活性酸素の生化学

● 分子は最外殻の電子軌道の電子を出し合って電子ペアをつくり結合している

● ペアをつくっている2個の電子の自転方向は（スピン）はお互いに逆向き

● １重項分子：電子ペアによって原子同士がお互いに結合している分子

● ラジカル（2重項分子）：ペアをつくっている電子の1個がとれた状態

● 3重項分子：1分子にペアになっていない電子を2個持つ分子

● 酸素は3重項（バイラジカル）で最も安定で反応性が低い

活性酸素 フリーラジカル

１

1S1 1S2

2S1

2S1*

σz

πx

πx* πy*

πy

3O21O2 O2

- O22-

3重項酸素（基底状態）

１重項酸素（励起状態）

スーパーオキシドアニオン

ペルオキシド（過酸化水素）

活性酸素種：Reactive Oxygen Species (ROS)

singlet oxygen superoxide anion hydrogenperoxide

２酸素分子は特殊な分子内電子配置をもっている

安定な酸素分子

活性酸素種のなかで，過酸化水素と遷移金属の反応で生成されるヒドロキシルラジカルは最も反応性が高く，まわりにある高分子を酸化する。

３

酸素分子（3重項分子）は電子ペアをもつ普通の分子（1重項分子）とは反応できない

酸素分子が反応するには１．遷移金属イオンによる活性化

鉄、銅、マンガンなどの金属イオンは最外殻の電子軌道（３ｄ軌道）にペアになっていない電子をもち、一種のラジカル生体内の遊離金属は危険

遷移金属結合タンパク質：（鉄） hemosiderin ヘモシデリンとferritin フェリチン(鉄貯蔵）

疾患： 原発性ヘモクロマトーシス（C282YおよびH63D遺伝子の変異）血中の輸送タンパク質transferrin トランスフェリン, 母乳lactoferrin ラクトフェリン

（銅） セルロプラスミン 疾患：ウイルソン病（ATP7B銅輸送体遺伝子の変異）

２．酸素分子の還元、励起による活性化活性酸素種

３．ラジカル（2重項分子）とは非常に反応しやすいラジカルはペアになっていない電子を酸素に与え、スーパーオキシドアニオンを生成

４．生体内の色素は光エネルギーを吸収し、3重項励起状態になる励起された色素分子のエネルギーが酸素に移動し、1重項酸素分子が生じるポルフィリン病（組織に対して有害となるポルフィリンやヘム前駆物質の蓄積）

５．酸化還元電位の低い基質酸化還元電位が非常に低い基質は電子を受け取りラジカルになりやすく、まわりの酸素に電子を与える事が出来る （例） パラコート中毒

４

生体内における活性酸素の産生

細胞内での活性酸素の主な産生場所５

過酸化脂質

スーパーオキシド

スーパーオキシド

色素

生体内でのスーパーオキシド産生源

６

a

b

７生体内でのラジカル分子の生成

８生体内でのラジカル分子の生成

９生体内でのラジカル分子の生成

共役二重結合：水素引き抜き反応が起こりやすい

１０過酸化脂質の生成反応

Initiation (開始反応）

多価不飽和脂肪酸 脂肪酸ラジカル （Ｒ・）

Prolongation （伸展反応）R・ + O2 → ROO・ROO・ + RH → ROOH + R・

Termination （終止反応）2 R・ → RR2ROO・ → O2 + ROORROO・ + R・ → ROOR

-H・

水素引き抜き反応

多価不飽和脂肪酸の過酸化反応

ラジカルスカベンジャービタミンＥ

１１

１２

血管内皮細胞由来血管弛緩因子（ＮＯ；一酸化窒素）も重要なラジカル

L-arginine

NO synthase (NOS；一酸化窒素合成酵素)Neuronal NOS (nNOS or NOS1):シグナル伝達Inducible NOS (iNOS or NOS2)：炎症、生体防御Endothelial NOS (eNOS or NOS3）：血管拡張

NOとO2-の反応

peroxinitrate

１４

生体内での活性酸素の消去

Ｒ ビタミンＥラジカル ビタミンＣ ＧＳＳＧ ＮＡＤＰＨ

Ｒ・ ビタミンＥ デヒドロビタミンＣ ＧＳＨ ＮＡＤＰ＋

過酸化脂質の生体内での還元反応

グルタチオン還元酵素

膜（疎水性） 親水性

１３

体外へ排出

１５

活性酸素・過酸化脂質に対する生体防御

１．抗酸化酵素

１） スーパーオキシドジスムターゼ：superoxide dismutase (SOD)

Cu, ZnSOD (細胞質型，SOD1遺伝子）、

MnSOD（ミトコンドリア型，SOD2遺伝子）

ECSOD（細胞外型，SOD3遺伝子）

O2- + O2- + 2 H+ → O2 + H2O2

（スーパーオキシドアニオンの付均化反応を触媒）

２） カタラーゼ：catalase （ペルオキシソーム）

2 H2O2 → 2 H2O + O2

３） グルタチオンペルオキシダーゼ：glutathione peroxidase（細胞質）

2 GSH + H2O2 → GSSG + 2 H2O

2 GSH + ROOH → GSSG + ROH + H2O

（過酸化水素と脂質ペルオキシドを水とアルコールにそれぞれ還元）

４） グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ

glutathione S-transferase

GSH + ROOH → GSOH + ROH

GSOH + GSH → GSSG + H2O

（脂質ペルオキシドをアルコールに還元）

１６

Glutathione Oxidation Reduction (Redox) Cycle

１７活性酸素消去酵素システム

１８

Mn-SOD

Cu, Zn-SOD

２．金属結合タンパク質による活性酸素産生の抑制

１） トランスフェリン (transferrin)血液中の鉄輸送タンパク質

２） ラクトフェリン (lactoferrin)母乳、好中球から分泌される。感染細菌の生育に必要な鉄を除去

３） ヘモシデリン (hemosiderin)、フェリチン (ferritin)細胞内の鉄貯蔵タンパク質

４） セルロプラスミン (celuroplasmin)細胞外液、特に、血液中に多く存在する銅結合タンパク質

５） メタロチオネイン (metallothionein)カドニウム、銅、亜鉛などの重金属被爆で誘導される構成アミノ酸の１／３がシステインでSH基を介して1分子あたり7分子の金属を結合させる

１９

生体内の抗酸化剤

２０

天然抗酸化物の化学構造 ２１

サケ・エビ・カニや海藻などの魚介類に多く含まれる赤い色素β-カロテンの一種、一重項酸素に有効

活性酸素によるDNAの損傷

(8-HDG)

２２

生体内での活性酸素の役割

●活性酸素 ＤＮＡ （ＤＮＡ損傷、突然変異） 細胞障害膜脂質 （過酸化脂質） 炎症タンパク質 （変性・失活） 組織障害

加齢に伴う疾患

●活性酸素： 細胞増殖、アポトーシス、発がんのシグナル

●活性酸素： 生体防御

寿命

２２

抗酸化剤応答配列ARE（antioxidant response element）

Nuclear Respiratory Factor 2 (NRF2)

好中球・マクロファージのNADPH oxidase

慢性肉芽腫症（chronic granulomatous disease; CGD）

・食細胞機能異常を原因とする原発性免疫不全症候群の一疾患

・スーパーオキシド産生酵素NADPH oxidaseの遺伝子異常

・伴性遺伝のgp91phox欠損型は，常染色体劣性遺伝のp22phox，p47phox，

p67phox欠損型より重症

・乳幼児期より重症細菌・真菌感染症を反復し， 諸臓器に肉芽腫形成を伴うのが特徴

予後不良で青年期までに大半が死亡していた．

抗菌療法の発達やインターフェロンγの導入，骨髄幹細胞移植等で予後は改善

PMN

SpecificGranules

PrimaryGranules

PMN Phagocytosis

Superoxide

MPOCl- H2O2

2O2-

2O2+

HOCl (~bleach)

pH = 7.5-8.0

Antimicrobial Proteins & Peptides

Proteases

FR DeLeo

２３

NADPH Oxidase: unassembled & inactive

2O2-

CYTOPLASM

p67

p47

p40

+

Sequestered SH3 Domains and Cationic Region

2O2

gp91phox p22-phox

Fe

2e-

Fe

２５

Conformational changes of p47phox

PX (wt) SH3 PN--- ---CSH3

SH3SH3PC---

N---

Protein kinase(s)

Resting cell

Stimulated cell

P

Pautoinhibitory region

２６

RhoGDI

RacGDP

RhoGDI

ACTIVATED

RESTING

Phosphorylation

CYTOPLASM

p67

p47

p40

1

+

Sequestered SH3 Domains and Cationic Region

?

2

NADPH Oxidase Activation and Assembly

3

2O2 2O2-

gp91phox p22-phox

Fe

p67p40

67

RacGTP

Rap1ANADPH

FAD

2e-

Fe

PP

P1

3

NADPHFAD

9

8p67

p47

p40

12

54

P P

3

２７

NAD(P)H oxidases

Phagocyte NADPH oxidase (gp91phox) Nox2

Non-phagocyte oxidase

(smooth muscle cells, endothelial cells, fibroblasts)

Gastric pit cell NAD(P)H oxidase (Teshima, Gastroenterology 1998)

Mitogen oxidase 1 (Mox1) (Lambeth, Nature 1999) Nox1

Renox (Leto, ProNAS 2000; Sumimoto, JBC 2001) Nox4

Thox 1, 2 (Duphy, JBC 1999; Edens, JBC 2001) Duox1, 2

Nox3 (Kikuchi, Gene 2000) Nox3

Nox5 (Lambeth, JBC 2001) Nox5

Nox organizer 1, Nox activator 1 (Leto; Krause; Sumimoto; JBCs 2003)

Nox1 in innate immunity (Kawahara et al. J Immunol 2004)

２８

Nox2 (gp91phox)

Nox1Nox3

Nox4

Nox5

Duox1

Duox2

NADPH oxidase (Nox) / Dual oxidase (Duox) family

(Lambeth et al, Trends. Biochem. Sci. 2000, Gordon Research Conference, 2001)

outside

inside COOH

NH2NADPH FAD

H

H

H

H

I II III IV V VIFe

Fe

Nox1

FAD , NADPH binding domainsEF-handCa++-binding domain

1 x transmembrane

Peroxidase domain

6 x transmembrane

２９

Functions of the Nox/Duox family

Nox1: local host defense, inflammationcell growth, transformation (?)regulation of vascular tone

Nox2 : host defense, recognition & memory ?

Nox3 : development, otoconial morphogenesis

Nox4 : aging, atherosclerosis, oxygen sensing

Nox5 : regulation of immune cell functions

Duox1, Duox2 : thyroid hormone synthesishost defense