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CINÉTICA ENZIMÁTICA

Aula 4 – Eng. Bioquimica Profa. Inês Roberto - 2015

Caso particular da Cinética Química

2Aula 4 – Eng. Bioquimica Profa.

Inês Roberto - 2015

Medir as velocidades de transformação

Avaliar a influência de condições de reação (conc. dereagentes, enzimas, temperatura, pH, etc..) nasvelocidades de reação

Correlacionar através de modelos matemáticos (empíricos)as velocidades das transformações com fatores que asafetam

Otimização; controle e projeto de reatores

OBJETIVOS

ENZIMAS

Aula 4 – Eng. Bioquimica Profa. Inês Roberto - 2015 3

�São catalisadores orgânicos protéicos, relativamenteespecíficos, produzidos por organismos vivos.

�São proteínas com atividade catalítica. Praticamentetodas as reações que caracterizam o metabolismocelular são catalisadas por enzimas.

�Como catalisadores celulares, as enzimas acelerama velocidade de uma reação, sem no entantoparticipar dela como reagente ou produto.

�Nomenclatura: sufixo ASE adicionado a seusubstrato Aula 4 – Eng. Bioquimica Profa.

Inês Roberto - 2015 4

Disponibilidade comercial

Industriais

(Ex: amilases)

Analíticas (Ex: glicose oxidase)

Médicas (Ex: asparaginase)

Natureza da reação catalisada

Oxiredutases

Transferases

Hidrolases

Liases

Isomerases

Ligases

Classificação

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/


Classificação Internacional das EnzimasIMPORTÂNCIA INDUSTRIAL


�Amiloglicosidase (A. niger) ------- Produção deglicose

�Proteases (B. subtilis) ---------- Detergentes

�Glicose isomerase (L.brevis) ----------Frutose

�Invertase (S. cerevisiae) ------- Alimentos (previne acristalização do açúcar)

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IMPORTÂNCIA INDUSTRIAL




É a parte da enzimologia que estuda a velocidadedas reações enzimáticas, e os fatores queinfluenciam nesta velocidade.

A cinética de uma enzima é estudada avaliando-sea quantidade de produto formado ou a quantidadede substrato consumido por unidade de tempo dereação.


Medida da Velocidade

PSE

→

2222 21 OOHOH

catalase

+→

�A velocidade de consumo de [S] ou formação de [P] varia com o tempo

�Mesmo mantendo constantes a temperatura e pH, a [E] pode diminuir devido a sua

labilidade (produtos inibidores de sua ação catalítica)

�A velocidade da reação deve ser calculada, sempre que possível no instante inicial t = 0

(instante em que as condições experimentais são conhecidas)

�Há porém casos, em que a v0 não pode ser medida (falta de técnicas experimentais,

equação química não totalmente conhecida). Nestes casos, a velocidade da reação pode

ser representada por uma velocidade média de substancias escolhidas, ou ainda pela

variação de uma propriedade do sistema (viscosidade)


Fatores que Afetam a Atividade Enzimática

A velocidade de reação aumenta aumento da

energia cinética

Depende dos grupos ionizáveis presente no sítio

ativos das enzimas.

Temperatura pH


Fatores que Afetam a Atividade Enzimática

A velocidade de reação

aumenta com o aumento da

[E]

Cinética de 1a ordem

A velocidade da reação aumenta com aumento da

[S] até um limite (saturação).

Concentração da enzima Concentração do substrato

Modelo cinético para explicar a influência das concentrações iniciais de [E] e [S] na velocidade da reação.

Michaelis-Menten


O substrato e a enzima reagem reversivelmente entre si formando um complexo intermediário chamado de complexo enzima-substrato

A formação do complexo se dá na proporção de 1 mol de [S] para cada mol de [E], produzindo 1 mol do complexo

O complexo formado se decompõe regenerando a enzima e formando produtos

Hipóteses

3


PEESSEv

k

k

k

+→+ →←

3

1

2

Sendo:

K1 = constante de velocidade de formação do complexo

K2 = constante de velocidade de dissociação do complexo

K3 = constante de velocidade de decomposição do complexo formando o produto

ν = velocidade de formação do produto

Balanço de massa

[ ] [ ]ESkdt

Pdv 3==Produto [P]:

Complexo [ES] [ ] [ ][ ] [ ] [ ]ESkESkSEkdt

ESd321 −−=

Enzima [E]: [ ]ESEE −= 0

(1)

(2)

(3)


Aplicando estado estacionário, na eq.2, ou seja [ ]0=

dt

ESd

[ ] [ ][ ] [ ] [ ]ESkESkSEkdt

ESd321 −−=

[ ] [ ][ ]32

1

kk

SEkES

+=

Substituindo a eq.(3) na eq.(4), teremos: [ ] [ ]( )[ ]32

01

kk

SESEkES

+

−=

[ ] [ ]][

1

32

0

Sk

kkSE

ES+

+=

(2)

(4)

Resolvendo a eq.(5), teremos:

(5)

(6)

Substituindo a eq.(6) na eq.(1), teremos:

[ ] [ ]][

1

32

03

Sk

kkSE

kdt

Pdv

++

==][

][

Sk

sVv

m +=(7) (8)

Equação de Michaelis-Menten


][

][

Sk

sVv

mmáx +

=

Sendo:

ν= velocidade da reação

V= velocidade máxima da reação

Km = constante de Michaelis.

Equação de Michaelis-Menten


][

][

Sk

sVv

mmáx +

=

S=Km

Quanto menor o valor de Km

maior será a afinidade da E

pelo S

Por que na região de elevada [S] a velocidade é máxima e constante?

Km = É a concentração de substrato a qualcorresponde a uma velocidade igual a metadeda máxima


Determinação das Constantes Cinéticas (km e Vmáx)

O método mais utilizado foi a linearização proposta porLineweaver-Burk (duplo recíproco) e consiste em inverterambos os lados da equação de Michaelis

SV

k

Vv máx

m

máx

111+=

aXbY +=


Determinação das Constantes Cinéticas (km e Vmáx)

O método proposto por Hanes, consiste simplesmente em

multiplicar por [S]ambos os lados da equação de Michaelis

máx

m

máx V

kS

Vv

S+=

1

baXY +=

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A título de exemplo, consideremos os valores da Tabela 1 que nos fornece os dados experimentais de uma reação enzimática.

S (g/L) νννν (g/l.h)

0,25 0,78

0,51 1,25

1,03 1,66

2,52 2,19

4,33 2,35

7,25 2,57

Tabela 1: Velocidade inicial de formação do produto em função da concentração inicial do substrato.

Determinar os valores das constantes cinéticas da reação aplicando O método de Lineweaver-Burk e de Hanes.


Os inibidores são substâncias que podem diminuir a velocidade da reação.

Influência da Presença de um Inibidor

Inibição

Reversível

CompetitivaO inibidor se liga no mesmo sítio de ligação do substrato

O efeito é revertido aumentando-se a concentração

de substrato

Não-CompetitivaO inibidor liga-se

reversivelmente à enzima em um sítio próprio de ligação

Depende apenas da concentração do inibidor.

Irreversível


Inês Roberto - 2015Aula 4 – Eng. Bioquimica Profa.


Modelos de Ligação Enzima-Substrato


Mecanismo para inibição COMPETITIVA

PEESS

EI

I

Ev

k

k

k

+→++

→←

3

1

2

b][1

][

Sk

Ik

sVv

Im

máx

+

+

=

Efeito do [I] é aumentar km pelofator αααα

Contornado pelo aumento de [S]

Não modifica a Vmáx

α

α=1 Não ocorre inibição

+=

Imappm k

Ikk 1,


Mecanismo para inibição NÃO-COMPETITIVA

][

][

1Sk

s

k

I

Vv

m

I

máx

+

+

=

O inibidor se liga em ambos (E ou ES)em um sítio distinto do sítio ativo

O efeito do [I] é diminuir a Vmáx

pelo fator αααα

Nenhuma mudança no km

+

=

I

app

kI

VV

1

maxmax,

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Influência da Presença de um Inibidor nas Constantes Cinéticas (Km e Vmáx)

Tipo de Inibidor Ligação no Sitio Ativo Efeito Cinético

Sem Inibidor

Competitivo

Nenhum

Compete com o S pelo mesmo

sítio ativo (reversível pelo S)

Não altera as constantes

Aumentar Km sem alterar a

velocidade

Não-CompetitivoO inibidor ocupa outro sítio

regulador da enzima (não

reversível pelo S)

Não altera o Km e a

velocidade decresce com

proporcionalmente a [I]


Inês Roberto - 2015 26Aula 4 – Eng. Bioquimica Profa.




Na tabela estão mostrados os dados experimentais obtidos após a reação de hidrólise do

amido com a enzima α-amilase na ausência e na presença de maltose. Pede-se:

a) Representação gráfica da influência do substrato sobre a velocidade de hidrólise do

amido, na presença e na ausência de maltose;

b) Representação gráfica de Lineweaver-Burk e determinação da constante de Michaelis

(KM) e a velocidade máxima (VM), para ambas condições

Ausência de Maltose Presença de Maltose

Substrato

(g/L)

Velocidade de hidrólise

(g/min) Substrato

Velocidade de hidrólise

(g/min)

12.56 101 10 77

11.24 98.2 7.7 71.4

9 92.4 5.26 62.5

8.12 90 4.55 58.9

6.33 82.7 3.33 51.4

5.61 79.1 2.04 38.9

4.28 70.9 1.89 37

3.56 65 1.67 34.2

2.34 51.7

1 28.8


Aula 4 – Eng. Bioquimica Profa. Inês Roberto - 2015 29 30


6


Inês Roberto - 2015 32Aula 4 – Eng. Bioquimica Profa.


Resolução

33

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15

V

[S]

Hidrólise do amido

Ausência de Maltose Presença de MaltoseAula 4 – Eng. Bioquimica Profa.


Resolução - Comportamento

34

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15

V

[S]

Hidrólise do amido


Vmáx

Vmáx

KM


Linearização



1/S 1/V 1/S 1/V

0.080 0.0099 0.100 0.013

0.089 0.0102 0.130 0.014

0.111 0.0108 0.190 0.016

0.123 0.0111 0.220 0.017

0.158 0.0121 0.300 0.019

0.178 0.0126 0.490 0.026

0.234 0.0141 0.529 0.027

0.281 0.0154 0.599 0.029

0.427 0.0193

1 0.034722

Resolução - Linearização

36

y = 0.0269x + 0.0078

y = 0.0325x + 0.0098

0.0000

0.0050

0.0100

0.0150

0.0200

0.0250

0.0300

0.0350

0.0400

0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200

1/V

[S]

Hidrólise do amido


Linear (Ausência de Maltose) Linear (Presença de Maltose)


7




1/S 1/V 1/S 1/V

-0.289 0.0000 -0.300 0.000

0.080 0.0099 0.100 0.013

0.089 0.0102 0.130 0.014

0.111 0.0108 0.190 0.016

0.123 0.0111 0.220 0.017

0.158 0.0121 0.300 0.019

0.178 0.0126 0.490 0.026

0.234 0.0141 0.529 0.027

0.281 0.0154 0.599 0.029

0.427 0.0193

1 0.034722


y = 0.027x + 0.0078

y = 0.0326x + 0.0098

-0.0050

0.0000

0.0050

0.0100

0.0150

0.0200

0.0250

0.0300

-0.400 -0.200 0.000 0.200 0.400 0.600

1/V

1/[S]

Hidrólise do amido


Linear (Ausência de Maltose) Linear (Presença de Maltose)

40

KM semelhante

Velocidades máximas diferentes





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