaray

(2004) encontró que los cultivos larvarios de A. maura que han dado

mejores resultados, son aquellos provenientes de organismos

madurados en el laboratorio. Resultados similares obtuvo Villegas-

Carrasco (2004) quien evaluó 11 cultivos larvarios en la almeja mano de

león Nodipecten subnodosus .

Page 74: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

56

9. CONCLUSIONES

• El análisis de imágenes aplicado a los análisis histoquímicos

permitieron obtener información cuantitativa de los ovocitos

durante la gametogénesis inducida en A. maura a las tres

temperaturas. De esta forma se identificaron diferencias en el

índice lipídico (IL) de los ovocitos a cada temperatura, siendo la

temperatura de 20°C la más adecuada para la inducción a la

maduración, como lo demostraron los análisis de las variables de

calidad y morfométricas de los ovocitos.

• La validación de la técnica de tinción Sudán Negro B empleada en

cortes de parafina, permitió la cuantificación de lípidos neutros o

de reserva (triglicéridos) y lípidos estructurales (fosfolípidos).

• El análisis de relación entre las variables morfométricas del

ovocito (área, diámetro teórico, relación núcleo/citoplasma) y de

calidad (índice lipídico) de las categorías ovocitarias, permitió

identificar las diferencias entre los ovocitos en cada estadio de

desarrollo gametogénico a las tres temperaturas de inducción a la

gametogénesis.

• La temperatura de 20°C es la más adecuada para la inducción a la

gametogénesis, como lo demostraron los análisis de las variables

de calidad y morfométricas de los ovocitos

• El análisis individual de los ovocitos en desove, permitió identificar

una alta heterogeneidad del contenido lipídico entre los ovocitos de

las hembras del medio natural. Los ovocitos normales fueron mas

heterogéneos en IL que los inmaduros y atrésicos.

• Las tres categorías de los ovocitos de las hembras del laboratorio

fueron menos heterogéneos en IL .

• A pesar de que los ovocitos de las hembras en desove que fueron

maduradas a 30°C presentaron el menor IL promedio, éste fue

Page 75: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

57

mayor que el IL de los ovocitos de las hembras silvestres. Esto debe

ser considerado para la producción de juveniles en el laboratorio.

• Los ovocitos atrésicos se presentaron con mayor frecuencia

durante la gametogénesis inducida las temperaturas de 25 y 30°C

y permanecieron presentes hasta el momento de la emisión de los

gametos en las hembras a 30°C.

• La talla de ovocitos en degeneración o atrésicos son diferentes a las

tallas de los ovocitos sobremadurados reportados por Enriquez-Díaz

et al. (2000) para esta especie, lo cual sugiere la ocurrencia de dos

fenómenos de degeneración celular diferentes.

• Por los resultados obtenidos, no es recomendable utilizar gametos

de reproductores recién colectados del medio natural para la

producción de larvas en el laboratorio. La inducción a la

maduración en condiciones controladas de alimento y temperatura

pueden garantizar mejores resultados en los cultivos larvarios.

Page 76: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

58

10. RECOMENDACIONES

• Se recomienda la inducción a la gametogénesis de Atrina maura a

temperatura de 20°C.

• Se recomienda emplear organismos en la misma etapa de desarrollo

gametogénico, y de ser posible permitir que los organismos hayan

pasado por un período de reposo para evitar la mezcla de gametos

residuales (atrésicos o en reabsorción).

• Es recomendable usar reproductores madurados en el laboratorio,

ya que además de ser de mayor calidad, presentan mayor

homogeneidad en cuanto al estadio de desarrollo de los ovocitos.

• Para la maduración de reproductores de Atrina maura se

recomienda el uso de un sistema de flujo continuo y abierto como el

empleado en este estudio, el cual dosifica el alimento a las

concentraciones de microalgas deseadas durante largos periodos de

tiempo.

• Para la determinación de las condiciones óptimas de maduración

reproductiva en otras especies de moluscos, se recomienda el uso

de la metodología de análisis de imágenes e histoquímica empleada

en este estudio.

Page 77: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

59

11. LITERATURA CITADA

Ansell, A. D. 1974. Seasonal changes in biochemical composition of the

bivalve Chlamys septemradiata from the Clyde Sea area. Mar.

Biol. 25:85-99.

Arcos-Ortega, F. G. 2003. Análisis fisiológico y genético del desempeño

reproductivo del camarón blanco Litopenaeus vannamei. Tesis de

Doctorado, Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, La

Paz, B.C.S., México, 255 pp.

Arizpe-Covarrubias, O. y R. Félix-Uraga. 1986. Crecimiento de Pinna

rugosa (Sowerby,1835) en la Bahía de La Paz, México. An. Inst.

Cien. Mar. Limnol. Universidad Nacional Autónoma de México.

13(2):167-172.

Arizpe-Covarrubias, O. 1995. Mortality, growth and secondary somatic

production of the bivalve, Pinna rugosa (Sowerby), in suspended

and bottom culture in Bahia de La Paz, México. Aquac. Res.

26:843-853.

Anónimo. 1994. Átlas Pesquero de México. Instituto Nacional de la Pesca.

SEPESCA. México. 234 pp.

Baqueiro, E. y M. Castagna. 1988. Fishery and culture of selected bivalves

in México: Present, past, and future. J. Shellfish Res. 7:433-443.

Baqueiro, C. E., J. A. Massó y H. Guajardo. 1982. Distribución y

abundancia de moluscos de importancia comercial en Baja California

Sur, México. Instituto Nacional de la Pesca, México. Serie de

Divulgación. (11):32 pp.

Bancroft, J. D. y A. Stevens. 1990. Theory and practice of histological

techniques. New York: Churchill Livingstone. 249 pp.

Page 78: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

60

Barber, B. J. y N. J. Blake. 1983. Growth and reproduction of the bay

scallop, Argopecten irradians (Lamarck) at its southern distribution

limit. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 66:247-256.

Barber, B. J. y N. J. Blake. 1981. Energy storage and utilization in

relation to gametogenesis in Argopecten irradians concentricus

(Say). J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 52:121-134.

Barber, B. J. y N. J. Blake. 1991. Reproductive physiology. En: S.E.

Shumway, (ed.). Scallops: biology, ecology and aquaculture. New

York: Elsevier. pp. 377-428.

Barnes, R. D. y E. E. Ruppert 1996. Zoología de los Invertebrados.

México: McGraw-Hill Interamericana. 1114 pp.

Bayliss, H. O. 1984. Lipid histochemistry (Microscopy handbooks 6).

Department of pathology, Guy’s Hospital Medical School London

Oxford University Press. Royal Microscopical Society 68 pp.

Bayne, B. L., P. A. Gabott y J. W. Widows. 1975. Some effects of stress in

the adult on the eggs and larvae of Mytilus edulis L. J. Mar. Biol.

Ass. U.K. 55:675-689.

Bayne, B. L. 1976. Aspects of reproduction in bivalve mollusks. En: M.

Wiley (ed.), Estuarine Processes. Vol.1. London: Academic Press.

pp. 432-448.

Bayne, B. L., A. Bubel, P. A. Gabbott, D. R. Livingston, D. M. Lowe y M.

N. Moore. 1982. Glycogen utilization and gametogenesis in Mytilus

edulis L. Mar. Biol. 3:89-105.

Bayne, B. y R. Newel. 1983. Bivalves. En: Mollusca 1: Physiology, Vol.

4, Verdonky A. N. y J. Van den Biggelaar, (eds.). New York:

Academic Press. pp. 1-64.

Besnard, J. Y. 1988. Etude des constituants lipidiques dans la gonade

femelle et les larves de Pecten maximus L. (Mollusque

Lamellibranche). Tesis de Doctorado, Université de Caen. Francia,

154 pp.

Page 79: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

61

Blake, N. J. 1972. Environmental regulation of neurosecretion and

reproductive activity in the bay scallop, Aequipecten irradians

(Lamarck). Tesis de Doctorado, University of Rhode Island,

Kingston, 161 pp.

Blake, N. J. y A. N. Sastry. 1979. Neurosecretory regulation of

oögenesis in the bay scallop Argopecten irradians (Lamarck). En:

E. Naylor y R. G. Hartnoll (eds.). Cyclic Phenomena in Marine

Plants and Animals. New York: Pergamon Press. pp. 181-190.

Briarty, L. G. 1975. Stereology methods for quantitative light and

electron microscopy. Sci. Prog. 62:1-32.

Brisson, P. y J. Regondaud. 1989. Origin and structure of the

presumptive gonad in basommatophoran pulmonate gastropods.

Malacologia 16 (2):457-466.

Brusca, C. R. 1980. Common Intertidal Invertebrates of the Gulf of

California. Tucson, Arizona: Univ. Arizona Press. 512 pp.

Burgos-Aceves, M. A. 2003. Maduración gonadal de hembras del

lenguado Paralichthys californicus en el medio natural. Tesis de

Maestría, Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, La

Paz, B.C.S., México, 100 pp.

Cardoza-Velazco, F. y A. N. Maeda-Martínez. 1997. An approach to

aquacultural production of the penshell Atrina maura Sowerby,

1835 (Bivalvia: Pinnidae) in northwest México. J. Shellfish Res.

16:311.

Ceballos-Vázquez, B. P., I. S. Racotta y J. F. Elorduy-Garay. 2003.

Qualitative and quantitative analysis of the ovarian maturation

process of Penaeus vannamei after a production cycle. Invert.

Rep. Develop. 43:9-18.

Page 80: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

62

Cendejas, J. M., M. G. Carvallo y L. M. Juárez. 1985. Experimental spat

collection and early growth of the Pen shell, Pinna rugosa

(Pelecypoda: Pinnidae) from the Gulf of California. Aquaculture

48:331-336.

Diario Oficial de la Federación. 2004. Poder Ejecutivo. Secretaría de

Seguridad Pública. (Segunda Sección).

de Gaulejac, B., M. Henry y N. Vicente. 1995a. An ultrastructural study

of gametogenesis of the marine bivalve Pinna nobilis (Linnaeus,

1758). I. Oogenesis. J. Moll. Stud. 61:375-392.

de Gaulejac, B., M. Henry y N. Vicente. 1995b. An ultrastructural study

of gametogenesis of the marine bivalve Pinna nobilis (Linnaeus,

1758). II Spermatogenesis. J. Moll. Stud. 61:393-403.

Devauchelle, N. y C. Mingant. 1991. Review of the reproductive

physiology of the scallop, Pecten maximus, applicable at intensive

aquaculture. Aquat. Living. Resour. 4:1-11.

Dorange, G., Y. M. Paulet., M. Le Pennec y J. C. Cochard. 1989. Critères

histologiques d’evaluation de la qualité des ovocytes émis par

Pecten maximus (Mollusque, Bivalve).C.R. Adac. Sci. Paris

309(3):113-120.

Dorange, G. 1989. Les gametes de Pecten maximus L. (Mollusca,

Bivalvia). Tesis de Doctorado, Universite de Bretagne Occidentale,

Francia, 140 pp.

Enríquez-Díaz, M.R. 2000. Estudios citológicos y químicos en el músculo,

glándula digestiva y gónada durante la gametogénesis inducida de

Atrina maura (Sowerby, 1835). Tesis de Maestría en Ciencias en

Acuacultura, Universidad Autónoma de Baja California Sur, La Paz,

B.C.S., México, 63 pp.

Page 81: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

63

Enriquez-Díaz, M., C. Cáceres-Martínez, J. Chávez-Villalba, G. Le Pennec

y M. Le Pennec. 2003. Gametogenesis of Atrina maura

(Bivalvia:Pinnidae) under artificial conditions. Invert. Rep.

Develop. 43:151-161.

Eckelbarger, K. J., y C. V. Davis. 1996. Ultrastructure of the gonad and

gametogenesis in the eastern oyster, Crassostrea virginica. I.

Ovary and oogenesis. Mar. Biol. 127:79-87.

Fang, Y. y X. Qi. 1988. Studies on ultrastructure of oocyte in process of

maturing in pen shell. Acta Oceanologica Sinica 7(3):459-472.

Fraser, A. J. 1989. Triacylglycerol content as a condition index for fish,

bivalve, and crustacean larvae. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 46:1868-

1873.

Gabbott, P. A. 1975. Storage cycles in marine bivalve mollusks: a

hypothesis concerning the relationship between glycogen

metabolism and gametogenesis. En: Barnes H. (ed.). 9th European

Marine Biology Symposium, Aberdeen University Press. pp. 191-

211.

Gallager, S. M. y R. Mann. 1986. Growth and survival of larvae of

Mercenaria mercenaria (L.) and Crassostrea virginica (Gmelin)

relative to broodstock conditioning and lipid content of eggs.

Aquaculture 56:105-121.

Gallager, S. M., R. Mann y G.C. Sasaki. 1986. Lipid as an index of

growth and viability in three species of bivalve larvae. Aquaculture

56:81-103.

García-Guerrero, M. 2003. Análisis bioquímico y morfológico del desarrollo

embrionario y postembrionario del acocil Cherax quadricarinatus

(Von Martens, 1868); DECAPODA: PARASTACIDAE. Tesis de

Doctorado, Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, La

Paz, B.C.S., México, 103 p.

Page 82: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

64

Giese, A.C. y J. S. Pearse. 1974. Introduction: general principles. En:

A.C. Giese y J. S. Pearse (ed.). Reproduction of marine

invertebrates. New York: Academic Press. pp. 1-49.

González-Corona, M. E. 2003. Estudio de la fisiología reproductiva y

gametogénesis del callo de hacha Atrina maura, (Sowerby, 1835).

Tesis de Maestría en Ciencias, Universidad de Sonora. Hermosillo,

Son., México, 74 pp.

González-Estrada, F. 2003. Temperaturas letales y temperaturas óptimas

para crecimiento de una población de almeja mano de león

(Nodipecten subnodosus Sowerby, 1835). Tesis de Maestría, Centro

de Investigaciones Biológicas del Noroeste. La Paz, B.C.S., México,

90 pp.

Heffernan, P. B. y R.L. Walker. 1989. Quantitative image analysis

methods for use in histological studies of bivalves reproduction. J.

Moll. Stud. 55: 135-137.

Holguín-Quiñones, O. y A. González-Pedraza, 1994. Moluscos de la Franja

Costera de Michoacán, Colima y Jalisco, México. Instituto Politécnico

Nacional. 153 pp.

Holland, D.L. 1978. Lipid reserves and energy metabolism in the larvae

of benthic marine invertebrates. Biochem. Biophys. Pers. Mar.

Biol. 4:84-123.

Howard, D. W. y C. S. Smith. 1983. Histological techniques for marine

bivalve mollusks. National Oceanic and Atmospheric

Administration. Technical Memorandum NMFS-F/NEC-25. U.S.

Department of Commerce. 95 pp.

Humason, L. G. 1979. Animal Tissue Techniques. San Francisco: W.H.

Freeman and Company (ed.). Cuarta edición. 661 pp.

Page 83: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

65

Keen, M. A. 1971. Sea Shells of Tropical West America. Marine Mollusks

from Baja California to Peru. Standford, California: Stanford

University Press. 1064 pp.

Krauter, J. N., M. Castagna y R. Van Dessel. 1982. Egg size and larval

survival of Mercenaria mercenaria (L.) and Argopecten irradians

(Lamarck). J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 56:3-8.

Leyva-Valencia, I. 1999. Termotolerancia, halotolerancia y temperatura

óptima en juveniles de callo de hacha (Atrina maura Sowerby,

1835). Tesis de Licenciatura, Universidad Nacional Autónoma de

México, Campus Iztalaca, México, 54 pp.

Le Pennec, M., F. Gueguen, J. C. Cochard, Y. M. Paulet y G. Dorange.

1990. Relations entre le contenu lipidique des ovocytes de Pecten

maximus et les performances des larves en élevage. Haliotis 10:

101-113.

Lodeiros, C. J., J. J. Rengel, H. Guderley, O. A. Nusetti y J. H.,

Himmelman. 2001. Biochemical composition and energy allocation

in the tropical scallop Lyropecten (Nodipecten) nodosus during the

months leading up to and following the development of gonads.

Aquaculture 199:63-72.

Loosanoff, V. L. y H. C. Davis. 1963. Rearing of bivalve molluscs. Adv.

Mar. Biol. 1:1-36.

Lora-Vilchis, M. C., P. Saucedo, C. Rodríguez-Jaramillo y A. Maeda-

Martínez. 2003. Histological characterization of the spawning

process in the catarina scallop, Argopecten ventricosus (Sowerby

II, 1842) induced by thermal shock and serotonin injection.

Invert. Rep. Develop. 44:79-88.

Lowe, D. M., M. N. Moore y B. L. Bayne. 1982. Aspects of

gametogenesis in the marine mussel Mytilus edulis L. J. Mar. Biol.

Ass. U. K. 62:133-145.

Page 84: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

66

Lubet, P., J. Y. Besnard, R. Faveris y I. Robbins. 1987. Physiologie de

la reproduction de la coquille St Jacques (Pecten maximus L.)

Oceanis 13(3): 265-290.

MacDonald, B. A., y R. J. Thompson, 1986. Influence of temperature

and food availability on the ecological energetics of the giant

scallop Placopecten magellanicus. III. Physiological ecology, the

gametogenic cycle and scope for growth. Mar. Biol. 93:37-48.

Maeda-Martínez, A., P. Monsalvo-Spencer y T. Reynoso-Granados. 1996.

Acondicionamiento, inducción al desove y obtención de embriones

de Callo de Hacha Atrina maura (Mollusca: Pinnidae). Lab. de

Ecofisiología y Cultivos Marinos. Div. de Biología Marina. Informe

Interno CIBNOR, La Paz, B. C. S., México. pp. 167-175.

Maminishkis, A. A., N. K. Gorlina y A. N. Cheredeev. 1995. A model for

assessment of fibroblast morphology. Klinicheskaya Laboratornaya

Diagnostika 5:16-20.

Mann, R. y S. M. Gallager. 1985. Physiological and biochemical energetics

of larvae of Teredo navalis L. Bankia gouldi (Bartsch)

(Bivalvia:Teredenidae). J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 85:1-18.

Marty, Y., F. Delaunay, J. Moal y J. F. Samain. 1992 Changes in the fatty

acid composition of Pecten maximus (L) during larval development.

J. Exp. Biol. Ecol. 163:221-234.

Martínez-Lagos, R. A. 2003. Maduración y desove del pargo amarillo

Lutjanus argentiventris en condiciones controladas de temperatura

y fotoperiodo. Tesis de Maestría, Centro de Investigaciones

Biológicas del Noroeste, La Paz, B.C.S., México, 78 pp.

Mathieu, M. y P. Lubet. 1993. Storage tissue metabolism and

reproduction in marine bivalves-a brief review. Invert. Rep.

Develop. 23:123-129.

Page 85: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

67

Noguera, F. O. y S. Gómez-Aguirre. 1972. Ciclo sexual de Pinna rugosa

Sowerby (Lamellibranchia, Pinnidae) de la Paz, B.C.S. México.

Memorias del IV Congreso Nacional de Oceanografía. México. 273-

282.

Paulet, Y. M., A. Lucas y A. Gérard. 1988. Reproduction and larval

development in two Pecten maximus (L.) populations from

Brittany. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 119:145-156.

Paulet, Y. M. 1990. Role of reproduction in the determinism of

recruitment in Pecten maximus (L) from the Bay of Saint Brieuc.

Tesis de Doctorado, Universite de Bretagne Occidentale, Francia,

340 pp.

Pearce, E. A. G., 1985. Histochemistry theoretical and applied. Vol. 2.

New York: Churchil Livingstone. 237 pp.

Racotta, I. S., J. L. Ramírez, A. M. Ibarra, M. C. Rodríguez-Jaramillo.,

D. Carreño y E. Palacios. 2003a. Growth and gametogenesis in the

lion-paw scallop Nodipecten (Lyropecten) subnodosus.

Aquaculture 217: 335-349.

Racotta, I. S., E. Palacios y A. M. Ibarra. 2003b. Shrimp larval quality in

relation to broodstock condition. Aquaculture 227:107-130.

Raven, C. P. 1966. Morphogenesis: The Analysis of Molluscan

Development, C.P. Raven (ed.). Oxford: Pergamon Press. 365 pp.

Reynoso-Granados, T., A. N. Maeda-Martínez, F. Cardoza-Velasco y P.

Monsalvo-Spencer. 1996. Cultivo de hacha. En: M. Casas-Valdez y

G. Ponce-Diaz (eds.). Estudio del Potencial Pesquero y Acuícola de

Baja California Sur. La Paz, B.C.S., México. CIBNOR. pp. 545-550.

Robles-Mungaray, M., S. J. Serrano-Guzmán y F. Hoyos-Chaires. 1996.

Cultivo de larvas y semillas de callo de hacha Atrina maura

(Sowerby,1835) en el CREMES de Bahía Kino, Son. Méx.

Resúmenes del XI Simposium Internacional de Biología Marina. La

Paz, B.C.S. 25 al 30 de Nov.

Page 86: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

68

Robles-Mungaray, M. 2000. Antecedentes del cultivo de callo de hacha.

Participación en el Foro Tecnológico de Acuacultura (camarón,

ostión, y callo de hacha) organizado por la Universidad Autónoma

de Baja California Sur. La Paz, B.C.S., 6 y 7 de Noviembre.

Robles-Mungaray M. 2004. Desarrollo de la biotecnología para la

producción de semilla diploide y triploide de callo de hacha Atrina

maura en el laboratorio. Tesis de Maestría, Universidad Autónoma

de Baja California Sur, La Paz, B.C.S., México, en preparación.

Rodríguez-González, H. 2001. Efecto del nivel de proteínas y lípidos en

el desarrollo de la gónada de hembras de la langosta de agua

dulce Cherax quadricarinatus (Von Martens). Tesis de Maestría,

Centro de Investigacioines Biológicas del Noroeste, La Paz, B.C.S.,

México, 69 pp.

Rodríguez-Jaramillo, C., A. N. Maeda-Martínez, M. E. Valdez, T.

Reynoso-Granados, P. Monsalvo-Spencer, D. Prado-Ancona, F.

Cardoza-Velasco, M. Robles-Mungaray y M. T. Sicard. 2001. The

effect of temperature on the reproductive maturity of penshell

Atrina maura (Sowerby, 1835) (Bivalvia:Pinnidae). J. Shellfish

Res. 20(1):39-47.

Ruiz-Verdugo, C. A. y C. Cáceres-Martínez. 1990. Estudio preliminar de

captación de juveniles de moluscos bivalvos en la Bahía de La Paz,

B.C.S. México. Inv. Mar. CICIMAR 15(1):29-38.

Ruiz-Durá, M. 1990. Recursos Pesqueros de las costas de México . México,

D.F. Ed. Limusa. 156 pp.

Sastry, A. N. 1963. Reproduction of the bay scallop, Aequipecten

irradians Lamarck. Influence of temperature on maturation and

spawning. Biol. Bull. 125:146-153.

Page 87: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

69

Sastry, A. N. 1966. Temperature effects in reproduction of the bay

scallops, Aequipecten irradians Lamarck. J. Mar. Biol. Assoc. U.K.

130:118-134.

Sastry, A. N. 1968. Relationships among food, temperature and gonad

development of the bay scallop, Aequipecten irradians

concentricus Say, reared in the laboratory. Bull. Mar. Sci. 15:417-

435.

Sastry, A. N. 1970. Environmental regulation of oöcyte growth in the

bay scallop Aequipecten irradians Lamarck. Experientia 26:1371-

1372.

Sastry, A. N. y N. J. Blake. 1971. Regulation of gonad development in

the bay scallop, Aequipecten irradians Lamarck. Biol. Bull.

140:274-282.

Sastry, A. N. 1979. Pelecypoda (excluding Ostraeidae). En: A. C. Giese y

J. S. Pearse (eds.). Reproduction of marine invertebrates. New

York: Academic Press. 297 pp.

Saout, C., C. Quéré, A. Donval, Y. M. Paulet y J. F. Samain. 1999. An

experimental study of the combined effect of temperature and

photoperiod on reproductive physiology of Pecten maximus from

the Bay of Brest (France). Aquaculture 172: 301-314.

Sheehan, D. y B. B. Hrapchak. 1973. Theory and practice of

Histotechnology. London: Mosby Company. 481 pp.

Spicer, S.S. y B. A. Schulte. 1992. Diversity of cell glycoconjugates shown

histochemically: a perspective. J. Histochem. Cytochem. 40(1):1-

38.

Page 88: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

70

Taylor, R. y J. Capuzzo. 1983. The reproductive cycle of the Bay scallop

Aequipecten irradians irradians (Lamarck), in a small coastal

embayment on Cape Cod Massachusetts. Estuaries 6:431-435.

Taylor, A. C. y T. J. Venn. 1979. Seasonal variation in weigth and

biochemical composition of the tissue of the queen scallop, Chlamys

opercularis, from the Clyde sea area. J. Mar. Biol. Ass. U.K. 59:605-

621.

Valdez-Ramírez, M. E., A. Donval, y M. Le Pennec. 2002. Ultrastructural

and histochemical criteria for determining normality in mature

oocyte of the pacific oyster Crassostrea gigas. J. Shellfish Res.

21:707-714.

Vélez-Barajas, J. A. y M. C. Fajardo-León. 1996. Pesquería de hacha. En:

Casas-Valdez M. y Ponce-Díaz G. (eds.). I. Estudio del Potencial

Pesquero y Acuícola de Baja California Sur. CIBNOR, La Paz,

México. pp. 101-111

Villegas-Carrasco, M. 2004. Evaluación de los cultivos larvarios de almeja

mano de león Nodipecten subnodosus (Sowerby, 1835), realizados

en el laboratorio del CIBNOR de 1998 a 2003. Tesis de Licenciatura,

Universidad Autónoma de Baja California Sur, La Paz, B.C.S.,

México, en preparación.

Zar J.H. 1999. Biostatistical Analysis. New Jersey: Prentice Hall. 663 pp.

Page 89: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

71

12. ANEXOS

ANEXO 1

FORMULACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE DAVIDSON

(Shaw y Battle, 1957 citado en Howard y Smith, 1983)

Glicerina 100 ml

Formaldehído al 37-40% 200 ml

Alcohol etílico 96% 300 ml

Agua de mar filtrada 300 ml

Ácido acético 100 ml

Page 90: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

72

ANEXO 2

TECNICA HISTOLÓGICA PARA CORTES EN PARAFINA

DESHIDRATACIÓN Y ACLARAMIENTO

1.- Alcohol etílico 70° (una hora)

2.-Alcohol etílico 80° ( 1 hora)

3.- Alcohol etílico 90° (1 hora)

4.- Alcohol etílico 96° (1 hora)

5.- Alcohol etílico 100° (2 cambios de 1 hora en c/u)

6.- Mezcla de alcohol etílico absoluto-xilol 1:1 (20 minutos)

7.- Xilol absoluto (5 minutos)

INCLUSIÓN EN PARAFINA

8.- Parafina-xilol (1:1) (25 minutos)

9.- Paraplast X-Tra (3 cambios de 1 hora cada uno)

Page 91: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

73

ANEXO 3

TECNICA DE HEMATOXILINA- EOSINA

(Humason, 1979; Sheehan y Hrapchak, 1973)

1.- Xilol (3 cambios de 10 minutos en cada uno)

2.- Alcohol etílico 96° (2 minutos)

3.- Alcohol etílico 70° (dos cambios de 2 minutos c/u)

4.- Agua destilada (5 minutos)

5.- Hematoxilina de Harris 1-2 min

6.- Agua destilada (dos cambios de 5 minutos c/u)

7.- Alcohol ácido (10 segundos)

8.- Agua destilada (5 minutos)

9.- Agua amoniacal (10 segundos)

10.- Agua destilada (5 minutos)

11.- Alcohol etílico 50° (2 minutos)

12.- Alcohol etílico 70° (2 minutos)

13.- Eosina-floxina (3 min)

14.- Alcohol etílico 96° (2 cambios de 2 minutos c/u)

15.- Alcohol etílico 100° (2 cambios de 1 minuto c/u)

16.- CitriSolv (sustituto de xilol) (5 min c/u)

17.- Montar en Entellan (resina sintética)

Resultados:

Núcleos azul

Nucleolos azul

Citoplasma rosa o naranja

Tejido conjuntivo rosa

Page 92: “EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA GAMETOGÉNESIS EN EL ... · Presentada por el alumno: RODRíGUEZ Apellido paterno JARAMILLO materno MARIA DEL CARMEN nombre(s) r ... Después

Efecto de la temperatura sobre la gametogénesis en el callo de hacha Atrina maura (Sowerby, 1835) Ma.del Carmen Rodríguez Jaramillo

74

ANEXO 4

NEGRO SUDÁN B PARA CORTES EN PARAFINA

(Pearse, 1985; Spicer y Schulte, 1992; Bayliss, 1984)

Preparar una solución saturada de Sudán Negro B en alcohol etílico al

70%

Procedimiento:

1.- Desparafinar e hidratar

2.- Colocar los cortes en alcohol 70° (5 minutos)

3.- Teñir en la solución de Negro Sudán B (15 minutos)

4.- Diferenciar en alcohol al 70° (1 minuto)

5.- Lavar en agua corriente

7.- Lavar en agua destilada

8.-Montar en gelatina glicerinada

Resultados:

Triglicéridos azul a negro

Fosfolípidos gris